CN114099660B

CN114099660B - 一种预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN114099660B
Application number: CN202111332865.4A
Authority: CN
Inventors: 李甜甜; 丁国伟; 叶正琴; 徐萍; 魏荣荣; 潘晨; 陈林中日; 陈森; 贾丁菡; 李琛; 荣雪路
Original assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-11-11
Filing date: 2021-11-11
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2041-11-11
Also published as: CN114099660A

Abstract

本发明公开了一种预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物及其制备方法，属于兽用生物制品领域。本发明提供的预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物包括TbdR1‑T3、SIP‑T3、CAMP、GldG‑T3、OmpA‑T3、TrpB及HA‑T3重组蛋白。本发明的鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗，免疫效果良好，免疫剂量小，一次接种就能有效预防鸭疫李默氏杆菌病不同血清型所造成的疾病。本发明的制备方法简单，能大量制备鸭疫李默氏杆菌病的抗原蛋白，耗时短，表达量高，大大降低了生产成本，有利于大规模生产，填补了现有市售鸭传染性浆膜炎疫苗中1型、2型和10型三价疫苗的空白。

Description

一种预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物及其制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸭传染性浆膜炎，又称鸭疫里默氏杆菌病，是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的细菌性传染病，危害养鸭业的主要疫病之一。1932年，美国学者Hendrickson和Hilbert首次报道该病，1936年，美国伊利诺斯州的一个商品鸭场发生该病，曾被称为“鸭败血症”，Dougherty等科研工作者于1995年经全面病理学研究后，将该病命名为“传染性浆膜炎”。Leibovitz提议使用“鸭疫里默氏杆菌感染”名称。我国自1982年郭玉璞等从北京郊区鸭场首次分离到鸭疫里默氏杆菌以来，所有养鸭地区几乎均有该病的发生，鸭、鹅及火鸡等多种禽类易感，是一种接触性传染病，多呈急性或慢性败血症过程，以纤维素性肝周炎、心包炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎为主要特征，传播速度快，死亡率较高，对抗生素的耐药性不断增加，疫苗免疫是控制该病的有效方法之一。

RA血清型众多，目前世界范围内已确定的有21种，各血清型之间的交叉保护作用差。根据我国学者的血清学研究结果表明流行菌株的优势血清型是血清1、2和10型。然而，目前我国有批准文号的市售疫苗均为1型、2型二价和1型、2型、7型三价灭活疫苗，未有1型、2型、10型疫苗在售，亟需研发一种1型、2型、10型三价疫苗。另外，目前我国商业化的只有灭活疫苗，生产中一般在雏鸭7日龄时注射鸭传染性浆膜炎灭活疫苗，由于疫苗接种后至产生有效保护性免疫应答需要7天或更长时间，所以在这段时期形成了一个免疫空白期，使得雏鸭容易在早期感染传染性鸭浆膜炎。灭活疫苗的免疫原性较差，需要多剂次加强，且在生产过程安全性要求较高，导致生产成本高。

因此研制一种生产成本低、生产效率高以及疫苗免疫效果好的预防鸭传染性浆膜炎的疫苗的生产方法具有重要的现实意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物及其制备方法和应用。该疫苗组合物生产成本低、生产效率高且免疫效果好。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

本发明的第一个目的是提供一种组合物，所述组合物中含有鸭传染性浆膜炎的TbdR1-T 3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白；其中TbdR1-T3、SIP-T3、GldG-T3、OmpA-T3、HA-T3重组蛋白为在TbdR1、SIP、GldG、OmpA及HA氨基酸序列的基础上，进行截短并进行了多次重复表达。

在一种实施方式中，所述TbdR1-T3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，SI-T3P蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，CAMP蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，GldG-T3蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；OmpA-T3蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，TrpB蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，HA-T3蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

在一种实施方式中，编码所述TbdR1-T3蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述SIP-T3蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述CAMP蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码所述GldG-T3蛋白的基因的核苷酸序列如SEQID NO.8所示，编码所述OmpA-T3蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，编码所述TrpB蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，编码所述HA-T3蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

在一种实施方式中，所述组合物中的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白的总含量为50～150μg/mL。

