CN103159855B - 融合蛋白及其用途、其抗疟疾疫苗和抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种融合蛋白的用途、其抗疟疾疫苗和抗体。本发明的融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次含有SEQ ID No.：7所示的氨基酸序列和SEQ ID No.：5所示的氨基酸序列。本发明的融合蛋白及疫苗具有以下优点和积极效果：重组蛋白具有较强的免疫原性，理化性质稳定，能激发可持续、高滴度特异性抗体，小鼠免疫血清能识别恶性疟原虫天然抗原，能诱发显著的T细胞应答，并能较好抑制恶性疟原虫体外生长，是极具潜力的候选疫苗，具有较好的开发前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种融合蛋白及其在制备用于预防和/或治疗疟疾的药物中的用途、含有该融合蛋白的抗疟疾疫苗、以及抗体或杂交瘤细胞或抗血清。
背景技术
由蚊媒传播的疟疾是危及人类生命的最古老的疾病，已有数千年历史，但时至今日仍旧被世界卫生组织(WHO)列为全球最严重的三大传染病之一。据最新统计数据估计，全球约40％的世界人口，处于罹患疟疾的危险之中，而每年有5亿人受到疟原虫感染，约100万人死于恶性疟疾，其中大部分是五岁以下的儿童和孕妇。疟疾不仅对发展中国家人民生命健康造成严重危害，而且还严重阻碍了这些国家
的社会经济发展。近几年来由于抗药性疟原虫虫株及抗杀虫剂蚊媒的产生及蔓延，传统防治疟疾的方法受到新的挑战，因此研制一种有效的疟疾疫苗是疟疾防治的重要替代途径，也是实现WHO提出的2010年疟疾发病率和死亡率下降50％的目标的主要手段。
生活在频繁传播疫区的居民天然条件下能获得临床免疫力，这种免疫力不仅能抵抗临床症状而且能对抗重症疟疾，另外也可能转为带虫免疫状态；用减毒子孢子或一些重组蛋白质疫苗(如红细胞前期(红前期)的RTS，S)免疫哺乳动物、灵长类以及人类，也能诱导部分或全部抗虫免疫；这些观察都为恶性疟疾疫苗研发的可行性提供了有利的证据。
但是疟原虫的生活周期复杂，包括蚊体内繁殖期、红细胞前期、红细胞内期，各期均可表达大量不同抗原。因此，尽管目前已鉴定出约50个分别针对疟原虫不同的生活时期的抗原，有些作为疫苗已经进入不同阶段的临床试验，但迄今为止还未有可用的疟疾疫苗。其原因包括：人们对疟疾免疫保护的机制研究不够深入，无法为疫苗的研制提供充分理论依据；仍缺乏具有显著保护作用的候选抗原；缺乏有效的动物模型；疟原虫抗原本身存在多态性、多变性和虫株特异性等特点，使得现有候选疫苗保护人群的范围可能非常有限等。再加上疟疾疫苗的研制投入大(每个候选疫苗平均投入5亿美元)，周期长(10-12年)等因素，都可能延缓有效疫苗的出现。
疟疾疫苗的研制按照保护人群的不同可分为不同类型：保护非疫区健康人不受感染的红细胞前期疫苗；保护疫区人群尤其是儿童抵抗感染、降低病死率的红内期疫苗；以及蚊媒传播阻断型疫苗。红细胞内期是恶性疟原虫致病和发病的唯一阶段，因此研制红内期疫苗就对降低病死率，减少并发症具有重大的现实意义。但到目前为止，所有单期单价疫苗的免疫效果都不理想。
目前所公知的是，针对疟原虫具有抗原阶段性、高变异性、差异性和多态性的特点，选取针对恶性疟疾不同生活时期、诱导产生多种免疫反应类型的不同抗原或表位，构建亚单位疫苗或多表位疫苗，是解决上述技术问题的一种有效手段，这也已经成为疟疾疫苗研究的热点。
对于红内期多表位疫苗的研制而言，最为理想的红内期疟疾疫苗应该能够模拟疫区人群所形成的天然免疫。通过选用来自多抗原的多个表位所产生的协同作用，激发免疫系统产生对疟原虫的免疫力，经降低虫载量达到降低病死率的效果。而在实际研究中，多个表位相互连接的组合顺序存在巨大的多样性，通过手工操作的办法难以获得具有最佳连接顺序的人工多表位抗原。
在中国专利申请No.200410080982.6中，公开了一种人工随机组合抗原——多表位人工抗原ES312(本文中以M.RCAg-1/Exp.V-3表示)，其具有323个氨基酸，相对分子量为约65kDa。其针对参与抗疟原虫红内期感染的免疫类型，借鉴分子育种技术的随机重组原理，利用表位改组技术构建了多表位基因库，并用库免疫血清筛选出免疫原性最佳、稳定性最好的人工随机组合抗原——M.RCAg-I。初步研究证实，免疫近交系小鼠、新西兰白兔和恒河猴后可诱导产生很高的抗体水平，并诱发显著的CD4+T细胞反应。在这个随机组合抗原中所包含的所有表位都能诱导产生很强的特异性抗体反应。在对来自中国海南、巴西和喀麦隆的恶性疟患者血清进行的检测中，血清抗体识别重组蛋白M.RCAg-I的阳性率与正常组有极显著性差异(p＜0.001)，且血清抗体滴度与被检测者的年龄呈正相关。综上所述，M.RCAg-I蛋白质疫苗是一个极具潜力的候选疫苗，具有较好的开发前景。
因此，对M.RCAg-I抗原进行进一步地优化重建，以提高蛋白的稳定性和针对恶性疟原虫的活性，则显得尤为重要。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种其抑制疟原虫的活性得到显著提高的融合蛋白。
具体而言，本发明提供：
(1)一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次含有SEQ ID No.：7所示的氨基酸序列和SEQ ID No.：5所示的氨基酸序列。
