CN103361364A

CN103361364A - 柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因及其应用

Info

Publication number: CN103361364A
Application number: CN2012100852642A
Authority: CN
Inventors: 韩红玉; 黄兵; 孔春林; 姜连连; 董辉; 朱顺海; 赵其平; 李婷; 王晔; 薛璞; 舒凡帆
Original assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Current assignee: Shanghai Veterinary Research Institute CAAS
Priority date: 2012-03-27
Filing date: 2012-03-27
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明公开了一种柔嫩艾美耳球虫基因，该基因为编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因。本发明还公开了上述基因编码的蛋白质。本发明柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因编码的重组蛋白对鸡球虫具有良好的免疫保护效果，适于开发成防治鸡球虫病的新疫苗或新药。

Description

柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种柔嫩艾美耳球虫真核翻译起始因子3d基因(eukaryotic translation initiation factor3d，eIF3d)及其应用。

背景技术

鸡球虫病是规模化养鸡场最容易发生的寄生虫病，它的病原体为艾美耳属鸡球虫。鸡球虫病能够导致禽类的生长缓慢和饲料转化率降低，间接地引起养殖经济损失，如果严重时，则直接导致鸡只大量死亡，从而造成养殖户的重大经济损失。目前，有报道表明，每年因鸡球虫病，就给全世界的养殖业造成了约5亿英镑的巨大损失。当前在禽类的养殖业中主要还是依靠药物来预防控制鸡球虫病，但是球虫抗药性的问题日益突出。同时鸡体药物残留和药物价格过高等问题也促使人们去寻找新的方法来防治鸡球虫病。现阶段，一些研究工作者通过寻找与鸡球虫发育、入侵相关的基因，研制基因工程疫苗成为防治鸡球虫病的新思路，也成为现阶段鸡球虫研究的热点。而寻找到合适的理想球虫抗原，就成为了研制基因工程疫苗的突破点和难点。

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是一种致病性和危害性最大的鸡球虫，它主要寄生于盲肠及其附近区域，能够引起出血性肠炎，对雏鸡危害最大，严重时能引起较高的死亡率。

真核翻译起始因子又称为真核起始因子，是指和真核翻译起始相关的一些蛋白质。目前已被鉴定的真核翻译起始因子共有12种。真核生物的翻译起始就是通过这些真核翻译起始因子之间或者不同的真核翻译起始因子与核糖体、mRNA以及起始tRNA之间的相互作用来完成。真核翻译起始因子中最大的起始因子是真核翻译起始因子3(eIF3)复合物，eIF3在真核翻译起始进程中起着核心作用。

不过，到目前为止还没有柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因，该EteIF3d基因编码的重组蛋白对鸡球虫具有良好的免疫保护效果，适于开发成防治鸡球虫病的新疫苗。

此外，还需要提供一种柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种柔嫩艾美耳球虫基因，所述基因为编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因。

优选的，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

在本发明的另一方面，提供了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白质，所述蛋白质为柔嫩艾美耳球虫eIF3d蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述柔嫩艾美耳球虫基因的重组载体。

所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表达载体、重组真核表达载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种宿主细胞，包含上述重组载体，或已用上述基因转化或转染。

在本发明的另一方面，还提供了一种抗血清，该抗血清是用上述重组载体表达的重组蛋白免疫动物而制得。

在本发明的另一方面，还提供了一种抗体IgG，该抗体IgG是由上述抗血清经纯化而制得。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因在制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物中的应用。

所述疫苗或药物通过抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞而阻断球虫生活史来发挥作用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫蛋白质在制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因在筛选预防或治疗鸡球虫病的药物中的应用。

本发明柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因，与子孢子入侵宿主细胞相关，Western-blot分析表明本发明EteIF3d的重组表达蛋白具有良好的抗原性；免疫保护性试验结果显示EteIF3d重组蛋白免疫组在增重、卵囊减少率、病变记分等方面都强于感染对照组，对鸡体内抗体水平进行检测，结果EteIF3d重组蛋白免疫后的鸡，在整个免疫期及感染期均有较高抗体存在于鸡体内。因此，本发明的EteIF3d基因，为开发防治鸡球虫病的新疫苗提供了新的候选抗原，适于开发成防治鸡球虫病的新基因工程疫苗。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1柔嫩艾美耳球虫ZB7-B08基因全长cDNA PCR扩增产物的电泳鉴定图；

图2是本发明实施例2实时定量PCR检测EteIF3d基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的表达图；

图3是本发明实施例3重组原核表达质粒pET28b-EteIF3d的双酶切鉴定图；

图4是本发明实施例3的SDS-PAGE分析EteIF3d重组蛋白不同时相表达图；

图5是本发明实施例3的EteIF3d重组蛋白的纯化结果图；

图6是本发明实施例3的EteIF3d重组蛋白的Western-Blot分析图；

图7是本发明实施例4扩增EteIF3d基因电泳检测图；

图8是本发明实施例4重组质粒pPIC9k-EteIF3d和空载体pPIC9k的双酶切分析图；

图9是本发明实施例4的pPIC9K-EteIF3d表达产物的SDS-PAGE分析图；

图10是本发明实施例4的EteIF3d酵母表达蛋白Western-blot分析图；

图11是本发明实施例5的柔嫩艾美尔球虫子孢子入侵DF-1细胞后不同发育时间EteIF3d的荧光定位图；

图12是本发明实施例5的柔嫩艾美尔球虫子孢子入侵活力检测结果图；

图13是本发明实施例5的不同浓度抗EteIF3d多抗血清对子孢子入侵细胞的抑制作用曲线图；

图14是本发明实施例6的免疫保护性试验的免疫程序图；

图15是本发明实施例6的免疫增重效果柱状图；

图16是本发明实施例6的不同时期血清中EteIF3d特异性抗体水平柱状图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。

本发明以致病力最强的柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)为研究对象，对子孢子阶段高表达基因ZB7-B08进行克隆，表达及分析，并对其功能、免疫保护力等进行了研究。

