CN111518788B - 一种柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株的分子标记及其应用 - Google Patents

一种柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株的分子标记及其应用，其中的分子标记为柔嫩艾美耳球虫ASNA1同源的ATP酶（EtASNA1），发现在地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株的mRNA的转录和蛋白表达明显高于敏感株；通过体外培养实验和体内实验检测了药物刺激对EtASNA1转录水平的影响，发现药物的加入会引起其表达的上调。抗体抑制试验检测EtASNA1参与了虫体入侵宿主细胞。本研究结果表明EtASNA1可能参与了柔嫩艾美耳球虫的入侵和生长发育，可能与柔嫩艾美耳球虫耐药性的形成密切相关，可能在对抗药物方面发挥着重要的功能。

Description

一种柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种柔嫩艾美耳球虫敏感株与地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株的分子标记及其应用，所述分子标记为柔嫩艾美耳球虫ASNA1同源的ATP酶（EtASNA1）蛋白。
背景技术
鸡球虫病是由几种艾美耳球虫引起一种严重的肠道寄生虫病，柔嫩艾美耳球虫是其中对鸡危害最严重的，发病最广的一种。药物治疗是目前最常用的治疗方法，抗球虫药物的广泛使用也加剧了球虫耐药性的问题。然而至今都没有找到球虫耐药性形成的机制，也没有找到控制球虫产生耐药性的靶基因。随着耐药性的普遍产生，抗球虫药物出现了防治效果逐渐降低甚至失效的现象。因此，为能够有效的指导现场用药，成功防治鸡球虫病的爆发，找到快速检测球虫耐药性的方法显得尤为重要。耐药性机制复杂，涉及广泛，可能与核基因突变、基因表达水平上调或下调的变化和表观遗传学如甲基化修饰等方面有关。近期通过蛋白质组学的研究表明，对聚醚类离子载体抗球虫药耐药的虫株中鉴定出97 种蛋白中有 25 种存在差异，其中肌动蛋白在耐药虫株中明显上调表达而微线蛋白则显著下调表达。这些研究都指示了在敏感株和耐药株中差异表达的基因在耐药性研究中的重要作用。但是，目前的检测方法应用性并不普遍，主要是由于没有找到耐药性相关的靶基因，无法解释球虫耐药性产生的分子机理，因此在利用现代分子生物学等技术鉴定球虫耐药性相关的靶基因，建立更加简单易行又快速的耐药性检测技术是未来耐药性分子诊断的发展趋势。
ASNA1是一种与大肠杆菌ATP酶ARSA同源的与砷的转运有关的蛋白。它在某些肿瘤甚至在某些正常细胞中高度表达，并参与调节细胞对砷、锑和铂的敏感性，以及细胞凋亡和内质网应激等生物过程，而且缺乏必要的临床试验数据的支持，更多的停留在理论推论阶段。以往的研究表明，ASNA1的下调导致线虫的生长停滞和对亚砷酸盐敏感性增加，胰岛素分泌减少，人类生长迟缓和凋亡增加。然而，由于筛选难度大，实验难以操作等因素，未见ASNA1在柔嫩艾美耳球虫中的报道。
此外，为了研究蛋白与球虫耐药性相关性的过程中，鸡球虫对某种药物耐药的单一耐药株的获得极其困难，虽然鸡球虫在田间长期用药的过程中较易对抗球虫药产生耐药性，但是鸡场用药复杂，产生的耐药株对多个药物同时耐药，即多重耐药或交叉耐药，不利于耐药基因的筛选。在本领域内并没有成熟的方法可以实现耐药株的筛选，从而也就无法实现蛋白与球虫耐药性相关性的研究，这也成为现阶段制约球虫耐药性相关性蛋白或者标志物获得的瓶颈。
发明内容