(2)根据(1)所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.：1所示的氨基酸序列。
(3)一种用于编码根据(1)或(2)所述的融合蛋白的DNA。
(4)根据(3)所述的DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为SEQ ID No.：2所示的核苷酸序列。
(5)根据(1)或(2)所述的融合蛋白在制备用于预防和/或治疗疟疾的药物中的用途。
(6)根据(5)所述的用途，其中，所述的药物为抗疟疾疫苗。
(7)根据(6)所述的用途，其中，所述的抗疟疾疫苗为抗红内期疟疾疫苗。
(8)一种抗疟疾疫苗，该抗疟疾疫苗含有(1)或(2)所述的融合蛋白。
(9)根据(8)所述的抗疟疾疫苗，其中，所述抗疟疾疫苗还含有佐剂，所述佐剂为选自油包水型佐剂MontnidelSA720、MontnidelSA51、弗氏佐剂或氢氧化铝佐剂中的一种或几种。
(10)根据(8)所述的抗疟疾疫苗，其中，所述融合蛋白的含量为10～100μg/ml。
(11)根据(9)所述的抗疟疾疫苗，其中，所述佐剂的含量为10～100μg/ml。
(12)根据(8)所述的抗疟疾疫苗，其中，所述的抗疟疾疫苗为抗红内期疟疾疫苗。
(13)一种抗体或杂交瘤细胞或抗血清，所述的抗体或杂交瘤细胞或抗血清是以根据(1)或(2)所述的融合蛋白或根据(8)-(12)中任一项所述的疫苗为免疫原而制备得到的。
(14)根据(13)所述的抗体或杂交瘤细胞或抗血清在制备用于预防和/或治疗疟疾的免疫制剂中的用途。
本发明的融合蛋白及疫苗与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明的融合蛋白(如重组蛋白M.RCAg-1/Exp.V-1)具有较强的免疫原性，理化性质稳定，能激发可持续、高滴度特异性抗体，小鼠免疫血清能识别恶性疟原虫天然抗原，能诱发显著的T细胞应答，并能较好抑制疟原虫体外生长，是极具潜力的候选疫苗，具有较好的开发前景。
本发明的融合蛋白(如重组蛋白M.RCAg-1/Exp.V-1)与M.RCAg-1/Exp.V-2、M.RCAg-1/Exp.V-3两种多表位蛋白在动物模型体内的免疫原性相似(p＞0.05)，但蛋白免疫小鼠后却诱导了不同类型的T细胞反应。
此外，上述三种蛋白的免疫血清IgG体外生长抑制率分别为93.9％，14.7％，54.3％，从上述结果可以看出，相对于M.RCAg-1/Exp.V-3，M.RCAg-1/Exp.V-1的体外抑虫活性得以大幅提高，即评价恶性疟疾红细胞内期疫苗有效性的标准-免疫兔血清抗体对体外培养的恶性疟原虫的生长抑制(GIA)率，在目前没有疫苗体内评价模型的情况下，体外保护力实验就具有更为重要的意义。而利用生物信息学和色谱技术分析，可以发现从不同表达载体制备的重组蛋白在二级和三级结构上出现极大差异。
附图说明
图1为M.RCAg-1/Exp.V-1、M.RCAg-1/Exp.V-2和M.RCAg-1/Exp.V-3三种多表位蛋白的氨基酸序列比较示意图；
图2为M.RCAg-1/Exp.V-1、M.RCAg-1/Exp.V-2和M.RCAg-1/Exp.V-3三种多表位蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中M代表低分子量蛋白Marker；1、2、3分别代表M.RCAg-1/Exp.V-1、M.RCAg-1/Exp.V-2和M.RCAg-1/Exp.V-3；
图3为圆二色谱法检测三种蛋白的光谱图；
图4为M.RCAg-1/Exp.V-1(图4A)、M.RCAg-1/Exp.V-2(图
4B)和M.RCAg-1/Exp.V-3(图4C)三种多表位蛋白的结构预测模型图；
图5为M.RCAg-1/Exp.V-1、M.RCAg-1/Exp.V-2和M.RCAg-1/Exp.V-3三种多表位蛋白的兔免疫血清对天然疟原虫蛋白的识别结果图；其中，左上为阴性对照；右下、左下、右上分别代表M.RCAg-1/Exp.V-1、M.RCAg-1/Exp.V-2和M.RCAg-1/Exp.V-3；
图6为ELISPOT检测小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ和IL-4分泌细胞克隆数的图；
图7为pDS-ex载体质粒的示意图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
虽然目前对于某些传染性疾病多表位疫苗的研发已经取得了一定的进展，但影响多表位蛋白免疫效能的因素较多，如不同表位的个体特性，多表位间的排列方式或连接方式，乃至于表位间的侧翼序列等因素，而也包括稳定多表位蛋白结构的设计及构建时载体的选择等因素，这些都属于多表位蛋白肽链内因素，也即如何连接表位才能尽可能诱导出所连接表位最优的免疫反应，但多表位蛋白构建时肽链外因素对多表位蛋白有效性的影响却鲜有报道，其中多表位蛋白的融合表达对其免疫有效性的影响更是尚不明确。
从理论上看，通过选择重要抗原的具有保护性和保守性的表位进行组合，有可能获得针对具有复杂抗原性病原体的高覆盖率。但在重组抗原分子中不同表位结构对蛋白免疫原性的影响是不同的，各表位间的相对位置，构象特征(可及性、柔性、二级结构等)及表位侧翼顺序等都与表位的功能都密切相关，而理想的疫苗分子应该包括一组合理组合与搭配的表位。本发明人通过表位改组的随机重组和菌落表达的免疫化学筛选方法，成功地获得了具有较高免疫原性和免疫反应多样性的多表位疫苗，已初步证实其中所有单个表位都能被递呈，多表位蛋白能够在动物体内诱导出较强的细胞免疫和体液免疫反应。