在一种实施方式中，所述组合物中的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白的比例为1:1:1:1:1:1:1。

本发明的第二个目的是提供上述组合物在制备预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗中的应用。

在一种实施方式中，所述三价基因工程亚单位疫苗还包括佐剂。

在一种实施方式中，所述佐剂包括但不限于：铝盐佐剂、脂质体佐剂、纳米颗粒佐剂、皂苷佐剂。

在一种实施方式中，所述三价基因工程亚单位疫苗中的佐剂为矿物油佐剂。

在一种实施方式中，所述三价基因工程亚单位疫苗的给药方式包括肌内、皮内或皮下给药。

本发明的第三个目的是提供一种预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗，所述疫苗中含有鸭传染性浆膜炎的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白；其中TbdR1-T3、SIP-T3、GldG-T3、OmpA-T3、HA-T3重组蛋白为在TbdR1、SIP、GldG、OmpA及HA氨基酸序列的基础上，进行截短并进行了多次重复表达。

在一种实施方式中，所述预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗中的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白的总含量为50～150μg/mL。

在一种实施方式中，所述预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗中的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白的比例为1:1:1:1:1:1:1。

在一种实施方式中，所述预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗还包括佐剂。

在一种实施方式中，所述预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗中的佐剂为矿物油佐剂。

在一种实施方式中，所述预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗的给药方式包括肌内、皮内或皮下给药。

本发明的第四个目的是提供一种制备所述预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物的方法，所述方法的具体步骤如下：

(1)将编码TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3蛋白的基因的核苷酸序列分别连接至至pFastBac I载体，获得重组质粒RA-A、RA-B、RA-C、RA-D、RA-E、RA-F和RA-G；

(2)将步骤(1)得到的重组质粒RA-A～RA-G分别转化DH10 Bac感受态细胞，获得重组杆粒rBacmid-RA-A、rBacmid-RA-B、rBacmid-RA-C、rBacmid-RA-D、rBacmid-RA-E、rBacmid-RA-F和rBacmid-RA-G；

(3)将步骤(2)获得的重组杆粒rBacmid-RA-A～rBacmid-RA-G分别转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒rRA-A、rRA-B、rRA-C、rRA-D、rRA-E、rRA-F和rRA-G；

(4)将步骤(3)获得的重组杆状病毒rRA-A～rRA-G分别接种HF细胞进行大量培养，离心收集培养液上清，得到TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白。

(5)将步骤(4)的重组蛋白经过纯化，加入佐剂，乳化，最后混匀制备得到鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物。

在一种实施方式中，所述佐剂包括但不限于：铝盐佐剂、脂质体佐剂、水包油佐剂、油包水佐剂、纳米颗粒佐剂、皂苷佐剂。

在一种实施方式中，所述三价基因工程亚单位疫苗组合物中的佐剂为矿物油佐剂。

在一种实施方式中，所三价基因工程亚单位疫苗组合物中的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白的总含量为50～150μg/mL。

在一种实施方式中，所述三价基因工程亚单位疫苗组合物中的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白的比例为1:1:1:1:1:1:1。

本发明还提供了所述组合物和所述预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗在制备预防和/或治疗鸭疫李默氏杆菌病相关疾病或由鸭疫李默氏杆菌病感染的相关疾病的药物中的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明对1型、2型和10型鸭疫李默氏杆菌的共同抗原抗原蛋白TbdR1、SIP、GldG、OmpA及HA进行截短和多重表达，将获得的片段TbdR1-T3、SIP-T3、GldG-T3、OmpA-T3及HA-T3与CAMP和TrpB共同构建获得预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物。其免疫效果良好，免疫剂量小，一次接种就能有效预防鸭疫李默氏杆菌病相关疾病或由鸭疫李默氏杆菌病感染相关疾病。

2、本发明提供的1型、2型和10型三价基因工程亚单位疫苗组合物的制备方法简单，能大量制备鸭疫李默氏杆菌病的抗原蛋白，耗时短，表达量高，大大降低了生产成本，有利于大规模生产，填补了现有市售鸭传染性浆膜炎疫苗中1型、2型和10型三价疫苗的空白。

