CN111939248A - 一种b型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法和应用，具体采用B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210基因的Region2(B‑HMTp210‑R2)为免疫原制备B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗，并对其核苷酸序列进行了优化。本发明将优化后的核苷酸序列克隆到PET‑30a表达载体中并转化BL21宿主菌，使得B‑HMTp210‑R2的可溶表达量显著提高2倍以上，并且稳定性显著提升。本发明据此制备得到的B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗具有较高的安全性和免疫效果，能够快速诱导免疫动物产生高水平的中和抗体，实现B型鸡传染性鼻炎的高效免疫保护。本发明的亚单位疫苗的制备过程简单，成本低廉，易于大规模生产。

Description

一种B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，具体涉及一种B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

鸡传染性鼻炎(Avian infectious coryza)是由副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)感染引起的一种鸡急性上呼吸道传染病。目前该病在鸡养殖领域已引起多种问题，特别是对蛋鸡的生产性能造成很大的影响。该病主要造成育成鸡生长不良和产蛋鸡产蛋明显下降，并可使肉鸡淘汰率明显升高，造成很大的经济损失。

副鸡禽杆菌为巴氏杆菌科的一种短小革兰氏阴性杆菌，Page等人将副鸡禽杆菌分为A、B和C三种血清型，后由研究表明A、B、C三个血清型的副鸡禽杆菌对鸡均有不同程度的致病力，且三种血清型之间交叉免疫保护力较弱。随着鸡传染性鼻炎等细菌病发病率的增加，临床上大量药物的使用等因素的影响，鸡传染性鼻炎菌株耐药性普遍增强，药物敏感度下降致使治疗效果亦受到了较大影响，市场对传染性鼻炎疫苗尤其是高品质疫苗的需求逐渐增加。目前市场上有二价疫苗、三价疫苗等多种防控鼻炎的疫苗产品，尤其是A、B、C全菌三价疫苗能够对所有的鼻炎血清型提供保护，因而市场容量较大。但由于副鸡禽杆菌属于苛生菌，培养成本较高，而且全菌灭活疫苗中含有大量的菌体蛋白、内毒素、其他毒性物质以及附加物等因素，易造成较为严重的副反应，在接种部位还会形成局灶性坏死斑。

发明内容

为了至少解决现有技术存在的一个问题，本发明提供了一种B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法和应用，通过优化B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的氨基酸序列显著提高其表达水平和稳定性。

第一方面，本发明提供一种B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗，所述B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗的抗原成分为B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2，所述B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，编码所述B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

进一步地，在所述B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗中，所述B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的含量为5～50μg/mL。

进一步地，所述B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗还包括佐剂，所述佐剂包括：包括：90～100份矿物油，1～2份硬脂酸铝，6～8份司本80。

本发明经过研究优化了B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的核苷酸序列，优化后，HMTp210-R2蛋白的表达水平显著提升2倍以上，稳定性也得到显著提升，可以在低温下至少保存6个月。

第二方面，本发明提供所述B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗的制备方法，包括：表达B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2，所述B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述表达为通过将如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列连接至表达载体，转化至宿主细胞后进行表达。

进一步地，所述表达载体为pET28、pET30、pET32中的一种或多种。

进一步地，所述宿主细胞为肠杆菌属细菌。

本发明进一步提供用于编码B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的核酸，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明进一步提供含有所述核酸的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

本发明进一步提供所述B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗、所述核酸和所述生物材料在鸡传染性鼻炎的免疫中的应用。

本发明具备如下有益效果：

本发明对B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的核苷酸序列进行了优化，显著提升其表达水平和稳定性，表达水平提高2倍以上，在4℃条件下可以保存6个月以上。以优化后的HMTp210-R2蛋白作为抗原制备的亚单位疫苗具有安全性高、免疫效力好的技术效果，在免疫动物后，能够快速诱导高水平的中和抗体的产生，实现B型鸡传染性鼻炎的高效免疫保护，免疫效果优于全菌灭活疫苗，且疫苗的制备过程简单，成本低，易于大规模生产。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的优化前和优化后的B-HMTp210-R2表达水平的变化；其中1-2泳道为1mg/mL BSA，0.5mg/mL BSA，3泳道为Marker，4-5泳道为pET30a-B-HMTp210-R2上清，pET30a-B-H MTp210-R2-OPTI上清；

