CN111196847A

CN111196847A - 柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111196847A
Application number: CN202010036329.9A
Authority: CN
Inventors: 刘群; 宋星桔; 刘晶; 杨旭; 许建海
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2020-05-26

Abstract

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白及其制备方法和应用。该蛋白是新发现的、柔嫩艾美耳球虫各发育阶段均高表达的蛋白。该蛋白氨基酸序列包含编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。将EtM2AP基因插入大肠杆菌表达载体pET28a获重组表达载体，转入大肠杆菌中表达鸡柔嫩艾美耳球虫重组蛋白(EtM2AP)，将该重组蛋白纯化并与佐剂混合，制得EtM2AP重组蛋白疫苗，该疫苗能有效提高雏鸡存活率和相对增重率，并能够减少免疫后雏鸡的球虫卵囊排出量，具有良好免疫保护效果的重组蛋白疫苗，有作为预防鸡柔嫩艾美耳球虫病疫苗的潜力。

Description

柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明是关于生物兽药技术领域，特别是关于一种柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

鸡球虫病是一种以肠道病变为主的寄生原虫病，是集约化养鸡场最常见的疾病之一，呈世界性分布。鸡球虫病的发病率高达50％～70％，死亡率为20％～30％，严重时高达80％，鸡球虫病是养鸡业必防的疾病之一，给养鸡业带来巨大经济损失，主要包括防治费用和生产性能下降(比如饲料转化率低，生长缓慢，死亡)造成的损失，美国农业部将该病列为对禽类危害最严重的五大疾病之一。世界公认的鸡球虫有7种，其中寄生于盲肠中的柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)致病性最强，危害最严重，常常引起急性球虫病。

目前，球虫病的防控主要是依靠抗球虫药物和活疫苗，但由于球虫耐药性、药物残留和环境毒性等问题，抗球虫药物的使用受到了很大限制。已经商品化的球虫苗主要包括田间分离虫株研制的强毒苗(如Coccivac)和早熟选育的弱毒苗(如

)，具有较好的免疫保护力，但同时存在保存期短、运输和储存条件高、应用后管理要求高、易导致免疫不均衡以及诱发球虫病等安全隐患。而且，这两类球虫苗的生产均必须在鸡体内进行，致使生产成本较高，价格较高。因此，研究者一直致力于亚单位疫苗的研发，但迄今为止，仅有

球虫疫苗上市，该疫苗是由巨型艾美耳球虫配子体的天然蛋白制备而成，主要成分是天然提取的巨型艾美耳球虫的配子体蛋白EmGAM56、EmGAM82和EmGAM230，主要用于免疫母鸡，旨在使雏鸡具备较好的母源免疫。但

主要从球虫卵囊的配子体阶段提取天然蛋白制备而成，存在抗原提取纯化工艺复杂，抗原来源不稳定，生产成本高，难以标准化等问题，所以未得到广泛应用。近年来，应用基因工程技术构建的重组蛋白疫苗证实可以诱导宿主产生较强的免疫保护力，一定程度地抵抗鸡球虫感染。重组蛋白疫苗与强毒苗、弱毒苗以及天然蛋白疫苗相比，具有安全性高、稳定性好、纯度高、易于制备以及产量高等优点，成为疫苗研发的新方向。

近年来，已经有多种柔嫩艾美耳球虫的保护性抗原见诸研究报道，如柔嫩艾美耳球虫IMP1和CD40 L重组蛋白免疫鸡后，被免疫鸡只产生较好的体液和细胞免疫应答，盲肠病变记分和增重均优于对照组；重组的柔嫩艾美耳球虫的RHO1蛋白免疫鸡后，被免疫鸡的IL–2和IFN-γ的表达水平以及CD4⁺、CD8⁺T 细胞的比例显著高于未免疫组，攻虫后免疫组的保护效率达到77.3％；用重组蛋白rEF-1α免疫雏鸡后，攻击柔嫩艾美耳球虫后雏鸡的卵囊排出量减少70％左右。此外，多位研究者分别报道了柔嫩艾美耳球虫的TA4、SO7、3-1E、SAG、HSP70、MIC1、MIC2和5401等一系列重组蛋白作为免疫抗原的研究，有着不同程度的免疫保护效果，但大多数重组蛋白的保护效果有限，主要原因是它们的免疫原性低或在虫体生命周期中的表达受限。已有的研究显示，不同抗原虽然能够诱发宿主一定程度上免疫反应，具有一定的抗球虫作用，但作为预防鸡球虫病的疫苗尚有一定的局限性，因此尚没有商品化的鸡球虫病重组蛋白疫苗应用于生产，需要进一步筛选有效的免疫保护抗原，为研制鸡球虫病重组蛋白疫苗奠定基础。