为了解决上述在实际生产中存在的问题和缺陷，本发明首先提供一种球虫耐药株的筛选获得方法，所述方法为：采用药物浓度逐渐递增的方法从柔嫩艾美耳球虫敏感株中诱导获得了柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株和柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素耐药株，分别以0.05ppm地克珠利为起始诱导浓度，经过18次传代诱导获得了柔嫩艾美耳球虫对1.2ppm地克珠利的耐药虫株；以2.0ppm马杜拉霉素为起始诱导浓度，经过20次传代诱导获得了柔嫩艾美耳球虫对7.0ppm马杜拉霉素的耐药虫株。采用鸡体试验法，以抗球虫指数（ACI）、最适抗球虫活性百分率（POAA）、病变记分减少率（RLS）和相对卵囊产量（ROP）4项指标，评价了2个耐药株对地克珠利和马杜拉霉素的抗性，其中地克珠利耐药株对1.2ppm地克珠利具有完全抵抗力，而对马杜拉霉素完全敏感；马杜拉霉素耐药株对7. 0ppm的马杜拉霉素具有完全抵抗力，而对地克珠利完全敏感。
进一步的，其中所述的18次传代诱导具体为：0.05ppm(3 代)- 0.1ppm(3 代)-0.2ppm(3代)-0.5 ppm(2 代)-0.8 ppm( 2 代), 1.0ppm(2 代) -1.2 ppm (3 代)；
进一步的，其中所述的20次传代诱导具体为：2.0ppm(4代)- 3.0ppm(4代)-4.0ppm(6代)-5.0 ppm(3代) - 7.0 ppm (3代)。
另外，本发明提供了一种柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株的分子标记及其应用，更具体的是，一种柔嫩艾美耳球虫敏感株与地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株的虫体的分子标记及其应用。其中，所述的分子标记为柔嫩艾美耳球虫ASNA1同源的ATP酶（EtASNA1）。
其中柔嫩艾美耳球虫EtASNA1蛋白，其序列如SEQ ID No:1所示，其编码序列如SEQID No:2所示。
进一步的，本发明提供一种EtASNA1作为分子标记在制备检测柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的试剂盒中的应用。
检测时可以通过基因水平或者蛋白水平进行上述两种蛋白表达水平的检测。本发明研究发现，EtASNA1在未孢子化卵囊和第二代裂殖子阶段较高，在子孢子阶段最低。
进一步的，本发明提供一种EtASNA1作为分子标记在制备检测柔嫩艾美耳球虫敏感株与地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株的虫体的试剂盒中的应用。
检测时可以通过基因水平或者蛋白水平进行上述蛋白表达水平的检测。本发明研究发现，与柔嫩艾美耳球虫敏感株相比，EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株及柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素耐药株中的表达量呈现显著上调的趋势。而且体内体外的药物刺激会上调EtASNA1的表达，随着药物浓度的升高，其转录水平逐渐上升。EtASNA1在田间分离的野生柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株的转录水平也显著高于敏感株，且表达水平会因为柔嫩艾美耳球虫对药物的敏感性不同而有差异。
本发明的另一方面在于提供用重组蛋白免疫兔子制备抗EtASNA1的多克隆抗体，并提供这种抗体在对球虫子孢子入侵DF-1细胞的抑制作用中的应用；
本发明的另一方面在于提供抗EtASNA1的多克隆抗体对鸡感染球虫后的免疫保护作用。
有益效果
本发明通过独特的传代手段获得了柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株和柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素耐药株，其中地克珠利耐药株对1.2ppm地克珠利具有完全抵抗力，而对马杜拉霉素完全敏感；马杜拉霉素耐药株对7.0ppm的马杜拉霉素具有完全抵抗力，而对地克珠利完全敏感。这两个耐药株和敏感株遗传背景一致，为后续转录组学分析提供基础。
