CN113135986B - 用于防治毒害艾美耳球虫的重组多肽及疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽用生物制品领域，具体而言，涉及一种用于防治毒害艾美耳球虫的重组多肽及疫苗。通过免疫毒害艾美耳球虫重组多肽疫苗EN‑NAVA蛋白，能有效控制鸡体感染毒害艾美耳球虫，大大降低养鸡场抗球虫药的使用量，有效控制鸡球虫病。

Description

用于防治毒害艾美耳球虫的重组多肽及疫苗

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，具体而言，涉及一种用于防治毒害艾美耳球虫的重组多肽及疫苗。

背景技术

毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix,E.necatrix)是一种专性细胞内寄生的顶复门原虫，可引起严重危害集约化养鸡业生产的鸡球虫病。在无预防措施或预防失败(如因抗药性问题致药物无效)的情况下，鸡发病率可达30％-100％，致死率可高达80％。全球每年因鸡球虫病引起的经济损失超过30亿美元以上。目前对鸡球虫病的防控仍主要是执行“在饲料中添加各种抗球虫药进行药物防控”和“活卵囊疫苗进行疫苗防控”的技术方法。但鸡球虫广泛而严重的抗药性，以及活卵囊疫苗存在的潜在散毒风险使鸡球虫病的防控面临严峻挑战，新的抗球虫药物及疫苗研制成为亟待解决的问题。然而，人们至今对球虫与宿主细胞的详细互作机制尚无系统认识，造成新型抗球虫药物及分子疫苗的研制面临巨大困难。

微线蛋白是一种在顶复门原虫中高度保守的微线分泌蛋白，可以和棒状体分泌的颈部蛋白共同形成“运动结合体(Moving Junction)”，共同完成虫体与宿主细胞的粘附作用，是协助虫体进入宿主细胞的关键物质。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一方面涉及重组多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示。

本发明的第二方面涉及分离的核酸，其编码如上所述的重组多肽。

本发明的第三方面涉及载体，其具有如上所述的核酸。

本发明的第四方面涉及宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸，或如上所述的载体。

本发明的第五方面涉及如上所述的重组多肽的制备方法，包括：

在适宜的条件下培养如上所述的宿主细胞，收集培养液和/或所述宿主细胞的裂解液，分离纯化得到所述重组多肽。

本发明的第六方面涉及疫苗，其含有如上所述的重组多肽、如上所述的核酸或如上所述的载体。

本发明的第七方面涉及成套试剂盒，其包含如上所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

本发明的第八方面涉及如上所述的重组多肽、如上所述的核酸或如上所述的载体在制备用于防治毒害艾美耳球虫的药物中的应用。

本发明的有益效果为：

通过免疫毒害艾美耳球虫重组多肽疫苗EN-NAVA蛋白，能有效控制鸡体感染毒害艾美耳球虫，大大降低养鸡场抗球虫药的使用量，有效控制鸡球虫病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中毒害艾美耳球虫重组多肽疫苗EN-NAVA真核表达质粒在DF-1细胞中表达的WB分析(M.蛋白质分子质量标准；1.DF-1细胞总蛋白；2.原核表达阳性对照；3.pCDA3.1-EN-NAVA1转染至DF-1细胞中的表达产物)；

图2为本发明一个实施例中毒害艾美耳球虫重组多肽疫苗EN-NAVA表达产物SDS-PAGE电泳分析图(M.蛋白质分子质量标准；1.未诱导菌液；2.37℃诱导后菌液；3-4.纯化后重组表达蛋白)；

图3为本发明一个实施例中毒害艾美耳球虫重组多肽疫苗EN-NAVA表达产物的WB图(M.蛋白质分子质量标准；1-2.pET30a-EN-NAVA2重组纯化蛋白)。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及重组多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示。

本发明还涉及分离的核酸，其编码如上所述的重组多肽。

核酸可以为DNA或RNA。

在一些实施方式中，所述的核酸针对宿主进行密码子优化。

在一些实施方式中，所述的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

此外，本领域技术人员容易得知，所述重组多肽的氨基酸序列还可以与选自SEQID NO：3的氨基酸序列实质上相似的序列。所述核酸的核苷酸序列还可以与选自SEQ IDNO：1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列实质上相似的序列。“实质上相似”意指给定核酸或氨基酸序列与参比序列共有至少95％的同一性，例如，96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％。或者，意指给定核酸或氨基酸序列与参比序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核酸或氨基酸的区别，对于多肽，这种区别优选为氨基酸的置换或者缺失。优选地，实质上相似的序列亦保留多肽的能够检测内源性抗体效率高的独特活性。通常置换视为保守置换，例如在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。

