CN110204604B - 一种柔嫩艾美耳球虫an1样锌指蛋白及其在抑制球虫入侵中的应用 - Google Patents
一种柔嫩艾美耳球虫an1样锌指蛋白及其在抑制球虫入侵中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白及其在抑制球虫入侵中的应用，对柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白进行克隆，表达和纯化。通过荧光定量PCR(qPCR)检测EtAN1‑ZnFP在虫体不同发育阶段的转录水平，通过免疫保护实验评估EtAN1‑ZnFP对鸡感染球虫后的免疫保护作用。本研究结果表明EtAN1‑ZnFP可能参与了柔嫩艾美耳球虫的入侵和生长发育。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白及其在抑制球虫入侵中的应用。
背景技术
原生动物寄生虫柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是鸡球虫病的主要致病因子，给全世界的养鸡业造成了相当大的经济损失。目前，球虫病的防控主要还是依赖于药物治疗和活疫苗的免疫预防。但是，由于长期广泛使用各种抗球虫药，艾美耳球虫对大多数市售的抗球虫药物产生了耐药性。此外，这些药物的残留引起了食品安全问题，而且活的抗球虫疫苗存在散毒、价格等问题。虽然亚单位疫苗的效果低于活疫苗，但相对而言更容易生产，也比较方便和安全。亚单位疫苗的免疫效果决定抗原的保护性，当前已经报道的抗原大多只能提供部分保护性，因此，寻找新的免疫保护性抗原迫在眉睫。迄今鉴定的免疫保护性抗原包括顶膜抗原1，折光体蛋白，微线体蛋白，延伸因子1α，热休克蛋白，表面抗原，免疫定位蛋白1，前纤维蛋白等。
柔嫩艾美耳球虫复杂的生活史决定了其入侵机制的复杂性，因此整个入侵过程涉及到的蛋白分子也就较多，这些分子有已知的还有未知的。含有锌指结构域的一类蛋白被称为锌指蛋白(ZnFPs)。ZnFPs通过锌指结构在DNA、RNA和蛋白质的识别和结合过程中发挥重要作用。有研究发现，在一些植物如水稻，拟南芥，小麦和棉花中，ZnFPs参与抗胁迫以及植物的生长发育。在分枝杆菌中，MsZnFP1和MsZnFP2通过与RNA聚合酶相互作用激活转录。在真核生物中，ZnFPs广泛表达并参与包括细胞分化，增殖和凋亡在内的重要生物过程。在弓形虫中，TgZNF2可能在mRNA核输出中起关键作用。E.tenella是引发鸡球虫病最重要球虫种类之一，属于具有复杂生命周期的顶复门，需要入侵鸡的肠上皮细胞维系自身的生长和发育。我们推测EtZnFPs可能参与了柔嫩艾美耳球虫生命活动中的某些重要生物过程。然而，迄今为止还没有关于EtAN1-ZnFP的研究。
发明内容
本发明对柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白(AN1-like Zinc finger domain-containing protein，putative partial mRNA，EtAN1-ZnFP)进行克隆，并且在大肠杆菌BL21(DE3)表达系统中表达了重组蛋白GST-EtAN1-ZnFP(rEtAN1-ZnFP)。用重组蛋白免疫兔子制备抗rEtAN1-ZnFP多克隆抗体。通过间接免疫荧光检测EtAN1-ZnFP在虫体不同发育阶段的分布，并采用体外抑制实验评估抗EtAN1-ZnFP多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞的抑制作用。通过荧光定量PCR(qPCR)检测EtAN1-ZnFP在虫体不同发育阶段的转录水平，通过免疫保护实验评估rEtAN1-ZnFP对鸡感染球虫后的免疫保护作用。本研究结果表明EtAN1-ZnFP可能参与了柔嫩艾美耳球虫的入侵和生长发育。
针对以上问题，本发明一方面提供一种cDNA分子，其序列如SEQ ID No：12所示。所述的cDNA分子编码柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白；
本发明的另一方面在于提供如SEQ ID No：11所示的柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白；
本发明的另一方面在于提供用重组蛋白免疫兔子制备抗rEtAN1-ZnFP多克隆抗体，并提供这种抗体在对球虫子孢子入侵DF-1细胞的抑制作用中的应用；
