CN116693632A - 非洲猪瘟病毒抗原表位肽、单克隆抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽或其编码核酸、与非洲猪瘟病毒S273R蛋白抗原表位特异性结合的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物、检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。本发明提供的非洲猪瘟病毒S273R蛋白抗原表位为B细胞线性表位，最小抗原表位位于S273R蛋白第136‑140位氨基酸，为包含EELQY核心序列(如SEQ ID NO：3所示)的截短肽。本发明提供的单克隆抗体能够特异性识别并结合该抗原表位，特异性强、稳定性好，为研究S273R蛋白功能以及研发S273R新型疫苗和药物靶标奠定了基础。

Description

非洲猪瘟病毒抗原表位肽、单克隆抗体及其用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽或其编码核酸、与非洲猪瘟病毒S273R蛋白抗原表位特异性结合的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物、检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、出血性、烈性传染病。所有品种和年龄的猪均可感染，发病率和死亡率最高可达100％。非洲猪瘟(ASF)流行百年之久，尚无商品疫苗，给全球养殖业造成了严重的经济损失。ASFV复杂的结构给疫苗研发带来巨大挑战。ASFV基因组长度约为170-194kb，编码150-167个开放阅读框(ORF)，目前已知的有150多种编码蛋白，具有复杂的蛋白作用机制，这些蛋白不仅参与病毒装配，基因组转录复制和翻译、病毒感染入侵，还参与逃避宿主防御机制，并且多数蛋白功能尚不明确，这也为疫苗研发带来巨大挑战。
ASFV是一种由多层结构构成、且具有正二十面体形态的大型囊膜病毒。二十面体结构对称，由5个同心层形成，从内到外依次为内核、内核心壳、内膜、衣壳和囊膜。内核心壳是一层主要由多聚蛋白pp62和pp220组成的宽蛋白层。ASFV pS273R是一种SUMO-1半胱氨酸蛋白酶，存在于成熟病毒颗粒的核心，通过识别Gly-Gly-Xaa水解位点裂解催化pp220和pp62多蛋白前体成熟成为核壳蛋白，并产生p5、p14、p34、p37、p150(来源于pp220)和p8、p15、p35(来源于pp62)8种结构蛋白。这一过程是形成核壳所必需的，产生的结构蛋白也是病毒形态发生所必需的，同时，这一过程对于ASFV粒子的成熟和感染性也是必不可少的。
截止到目前为止，非洲猪瘟的预防或治愈尚没有有效的治疗方法，因此，开发一种抗病毒药物迫在眉睫。已有研究表明，S273R在病毒生命周期和复制中发挥着关键作用，是一个良好的靶点，将其用于新型疫苗和抗病毒药物的研发可能会具有良好的应用前景。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽，用于刺激、诱导机体产生B细胞介导的体液免疫应答，并产生效应分子(抗体)和效应细胞，从而发挥免疫效应，有效杀灭非洲猪瘟病毒。
同时，本发明还提供一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽或其编码核酸的用途。例如，在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用；或者，在制备检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。
其次，本发明还提供一种与非洲猪瘟病毒抗原表位(即S273R蛋白的B细胞线性表位)特异性结合的单克隆抗体，以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
最后，本发明还提供一种抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白单克隆抗体或杂交瘤细胞株的用途。例如，在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用；或者，在制备检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽，所述非洲猪瘟病毒抗原表位肽包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
本发明提供的非洲猪瘟病毒S273R蛋白抗原表位为B细胞线性表位，最小抗原表位位于非洲猪瘟病毒S273R蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码核酸的序列如SEQ IDNO：2所示)第136-140位氨基酸，具体为包含EELQY核心序列(如SEQ ID NO：3所示)的截短肽。
一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽的编码核酸。
具体的，所述非洲猪瘟病毒抗原表位肽的编码核酸为DNA或RNA。在不改变编码的氨基酸序列的前提下，可以根据密码子的偏好性进行修饰改造。