柔嫩艾美耳球虫有棒状体、微线体和致密颗粒三种特殊分泌细胞器，其中微线体蛋白2相关蛋白(MIC2-associated protein M2AP)是由微线体分泌的，在虫体运动、黏附和入侵过程中发挥关键作用。因此，筛选该蛋白并对其免疫保护效果进行评价，将对鸡球虫病重组蛋白疫苗的应用具有重大意义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白(EtM2AP)，该蛋白是新筛选的、在柔嫩艾美耳球虫各发育阶段均高表达的蛋白，其是由微线体分泌的、在柔嫩艾美耳球虫虫体运动、黏附和入侵过程中发挥关键作用。筛选到该高效的抗原蛋白是研制鸡球虫病重组蛋白疫苗的关键因素。

为实现上述目的，本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白，命名为EtM2AP(通过分析、比对发现其氨基酸序列与弓形虫微线体蛋白2相关蛋白(TgM2AP)同源性最近，因此将其命名为EtM2AP)，具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白，命名为EtM2AP，具有SEQ ID NO.1中的部分氨基酸序列，该部分氨基酸序列能够表达出活性蛋白质片段。

在本发明的一实施方式中，编码该柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了用于扩增上述核苷酸序列的引物，具有以下序列：上游引物：AGCAAATGGGTCGCGGATCCAGAGTCCCAGGCGAAGATAG(SEQ ID NO.3)，下游引物：TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGGATGACTGTTGAGTGTCACTCT(SEQ ID NO.4)。

本发明还提供了一种重组载体，包含上述核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组蛋白，包含上述氨基酸序列。

本发明还提供了一种重组蛋白疫苗，包括上述重组蛋白和佐剂。

本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：基因扩增：通过权利要求4所述的引物以柔嫩艾美尔球虫子孢子的cDNA为模板扩增出EtM2AP基因序列；重组载体构建：将扩增出的EtM2AP基因序列与pET-28a骨架构建重组载体；以及重组蛋白表达：将上述重组载体通过IPTG进行诱导表达(具体的，表达质粒转化表达菌Transetta(DE3)，表达菌接种于1L的新鲜LB(含AMP 100μg/mL)培养液中，37℃摇床培养3h，至菌液OD_600nm值约为0.6后加入诱导剂IPTG(0.8mmol/L)，37℃诱导6h(170r/min))，并通过Western bloting鉴定，即得。Western-blot分析显示EtM2AP的原核表达蛋白具有良好的抗原性。免疫保护实验显示EtM2AP重组蛋白与佐剂混合后免疫雏鸡，具有良好的免疫保护效果，可有效预防鸡柔嫩艾美耳球虫病。

本发明还提供了一种能够与上述柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白特异性结合的抗体或血清，该抗体是用100μg上述重组蛋白免疫BALB/c小鼠而制得的多克隆抗体。

本发明还提供了上述柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白在制备预防鸡球虫病疫苗中应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明在ToxoDB数据库中，通过New serach-Genes-Transcriptomics-RNASeq Evidence筛选出前50个子孢子与裂殖子阶段高表达的蛋白，通过预测这些蛋白的分子量、信号肽、B细胞及T细胞抗原表位，以分子量在20-100kDa、有信号肽、各阶段表达量大、抗原表位多的分泌蛋白作为筛选依据，在ToxoDB数据库中筛选到EtM2AP的基因。

(2)本发明进一步通过上述获取的柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白(EtM2AP)的基因信息，成功表达、鉴定并纯化EtM2AP重组蛋白，并对其免疫保护效果进行评价，发现该重组蛋白具有表达量大、可溶性表达、易表达和纯化、保存方便等优点，从而有利于重组蛋白疫苗的开发应用。Western-blot分析显示EtM2AP的原核表达蛋白具有良好的抗原性。免疫保护实验显示EtM2AP重组蛋白与佐剂混合后免疫雏鸡，具有良好的免疫保护效果，可有效预防鸡柔嫩艾美耳球虫病。