1.柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段高表达新基因cDNA全长的克隆及分析

本实验室前期利用抑制性消减杂交技术(SSH)和cDNA微阵列技术筛选获得了柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊和子孢子阶段虫体差异表达的ESTs序列。选取其中一个EST序列，其克隆号为ZB7-B08，通过RACE技术获得该差异基因的含一个完整开放阅读框(ORF)的全长cDNA序列。在NCBI网站经同源性比对，发现该基因与犬新孢虫真核翻译起始因子3第7亚单位具有68％的相似性，推测该基因为柔嫩艾美耳球虫真核翻译起始因子3基因(eukaryotictranslation initiation factor 3，eIF3)。由于该基因开放阅读框(ORF)编码571个氨基酸，理论分子量约为65KD，符合eIF3中d亚单位的命名规则，故命名该基因为柔嫩艾美耳球虫真核翻译起始因子3d基因(EteIF3d)。利用Real-time PCR检测了该基因在柔嫩艾美耳球虫四个不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)的表达情况，结果显示，该基因在子孢子和第二代裂殖子阶段表达量相对较高，其中在第二代裂殖子阶段最高。

2.柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因的表达及抗原性验证

将目的基因EteIF3d连接到pET28b(+)表达载体上，将构建成功的重组表达质粒pET28b-EteIF3d转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达，重组蛋白主要以无活性的包涵体形式出现，用尿素将其变性后，过柱纯化重组蛋白rEteIF3d，经Western-blot分析，结果表明重组蛋白rEteIF3d具有良好的抗原性。为进一步对其功能进行研究，将其进行分泌表达，把EteIF3d基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，然后转化GS115酵母感受态细胞，利用甲醇作为唯一碳源，表达后获得了有活性的可溶性蛋白，Western-blot验证其具有良好的抗原性。

3.柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因的功能分析

采用免疫荧光实验，在柔嫩艾美耳球虫子孢子体外接种鸡胚成纤维细胞(DF-1)后，利用制备的兔抗EteIF3d多克隆抗体为一抗，分析EteIF3d蛋白在虫体不同发育阶段的定位、表达情况。结果显示，在子孢子入侵不同时间段，表达量逐渐呈增加趋势，并且刚入侵细胞时有向顶端聚集的趋势，随着子孢子的不断发育，表达量也呈上升趋势，到裂殖子阶段表达量达到最大。推测该基因在子孢子、裂殖子的发育过程中发挥一定作用，同时也可能和子孢子、裂殖子入侵肠道上皮细胞有一定关系。为进一步确认该蛋白与子孢子入侵的关系，随后又进行体外抑制实验，将纯化后的兔抗EteIF3d多抗IgG以不同浓度(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL)与子孢子孵育2h后接入DF-1细胞，采用流式细胞仪检测后分析。结果显示，随着抗体浓度的升高，子孢子对宿主细胞的入侵率逐渐降低，说明该蛋白与子孢子入侵宿主细胞具有一定的关系。

4.EteIF3d基因编码重组蛋白对鸡球虫的免疫保护性实验

为了验证EteIF3d基因编码的重组蛋白是否对鸡球虫有较好的免疫保护效果，将重组蛋白分别以50μg/只，100μg/只分两组对雏鸡进行肌肉注射免疫，二免后第7天用柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊1×10⁴/只给鸡灌服，并在不同的时间段采样检测不同的指标，最后综合分析评价该蛋白的免疫保护性效果。结果显示，在增重、卵囊减少率、病变记分等方面，免疫组都强于感染对照组，并且高剂量免疫组的效果明显更好；在体液免疫方面，EteIF3d能产生特异性抗体，在整个免疫期及感染期，免疫组均有较高抗体存在于鸡体内，而且高剂量组产生的抗体效价也相对较高。

实施例1柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因全长cDNA的克隆及分析

利用RACE技术扩增获得了EteIF3d基因的全长cDNA，具体步骤如下：

1.柔嫩艾美耳球虫子孢子的收集和纯化

(1)向玻璃匀浆器中加入适量的PBS缓冲液，将稀释后的纯化的孢子化卵囊也加入到匀浆器中，通过玻璃匀浆器研磨破碎卵囊，直到孢子囊完全释放，镜检无卵囊残留为止。

(2)将孢子囊转移至50mL灭菌的离心管中，加入适量PBS混匀，3000r/min，离心10min，弃上清。再用PBS洗涤2次，收集沉淀。

(3)用适量PBS缓冲液将沉淀悬浮，转移到50mL灭菌的三角烧瓶中，向三角烧瓶中加入浓度为5％的鸡胆汁以及浓度为0.5％的胰蛋白酶，放入41℃的恒温水浴锅中消化1～2h(消化过程中，隔一段时间就搅拌一次，直到镜检子孢子释放90％以上即可)。

(4)收集消化好的消化液，3000r/min，离心5min收集沉淀，用PBS再次悬浮沉淀，依次用G3砂芯漏斗和G4砂芯漏斗负压过滤。

(5)收集滤液，装入10mL离心管中，3000r/min，离心10min，收集沉淀。

(6)再用PBS悬浮、离心洗涤2-3次，装入灭菌的离心管中，12000r/min，4℃离心3min，沉淀为纯化的子孢子，液氮冻存备用。

2.柔嫩艾美耳球虫子孢子总RNA提取

将研钵、玻璃器皿以及钥匙、镊子等金属器械先去污，再用蒸馏水洗净。对于提取RNA的每件器械，均需单独用锡箔纸包好，然后再放入180℃烤箱内烘烤5～8h。如果是用到的塑料制品，须用0.1％的DEPC水浸泡过夜，用报纸包好后再进行高压灭菌20min以除去RNase。所用的移液器枪头及离心管均为无RNase产品。实验过程中使用的一次性手套，须经常更换，防止污染。

子孢子总RNA提取按照Trizol试剂的说明指导操作，具体步骤为：

(1)将保存于液氮中的E.tenella子孢子样品装入EP管，向其中按一定比例加入Trizol试剂，上下来回振荡，在离心管架上放置5min。

(2)按照1mL Trizol中加200μL氯仿的剂量，向步骤(1)中加入相应体积的氯仿，盖紧离心管盖，反复来回颠倒震荡离心管数次，再在室温下静置15min。

(3)将上述样品置于4℃离心机，在离心机中以12000r/min的转数离心15min。然后小心翼翼的取出离心管，防止分层的液面被破坏，马上将上层清液吸取转移至另一新的EP管中。