本发明的另一方面在于提供EtAN1-ZnFP对鸡感染球虫后的免疫保护作用。
本发明的另一方面在于提供一种特异引物对，其可由用于扩增特异DNA片段的两条引物组成；所述特异DNA片段中具有EtAN1-ZnFP中引物F和引物R组成的引物对的靶序列；
所述引物F可为如下a1)或a2)：
a1)序列表的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子；
a2)将SEQ ID NO.1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.1或SEQ ID NO.5具有相同功能的DNA分子；
所述引物R可为如下a3)或a4)：
a3)序列表的SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子；
a4)将SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.6具有相同功能的DNA分子。
所述特异引物对具体可由所述引物F和所述引物R组成。
本发明还保护一种试剂盒，其含有上述任一所述特异引物对。
所述试剂盒的应用也属于本发明的保护范围。
所述EtAN1-ZnFP片段的应用也属于本发明的保护范围。所述DNA片段的应用可为如下b1)-b2)中的任一种：
b1)利用EtAN1-ZnFP蛋白免疫兔子制备抗rEtAN1-ZnFP多克隆抗体，并提供这种抗体在对球虫子孢子入侵DF-1细胞的抑制作用中的应用；
b2)利用抑制或者敲除EtAN1-ZnFP蛋白实现对球虫子孢子入侵DF-1细胞的抑制作用。本发明的有益效果是：
本发明柔嫩艾美耳球虫EtAN1-ZnFP基因，免疫荧光定位实验和体外抑制试验结果显示EtAN1-ZnFP与子孢子的入侵相关，在球虫子孢子入侵宿主细胞时发挥了重要作用。因此，本发明的EtAN1-ZnFP基因，为开发抑制子孢子入侵、阻断球虫生活史的新疫苗或新药提供了新思路。
附图说明
图1：EtAN1-ZnFP基因cDNA核苷酸序列及氨基酸序列的生物信息学分析
双下划线：酪蛋白激酶II磷酸化位点；黑色方框：AN1样锌指蛋白结构域；黑色阴影白色字体：N-豆蔻酰化位点；灰色阴影黑色字体：蛋白激酶C磷酸化位点；虚线黑色方框：A20样锌指蛋白结构域；黑色加粗小写字母：富含丙氨酸的区域；波浪线：锌指泛素水解酶；星号：终止密码子
图2：rEtAN1-ZnFP的表达和纯化
(A)SDS-PAGE分析：用IPTG诱导3-9h(泳道3至5)的rEtAN1-ZnFP，阴性对照(未用IPTG诱导)(泳道2)。(B)Western blot分析：抗GST单克隆抗体孵育的rEtAN1-ZnFP蛋白(泳道2)。(C)Western blot分析：兔抗柔嫩艾美耳球虫子孢子总蛋白血清孵育(泳道2)小鼠阴性血清孵育(泳道4)。泳道1和泳道3：蛋白分子量(kDa)
图3：EtZN1-ZnFP基因转录水平分析
UO：未孢子化卵囊；SO：孢子化卵囊；Spz：子孢子；Mrz：第二代裂殖子。字母不同表示差异显著(P＜0.05)，字母相同表示差异不显著(P＞0.05)
图4：间接免疫荧光检测EtAN1-ZnFP在不同虫体发育阶段的分布
A：PBS孵育2h的子孢子；B：完全培养基孵育2h的子孢子；C：入侵DF-1细胞48h；D：入侵DF-1细胞60h；E：入侵DF-1细胞82h；F：PBS孵育2h的第二代裂殖子
图5：抗rEtZN1-ZnFP多抗IgG对子孢子入侵DF-1细胞的抑制作用分析
Anti-rEtZN1-ZnFP：纯化后的EtZN1-ZnFP多抗；NA：正常兔血清IgG
图6：攻虫后9天细胞因子水平
A：血清IgG；B：CD4；C：CD8；D：IFN-γ；E：IL-10；F：IL-17；G：TGF-β1。字母不相表示差异显著(P＜0.05)，字母相同表示差异不显著(P＞0.05)
实施例
实施例1 EtAN1-ZnFP基因的获得及其功能分析
虫株
柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊上海株(资源编号：CAAS21111601)，由中国农业科学院上海兽医研究所原虫病创新团队分离并保存。
RNA提取和cDNA制备
使用TRIzol试剂(TaKaRa，Tokyo，Japan)根据使用说明书从未孢子化卵囊中提取总RNA。采用分光光度计(Eppendorf，Hamburg，Germany)在260nm处测定总RNA浓度。采用1％琼脂糖凝胶进行电泳评估RNA质量。采用Super Script III RT试剂，用未孢子化卵囊总RNA合成互补DNA(cDNA)。