附图说明

图1是根据本发明一实施方式的柔嫩艾美耳球虫EtM2AP基因扩增产物电泳鉴定图；

图2是根据本发明一实施方式的EtM2AP重组蛋白表达及纯化的SDS-PAGE图；

图3是根据本发明一实施方式的EtM2AP蛋白免疫原性分析的Western-blot图。

主要附图标记说明：

1-纯化并浓缩后的蛋白；2-诱导后菌液；3-菌液超声裂解并离心后包涵体；4-菌液超声裂解并离心后上清；5-鸡柔嫩艾美耳球虫感染阳性血清；6-鼠源EtM2AP多克隆抗体；7-阴性血清。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

本发明所涉及到的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

E.coli Transetta(DE3)菌株：购自北京全式金生物技术有限公司。

菌株E.coli DH5α：购自北京聚合美生物技术有限公司。

高保真酶，Taq酶：购自购自南京诺唯赞生物技术有限公司。

多片段连接试剂盒，反转录试剂盒：购自北京全式金生物技术有限公司。

镍亲和层析填料：购自美国novagen公司。

表达载体pET-28a(+)：本实验室保存。

弗氏佐剂(完全，不完全):购自Sigma-aldrich公司，USA。

6～8周龄雌性BALB/c小鼠：购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司。

SPF雏鸡：购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司。

柔嫩艾美耳球虫：由中国农业大学大学兽医寄生虫学实验室分离、鉴定并保存。

以下通过实施例1-3对EtM2AP重组蛋白的制备、抗原性、以及免疫保护效果进行具体描述。

实施例1：EtM2AP重组蛋白的制备

本发明中鸡柔嫩艾美耳球虫的蛋白为EtM2AP(ToxoDB数据库中的登录号为ETH_00006930(https://toxodb.org/toxo/app/record/gene/ETH_00006930),编码该蛋白的基因片段长度为969bp。

1.EtM2AP基因的克隆和重组质粒的构建

扩增EtM2AP基因的引物序列见表1：

表1

以柔嫩艾美耳球虫子孢子的cDNA为模板，对EtM2AP进行扩增，反应体系如下：

表2

PCR反应条件：94℃预变性10min，进行30轮循环，循环包括94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸90s，终延伸72℃10min。PCR产物取样进行琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定其是否扩增成功(结果见图1)。利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收与目的片段大小相符的扩增产物。利用Vazyme公司的多片段无缝连接试剂盒(ClonExpressTMMultiS One StepCloning Kit)连接EtM2AP片段和pET-28a骨架，具体反应体系如下：

表3

2.EtM2AP重组蛋白的表达

将上述连接所得重组质粒转入表达感受态Transetta(DE3)中，冰浴30min，42℃热激1min，冰浴3-5min；加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃摇菌1h，取100-200μl菌液涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，37℃过夜培养。次日挑取单个菌落，加入含有卡那霉素的LB液体培养基37℃培养至对数生长期(OD_600nm值约为0.6)，加入IPTG，使其终浓度为0.8mM。继续培养6h，将菌液9000rpm 4℃离心20min，收集菌体沉淀，超声破碎菌体，将破碎后的菌体裂解液在4℃条件下离心10min(12,000rpm)，分离沉淀与上清，沉淀加入适量的8M尿素溶解。上清和沉淀各取40μL，分别加10μL 5×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸10min，离心10min(12,000rpm)，进行SDS-PAGE电泳。结果显示EtM2AP蛋白表达量大，且为可溶性表达。用镍亲和层析填料对上清中的蛋白进行纯化，结果显示EtM2AP-His重组蛋白易纯化，见图2。

实施例2：EtM2AP抗原性的鉴定

1.多克隆抗体的制备

用EtM2AP-His重组蛋白与同体积弗氏完全佐剂混合乳化后，按照重组蛋白100μg/只首次免疫BALB/c小鼠；重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，分别按照50μg/只进行第二次和第三次免疫BALB/c小鼠，每次免疫间隔2周。二免和三免后10天眼眶采集血液、分离血清并检测抗体滴度，当滴度达到10⁶以上后，将小鼠摘眼球采血分离血清，制成鼠源EtM2AP多抗血清。