(4)计算所得的上清体积，加入与上清等体积的异丙醇，上下来回颠倒EP管，充分混匀后，在室温下放10min左右即可。12000r/min，4℃离心10min，弃上清，管底的白色沉淀即子孢子总RNA。

(5)加入适量的75％的乙醇(DEPC水配制)，轻弹离心管底部，使沉淀悬浮，以洗去残留的异丙醇。

(6)12000r/min，4℃离心5分钟后小心弃去上清，并用枪头尽量吸干残留的液体。沉淀放在超净台上干燥10min，使乙醇挥发完全后，再用少量DEPC水溶解沉淀。

(7)取少量提取的RNA样品，进行凝胶电泳分析其完整性，并用紫外分光光度计测定其浓度。

3.按照GeneRacer^TMKit(美国Invitrogen公司)说明书操作步骤将提取柔嫩艾美耳球虫子孢子RNA反转录合成cDNA第一链。

4.柔嫩艾美耳球虫ZB7-B08基因的3′和5′RACE扩增

(1)RACE引物设计

根据所得到的EST序列，利用Primer Premier 5.00软件为其设计引物，所得RACE引物见下表1。

表1RACE引物序列

(2)利用上述设计的RACE引物扩增3’和5’cDNA末端。将3’RACE和5’RACE PCR扩增产物回收后，与pGEM-T-easy载体连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑选白色菌落进行PCR鉴定，如果扩增片段与预期一致，则取500μL菌液送公司测序。对于阳性克隆测序结果，用DNAstar软件查找3’RACE和5’RACE扩增产物序列与原EST序列的重叠部分，拼接全长cDNA序列。

根据拼接的全长cDNA序列设计两端引物(见下表2)，以3’RACE和5’RACE扩增时反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。

表2全长cDNA扩增引物

反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳分析(见图1)。在图1中，M：标准DNA分子量(从上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；1：扩增的ZB7-B08基因全长。将回收的PCR产物与pGEM-T-easy载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞。挑选白色菌落进行PCR鉴定。将鉴定的阳性菌落送公司测序。

利用常规生物信息学软件对获得的全长cDNA序列及其编码蛋白结构进行预测分析。

5.结果

通过ZB7-B08的EST序列，扩增得到了该基因含一个完整开放阅读框的cDNA序列，全长2278bp(SEQ ID NO.2)，分析表明，该基因在156-1871之间有一个1715bp的完整开放阅读框，总共编码571个氨基酸(SEQ ID NO.1)。预测等电点为5.99，理论分子量为64925.3Da。同源搜索的结果显示，该基因与犬新孢子虫真核翻译起始因子3第7亚基具有68％的相似性，并且具有一个真核翻译起始因子3-zeta超家族的保守结构域，推测该基因为柔嫩艾美耳球虫子孢子阶段高表达的一个新基因，由于该基因编码蛋白理论分子量接近66KD，符合eIF3中d亚单位的命名规则，故将其命名为柔嫩艾美耳球虫真核翻译起始因子3d基因(EteIF3d)。

实施例2EteIF3d基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的表达差异分析

分别提取柔嫩艾美球虫4个发育阶段虫体(孢子化卵囊、未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子)的总RNA，以柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子、第二代裂殖子的cDNA第一链为模板，利用实时荧光定量PCR，选择18s rRNA作为内参，验证EteIF3d基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体中的表达情况。表3为实时荧光定量PCR扩增引物序列。结果表明，EteIF3d基因在子孢子和第二代裂殖子阶段高度表达，其中，在第二代裂殖子阶段表达量最高(见图2)。图2中，0：未孢子化卵囊；6h、12h、20h、30h和48h：卵囊孢子化不同时间段；Z：子孢子；L：第二代裂殖子。

表3实时定量PCR扩增引物序列

实施例3EteIF3d基因的原核表达及抗原性分析

1.原核表达重组质粒的构建

根据EteIF3d基因的开放阅读框设计引物，在上下游引物序列中分别加入了Hind III和Xhol I的酶切位点，该上下游引物序列见下表4，用这对引物进行PCR扩增，将目的条带克隆进载体pGEM-T-easy后，提取质粒进行双酶切，然后再与用同样限制性内切酶双酶切的表达载体pET-28b(+)连接，构建重组表达质粒。经过PCR以及双酶切鉴定后，获得与预期大小一致的目的条带(见图3)。表明含EteIF3d基因的原核表达质粒构建成功。图3中，1.pET28b-Ete IF3d重组质粒Xho l I和Hind III双酶切；2.pET28b空载体Xho l I和Hind III双酶切。

表4PCR反应中所用的引物名称及序列

2.EteIF3d重组蛋白的表达

将构建成功的pET28b-EteIF3d重组表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，用常规的1mmol/L IPTG浓度进行诱导表达。分别取不同时间段的表达菌，进行SDS-PAGE电泳分析。发现目的条带在6h已达到表达高峰，大小为69KD左右(图4)，与预期大小一致(EteIF3d基因编码蛋白大小约65KD，表达的融合蛋白His标签约3.5KD)。图4中，M：标准蛋白质分子量(从上至下)；1：未加IPTG诱导的0h菌液；2-6：分别为2h，4h，6h，8h，10h的表达产物。

3.EteIF3d重组蛋白包涵体的纯化

将IPTG诱导表达的大量菌液，4℃离心获得菌体沉淀后，加入适量PBS缓冲液，悬浮混匀，经超声裂解后，离心。分别取适量上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示，表达的融合蛋白His-EteIF3d以包涵体形式存在。经过一系列诱导条件的改变，该融合蛋白仍然以包涵体形式存在。故采用包涵体纯化方法对重组蛋白进行纯化。经过变形后，取少量纯化后收集的各个离心管样品，分别进行SDS-PAGE电泳。结果表明，获得了较高纯度的His-EteIF3d融合蛋白(图5)。图5中，M：标准蛋白质分子量(从上至下)；1-6：纯化的蛋白。