本发明是在对多表位疫苗蛋白M.RCAg-1高效表达载体的改造实验中偶然发现的。本发明人对M.RCAg-I重组蛋白进行优化重建，以获得高表达量的工程菌，并分析了不同的载体肽融合表达对多表位蛋白M.RCAg-1结构及免疫活性的影响，在研究中发现了部分载体系统对重组蛋白免疫有效性的影响，而且肽段可增强多表位疫苗M.RCAg-1的体外抑虫活性，体外免疫保护性有显著差异，与直接表达为不带载体融合肽的M.RCAg-1/Exp.V-3重组蛋白诱导产生的特异性抗体的50％左右的抑虫率相比，带有肠激酶(Enterokinase)酶切识别位点N端融合肽的M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白能够几乎完全抑制疟原虫的生长，而带有前切割蛋白酶(PreScission protease)酶切识别位点的N端融合肽M.RCAg-1/Exp.V-2蛋白，其特异性抗体对疟原虫生长的抑制率却降低到15％左右。本发明为成功构建新一代多表位疟疾疫苗提供了有力的理论和实验依据。
本发明的一个方面提供了一种融合蛋白，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次含有SEQ ID No.：7所示的氨基酸序列(其DNA序列如SEQ ID No.：8所示)和SEQ ID No.：5所示的氨基酸序列。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.：1所示的氨基酸序列。所述融合蛋白具有366个氨基酸，相对分子量为约70kDa。
本发明的另一个方面提供了一种分离的用于编码所述的融合蛋白的DNA。优选地，所述DNA的核苷酸序列为SEQ ID No.：2所示的核苷酸序列。
本发明的另一个方面提供了所述的融合蛋白在制备用于预防和/或治疗疟疾的药物中的用途。优选地，所述的药物为疫苗。更优选的是，所述疫苗为红内期疟疾疫苗。
本发明的另一个方面提供了一种抗疟疾疫苗，所述疫苗包含所述的融合蛋白。本发明的疫苗可含有佐剂，也可以不含有佐剂。
本领域技术人员可以根据需要确定所述融合蛋白在本发明的疫苗中的含量。优选地，所述融合蛋白的含量为10～100μg/ml。
优选地，本发明的疫苗中含有佐剂。佐剂可以为本领域公知的常用的佐剂，例如：油包水型佐剂MontnidelSA720、MontnidelSA51、弗氏佐剂或氢氧化铝佐剂中的一种或几种。更优选地，所述佐剂为MontnidelSA51。
本领域技术人员可以根据需要确定佐剂在本发明的疫苗中的含量。优选地，所述佐剂的含量为10～100μg/ml。
优选地，每剂疫苗为0.1～1ml；更优选地，每剂疫苗为0.2～0.4ml。
本发明的疫苗可以通过肌肉注射、皮下注射或腹腔注射的方式来施用。
本发明的另一个方面提供了一种抗体或杂交瘤细胞或抗血清，所述的抗体或杂交瘤细胞或抗血清是以所述的融合蛋白或所述的疫苗为免疫原而制备得到的。
可以根据本领域常用的方法，来制备抗体或杂交瘤细胞或抗血清。
单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。淋巴细胞杂交瘤是用人工方法使骨髓瘤细胞(纯系小鼠的腹水瘤型浆细胞)与已用抗原致敏并能分泌某种抗体的淋巴细胞(常用致敏动物的脾细胞，起作用的是其中的B细胞)融合而成的。用来使上述淋巴细胞致敏的抗原有人和动物的T细胞、B细胞、红细胞、肿瘤细胞、各种微生物或其他抗原物质等。用适当方法把杂交瘤细胞分离出来，进行单个细胞培养，使之大量繁殖，则在该培养液中增殖而形成的细胞克隆，只产生完全均一的、单一特异性的抗体，即单克隆抗体。
本发明的另一个方面提供了所述的抗体或杂交瘤细胞或抗血清在制备用于预防和/或治疗疟疾的免疫制剂中的用途。本发明中的免疫制剂为人工主动或被动免疫制剂，人工主动免疫制剂是指用于预防接种的生物制品，接种后可使机体获得免疫力，可能为亚单位疫苗，基因工程疫苗以及DNA疫苗，人工被动免疫制剂是含有特异性抗体的免疫制剂，接种于人体后，可立即获得免疫力。
根据本发明的一种实施方案，将M.RCAg-1基因克隆到含有不同载体标签或不含有载体标签的原核表达载体pDS-ex上，表达纯化得到M.RCAg-1/Exp.V-1、M.RCAg-1/Exp.V-2、M.RCAg-1/Exp.V-3三种多表位蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.：1、SEQ ID No.：3以及SEQ ID No.：5所示；其DNA序列分别为SEQ ID No.：2、SEQ IDNo.：4以及SEQ ID No.：6所示。
图1显示了M.RCAg-1/Exp.V-1，M.RCAg-1/Exp.V-2和M.RCAg-1/Exp.V-3三种多表位蛋白的氨基酸序列比较示意图，其中M.RCAg-1/Exp.V-1是在N端融合有带有肠激酶酶切识别位点的43个载体氨基酸的多表位蛋白，M.RCAg-1/Exp.V-2是在N端融合有带有前切割蛋白酶(PreScission Protease)酶切识别位点的43个载体氨基酸的多表位蛋白，M.RCAg-1/Exp.V-3是没有融合载体氨基酸的多表位蛋白。从图中可看出M.RCAg-1/Exp.V-1与M.RCAg-1/Exp.V-2这两种蛋白总的氨基酸数目相同，但M.RCAg-1蛋白基因序列N端融合有43个氨基酸的载体肽段中具有不同的蛋白酶酶切识别位点，所以两者有8个氨基酸种类的差别，而M.RCAg-1/Exp.V-3蛋白不带有任何融合肽段，与前二者有43个氨基酸数量的差别。