图2为本发明实施例2提供的B-HMTp210-R2的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，1泳道为Marker，2-4泳道分别为0.5，1，2mg/ml BS A蛋白标准，5-7泳道分别为5μL，7.5μL和10μLpET30a-B-HMTp210-R2-OPTI表达上清；

图3为本发明实施例2提供的B-HMTp210-R2的SDS-PAGE电泳的稳定性检测结果，其中，1泳道为Marker，2泳道为新制备B-HMTp210-R2蛋白，3泳道为4度保存1个月B-HMTp210-R2蛋白，4泳道为4度保存3个月B-HMTp210-R2蛋白，5泳道为4度保存6个月B-HMTp210-R2蛋白。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1、B-HMTp210-R2核苷酸序列的优化

为提高目的蛋白的表达量、可溶性表达水平和稳定性，本实施例对B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白B-HMTp210-R2的核苷酸序列(如SEQ ID NO.3所示)以及氨基酸序列进行了多方面优化。本发明经过大量筛选和对比实验，最终确定B-HMTp210-R2核苷酸序列优化方案(优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)：

2、B-HMTp210-R2蛋白的可溶性表达

合成上述经核苷酸序列优化的B-HMTp210-R2基因序列，将核苷酸序列优化前、后的B-HMTp210-R2分别经Nde I/Xho I酶切后克隆到pET-30a载体中，得到的重组表达载体分别命名为pET30a-B-HMTp210-R2和pET30a-B-HMTp210-R2-OPTI。将pET30a-B-HMT p210-R2和pET30a-B-HMTp210-R2-OPTI重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，将得到的重组菌接种至卡那抗性培养基，37℃震荡培养4-5h，至OD₆₀₀达到0.8左右后加入IPTG，16℃诱导15h。收获菌体，超声破碎后离心，SDS-PAGE电泳，表达情况如图1。结果表明，经核苷酸序列优化后，B-HMTp210-R2蛋白的可溶表达量提高了2倍以上。

实施例2

本实施例提供一种B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗的制备流程，具体步骤如下：

1、B-HMTp210-R2蛋白的表达：

(1)基因工程菌活化，取实施例2中构建的工程菌pET30a-B-H MTp210-R2-OPTI甘油菌10μL接种于5ml卡那抗性LB培养基，震荡培养过夜；

(2)按1:200比例接种200mL卡那抗性培养基，37℃震荡培养4-5h，至OD600值达到0.8左右；

(3)按1:2000加入IPTG，16℃诱导15h；

(4)收集菌体；

(5)用20mL专用buffer重悬细菌；

(6)超声破碎细菌；

(7)12000rpm离心10min，离心2次；

(8)加入40％硫酸铵沉淀目的蛋白，12000rpm离心10min，沉淀再用20ml专用Buffer重悬。

(9)加入1％曲拉通X114去除内毒素。

(10)SDS-PAGE电泳检测蛋白浓度。

SDS-PAGE电泳检测结果如图2所示，其中，1泳道为Marker，2-4泳道分别为0.5，1，2mg/ml BSA蛋白标准，5-7泳道分别为5μL，7.5μL和10μL pET30a-B-HMTp210-R2-OPTI表达上清。经过灰度分析测算，计算B-HMTp210-R2抗原浓度。

2、B-HMTp210-R2蛋白的稳定性

将本实施例中1获得B-HMTp210-R2蛋白放置4℃冰箱，分别在1个月，3个月和6个月取样，进行SDS-PAGE，结果显示B-HMTp210-R2蛋白在4℃冰箱放置6个月未见明显降解，因此配制疫苗后相比现有全菌疫苗具有更好的稳定性和更长的保存期。检测结果见图3，其中，1泳道为Marker，2泳道分别为新制备B-HMTp210-R2蛋白，3泳道分别为4度保存1个月B-HMTp210-R2蛋白，4泳道分别为4度保存3个月B-HMTp210-R2蛋白，5泳道分别为4度保存6个月B-HMTp210-R2蛋白。

3、B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗的制备

(1)油相制备：取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备管中混合均匀并加热至80℃后，再加入5份司本80，至温度达到115℃时维持30分钟，冷却后完成油相制备；