4.柔嫩艾美耳球虫子孢子、EteIF3d重组蛋白兔多抗血清的制备

(1)柔嫩艾美耳球虫子孢子兔多抗血清的制备

将纯化好的柔嫩艾美耳球虫子孢子从液氮中取出，加入适量PBS(含1mmol/L的BMSF蛋白酶抑制剂)悬浮，冰上超声(40W功率超声20min，超声3s然后停5s)，以8000r/min的转数，4℃离心20min左右，收集上清。测子孢子全蛋白浓度，以每只兔子200μg子孢子全蛋白的剂量，与弗氏完全佐剂按1∶1的比例混合装入EP管中，然后利用漩涡振荡仪振荡乳化，吸入1mL的注射器中，在兔子腹股沟皮下多点注射，进行一免。两周后用相同剂量的蛋白与弗氏不完全佐剂按1∶1比例混合乳化，相同方式进行二免，以后每隔一周进行一次免疫，待四免时，从兔耳缘静脉采1mL血液进行琼扩实验测免疫效价。第五次免疫7天后，从兔颈动脉采血，收集血清，分装后于-20℃冻存。

(2)EteIF3d重组蛋白兔多抗血清的制备

取纯化透析好的EteIF3d重组蛋白，测得浓度后，按照与上述制备柔嫩艾美耳球虫子孢子兔多抗血清的相同方法，进行免疫。最后采血，将血清分装冻存于-20℃。

5.重组蛋白的Western-blot分析

将纯化的His-EteIF3d重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，再转印至PVDF膜上，用柔嫩艾美耳球虫子孢子的兔抗多克隆血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为二抗，进行Western-blot分析，结果在His-EteIF3d重组蛋白分子量大小处出现了一条明显的条带(图6)，表明His-EteIF3d重组蛋白具有良好的抗原性。图6中，M.：预染的蛋白质标准分子量(从上至下为：170kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kDa、43kDa、34kDa、26kDa、17kDa、11kDa)；1：柔嫩艾美耳球虫子孢子免疫兔子的抗血清；2：抗His标签单抗。

实施例4EteIF3d基因的真核表达及抗原性分析

为进一步分析EteIF3d功能，将其进行分泌表达，把EteIF3d基因连接到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，然后转化GS115酵母感受态细胞，经甲醇诱导表达，获得了有活性的可溶性蛋白，具体步骤如下：

(1)扩增EteIF3d基因

根据EteIF3d编码核苷酸序列及酵母表达载体pPIC9K多克隆位点序列，设计1对含SnaBI和Avr II酶切位点的引物，引物序列见下表5。

表5 PCR反应中所用的引物名称及序列

以重组质粒pET28a-EteIF3d为模板，进行PCR扩增反应，反应结束后取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。结果获得大小约1900bp的基因片段，与预计的相符(见图7)。图7中，M：DNA分子量标准；1：EteIF3d目的基因。再将EteIF3d目的基因与pGEM-T-easy载体连接，挑取白斑提取质粒。

(2)pPIC9k-EteIF3d重组质粒的构建

将目的片段用SnaBI和Avr II双酶切后与同样双酶切的空载体pPIC9k连接，构建了重组质粒pPIC9k-EteIF3d。该重组质粒pPIC9k-EteIF3d转化TOP10感受态细胞，PCR鉴定的阳性克隆提取质粒。将重组质粒和空载体分别用SnaB I和Avr II双酶切进行鉴定，获得一大一小两条片段，与预期的大小一致，同时对空载体pPIC9k进行双酶切，仅有一条大分子量条带(图8)，表明重组质粒pPIC9K-EteIF3d构建成功。图8中，M：DL2000标准分子量；1：pPIC9k-EteIF3d重组质粒用SnaB I、Avr II双酶切分析；pPIC9k空载体用SnaB I、Avr II双酶切分析。

(3)pPIC9k-EteIF3d重组质粒的转化和筛选

将重组质粒载体pPIC9k-EteIF3d和空载体pPIC9k用Sac I酶切线性化后，转化GS115酵母感受态细胞。

(4)重组蛋白的诱导表达

1)取鉴定阳性的转化菌以及空载体转化菌100μL分别加入到两只4mL的含YPD的试管中，30℃摇床中振荡培养12h，转数为180r/min。

2)再将两个试管的菌液分别全部接种到50mL的BMGY培养基中，于30℃摇床中180r/min振荡培养，适时检测OD₆₀₀，待其值到10～20时停止培养。

3)将上述培养液分装入新的离心管中，4000r/min室温离心10min，去掉上清液，将其转入含50mL BMMY培养基的锥形瓶中，于30℃摇床中180r/min振荡培养24h。

4)向含有转化菌的BMMY培养基中加入500μL 10×甲醇，于30℃摇床中振荡培养24h，转数为180r/min。

5)分别收集1-3d的诱导表达上清2mL(每天添加1％甲醇)，4000r/min室温离心5min，将不同时间段的上清分别保存于4℃，备用。

取24h、48h、72h的酵母表达上清，进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，结果显示与空质粒相比，重组菌诱导表达液在分子量蛋白约70KD处有明显的条带出现，与预算69KD的大致相符，随着诱导时间的增加，蛋白条带逐渐加深，72h表达量最高(图9)。图9中，M：蛋白质标准分子量(从上至下为94.0KDa、66.2kDa、45.0kDa、35.0kDa、26.0kDa、20.0kDa、14.4kDa)；1：诱导的GS115-pPIC9K对照；2-4：分别为诱导24h、48h、72h的上清。

(5)重组蛋白Western-blot分析

取酵母表达的经过浓缩的蛋白做Western-blot分析，兔抗重组EteIF3d蛋白多克隆抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗，DAB显色至目的条带清晰时终止反应。结果显示在约70KD处(预期大小)出现了一条特异性条带，说明该蛋白在毕赤酵母细胞中成功表达，且蛋白能与兔抗EteIF3d血清发生免疫反应(图10)，证实表达的蛋白具有良好的抗原性。图10中，M：蛋白质标准分子量(从上至下为170kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kDa、43kDa、34kDa、26kDa、17kDa、11kDa)；1：目的蛋白。