附图说明

图1是SDS-PAGE检测重组杆状病毒表达产物；1：对照；2：TbdR1-T3；3：SIP-T3；4：CAMP；5：GldG-T3；6：OmpA-T3；7：TrpB；8：HA-T3。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。

下述实施例中涉及到的实验材料

鸭疫里默氏杆菌均由扬州优邦生物药品有限公司分离、鉴定、保存，1型鸭疫里默氏杆菌：Riemerella anatipestifer YB-1株、2型鸭疫里默氏杆菌：Riemerellaanatipestifer YB-2株、10型鸭疫里默氏杆菌：Riemerella anatipestifer YB-10株均由我公司分离获得。

商业化质粒pFastBac I、大肠杆菌DH10Bac感受态细胞均购买于thermo公司。

实施例1：重组杆状病毒的构建

1、转移载体构建：将鸭疫李默氏杆菌的抗原蛋白TbdR1、SIP、GldG、OmpA及HA进行截短和多重表达，将获得的蛋白片段TbdR1-T3、SIP-T3、GldG-T3、OmpA-T3、HA-T3、CAMP和TrpB委托安徽通用生物进行基因合成，并连接至商业化载体pFastBac I，获得转移载体RA-A、RA-B、RA-C、RA-D、RA-E、RA-F和RA-G。

2、重组杆状病毒构建：将步骤1中合成的转移载体RA-A～RA-G分别转入大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞中，并挑选阳性克隆用M13引物作PCR鉴定。

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R：CAGGAAACAGCTATGAC

PCR反应体系为(总体积25μL)：DNA模板0.5μL、M13-F和M13-R个0.5μL、DNA聚合酶12.5μL及无菌水11μL。

PCR反应条件为：93℃，5min；94℃30s，55℃45s，72℃5min，30个循环；72℃10min。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示，成功扩增出约3000-5000bp的特异性条带，与预期大小相符。阳性重组杆粒命名为rBacmid-RA-A、rBacmid-RA-B、rBacmid-RA-C、rBacmid-RA-D、rBacmid-RA-E、rBacmid-RA-F和rBacmid-RA-G。

3、重组杆粒转染sf9细胞：将步骤2中的阳性重组杆粒用脂质体转染的方法将重组杆粒转染昆虫细胞sf9，具体操作方法参照赛默飞世尔科技(中国)有限公司的cellfectin转染试剂说明书进行，获得f1代重组杆状病毒rRA-A、rRA-B、rRA-C、rRA-D、rRA-E、rRA-F和rRA-G。

实施例2：重组蛋白的制备

1、重组杆状病毒扩增：将实施例1获得的f1代重组杆状病毒rRA-A、rRA-B、rRA-C、rRA-D、rRA-E、rRA-F和rRA-G分别接种昆虫细胞sf9，27℃培养4天，收集培养物，离心取上清即获得f2代重组杆状病毒；

2、表达蛋白鉴定：

(1)将步骤1中获得的f2代重组杆状病毒rRA-A～rRA-G以MOI＝5～10的接种量分别接入昆虫细胞sf9，27℃培养4天，收集培养物，离心取上清即获得重组蛋白TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3；

(2)SDS-PAGE鉴定：将步骤2获得的上清进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，TbdR1-T3样品条带为45kDa、SIP-T3样品条带为49kDa、CAMP样品条带为37kDa、GldG-T3样品条带为60kDa、OmpA-T3样品条带为40kDa、TrpB样品条带为34kDa及HA-T3样品条带为46kDa。电泳结果条带大小均与目标蛋白理论分子量大小一致，证明蛋白表达成功(图1)。

(3)重组蛋白的大量表达：将鉴定正确的重组病毒以MOI＝1～10的接毒量接种HF细胞大量培养，离心收集培养液上清，即获得含有大量的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白。

(4)蛋白纯化：蛋白纯化采用常规Ni亲和层析进行纯化，具体实验操作参照千纯生物科技有限公司Ni-NTA Purose 6Fast Flow填料说明书。

实施例3：疫苗制备

1、灭活：将实施例2中制备的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白加入到灭活罐中，加入终浓度为0.2％～0.5％灭活剂BEI，于37℃灭活24h。