(2)水相制备：取上述制备的B型鸡传染性鼻炎亚单位抗原，按照20μg/羽份制备B型鸡传染性鼻炎亚单位灭活疫苗。取抗原液95份，加入灭菌的5份吐温80，充分混匀；

(3)乳化：取2份油相，1份水相，放入乳化罐中，3500r/min搅拌5分钟，8000r/min搅拌15分钟，完成乳化制备，得到亚单位疫苗。

4、亚单位疫苗的检验

①性状

外观：乳白色均匀乳剂。

剂型：油包水型，取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，除第一滴外，均未扩散。

稳定性：吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相不超过0.5mL。

②无菌检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果表明，无菌生长。

实施例3

本实施例对实施例2制备得到的B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗进行效力分析，具体如下：

(1)最小使用日龄、不同途径一次单剂量接种的安全性试验

将70只7日龄SPF鸡分成4组，1～3组免疫组各为20只，第4组对照组10只，1～3组免疫组每组再分成两小组，每小组各10只SPF鸡，通过不同的免疫途径(肌肉注射或颈部皮下注射)分别接种B型鸡传染性鼻炎亚单位灭活疫苗(批次分别为20190712，20190805和20190820，制备方法同实施例2)，剂量为0.5mL/只；对照组10只SFP鸡颈部皮下注射灭菌生理盐水，剂量为0.5mL/只。各组鸡在同条件下分别饲养管理，连续观察14日；如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变；观察活鸡有无不良反应。接种后14天将存活的鸡全部剖杀，观察内脏有无病变。最小使用日龄不同途径单剂量接种的安全试验的结果如表1所示。

表1最小使用日龄、不同途径单剂量接种的安全性试验结果

(2)单剂量重复接种的安全性试验

将40只14日龄SPF鸡分成4组，每10只，实验组1、实验组2和实验组3分别通过颈部皮下注射B型鸡传染性鼻炎亚单位灭活疫苗(批次分别为20190712，20190805和20190820，制备方法同实施例2)，剂量为0.5mL/只；对照组的10只SPF鸡颈部皮下注射0.5mL/只灭菌生理盐水。在同条件下饲养管理，连续观察14日；观察鸡只有无不良反应，如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变。

于第一次免疫后14天再以同样剂量重复接种，继续观察14天，观察鸡只有无不良反应，如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变。对鸡只的局部炎症、组织病变等进行评判。第二次免疫后14天将存活的鸡全部剖杀，观察注射部位及内脏有无病变。单剂量重复接种安全性试验的结果如表2所示。

表2单剂量重复接种的安全性试验结果

(3)一次超剂量接种安全性试验

将40只14日龄SPF鸡分成4组，每10只，实验组1、实验组2和实验组3分别通过颈部皮下注射批号为20190712、20190805和20190820的B型鸡传染性鼻炎亚单位灭活疫苗，剂量为2.0mL/只；对照组10只颈部皮下注射2.0mL/只灭菌生理盐水。在同条件下饲养管理，连续观察14日，将存活的鸡全部剖杀，观察注射部位及内脏有无病变。超剂量接种的安全性试验的结果如表3所示。

表3超剂量接种的安全性试验结果

疫苗批号	免疫日龄	试验鸡数	免疫剂量	免疫途径	结果判定
						20190712	21	10只	2mL	颈部皮下	正常
20190805	21	10只	2mL	颈部皮下	正常
						20190820	21	10只	2mL	颈部皮下	正常
对照	21	10只	2mL	颈部皮下	正常

2、B型鸡传染性鼻炎亚单位灭活疫苗的免疫效力分析

取10日龄SPF鸡60只，分成6组，每10只，1～3组分别于免疫3批B型鸡传染性鼻炎亚单位灭活疫苗(批号分别为20190712、20190805和20190820)，每只0.5mL。第4组为B型全菌灭活疫苗对照组(免疫注射0.5mL)，第5组非免疫攻毒对照组，免疫注射0.5mL/只PBS，第6组为健康对照组。免疫后28天用2X105.0CFU/只的剂量进行攻毒，攻毒途径为眶下窦内注射，连续观察7日，记录临床症状(包括面部一侧或两侧眶下窦及周围肿胀以及流泪、流涕等)。结果表明，采用实施例2的方法制备的亚单位疫苗具有良好的免疫原性，能够快速、有效地诱导高水平中和抗体的产生，攻毒后实现了90％以上的免疫保护，优于全菌疫苗组，未免疫鸡攻毒后100％发病，并且具有明显的鸡传染性鼻炎的临床症状。