实施例5 EteIF3d功能分析

1.EteIF3d蛋白的体外间接免疫荧光定位

利用免疫荧光反应，在柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵DF-1细胞动态发育过程中，分时间段取出不同发育阶段的虫体，固定，封闭后以兔抗EteIF3d多克隆血清为一抗，FIFC标记鼠抗兔荧光抗体为二抗，细胞核经DAPI染色后，在正置荧光显微镜下观察EteIF3d基因在各个发育阶段的位置变化，以及表达量变化。结果显示：在刚纯化的子孢子体内，EteIF3d基因弥散分布在其中(图11A)；当子孢子在DMEM培养基中37℃孵育1h，准备入侵细胞时，EteIF3d基因在顶部的表达量逐渐增多(图11B)；子孢子接种DF-1细胞2h后，从图上可以明显的观察到子孢子已经入侵DF-1细胞，同时发现目的基因编码的蛋白EteIF3d主要分布在子孢子边缘(图11C)；从图中看到接种细胞24h后，观察到子孢子已经发育为圆球形，并且EteIF3d已经从四周向子孢子顶端(一端)移动，聚集在子孢子顶端(一端)(图11D)；当子孢子接种DF-1细胞36h后，可以观察到子孢子已经发育为滋养体，在细胞内也出现了带虫空泡，EteIF3d也不在集中在一端，而是均匀分布于虫体内(图11E)；从图中可以看到接种DF-1细胞48h后，观察到球虫虫体已经开始发育成为未成熟的裂殖体，EteIF3d也开始大量表达，均匀分布于整个未成熟裂殖体中(图11F)；从图中可以看到接种DF-1细胞60h后，观察到球虫虫体已经发育为了一个成熟的裂殖体，体积也比未成熟裂殖体大了一些，同时，EteIF3d也继续高表达于裂殖体中(图11G)；从图中可以看到接种DF-1细胞68h后，可以观察到很多第一代裂殖子，而且已经发育完成，即将从裂殖体中释放出去，而EteIF3d也均匀分布于第一代裂殖子中，并且表达量也很高(图11H)；当子孢子接种DF-1细胞72h后，第一代裂殖子已经发育成熟，并且从裂殖体中释放入细胞中，而EteIF3d依然均匀的高表达于裂殖子体内(图11I)。图11中，A：子孢子在PBS中孵育1h；B：子孢子在DMEM培养基中孵育1h；C：子孢子接种DF-1细胞2h；D：子孢子接种DF-1细胞24h；E：子孢子接种DF-1细胞36h；F：子孢子接种DF-1细胞48h；G：子孢子接种DF-1细胞60h；H：子孢子接种DF-1细胞68h；I：子孢子接种DF-1细胞72h。

由此可以推测本发明EteIF3d蛋白在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段发挥一定作用，同时也可能和子孢子、裂殖子入侵肠道上皮细胞有一定关系。

2.EteIF3d兔多抗血清对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的抑制作用

体外荧光定位实验提示EteIF3d蛋白很可能与子孢子入侵相关，故对其进行体外入侵抑制性实验。利用Protein A Agarose纯化兔抗EteIF3d抗血清的IgG，将纯化的IgG分别以浓度50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL量与子孢子在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育2h，另外一管不加抗体，作为阴性对照。同时，以本实验室制得的另一已知的EtAMA1抗体IgG作为阳性对照，在相同的条件下，用相同浓度的抗体作用子孢子。最后分别接种于DF-1细胞中，培养16h后，用流式细胞分析仪进行分析。结果显示，EteIF3d抗体作用后的子孢子对细胞的入侵能力有一定程度的降低。随着抗体浓度的不断增大，作用后的子孢子入侵抑制率逐渐增加，直到抗体浓度为200μg/mL时，子孢子入侵抑制率达到最大，而阳性对照组中，随着抗体浓度的增大，入侵抑制率也逐渐增加，并且在400μg/mL浓度时依然具有很高的抑制能力(图12、图13)，说明EteIF3d蛋白与子孢子入侵宿主细胞具有一定的关系。图12中，A：未接种子孢子的正常DF-1细胞；B：接种子孢子，并与浓度为200μg/mL多抗IgG作用的细胞；C：接种子孢子，未与抗EteIF3d多抗IgG作用(阴性对照)。

实施例6EteIF3d基因编码的重组蛋白对鸡球虫的免疫保护性试验

1.免疫保护性试验分组及免疫程序

将1日龄小鸡在无球虫环境中饲养，7日龄时进行称重分组，每组30只鸡，试验共四组(两个不同剂量免疫组、一个感染对照组和一个健康对照组)。免疫剂量和免疫组别见表6，具体免疫程序如图14所示。图14中，OPG指卵囊数，G4、G7、G10分别指攻虫后第4、7、10天。

表6 EteIF3d的免疫保护性试验的分组情况

2.免疫保护性效果观察

主要从以下几个方面评价免疫保护性效果：

1)增重变化：本试验过程中，共进行了6次称重，分别在一免前、一免后7天、二免后7天、攻虫后第4天、第7天以及第10天。统计各组每个时期的平均增重，平均增重(g/只)＝试验结束后平均增重-初始分组平均重量；相对增重率＝平均增重/健康对照组平均增重。

2)粪便中卵囊产量变化：本试验中，从攻虫后第6天开始每天收集试验组以及对照组的粪便(多点采集)。按照本课题组建立的球虫卵囊检测方法进行卵囊检测。具体步骤如下：

①将粪便混合均匀，称取2g粪便于小烧杯中，加入58mL清水，搅拌均匀。

②用双层纱布过滤后，吸取2mL的粪液于15mL的离心管中，再加入4mL的饱和食盐水，用吸管混匀。

③吸取适量溶液滴到改良的麦氏虫卵计数板上，等10min左右即可在显微镜下计数。

按照公式：每克粪便含卵囊数(OPG)＝两次计数的平均值×600，得出每天每组排出的卵囊量，再根据5天的平均值，计算整个实验过程中，免疫组以及对照组的OPG变化情况。

卵囊减少率(％)＝[(感染对照组卵囊数-免疫组卵囊数)/感染对照组卵囊数]×100％。

3)盲肠病变记分：由于柔嫩艾美耳球虫主要破坏鸡盲肠，故攻虫后第10天，剖杀所有组的全部剩余鸡只，将两个盲肠取出，观察并记录两侧的盲肠病变情况。按照Johnson和Reid(1970)建立的双盲测试法(最低0分，最高4分)进行病变记分，若两侧盲肠病变不一致，则以严重的一侧为准。具体评分标准如下。