本发明还涉及载体，其具有如上所述的核酸。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

本发明还涉及宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸，或如上所述的载体。

术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞优选为真核细胞，更优选为禽类动物细胞。宿主细胞通常不具有全能性的动物细胞(优选禽类细胞，例如鸡细胞)，例如不包括受精卵、胚胎、生殖干细胞、胚胎干细胞等。

本发明还涉及如上所述的重组多肽的制备方法，包括：

在适宜的条件下培养如上所述的宿主细胞，收集培养液和/或所述宿主细胞的裂解液，分离纯化得到所述重组多肽。

本发明还涉及疫苗，其含有如上所述的重组多肽、如上所述的核酸或如上所述的载体。

在一些实施方式中，所述的疫苗进一步包含佐剂和/或药学上可接受的载体。

如本文所使用，“佐剂”是这样的物质，其能够有利于或放大免疫学事件级联，最终导致更好的免疫应答，即针对抗原的整合的身体应答。佐剂通常不是免疫应答发生所需的，但有利于或放大该应答。

佐剂还可以为铝盐、脂质体、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、明矾佐剂、MF59、单磷酰脂质A、鞭毛蛋白、CpG-ODN以及Poly(I：C)中的至少一种。在一些实施方案中，所述铝盐选自磷酸铝、磷酸铝钾和氢氧化铝。其他众所周知的佐剂包括烃油、聚合物、皂苷类和/或由水中的丙烯酸钠的凝胶颗粒构成的佐剂，例如，MONTANIDETM PET GEL ATM(Seppic,ParisFrance)。一种低分子量共聚物佐剂可以在溶液中形成交联以变成高分子量凝胶，例如POLYGENTM(MVPLaboratories,Omaha)。当添加时，疫苗中的佐剂的量通常在约1％～20％(v/v)之间。在具体实施方案中，所述佐剂的量在约2％～10％(v/v)之间。在更具体实施方案中，所述佐剂的量在约3％～6％(v/v)之间。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的油包水乳液。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的水包油乳液。

疫苗典型地被配制用于肠胃外施用。典型的免疫接种是通过皮下(SC)或肌内(IM)注射实现，但本发明还考虑了鼻腔途径的疫苗接种、或者口腔、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)注射实现。或者，所述疫苗还可以经由皮肤贴剂、在延迟释放植入物中、划痕或局部施用进行施用。还可以经由受体禽类的饮用水和/或食物进行施用。

上述疫苗是以与剂量配方相容的方式，以及诸如治疗有效量和免疫原性有效量的用量被施用的。施用量取决于接受治疗的对象、该对象的免疫系统合成抗体的能力，以及预期的保护程度。需施用的活性成分的准确数量取决于医师的判断，个体不同，用量也不同。最初施用和加强接种的合适方案也可变化，但典型地在首次施用后的一定间隔时间(数周或数月)后再进行1次注射或以其它方式施用。

“药学上可接受的载体”意在帮助疫苗的稳定和施用，同时无害且被目标良好耐受。此类载体可以例如是无菌水或无菌生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体可以例如是缓冲液，其可以包含进一步的添加剂，例如稳定剂或防腐剂。水或水溶液盐水溶液和糖(例如，右旋糖和/或甘油)水溶液可以用作载体，特别是用于可注射溶液。此外，所述载体可以是和/或包含水胶体和/或聚合物溶液，例如，以使待喷在禽类上的禽类疫苗变稠。

在一些实施方式中，所述的疫苗进一步包含灭活的病毒和/或灭活的细菌(例如菌苗)和/或菌苗的抗原。这可以以任何合适的方式，例如作为“活”减毒、灭活或亚单位抗原衍生自对禽类致病的该微生物。

源自对禽类致病的微生物的额外抗原优选源自一种或多种选自以下组的微生物：

-病毒：传染性支气管炎病毒、NDV、减蛋综合征病毒、IBDV、鸡贫血病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽痘病毒、火鸡鼻气管炎病毒、鸽痘病毒、MDV、禽白血病病毒、ILTV、禽肺病毒和呼肠孤病毒；