一种包含非洲猪瘟病毒抗原表位肽或其编码核酸的生物材料。
具体的，所述生物材料为重组表达载体(如质粒载体、病毒载体)、基因表达盒、重组菌、宿主细胞(如原核细胞、真核细胞)等。
一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽或其编码核酸、生物材料的用途。
作为本发明一种优选的实施方案，所述用途包括以下任一种或多种：
(1)在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用；
(2)在制备检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。
一种预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物，所述药物包含以下一种或多种：
(1)非洲猪瘟病毒抗原表位肽的氨基酸序列；
(2)非洲猪瘟病毒抗原表位肽的编码核酸；
(3)包含非洲猪瘟病毒抗原表位肽或其编码核酸的生物材料。
具体的，所述药物为预防和/或治疗性疫苗。所述疫苗可以为核酸疫苗，其中包含非洲猪瘟病毒抗原表位肽的编码核酸，如DNA疫苗、RNA疫苗。所述疫苗也可以为多肽疫苗、重组蛋白疫苗或合成长肽疫苗，其中包含非洲猪瘟病毒抗原表位肽的氨基酸序列。
作为本发明一种优选的实施方案，所述疫苗还可以包含免疫调节剂或佐剂，选自聚-ICLC(poly-ICLC)、1018ISS、Amplivax、MF59、AS03、AS04、AS15、BCG、CP-870、CP-893、CpG7909、CyaA、环二核苷酸(如STING)、dSLIM、GM-CSF、IL-2、IC30、IC31、Montanide ISATM(如Montanide ISA51)等中的一种或多种。
一种检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂，所述试剂为免疫检测和/或诊断试剂，试剂中包含非洲猪瘟病毒抗原表位肽的氨基酸序列，可用于检测猪体液中是否存在非洲猪瘟病毒感染后产生的抗体；或者，所述试剂为分子检测和/或诊断试剂，试剂中包含检测非洲猪瘟病毒抗原表位肽的编码核酸的引物、探针等，所述引物、探针根据非洲猪瘟病毒抗原表位肽的编码核酸的序列设计合成，可用于检测猪体液中是否存在非洲猪瘟病毒(即非洲猪瘟病毒的S273R蛋白)。
作为本发明一种优选的实施方案，所述试剂还可以包含药剂学上可接受的载体、辅料等。例如，对于免疫检测和/或诊断试剂，所述试剂还包含样本稀释液、酶标板、封闭液、洗涤液、底物、终止液、阴性对照、阳性对照等中的一种或多种；对于分子检测和/或诊断试剂，所述试剂中还包含聚合酶(依赖RNA和/或DNA的聚合酶)、扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照等中的一种或多种。
一种抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：C202336的杂交瘤细胞株ASFV-S273R-4A10(Hybridoma cell line ASFV-S273R-4A10)分泌产生。
具体的，所述单克隆抗体特异性识别并结合非洲猪瘟病毒S273R蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)，尤其是S273R蛋白的B细胞线性表位(最小抗原表位位于非洲猪瘟病毒S273R蛋白第136-140位氨基酸，其核心序列为EELQY，如SEQ ID NO：3所示)。
具体的，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG2b型，轻链恒定区为Kappa型。
一种用于制备抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C202336。
具体的，所述杂交瘤细胞株以非洲猪瘟病毒S273R蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)为免疫原制备得到。
一种抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株的用途。
作为本发明一种优选的实施方案，所述用途包括以下任一种或多种：
(1)在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用；
(2)在制备检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。
一种预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物，所述药物包含以下一种或多种：
(1)抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体的氨基酸序列；
(2)用于制备抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
作为本发明一种优选的实施方案，所述药物可以通过局部给药的方式施用，剂量为药物治疗学上可接受的剂量。所述药物的剂型为药剂学上可接受的剂型，可以包含药剂学上可接受的佐剂。