0分，无肉眼病变。

+1分，盲肠壁有很少量散在的瘀点，肠壁不增厚，内容物正常。

+2分，病变数量较多，盲肠内容物明显带血，盲肠壁稍增厚，内容物正常。

+3分，盲肠内有大量血液或有盲肠芯(血凝块或灰白色干酪样的香蕉型块状物)，盲肠壁肥厚明显，盲肠中粪便含量少。

+4分，因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯中含有粪渣或不含，死亡鸡只也记4分。

4)体液免疫水平免疫效果：在一免后7天、二免后7天、攻虫后4天、攻虫后7天以及攻虫后10天，每次分别从每组随机取出三只鸡，心脏采血，分离血清，用间接ELISA方法检测鸡血清中EteIF3d特异性抗体水平的变化。

3.EteIF3d重组蛋白的免疫保护性试验结果

(1)免疫增重效果

实验表明，免疫后的鸡只和没有免疫的鸡只在增重方面大致相当，没有显著区别(图15)。

(2)卵囊产量

从攻虫后第6天开始收集粪便，检查卵囊排出情况，总共持续5天。实验结果表明，5天之内，两个免疫组卵囊排出量明显少于感染对照组，卵囊减少率分别为41.39％以及56.98％。在抑制卵囊排出量方面，100μg免疫组比低剂量组好(表7)。

表7卵囊排出量

(3)盲肠病变记分

结果显示，免疫组盲肠病变均小于感染组，并且100μg免疫组免疫保护效果更好(表8)。

表8盲肠病变记分

(4)体液免疫效果评价

结果如图16所示：一免后7天(1M)，免疫重组蛋白的鸡只相比于对照组，在鸡体内产生了较高的特异性抗体水平；二免后7天(2M)，免疫组鸡只体内抗体水平相比于一免后有显著上升；攻虫后第4天(G4)，免疫组鸡只体内抗体水平仍然高于对照组，只是相比于二免后稍有下降；攻虫后第7天(G7)，高剂量免疫组抗体水平依然呈现高水平；攻虫后第10天(G10)，免疫组鸡只体内抗体水平维持在高位。由此可知，100μg免疫组在特异性抗体效价方面表现更好，基本能维持在一个比较高的水平，具有比较好的体液免疫保护力。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因及其应用

