CN105617373B - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种疫苗组合物,该疫苗组合物包括免疫量的副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白以及药学上的载体。本发明的疫苗组合物对副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型有交叉保护效果,能够有效预防和治疗多种血清型副猪嗜血杆菌的感染。该疫苗组合物每次免疫1ml即可得到有效的免疫。本发明还提供了该疫苗组合物的制备方法,采用该制备方法能够该疫苗组合物的产业化生产,经济可靠。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域,具体地涉及一种预防和治疗副猪嗜血杆菌相关疾病的疫苗组合物、制备方法及应用。
背景技术
副猪嗜血杆菌病是副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎,该病又称为猪革拉泽氏病(Glsser’s Disease)。在大量分离副猪嗜血杆菌的基础上,发现该菌的血清型复杂多样,按Kieletein-Rapp-Gabriedson(KRG)琼脂扩散血清分型方法,至少可将副猪嗜血杆菌分为15个血清型;根据我国血清流行病学调查和分离菌株的鉴定,以4、5型最为流行。
采用疫苗进行免疫预防是国内外控制副猪嗜血杆菌病的根本手段,而市场销售的商品疫苗只有副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清4型MD0322+血清5型SH0165)、副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(Z-1517株)、副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(血清1型SV1+血清6型SV6),这些疫苗的应用起到了一定的预防作用,但这些灭活疫苗一般由2个或者3个血清型的地方流行菌株制备而成,随着病原流行株和不同血清型之间缺乏交叉保护已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效果,而且市售商品疫苗需多次免疫,成本较高,对猪只的应激较大,因此,需要发明一种新型的能有效抵抗多种血清型的副猪嗜血杆菌毒株的疫苗以解决上述问题。
发明内容
为了解决现有技术的不足,本发明的主要目的在于克服现有技术缺陷,提供一种用于预防和/或治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物,包含四种副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原和佐剂。
本发明的第一方面在于一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包括免疫量的副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白以及药学上的载体。
本发明提供的预防和/或治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物包含的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原为TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA蛋白。
本发明从副猪嗜血杆菌地方分离株ZJ菌株(菌株来源参见实施例1)中分别克隆到TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA基因。经过测序发现TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA蛋白基因编码区分别由2703bp、834bp、1077bp和2862bp个碱基组成,具有序列表SEQ ID NO:1~4所示的核苷酸序列。经过序列分析发现其编码的蛋白rTbpA、rCdtB、rOmpP2、rVtaA分别有901、278、359、954个氨基酸残基组成,具有序列表SEQ ID NO:5~8所示的氨基酸序列,去掉信号肽部分之后表达蛋白预计分子量大小为11、33、43、11KDa。通过原核表达和实验室试验证实本发明的rTbpA、rCdtB、rOmpP2、rVtaA蛋白,能够对副猪嗜血杆菌感染具有保护作用,且意外的发现四种蛋白可以对血清4型、5型、12型具有交叉保护,预示着可以研制副猪嗜血杆菌亚单位疫苗。
本发明提供的上述基因序列是副猪嗜血杆菌的具有免疫原性的四种蛋白基因(TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA),该蛋白还可以应用对于副猪嗜血杆菌亚单位疫苗和诊断试剂研制中。
作为本发明的一种实施方式,在本发明的疫苗组合物中,所述副猪嗜血杆菌TbpA蛋白序列为SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列;所述副猪嗜血杆菌CdtB蛋白序列为SEQ IDNO:6编码的氨基酸序列;所述副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白序列为SEQ ID NO:7编码的氨基酸序列;所述副猪嗜血杆菌VtaA蛋白序列为SEQ ID NO:8编码的氨基酸序列。
