CN106854653A - 柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫基因，该基因为柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明的柔嫩艾美耳球虫基因，是柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段高表达的基因，与子孢子入侵宿主细胞相关，对开发抑制子孢子入侵宿主细胞、阻断球虫生活史的新疫苗或新药具有很高的应用价值。

Description

柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因及其应用。

背景技术

鸡球虫病是几种艾美耳球虫寄生肠道所引起的一种危害极其严重的全球性寄生虫病，严重危害鸡的生长发育，是集约化养鸡业危害最大的疾病之一，每年给养鸡业造成巨大的经济损失。柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是致病性最为严重的鸡球虫之一，它主要寄生于盲肠及其附近区域，能引起出血性肠炎，对雏鸡危害最大，严重时能引起较高的死亡率。目前控制鸡球虫病的方法主要以在饲料中添加抗球虫药物预防为主，但由于抗球虫药的长期使用，鸡球虫耐药性的产生已成为无法避免的问题，任何一种抗球虫药在使用一定时间后都会引起球虫的耐药性，使得许多抗球虫药的防治效果显著降低，甚至完全失效，即使提高药物浓度也无济于事，仍然爆发球虫病，给养鸡业带来了无法弥补的损失。

钙元素广泛的存在于自然界和各种生物体内，而游离态的Ca²⁺更是在生命活动中扮演着极其重要的角色，它几乎参与了生命体所有的生理生化活动。在所有真核生物细胞中，钙离子(Ca²⁺)是细胞内一种重要的信号分子，作为第二信使在许多细胞和生理功能中发挥重要的作用。当细胞受到激素或电刺激后，胞浆内的Ca²⁺浓度升高，可引起细胞内的一系列生理反应。

顶复器原虫是一种真核生物，需要入侵宿主细胞后在宿主细胞内生长、发育繁殖等，而Ca²⁺在顶复器原虫的整个生活史发育中起着不可缺少的作用，控制着许多重要生理过程，包括调控虫体蛋白的分泌、运动、分化及入侵和逃逸宿主细胞等，同样，Ca²⁺也控制着虫体在宿主细胞内的生长发育。虽然Ca²⁺在真核生物细胞的信号传导通路中发挥着重要功能，但细胞内Ca²⁺的浓度是瞬时变化的，聚集也是非常短暂的。Ca²⁺能否将信号快速准确的传递给下游分子，取决于与Ca²⁺结合的蛋白。因此，与Ca²⁺结合的蛋白在Ca²⁺信号通路中非常关键。在哺乳动物细胞中，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)和钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶(calcium/calmodiulin dependent protein kinase，CaMK)是Ca²⁺信号通路中重要的效应分子。但顶复器原虫体内缺少PKC，仅有少量的CaMK异构体，而代替这两类激酶的是另一类丝/苏氨酸激酶——钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases，CDPKs),CDPKs是顶复器原虫体内最丰富的一类Ca²⁺依赖的激酶。CDPKs的全称是钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶或类似钙调素结构域的蛋白激酶(calmodulin-like domain protein kinases)，CDPKs是一个由多基因编码的大家族,它不同于哺乳动物细胞中的PKC和CaMK。迄今为止，仅在植物、绿藻、纤毛虫及顶复器原虫体内发现CDPKs，而在细菌、真菌、酵母、线虫和动物中尚未发现。已有研究表明：CDPKs是疟原虫和弓形虫Ca²⁺信号通路中重要的效应分子，不同的CDPKs表达具有虫体发育阶段特异性，控制许多至关重要的Ca²⁺依赖的生理过程，包括微线的分泌、细胞骨架的动力学和运动复合体的调控等，从而影响虫体的滑移运动、细胞入侵和逃逸、发育阶段的转化、分化繁殖等。

目前对CDPKs在鸡球虫生活史中的功能还不是很清楚，有待作进一步研究，为研发新治疗药物和研制新型疫苗提供新思路。

发明内容

本发明要解决针对药物防治球虫病极易产生耐药性的问题急需开发新型疫苗和新药的技术问题，提供一种柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因(Et CDPK4)，该Et CDPK4在柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞过程中起着重要作用，对开发防治鸡球虫病的新疫苗或新药具有很高的应用价值。