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>571

<212>PRT

<213>Eimeria tenella

<400>1

Met Pro Ala Ser Ala Asn Asp Ile Phe Pro Tyr Ala Ser Gly Gly Ala

1 5 10 15

Pro Cys Trp Gly Pro Pro Glu Lys Pro Asn Ser Lys Ser Glu Phe Asp

20 25 30

Leu Asn Leu Lys Ser Pro Leu Phe Ser Gln Gln Leu Phe Asp Asp His

35 40 45

Leu Gln Glu Gly Leu Ser Leu Leu Glu Val Leu Pro Arg Cys Cys Asp

50 55 60

Phe Thr Phe Asn Ser Lys Gln Arg Asp Pro Arg Gly Ala Ala Pro Val

65 70 75 80

Asp Asp Glu Lys Glu Phe His Met Val Asp Ser Lys Pro Met Met Arg

85 90 95

His Lys Thr Thr Gly Glu Gly Trp Leu Ser Arg Arg Arg Ala Pro Val

100 105 110

Lys Gln Thr Thr Ala Ala Phe Asn Glu Lys Thr Lys Asp Glu Glu Glu

115 120 125

Leu Thr Leu Gly Lys Lys Ala Lys Ser Asp Gln Lys Lys Gln Gln Gln

130 135 140

Gln Gln Gln Ala Arg Tyr Ala Arg Ile His Ala Arg His Arg Ala Phe

145 150 155 160

Ser Glu Trp Ser Ile Gln Pro Thr Asn Asp Trp Gln Val Leu Ala Glu

165 170 175

Leu Pro Leu Gln Gln Leu His Arg Gln Gln Ile Glu Thr Pro Arg Val

180 185 190

Thr Val Glu Asp Leu Glu Trp Arg Gly Thr Leu Gly Val Tyr Ser Arg

195 200 205

Gln Ala Asp Lys Ile Ser Ser Lys Leu Pro Val Pro Met Gln Asn Leu

210 215 220

Ser Ser Asn Phe Tyr Tyr Tyr Trp Val Thr Thr Gln Asp Asp Glu Val

225 230 235 240

Ile Arg Asp Tyr Met Leu Asn Gly Ser Lys Gln Val Asp Val Ala Ala

245 250 255

Thr Asp Gln Val Leu Ala Cys Leu Met Ala Ala Pro Gln Ser Lys Tyr

260 265 270

Ser Trp His Leu Tyr Leu Thr Lys Ile Asp Gly Lys Ile Ile Ile Asp

275 280 285

Lys Ala Asn Gly Ser Ile Val Asp Leu Leu Thr Val Asn Glu Thr Ser

290 295 300

Ile Glu Pro Pro Met Gln Asp Ala Glu Asn Arg Leu Asn Arg Pro Ala

305 310 315 320

Ala Leu Gly Phe Glu Ala Val Arg Ile Asn Gln Asn Leu Arg Gln Gln

325 330 335

Leu Leu Val Pro Gly Glu Val Ala Ala Glu Tyr Pro Pro Ala Pro Phe

340 345 350

Val Glu Ser Gly Asp Thr Pro Ala Thr Ile Ala Tyr Arg Tyr Arg Leu

355 360 365

Phe Thr Ile Pro Pro Arg Ala Gly Pro Asn Ala Ser Arg Arg Pro Ile

370 375 380

Asn Ile Leu Thr Arg Ala Glu Val Tyr Ala Lys Ser Pro Met Ala Arg

385 390 395 400

Ala Asp Leu Lys Glu Ala Arg Glu Gly Asp Asn Phe Ile Val Asp Gly

405 410 415

Gly Gly Tyr Ile Tyr Thr Cys Ala Leu Asn Glu Ile Glu Pro Lys Gly

420 425 430

Gln Lys Asn Trp Arg Thr Leu Leu Glu Ser Gln Arg Gly Ala Leu Leu

435 440 445

Ala Thr Glu Val Arg Asn Asn Ala Cys Lys Leu Arg Lys Phe Val Thr

450 455 460

Ser Ala Met Ile Ala Gly Cys Asp Glu Leu Arg Leu Gly Phe Val Ala

465 470 475 480

Arg Lys Thr Pro Asn Asp Asn Glu Gln His Leu Ile Leu Thr Val His

485 490 495

Asn Tyr Gln Thr Arg Asp Leu Gly Arg Gln Ile Gly Leu Arg Pro Glu

500 505 510

Asn Ala Trp Gly Ile Val Arg Ala Val Leu Asp Leu Leu Glu Asp Lys

515 520 525

Pro Asp Gly Arg Tyr Val Leu Leu Lys Asp Pro Thr Lys Pro Met Met

530 535 540

Arg Leu Tyr Ser Arg Pro Glu Asp Glu Glu Glu Arg Glu Glu Ala Asn

545 550 555 560

Glu Ala Asn Arg Glu Gln Ala Glu Glu Glu Gln

565 570

<210>2

<211>2278

<212>DNA

<213>Eimeria tenella

<220>

<221>CDS

<222>(156)..(1871)

<400>2

ggacactgac atggactgaa ggagtagaaa atttttttac acctcagcct tagttggttt 60

ctggggatct tgttggctca agcggttttc ttccttccgc gggcgattct gctgcctagg 120

gttcacctag ggtttagggt ttagggtttg ctgcg atg cct gcc tct gcc aac 173

Met Pro Ala Ser Ala Asn

1 5

gac ata ttc ccc tac gcc tct ggc ggg gcc ccc tgc tgg ggg ccc ccc 221

Asp Ile Phe Pro Tyr Ala Ser Gly Gly Ala Pro Cys Trp Gly Pro Pro

10 15 20

gag aag cca aac agc aaa tct gag gat gac cat ttg cag gag ggt tta 269

Glu Lys Pro Asn Ser Lys Ser Glu Asp Asp His Leu Gln Glu Gly Leu

25 30 35

tcc ctt ttg gag gtt ttg cct ttc gac ctc aac ctg aag tct ccc ctc 317

Ser Leu Leu Glu Val Leu Pro Phe Asp Leu Asn Leu Lys Ser Pro Leu

40 45 50

ttt tct cag cag ctc ttc agg tgc tgc gat ttc aca ttc aac agc aag 365

Phe Ser Gln Gln Leu Phe Arg Cys Cys Asp Phe Thr Phe Asn Ser Lys

55 60 65 70

caa aga gac cca agg gga gcg gcc cca gtg gat gat gag aag gaa ttc 413

Gln Arg Asp Pro Arg Gly Ala Ala Pro Val Asp Asp Glu Lys Glu Phe

75 80 85

cac atg gtt gac agc aag cca atg atg cgg cac aag acc aca gga gag 461

His Met Val Asp Ser Lys Pro Met Met Arg His Lys Thr Thr Gly Glu

90 95 100

ggc tgg ctc agc cgt cgc aga gcc ccg gtg aag cag acg aca gca gca 509

Gly Trp Leu Ser Arg Arg Arg Ala Pro Val Lys Gln Thr Thr Ala Ala

105 110 115

ttt aac gag aag aca aaa gat gaa gag gag ctg aca ttg ggc aaa aag 557

Phe Asn Glu Lys Thr Lys Asp Glu Glu Glu Leu Thr Leu Gly Lys Lys

120 125 130

gca aag agt gac cag aag aag cag cag cag caa cag caa gca aga tac 605

Ala Lys Ser Asp Gln Lys Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala Arg Tyr