当同一基因序列与不同的肽段融合表达后，其制备的重组蛋白诱导产生的免疫原性并无显著差异(p＞0.05)，但体外免疫保护性却有显著差异。M.RCAg-1/Exp.V-1与M.RCAg-1/Exp.V-2这两种蛋白总的氨基酸数目相同，因为目的序列之前具有不同的蛋白酶酶切位点，所以两者有8个氨基酸种类的差别，通过两者二级结构含量的比较，本发明人发现二者的二级结构差别迥异，而且蛋白免疫小鼠后诱导了不同类型的CD4+T细胞反应，M.RCAg-1/Exp.V-2诱导出以IL-4为主的Th2型细胞免疫反应，但M.RCAg-1/Exp.V-1却是诱发了以IFN-γ为主的Th1型细胞免疫反应。研究表明Th1型CD4+T细胞免疫在抵抗疟疾时具有重要的免疫保护作用，M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白免疫机体后产生以Th1为主的细胞反应类型，辅以适中的Th2反应类型，这种细胞免疫反应模式有利于抵抗红内期疟原虫的攻击，蛋白免疫机体后产生以Th2为主的细胞反应类型，这种细胞反应将更有利于抗体水平的提高，但降低的IFN-γ水平却直接导致了蛋白免疫血清抑虫效果的下降，这一点在体外GIA试验中得以证实。这表明，多表位蛋白分子的构象会受到某些特定氨基酸序列的影响，也即某些特定氨基酸影响了整个肽链的折叠。
从以上结果可知，目的序列克隆入pDS-ex表达载体后，43个氨基酸的载体序列在多表位蛋白表达时，影响了蛋白分子的折叠，这一结果提示：M.RCAg-1构建在不同的表达载体后，由于载体肽段或其中某些特殊氨基酸的影响，表达蛋白二级结构发生改变，影响了其折叠和构象，进而影响了蛋白的免疫效能，而这种影响有可能是正面的也可能是负面的。有研究表明具有相似的长度和氨基酸的序列在改变部分氨基酸后可折叠为不同的蛋白结构，而这一现象在其它蛋白的研究中也被多次证实。本发明的实验结果已经显示出，多表位蛋白的免疫原性与免疫保护性不仅与多表位间的组合排列方式有关，且受组装后肽链外融合肽段的影响，可能增强或抑制多表位蛋白的生物活性，构建多表位蛋白时，应该充分地考虑到影响蛋白折叠的因素，才能达到预期的目的。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些例子不应被理解为对本发明保护范围的限制。
以下实施例及试验例中所用的EcoR I、Bgl II、Nde I、碱性磷酸酶、T4DNA连接酶可购自TAKARA公司；大肠杆菌BL21(DE3)可购自NOVEGEN公司；油包水型佐剂MontnidelSA720、MontnidelSA51可购自法国SEPPIC公司；弗氏佐剂可购自sigma公司；BAL B/c小鼠、新西兰大白兔可购自北京天坛生物股份有限公司；羊血清、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体可购自北京中杉金桥生物技术有限公司；恶性疟原虫3D7株可购自美国The Malaria Research andReference Reagent Resource Center；FITC标记的羊抗兔IgG可购自BD公司；EZ-SepTM Mouse 1×淋巴细胞分离液、RPMI-1640培养基、IFN-γELISPOT和IL-4 ELISPOT培养板可购自广州达科为生物技术有限公司；PHA刺激剂可购自广州达科为生物技术有限公司；小量质粒抽提试剂盒可购自QIAGEN公司；E.coli BL21(DE3)可购自MERK公司；IPTG可购自invitorgen公司；正常人血细胞可购自北京红十字血液中心；DNA片段回收试剂盒可购自QIAGEN公司。SOC培养基可购自Amresco公司；RP-C培养液可购自美国ScienCell公司；Giemsa染液可购自德国AppliChem公司。
以下实施例及试验例中所用的BCA法测定多表位蛋白的浓度，使用的是The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Reagent试剂盒，购自Thermo Scientific Pierce公司。
实施例1构建VR1012-312质粒和pDS-ex质粒
按照中国专利申请No.200410080982.6中公开的方法，构建VR1012-312质粒和pDS-ex质粒。具体如下：
按照中国专利申请No.200410080982.6中公开的方法获得基因片段m.rcag-1(即中国专利申请No.200410080982.6中公开的ES312基因片段)，并将所得的基因片段m.rcag-1连接在pDS-ex质粒上(按照中国专利申请No.200410080982.6中公开的方法，将原核表达载体pET-30a(+)(得自Novagen公司)利用PCR技术将Not I和Eag I酶切位点替换为Bgl II，前移Kpn I，并去除EcoRV、Bgl II、Nsp V酶切位点，从而得到pDS-ex质粒)，其DNA序列如SEQ ID No.：10所示，其物理图谱为图7所示。
实施例2获得M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白
1.将实施例1得到的VR1012-312质粒和pDS-ex质粒分别进行EcoR I和BglII双酶切，从而使m.rcag-1连接入pDS-ex载体，从而构建得到重组质粒M.RCAg-1/pDS-ex。