本发明提供的预防和/或治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物包含的副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原TbpA蛋白、CdtB蛋白、OmpP2蛋白、VtaA蛋白还可以是与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。
本发明涉及的副猪嗜血杆菌多肽,其有利地激发动物中的保护性反应。具体地,本发明实施方式的多肽包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。
如本文一般理解和使用,“功能性片段”指编码与完整核酸序列的生物活性基本相似的功能生物活性的核酸序列。换言之,在本发明的上下文中,其优选地指基本上保留了编码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段,所述多肽/蛋白质当施用于动物时,激发针对副猪嗜血杆菌菌株攻击的免疫应答,和更优选地保护性反应。
当指氨基酸序列时,“基本上相同”可以理解为本发明的多肽优选地具有这样的氨基酸序列,其与SEQ ID NO:5-8中所示的序列的部分或全部具有至少70%同源性,或甚至优选地80%同源性,或甚至更优选地90%同源性,或最优选地95%同源性。
在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似,同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具),本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列,同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。
术语“功能衍生物”指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物活性的蛋白/肽序列。换言之,其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时,基本上保留了激发免疫应答,如针对副猪嗜血杆菌菌株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。
术语“片段”指这样的多核苷酸序列,其是人工构建(例如通过化学合成)或通过将天然产物裂解成多个小片段(使用限制性内切酶,或机械剪切)构建的本发明核酸的分离的部分,或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的核酸的部分,或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸部分。
作为本发明的一种优选实施方式,在本发明的疫苗组合物中,所述副猪嗜血杆菌TbpA蛋白序列为SEQ ID NO:1编码的核苷酸序列;所述副猪嗜血杆菌CdtB蛋白序列为SEQID NO:2编码的核苷酸序列;所述副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白序列为SEQ ID NO:3编码的核苷酸序列;所述副猪嗜血杆菌VtaA蛋白序列为SEQ ID NO:4编码的核苷酸序列。
作为本发明的一种实施方式,在本发明的疫苗组合物中,所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白含量分别为100-200μg/ml。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型,待治疗的动物的类型和年龄,施用的方式,以及组合物中的其它成分而变化。
优选地,对于动物猪而言,本发明疫苗组合物TbpA蛋白抗原含量为100-200μg/ml;CdtB蛋白抗原含量为100-200μg/ml;OmpP2蛋白抗原含量为100-200μg/ml;VtaA蛋白抗原含量为100-200μg/ml。
更优选地,所述疫苗组合物TbpA蛋白抗原含量为150μg/ml;CdtB蛋白抗原含量为150μg/ml;OmpP2蛋白抗原含量为150μg/ml;VtaA蛋白抗原含量为150μg/ml。
作为本发明的一种优选实施方式,在本发明的疫苗组合物中,所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白含量分别为150μg/ml。
作为本发明的一种实施方式,在本发明的疫苗组合物中,所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白含量比例为1:1:1:1。
作为本发明的一种实施方式,在本发明的疫苗组合物中,所述疫苗组合物还包括佐剂,所述佐剂包括氢氧化铝胶佐剂、Montanide GEL 01、Montanide PET GEL A、Montanide IMS 1313、蜂胶、CpG-ODN佐剂、细胞因子、单磷酰基脂质(MPIA)。
术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括,但不限于:氢氧化铝胶佐剂、Montanide GEL 01、Montanide PET GEL A、Montanide IMS 1313、蜂胶、CpG-ODN佐剂、细胞因子、单磷酰基脂质(MPIA)。
优选地,本发明使用的佐剂为Montanide GEL 01、Montanide PET GEL A、蜂胶佐剂。