本发明涉及到的柔嫩艾美耳球虫ASNA1同源的ATP酶（EtASNA1），免疫荧光定位实验和体外抑制试验结果显示EtASNA1与子孢子的入侵相关，在球虫子孢子入侵宿主细胞时发挥了重要作用。因此，本发明的EtASNA1基因，为开发抑制子孢子入侵、阻断球虫生活史的新疫苗或新药提供了新思路。
附图说明
图1： EtASNA1的基因扩增及其蛋白表达，其中，A：EtASNA1基因的PCR扩增，M：DNA分子量标准（DL2000）；B：重组蛋白EtASNA1的表达，M：蛋白分子量标准；1：沉淀；2：上清。
图2：EtASNA1在虫体不同发育阶段的转录水平；SO：孢子化卵囊；UO：未孢子化卵囊；SZ：子孢子；SM；第二代裂殖子。
图3：EtASNA1在虫体不同发育阶段的翻译水平，A：Western Blot结果；B：灰度分析结果； SO：孢子化卵囊；UO：未孢子化卵囊；SZ：子孢子；SM；第二代裂殖子。
图4：EtASNA1在虫体内的分布定位 ( A)：PBS孵育的子孢子；(B)：PBS孵育的裂殖子；(C)：子孢子感染DF-1细胞12 h； (D)：感染24 h的未成熟裂殖体；(E)：入侵48 h的未成熟裂殖体；(F)：入侵72 h的未成熟裂殖体。
图5 EtASNA1基因在柔嫩艾美耳球虫敏感株和耐药株的转录与翻译水平，A：EtASNA1基因的mRNA转录水平；B：EtASNA1基因的翻译水平；C：灰度分析；DS：敏感株；DZR：地克珠利耐药株；MRR：马杜拉霉素耐药株。
图6 EtASNA1在不同耐药株中的mRNA转录水平，DS：敏感株；DZR：地克珠利耐药株；MRR：马杜拉霉素耐药株；Sal：盐霉素耐药株
图7 EtASNA1在不同浓度地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株中的转录水平。
图8 EtASNA1在分离的柔嫩艾美耳球虫野生地克珠利耐药株中的转录水平，DS：敏感株；D2, D4, D5, D8: 单卵囊分离的几个野生株中随机选取的4株； DZR：地克珠利耐药株
图9体外实验：地克珠利作用柔嫩艾美耳球虫敏感株和地克珠利耐药株后对EtASNA1转录水平的影响。DS(+):敏感株子孢子培养过程中添加地克珠利；DS(-)敏感株子孢子培养过程中不添加药物；DZR(+):地克珠利耐药株子孢子培养过程中添加地克珠利；DZR(-)：地克珠利耐药株子孢子培养过程中不添加药物。
图10体外实验：马杜拉霉素作用柔嫩艾美耳球虫敏感株和马杜拉霉素耐药株对EtASNA1转录水平的影响。DS(+):敏感株子孢子培养过程中添加马杜拉霉素；DS(-)敏感株子孢子培养过程中不添加药物；MRR(+):马杜拉霉素耐药株子孢子培养过程中添加马杜拉霉素；MRR(-)：马杜拉霉素耐药株子孢子培养过程中不添加药物。
图11体内实验：药物刺激对EtASNA1转录水平的影响。DS：敏感株感染鸡后无药物饲喂；DZR（-）：地克珠利耐药株感染鸡后不饲喂药物组；DZR（+）：地克珠利耐药株感染鸡后饲喂药地克珠利(1ppm)组；MRR（-）：马杜拉霉素耐药株感染鸡后不饲喂药物组；MRR（+）：马杜拉霉素耐药株感染鸡后饲喂马杜拉霉素(5ppm)实验组。
图12兔抗rEtASNA1多克隆抗体对子孢子入侵DF-1细胞的影响。
实施例
实施例1 EtASNA1基因的克隆和表达
实验虫株和实验动物
本研究中使用的实验虫株和实验动物全部由中国农业科学院上海兽医研究所提供。
提取和cDNA制备
使用TRIzol试剂从纯化好的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA，并使用M-MLV反转录试剂盒将其反转录为cDNA第一链用于PCR扩增的模板。
扩增
使用表1中的引物，利用常规的PCR扩增手段获得扩增EtASNA1基因的ORF序列，如SEQ ID NO. 1所示。
表1 PCR引物
名称 序列
<i>Et</i>ASNA1 UP：5'-ATGACAGACGACGAGTTTCCCCTTG-3'（SEQ ID NO.3）