一种检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂，所述试剂为免疫检测和/或诊断试剂，包含以下一种或多种：
(1)抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体的氨基酸序列；
(2)用于制备抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
所述试剂可用于检测猪体液中是否存在非洲猪瘟病毒(或非洲猪瘟病毒的S273R蛋白)。
作为本发明一种优选的实施方案，所述试剂还可以包含药剂学上可接受的载体、辅料等，同上所述。
本发明的有益效果：
本发明根据NCBI发布的ASFV S273R蛋白(China/2018/AnhuiXCGQ，MK128995.1)的基因序列，筛选抗原表位序列进行优化设计，得到核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。用SEQ ID NO：2利用原核表达系统构建载体，再将纯化的S273R蛋白作为免疫原，通过免疫学方法免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。原核表达系统成本低、操作简单、表达量高，适合大规模生产。
本发明提供的单克隆抗体对于非洲猪瘟病毒(ASFV)S273R蛋白的特异性良好。采用Western Blot法检测发现，该单克隆抗体与非洲猪瘟病毒S273R蛋白能够发生特异性结合反应，而不与ASFV的另一种蛋白B125R反应，表明单克隆抗体的特异性较好，具有抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的特性。
本发明还对S273R蛋白的表位区域进行了分析，结果显示S273R蛋白大部分区域具有较好的抗原性。根据抗原表位分布情况，本发明首先将全长的S273R蛋白序列分为4段相互重叠的S273R蛋白序列S273R-1、S273R-2、S273R-3、S273R-4，将截短片段克隆至pET-32a载体，原核系统表达截短蛋白，利用Western Blot鉴定发现，单抗4A10与S273R-2反应。同上所述，再将S273R-2截短为5段即S273R-2-1、S273R-2-2、S273R-2-3、S273R-2-4和S273R-2-5，再次表达鉴定后，表位进一步缩小为S273R-2-5。再将S273R-2-5(115-145AA)截短为9段，WB鉴定发现单抗4A10与S273R-2-5-4、S273R-2-5-5和S273R-2-5-6反应，而这3段重叠136-143AA，说明单抗识别的表位位于第136-143位氨基酸。为了精确定位单克隆抗体识别的区域，构建136-143AA(S273R-2-5-10)截短体，并将136-143AA通过丙氨酸定点突变的方式逐步截短，用丙氨酸代替单个氨基酸。结果显示，mAb 4A10与S273R-2-5-10、13、14和15反应，重叠136-140AA，但当S273R-2-5-12即140AA突变为丙氨酸时不与Mab 4A10反应，结合上一步实验结果，表明136E和140Y是参与抗体识别的关键氨基酸位点，Mab 4A10识别的最小抗原表位位于第136-140位氨基酸，多肽序列为136EELQY140。
综上可知，本发明首次明确了S273R蛋白的一个线性B细胞表位，该单克隆抗体能够特异性地识别并结合S273R蛋白的136-140位特定的线性B细胞表位区域，该表位尚未报道，并且在不同毒株间高度保守，这也表明分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株可以识别大多数ASFV毒株。由于本发明提供的ASFV S273R抗体能够特异性识别该抗原表位，特异性强、稳定性好，因而为研究S273R蛋白功能以及研发S273R新型疫苗和药物靶标奠定了基础。
附图说明
图1为pET32a-S273R原核表达质粒的双酶切鉴定结果；
M：DNA分子质量标准；1：S273R目的基因对照；2：pET32a对照；3：pET32a-S273R双酶切产物。
图2为S273R蛋白原核表达后的SDS-PAGE结果图；
M：蛋白质分子量标准；1：未诱导菌对照；2：S273R蛋白表达；3：S273R蛋白表达上清；4：S273R蛋白表达沉淀。
图3为S273R纯化蛋白的SDS-PAGE结果图；
M：蛋白质分子量标准；1：S273R纯化蛋白。
图4为用鼠源His单抗鉴定纯化的S273R蛋白的结果图；
M：蛋白质分子量标准；1：S273R纯化蛋白。
图5为用ASFV阳性血清鉴定纯化的S273R蛋白的结果图；
M：蛋白质分子量标准；1：S273R纯化蛋白；2：空载体对照。
图6为S273R纯化蛋白免疫小鼠血清效价结果图。
图7为间接ELISA鉴定单克隆抗体4A10与S273R原核蛋白反应的结果图。
图8为单克隆抗体4A10的Western Blot鉴定结果图；
M：蛋白质分子量标准；1：真核5’Flag-B125R蛋白对照；2：真核5’Flag-S273R蛋白。
图9为IFA验证单克隆抗体识别真核S273R的结果图。
图10为单克隆抗体4A10的亚型鉴定结果图。