具体步骤如下所示：
1)VR1012-312质粒和pDS-ex质粒的限制性内切酶酶切体系(以EcoR I和Bgl II为例)如下所示：
37℃下酶切2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，DNA片段回收试剂盒回收，从而得到基因片段m.rcag-1和pDS-ex质粒片段。
2)回收的基因片段m.rcag-1和pDS-ex质粒片段的去磷酸化
具体反应体系如下所示：
3)在回收的基因片段m.rcag-1和pDS-ex质粒片段的连接反应中，回收的pDS-ex质粒和基因片段m.rcag-1的摩尔比可以为1∶3-1∶10；
具体的连接反应体系如下所示：
16℃连接过夜，从而构建得到重组质粒M.RCAg-1/pDS-ex。M.RCAg-1/pDS-ex的DNA序列如SEQ ID No.：9所示。
2.将重组质粒M.RCAg-1/pDS-ex进行表达以及蛋白质纯化，从而得到M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白
具体步骤如下：
1)将重组质粒M.RCAg-1/pDS-ex转入感受态E.coli DH5α中
转化条件方法如下：将上述重组质粒加入至100μl的感受态细胞中，轻柔混匀，置冰上30min，42℃热休克90秒，冰上放置5min，加入SOC培养基0.8ml，放37℃恒温摇床，在200rpm/min下，振摇50min，然后在8000rpm下离心1分钟，弃上清，用50ml LB培养基悬浮菌体，在带有终浓度50ug/ml氨苄青霉素抗性(AP+)的LB培养基平皿上，均匀涂布以上菌液，37℃培养过夜。从培养平板上挑取5个单克隆菌落，分别接入加有氨苄青霉素的5ml LB培养管中250rpm，37℃振荡过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，再用EcoR I和BglII酶切，1％琼脂糖电泳鉴定，条带与插入基因片断的大小符合的质粒委托北京英俊公司测序，测序正确者用10％的甘油保种，并提取质粒备用。
2)表达工程菌构建
将测序正确的克隆菌抽提表达质粒M.RCAg-1/pDS-ex，转入感受态表达菌E.coli BL21(DE3)，涂Kanamycin+的LB平板，37℃培养过夜，挑取5个单克隆，接入5mlLB培养基在37℃，250rmp的摇床中培养5小时作为种子菌。用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，再用EcoRI和Bgl II酶切，1％琼脂糖电泳鉴定，条带与插入基因片断的大小符合的质粒委托北京英俊公司测序，测序正确者用10％的甘油保种，备用。另取5ml LB培养管中分别接种表达菌，37℃培养至OD为0.6左右时，加入终浓度1mM的IPTG(异丙基-p-D硫代半乳糖苷)，在37℃下诱导，继续培养4小时，待OD值分别达到1.0后，取出培养管，吸取200μl菌液，加入1.5ml EP管中，收集菌体，加入蛋白loadingbuffer 40μl混匀，煮沸5分钟，高速离心3分钟，加样进行SDS-PAGE蛋白电泳，利用Gel-pro4.5软件分析目的蛋白表达量。
2)蛋白质的纯化
之后用镍柱亲和层析纯化蛋白质，其中具体试验条件为：HisTrapHP，上样缓冲液(pH8.0)：50mmol/L NaH2PO4+0.5mmol/L NaCl+10mmol/L咪唑+0.1％Tween-20；洗脱缓冲液(pH 8.0)：50mmol/LNaH2PO4+0.5mmol/L NaCl+100mmol/L咪唑。
所得的蛋白质进一步用凝胶过滤层析柱(Hiload 16/60superdex75，缓冲液为50mmol/L PBS，pH7.2)纯化，再用超滤(10K超滤管，缓冲液为50mmol/L NaH2PO4+50mmol/L NaCl，pH 7.2)、阴离子交换层析(HiTrap Q Hp，上样缓冲液(pH7.2)：50mmol/L NaH2PO4+25mmol/L NaCl；洗脱缓冲液(pH7.2)：50mmol/L NaH2PO4+25mmol/LNaCl+1mol/L NaCl)和凝胶过滤(Hiload 16/60superdex 200，缓冲液为50mmol/L PBS，pH7.2)三步纯化，收集目的峰，进行SDS-PAGE分析，纯化蛋白BCA法定量后分装于-80℃保存，备用；
将纯化后的样品经非还原SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，可见单一条带，纯度可达到95％左右。
实施例3获得M.RCAg-1/Exp.V-2蛋白
1.构建得到重组质粒M.RCAg-1/pDS-ex
具体步骤可参见实施例2。
2.构建获得重组质粒M.RCAg-1/pDS-ex-PPase
具体步骤可以是：
以M.RCAg-1/pDS-ex序列为模板，设计引物，其中，上游引物和下游引物可由TAKARA公司合成，上游引物的序列为：
5’-CGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGA-3’(SEQ ID No.：11)；下游引物的序列为：
3’-CGTGTACCTGTCGGGTCTGGACCTTCAAGACAAGGTCCCCGG GTACCGTAC-5’(下划线部分为前切割蛋白酶识别序列)(SEQ ID No.：12)。