LP：5'-TGCATCAATTCGGCGAAAGAAAGGG-3'（SEQ ID NO.4）
根据EtASNA1基因的ORF序列，设计引物，以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的cDNA为模板，通过PCR对EtASNA1基因进行扩增。之后将扩增获得的片段纯化回收后与pGEM-Teasy载体进行连接，转化，经过菌液PCR的鉴定，得到了与预期大小一致的条带，如图1A所示。将菌液送上海生工生物公司测序，测序结果与预期一致，说明我们成功克隆了EtASNA1基因。并通过常规生物实验对其进行蛋白表达并进行SDS-PAGE分析，如图1B所示。
用纯化的rEtASNA1分别免疫巴贝斯小鼠和新西兰大白兔获得兔抗或鼠抗重组蛋白的多克隆抗体，具体步骤如下：纯化的重组蛋白用BCA试剂盒（碧云天）测定其浓度，按照兔子200μg/只，小鼠50μg/只的量进行免疫。将弗氏完全佐剂与重组蛋白按照1:1的比例混合乳化，之后用皮下注射的方式分别免疫小鼠和兔子。两周后，用弗氏不完全佐剂与重组蛋白等体积混合乳化，对小鼠和兔子进行增强免疫，之后每7天进行一次免疫接种，共进行5次免疫接种，最后一次免疫后一周收集抗重组蛋白多克隆抗体。
EtASNA1的序列分析结果表明，408bp的开放阅读框(ORF)序列编码了135个氨基酸残基的多肽，预测分子质量为14.6kDa，无跨膜结构域和信号肽。预测蛋白的结构功能域发现，EtASNA1含有两个N-糖基化位点（位点位置：62-65和102-105）、一个ATP/GTP结合位点基序A（位点位置：28-35）、一个cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点（位点位置：48-51）、三个酪蛋白激酶II磷酸化位点（位点位置：2-5、11-14和129-132）、两个N-肉豆蔻酰化位点（位点位置：27-32和123-128）、两个蛋白激酶C磷酸化位点(位点位置：20-22和68-70），蛋白异戊二烯基转移酶α亚基重复序列（位点位置：123-135），阴离子运输ATPase（位点位置：21-134），a CobQ / CobB / MinD / ParA核苷酸结合（位点位置：23-68），4Fe-4S铁硫簇结合蛋白，NifH / frxC家族（位点位置：22-59）和NB-ARC域（位点位置：8-41）。
实施例2 EtASNA1基因的差异化表达及其定位
为了检测EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的mRNA转录水平，我们用未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的cDNA第一链为模板，以18S rRNA作为内参，分别利用qPCR和Western Blot的方法分析了EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫四个不同发育阶段的转录和翻译水平。
其中，qPCR（荧光定量PCR）的引物为：EtASNA1-AP 5'- GGCGTCGGCAAGACAACCAC -3' （SEQ ID NO.5）和EtASNA1-SP 5'- GTGGACAGCAGCAGCACTGATTC -3' （SEQ ID NO.6）。
结果如图2、图3所示，结果证实， EtASNA1的mRNA转录水平在未孢子化卵囊和第二代裂殖子阶段较高，在子孢子阶段最低。通过图3我们可以看出EtASNA1翻译水平在未孢子化卵囊和第二代裂殖子阶段较高，而在其他阶段较低，这一结果也与qPCR的结果相一致。