扩增
使用上游引物5′-ATGAGCTCAGAGCAACACG-3′(SEQ ID NO.1)和下游引物5′-AAAGCTTCTGGAGTTTGTCTG-3′(SEQ ID NO.2)扩增EtAN1-ZnFP基因的ORF序列。采用未孢子化卵囊的cDNA作为模板，进行PCR扩增。总体系25，μL，程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，72℃持续延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并采用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Duesseldorf，Germany)回收目的条带。使用T4 DNA连接酶将EtAN1-ZnFP片段连接到pGEM-T-easy载体(Promega，Madison，WI，USA)上构建重组质粒T-EtAN1-ZnFP。重组质粒送生工生物(中国上海)采用上游引物SP6：5′-ATTTAGGTGACACTATAG-3′(SEQ ID NO.3)和下游引物T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′(SEQID NO.4)进行测序鉴定。同时，以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊上海株(资源编号：CAAS21111601)基因组为模板，进行PCR扩增，具体PCR体系和步骤如上所述，
生物信息学分析
使用ExPASy上的ProtParam工具(http：//web.expasy.org/protparam/)预测EtZN1-ZnFP的分子量和理论等电点。使用计算工具SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测编码蛋白有无信号肽，使用TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.O/)预测编码蛋白有无跨膜结构。采用MotifScan(http：//hits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)分析蛋白质基序。
核苷酸序列分析显示EtAN1-ZnFP ORF序列长度为798bp，编码265个氨基酸(蛋白序列如SEQ ID NO.11所示，全长核酸序列如SEQ ID NO.13所示，其中小写字母为内含子序列，剪接后的编码核酸如SEQ ID NO.12所示)，预测等电点为6.12。BLASTp分析显示，该序列分别与来自柔嫩艾美耳球虫(Genbank登录号：XP_013229520.1)，毒害型艾美耳球虫(Genbank登录号：XP_013436074.1)和巨型艾美耳球虫(Genbank登录号：XP_013335464.1)的预测的AN1样锌指蛋白具有100％，92％和63％的同源性。氨基酸序列与推测的柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白(蛋白ID：XP_013229520.1)具有100％同源性。SignalP程序分析显示该蛋白质不具有信号肽和跨膜结构域。蛋白序列分析显示，该蛋白质含有AN1样锌指和A20样锌指结构域。预测还显示该蛋白含有1个锌指泛素水解酶结构域(204-236aa)，3个酪蛋白激酶II磷酸化位点，2个N-豆蔻酰化位点和1个蛋白激酶C磷酸化位点(图1)。
实施例2 EtAN1-ZnFP表达与Western blot分析
使用分别带有限制性酶切位点BamHI和SalI(下划线)上游引物5′-GCGGATCCATGAGCTCAGAGCAACACGAAAACGAAAGGCCTTCTGCTCCGCCCTTGTGTGCGAAGAACTGCGGCTT-3(SEQ IDNO.5)′和下游引物5′-GCGTCGACTCAAAGCTTCTGGAGTTTGTCTG-3′(SEQ ID NO.6)采用PCR扩增EtAN1-ZnFPORF序列。用BamHI/SalI对扩增的片段和pGEX-4T-1载体进行双酶切。将BamHI/SalI双重消化的EtAN1-ZnFP片段和pGEX-4T-1载体进行琼脂糖凝胶回收，连接后将重组pGEX-4T-EtAN1-ZnFP质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中(天根，中国)。