此外，还需要提供一种柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种柔嫩艾美耳球虫基因，该基因为柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因(Et CDPK4)，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明利用5’RACE和3’RACE首次扩增了完整的Et CDPK4基因序列，该序列全长2499bp(SEQ ID NO.1)，包括5’端的UTR序列，长185bp，3’端UTR序列，长511bp，含Ploy(A)尾，ORF长1803bp(186-1988bp)。其中5’-UTR和3’-UTR，可通过一些调控因子的结合来对该基因的表达进行调控。mRNA分子的5’UTR通过其长度和碱基顺序以及二级结构等来参与表达调控。其中5’-UTR主要参与翻译调节，影响转录后的各个阶段，包括mRNA的稳定，折叠和核糖体的相互作用；3’-UTR影响RNA的水平，从而影响翻译后蛋白的表达量，因此，5’-UTR和3’-UTR在真核生物基因的转录、翻译和表达过程中发挥重要作用。

在本发明的另一方面，提供了一种重组载体，包含编码柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4开放阅读框完整或部分氨基酸序列的核苷酸序列，所述开放阅读框完整氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经表达而制得。

在本发明的另一方面，还提供了一种抗体，该抗体是用上述重组蛋白免疫动物而制得。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。

所述疫苗或药物通过抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞而阻断球虫生活史来发挥作用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于筛选预防或治疗球虫病的药物。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述重组蛋白的疫苗。

在本发明的另一方面，还提供了一种作用靶标为柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4的抗球虫药物。

本发明柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因(Et CDPK4)，是柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)的一个新基因。免疫荧光定位实验和体外抑制试验结果显示Et CDPK4与子孢子的入侵相关，在球虫子孢子入侵宿主细胞时发挥了重要作用。因此，本发明的Et CDPK4基因，为开发抑制子孢子入侵、阻断球虫生活史的新疫苗或新药提供了新思路。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例2的EtCDPK4基因克隆及其原核表达系统构建结果图；

图2是本发明实施例3的pCold I-EtCDPK4原核表达蛋白形式确定以及纯化结果图；

图3是本发明实施例3抗EtCDPK4重组融合蛋白血清的Western Blotting检测结果图；

图4是本发明实施例4的EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球虫四个发育阶段转录水平高低的比较柱状图；

图5是本发明实施例5的EtCDPK4酶活性的测定结果图；

图6是本发明实施例6不同Ca²⁺浓度对EtCDPK4酶活性影响的定性检测实验结果图；

图7是本发明实施例6不同Ca²⁺浓度对EtCDPK4酶活性影响的定量检测实验结果图；

图8是本发明实施例7的EtCDPK4的7种特异性抑制剂筛选的定性反应检测结果图；

图9是本发明实施例7的EtCDPK4的7种特异性抑制剂筛选的定量反应的显著性差异分析图；

图10是本发明实施例8的Anti-rEtCDPK4兔血清在体外对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1细胞的抑制实验结果图；

图11是本发明实施例9不同时相、不同阶段在子孢子入侵DF-1细胞时对EtCDPK4的免疫荧光定位图；

图12是本发明实施例10体外酶活筛选出的EtCDPK4特异性抑制剂的子孢子入侵DF-1细胞的抑制试验结果图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本发明以柔嫩艾美耳球虫为研究对象，筛选鉴定参与柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞的相关蛋白。在实验室前期利用抑制性消减杂交技术和cDNA微阵列技术大规模筛选了子孢子和孢子化卵囊差异表达基因，获得了大量的差异表达基因ESTs的基础上，选择了1个在子孢子阶段高表达基因的EST序列。根据该序列设计合成5’RACE和3’RACE引物，利用RACE技术扩增含5’UTR和3’UTR，以及ORF的全长cDNA序列，该序列是柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因(Et CDPK4)的全长cDNA序列。原核表达系统成功表达了该Et CDPK4蛋白，并通过实验表明Et CDPK4与子孢子的入侵相关。