进一步，运用间接免疫荧光的方法分析了EtASNA1在虫体内的分布定位。收集新鲜纯化的子孢子和第二代裂殖子，以及子孢子入侵DF-1细胞不同时间段的虫体，将其固定在玻片上，用兔抗rEtASNA1多克隆抗体为一抗，FITC标记的山羊抗兔为二抗，DAPI染核，使用荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察定位结果，从图4中可以看出，A和B是在子孢子和第二代裂殖子中的定位结果，我们可以看到， EtASNA1定位于子孢子除折光体外的大部分区域和第二代裂殖子的整个细胞质中。当子孢子入侵到DF-1细胞后，从子孢子逐步发育成滋养体，未成熟裂殖体的过程中EtASNA1始终分布在虫体的大部分区域。但当滋养体新发育为未成熟裂殖体时，荧光强度显著增加，但随着虫体进一步发育为未成熟裂殖体后，荧光强度减弱。
实施例3 EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株中的差异分析
利用qPCR的方法，以柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株及马杜拉霉素耐药株的孢子化卵囊cDNA第一链为模板，18S rRNA为内参，研究EtASNA1的mRNA在柔嫩艾美耳球虫敏感株和地克珠利耐药株及马杜拉霉素耐药株中的转录水平。结果发现，与敏感株相比，EtASNA1在地克珠利耐药株及马杜拉霉素耐药株中表达量显著上调，这与之前转录组测序的结果一致。之后，我们以柔嫩艾美耳球虫敏感株、地克珠利耐药株及马杜拉霉素耐药株的孢子化卵囊的虫体蛋白为模板，兔抗rEtASNA1多克隆抗体为一抗，用Western Blot的方法，将anti-α-tubulin作为内参，比较了EtASNA1在敏感株和地克珠利耐药株及马杜拉霉素耐药株中的翻译水平。我们发现，同样的，与敏感株相比，EtASNA1在地克珠利耐药株及马杜拉霉素耐药株中的表达量也呈现显著上调的趋势（图5）。
我们实验室另外诱导了柔嫩艾美耳球虫盐霉素的耐药株，我们比较了EtASNA1在敏感株，地克珠利耐药株，马杜拉霉素耐药株及盐霉素耐药株的转录水平，结果发现EtASNA1在盐霉素耐药株中的转录水平虽然也高于敏感株，但与地克珠利耐药株，马杜拉霉素耐药株相比，在统计学上并不显著（图6）。
通过上述实验证明：与敏感株相比，EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株和马杜拉霉素耐药株中显著上调表达。其中EtASNA1在地克珠利耐药株上调表达的Ratio比值为2.5，在马杜拉霉素耐药株中上调表达的Ratio比值为2.3。因此上述蛋白可以作为柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株的区分分子标记。
实施例4 EtASNA1在柔嫩艾美耳球虫不同耐药株中的差异分析
保存在2.5%重铬酸钾中的不同浓度的地克珠利耐药株（0.2ppm,0.5ppm,0.8ppm,1ppm）和马杜拉霉素耐药株（3ppm， 5ppm）用清水离心清洗2-3次以洗去重铬酸钾，显微镜下计数，以3万每只的量以灌胃的方法接种14日龄无球虫污染的雏鸡，收集感染后第6-8天的粪便，收集纯化孢子化卵囊。在接种后到收集卵囊期间将相应浓度的地克珠利或马杜拉霉素均匀拌在饲料中饲喂鸡。
我们以0.2ppm,0.5ppm,0.8ppm, 1ppm地克珠利耐药株孢子化卵囊cDNA第一链以及3ppm，5ppm马杜拉霉素的耐药株孢子化卵囊cDNA第一链为模板，18S rRNA为内参，通过qPCR的方法研究了药物浓度与EtASNA1转录水平的关系。图7是EtASNA1的mRNA转录水平受药物浓度影响的结果，可以看到，随着耐药株药物浓度的升高，EtASNA1的转录水平也在不断升高，与敏感株相比， 0.8ppm和1.0ppm的地克珠利耐药株和5ppm马杜拉霉素耐药株与敏感株相比存在显著差异。
我们从野外采集获得了鸡球虫田间株，鸡体药物敏感性试验发现对地克珠利存在完全耐药，于是我们用单卵囊的方法分离出了几株柔嫩艾美耳球虫田间地克珠利耐药株，并以它们的孢子化卵囊cDNA第一链为模板，利用qPCR的方法研究了其转录水平。从图8我们可以看到，与敏感株相比，EtASNA1在野生地克珠利耐药株中的转录水平呈现显著的上调。
实施例5 药物作用柔嫩艾美耳球虫敏感株和耐药株后对EtASNA1表达的差异分析