2.鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清的制备

用2000个鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊/只经口感染3周龄SPF鸡，间隔2周后再次同样剂量接种雏鸡。第二次接种后14天后采集血液、分离血清并检测抗体滴度，制备鸡柔嫩艾美耳球虫的阳性血清。

3.EtM2AP抗原性的鉴定

取重组EtM2AP-His蛋白进行SDS-PAGE电泳，随后电转移至PVDF膜上，分别用鼠源EtM2AP-His重组蛋白多抗血清和鸡柔嫩艾美耳球虫阳性血清进行Western-blotting分析。结果显示，EtM2AP蛋白可与两种血清进行反应，并呈现单一条带(图3)，证实重组EtM2AP-His蛋白具有良好的抗原性。

实施:3：鸡柔嫩艾美耳球虫EtM2AP重组蛋白的免疫保护效果的评价

1.鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的制备

用5只14日龄无球虫感染鸡，分别经口接种1×10⁴个孢子化E.tenella卵囊，接种后144h后开始收集粪便，连续收集3天的鸡粪，采用饱和盐水漂浮法收集粪中卵囊。收集的未孢子化卵囊置于27℃摇床进行孢子化培养，期间吸取适量卵囊液镜检，观察孢子化程度，当95％球虫卵囊完成孢子化后，停止培养，计数卵囊量，标记并置于2～8℃保存备用。

2.重组蛋白疫苗的免疫保护效果评价

2.1免疫及攻虫方案

购买30只1日龄SPF雏鸡，将30只鸡随机分为3组，每组10只鸡.第一组为佐剂免疫非攻虫组(阴性对照组)，第二组为佐剂免疫攻虫组(阳性对照组)，第三组为EtM2AP-His重组蛋白免疫攻虫组。饲养至14日龄进行首次免疫，第一组和第二组鸡只的分别用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂进行首免和二免，第三组用EtM2AP-His重组蛋白并分别在首免和二免与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按照1:1混合制成乳剂进行免疫，重组蛋白的使用剂量为100μg/羽；至雏鸡21日龄进行二免，剂量同上。所有免疫途径均采用鸡腿部肌肉注射。至鸡只28日龄时，逐只称重；然后经口服接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，剂量为1×10⁴个/羽。逐日观察并记录鸡只的精神状态、临床表现以及死亡情况。至鸡只34日龄时，逐只称重，每组剖杀6只鸡进行盲肠病变记分；至39日龄时，收集每组剩余鸡只的粪便，进行卵囊计数。具体免疫及攻虫方案见表4。

表4

2.2重组蛋白疫苗的免疫保护效果评价

1)存活率：攻虫后各组鸡只的死亡情况。免疫重组蛋白的鸡攻虫后，雏鸡的死亡率显著降低，说明用重组蛋白免疫能有效地降低柔嫩艾美尔球虫的攻击造成的鸡死亡。见表5

表5

2)增重:分别于免疫、攻虫和剖杀时对鸡逐只称重，记录各阶段鸡只的体重变化，计算平均增重和相对增重率。以平均增重表示重组蛋白对免疫后攻虫鸡增重的影响。

增重＝(宰杀时重-攻虫时重)/只

增重率(％)＝(宰杀时鸡只重-攻虫时鸡只重)/攻虫时鸡只重×100％；

相对增重率(％)＝(实验组鸡只增重/非免疫非攻虫组鸡只增重率)×100％。

各组鸡的平均增重和相对增重率见表6。结果显示，EtM2AP-His重组蛋白免疫组攻虫组与佐剂免疫攻虫组之间的平均增重和相对增重率的差异均极显著(P<0.01)，免疫组的鸡只相对增重率达42％，而只免疫佐剂组的EtM2AP鸡只相对增重率是-45％，说明免疫EtM2AP-His重组蛋白能有效预防鸡只感染球虫后导致的增重下降。