2、半成品检验

(1)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(2)蛋白含量测定：按BCA法检测蛋白含量。

(3)灭活检验：将灭活后的重组蛋白分别接入昆虫细胞sf9，置于27℃继续培养72小时。观察无病变出现，判定灭活检验合格。

3、疫苗疫苗组合物制备：

经过检验合格后的半成品蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)油相制备：取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加5份司本-80，至温度达到115℃时，维持，冷却后备用。

(2)水相制备：将各重组蛋白使用生理盐水稀释成100μg/mL，并按适宜比例进行混合。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用蛋白液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。

(3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000rpm乳化5分钟。乳化后，取10mL，以3000rpm离心15min，管底析出的水相应不超过0.5mL。

实施例4：疫苗成品检验

1、性状

外观：疫苗应为乳白色白乳剂，无杂质并且外包装应合格；

剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均应不扩散。

稳定性：吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000rpm离心15min，管底析出水相应不超过0.5mL。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

2、装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

3、无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。

4、安全检验：

鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗，批号分别为rRA-001P、rRA-002P、rRA-003P共3批。

取5-6日龄的健康易感鸭(血清1型、2型、10型鸭疫里默氏杆菌抗体凝集效价均不高于1:2)10只，每只颈部皮下注射疫苗0.3mL，观察14日内实验鸭有无局部或全身明显不良反应。结果显示，疫苗注射后实验动物无不良反应(如喜卧、废食，疫苗注射部位无结痂、肿胀，剖检显示疫苗注射部位无疫苗残留)

5、效力检验：

5.1分组及攻毒：取5-6日龄健康易感鸭(血清1型、2型、10型鸭疫里默氏杆菌抗体凝集效价均不高于1:2)90只，随机均分为A-I九组，每组10只。A、B、C组为免疫组，每只颈部皮下注射疫苗0.15mL，D、E、F组为市售疫苗对照(齐鲁动物保健品有限公司，该疫苗为包含1型、2型和7型三个血清型抗原)，G、H、I为非免疫攻毒对照。免疫后14日，用1型、2型、10型鸭疫里默氏杆菌(YB-1、YB-2、YB-10)分别进行攻毒实验，其中A、D、G组使用活菌量约为4×10⁹CFU/mL的YB-1株菌液1mL腿部肌肉注射攻毒，B、E、H组使用活菌量约为1×10⁹CFU/mL的YB-2株菌液1mL腿部肌肉注射攻毒，C、F、I组使用活菌量约为6×10⁹CFU/mL的YB-10株菌液1mL腿部肌肉注射攻毒，观察10日内实验鸭发病和死亡情况。

5.2效力检验结果：取5-6日龄健康易感鸭(血清1型、2型、10型鸭疫里默氏杆菌抗体凝集效价均不高于1:2)90只，随机均分为A-I九组，每组10只。A、B、C组为免疫组，每只颈部皮下注射疫苗0.15mL，D、E、F组为市售疫苗对照，G、H、I为非免疫攻毒对照组。免疫后14日，A、D、G组使用活菌量约为4×10⁹CFU/mL的YB-1株菌液1mL腿部肌肉注射攻毒，B、E、H组使用活菌量约为1×10⁹CFU/mL的YB-2株菌液1mL腿部肌肉注射攻毒，C、F、I组使用活菌量约为6×10⁹CFU/mL的YB-10株菌液1mL腿部肌肉注射攻毒，观察10日内实验鸭发病和死亡情况。RA-002P疫苗免疫14日后攻毒，免疫鸭保护率均10/10，市售疫苗对照组保护率为(1型7/10、2型8/10、10型0/10)，对照鸭发病均10/10。详见下表。

表1鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位灭活疫苗效力检验结果

注：鸭传染性浆膜炎发病判断标准(符合条件之一即可判为发病)

(1)精神不振、行动蹒跚、眼鼻有分泌物流出、排绿色或黄绿色稀薄粪便或死亡；

(2)剖检出现心包炎或肝周炎或浆膜炎病变；

采集的血清样本或肝脏或脾脏组织，接种巧克力琼脂平板分离细菌，分离到的细菌呈阳性。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州优邦生物药品有限公司