将测序正确后的菌落在37℃扩大培养，培养至OD值至0.6-1.0之间时加入1.0mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)(Sigma，St Louis，MO，USA)诱导表达8h。冰浴超声裂解菌体，超声2s，停2s，持续20min。使用谷胱甘肽亲和层析介质(Beyotime，Haimen，China)纯化rEtAN1-ZnFP蛋白。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime，Haimen，China)测定蛋白质浓度。以抗GST小鼠单克隆抗体和抗子孢子总蛋白多克隆抗体为一抗，以1∶15000的比例稀释后的IRDye800RD Goatanti-Rabbit IgG为二抗，进行Western blot分析。剩余蛋白存储于-20℃以用于后续分析。
用0.8mM IPTG于37℃诱导8小时后，通过连接表达载体pGEX-4T-1在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达rEtAN1-ZnFP。使用谷胱甘肽亲和层析柱从上清中纯化获得rErAN1-ZnFP。与GST标签融合的rEtAN1-ZnFP的分子量约为72kDa(图2A)，但大于预期(55kDa)。Westernblot分析显示，用抗GST单克隆抗体(图2B)和抗柔嫩艾美耳球虫子孢子的兔血清孵育后有条带(图2C，泳道2)，小鼠阴性血清孵育后则无目的条带(图2C，泳道4)。
实施例3 rEtAN1-ZnFP抗血清的制备
取200μg纯化的rEtAN1-ZnFP用等体积弗氏完全佐剂(Sigma，St Louis，MO，USA)乳化后皮下注射免疫2个月大的新西兰白兔。两周后，进行加强免疫，加强免疫采用弗氏不完全佐剂(Sigma，St Louis，MO，USA)进行乳化。每7天进行一次免疫，总共进行5次免疫。于最后一次免疫后7天，收集血液，分离多克隆抗体血清。阴性血清于免疫前从兔耳缘静脉采集血液后分离所得。
荧光定量PCR
为了检测EtAN1-ZnFP在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)的转录水平，提取4个阶段虫体RNA，去除基因组后，使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和随机引物(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)合成第一cDNA链。使用上游引物5′-CGTCGTCAGCAGTTCCCGCAGAGCA-3′(SEQ ID NO.7)和下游引物5′-CATCATCAGCAGGTTCTTGCGTAGG-3′(SEQ ID NO.8)，以4个阶段虫体cDNA为模板，利用SYBR GreenI对EtZN1-ZnFP在虫体4个阶段的转录水平进行检测。以柔嫩艾美耳球虫的18S核糖体RNA为参照，并使用上游引物5′-TGTAGTGGAGTCTTGGTGATTC-3′(SEQ ID NO.9)和下游引物5′-CCTGCTGCCTTCCTTAGATG-3′(SEQ ID NO.10)进行扩增。每个样品3个重复，实验重复三次。使用2-ΔΔCt方法计算EtAN1-ZnFP的相对表达水平。
EtZN1-ZnFP在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的分布
按照每孔2×105的量将DF-1细胞接种于放有细胞爬片的六孔板(Corning，NY，USA)中，加入2mL完全培养基(含有10％胎牛血清，100单位/mL双抗)在37℃细胞培养箱中培养24小时。将新鲜的柔嫩艾美耳球虫子孢子(每孔6×105寄生虫)在完全培养基中于41℃温育2小时后感染DF-1细胞，在感染后48，60和82h收集细胞爬片。所有样品在室温下o用4％多聚甲醛固定20min，用1％TritonX-100通透15min，然后用2％牛血清白蛋白于4℃冰箱封闭过夜。将样品用兔抗rEtAN1-ZnFP多克隆抗体以1∶100的比例在37℃下孵育2小时，然后用异硫氰酸酯(FITC)荧光素标记的山羊抗兔IgG(1∶500稀释)(Sigma，St Louis，MO，USA)在37℃孵育1h。细胞核用15μg/ml的4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Beyotime，Haimen，China)染色30min。