-细菌；大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、鼻气管鸟杆菌(Ornitobacteriumrhinotracheale)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)、多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、丹毒种(Erysipelas)、支原体属(Mycoplasma)和梭菌属(Clostridium)；

-寄生虫：艾美虫属(Eimeria)；和

-真菌：曲霉属(Aspergillus)。

根据本发明的再一方面，还涉及成套试剂盒，其包含如上所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

接种容器优选为医用注射器或者滴鼻器。

根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的重组多肽、如上所述的核酸或如上所述的载体在制备用于防治毒害艾美耳球虫的药物中的应用。

本发明进一步提供了保护禽类免于毒害艾美耳球虫感染的方法，其包括给所述动物施用预防有效量/治疗有效量的根据本发明的疫苗。

术语“禽类”是指野生或经过驯化的鸡、鸭、鹅、天鹅、大雁、鸽子、鹌鹑等禽类，其中特别是鸡。

影响优选剂量方案的因素可以包括例如主体的物种或品种(例如禽类的物种或品种)、年龄、重量、饮食、活动、肺大小，和状况；施用途径；使用的特定疫苗的功效、安全性和免疫持续时间概况；是否使用递送系统；以及疫苗是否作为药物和/或疫苗组合的一部分施用。因此，实际上采用的剂量可以对于特定动物不同，并且因此可以偏离上文所述的典型剂量。这样的剂量调整的确定通常在使用常规方法的疫苗开发领域技术人员的技术内。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例

1 EN-NAVA编码基因的制备

1.1编码基因的优化

根据申请人团队获得的毒害艾美耳球虫微线蛋白及棒状体颈部蛋白所编码的相关基因进行生物信息学分析，筛选微线蛋白(208个氨基酸)和棒状体颈部蛋白2(125个氨基酸)作为候选串联多肽，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，使用在线密码子优化软件针对不同宿主进行密码子优化，分别获得原核表达编码基因序列，如SEQ ID NO:1所示，以及真核表达编码基因序列，如SEQ ID NO:2所示。

1.2编码基因的合成

使用全基因合成技术分别制备EN-NAVA原核编码基因(SEQ ID NO:1)和真核编码基因(SEQ ID NO:2)，并分别制备T载体质粒(pMD18-T-EN-NAVA1与pMD18-T-EN-NAVA2)。

2 EN-NAVA真核质粒的制备

2.1引物设计

针对目的基因上下游设计引物序列：

上游引物EN-NAVA-ZF:

GAAGGATCCAACGCCGTCGCAACTATGTG(下划线部分为HindIII酶切位点)；

下游引物EN-NAVA-ZR:

GAAAAGCTTTTATTTTGGAGATGCTTTTGGAG(下划线部分为BamHI酶切位点)。

2.2基因扩增

(1)PCR反应体系及扩增条件

以pMD18-T-EN-NAVA1质粒为模板，使用PrimeSTAR高保真酶扩增基因目的片段，具体反应体系与条件如下：

表1 EA-NAVA1的PCR反应体系(单位：μL)

PCR反应程序：

94℃预变性5min→94℃变性30sec→55℃退火30sec→72℃延伸2min→72℃延伸10min→4℃；共30个循环。

(2)电泳

将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外检测仪下观察结果。产物大小约为1000bp，与预期产物大小一致。

(3)PCR产物回收

用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，并进行酶切反应(表2)：

表2 EA-NAVA1酶切反应体系(单位：μL)

37℃孵育3h后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段。

2.3表达载体的处理

取8μL(1μg/μL)的pCDNA3.1质粒，用BamHI和HindIII双酶切，建立如下酶切反应，酶切质粒：

表3质粒的酶切反应体系(单位：μL)

37℃孵育3h后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的质粒；

2.4酶切载体与酶切片段的连接

酶切后的EA-NAVA1与pCDNA3.1按表4组成建立连接反应，构建pCDNA3.1-EA-NAVA1重组真核表达质粒。

表4酶切载体与片段的连接反应体系(单位:μL)

2.5连接产物转化E.coli DH5α

(1)冰浴中将10μL连接产物加入至100μL E.coli DH5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30min。