<120> 一种预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗组合物及其制备方法

<130> BAA211384A

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 408

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met His His His His His His Thr Val Lys Thr Lys Gln Val Glu Glu

1 5 10 15

Val Val Leu Leu Gly Ser Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Thr Asp Ser

20 25 30

Pro Val Pro Val Asp Val Phe Asp Val Gln Lys Met Gly Val Thr Leu

35 40 45

Pro Gln Thr Asn Ile Asn Gln Ile Leu Asn Val Val Ala Pro Ser Phe

50 55 60

Thr Ser Thr Val Gln Thr Gly Ala Asp Gly Thr Asp His Leu Asp Pro

65 70 75 80

Ala Gln Leu Arg Gly Leu Gly Pro Asp Gln Val Leu Val Leu Val Asn

85 90 95

Gly Lys Arg Arg His Thr Ser Ala Leu Ile Asn Val Asn Gly Thr Pro

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Val Gly Thr Asp Leu Asn Ala Ile Pro Ala Phe Ala

115 120 125

Leu Ser Lys Ile Glu Val Leu Arg Asp Gly Ala Ser Ala Gln Tyr Gly

130 135 140

Ser Asp Ala Ile Ala Gly Val Met Asn Leu Asn Leu Lys Arg Asn Thr

145 150 155 160

Gly Arg Ser Asp Ala Asn Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp

165 170 175

Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro

180 185 190

Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met

195 200 205

Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln

210 215 220

Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly

225 230 235 240

Glu Thr Cys Val Tyr Pro Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp

245 250 255

Tyr Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu

260 265 270

Ser Met Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp

275 280 285

Pro Ala Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr

290 295 300

Glu Ala Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr

305 310 315 320

Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly

325 330 335

Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr

340 345 350

Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys

355 360 365

Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Ser Ser Arg Leu Pro Ile Ile

370 375 380

Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe

385 390 395 400

Asp Val Gly Pro Val Cys Phe Leu

405

<210> 2

<211> 1227

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcaccatc accatcacca tactgtaaag accaaacaag tagaagaagt agtactacta 60

gggagccgtt ctggagctcg ttctaaaacg gatagccccg tgccagtaga tgtgtttgat 120

gttcaaaaaa tgggggttac attgcctcaa accaatatca accaaatact gaatgtggta 180

gctccatcat ttacttctac cgtacagacg ggagctgatg gtacagacca cctagaccct 240

gcacagctta gaggcttagg tccagaccag gtcttggtat tagttaatgg taaaaggagg 300

catacctctg ccctcatcaa tgttaatggg acaccaggga gaggtaccgt aggtaccgac 360

ctcaatgcca taccagcctt tgcacttagc aaaatagaag tgcttagaga tggtgcttcg 420

gcacaatatg gctctgatgc tattgcaggg gtaatgaacc tcaatctcaa aagaaataca 480

ggccgcagcg atgcgaacgt ggtgcgcgat cgcgatctgg aagtggatac caccctgaaa 540

agcctgagcc agcagattga aaacattcgc agcccggaag gcagccgcaa aaacccggcg 600

cgcacctgcc gcgatctgaa aatgtgccat agcgattgga aaagcggcga atattggatt 660

gatccgaacc agggctgcaa cctggatgcg attaaagtgt tttgcaacat ggaaaccggc 720

gaaacctgcg tgtatccgac ccagccgagc gtggcgcaga aaaactggta tattagcaaa 780

aacccgaaag ataaacgcca tgtgtggttt ggcgaaagca tgaccgatgg ctttcagttt 840

gaatatggcg gccagggcag cgatccggcg gatgtggcga ttcagctgac ctttctgcgc 900

ctgatgagca ccgaagcgag ccagaacatt acctatcatt gcaaaaacag cgtggcgtat 960

atggatcagc agaccggcaa cctgaaaaaa gcgctgctgc tgaaaggcag caacgaaatt 1020

gaaattcgcg cggaaggcaa cagccgcttt acctatagcg tgaccgtgga tggctgcacc 1080

agccataccg gcgcgtgggg caaaaccgtg attgaatata aaaccaccaa aagcagccgc 1140

ctgccgatta ttgatgtggc gccgctggat gtgggcgcgc cggatcagga atttggcttt 1200

gatgtgggcc cggtgtgctt tctgtaa 1227

<210> 3

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met His His His His His His Asp Thr Gln Phe Arg His Tyr Thr Pro