实施例1 柔嫩艾美耳球虫Et CDPK4基因全长cDNA的克隆及分析

1.材料和方法

在实验室前期利用抑制性消减杂交技术和cDNA微阵列技术大规模筛选了子孢子和孢子化卵囊差异表达基因，获得了大量的差异表达基因ESTs的基础上，选择了1个在子孢子阶段高表达基因的EST序列，与柔嫩艾美耳球虫基因组数据库(http://www.genedb.org/Homepage/Etenella)比较发现，该EST与球虫基因组数据库中推测的钙依赖蛋白激酶家族的钙调蛋白激酶(ETH_00010685)100％同源。因此根据该序列设计合成5’RACE和3’RACE引物，利用RACE技术扩增含5’UTR和3’UTR，以及ORF的全长cDNA序列。按照GeneRacer^TMKit(美国Invitrogen公司)说明书操作步骤将提取柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA反转录合成cDNA第一链，制备扩增5’RACE和3’RACE的cDNA模板，利用RACE技术扩增基因的全长cDNA序列。以下表1为5’RACE和3’RACE引物的序列。

表1 获取EtCDPK4全长的RACE引物序列

2.结果

利用RACE引物扩增获得了该基因的5’和3’cDNA末端，将5’和3’RACE PCR扩增产物回收后，与pGEM-T-easy载体连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑选白色菌落进行PCR鉴定，如果扩增片段与预期一致，则送公司测序。对于阳性克隆测序结果，用DNAstar软件查找5’和3’RACE扩增产物序列与原EST序列的重叠部分，拼接获得全长cDNA序列。该序列全长2499bp(SEQ ID NO.1)，包括5’端的UTR序列，长185bp，3’端UTR序列，长511bp，含Ploy(A)尾，ORF长1803bp(186-1988bp)，编码600个氨基酸(SEQ ID NO.2)。预测分子量为68kDa，等电点为6.0。

对编码的氨基酸序列进行生物信息学分析显示：在302-324位有一个明显的跨膜结构区域；无信号肽；疏水性的分析发现多肽链最大的疏水性为+2.3，最小的疏水性为-2.7；功能结构域预测和保守结构域预测，发现它既具有一般钙依赖蛋白激酶家族(CDPKs)成员的共性，即可变区、催化区、连接区和调控区(也叫钙离子结合结构域)，同时又具有自己的独特性，大部分钙依赖蛋白激酶家族(CDPKs)的成员只有在氨基酸多肽链的C端才会有3-4个钙离子结合结构域即EF手性分子，但是对于EtCDPK4来说，其在N端也有2个EF手性分子，也就是说具有2个连接区结构域。使用DNAstar对EtCDPK4的二级结构、抗原指数、柔性区域以及表面可及性和疏水性概况进行分析后发现，EtCDPK4基因表达的多肽链中富含比较丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规卷曲，也就是说EtCDPK4基因表达的这段多肽链的二级结构非常的多样化，同时结果也说明这段多肽链存在着大量的柔性区域，这些柔性区域的存在使蛋白质多肽链能够在形成三级结构的时候更容易进行折叠，进而有效的发挥作用；这段多肽链的抗原指数分数也比较高，最高的可以达到1.7，因此说明了这段多肽链的空间构象中有较多的抗原位点，具有较丰富的免疫原性，通过这段多肽链表面可及性的分析，发现其分数较高，可达到6左右，因此可以推断出EtCDPK4基因表达的多肽要执行相应的功能需要运动到细胞(子孢子)的膜表面。

实施例2 EtCDPK4基因原核表达系统的构建

1.材料和方法

根据该基因ORF的全长1803bp，选取它的一段编码区序列进行克隆和分析。其选取的编码区大小为1660bp,编码的氨基酸数目为550aa，大小为62.6KDa。

使用说明书利用Trizol试剂(TaKaRa)提取纯净子孢子的总RNA，经过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定合格后使用M-MLV Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen，USA)将其全部反转录为cDNA作为PCR扩增的模板，使用下列带有限制性内切酶酶切位点的特异性引物进行PCR扩增：EtCDPK4UP：5’-CGGGATCCAGCAGGTGATGGGTGGGCGGGAGGT-3’(SEQ ID NO.7，含BamHI酶切位点)，EtCDPK4LOW：5’-GCGTCGACAATTCGTCCCAGTCAATCTGCCCAT-3’(SEQ ID NO.8，含SalI酶切位点)，将最后的目的基因EtCDPK4扩增结果切胶以后进行胶回收，然后将EtCDPK4的胶回收产物与原核表达载体pCold-I分别进行双酶切后连接并将其转入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，待菌长出以后进行测序，将测序正确的菌液提取pCold-I-EtCDPK4质粒保存备用。