(2)将离心管放入预加温至42℃水浴中，静置90s。

(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

(4)每管加800μL SOC培养基，于37℃缓慢振摇培养温育45min。

(5)将培养物涂布于LB琼脂平板(含100μg/mL Amp)，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，37℃过夜培养(约12～16h)。

2.6菌落PCR法鉴定转化克隆

挑取一些菌落分别接种于10ml LB培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃振荡过夜培养后，取培养物建立如下PCR反应筛选阳性克隆：

表5鉴定转化克隆的PCR反应体系(单位：μL)

PCR反应程序：同上。

取PCR反应产物10μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳，选取阳性菌落摇菌，测序。

2.7阳性克隆测序验证

将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证，测序完成后，软件比对测序结果，测序引物见下表：

表6测序引物

2.8质粒小提

经测序验证正确的阳性克隆，安排质粒小提，具体步骤见质粒小提试剂盒说明书。

2.9 EA-NAVA1真核质粒表达验证

2.9.1细胞转染

(1)转染前一天，消化DF-1细胞并计数，按1.0×10⁶cells/孔的细胞量接种至6孔板，使细胞在24h后的汇合度在70％～90％之间，每孔2ml完全培养基培养；

(2)转染当天，细胞换成无双抗完全培养基，37℃、5％CO₂培养箱孵育；

(3)转染前准备：a.用250μL无血清DMEM稀释质粒DNA，轻轻混匀；b.混匀lipofectamin试剂，取适量的lipofectamin试剂用250μL无血清DMEM稀释，轻轻混匀，室温放置5分钟；c.将前两步所稀释的DNA和lipofectamin试剂混合，轻轻混匀，室温下静置20～30分钟；

(4)在每孔细胞中加入第3步骤的混合液；

(5)转染4～6h后，可更换完全培养基；

(6)细胞于5％CO₂培养箱中37℃温育48～72h后，进行转染后的检测。

2.9.2 Western blot验证

2.9.2.1样本制备

(1)去除细胞培养基，用PBS轻轻冲洗细胞，用刮刀将细胞从培养皿中刮下来，转移到1.5ml EP管中，1000rpm离心5min，用PBS洗3次，1000rpm离心5min，弃上清；

(2)每管分别加入100μL裂解液，冰上裂解10min；

(3)12000rpm 4℃离心10min，将上清转移到新的1.5ml EP管中。

2.9.2.2蛋白质定量

取5(1μL)、10(2μL)、15(3μL)、20(4μL)、25(5μL)、30(6μL)、35(7μL)μg的BSA(5ug/μL)制作标准曲线，样品取2μL，三复管测定，最后取平均值。每支管加入1mL Bradford进行染色，涡旋振荡20s，使其充分混匀后即可测定吸光值，测定时两个样品之间的操作间隔也应该是20s左右。打入液体时要均匀，避免产生气泡。

2.9.2.3 SDS-PAGE凝胶电泳

根据定量结果，每个样本取20ug，加ddH₂O补足至18μL，再加入6μL4×Loadingbuffer，100℃煮5min，12000rpm 4℃离心3min，上样，开始电泳。恒压130V/胶电泳，直到溴酚蓝跑出胶底部，积层胶浓度4％，分离胶10％。

2.9.2.4电泳转膜

(1)准备NC膜，切膜的时候戴手套。

(2)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回以擀几遍以擀走里面的气泡。在海绵垫上垫两层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀走其中的气泡。

(3)将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为海绵垫片→2层滤纸→样品胶→NC膜→2层滤纸(注意：排除气泡)→海绵垫片，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。

(4)转膜时间1小时30分钟，恒流：300mA。

2..9.2.5封闭

5％脱脂奶粉溶于1×TBST中，室温封闭1h。

2.9.2.6孵育抗体

(1)将一抗(兔抗EN-NAVA多抗，编号KHD2018165，上海生工)用1×TBST稀释到适合浓度，4度孵一抗过夜。

(2)孵一抗过夜后，用TBST在摇床上洗膜三次，每次5min。

(3)将二抗(羊抗兔，编号A0277，购自碧云天)用1×TBST稀释到适合浓度，与膜室温孵育2h后，用1×TBST在摇床上洗膜三次，每次5min。

2.9.2.7化学发光，显影，定影

(1)先用滤纸吸干膜上液体

(2)将A和B两种发光试剂在EP管中等体积混合，将发光试剂涂于玻璃板上，将膜正面朝下，用枪弄平，计时2min。

(3)在NC膜上将配好的ECL化学发光液均匀点好，10～30s后用化学发光凝胶成像系统进行曝光。结果见图1。

3 EN-NAVA蛋白的制备

3.1引物设计

针对目的基因上下游设计引物序列：

上游引物EN-NAVA-YF:

GAAGGATCCAACGCAGTGGCCACCATGTG(下划线部分为BamHI酶切位点)；

下游引物EN-NAVA-YR:

GAATCTAGATTACTTTGGCGACGCTTTTGG(下划线部分为HindIII酶切位点)。

3.2基因扩增

(1)PCR反应体系及扩增条件：以pMD18-T-EN-NAVA2质粒为模板，使用PrimeSTAR高保真酶扩增基因目的片段，具体反应体系与条件如下：

表7 EN-NAVA2的PCR反应体系(单位：μL)

PCR反应程序：

94℃预变性5min→94℃变性30sec→55℃退火30sec→72℃延伸2min→72℃延伸10min→4℃；共30个循环。

(2)电泳：将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外检测仪下观察结果。产物大小约为1000bp，与预期的产物大小一致。

(3)PCR产物回收：用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，并进行酶切反应(表8)：

表8 EN-NAVA2酶切反应体系(单位：μL)

37℃孵育3h后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段。

3.3表达载体的处理

取6μL(1μg/μL)的pET30a质粒，用BamHI和Hind III双酶切，建立如下酶切反应，酶切质粒：

表9质粒的酶切反应体系(单位：μL)

37℃孵育3h后，进行1％琼脂糖凝胶电泳。用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的质粒；

3.4酶切载体与酶切片段的连接

酶切后的EN-NAVA2与pET30a按表10组成建立连接反应，构建pET30a-EN-NAVA2重组原核表达质粒。

表10酶切载体与片段的连接反应体系(单位：μL)

3.5连接产物转化E.coli DH5α

(1)冰浴中将10μL连接产物加入至100μL E.coli DH5α感受态细胞中。轻轻旋转混匀，冰浴30min。

(2)将离心管放入预加温至42℃水浴中，静置90s。

(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

(4)每管加800μL SOC培养基，于37℃缓慢振摇培养温育45min。

(5)将培养物涂布于LB琼脂平板(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，37℃过夜培养(约12～16h)。

3.6菌落PCR法鉴定转化克隆

挑取一些菌落分别接种于10ml LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，37℃振荡过夜培养后，取培养物建立如下PCR反应筛选阳性克隆：

表11鉴定转化克隆的PCR反应体系(单位：μL)

PCR反应程序：同上。

取PCR反应产物10μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳，选取阳性菌落摇菌，测序。

3.7质粒小提

经测序验证正确的阳性克隆，安排质粒小提，具体步骤见质粒小提试剂盒说明书。

3.8 pET30a-EN-NAVA2在表达菌中的诱导表达

3.8.1表达载体转化及诱导表达

将构建好的pET30a-EN-NAVA2质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，然后均匀涂布到LB平板上(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，之后倒置于37℃培养箱过夜。

从转化的平板中挑选单克隆，接种到4L的LB培养基中(含50μg/mL的硫酸卡那霉素)，待培养至OD₆₀₀为0.5～0.8，向培养液中加入终浓度0.1mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达。

3.8.2 SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果

取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳。电泳前10min时，100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。结果见图2。

3.8.3蛋白纯化

包涵体采用20mM PBS(pH7.2)，150mM NaCl含1％Triton X-100，2mM EDTA，2mMDTT洗涤后，以20mM PB(pH7.2)，150mM NaCl，8M Urea，20mM Imidazole缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测。结果见图2。

经Ni-IDA亲和层析纯化分析，收集纯度较高的Lane 5-11，将其加入到处理后的透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液1×PBS(pH 7.4)，4mM GSH，0.4mM GSSG，2mM EDTA，0.4ML-Arginine中复性，复性后EN-NAVA蛋白最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)，10％Glycerol溶液约6-8h。透析复性结束后，上清用0.22μm滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。

3.9重组蛋白的免疫印迹(Western blot)分析

将重组EN-NAVA2蛋白采用免疫印迹(Western blot)方法进行免疫活性鉴定。一抗为鼠源his单克隆抗体(Sigma公司)，二抗为羊抗鼠IgG-HRP(Sigma公司)。结果见图3。