我们研究了在敏感株和地克珠利耐药株以及马杜拉霉素耐药株子孢子体外繁殖过程中药物的加入对EtASNA1转录水平的影响。用“+”来表示在繁殖过程中添加药物，“-”表示繁殖过程不添加药物。
体外培养试验：
在细胞培养用的6孔板中以每孔30万细胞的初始量培养DF-1细胞，在37 °C和5%CO2条件下培养12h。然后将新鲜提取的柔嫩艾美耳球虫敏感株，地克珠利耐药株以及马杜拉霉素耐药株的子孢子分别以每孔60万的量加入到DF-1细胞中。感染24h后，每孔加入1 mLPBS，轻轻晃动，吸出PBS，重复三次以洗去未入侵的子孢子，可在倒置显微镜下观察。之后加入DMEM继续培养，进一步孵育24h，即在感染48 h后，向敏感株子孢子感染组加入地克珠利(10μg/mL)或马杜拉霉素(10μg/mL)，向地克珠利耐药株子孢子感染组中加入地克珠利(10μg/mL)，向马杜拉霉素耐药株子孢子感染组中加入马杜拉霉素(10μg/mL)。加入药物后，继续培养48小时，即感染后48-96h与药物共培养，感染96 h时，虫体已基本全部发育为裂殖子或成熟裂殖体。收集细胞和虫体，提取中RNA，反转录cDNA第一链，利用qPCR分析了EtASNA1的mRNA转录水平。
图9是地克珠利耐药株组与敏感组的比较，可以看出地克珠利耐药株EtASNA1的转录水平显著高于敏感株。结果显示无论是在敏感株还是在地克珠利耐药株中，地克珠利的加入都会导致EtASNA1转录水平的提高。
图10是马杜拉霉素耐药株组与敏感组的比较，同样可以清楚地看到，马杜拉霉素耐药株的转录水平高于敏感株。在马杜拉霉素耐药株组中，马杜拉霉素的加入会导致EtASNA1转录水平的显著提高，但在敏感株中，这种上升趋势在统计学上并不显著。
体内试验：
此外，我们还研究了柔嫩艾美耳球虫敏感株，地克珠利耐药株以及马杜拉霉素耐药株在鸡体内发育过程中是否饲喂药物对EtASNA1转录水平的影响。将保存在重铬酸钾中的柔嫩艾美耳球虫敏感株，地克珠利耐药株以及马杜拉霉素耐药株卵囊分别清洗干净，以3万每只的量接种14日龄无球虫感染鸡。实验分为敏感株感染、无药物饲喂对照组(DS)；地克珠利耐药株感染、无药物饲喂对照组(DZR-)；地克珠利耐药株感染、饲喂地克珠利(1ppm)实验组(DZR+)；马杜拉霉素耐药株感染、无药物饲喂对照组(MRR-)；马杜拉霉素耐药株感染、饲喂马杜拉霉素(5ppm)实验组(MRR+)，药物以拌料的方式饲喂。接种后第五天时，将鸡剖杀，收集盲肠，收集各组第二代裂殖子，提取总RNA，反转录成cDNA第一链，并以此为模板进行qPCR，研究EtASNA1在各组中的mRNA转录水平的变化。图11显示， EtASNA1在两个耐药菌株的转录水平均显著高于敏感株，这与我们之前的qPCR和Western Blot结果一致。此外无论是在地克珠利耐药株组还是马杜拉霉素耐药株组，药物的加入都会导致其转录水平的显著提高，这也与体外实验的结果相吻合。
实施例5 兔抗重组蛋白rEtASNA1多克隆抗体体外抑制分析
分别选取了纯化的50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL以及400μg/mL的兔抗重组蛋白rEtASNA1多克隆抗体 IgG来孵育子孢子，同时用相同浓度的兔阴性IgG作为对照，观察其是否会影响子孢子的体外入侵，结果显示兔抗rEtASNA1多克隆抗体对子孢子入侵的抑制效果，从图12中我们可以看到，抑制作用是剂量依赖性的，随着抗体浓度的上升，其抑制率也在上升。在400μg/mL浓度下，兔抗rEtASNA1多克隆抗体对子孢子入侵细胞的抑制率达到了20%以上，且300μg/mL和400μg/mL兔抗rEtASNA1的IgG预处理组抑制率与阴性兔血清IgG相比有显著差异。相比之下，阴性兔血清IgG对子孢子的入侵无明显影响。
尽管本发明的优选实施方案已在本文中进行了演示和描述，对于本领域的技术人员而言很明显这些实施方案仅以示例性的方式进行提供。本领域的技术人员在不脱离本发明的情况下可想到大量的改造、变动和替换。应当了解本文所述的本发明实施方案的多种不同的替代方案可被用于实施本发明。下列权利要求意图定义本发明的范围并且这些权利要求范围中的方法和结构及它们的等同物因此被涵盖在内。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 一种柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株的分子标记及其应用