表4B型鸡传染性鼻炎亚单位灭活疫苗免疫效力的检验

组别	攻毒剂量	SPF鸡数量	保护情况
				20190712	2×10<sup>5.0</sup>CFU/只	10	9/10保护
20190805	2×10<sup>5.0</sup>CFU/只	10	10/10保护
				20190820	2×10<sup>5.0</sup>CFU/只	10	9/10保护
全菌疫苗组	2×10<sup>5.0</sup>CFU/只	10	8/10保护
				未免疫对照组	2×10<sup>5.0</sup>CFU/只	10	0/10保护
健康对照组	/	10	10/10正常

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 乾元浩生物股份有限公司

<120> 一种B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法和应用

<130> KHP201112909.5

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Ile Gly Gly Thr Gly Gln Asp Thr

1 5 10 15

Ile His Asp Ala Ile Asn Asn Val Leu Thr Lys Leu Ile Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Thr Glu Glu Glu Val Val Ser Gly Glu Pro Val Tyr Glu Pro Leu

35 40 45

Lys Gly Ala Lys Pro Thr Val Ser Ala Glu Ala Asn Lys Asp Ile Thr

50 55 60

Gly Leu Val Asp Val Val Lys Lys Ala Asn Ser Pro Ile Thr Val Glu

65 70 75 80

Pro Ser Thr Asp Asn Asn Lys Lys Lys Thr Phe Thr Val Gly Leu Met

85 90 95

Lys Asp Ile Glu Gly Val Asn Ser Ile Thr Phe Asp Lys Ser Gly Gln

100 105 110

Asp Pro Asn Gln Val Thr Gly Arg Met Ser Ser Ala Gly Leu Thr Phe

115 120 125

Lys Lys Gly Asp Thr Thr Asn Gly Ser Thr Thr Thr Phe Ala Glu Asp

130 135 140

Gly Leu Thr Ile Asp Ser Thr Thr Asn Ser Ala Gln Thr Asn Leu Val

145 150 155 160

Lys Val Ser Arg Asp Gly Phe Ser Val Lys Asn Gly Ser Asp Glu Ser

165 170 175

Lys Leu Ala Pro Thr Lys Leu Ser Ile Gly Ala Glu Asn Ala Glu His

180 185 190

Val Glu Val Thr Lys Ser Gly Ile Ala Leu Lys Ala Asp Asn Thr Ser

195 200 205

Asp Lys Ser Arg Ile Thr Leu Ala Gln Asp Ala Ile Thr Leu Ala Gly

210 215 220

Asn Ala Thr Gly Thr Ala Ile Lys Leu Thr Gly Val Ala Asp Gly Asn

225 230 235 240

Ile Thr Ala Asn Ser Lys Asp Ala Val Asn Gly Gly Gln Leu Arg Thr

245 250 255

Leu Leu Gly Val Asp Ser Gly Ala Lys Ile Gly Gly Thr Glu Lys Thr

260 265 270

Thr Ile Ser Glu Ala Ile Ser Asp Val Lys Gln Ala Leu Thr Asp Ala

275 280 285

Thr Leu Val Tyr Lys Ala Asp Asn Lys Asn Gly Lys Thr Val Lys Leu

290 295 300

Thr Asp Gly Leu Asn Phe Thr Ser Thr Thr Asn Ile Gly Ala Ser Val

305 310 315 320

Glu Asp Ser Gly Val Val Lys Phe Thr Leu Lys Asp Arg Leu Thr Gly

325 330 335

Leu Lys Thr Ile Val Thr Glu Ser Leu Asn Ala Ser Gln Asn Ile Ile

340 345 350

Ala Gly Gly Thr Val Thr Val Gly Gly Glu Thr Glu Gly Ile Val Leu

355 360 365

Thr Lys Ser Gly Ser Gly Asn Asp Arg Thr Leu Ser Leu Ser Gly Ala

370 375 380

Gly Asn Ala Ala Thr Asp Gly Ile Lys Val Ser Gly Val Lys Ala Gly

385 390 395 400

Thr Ala Asp Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly Gln Leu Asp Lys Leu Phe