4 EN-NAVA的免疫保护性试验

4.1材料

球虫卵囊：毒害艾美耳球虫惠州株孢子化卵囊，由广东省农业科学院动物卫生研究所寄生生物学研究室保存，使用前在无球虫雏鸡体内复壮。

雏鸡：岭南黄雏鸡，由广东省农业科学院动物科学研究所提供，饲养于已消毒的专用动物房内；鸡笼和所用器皿均严格消毒，自由采食和饮用纯净水；实验前观察雏鸡有无临床症状及连续3天检查粪便有无球虫卵囊，备用。

饲料：由广东省农业科学院动物科学研究所定制育雏料，不含任何抗球虫药物。

4.2试验方法

分组：180只1日龄试验雏鸡逐只称重后，剔除瘦弱或体重过大雏鸡，选择个体体重差异在10g以内的健康鸡，随机分成6组，每组30只。

处理：

EN-NAVA2重组蛋白的乳化：取3.9纯化后所得的EN-NAVA2重组蛋白与弗氏佐剂(FCA)按照1：1的比例混匀；用7号针头注射器反复抽吸至滴于水上5min内不扩散为止。

试验鸡于1、7、14日龄分别用pCDNA3.1-EN-NAVA1真核质粒(腿部肌肉注射)或pET30a-EN-NAVA2重组蛋白(皮下注射)进行免疫，另设非免疫感染组及非免疫非感染组作为对照。21日龄分别经口感染3×10⁴个新鲜的E.necatrix孢子化卵囊。每天观察并记录鸡群的精神状况、采食量、粪便情况等；对死亡雏鸡称重，剖检，若为毒害艾美耳球虫感染引起死亡则病变记分为+4分；所有雏鸡于感染后第8天逐只称重，剖检，进行小肠中段病变记分。具体的试验分组详见表12：

表12试验分组设计

抗球虫指数评定标准：

相对增重率：试验开始及结束时分别称鸡只体重，计算平均增重和相对增重率。相对增重率＝(各组增重率/非免疫非感染组增重率)×100％。

存活率：记录各组死亡鸡数，剖检确定死因，算出存活率。存活率＝(试验结束时存活鸡只数/试验组鸡只数)×100％。

病变值：感染后第8天宰杀鸡，参照Johnson和Reid(1970)设计的病变记分法,进行每只鸡的肠道病变记分，并将病变记分换算成病变值；

感染后第8天剖检小肠中段。

0无肉眼可见病变；

1小肠中段浆膜面可见针尖状大小散在的出血点和白点，肠腔内可见少量橘红色内容物，肠壁略增厚；

2肠壁增厚，浆膜面有大量的出血点和白点，小肠中段出现轻度胀气，肠腔局部混有凝血块；

3浆膜面布满红色出血点和白点，肠腔鼓气扩张，肠壁明显增厚，整个肠内容物中含有多量的血凝块和坏死脱落的上皮组织，肠黏膜面粗糙，没有正常的肠内容物；

4小肠中段高度肿胀，肠段出现萎缩、明显缩短，病变延伸至十二指肠和小肠后段，小肠内容物中含有酱油色或棕色粘液，肠道黏膜出血，坏死。因本球虫致死的鸡记为+4分。

病变值(0～40)＝各试验组的平均病变记分(0～4)×10。

卵囊值：用麦克马斯特计数法进行粪便卵囊计数，求出每组克粪便卵囊数(OPG)，计算卵囊数，根据表13换算得出卵囊值。

表13卵囊数与卵囊值的换算关系

抗球虫指数(ACI)：ACI＝(相对增重率+存活率)×100-(病变值+卵囊值)计算而得。

免疫效果判定标准：ACI>180属高效；160<ACI<180属中效；120<ACI<160属低效；ACI<120对球虫无效。

4.3试验结果

临床症状观察：

非免疫感染对照组试验鸡感染孢子化卵囊后逐渐出现采食减少、精神差等反应。感染后第4天，pCDNA3.1组、pET30a组及非免疫感染对照组均有少量呈咖啡色血粪排出，饮水量减少，第5天和第6天更为严重，剖检见小肠病变，黏膜面和浆膜面可见红色出血点和白点，肠腔鼓气扩张，肠壁明显增厚，其他脏器未观察到病变；质粒+重组蛋白免疫组、重组蛋白+质粒免疫组及非免疫非感染对照组均无血粪，采食，饮水正常。