图11为截短的S273R蛋白的位置和长度示意图；
深灰色区域为4A10识别的区域；浅灰色的部分是未识别的部分；黑色区域是突变为丙氨酸的区域。
图12为截短蛋白SDS-PAGE结果图以及截短蛋白和单克隆抗体4A10反应性的Western Blot鉴定结果图。
图13为单克隆抗体抗原表位的保守性分析结果图。
图14为单克隆抗体抗原表位的蛋白空间结构定位图。
图15为核心表位的二级结构预测图。
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，以上对实验例中得到的附图进行简单地介绍。应当理解，上述附图仅示出了本发明的某些实验例，不应看作是对权利要求保护范围的任何限制。对于本领域的普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图得到其他相关的附图。
保藏信息
保藏名称：杂交瘤细胞株ASFV-S273R-4A10(Hybridoma cell line ASFV-S273R-4A10)。
保藏编号：CCTCC NO：C202336。
保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学。
保藏日期：2023年2月16日。
具体实施方式
下面将结合具体实施例和实验例对本发明的技术方案进行清楚完整的描述。但本领域技术人员应当理解，实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不应视为限制本发明的保护范围。基于下述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施方案，例如修改、变形或简单替换后得到的实施方案，均应属于本发明的保护范围。
下述实施例及实验例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的原料、试剂、仪器等如无特殊说明，均可通过商业途径获得；所涉名词、缩写均为本领域的常规含义，如PBS为磷酸盐缓冲液。
实施例1
本实施例提供了一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽及其编码核酸，所述非洲猪瘟病毒抗原表位肽包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
本实施例还提供一种包含非洲猪瘟病毒抗原表位肽的重组菌或宿主细胞。
本实施例还提供一种包含非洲猪瘟病毒抗原表位肽的编码核酸的重组表达载体(如质粒载体、病毒载体)或基因表达盒。
本实施例还提供一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽、重组菌或宿主细胞在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用。
本实施例还提供一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽的编码核酸、重组表达载体或基因表达盒在制备检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。
实施例2
本实施例提供了一种预防非洲猪瘟病毒感染的药物，所述药物为mRNA疫苗，所述疫苗包含药效量的、由脂质纳米颗粒(LNP)递送的mRNA，以及适量的佐剂等；所述mRNA经密码子优化且能编码非洲猪瘟病毒抗原表位肽的氨基酸序列(同实施例1)。
本实施例还提供一种治疗非洲猪瘟病毒感染的药物，所述药物为合成多肽疫苗，所述疫苗包含药效量的非洲猪瘟病毒抗原表位肽(同实施例1)，以及适量的佐剂等。
本实施例还提供一种检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂，所述试剂为酶联免疫检测试剂，试剂中包含非洲猪瘟病毒抗原表位肽的氨基酸序列，以及样本稀释液、酶标板、封闭液、洗涤液、底物、终止液、阴性对照、阳性对照等。该试剂主要用于检测猪体液中是否存在非洲猪瘟病毒感染后产生的抗体。
本实施例还提供一种检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂，所述试剂为分子诊断试剂，试剂中包含检测非洲猪瘟病毒抗原表位肽的编码核酸的引物、探针，以及聚合酶(依赖RNA和/或DNA的聚合酶)、扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照等。该试剂主要用于检测猪体液中是否存在非洲猪瘟病毒(即非洲猪瘟病毒的S273R蛋白)。
实施例3
本实施例提供了一种抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：C202336的杂交瘤细胞株ASFV-S273R-4A10(Hybridoma cell line ASFV-S273R-4A10)分泌产生。该单克隆抗体的重链恒定区为IgG2b型，轻链恒定区为Kappa型，能够特异性识别并结合非洲猪瘟病毒S273R蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)，尤其是S273R蛋白的B细胞线性表位(最小抗原表位位于非洲猪瘟病毒S273R蛋白第136-140位氨基酸，其核心序列为EELQY，如SEQ ID NO：3所示)。