每次孵育后，所有样品均用PBS洗涤4次。采用相同的方法处理子孢子和第二代裂殖子。简言之，将子孢子和第二代裂殖子均匀地涂布在细胞爬片上。然后，经4％多聚甲醛固定，1％Triton X-100和2％牛血清白蛋白封闭后，以兔抗rEtAN1-ZnFP多克隆抗体为一抗、FITC为二抗孵育样品，用DAPI标记细胞核。之后，于载玻片上滴加60μL抗荧光淬灭剂(Sigma，St.Louis，MO，USA)将细胞爬片反扣于载玻片上。采用激光共聚焦荧光显微镜(Zeiss LSM800显微镜，Carl Zeiss，Germany)观察拍照。
EtZN1-ZnFP基因在柔嫩艾美耳球虫四个阶段虫体内的转录
以柔嫩艾美尔球虫四个阶段虫体的cDNA为模板，通过荧光定量PCR评估不同发育阶段的EtAN1-ZnFP的转录水平。采用2-ΔΔCt公式计算EtAN1-ZnFP的相对表达量。结果显示，EtAN1-ZnFP转录水平在未孢子化的卵囊中最高，在子孢子阶段中度表达，在孢子化卵囊和第二代裂殖子中相对较低(图3)。
EtZN1-ZnFP在不同阶段虫体内的分布
收集新鲜纯化的子孢子和第二代裂殖子，部分子孢子和第二代裂殖子用PBS重悬后涂布于细胞飞片上，分别在入侵48h、60h和82h取出细胞飞片，经固定、通透和封闭，以抗EtZN1-ZnFP兔多克隆抗体为一抗，FITC标记的山羊抗兔为二抗，并用DAPI标记细胞核，采用间接免疫荧光的方法检测EtZN1-ZnFP蛋白在子孢子体外入侵DF-1细胞后的分布，同时检测其在未入侵细胞的子孢子和第二代裂殖子中的分布情况。结果显示，在用PBS或完全培养基(CM)孵育的子孢子中，除折光体外，EtAN1-ZnFP均匀分布在细胞质中。在CM中孵育2小时后，EtAN1-ZnFP的表达水平与PBS中表达的水平相同。在子孢子感染DF-1细胞48-60小时后，EtAN1-ZnFP均匀分布在未成熟裂殖体的细胞质中，且荧光强度增强。然而，在82小时分化成第一代成熟裂殖体后，EtAN1-ZnFP的表达水平降低，绿色荧光强度降低。此外，EtAN1-ZnFP主要位于第二代裂殖子的细胞膜和细胞质中(图4)。
实施例4抗EtZN1-ZnFP多克隆抗体体外抑制分析
接种DF-1细胞(每孔3×105个细胞)于24孔板(Coming，NY，USA)，加入1mL完全培养基(含有10％胎牛血清，100单位/mL双抗)在37℃细胞培养箱中培养16小时。参照说明书，使用Protein A+G琼脂糖(Beyotime，Haimen，China)纯化抗体，通过BCA蛋白质测定试剂盒(Beyotime，Haimen，China)测定IgG的浓度。参照说明书，使用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA SE)(Beyotime，Haimen，China)标记将新鲜纯化的子孢子，设置50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和300μg/mL4个抗体浓度梯度，向子孢子中分别加入纯化好的抗EtZN1-ZnFPIgG，37℃孵育2h，同时设置同浓度的兔IgG为对照，预留不用任何IgG孵育的带荧光标记的入侵DF-1细胞的为空白对照，不用任何IgG孵育的带荧光标记的且不入侵DF-1细胞的子孢子为阳性对照。之后，用子孢子(每孔6×105个)感染DF-1细胞，并在41℃细胞培养箱中培养12小时。用PBS洗涤细胞，再用胰蛋白酶消化，收获细胞，并使用流式细胞仪(型号CytomicsFC500；Beckman Coulter，California，USA)进行分析。所有样品设置3个重复。按照以下公式进行计算：入侵抑制率＝(1-处理后虫体的入侵率/正常虫体入侵率)*100％。
EtZN1-ZnFP的免疫保护评价
将rEtZN1-ZnFP蛋白进行纯化后，对鸡进行免疫，诱导其产生免疫应答，攻虫后，通过平均增重、卵囊输出量、盲肠病变计分、血便计分和血清中的细胞因子水平等指标来评价rEtAN1-ZnFP对鸡的免疫保护效果。雏鸡在无球虫条件下饲养到7日龄，将48只鸡(三黄鸡，上海奉贤区)随机分成4组，每组12只。将纯化好的rEtAN1-ZnFP蛋白用ISA71佐剂(Seppic，Puteaux，France)以3∶7的比例进行乳化，分别在7和14日龄进行免疫。按照分组，每只鸡皮下注射50μg或100μg乳化后的rEtZN1-ZnFP蛋白。阴性对照组用乳化后的PBS进行免疫。二免后7天，免疫组和攻虫对照组的鸡经口感染1.0×104的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，未免疫未攻虫对照组的鸡口服给予等体积的PBS。收集攻虫后7-9天的粪便。攻虫后第9天扑杀所有鸡，并收集血清和盲肠，根据Johnson和Reid的方法对盲肠病变进行评分。