2.结果

通过使用鉴定合格的柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA(见图1A)反转录得到的cDNA模板，使用特异性的引物进行PCR扩增后在1000bp-2000bp之间有一个明显的条带，大小约为1660bp左右(见图1B)，将其同原核表达载体pCold I使用BamHI和SalI双酶切以后(见图1C)，使用T4DNA Ligase过夜连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，过夜后挑菌并且摇菌，将菌液送去测序后结果表明与原序列的相同性为100％，因此pCold I-EtCDPK4原核表达载体构建成功。图1中，A.SpzRNA:柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA的提取；B.EtCDPK4基因的PCR扩增；C.EtCDPK4基因和pCold I空质粒的双酶切反应；M：(DL2000)DNA分子量的大小。

实施例3 抗EtCDPK4重组融合蛋白血清的获得和鉴定

1.材料和方法

将测序正确的pCold-I-EtCDPK4重组质粒转化入大肠杆菌BL21菌株中，利用16℃，1mMIPTG进行24h诱导表达，将得到的可溶性重组蛋白利用能特异性结合His-Tag的亲和树脂进行亲和柱层析，然后对得到的蛋白进行BCA定量后去免疫2只新西兰大白兔和5只Balb/c小鼠，免疫剂量分别为200μg/只和50μg/只，初次免疫要与弗氏完全佐剂(FCA)进行乳化(1:1)，间隔2周后进行二次免疫，此时重组可溶性蛋白要与弗氏不完全佐剂进行乳化(1:1)，此后每隔一周免疫一次，直到第五次免疫后对新西兰大白兔和Balb/c小鼠分别采血进行检测(WB)和使用间接ELISA方法测定免疫兔血清的效价。

2.结果

通过对pCold I-EtCDPK4原核表达载体和pCold I空载体在0h和24h的菌液超声处理后，进行SDS-PAGE确定其重组蛋白的表达形式(见图2)，最后发现pCold I-EtCDPK4重组蛋白以可溶性形式大量表达，在24h的时候产量较大。将其使用Ni-柱纯化后，发现pColdI-EtCDPK4在大肠杆菌BL21中能够大量的表达，通过摸索咪唑的最佳洗脱浓度，最后发现在150mM和250mM的咪唑洗脱缓冲液能够有效的将该重组蛋白洗脱下来，其产量可以用于后面的动物免疫试验。图2中，1:0h pCold-I-EtCDPK4重组大肠杆菌抽提蛋白；2:0h pCold-I空质粒大肠杆菌抽提蛋白；3:24h pCold-I-EtCDPK4重组大肠杆菌抽提蛋白上清；4:24h pCold-I空质粒大肠杆菌抽提蛋白上清；5:24h pCold-I-EtCDPK4重组大肠杆菌抽提蛋白沉淀；6:24hpCold-I空质粒大肠杆菌抽提蛋白沉淀；7:250mM咪唑洗脱Buffer洗脱重组pCold-I-EtCDPK4可溶性蛋白；8:150mM咪唑洗脱Buffer洗脱重组pCold-I-EtCDPK4可溶性蛋白；黑色箭头所指位置即为所表达的重组蛋白所在的位置(62.6KDa)。

待所设定的动物免疫程序结束以后采取其所有的血液制备Anti-rEtCDPK4血清抗体，使用Western Blotting检测所制备血清的反应原性(见图3A、B)；使用pCold I-EtCDPK4原核表达纯化后的可溶性蛋白包被ELISA96孔板，然后使用间接ELISA测定Anti-EtCDPK4血清抗体的效价，最后结果为1:12800。图3中，A.新西兰大白兔血清的Western Blotting检测结果；B.Balb/c小鼠血清的Western Blotting检测结果。