1 5 10 15

Ser Tyr Phe Asn Gln Glu Lys Gly Val Cys Glu Val Leu Phe Tyr Val

20 25 30

His Asn Gln Gly Val Gly Ser Lys Trp Val Glu Gln Leu Lys Val Gly

35 40 45

Asp Asn Tyr Lys Leu Ile Gly Pro Gly Gly Lys Thr Ala Leu Arg Thr

50 55 60

Asp Val Asp Phe His Phe Ile Phe Gly Asp Glu Thr Ser Leu Gly Leu

65 70 75 80

Met Glu Cys Leu Thr Arg Glu Ile Pro Glu Asn Tyr Tyr Cys Leu Ala

85 90 95

Glu Leu Asp Asp Lys Asn Leu Asn Ile Ala Asp Glu Leu Asp Phe Glu

100 105 110

Ile Glu Thr Cys Lys Lys Ser Thr Ile Asn Lys Ala Gln Tyr Ala Ile

115 120 125

Glu Lys Thr Lys Glu Phe Leu Asn Asn Tyr Gln Gly Asn Lys Glu Asn

130 135 140

Ile Ala Phe Tyr Leu Thr Gly Asn Ala Lys Ser Ile Ala Asn Leu Arg

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Asn Thr Leu Thr Lys Leu Gly Ile Asn Gln Lys Thr Gln Ile Gln Thr

165 170 175

Glu Pro Tyr Trp Val Glu Gly Lys Arg Ser Asp Ala Asn Val Val Arg

180 185 190

Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln

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Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn Pro Ala Arg

210 215 220

Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp Trp Lys Ser Gly Glu

225 230 235 240

Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val

245 250 255

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Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr Ile Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys

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325 330 335

Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys

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Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu

355 360 365

Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser

370 375 380

His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys

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Ser Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu Asp Val Gly Ala

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<210> 4

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

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<212> PRT

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Pro Lys Phe Pro Phe Leu Cys Leu Thr Val Ser Gly Gly His Thr Met

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Ile Val Leu Val Lys Asp Tyr Phe Asp Met Glu Ile Ile Gly Lys Thr

130 135 140

Ile Asp Asp Ala Ala Gly Glu Ala Phe Asp Lys Ile Gly Lys Ile Phe

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165 170 175

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Asp Tyr Ser Phe Ser Gly Ile Lys Thr Ser Val Leu Tyr Phe Ile Gln

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<212> DNA

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<212> PRT

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

Asp Ala Phe Gln Gly Phe Val Asp Met Ala Leu Glu Asn Tyr Asn Ile

180 185 190

Gly Ala Ile Ile Pro Glu Lys Glu Thr Gly Leu Ser Val Ala Asp Met

195 200 205

Pro Lys Leu Lys Lys Met Asp Ala Leu Val Val Ala Lys Pro Arg Lys

210 215 220

Pro Phe Ser Asp Glu Glu Lys Val Val Leu Asp Gln Tyr Ile Met Asn

225 230 235 240

Gly Gly Lys Met Leu Trp Met Leu Asp Ala Val Asn Ala Glu Met Asp

245 250 255

Thr Leu Phe Gln Ala Lys Lys Ile Met Ala Tyr Pro Val Asp Leu Asn

260 265 270

Leu Thr Asp Phe Phe Phe Asn Tyr Gly Val Arg Ile Thr Pro Ala Leu

275 280 285

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290 295 300

Thr Thr Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro

305 310 315 320

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325 330 335

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370 375 380

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385 390 395 400

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530 535

<210> 8

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

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<210> 9

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

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Val Arg Val Gly Ala Asn Tyr Leu Arg His Asp Tyr Thr Gly Leu Thr

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Leu Lys Ser Leu Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly

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Asn Leu Asp Ala Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr

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Ser Lys Asn Pro Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser Met

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Thr Asp Gly Phe Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala

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Asp Val Ala Ile Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu Ala

245 250 255

Ser Gln Asn Ile Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met Asp

260 265 270

Gln Gln Thr Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Ser Asn

275 280 285

Glu Ile Glu Ile Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val

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Thr Val Asp Gly Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val