本发明实施例中使用了Montanide GEL 01佐剂。
适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型,待治疗的动物的类型和年龄,施用的方式,以及组合物中的其它成分而变化。
在一个实施方式中,本发明提供一种预防和/治疗副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物,由副猪嗜血杆菌免疫抗原TbpA蛋白、CdtB蛋白、OmpP2蛋白、VtaA蛋白和Montanide GEL 01佐剂组成。
本发明疫苗组合物还可以进一步包含其他的试剂。例如,本发明的组合物还可以包含试剂,如:药物,免疫刺激剂(如:α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和白介素2(IL2)),抗氧化剂,表面活性剂,着色剂,挥发性油,缓冲剂,分散剂,推进剂和防腐剂。为了制备这样的组合物,可以使用本领域公知的方法。
本发明的第二方面在于一种制备所述的疫苗组合物的方法,其中,所述方法包括:(1)分别克隆、表达所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白;以及(2)混合所述表达的TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白以及佐剂。
抗原的制备可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行,包括基因工程手段,例如通过包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。术语“载体”涉及被设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体可以是,例如“克隆载体”,其被设计用于分离、增殖和复制插入的核苷酸;“表达载体”,其被设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列;或“病毒载体”,其被设计用于生产重组病毒或病毒样颗粒;或“穿梭载体”,其包含不只一种类型的载体的性质。适合制备本发明副猪嗜血杆菌抗原的公众可获得的载体包括质粒、腺病毒、杆状病毒、酵母杆状病毒、植物病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、α病毒、慢病毒等,还可以获得构建这样的载体的方法。本发明副猪嗜血杆菌抗原的制备还包括通过人工合成的方式来实现。
作为本发明的一种实施方式,在本发明的制备方法中,所述副猪嗜血杆菌TbpA蛋白序列为SEQ ID NO:5编码的氨基酸序列;所述副猪嗜血杆菌CdtB蛋白序列为SEQ ID NO:6编码的氨基酸序列;所述副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白序列为SEQ ID NO:7编码的氨基酸序列;所述副猪嗜血杆菌VtaA蛋白序列为SEQ ID NO:8编码的氨基酸序列。
作为本发明的一种实施方式,在本发明的制备方法中,所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白含量分别为100-200μg/ml。
作为本发明的一种优选实施方式,在本发明的制备方法中,所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白含量分别为150μg/ml。
本发明的第三方面在于所述的疫苗组合物在制备治疗和预防感染副猪嗜血杆菌相关疾病的药物中的应用。
本发明的另一个目的在于提供包含副猪嗜血杆菌免疫抗原TbpA蛋白、CdtB蛋白、OmpP2蛋白、VtaA蛋白或其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽在用于预防和/或治疗副猪嗜血杆菌相关疾病或感染的组合物中的应用。
本发明可以应用的副猪嗜血杆菌相关疾病的非穷举性列表包括,如猪多杀性浆膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎。
术语“预防”指通过其与副猪嗜血杆菌菌株相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟;术语“治疗”指通过与副猪嗜血杆菌菌株相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。
术语“保护性反应”意为在动物中预防副猪嗜血杆菌相关疾病或由副猪嗜血杆菌导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。
本发明的另一个目的是提供一种疫苗组合物在制备预防和/或治疗副猪嗜血杆菌相关疾病或感染的药物的应用。
附图说明
图1为扩增各抗原基因的PCR结果电泳图其中,各泳道分别是泳道M为DNA分子质量标准(DL2000),泳道-为阴性对照,泳道1为TbpA基因(2697bp),泳道2为CdtB基因(834bp),泳道3为OmpP2基因(1077bp),泳道4为VtaA基因(2862bp);
图2为表达各抗原蛋白后上清的SDS-PAGE电泳图,其中,各泳道分别是:泳道1为TbpA蛋白(10.8KDa),泳道2为CdtB蛋白(33KDa),泳道3为OmpP2蛋白(43KDa),泳道4为VtaA蛋白(11KDa),泳道CK为PET-30空载体对照,泳道M为蛋白分子量标准(250KDa);