表6

注：与非免疫攻虫组相比，*P<0.05,差异显著；**P<0.01,差异极显著

3)盲肠病变记分：在鸡只攻虫后第6天，每组留下4只鸡，其余剖杀，按Johnson方法进行盲肠病变记分，记分标准如下：

0:未见病变；

+1:盲肠壁散在极少数的点状出血斑，肠壁不增厚，内容物正常；

+2:盲肠内容物混有少量血液，肠壁稍肥厚，可见很多出血病灶；

+3:盲肠内大量血液或盲肠凝块(凝血或灰白色的栓芯)，盲肠壁肥厚，盲肠明显地变形或萎缩；

+4:盲肠显著萎缩，病变延伸至直肠。盲肠壁极度肥厚，盲肠内容物为凝血或栓芯。

如两侧病变不一致，以病变严重的一侧为准。

病变值＝平均病变记分×10

各组鸡只的盲肠病变记分见表7。由表看出，佐剂免疫攻虫组与佐剂免疫非攻虫组之间盲肠病变记分差异明显，说明攻虫成功。佐剂免疫攻虫组鸡的盲肠病变最明显，平均病变记分达4；重组蛋白EtM2AP免疫组病变记分为3，与佐剂免疫攻虫组的盲肠病变记分差异显著(P<0.05)，表明重组蛋白免疫后对鸡柔嫩艾美耳球虫感染有较好的保护效果，有效地减轻了球虫感染对鸡盲肠造成的损伤。

表7

4)卵囊计数：按麦克马斯特法进行卵囊计数，具体方法为：收取攻虫后6～11天的鸡粪便，加入适量的2.5％的重铬酸钾，混匀粪便，称量粪便总重，用50毫升离心管在不同的三个位置各取三份粪便样品，再次混匀所取得的三份粪便样品，每份称取2g，放入100毫升烧杯，先加10mL饱和食盐水混匀，再加50mL饱和食盐水，混匀后立即取粪液充满两个计数室，静止2min，镜检计数。计数室容积0.15mL，0.15mL内含内容物0.005g，两个计数室则为0.01g，所以OPG＝卵囊数×100。

卵囊排出量＝OPG×粪便总重

卵囊减少率(％)＝(佐剂免疫攻虫组鸡的卵囊排出量-蛋白免疫组鸡的卵囊排出量)/佐剂免疫攻虫组鸡的卵囊排出量×100％

各组鸡的卵囊排出量和卵囊减少率结果见表8，由表可看出EtM2AP-His重组蛋白免疫组鸡的卵囊减少率达88％(P<0.01)，与佐剂免疫攻虫组鸡相比，差异极显著(P<0.01)，表明免疫重组蛋白后能够显著减少柔嫩艾美耳球虫在鸡体内的发育繁殖和卵囊形成，具有较好的预防球虫病的效果。

表8

注：与非免疫攻虫组相比，*P<0.05,差异显著，**P<0.01,差异极显著。前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。