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Ile Glu Tyr Lys Thr Thr Lys Ser Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val

325 330 335

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Gly Pro Val Cys Phe Leu

355

<210> 10

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atgcaccatc accatcacca taacgaagat gcatggtttg acccttatgt aagagttgga 60

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acctatagcg tgaccgtgga tggctgcacc agccataccg gcgcgtgggg caaaaccgtg 960

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<210> 11

<211> 331

<212> PRT

<213> 人工序列

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Met His His His His His His Val Gly Arg Glu Thr Pro Leu Tyr Phe

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260 265 270

Tyr Gln Gln Lys Arg Ala Glu Phe Leu Ser Ile Asn Asp Asp Glu Ala

275 280 285

Leu Lys Ser Ala Phe Asn Leu Thr Lys Thr Glu Gly Ile Ile Pro Ala

290 295 300

Leu Glu Ser Ala His Ala Leu Ala Val Leu Asp Lys Lys Lys Phe Gly

305 310 315 320

Lys Glu Asp Ile Val Val Ile Cys Leu Ser Gly

325 330

<210> 12

<211> 996

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atgcaccatc accatcacca tgtggggcga gaaacaccat tgtattttgc ccccaatttg 60

agccgacaat atggcactaa aatctacctt aaaagagaag atttaaacca tacaggagcc 120

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gtgaataatg aaaaagtcaa tatcattgcg gcagaagctg gtggtttggg cgttcattcc 660

ggagaaactg ctgcaacaac ggctttgggg agcattggcg ttttgcacgg cagtcagagt 720

ttggttattc agaccaaaga cggacaagtg attgagccct actctatttc tgcgggatta 780

gattatccgg ggattggacc gatgcacgcc aatctttacc aacaaaaacg agccgaattt 840

ttaagcatca acgatgatga agctctaaaa tccgcattta atctgactaa aacagaaggt 900

attattccag cgttagaaag tgcccacgcc ttggcggttt tggataaaaa gaagtttgga 960

aaagaagaca ttgttgtcat ctgcctaagt ggttaa 996

<210> 13

<211> 402

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Met His His His His His His Ala Gln Thr Trp Ala Thr Asp Asp Gln

1 5 10 15

Tyr Ile Gln Arg Phe Ala Gly Tyr Ala Val Glu Glu Met Glu Lys Tyr

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Lys Ile Pro Ala Ser Ile Thr Leu Ala Gln Gly Ile Leu Glu Thr Gly

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Gly Gly Gln Ser Arg Leu Ala Gln Glu Gly Asn Asn His Phe Gly Ile

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100 105 110

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115 120 125

Lys Ala Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Arg Tyr Ala Tyr Ile Leu Ile Ser