图3为纯化的抗原蛋白SDS-PAGE电泳图,其中,各泳道分别是:泳道1为TbpA蛋白(10.8KDa),泳道2为CdtB蛋白(33KDa),泳道3为OmpP2蛋白(43KDa),泳道4为VtaA蛋白(11KDa),泳道M为蛋白分子量标准(250KDa);
图4为制备的各疫苗免疫仔猪后抗体水平的检测情况图;
图5为制备的各疫苗免疫Balb/C小鼠攻毒保护存活率随时间变化图谱。
序列表中:
序列1为副猪嗜血杆菌ZJ菌株TbpA核苷酸序列;
序列2为副猪嗜血杆菌ZJ菌株CdtB核苷酸序列;
序列3为副猪嗜血杆菌ZJ菌株OmpP2核苷酸序列;
序列4为副猪嗜血杆菌ZJ菌株VtaA核苷酸序列;
序列5为副猪嗜血杆菌ZJ菌株TbpA氨基酸序列;
序列6为副猪嗜血杆菌ZJ菌株CdtB氨基酸序列;
序列7为副猪嗜血杆菌ZJ菌株OmpP2氨基酸序列;
序列8为副猪嗜血杆菌ZJ菌株VtaA氨基酸序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下本发明的实施例中以副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、12型HeB株的抗原蛋白说明本发明。
本发明的具体实验方法可参见《中华人民共和国兽药典(二〇一〇年版)》及附录。有关DNA的操作方法和使用试剂均参考《分子克隆试验指南》所述内容。本发明中涉及的其他各种实验操作,均为本领域的常规技术,其他未注明的试剂或原料均可由本领域技术人员根据现有技术或参照本发明申请之日前的各种常用工具书、科技文献、说明书、手册等获得并加以实施。
本发明所涉及的菌株信息:
副猪嗜血杆菌血清4型JS株(Haemophilus parasuis Serotype 4,Strain JS),保藏号为:CCTCC NO:M 2011172;
副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株(Haemophilus Parasuis Serotype 5,Strain ZJ),保藏号为:CCTCC NO:M 2011173;
副猪嗜血杆菌血清12型HeB株(Haemophilus parasuis Serotype12,StrainHeB),保藏号为:CCTCC NO:M 2011174;
均由普莱柯生物工程股份有限公司分离、鉴定,已在中国典型培养物保藏中心进行保藏,保藏日期:2011年5月18日,保藏地址为中国武汉·武汉大学。
实施例1副猪嗜血杆菌ZJ株免疫原性蛋白基因的获取
1.四种蛋白编码基因的制备
利用副猪嗜血杆菌ZJ株的基因组为模板,申请人依据4种蛋白编码基因核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1-4所示),并在两端引入酶切位点Nde I和BamH I设计引物,引物序列见表1。
扩增体系:(50μl):
TbpA基因:94℃预变性5min;94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸45s,共30个循环;72℃后延伸10min。
cdtB基因:95℃预变性5min;94℃变性35s,61℃退火30s,72℃延伸lmin,循环30次,最后72℃延伸10min。
Ompp2基因:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸45s,共30个循环;72℃后延伸10min。
VtaA基因:95℃预变性5min;94℃变性30s,54℃退火30s,72℃延伸1min30s,共30个循环;72℃后延伸10min。
2.目的蛋白的获取
2.1扩增到的目标片段通过PCR产物回收试剂盒(购自上海生工)回收纯化后与pMDl8-T载体(购自大连Takara公司)连接,转化JM109,筛选阳性克隆经PCR鉴定结果表明和副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA蛋白基因大小一致,PCR结果的电泳图见图1。
2.2用内切酶NdeI和BamHI对转化的质粒和PET30a(货号69553,Merck公司)进行双酶切,再用T4连接酶将其连接,得到PET30a/HPs-TbpA、PET30a/HPs-CdtB、PET30a/HPs-OmpP2、PET30a/HPs-VtaA,然后将重组质粒转化进表达菌株DL21(DE3)。筛选转化子后,用LB液体培养基活化,提质粒进行酶切验证,酶切片段大小与预期大小一致。将阳性转化子LB液体培养基活化培养物送至上海Invitrogen公司测序,测序结果表明获得了序列为SEQ IDNO:1-4所示的DNA片段,通过软件分析预测,编码如序列表SEQ ID NO:5-8中所示的副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA多肽片段,分子量分别为11、33、43、11KDa。
实施例2副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白的表达与纯化
将PET30a/HPs-TbpA、PET30a/HPs-CdtB、PET30a/HPs-OmpP2、PET30a/HPs-VtaA重组表达质粒转化进表达菌株DL21(购自Invitrogen公司),接种于LB液体培养基,OD600=0.6时,加入异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG,购自Sigma公司)至终浓度0.08mmol/L,进行诱导表达。诱导后的菌液离心,将沉淀用PBS(pH为6.4,0.01mol/L重悬),在冰浴中超声破碎,12000rmp离心10min,取上清。上清中的目的蛋白SDS-PAGE电泳图见图2,上清中的目的蛋白用His-Ni柱(货号70238,His·Bind,Merck公司)进行纯化。