实施例4 EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球虫四个发育阶段转录水平高低的比较

1.材料和方法

为了测定EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球虫四个不同发育阶段中转录水平的高低，使用以SYBR染料标记的荧光探针(TaKaRa)的实时荧光定量PCR法进行检测。提取柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子四个发育阶段的总RNA，待验证所提取的RNA合格后进行定量，去除DNA后利用M-MLV Reverse Transcriptase Kit(Invitrogen，USA)将其全部进行反转录为cDNA作为实时荧光定量PCR的模板，以鸡球虫18srRNA基因作为内参，使用下面的特异性引物进行实时荧光定量PCR：

(CTCAAAGACATCCACATCTCCCCCATCATTTGCGAAAACATGAAAAAATACATGCGACAGTCACATCTCAAGAACGCACTTGTGAATCTGATGGTC(SEQ ID NO.9)，保守结构域序列大小是96bp，使用3步法，增设溶解曲线进行qRT-PCR反应)

EtCDPK4-RT(UP)：5’-GACCATCAGATTCACAAG-3’(SEQ ID NO.10)，

EtCDPK4-RT(LOW)：5’-CTCAAAGACATCCACATC-3’(SEQ ID NO.11)。

2.结果

实时荧光定量PCR的结果表明在柔嫩艾美耳球虫的四个不同的发育阶段中，EtCDPK4基因在柔嫩艾美耳球虫的子孢子阶段的转录水平较其他的三个发育阶段要高，孢子化卵囊中的量次之，未孢子化卵囊阶段和裂殖子阶段中的量较低，结果见图4。

实施例5 重组EtCDPK4蛋白酶活性的测定

1.材料和方法

重组EtCDPK4(rEtCDPK4)蛋白的酶活性可以定义为每毫升rEtCDPK4酶蛋白每分钟转移到底物上的磷酸基团的nmol数。对于rEtCDPK4酶活性的检测使用一种非放射性的方法，即在体外构建一个磷酸化的反应体系，这个酶活性测定反应包括定性检测和定量检测2个部分，这个体系的反应组分为：100mM HEPES(pH 7.4)、6.5mM CaCl₂、5mM DTT、50mM MgCl₂、5mM ATP、1mg/ml Phosphatidylserine、0.05％X-100、10mM Mercaptoethanol、1μg/mlLeupeptin、1μg/ml Aprotinin、C1 Peptide(0.4μg/μl)(Promega)、Peptide保护液以及近期重新诱导表达且纯化的可溶性的EtCDPK4重组蛋白，总体系设置为25μL，同时增设阴性对照和PKC阳性对照，将上述反应体系置于30℃水浴锅中磷酸化反应30min后再将其置于95℃水浴锅中5min用以终止磷酸化反应，然后再分别加入1μL的甘油充分的吹打混匀后避光放置，同时配制Tris-HCl缓冲液(PH8.0)1L，用Tris-HCl缓冲液(pH8.0)配制0.8％的琼脂糖凝胶，避光条件下使上述反应产物在140V的电压下电泳30min后在UV灯下迅速拍照，并且切割阴性对照中向负极泳动的条带，切割PKC阳性对照和EtCDPK4样品中向正极泳动的条带，然后根据说明书测定A_570nm处的光吸收值进行磷酸化产物的定量分析。酶活性测定和分析的原则是切下的样品、阴性对照以及阳性对照的胶块的光吸收值在一定的范围内微小的变动，此时就可以计算出r EtCDPK4在自然状态下的酶活性大小。

2.结果

利用体外磷酸化反应测定rEtCDPK4酶活性。继续通过纯化低温诱导表达的pColdI-rEtCDPK4原核可溶性蛋白(见图5A，图5A是EtCDPK4原核重组蛋白的诱导表达和纯化即EtCDPK4酶蛋白的获得结果图)作为酶蛋白，rEtCDPK4酶活性测定的定性反应结果见图5B，酶活性的定量检测计算结果见图5D，重复5次后结果表明EtCDPK4的酶活性大小在0.87nmol·min^-1·ml^-1或者0.87Units/ml左右(结果见图5C、D，图5C是EtCDPK4酶活性定量检测的5次重复光吸收值(A_570nm值))。与试剂盒中提供的PKC阳性对照相比，要低一些。