405 410 415

Lys Ala Ile Asn Asp Ala Leu Gly Thr Thr Asp Leu Ala Val Thr Lys

420 425 430

Asn Pro Asn Gln Thr Ser Ile Phe Asn Pro Ile Asn Gly Thr Ala Pro

435 440 445

Thr Thr Phe Lys Asp Ala Val Asp Lys Leu Thr Thr Ala Val Asn Thr

450 455 460

Gly Trp Gly Ser Lys Val Gly Ile Leu Ala Thr Gly Ile Asp Gly Ile

465 470 475 480

Asp Ala Gly Asn Lys Lys Ile Ser Asn Val Ala Asp Gly Asp Ile Ser

485 490 495

Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Thr Gly Arg Gln Leu Tyr Ala Leu Met

500 505 510

Gln Lys Gly Ile Arg Val Tyr Gly Asp Glu Val Ser Pro Thr Lys Thr

515 520 525

Gln Thr Thr Ala Pro Thr Ala Ser Ser Thr Gln Gly

530 535 540

<210> 2

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatggcacca ttacctttac caatattggc ggcaccggcc aagataccat ccacgatgcg 60

attaataatg ttctgaccaa attgatctcg ctgtcggcaa ccgaagaaga agtggtgtcg 120

ggcgaacctg tctatgaacc actgaaaggt gcaaaaccaa ccgtttcggc agaagccaac 180

aaagacatta ctggcttggt ggatgtggtg aaaaaagcaa attcgccgat caccgttgag 240

ccttctaccg ataacaacaa gaaaaaaacc ttcactgtcg gcttaatgaa agacattgaa 300

ggcgtgaaca gcattacctt tgataagtcg ggccaagatc caaatcaagt taccggccgc 360

atgagcagcg cgggtttaac cttcaaaaaa ggcgacacca ccaatggttc gaccaccact 420

tttgcagaag atggcttaac cattgatagc accaccaatt ctgctcaaac caacttagtg 480

aaagtgagcc gtgatggctt ctcggtgaaa aatggcagcg atgaaagcaa attagccccg 540

accaaattat ctatcggtgc ggaaaatgca gaacacgttg aagtgactaa atcgggcatt 600

gccttaaaag cggataacac ctccgataaa tctcgcatca ccttagccca agatgcgatt 660

actctggcgg gcaacgcaac cggcaccgcg attaaattga ctggtgttgc agatggcaac 720

attaccgcaa attcgaaaga tgcggtgaat ggcggccagt tgcgtacctt attaggcgtt 780

gatagcggcg ctaaaattgg cggtactgag aaaaccacca tcagcgaagc catttctgat 840

gtgaagcaag ctctgaccga tgcgaccttg gtgtataaag cggacaataa aaacggtaaa 900

accgttaaat tgactgacgg cttgaatttt actagcacca ccaatattgg cgcctcggtg 960

gaagatagcg gtgtggtgaa attcacctta aaagatcgct taaccggctt aaaaactatc 1020

gtgactgagt ctttgaatgc ttctcaaaac attattgctg gcggcaccgt gaccgtgggc 1080

ggcgagaccg agggcattgt gctgaccaaa tctggctcgg gcaatgaccg cactttatct 1140

ttatctggtg caggcaatgc agcaaccgat ggcattaaag tctctggcgt gaaagcaggc 1200

accgcagaca ccgatgcggt gaataaaggt cagttagata aactgtttaa agcgatcaat 1260

gacgcattag gcaccaccga tttagcggtg accaaaaatc caaatcaaac ctctatcttt 1320

aatccgatta acggcaccgc tccaaccacc tttaaagacg cggtggataa attaaccacc 1380

gctgtgaata ccggttgggg ctcgaaggtg ggtattttgg caaccggtat tgatggtatt 1440

gatgctggca ataagaaaat tagcaatgtc gccgatggcg atatttctcc aaccagcggt 1500

gatgtggtga ccggtcgtca gctgtacgcc ttaatgcaga aaggtattcg cgtgtatggt 1560

gatgaagtta gcccaaccaa gactcaaacc accgcaccta ccgcatctag cactcaaggt 1620

<210> 3

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatggcacaa ttacatttac aaatattggc ggcacagggc aagatacaat ccacgatgcg 60