rTbpA、rCdtB、rOmpP2、rVtaA重组蛋白复性,用磷酸盐缓冲液配制(NaH2PO4100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L)的浓度为8mol/L、6mol/L、4mol/L、2mol/L、0mol/L的尿素溶液透析复性,其中不同浓度的溶液pH均为5.8。在磷酸盐缓冲液中透析2小时,即复性。将复性的目的蛋白浓度稀释至20mg/ml。对最终的纯化产物进行SDS-PAGE电泳,电泳图见图3,结果,与预计的蛋白分子量大小吻合,证明本发明的副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白rTbpA、rCdtB、rOmpP2、rVtaA成功表达。
实施例3副猪嗜血杆菌亚单位疫苗的制备及免疫后仔猪抗体水平
1将副猪嗜血杆菌纯化后的蛋白rTbpA、rCdtB、rOmpP2、rVtaA,分别与MontanideGEL 01ST佐剂混合,使每种疫苗中蛋白含量为200μg/ml;同时将4种蛋白等比例(重量比)混合后,与Montanide GEL01 ST佐剂1:1(体积比)乳化,使每种疫苗中蛋白含量分别为100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml。另外用ZJ株菌液灭活后,和Montanide GEL 01ST制备灭活疫苗(含灭活前活菌数至少为2×109/ml),各疫苗中成分见表2。
表2疫苗组分及含量
2不同抗原含量(蛋白混合)疫苗比较试验
2.1Balb/C小鼠半数致死量
试验将用副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株对数生长期的细菌悬液作倍比稀释,并细菌计数,确定接种的实际菌量。取适宜稀释度的细菌定量接种小鼠,由最高稀释度开始,每一稀释度接种10只,共分5组。试验结束后,统计数据,按寇氏(Korbor)法测定出半数致死量(LD50),结果LD50为1.2×109CFU。
表3对BALB/c小鼠的半数致死量(LD50)毒力试验结果
LD50的计算公式logLD50=∑l/2×(Xi+Xi+l)(Pi+l-Pi)
Xi与Xi+l及Pi+l与Pi分别为相邻两组的剂量对数以及动物死亡百分比。
2.2不同抗原含量(蛋白混合)疫苗比较
用纯化蛋白制备的不同含量(蛋白混合)疫苗E、G、H、I,分别免疫18~22g的Balb/C小鼠,皮下接种0.5mL疫苗,3周后二免,二免后14日连同对照组每组各10只,用副猪嗜血杆菌5型ZJ株进行腹腔注射1ml(含菌量为2×LD50),另外10只设为佐剂对照,观察7天。结果表明,疫苗E、疫苗G和疫苗H混合组免疫保护基本一致,攻毒后4天内保护率较高,7天仍有80%保护,为了节省成本,蛋白混合物制备疫苗的抗原含量确定为150μg/ml。
2.3免疫后仔猪抗体水平
分别用检验合格的疫苗A、B、C、D、E、F进行仔猪免疫后的抗体水平评价。将3周龄的仔猪随机分成7组,每组5头。第1-6组猪分别颈部肌肉注射A、B、C、D、E、F疫苗,1ml/头,第7组为空白对照,注射PBS,1ml/头;仔猪6周龄时用相同的剂量和注射方式进行第二次疫苗的注射。仔猪免前、4、5、6、7、8周龄时采血,进行ELISA抗体检测,结果见图4,结果显示,E疫苗二免后抗体水平和灭活疫苗相当,优于其它疫苗。
实施例4副猪嗜血杆菌亚单位疫苗对副猪嗜血感染保护力的检测
1Balb/C小鼠免疫攻毒试验18~22g的Balb/C小鼠,皮下接种0.5mL疫苗,3周后二免,二免后14日连同对照组每组各10只,用副猪嗜血杆菌5型ZJ株进行腹腔注射1ml(含菌量为2.5×109CFU),另外10只设为佐剂对照,观察7天。检验结果见图5,结果表明,疫苗E和灭活疫苗F免疫Balb/C小鼠保护率均为90%,高于其它疫苗免疫组。
2仔猪免疫攻毒保护试验
根据实施例3免疫仔猪抗体水平检测结果和疫苗免疫Balb/C小鼠攻毒保护试验结果,我们用疫苗E和F进行仔猪免疫攻毒保护试验,同时用副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株、12型HeB株进行攻毒,检测亚单位疫苗E的保护效果。
实施步骤:取实施例3制备的疫苗E、F,每组疫苗各用3~4周龄的健康易感猪15头,每头肌肉注射1mL,含1个使用剂量,间隔3周后二免,二免后14天,将注射了每种疫苗的免疫试验猪随机分为三组,分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株和血清12型HeB株攻毒。对照猪15头,分三组,分别用所述副猪嗜血杆菌血清4型JS株、5型ZJ株和血清12型HeB株攻毒。
副猪嗜血杆菌血清4型JS株:选取免疫猪各5头,连同条件相同的对照猪5头,腹腔注射1个发病量的血清4型JS株菌液,观察14天,测温7天,死亡猪剖检观察病变并分离细菌,试验结束日安乐死存活猪,剖检观察病理变化,结果亚单位疫苗免疫猪80%保护,对照猪100%发病,通过评分评价,亚单位E疫苗对攻毒对照差异显著(P<0.05),亚单位E疫苗对5型单价灭活疫苗免疫组差异也显著(P<0.05),结果分析见表4、7。