本实施例还提供一种用于制备抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C202336。该杂交瘤细胞株以非洲猪瘟病毒S273R蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)为免疫原制备得到。
本实施例还提供一种抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体、杂交瘤细胞株在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用。
实施例4
本实施例提供了一种预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物，所述药物包含药效量的抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体(同实施例3)，以及适量的佐剂等。
本实施例还提供一种检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂，所述试剂为酶联免疫检测试剂，试剂中包含抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体的氨基酸序列，以及样本稀释液、酶标板、封闭液、洗涤液、底物、终止液、阴性对照、阳性对照等。该试剂主要用于检测猪体液中是否存在非洲猪瘟病毒(或非洲猪瘟病毒的S273R蛋白)。
在本发明的其他实施例中，预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物、检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂还可以制成其他的药物或试剂形式，均可采用本领域的常规手段。
实验例
一、抗原制备
ASFV S273R蛋白表达载体的构建及蛋白表达纯化、鉴定：
根据NCBI发布的ASFV S273R蛋白(China/2018/AnhuiXCGQ，MK128995.1)的基因序列，使用SnapGene设计针对ASFV S273R蛋白的引物(序列如SEQ ID NO：4-5所示)，在上下游引入EcoR I和Xho I酶切位点，将S273R序列经EcoR I和Xho I双酶切后插入到添加有6×His标签的pET32a载体中，转入到DH5α感受态细胞，挑取单克隆，接种于含Amp+的1mL LB培养基中，37℃、220rpm培养12h。经菌液PCR和双酶切鉴定后测序，将阳性重组质粒命名为pET32a-S273R。
S273R蛋白片段扩增引物：
上游引物S273R-F：5’-ATCGGATCCGAATTCATGTCTATATTAGAA-3’；
下游引物S273R-R：5’-GTGGTGGTGCTCGAGTGCGATGCGAAACAG-3’。
pET32a-S273R转化TSsetta(DE3)感受态细胞，经鉴定后，取3mL的菌种于含有Amp+抗性的300mL LB培养基中，37℃、220rpm培养3h，使OD600nm达到0.4-0.6，在无菌条件下，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG，调整诱导温度为25℃，继续培养8h。
4℃离心(12000rpm，5min)，弃上清收集菌体。用PBS重悬含有S273R目的蛋白的大肠杆菌菌泥。将重悬样品进行超声破碎，工作5s、停5s，功率为总功率的27％，时间为40min。4℃离心机中，12000rpm离心20min，分别收集诱导后上清和沉淀，沉淀用8mol/L尿素溶解。然后进行12.5％ SDS-PAGE电泳，电泳结束后，进行考马斯亮蓝染色、脱色后，观察出现条带后拍照分析蛋白表达情况。
利用Ni柱进行纯化，含有His标签的重组ASFV S273R蛋白可与Ni填料结合，将Ni填料混匀加入到层析柱中，然后加入破碎后8mol/L尿素溶解的菌体沉淀，使液体按照每3秒一滴的速度滴下。待上样结束后，用10mmol/L咪唑洗去杂蛋白，再用300mmol/L咪唑收集洗脱液。将收集的蛋白样品装入透析袋，使用含有6mol/L、4mol/L、3mol/L、2mol/L、1mol/L、0mol/L尿素的PBS溶液，按照尿素由高浓度到低浓度，在4℃冰箱的磁力搅拌器上进行梯度透析，每个梯度透析8h。透析完成后，测定蛋白浓度，分装并保存于-80℃。将S273R纯化蛋白经SDS-PAGE检测纯度，并用鼠源His单抗和ASFV阳性临床血清进行Western Blot鉴定。
pET32a-S273R原核表达质粒进行双酶切鉴定(图1)，条带大小符合预期，送公司测序结果正确，重组原核质粒构建成功。
S273R蛋白的最佳表达条件为：0.3mmol/L IPTG、25℃、220rpm条件下培养8h。与未诱导菌相比，S273R蛋白主要以包涵体形式表达，大小约为46kDa，符合预期(图2)。
经Ni柱亲和层析纯化后，得到了条带比较单一的S273R蛋白(图3)。
使用鼠源His单抗Western Blot鉴定纯化蛋白，纯化蛋白与His单抗结合良好，说明S273R蛋白获得表达和纯化(图4)。