这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白及其制备方法和应用

<130> P191272DD1F

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 322

<212> PRT

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 1

Ala Val Arg Thr Arg Val Pro Gly Glu Asp Ser Phe Ser Pro Glu Ser

1 5 10 15

Gly Val Leu Ser Gly Thr Asp Ala Pro Glu Arg Arg Pro Ile Val Pro

20 25 30

Gly Leu Val Glu Gly Asn Cys Gly Arg Leu Thr Val Arg Asn Gly Leu

35 40 45

Ser Val Asp Glu Thr Ile Lys Val Thr Ser Ala Gly Trp Thr Lys Ser

50 55 60

Glu Arg Asp Phe Ile Val Ser Leu Val Ala Asp Glu Thr Arg Lys Val

65 70 75 80

Val Gln Leu Arg Glu Ser Glu Gly Ala Ser Gly Ala Ser Gly Pro Gly

85 90 95

Pro Ala Pro Ala Glu Lys Pro Pro Ser Gly Gln Gly Ser Ala Glu Glu

100 105 110

Ala Pro Lys Gly Glu Gly Gly Gln Glu Lys Pro Ser Val Pro Leu Ile

115 120 125

Ala Val Arg Ile His Gly Ser Gly Gly Asp Lys Gly Glu Ser Ala Pro

130 135 140

Gln Ser Ala Val Leu Leu Tyr Gly Asn Asp Glu Ser Glu Pro Thr Glu

145 150 155 160

Val Pro Leu Glu Thr Ala Ala Gly Pro Thr Thr Pro Leu Met Val Leu

165 170 175

Ile Thr Gln Gln Asn Pro Lys Glu Val Glu Val Arg Val Leu Ala Trp

180 185 190

Ile Ser Thr Asp Ala Thr Thr Gly Lys Gly Ser Trp Lys Glu Asn Ser

195 200 205

Val Val Val Gly Ser Ser Leu Ser Gly Arg Asp Leu Thr Val Asn Leu

210 215 220

Ser Asp Cys Gly Pro Ser Ser Leu Arg Val Tyr Gly Ser Ala Ser Ala

225 230 235 240

Asp Leu Val Thr Val Lys Glu Gly Met Cys Glu Ala Asp Asp Pro Glu

245 250 255

Leu Ile Ala Leu Thr Arg Pro His Thr Ser Ala Ala Ser Pro Leu Pro

260 265 270

Ala Glu Glu Gly Asp Val Ala Gln Asp Ala Gln Gln Ser Ala Gly Ala

275 280 285

Gln Gln Glu Ala Glu Ala Gln Glu Val Gly Glu Pro Gln Gln Glu Ala

290 295 300

Ala Ala Ala Glu Gln Gly Ser Ser Ala Ala Glu Ser Asp Thr Gln Gln

305 310 315 320

Ser Ser

<210> 2

<211> 969

<212> DNA

<213> 柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)

<400> 2

gccgttagga cgagagtccc aggcgaagat agcttctctc ctgaatctgg cgttctcagt 60

gggacagatg cgccggaacg acgtcccatc gtgcctggac tagttgaagg taactgcggc 120

aggctgacgg ttcgtaacgg cctgagcgtg gatgagacca tcaaagtgac cagcgctgga 180

tggacgaaga gcgaacggga cttcattgtc tcccttgttg ccgacgaaac gcgcaaagtt 240

gttcagctga gagaatcaga aggtgcatcc ggcgccagtg gccctggacc cgcgccagct 300

gaaaagcctc caagtggcca aggaagcgct gaggaggctc ctaaagggga aggtggacag 360

gagaagccgt ctgtaccctt gattgctgtt cgcatccatg gatctggcgg cgacaaaggg 420

gagagcgctc cgcagtcggc tgttctgctt tacggaaatg atgaaagcga gcctacggag 480

gttcccctag aaacagcagc tggaccgacc acgccactca tggtactcat tacgcagcag 540

aacccaaagg aagtggaagt ccgtgttctt gcttggatat ctacggacgc tacaactgga 600

aagggctctt ggaaagaaaa ttccgtggtc gttggcagct ccttgagcgg gcgcgacctt 660

accgtgaact tgagcgactg tggaccaagc tccctcaggg tttatggctc ggcatcagct 720

gaccttgtaa ctgtcaagga gggcatgtgt gaggcagacg acccagagtt gatcgcgctg 780

actcggcctc atacatcggc agcttctccg ctgcctgcag aggaaggaga cgtagcgcag 840

gacgcccagc agagcgcagg agcccagcag gaagcagaag cccaggaggt tggagaaccc 900

cagcaggaag cagctgctgc agagcaagga agcagcgctg cagagagtga cactcaacag 960

tcatcctga 969

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcaaatggg tcgcggatcc agagtcccag gcgaagatag 40

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgagtgcgg ccgcaagctt ggatgactgt tgagtgtcac tct 43

Claims

1.一种柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白，其特征在于，命名为EtM2AP，具有如SEQID NO.1所示的氨基酸序列。

2.一种柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白，其特征在于，命名为EtM2AP，具有SEQID NO.1中的部分氨基酸序列，该部分氨基酸序列能够表达出活性蛋白质片段。

3.如权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白，其特征在于，编码该柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.用于扩增权利要求3所述的核苷酸序列的引物，其特征在于，具有以下序列：

上游引物：AGCAAATGGGTCGCGGATCCAGAGTCCCAGGCGAAGATAG(SEQ ID NO.3)，

下游引物：TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGGATGACTGTTGAGTGTCACTCT(SEQ ID NO.4)。

5.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求3所述的核苷酸序列。

6.一种重组蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述的氨基酸序列。

7.一种重组蛋白疫苗，其特征在于，包括权利要求6所述的重组蛋白和佐剂。

8.权利要求6所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

基因扩增：通过权利要求4所述的引物以柔嫩艾美尔球虫子孢子的cDNA为模板扩增出EtM2AP基因序列；

重组载体构建：将扩增出的EtM2AP基因序列与pET-28a骨架构建重组载体；以及

重组蛋白表达：将上述重组载体通过IPTG进行诱导表达，并通过Westernbloting鉴定，即得。

9.一种能够与权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白特异性结合的抗体或血清。

10.权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫微线体蛋白2相关蛋白在制备预防鸡球虫病疫苗中应用。