副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株:选取免疫猪5头,连同条件相同的对照猪5头,腹腔注射1个发病量的血清5型ZJ株菌液,观察14天,测温7天,死亡猪剖检观察病变并分离细菌,试验结束日安乐死存活猪,剖检观察病理变化,结果亚单位疫苗E免疫猪80%保护,对照猪100%发病,通过评分评价,亚单位E疫苗对攻毒对照差异极显著(P<0.01),亚单位E疫苗和灭活疫苗免疫效果相比差异不显著(P>0.05),结果分析见表5、8。
副猪嗜血杆菌血清12型HeB株:选取免疫猪5头,连同条件相同的对照猪5头,静脉注射1个发病量的血清12型HeB株菌液,观察14天,测温7天,死亡猪剖检观察病变并分离细菌,试验结束日安乐死存活猪,剖检观察病理变化,结果亚单位疫苗E免疫猪60%保护,对照猪100%发病,通过评分评价,亚单位E疫苗对攻毒对照差异显著(P<0.05),亚单位E疫苗对5型单价灭活疫苗免疫组差异也显著(P<0.05),结果分析见表6、9。
表4 4型JS株攻毒后存活猪直肠体温
注:不同时间存活猪体温分析,*表示和0h相比差异显著(P<0.05),表示和攻毒对照组相比差异显著(P<0.05)。
表5 5型ZJ株攻毒后存活猪直肠体温
注:不同时间存活猪体温分析,*表示和0h相比差异显著(P<0.05),表示和攻毒对照组相比差异显著(P<0.05)。
表6 12型HeB株攻毒后存活猪直肠体温
注:不同时间存活猪体温分析,*表示和0h相比差异显著(P<0.05),表示和攻毒对照组相比差异显著(P<0.05)。
表7疫苗免疫仔猪4型JS株攻毒试验评测
注:*E疫苗免疫组和攻毒对照相比差异显著(P<0.05),表示E疫苗免疫组和F疫苗免疫组相比差异显著(P<0.05)。
表8疫苗免疫仔猪5型ZJ株攻毒试验评测
注:*E疫苗免疫组和攻毒对照相比差异极显著(P<0.01)。
表9疫苗免疫仔猪12型HeB株攻毒试验评测
注:*E疫苗免疫组和攻毒对照相比差异显著(P<0.05),表示E疫苗免疫组和F疫苗免疫组相比差异显著(P<0.05)。
本发明四种基因(TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA)表达的蛋白作为副猪嗜血杆菌免疫保护性抗原组合物,利用其编码的蛋白应用于研制对副猪嗜血杆菌感染具有保护力的亚单位疫苗和诊断试剂中。且制备的亚单位疫苗对副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型有交叉保护效果,克服了现有商品化疫苗只能预防1种或者2种副猪嗜血杆菌感染的不足。
本发明采用了水性疫苗佐剂和适宜的配苗技术制备了副猪嗜血杆菌亚单位疫苗,每次免疫1ml,可以看出水型佐剂安全、可靠,注射方便,无副反应,克服现有疫苗副反应大等不足,满足不同用户的要求。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽然本发明已以优选实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (8)
1.一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包括免疫量的副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白以及药学上的载体;所述副猪嗜血杆菌TbpA蛋白序列如SEQ ID NO:5所示;所述副猪嗜血杆菌CdtB蛋白序列如SEQ ID NO:6所示;所述副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白序列如SEQ ID NO:7所示;所述副猪嗜血杆菌VtaA蛋白序列如SEQ ID NO:8所示;其中,所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白含量分别为100-200μg/ml。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白含量分别为150μg/ml。
3.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白含量比例为1:1:1:1。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物还包括佐剂,所述佐剂选自氢氧化铝胶佐剂、Montanide GEL 01、Montanide PET GEL A、Montanide IMS 1313、蜂胶、CpG-ODN佐剂、细胞因子、单磷酰基脂质。
5.一种制备权利要求1所述的疫苗组合物的方法,其中,所述方法包括:
(1)分别克隆、表达所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白;以及
(2)混合所述表达的TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白以及佐剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其中,所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白含量分别为100-200μg/ml。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其中,所述副猪嗜血杆菌TbpA、CdtB、OmpP2、VtaA抗原蛋白含量分别为150μg/ml。
8.根据权利要求1~4任一项所述的疫苗组合物在制备治疗和预防感染副猪嗜血杆菌相关疾病的药物中的应用。
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