实施例6 不同Ca²⁺浓度对EtCDPK4酶活性的影响

1.材料和方法

在EtCDPK4自然酶活性测定反应体系的基础上改进了最初的反应体系成分，这个酶活性测定反应包括定性检测和定量检测2个部分，这个体系的反应组分为：100mM HEPES(pH7.4)、5mM DTT、50mM MgCl₂、5mM ATP、1mg/ml Phosphatidylserine、0.05％X-100、10mM Mercaptoethanol、1μg/ml Leupeptin、1μg/ml Aprotinin、C1 Peptide(0.4μg/μl)(Promega)、Peptide保护液以及近期重新诱导表达且纯化的可溶性的EtCDPK4重组蛋白和5个呈梯度且浓度不同的CaCl₂溶液，CaCl₂溶液的浓度设置为：0μM、10μM、50μM、100μM、1000μM，总体系设置为30μL，同时要增设阴性对照和EtCDPK4自然样品对照，将上述反应体系置于30℃水浴锅中磷酸化反应30min后再将其置于95℃水浴锅中5min用以终止磷酸化反应，然后再分别加入1μL的甘油充分的吹打混匀后避光放置，同时配制Tris-HCl缓冲液(PH8.0)1L，用Tris-HCl缓冲液(PH8.0)配制0.8％的琼脂糖凝胶，避光条件下使上述反应产物在140V的电压下电泳30min后在UV灯下迅速拍照，并且切割阴性对照中向负极泳动的条带，切割EtCDPK4自然样品对照和不同CaCl₂溶液的浓度样品中向正极泳动的条带，然后根据说明书测定A_570nm处的光吸收值进行磷酸化产物的定量分析。整个实验重复2次，然后将得到的结果绘图进行分析。

2.结果

通过改变EtCDPK4酶活性测定反应的反应体系的组成，设置5个不同的Ca²⁺浓度，最后结果表明，当Ca²⁺浓度为0时，EtCDPK4没有任何的酶活性，这也说明了EtCDPK4发挥功能完全依赖于Ca²⁺浓度，随着Ca²⁺浓度的不断的升高，可以明显的看到EtCDPK4的酶活性不断增强(见图6、7和表2)，但是条带还是相对较弱。图6是不同Ca²⁺浓度对EtCDPK4酶活性影响的定性检测实验结果图，其中，SC:EtCDPK4样品正常酶活性反应对照；NC：阴性对照；Ca²⁺浓度设置为5个梯度：0μM、10μM、50μM、100μM、1000μM。图7是不同Ca²⁺浓度对EtCDPK4酶活性影响的定量检测实验结果图，其中，A.不同钙离子浓度下EtCDPK4磷酸化短肽的光吸收值；B.不同Ca²⁺浓度下EtCDPK4酶活性大小的定量计算。

表2 不同钙离子浓度对EtCDPK4酶活性的影响

在正常的所建立该Ca²⁺依赖的体外磷酸化酶促反应中，Ca²⁺的工作浓度是6.5mM。上述不同钙离子浓度都是在正常酶活反应水平以下，该酶活反应充分证实了EtCDPK4是完全钙依赖的一种蛋白激酶，并且在体外随着钙离子浓度的升高它的激酶反应活性不断升高。