进行PCR反应，PCR具体反应条件为：94℃，30秒；65℃30秒；72℃，1分钟；30个循环，从而将M.RCAg-1/pDS-ex质粒中的肠激酶酶切识别位点(Enterokinase，DDDDK)更换为前切割蛋白酶酶切识别位点(PreScission Protease，LEVLFQGP，GACCTTCAAGACAAGGTCCCCGGG)，构建获得重组质粒M.RCAg-1/pDS-ex-PPase，由TAKARA公司测序鉴定。
3.将重组质粒M.RCAg-1/pDS-ex-PPase进行表达以及蛋白质纯化，从而得到M.RCAg-1/Exp.V-2蛋白
具体步骤可参见实施例2。
将纯化后的样品经非还原SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，可见单一条带，纯度可达到95％左右。
实施例4获得M.RCAg-1/Exp.V-3蛋白
1.通过Nde I和Bgl II双酶切将m.rcag-1基因片段克隆入pDS-ex载体
具体的双酶切步骤以及连接步骤可参见实施例2，唯一不同的是：将内切酶EcoR I替换为Nde I，从而获得不带有载体融合标签的M.RCAg-1/V-3重组质粒。
具体步骤如下所示：
1)VR1012-312质粒和pDS-ex质粒的限制性内切酶酶切体系：
37℃下酶切2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，DNA片段回收试剂盒回收，从而得到基因片段m.rcag-1和pDS-ex质粒片段。
2)回收的基因片段m.rcag-1和pDS-ex质粒片段的去磷酸化
具体反应体系如下所示：
3)在回收的基因片段m.rcag-1和pDS-ex质粒片段的连接反应中，回收的pDS-ex质粒和基因片段m.rcag-1的摩尔比可以为1∶5；
具体的连接反应体系如下所示：
16℃连接过夜，从而构建得到重组质粒M.RCAg-1/V-3。将不带有载体融合标签的M.RCAg-1/V-3重组质粒进行表达以及蛋白质纯化，从而得到M.RCAg-1/Exp.V-3蛋白。具体步骤可参见实施例2。
将纯化后的样品经非还原SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，可见单一条带，纯度可达到95％左右。
实施例5
将多表位蛋白进行稀释，具体的配伍方法可以是：采用BCA法分别测定多表位蛋白M.RCAg-1/Exp.V-1、M.RCAg-1/Exp.V-2和M.RCAg-1/Exp.V-3的浓度，以PBS分别稀释实施例2-4得到的蛋白原液到0.01-0.1mg/ml。
稀释后的蛋白溶液可分别按体积比3∶7与油包水型佐剂MontnidelSA720混合、按体积比5∶5与MontnidelSA51混合、按体积比1∶1与弗氏佐剂混合，用乳化振荡器冰上震荡中5分钟，以乳液滴入水中不散开为标准。所得蛋白溶液中的蛋白的浓度为0.01-0.1mg/ml。
此外，稀释后的蛋白溶液还可与浓度为13g/L的氢氧化铝佐剂按体积比1∶1混合，4℃摇床轻柔混匀过夜备用。所得蛋白溶液中的蛋白的浓度为0.01-0.1mg/ml。
试验例1
三种蛋白免疫BALB/c小鼠及新西兰白兔
以BCA法测定多表位蛋白浓度，以PBS分别稀释实施例2-4得到的蛋白原液到0.01-0.1mg/ml，将稀释好的蛋白溶液与浓度为0.01-0.1mg/ml的弗氏佐剂按体积比1∶1混合，用乳化振荡器冰上震荡中5分钟，以乳液滴入水中不散开为标准。
6-8周龄，雌性BAL B/c小鼠，随机分为4组(PBS对照组，M.RCAg-1/Exp.V-1、M.RCAg-1/Exp.V-2和M.RCAg-1/Exp.V-3组)，每组10只，各组小鼠免疫剂量为20μg/100μl/只，三次皮下多点注射免疫，间隔3周。每只小鼠于免疫后14天尾部动脉采血，第三次免疫后10天眼球放血。
12只新西兰大白兔，4月龄，体重2.6-3.0k g，随机分成4组，分别为三种蛋白与弗氏佐剂乳化免疫组及阴性对照组。上述三种蛋白抗原家兔免疫剂量为100ug/1ml/只，三次皮下多点注射免疫，间隔3周，全部新西兰大白兔第三次免疫后10天颈动脉采血，离心分离血清。
试验例2上述三种蛋白免疫的小鼠及新西兰白兔的血清特异抗体的检测
免疫后的小鼠和新西兰兔的血清针对11个表位特异性抗体水平分析
将上述三种蛋白稀释至10μg/ml，单表位合成肽(11种肽段由中国军事医学科学院合成)稀释至2μg/ml，分别包被96孔酶标板，100μl/孔，包被的酶标板经含有2％羊血清的PBS(pH 7.4)封闭后，用间接ELISA法检测免疫小鼠及兔血清中特异性IgG含量及单表位抗体滴度，并用上述血清做倍比系列稀释，37℃作用2h，加入1∶104稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃作用1h，以邻苯二胺显色，2mol/L硫酸终止反应，用酶标仪测定OD492值，P/N≥2.1判为阳性。
三种蛋白免疫及抗体评价结果：结果见表1。
表1