<130> 6
<160>
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 135
<212> 氨基酸
<213> EtASNA1
<400> MTDDEFPLEGSLDELINTPTLKWIFVGGKGGVGKTTTSCAIATKLAEKRESVLLLSTDPAHNLSDALTQKFSSTPTLVKGFSNLYAMEIDSKPHEATEFNLNASKEANDFAKFLPEIIHAVPGIDEALSFAELMQ
<210> 2
<211> 408
<212> DNA
<213> EtASNA1核苷酸序列
<400>
ATGACAGACG ACGAGTTTCC CCTTGAGGGG AGCCTAGACG AGTTAATTAA CACTCCTACTTTAAAATGGA TCTTTGTGGG GGGAAAAGGC GGCGTCGGCA AGACAACCAC AAGCTGCGCC ATAGCGACGAAGCTTGCAGA GAAGAGAGAA TCAGTGCTGC TGCTGTCCAC TGACCCCGCC CACAACCTCA GCGACGCCCTCACCCAAAAG TTCAGCAGCA CTCCAACCCT AGTTAAGGGT TTTAGCAATC TCTACGCCAT GGAAATCGACTCGAAACCCC ACGAAGCCAC GGAGTTCAAT TTAAATGCTT CAAAAGAGGC AAATGACTTC GCCAAATTTCTTCCGGAAAT TATCCACGCG GTTCCCGGCA TTGACGAGGC CCTTTCTTTC GCCGAATTGA TGCAGTAG
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> EtASNA1上游引物
<400> ATGACAGACGACGAGTTTCCCCTTG
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> EtASNA1下游引物
<400> TGCATCAATTCGGCGAAAGAAAGGG
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> EtASNA1-AP
<400> GGCGTCGGCAAGACAACCAC
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> EtASNA1-SP
<400>GTGGACAGCAGCAGCACTGATTC

Claims (1)

1.一种柔嫩艾美耳球虫敏感株与地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株的虫体的分子标记在制备检测柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的试剂盒中的应用，其特征在于所述的分子标记为柔嫩艾美耳球虫ASNA1同源的ATP酶EtASNA1，其中，柔嫩艾美耳球虫ASNA1同源的ATP酶EtASNA1的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，所述的柔嫩艾美耳球虫ASNA1同源的ATP酶的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述不同发育阶段为未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子。
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