attaataatg ttctcaccaa attgatctcg ctttcggcaa cagaagaaga agtggtgtca 120

ggggaacctg tctatgaacc acttaaaggt gcaaaaccaa cggtttcagc agaagccaac 180

aaagacatta ctggcttggt ggatgtggtg aaaaaagcaa attcaccgat cacagttgag 240

ccttctaccg ataacaacaa gaaaaaaacc ttcactgtcg gcttaatgaa agacattgaa 300

ggggtaaaca gcattacctt tgataagtca gggcaagatc caaatcaagt tacgggcaga 360

atgagcagtg cgggtttaac cttcaaaaaa ggcgacacaa caaatggttc aaccaccact 420

tttgcagaag atggcttaac cattgatagc acaacaaatt ctgctcaaac aaacttagtg 480

aaagtaagtc gtgatggctt ctcggtgaaa aatggcagcg atgaaagcaa attagccccg 540

acaaaattat ctatcggtgc ggaaaatgca gaacacgttg aagtaactaa atcgggcata 600

gccttaaaag cggataacac ctccgataaa tctcgcatca ccttagccca agatgcgatt 660

actcttgcgg ggaacgcaac cggaacggcg attaaattga ctggtgttgc agatggcaac 720

attacggcaa attcaaaaga tgcggtaaat ggggggcagt tgcgtacgtt attaggggtt 780

gatagcgggg ctaaaattgg cggtactgag aaaacaacga tcagtgaagc catttctgat 840

gtgaagcaag ctcttaccga tgcgacattg gtatataaag cggacaataa aaacggtaaa 900

acagttaaat tgactgacgg attgaatttt actagcacga ccaatattgg cgcctcagta 960

gaagatagtg gtgtggtgaa attcacctta aaagatcgat taacaggctt aaaaactatc 1020

gtaactgagt ctttgaatgc ttctcaaaac attattgctg gcggcacagt aaccgtgggc 1080

ggcgagacag agggcattgt gctaacaaaa tctggctcag gaaatgaccg cactttatct 1140

ttatctggtg caggcaatgc agcaacagat ggcattaaag tctctggcgt gaaagcaggg 1200

acggcagaca ccgatgcggt gaataaaggt cagttagata aactttttaa agcgatcaat 1260

gacgcattag gcacaacaga tttagcggta accaaaaatc caaatcaaac ctctatcttt 1320

aatccgataa acggcacggc tccaaccacc tttaaagacg cggtggataa attaaccacc 1380

gctgtgaata caggttgggg atcaaaggta ggtattttgg caacaggtat tgatggtatt 1440

gatgctggga ataagaaaat tagtaatgtc gccgatgggg atatttctcc aaccagtggt 1500

gatgtagtga caggtcgtca gctctacgcc ttaatgcaga aaggtattcg cgtgtatggt 1560

gatgaagtta gtccaacgaa gactcaaaca acagcaccta cagcatctag cactcaaggt 1620

Claims (10)

1.一种B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗，其特征在于，所述B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗的抗原成分为B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2，所述B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗，其特征在于，编码所述B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗，其特征在于，在所述B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗中，所述B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的含量为5～50μg/mL。

4.根据权利要求1-3任一项所述的B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗，其特征在于，还包括佐剂，所述佐剂以重量份计，包括：90～100份矿物油，1～2份硬脂酸铝，6～8份司本80。

5.权利要求1-4任一项所述B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括：表达B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2，所述B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述表达为通过将如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列连接至表达载体，转化至宿主细胞后进行表达。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pET28、pET30、pET32中的一种或多种，和/或，所述宿主细胞为肠杆菌属细菌。

8.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码B型鸡传染性鼻炎外膜蛋白HMTp210-R2，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

9.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求8所述核酸，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

10.权利要求1-4任一项所述B型鸡传染性鼻炎亚单位疫苗或权利要求8所述核酸或权利要求9所述生物材料在鸡传染性鼻炎的免疫中的应用。

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