通过平均增重、病变评分、粪便卵囊输出量和卵囊减少率来评估rEtZN1-ZnFP蛋白的保护效力。粪便中卵囊按照以下公式进行计算：
卵囊减少率＝[(攻虫非免疫组每只鸡排出了卵囊总量-攻虫免疫组每只鸡排出的卵囊总量)/攻虫非免疫组每只鸡排出的卵囊总量]*100％。
血清中IgG和细胞因子检测
对攻虫后第9天的鸡血清中的IgG采用ELISA进行检测，简言之，将96孔板(Corning，NY，USA)用纯化后的rEtAN1-ZnFP(10μg/孔)在4℃包被过夜。所有96孔板用浓度为0.1％的PBS-T洗涤4次，并用含有1％BSA在37℃封闭2h。将血清样品以1∶25稀释度(50μl/孔)加入96孔板，37℃孵育1h。用PBS-T洗涤4次后，加入50μL/孔HRP标记的驴抗鸡IgG抗体(1∶5000稀释)(Sigma，St.Louis，MO，USA)，37℃孵育2h。洗涤5次后，用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺显色。在OD450nm处检测吸光值。每个样品3个重复。
同时采用试剂盒对血清中的Th1型细胞因子CD4、CD8和IFN-γ，Th2型细胞因子IL-10和IL-17，以及Tred型细胞因子TGF-β1分别进行检测。检测步骤参照试剂盒说明书进行。
统计学分析
SPSS 22.0(SPSS，Chicago，IL，USA)用于统计平均增重、病变评分、粪便卵囊输出量和卵囊减少率。采用Windows的Microsoft Office Excel 2016(Redmond，Washington，USA)记录体重、卵囊计数抗体水平和细胞因子水平的原始数据。用GraphPad Prismversion 6.0(GraphPad，La Jolla，CA，USA)分析荧光定量PCR、入侵抑制、抗体和细胞因子水平等数据。通过单因素方差分析(ANOVA)和Duncan的多范围检验分析组间差异。P值小于0.05：差异显著，P值小于0.01：差异极显著。
体外抑制分析
在实施例3中看到EtZN1-ZnFP在入侵DF-1细胞后，其表达量有所增加，因此我们推测它们可能与柔嫩艾美耳球虫入侵细胞有关。所以，我们采用抗EtZN1-ZnFP的多克隆抗体进行了体外抑制实验，进一步检测EtZN1-ZnFP蛋白是否和虫体入侵相关。用50到300μg/mL的4个浓度梯度的抗体分别孵育子孢子，入侵DF-1细胞12h后采用贝克曼流式细胞仪检测子孢子入侵DF-1的情况。结果显示，入侵抑制率随着抗体浓度的增加而增加，入侵抑制率最高可达30％。且入侵抑制率在抗体浓度为100、200、300μg/mL时，与兔IgG相比差异显著(P＜0.05)(图5)，说明EtZN1-ZnFP在子孢子入侵DF-1细胞中发挥了一定作用
免疫保护效果
用50或100μg纯化的rEtAN1-ZnFP皮下免疫两次。免疫且攻虫组鸡的平均增重高于未免疫攻虫对照组，但差异不显著(P＞0.05)(表1)。rEtZN1-ZnFP/ISA71(50μg/只)组和rEtZN1-ZnFP/ISA71(100μg/只)组免疫组的平均增重低于未免疫未攻虫对照组，但仅rEtZN1-ZnFP/ISA71(100μg/只)组差异显著(P＞0.05)。两个免疫组的盲肠病变计分和粪便卵囊输出量显着低于未免疫攻虫对照组(P＜0.05)。rEtZN1-ZnFP/ISA71(50μg/只)组的盲肠病变计分和平均增重比rEtZN1-ZnFP/ISA71(100μg/只)组的效果好。然而，rEtZN1-ZnFP/ISA71(100μg/只)组的卵囊减少率比rEtZN1-ZnFP/ISA71(50μg/只)组更明显(表1)。
表1 rEtAN1-ZnFP蛋白对柔嫩艾美耳球虫感染的保护效果
a-d同一列中上标不同字母者表示差异极显著(P＜0.05)，相同者表示差异不显著(P＞0.05)。
血清中IgG和细胞因子水平