实施例7 EtCDPK4特异性抑制剂的筛选和显著性分析

1.材料和方法

通过对EtCDPK4功能结构域的生物信息学分析，针对于它的不同的功能结构域选择7个抑制剂，它们分别是W-7、H-7、H-89、Staurosporine、D-Sphingosine、Ro-31-8220和Myristoylated Peptide，其中这7个抑制剂分属于三个不同的类别：ATP竞争性抑制剂、蛋白激酶底物抑制剂和Ca²⁺结合结构域抑制剂。利用前期已经构建成功的体外磷酸化酶活性反应体系以及结合这些抑制剂说明书上推荐的的最佳抑制浓度，将这些抑制剂在最终反应体系中的浓度都调整为100μM(根据抑制剂说明书推荐的最佳抑制浓度)，其整个反应体系的成分为：100mM HEPES(pH 7.4)、6.5mM CaCl₂、5mM DTT、50mM MgCl₂、5mM ATP、1mg/mlPhosphatidylserine、0.05％X-100、10mM Mercaptoethanol、1μg/ml Leupeptin、1μg/mlAprotinin、C1 Peptide(0.4μg/μl)(Promega)、Peptide保护液以及近期重新诱导表达且纯化的可溶性的EtCDPK4重组蛋白和上述已经配置好的要加入反应体系中的特异性抑制剂母液(15×)，总体系设置为30μL，同时增设阴性对照和无抑制剂参与下的EtCDPK4正常酶活性反应的对照，将上述反应体系置于30℃水浴锅中磷酸化反应30min后再将其置于95℃水浴锅中5min用以终止磷酸化反应，然后再分别加入1μL的甘油充分的吹打混匀后避光放置，同时配制Tris-HCl缓冲液(PH8.0)1L，用Tris-HCl缓冲液(PH8.0)配制0.8％的琼脂糖凝胶，避光条件下使上述反应产物在140V的电压下电泳30min后在UV灯下迅速拍照，并且迅速的切割阴性对照中向负极泳动的条带(继续带正电荷，未被磷酸化的条带)，切割无抑制剂参与下的EtCDPK4正常酶活性反应的对照和有抑制剂参与下的EtCDPK4酶活性反应的样品中向正极泳动的条带，然后根据被颜色标记的C1多肽底物使用说明书测定A_570nm处的光吸收值然后进行磷酸化产物的定量分析。将最后的结果绘图进行分析，同时将所得到的所有相关的数据进行单因素方差分析(ANOVA)。

2.结果

通过改变EtCDPK4自然酶活性的体外磷酸化反应体系，将购买的7种抑制剂应用于体外磷酸化反应中，定性检测见图8；定量检测见图9、表3，从定性检测和应用推导的EtCDPK4酶活性定量计算的公式进行分析，数据表明除了D-Sphingosine外，其余的6种抑制剂：W-7、H-7、H-89、Staurosporine、Ro-31-8220和Myristoylated Peptide均能够在一定程度上有效的抑制EtCDPK4酶活性。图8中，NC：不加EtCDPK4和任何抑制剂的阴性对照；SC：只有EtCDPK4参与反应但是没有抑制剂参与的样品对照。

EtCDPK4酶活性大小计算推导公式：

EtCDPK4酶活单位：nmol×min^-1×ml^-1

As:样品在570nm波长下的光吸收值，C_NP：C1的标准浓度

V_T:比色皿中样品的总体积(500μl),1.43:测定光吸收值的修正系数(250/175)

A_NC：阴性对照中非磷酸化多肽在570nm波长下的光吸收值

V_EtCDPK4：反应体系中EtCDPK4所加的总体积(10μl)

t:磷酸化反应所进行的时间(30min)。

表3 EtCDPK4抑制剂抑制结果的ANOVA分析结果

注:跟对照组相比，差异显著，P<0.05。

实施例8 Anti-EtCDPK4血清的体外入侵抑制试验

1.材料和方法

利用前期的EtCDPK4原核表达系统表达的可溶性蛋白免疫新西兰大白兔后得到的血清经过Protein A+G纯化后，将其稀释为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml这6个不同的浓度。在24孔细胞培养板中每一孔中接入15万DF-1细胞，次日提取纯净的柔嫩艾美耳球虫子孢子，将其使用CFDA(碧云天)荧光探针标记以后，加入到之前稀释好的纯化血清中，每一个血清浓度下做3个平行重复，每一孔中接入15万经过CFDA荧光探针标记和血清抗体处理过的柔嫩艾美耳球虫子孢子，并且增设荧光标记子孢子和正常DF-1细胞的阴性对照，然后通过流式细胞仪进行细胞计数和分选，对数据进行处理后可以计算出入侵率和抑制率(入侵抑制率＝[1-(抗体作用的子孢子入侵率/未经抗体作用的子孢子入侵率)]×100％)。通过Beckman细胞流式分选系统进行分析，结果进行ANOVA分析。