从小鼠免疫结果来看(参见表1)，三种蛋白的单表位抗体滴度水平有一定的差异，对于M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白而言，11个表位都能被很好的递呈，其中MSA-1、LSA-1、CSP表位呈递能力最好，产生抗体滴度最高达1∶4,096,000，针对Mag-1表位肽特异抗体滴度最低(1∶51,200)，而对于M.RCAg-1/Exp.V-2，3蛋白而言，并不是每个表位都能被很好的递呈，尤其是M.RCAg-1/Exp.V-2蛋白中只有少数表位能被高滴度识别，甚至个别表位，如MSA-2表位抗体水平只有1∶635。而对兔免疫结果，其中NKND表位的抗体水平最低，达1∶16,127，而MSP-1、CSP、AMA-1(E10)的抗体水平最高达1∶258032。而M.RCAg-1/Exp.V-2、3蛋白针对11个表位仅有个别表位可诱导高水平特异抗体滴度，MSA-2都以较低滴度识别(分别为1∶317和1∶504)，特别值得注意的是两个蛋白中的AMA-1(E9)和AMA-1(E10)两个表位识别滴度非常高，甚至达到1∶650,199。这与小鼠体内得到的推测结论是一致的。这说明M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白质比M.RCAg-1/Exp.V-2、3蛋白在弗氏佐剂辅助下能更有效呈递包含的11个表位肽，提示M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白质具有一定的优势构象。
试验例3间接免疫荧光分析(indirect immunofluorescence assay，IFA)
将恶性疟原虫3D7株红内期混合期细胞(感染率5％左右)均匀涂于载玻片上，室温风干。用100％丙酮固定10分钟。室温风干。加入不同稀释度的一抗血清(兔抗血清)，室温，37℃湿盒内30分钟，以正常兔血清作为阴性对照。用PBS冲洗3次，每次10分钟，风干。加入1∶200稀释的FITC标记的羊抗兔IgG，37℃，湿盒内30分钟。用PBS洗3次，每次10分钟，风干。立刻用荧光显微镜观察并拍照记录。
间接免疫荧光分析结果如下：
间接免疫荧光分析三种蛋白质免疫血清对恶性疟原虫天然蛋白质的识别
三种蛋白免疫动物血清均能识别恶性疟原虫天然蛋白质，数据表明(图5)IFA识别恶性疟原虫(P.falciparum)天然蛋白质滴度水平相近，最高滴度为(1∶1280)为M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白识别结果，与另两种蛋白(M.RCAg-1/Exp.V-2免疫血清最高滴度为1∶865，M.RCAg-1/Exp.V-3免疫血清最高滴度为1∶1225)相互比较没有差异(p＞0.05)。其中滴度为几何平均滴度。
试验例4细胞免疫检测方法-特异性T淋巴细胞分泌细胞因子检测
三次免疫后完成后10天将小鼠处死，无菌条件下取脾脏，用EZ-SepTM Mouse 1×淋巴细胞分离液分离脾淋巴细胞，用RPMI-1640培养基调整细胞浓度至1×106个细胞/ml，置于预包被的IFN-γELISPOT和IL-4ELISPOT培养板中，2×105个细胞/well，设复孔。试验孔分别加入上述三种蛋白抗原至15μg/ml，阳性对照孔加入PHA(植物血凝素)刺激剂，10μl/孔；二氧化碳孵箱培养36小时。后续步骤按达科为小鼠细胞因子IFN-γ与IL-4ELISPOT检测试剂盒说明书进行。
细胞免疫检测结果-分泌IFN-γ和IL-4特异性淋巴细胞克隆数目的分析：
采用ELISPOT方法检测分泌细胞因子的特异性淋巴细胞克隆数(图6)，用相应免疫原刺激时发现，对于M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白刺激分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数明显高于分泌IL-4的特异T细胞克隆数，对于M.RCAg-1/Exp.V-2刺激分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数明显低于分泌IL-4的特异淋巴细胞克隆数，而对于M.RCAg-1/Exp.V-3刺激分泌IFN-γ的特异性淋巴细胞克隆数虽然高于分泌IL-4的特异T细胞克隆数，但这种差异并不显著(p＞0.05)。
M.RCAg-1/Exp.V-2诱导出以IL-4为主的Th2型细胞免疫反应，但M.RCAg-1/Exp.V-1却是诱发了以IFN-γ为主的Th1型细胞免疫反应，有研究表明，Th1型CD4+T细胞免疫在抵抗疟疾时具有重要的免疫保护作用，M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白免疫机体后产生以Th1为主的细胞反应类型，辅以适中的Th2反应类型，这种细胞免疫反应模式有利于抵抗红内期疟原虫的攻击，蛋白免疫机体后产生以Th2为主的细胞反应类型，这种细胞反应将更有利于抗体水平的提高，但降低的IFN-γ水平却直接导致了蛋白免疫血清抑虫效果的下降，这一点在体外GIA试验中得以证实。
试验例5体外活性评价方法-免疫兔血清IgG对体外恶性疟原虫生长抑制实验
以山梨醇同步化的恶性疟原虫3D7虫株早期感染红细胞作为实验细胞；
用正常人血细胞和RP-C培养液调节感染红细胞至4％悬液，分装于96孔板内，120μl/孔(每孔血细胞含量最终为3-5％，最终起始感染率为0.1-1％)；分别加入过滤无菌含不同浓度纯化抗体，每个浓度3个复孔，每孔30μl(注意抗体体积不能超过总培养体积的20％)；37℃正常蜡烛缸中培养48小时后，涂片，用Giemsa染色，镜检，计数3000个细胞(FACS检测为104个细胞)。生长抑制率按下列公式计算：