试验结果表明，pCDNA3.1组、pET30a组的抗球虫指数均低于120，均呈现出无效的抗球虫效果；质粒+重组蛋白免疫抗球虫指数为165.00，重组蛋白+质粒免疫组抗球虫指数为172.25，具有中等效力的抗球虫效果。结果详见表14。

表14 EN-NAVA的免疫保护效果评价

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所

<120> 用于防治毒害艾美耳球虫的重组多肽及疫苗

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1017

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

aacgcagtgg ccaccatgtg gcctgtgggc gccttttcca aggaccagcc ccacacgcag 60

ggggtgggca ccaactatgc caactggtac accaatggta cttgcgaaat gtatgacatg 120

gtccccactt gcttcaccct cgcccccaac cagttctcgt tcacatcttt gggatcggtc 180

gatcccagca ctgccgagct gcccccctgc accgaagcca gcgagggctg ggaaatctac 240

ggctactgcg agtgcggaga cggccactcg aagccctgga agtgtgagaa cggccagtgg 300

gttggcggcg gcgacgactg caactgcagc agcatccttc ccgtagcctt gggcattagc 360

ttcggcctgc ttgtgccgat tgccgctctt atcggctact tcatctacaa acgaaaaaaa 420

gacaccagca tcgcaaagaa ccctgagaag aagaagcttc tggacgggga cgacgagagg 480

gatgaggagt tcttgaaagt gcaagagaag aggaagcaca agcaaagtga tttggcccaa 540

gaggccgagc cttccttctg gggagaaact ccccaggacc aaacaaacgt tgtggtcgac 600

cagaacgccc acgacgccta ctacgaagcg gcggctaaag tctttcttat tggactgttt 660

tcgggatcag ctggaggaat gtcgctcgtc ttaacgatta actctgcaat cgctgtcatt 720

gtcaaccagt ccaagacgct catgcgtcta caaatgtgct taggatcaac tgttatgggg 780

ctcctgcgga aaggtgcaag ctccttttca cgagtccgtc agtatttcga caaacgccgg 840

gctgtgaagc gagttatgct ccagcgagcg cttgctggca tgaagagtgg ttcaactgca 900

acccttatga gcaactcaga agccacggaa ctcgcagacg gtgtccttgc caagctcatt 960

ggcacaagcc gtgccactct tgtgaaggga cctagcccaa aagcgtcgcc aaagtaa 1017

<210> 2

<211> 1017

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

aacgccgtcg caactatgtg gcctgtgggc gcattctcta aagatcagcc gcacactcag 60

ggtgtgggta cgaactacgc gaattggtat accaacggta cttgcgaaat gtacgacatg 120

gtaccgacct gcttcaccct ggcaccgaac cagttttcct tcacctccct gggttccgtt 180

gatccgtcca ctgctgaact gccaccgtgc actgaagcga gcgaaggctg ggaaatttat 240

ggttattgcg aatgcggtga cggccactcc aaaccgtgga aatgcgaaaa tggtcagtgg 300

gtgggtggtg gtgacgattg caactgttcc agcatcctgc cggttgcact gggcatttct 360

ttcggtctgc tggtgccgat tgctgcgctg atcggttatt ttatctacaa acgtaagaaa 420

gacacgtcca tcgcgaaaaa cccggaaaaa aaaaagctgc tggatggcga cgacgaacgt 480

gacgaagaat ttctgaaagt tcaggaaaaa cgtaaacaca aacagtctga tctggctcag 540

gaagcagagc cgagcttctg gggtgaaacg ccacaggatc agactaacgt tgtagttgac 600

cagaacgctc acgatgctta ttatgaagca gcggcaaaag ttttcctgat cggtctgttc 660

tccggttccg cgggtggtat gtccctggtc ctgactatca attccgctat cgcggttatc 720

gtcaaccagt ccaagaccct gatgcgtctg cagatgtgcc tgggctctac cgttatgggt 780

ctgctgcgta aaggcgcttc ctctttcagc cgtgttcgtc aatacttcga taaacgtcgt 840