135 140 145 150

gcc cgc atc cac gcg cgc cac cgc gcc ttc tct gaa tgg tcc att cag 653

Ala Arg Ile His Ala Arg His Arg Ala Phe Ser Glu Trp Ser Ile Gln

155 160 165

ccc acc aac gac tgg cag gtt ctg gcg gag ctg ccg ctg cag cag ctg 701

Pro Thr Asn Asp Trp Gln Val Leu Ala Glu Leu Pro Leu Gln Gln Leu

170 175 180

cac agg cag cag att gaa act cca cgt gtt act gtt gag gat ttg gaa 749

His Arg Gln Gln Ile Glu Thr Pro Arg Val Thr Val Glu Asp Leu Glu

185 190 195

tgg cgc ggc acc ttg ggt gtc tac tcg cgg caa gct gac aag att tcc 797

Trp Arg Gly Thr Leu Gly Val Tyr Ser Arg Gln Ala Asp Lys Ile Ser

200 205 210

agc aaa ctg ccg gtg cca atg caa aac ctc agc agc aac ttc tac tac 845

Ser Lys Leu Pro Val Pro Met Gln Asn Leu Ser Ser Asn Phe Tyr Tyr

215 220 225 230

tac tgg gtc acc aca caa gat gac gaa gtc atc agg gat tat atg cta 893

Tyr Trp Val Thr Thr Gln Asp Asp Glu Val Ile Arg Asp Tyr Met Leu

235 240 245

aac ggc agc aag cag gtt gat gtt gca gca acc gac cag gta ctg gct 941

Asn Gly Ser Lys Gln Val Asp Val Ala Ala Thr Asp Gln Val Leu Ala

250 255 260

tgc ctt atg gcg gcg cct cag tcc aag tat tcg tgg cat ctt tac ctg 989

Cys Leu Met Ala Ala Pro Gln Ser Lys Tyr Ser Trp His Leu Tyr Leu

265 270 275

acc aag att gac ggg aaa atc att atc gac aag gcc aac gga tcc att 1037

Thr Lys Ile Asp Gly Lys Ile Ile Ile Asp Lys Ala Asn Gly Ser Ile

280 285 290

gtg gat ctg ctc acc gtc aac gaa acg agc att gag ccc cct atg cag 1085

Val Asp Leu Leu Thr Val Asn Glu Thr Ser Ile Glu Pro Pro Met Gln

295 300 305 310

gac gca gag aac cgc cta aat cgc cca gca gct cta ggg ttt gag gct 1133

Asp Ala Glu Asn Arg Leu Asn Arg Pro Ala Ala Leu Gly Phe Glu Ala

315 320 325

gtc cgt atc aac cag aat ttg aga cag cag ctc ttg gtg ccc ggc gaa 1181

Val Arg Ile Asn Gln Asn Leu Arg Gln Gln Leu Leu Val Pro Gly Glu

330 335 340

gtt gct gct gag tat ccg cct gcc ccg ttc gta gag agt ggg gat act 1229

Val Ala Ala Glu Tyr Pro Pro Ala Pro Phe Val Glu Ser Gly Asp Thr

345 350 355

ccc gcg acc att gct tat aga tac cgc ctc ttc acc att cct cct cgc 1277

Pro Ala Thr Ile Ala Tyr Arg Tyr Arg Leu Phe Thr Ile Pro Pro Arg

360 365 370

gcc gga cca aac gcc tct cgc cgc ccc atc aac atc ctt aca agg gct 1325

Ala Gly Pro Asn Ala Ser Arg Arg Pro Ile Asn Ile Leu Thr Arg Ala

375 380 385 390

gag gtc tac gcc aag tct cca atg gcg cgc gcg gac ctg aag gaa gcg 1373

Glu Val Tyr Ala Lys Ser Pro Met Ala Arg Ala Asp Leu Lys Glu Ala

395 400 405

aga gag ggt gac aac ttc att gtg gat gga gga ggg tac att tat act 1421

Arg Glu Gly Asp Asn Phe Ile Val Asp Gly Gly Gly Tyr Ile Tyr Thr

410 415 420

tgt gct ctt aac gag ata gag cca aaa ggg cag aag aac tgg cgc act 1469

Cys Ala Leu Asn Glu Ile Glu Pro Lys Gly Gln Lys Asn Trp Arg Thr

425 430 435

ctc tta gag agc cag cgt ggt gcc ctt ttg gcc acg gag gtt cgc aat 1517

Leu Leu Glu Ser Gln Arg Gly Ala Leu Leu Ala Thr Glu Val Arg Asn

440 445 450

aac gcc tgc aaa ttg aga aag ttt gta acc tca gca atg att gcc ggt 1565

Asn Ala Cys Lys Leu Arg Lys Phe Val Thr Ser Ala MetIle Ala Gly

455 460 465 470

tgt gat gaa ctt cga ctt ggc ttt gtc gcc agg aag acg ccc aac gac 1613

Cys Asp Glu Leu Arg Leu Gly Phe Val Ala Arg Lys Thr Pro Asn Asp

475 480 485

aat gag cag cac tta att ctg acg gtg cac aat tat cag aca aga gac 1661

Asn Glu Gln His Leu Ile Leu Thr Val His Asn Tyr Gln Thr Arg Asp

490 495 500

ctg gga agg caa att ggt ctc cgg ccg gaa aac gcc tgg ggt att gtg 1709

Leu Gly Arg Gln Ile Gly Leu Arg Pro Glu Asn Ala Trp Gly Ile Val

505 510 515

agg gct gtg ctc gat ctg ctc gaa gac aag cct gac ggc aga tac gtg 1757

Arg Ala Val Leu Asp Leu Leu Glu Asp Lys Pro Asp Gly Arg Tyr Val

520 525 530

ctg cta aag gac cca acg aaa ccg atg atg cgc ctt tac tcg cgc cca 1805

Leu Leu Lys Asp Pro Thr Lys Pro Met Met Arg Leu Tyr Ser Arg Pro

535 540 545 550

gag gat gaa gag gag aga gaa gaa gca aac gaa gcc aac agg gag cag 1853

Glu Asp Glu Glu Glu Arg Glu Glu Ala Asn Glu Ala Asn Arg Glu Gln

555 560 565

gca gag gag gaa cag tag agcggaagac agacaaaaca ggaagattgt 1901

Ala Glu Glu Glu Gln

570

tcaactcaag agcccaccga agtctggcca aagaaggaga cccagcaaat gcatgcacga 1961

acaacgcgcg catgtgacac tgcatgcgct tcctttgaat tcctcagtgc atgcaagcgc 2021

gcatgcgcgt gcaggcccgc agcttgcatg gatgcagata agcatcatgc ggtttactcg 2081

ggactggcag ttcacggctg cattgttggg gagagacaga aaactaaata taattgcgat 2141

gcatgcagcc ccaaaaaaaa aaaaaaaaac actgtccatg gccgttacgt agaaatccac 2201

taatggaatt ttccggccgc cctggcggtg tgacccttat tgggagagac tcctcccacc 2261

ccgttgggat gggtagc 2278

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物

<400>3

ccggcgaagt tgctgctgag tatc 24

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>4

tcccgcgacc attgcttata gatac 25

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400>5

gctgggcgat ttaggcggtt ctc 23

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物

<400>6

atttaggcgg ttctctgcgt cctg 24

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物

<400>7

cgatgcctgc ctctgccaac gaca 24

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>8

gccgtgaact gccagtcccg ag 22

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>9

cggcagcaag caggttgatg 20

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>引物

<400>10

tgggcgattt aggcggttct c 21

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>引物

<400>11

tgtagtggag tcttggtgat tc 22

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>引物

<400>12

cctgctgcct tccttagatg 20

<210>13

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(32)

<223>引物

<400>13

gcaagcttat gcctgcctct gccaacgaca ta 32

<210>14

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(31)

<223>引物

<400>14

gcctcgagcc gtgaactgcc agtcccgagt a 31

<210>15

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(32)

<223>引物

<400>15

gctacgtaat gcctgcctct gccaacgaca ta 32

<210>16

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(31)

<223>引物

<400>16

gacctaggcc gtgaactgcc agtcccgagt a 31

Claims

1.一种柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因为编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的柔嫩艾美耳球虫eIF3d基因。

2.根据权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

3.一种柔嫩艾美耳球虫蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为柔嫩艾美耳球虫eIF3d蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求4所述的重组载体，或已用权利要求1所述基因转化或转染。

6.一种抗血清，其特征在于，该抗血清是用权利要求4所述重组载体表达的重组蛋白免疫动物而制得。

7.一种抗体IgG，其特征在于，该抗体IgG是由权利要求6所述抗血清经纯化而制得。

8.权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因在制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物中的应用。

9.权利要求3所述柔嫩艾美耳球虫蛋白质在制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物中的应用。

10.权利要求1所述柔嫩艾美耳球虫基因在筛选预防或治疗鸡球虫病的药物中的应用。