攻虫后第9天通过心脏采血，血清中IgG的水平采用ELISA进行检测，血清中CD4、CD8、IFN-γ、IL-10、IL-17和TGF-β1的水平采用细胞因子检测试剂盒进行检测。图5.2显示，rEtCHP/ISA71和rEtZN1-ZnFP/ISA71组血清中IgG水平显著高于未免疫对照组(P＜0.05)，攻虫组血清中IgG水平也显著高于未攻虫对照组，这说明柔嫩艾美耳球虫感染刺激机体产生了免疫应答；与攻虫未免疫对照组相比，rEtZN1-ZnFP/ISA71(50μg/只)组CD4水平显著升高(P＜0.05)；与攻虫未免疫对照组相比，rEtZN1-ZnFP/ISA71两个组CD8水平都显著升高(P＜0.05)；rEtCHP/ISA71两个组IL-17和TGF-β1水平显著高于攻虫未免疫对照组(P＜0.05)，但是，其他细胞因子水平与攻虫未免疫对照组相比差异均不显著(P＞0.05)。
尽管本发明的优选实施方案已在本文中进行了演示和描述，对于本领域的技术人员而言很明显这些实施方案仅以示例性的方式进行提供。本领域的技术人员在不脱离本发明的情况下可想到大量的改造、变动和替换。应当了解本文所述的本发明实施方案的多种不同的替代方案可被用于实施本发明。下列权利要求意图定义本发明的范围并且这些权利要求范围中的方法和结构及它们的等同物因此被涵盖在内。
Claims (3)
1.一种柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白的应用，所述应用为参与球虫子孢子入侵DF-1细胞的作用，所述柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：11所示，核酸序列如SEQ ID No：12或SEQ ID No：13所示。
2.如权利要求1的一种柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白的应用，所述应用为：利用外源表达系统表达纯化柔嫩艾美耳球虫AN1样锌指蛋白，用重组蛋白免疫兔子制备抗rEtAN1-ZnFP多克隆抗体，并利用这种抗体实现对球虫子孢子入侵DF-1细胞的抑制作用。
3.如权利要求2所述的应用，具体为：
(1)使用TRIzol试剂根据使用说明书从未孢子化卵囊中提取总RNA；采用分光光度计在260nm处测定总RNA浓度；采用1％琼脂糖凝胶进行电泳评估RNA质量；采用Super ScriptIII RT试剂，用未孢子化卵囊总RNA合成互补DNA；
(2)使用分别带有限制性酶切位点BamHI和SalI上游引物5′-GCGGATCCATGAGCTCAGAGCAACACGAAAACGAAAGGCCTTCTGCTCCGCCCTTGTGTGCGAAGAACTGCGGCTT-3′和下游引物5′-GCGTCGACTCAAAGCTTCTGGAGTTTGTCTG-3′采用PCR扩增EtAN1-ZnFPORF序列；
(3)用BamHI/SalI对扩增的片段和pGEX-4T-1载体进行双酶切，将BamHI/SalI双重消化的EtAN1-ZnFP片段和pGEX-4T-1载体进行琼脂糖凝胶回收，连接后将重组pGEX-4T-EtAN1-ZnFP质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；将测序正确后的菌落在37℃扩大培养，培养至OD值至0.6-1.0之间时加入1.0mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导表达8h；冰浴超声裂解菌体，超声 2s，停2s，持续20min；
(4)使用谷胱甘肽亲和层析介质纯化rEtAN1-ZnFP蛋白；
(5)取200μg纯化的rEtAN1-ZnFP用等体积弗氏完全佐剂乳化后皮下注射免疫2个月大的新西兰白兔；两周后，进行加强免疫，加强免疫采用弗氏不完全佐剂进行乳化；每7天进行一次免疫，总共进行5次免疫；于最后一次免疫后7天，收集血液，分离多克隆抗体血清；
(6)接种DF-1细胞，每孔3×105个细胞，于24孔板，加入1mL完全培养基，含有10％胎牛血清，100单位/mL双抗，在37℃细胞培养箱中培养16小时；使用ProteinA+G琼脂糖纯化抗体，通过BCA蛋白质测定试剂盒测定IgG的浓度；使用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯标记将新鲜纯化的子孢子，设置50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和300μg/mL4个抗体浓度梯度，向子孢子中分别加入纯化好的抗EtZN1-ZnFP IgG，37℃孵育2h。
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