生长抑制率＝(加免疫前IgG感染率-加免疫后IgG感染率)/加免疫前IgG感染率×100％。
体外活性评价结果：三种蛋白质免疫家兔后纯化多克隆IgG体外对恶性疟生长抑制实验比较
三种蛋白免疫组体外抑制率见表2，发现M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白免疫产生的IgG在浓度为2mg/ml时几乎能完全抑制体外恶性疟原虫生长，对3D7的抑制率为93.9％，而序列基本相同的M.RCAg-1/Exp.V-2蛋白在同等IgG浓度下，血清IgG体外抑虫效果不理想，只有原来的1/5甚至更低。不带有融合序列的M.RCAg-1/Exp.V-3蛋白产生的IgG在相同浓度下抑制率也只有54％左右。
表2不同构建的M.RCAg-1蛋白质免疫兔后纯化IgG对恶性疟原虫3D7株生长抑制实验
试验例6CD(圆二色谱)分析方法
用π*-180谱仪在0.1cm波长池中测量，谱宽是1.0nm，灵敏度是20mdeg，扫插速度是1nm/min，在N2吹扫30分钟后5次累加。样品在25℃测量，所用蛋白样品的浓度为0.2mg/ml，溶剂为磷酸盐缓冲液，先测量一个空白值，获得的CD谱扣除空白值是最后获得的谱图，CD数据处理采用CDPro软件包的CONTIN程序。
CD(圆二色谱)分析结果：不同载体融合肽多表位蛋白的圆二色性光谱分析结果
利用圆二色性光谱(CD)分析了M.RCAg-1在不同载体中表达获得的三种蛋白的二级结构特征(图3)。从光谱图结果来看，M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白与另几种蛋白相比具有较为典型的α-螺旋结构特征，而其它二种蛋白M.RCAg-1/Exp.V-2、V-3的结构相似，都具有无规卷曲典型特征。
另外，我们可以看到M.RCAg-1/Exp.V-1与M.RCAg-1/Exp.V-2这两种蛋白总的氨基酸数目相同，因为目的序列之前具有不同的蛋白酶酶切识别位点，所以两者有8个氨基酸在种类上的差别，通过广谱结果分析，我们发现二者在α螺旋、β-折叠组分上有很大差别，即二者二级结构差别迥异。
试验例7蛋白三级结构预测方法
通过美国华盛顿大学David Baker研究小组的ROSETTA网络服务器平台http://robetta.bakerlab.org/将序列在线提交，待预测完成后，下载相应的PDB文件，然后结合INSIGHT II软件进一步进行能量优化并获得蛋白结构预测模型，观察和分析使用软件PyMol 0.99。
三级结构预测结果
通过ROBETTA服务器预测，每种蛋白分子分别得到了5种结构，经过能量优化，选用能量最低的结构作为蛋白结构预测模型，其三级结构示意图如下(图4中A、B、C)，我们可以看出，三种蛋白构象类型并不相同，M.RCAg-1/Exp.V-1的结构要相对紧凑一些，而M.RCAg-1/Exp.V-2和M.RCAg-1/Exp.V-3蛋白的结构要疏松一些，结合圆二色谱的结果，从图中可观察到三者之间α螺旋、β-折叠及无规则卷曲有一定的差异。
另外，为了观察单个表位位置的变化，从组成多表位蛋白的11个表位中选择了一个B/Th和一个B表位，分别为E2和E3(其它表位结果未列出)，来观察三种预测结构中表位位置的变化情况，E2中的箭头所指浅色部分代表Th表位部分，其余深色部分代表B表位部分；E3中箭头所指整个深色区域代表整个B表位，从图4中可以看出，E2和E3在M.RCAg-1/Exp.V-1蛋白的分子表面，而在另外两个蛋白的分子内部，据此推测一些表位在蛋白分子中的位置有明显改变。
Claims (11)
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列从N端到C端依次含有SEQ ID No.:7所示的氨基酸序列和SEQ ID No.:5所示的氨基酸序列，其中，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.:1所示的氨基酸序列。
2.一种编码根据权利要求1所述的融合蛋白的DNA。
3.根据权利要求2所述的DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为SEQ ID No.:2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白在制备用于预防和/或治疗疟疾的药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述的药物为抗疟疾疫苗。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述的抗疟疾疫苗为抗红内期疟疾疫苗。
7.一种抗疟疾疫苗，该抗疟疾疫苗含有权利要求1所述的融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的抗疟疾疫苗，其中，所述抗疟疾疫苗还含有佐剂，所述佐剂为选自MontnidelSA720、MontnidelSA51、弗氏佐剂或氢氧化铝佐剂中的一种或几种。
9.根据权利要求7所述的抗疟疾疫苗，其中，所述融合蛋白的含量为10～100μg/ml。
10.根据权利要求8所述的抗疟疾疫苗，其中，所述佐剂的含量为10～100μg/ml。
11.根据权利要求7所述的抗疟疾疫苗，其中，所述的抗疟疾疫苗为抗红内期疟疾疫苗。
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