gctgttaagc gtgttatgct gcagcgtgcg ctggctggta tgaaatctgg ctctaccgct 900

accctgatgt ctaattccga agctaccgaa ctggcagacg gcgttctggc gaaactgatt 960

ggtacctctc gtgcaaccct ggtaaaaggt ccatctccaa aagcatctcc aaaataa 1017

<210> 3

<211> 338

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 3

Asn Ala Val Ala Thr Met Trp Pro Val Gly Ala Phe Ser Lys Asp Gln

1 5 10 15

Pro His Thr Gln Gly Val Gly Thr Asn Tyr Ala Asn Trp Tyr Thr Asn

20 25 30

Gly Thr Cys Glu Met Tyr Asp Met Val Pro Thr Cys Phe Thr Leu Ala

35 40 45

Pro Asn Gln Phe Ser Phe Thr Ser Leu Gly Ser Val Asp Pro Ser Thr

50 55 60

Ala Glu Leu Pro Pro Cys Thr Glu Ala Ser Glu Gly Trp Glu Ile Tyr

65 70 75 80

Gly Tyr Cys Glu Cys Gly Asp Gly His Ser Lys Pro Trp Lys Cys Glu

85 90 95

Asn Gly Gln Trp Val Gly Gly Gly Asp Asp Cys Asn Cys Ser Ser Ile

100 105 110

Leu Pro Val Ala Leu Gly Ile Ser Phe Gly Leu Leu Val Pro Ile Ala

115 120 125

Ala Leu Ile Gly Tyr Phe Ile Tyr Lys Arg Lys Lys Asp Thr Ser Ile

130 135 140

Ala Lys Asn Pro Glu Lys Lys Lys Leu Leu Asp Gly Asp Asp Glu Arg

145 150 155 160

Asp Glu Glu Phe Leu Lys Val Gln Glu Lys Arg Lys His Lys Gln Ser

165 170 175

Asp Leu Ala Gln Glu Ala Glu Pro Ser Phe Trp Gly Glu Thr Pro Gln

180 185 190

Asp Gln Thr Asn Val Val Val Asp Gln Asn Ala His Asp Ala Tyr Tyr

195 200 205

Glu Ala Ala Ala Lys Val Phe Leu Ile Gly Leu Phe Ser Gly Ser Ala

210 215 220

Gly Gly Met Ser Leu Val Leu Thr Ile Asn Ser Ala Ile Ala Val Ile

225 230 235 240

Val Asn Gln Ser Lys Thr Leu Met Arg Leu Gln Met Cys Leu Gly Ser

245 250 255

Thr Val Met Gly Leu Leu Arg Lys Gly Ala Ser Ser Phe Ser Arg Val

260 265 270

Arg Gln Tyr Phe Asp Lys Arg Arg Ala Val Lys Arg Val Met Leu Gln

275 280 285

Arg Ala Leu Ala Gly Met Lys Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Met Ser

290 295 300

Asn Ser Glu Ala Thr Glu Leu Ala Asp Gly Val Leu Ala Lys Leu Ile

305 310 315 320

Gly Thr Ser Arg Ala Thr Leu Val Lys Gly Pro Ser Pro Lys Ala Ser

325 330 335

Pro Lys

Claims (11)

1.重组多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示。

2.分离的核酸，其编码权利要求1所述的重组多肽。

3.根据权利要求2所述的核酸，其针对宿主进行密码子优化。

4.根据权利要求3所述的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

5.载体，其具有权利要求2～4任一项所述的核酸。

6.宿主细胞，其基因组中掺有权利要求2～4任一项所述的核酸，或权利要求5所述的载体。

7.权利要求1所述的重组多肽的制备方法，包括：

在适宜的条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，收集培养液和/或所述宿主细胞的裂解液，分离纯化得到所述重组多肽。

8.疫苗，其含有权利要求1所述的重组多肽、权利要求2～4任一项所述的核酸或权利要求5所述的载体。

9.根据权利要求8所述的疫苗，其进一步包含佐剂和/或药学上可接受的载体。

10.成套试剂盒，其包含权利要求8或9所述的疫苗，以及用于接种所述疫苗的容器。

11.权利要求1所述的重组多肽、权利要求2～4任一项所述的核酸或权利要求5所述的载体在制备用于防治毒害艾美耳球虫的药物中的应用。

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