2.结果

结果显示Anti-EtCDPK抗血清在最高浓度400μg/ml下对子孢子入侵DF-1细胞的入侵率达到了52％左右(见图10)，能明显抑制子孢子入侵DF-1细胞，说明EtCDPK在柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞过程中发挥重要功能。此次流式设置的DF-1细胞计数上限为15000个。

实施例9 EtCDPK4表达蛋白在子孢子入侵DF-1细胞不同时相的免疫定位

1.材料和方法

将饲养的状态良好并且已经传代次数超过3代的DF-1细胞使用0.25％的胰酶-EDTA在37℃、5％CO₂条件下消化2min以后进行细胞计数，然后在加入细胞级别的圆形的洁净盖玻片的6孔板中每一孔中接入20万的DF-1细胞，让其生长20h左右，次日无菌手段提取柔嫩艾美耳球虫的子孢子，经过细胞计数后每一孔中也接入20万的子孢子，在接子孢子前要将已经计数好的子孢子用完全细胞培养基DMEM(5％双抗、10％FBS)充分悬浮后在37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育2h后再将其接于生长有DF-1细胞的六孔板之中，然后分别于12h、24h、36h、48h、60h、72h时收取一块6孔板以及将没有入侵过细胞的使用PBS处理2h的子孢子和裂殖子、DMEM(含有10％FBS)处理2h的子孢子，使用2％多聚甲醛进行固定15min，透明15min，再加入2％的BSA-PBS封闭过夜，次日使用灭菌的PBS充分的洗涤以除去2％的BSA-PBS，然后加入1:500稀释的抗rEtCDPK4兔血清，在37℃条件下孵育2h后，再加入1:2000稀释的FITC-羊抗兔IgG，在37℃避光条件下孵育2h后使用1:50稀释的DAPI染核20min后加入50μl抗荧光猝灭剂(Sigma)于圆形盖玻片上然后将其倒置于洁净的载玻片上，并且进行标记，然后在荧光显微镜(OLYMPUS)下进行观察，拍照。

2.结果

结果如图11所示，发现该蛋白除了折光体之外均匀分布于子孢子，当子孢子进入DF-1细胞后，蛋白表达量上升，且发现该蛋白位于带虫空泡膜上；当虫体发育至未成熟裂殖体和成熟裂殖体时，蛋白均匀的分布于整个虫体，且荧光增强，表达量上升。另外，也发现该蛋白均匀分布于第二代裂殖子，且表达量上升。

实施例10 筛选出的特异性抑制剂抑制子孢子对DF-1细胞的入侵试验

1.材料和方法

将通过酶活性实验筛选出的六种特异性抑制剂：W-7、H-7、H-89、Staurosporine、Ro-31-8220和Myristoylated Peptide以及阴性对照DMSO(Sigma)按照100μM的浓度分别处理使用CFDA(碧云天)荧光探针标记的子孢子，将其在37℃水浴锅中孵育2h后不离心直接接入生长有DF-1细胞的24孔板中，每一个抑制剂做3个平行重复，然后使用Beckman流式分选系统进行分析，结果进行ANOVA分析。

2.结果

分析结果表明通过体外酶活筛选出的特异性抑制剂中W-7、H-7、H-89以及MyristoylatedPeptide对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1细胞具有良好的抑制作用(见图12)。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因为柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于，包含编码柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4开放阅读框完整或部分氨基酸序列的核苷酸序列，所述开放阅读框完整氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白是由权利要求2所述重组载体经表达而制得。

4.一种抗体，其特征在于，该抗体是用权利要求3所述重组蛋白免疫动物而制得。

5.权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，其特征在于，用于制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。

6.权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，其特征在于，用于筛选预防或治疗鸡球虫病的药物。

7.权利要求3所述重组蛋白的应用，其特征在于，用于制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。

8.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求3所述重组蛋白。

9.一种作用靶标为柔嫩艾美耳球虫钙依赖蛋白激酶4的抗球虫药物。

10.根据权利要求9所述的抗球虫药物，其特征在于，所述药物包括：ATP竞争性抑制剂、蛋白激酶底物抑制剂、或Ca²⁺结合结构域抑制剂。