130 135 140

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145 150 155 160

Val Val Arg Asp Arg Asp Leu Glu Val Asp Thr Thr Leu Lys Ser Leu

165 170 175

Ser Gln Gln Ile Glu Asn Ile Arg Ser Pro Glu Gly Ser Arg Lys Asn

180 185 190

Pro Ala Arg Thr Cys Arg Asp Leu Lys Met Cys His Ser Asp Trp Lys

195 200 205

Ser Gly Glu Tyr Trp Ile Asp Pro Asn Gln Gly Cys Asn Leu Asp Ala

210 215 220

Ile Lys Val Phe Cys Asn Met Glu Thr Gly Glu Thr Cys Val Tyr Pro

225 230 235 240

Thr Gln Pro Ser Val Ala Gln Lys Asn Trp Tyr Ile Ser Lys Asn Pro

245 250 255

Lys Asp Lys Arg His Val Trp Phe Gly Glu Ser Met Thr Asp Gly Phe

260 265 270

Gln Phe Glu Tyr Gly Gly Gln Gly Ser Asp Pro Ala Asp Val Ala Ile

275 280 285

Gln Leu Thr Phe Leu Arg Leu Met Ser Thr Glu Ala Ser Gln Asn Ile

290 295 300

Thr Tyr His Cys Lys Asn Ser Val Ala Tyr Met Asp Gln Gln Thr Gly

305 310 315 320

Asn Leu Lys Lys Ala Leu Leu Leu Lys Gly Ser Asn Glu Ile Glu Ile

325 330 335

Arg Ala Glu Gly Asn Ser Arg Phe Thr Tyr Ser Val Thr Val Asp Gly

340 345 350

Cys Thr Ser His Thr Gly Ala Trp Gly Lys Thr Val Ile Glu Tyr Lys

355 360 365

Thr Thr Lys Ser Ser Arg Leu Pro Ile Ile Asp Val Ala Pro Leu Asp

370 375 380

Val Gly Ala Pro Asp Gln Glu Phe Gly Phe Asp Val Gly Pro Val Cys

385 390 395 400

Phe Leu

<210> 14

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgcaccatc accatcacca tgctcagaca tgggcaacag atgaccaata tatccagcgt 60

tttgcaggat atgccgtaga agaaatggaa aaatataaaa ttccagcaag tattactttg 120

gcacaaggga tattagaaac aggaggtggg caatctcgct tagcacaaga aggtaacaat 180

cactttggga ttaaatgtaa ggaagattgg actggcaaaa ccatgaggca taccgatgat 240

gctcctaacg aatgtttccg tgtgtataac gacccaaagg agtcttacga agaccattct 300

aagtttttag cttatcgtaa atactatact aatctgttta aacttgatcc aaaggattat 360

aaagcttggg ctcatggact taaaaaagcg gggtatgcta ccaatcctag atatgcttat 420

attttgataa gcaaaataga aaagtataaa ttatacgagt ttgatcgcag cgatgcgaac 480

gtggtgcgcg atcgcgatct ggaagtggat accaccctga aaagcctgag ccagcagatt 540

gaaaacattc gcagcccgga aggcagccgc aaaaacccgg cgcgcacctg ccgcgatctg 600

aaaatgtgcc atagcgattg gaaaagcggc gaatattgga ttgatccgaa ccagggctgc 660

aacctggatg cgattaaagt gttttgcaac atggaaaccg gcgaaacctg cgtgtatccg 720

acccagccga gcgtggcgca gaaaaactgg tatattagca aaaacccgaa agataaacgc 780

catgtgtggt ttggcgaaag catgaccgat ggctttcagt ttgaatatgg cggccagggc 840

agcgatccgg cggatgtggc gattcagctg acctttctgc gcctgatgag caccgaagcg 900

agccagaaca ttacctatca ttgcaaaaac agcgtggcgt atatggatca gcagaccggc 960

aacctgaaaa aagcgctgct gctgaaaggc agcaacgaaa ttgaaattcg cgcggaaggc 1020

aacagccgct ttacctatag cgtgaccgtg gatggctgca ccagccatac cggcgcgtgg 1080

ggcaaaaccg tgattgaata taaaaccacc aaaagcagcc gcctgccgat tattgatgtg 1140

gcgccgctgg atgtgggcgc gccggatcag gaatttggct ttgatgtggg cccggtgtgc 1200

tttctgtaa 1209

Claims

1.一种预防鸭传染性浆膜炎的组合物，其特征在于，所述组合物中含有鸭传染性浆膜炎的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白；

所述TbdR1-T3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，SI-T3P蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，CAMP蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，GldG-T3蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；OmpA-T3蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，TrpB蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，HA-T3蛋白片段的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示；

所述组合物中的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白的总含量为50～150 μg/mL；

所述组合物中的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白的比例为1:1:1:1:1:1:1。

2.一种预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗中含有鸭传染性浆膜炎的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白；

疫苗中的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白的总含量为50～150 μg/mL；

疫苗中的TbdR1-T3、SIP-T3、CAMP、GldG-T3、OmpA-T3、TrpB及HA-T3重组蛋白的比例为1:1:1:1:1:1:1。

3.根据权利要求2所述的预防鸭传染性浆膜炎三价基因工程亚单位疫苗，其特征在于，疫苗中还包括佐剂，所述佐剂为铝盐佐剂、脂质体佐剂、纳米颗粒佐剂、皂苷佐剂。

4.一种权利要求1所述组合物或权利要求2所述三价基因工程亚单位疫苗在制备预防鸭疫李默氏杆菌病感染的药物中的应用。