使用ASFV阳性血清Western Blot鉴定纯化蛋白，反应良好，说明S273R蛋白具有良好的免疫原性(图5)。
二、单克隆抗体制备
动物免疫及抗体效价检测：
准备五只6-8周龄BALB/c雌鼠，随机分为两组，第1组免疫纯化后S273R原核表达蛋白，将抗原和佐剂按照1：1的比例乳化后进行免疫；第2组免疫PBS作为阴性对照。小鼠免疫流程如表1。
表1小鼠免疫流程
三免14天后尾静脉采血，通过间接ELISA方法对其血清进行效价检测。融合前3天对抗体效价较高的小鼠进行加强免疫。
间接ELISA试验方法步骤如下：
(1)包被：用0.05mol/L CB将纯化后的S273R蛋白稀释成2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL以确定其最佳包被浓度，每孔100μL加入96孔酶标板，4℃包被过夜或37℃包被3h。
(2)封闭：弃包被液，酶标板经PBST清洗2次后拍干，每孔150μL 1％ BSA(m/v＝g/mL)封闭液，37℃封闭2h。
(3)一抗：弃封闭液，酶标板拍干后加入一抗，将一抗阳性小鼠血清用PBS按照1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、1/12800、1/25600的比例进行稀释，空白对照孔加入PBS；阴性小鼠血清1/400稀释后加入阴性对照孔，每孔100μL，37℃孵育1h。
(4)二抗：弃一抗，PBST清洗4次，拍干，每孔加入100μL 1/5000稀释的HRP-山羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育50min。
(5)显色：弃二抗，PBST清洗4次，拍干，每孔加入100μL TMB显色液，避光显色10min。
(6)终止：每孔加入50μL 2mol/L H2SO4终止液，终止显色，酶标仪OD450nm读值。
细胞融合实验：
SP2/0细胞的培养：
从液氮罐取出SP2/0细胞，37℃水浴锅内快速融化，经无血清培养基清洗，1000rpm离心10min。弃上清，用RPMI-1640培养基重悬细胞转移至T25培养瓶中，在37℃、5％ CO2培养箱中培养。
饲养层细胞的制备：
取一只健康无免疫BALB/c雌性小鼠，脱颈致死，于75％酒精中浸泡消毒，将小鼠四肢固定在超净台中的解刨板上，剪开腹部皮肤，用注射器向小鼠腹腔注入HAT培养基，来回按压小鼠腹部，再抽出腹腔中的培养基，即为饲养层细胞悬液。
脾细胞的制备：
取一只S273R抗原加强免疫后的小鼠，脱颈致死，于75％酒精中浸泡消毒，将小鼠四肢固定在超净台中的解刨板上，无菌条件下剥离脾脏，经无血清培养基清洗后，在含有无血清DMEM的平皿中放置细胞筛，剪开脾脏，用注射器的活塞将脾脏经细胞筛研磨为单个细胞，再用细胞筛过滤单脾脏细胞悬液。
细胞融合：
(1)混合：SP2/0细胞悬液与过滤后的单脾脏细胞悬液混匀，1000rpm离心10min。
(2)融合：在手心轻轻转动离心管，使脾细胞和SP2/0细胞混合均匀，置于37℃水浴，拿出1mL预热的PEG 1420，以每秒1滴的速度滴加，边加边用吸管轻轻摇匀，静置90s，然后滴加无血清培养基终止融合，在接下来的1min、2min、5min后依次滴加1mL、2mL、5mL无血清培养基，速度由慢到快，10min内滴加30mL。1000rpm离心10min。
(3)重悬：弃上清，细胞团用含有饲养层细胞的HAT选择培养基重悬混匀，200μL每孔，铺至96孔细胞板。
(4)培养：37℃、5％ CO2培养箱中培养，5-7天后，细胞出现明显的细胞团时，半量换HT培养基，第10天再次半量换HT培养基，第二天使用间接ELISA方法检测细胞上清效价。
杂交瘤细胞的筛选：
以S273R蛋白作为包被抗原，利用间接ELISA法检测杂交瘤细胞上清筛选阳性杂交瘤细胞，对效价较高的细胞孔补液，次日复检。具体操作步骤同血清效价测定。
杂交瘤细胞的亚克隆：
使用有限稀释法对筛选后的杂交瘤细胞株进行亚克隆。用含有饲养层细胞的HT培养基稀释上述阳性杂交瘤细胞至约1个细胞/0.2mL，每孔200μL铺至96孔板。37℃、5％ CO2的培养箱中培养，5-6天后，利用间接ELISA法检测，选择单克隆阳性孔用同样的方法继续亚克隆，经过2-3次亚克隆，获得1株稳定分泌抗S273R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4A10。将阳性单克隆细胞株进行扩大培养并及时冻存。取一部分送至武汉大学中国典型培养物保藏中心进行专利程序的保藏，保藏名称为杂交瘤细胞株ASFV-S273R-4A10(Hybridoma cell line ASFV-S273R-4A10)，保藏编号为CCTCC NO：C202336。
单克隆抗体腹水的大量制备：
取10周龄BALB/c雌鼠，腹腔注射500μL/只无菌液体石蜡；一周后，收集扩大培养的阳性单细胞株4A10，1000rpm离心10min，弃上清，用无血清培养基重悬细胞，每只腹腔注射600μL；注射一周后，小鼠腹部显著隆起即可采集腹水。12000rpm离心5min，收集上清，细胞筛过滤，-80℃保存。
Western Blot检测单克隆抗体：
由于一般实验室无法操作ASFV活病毒，而真核表达蛋白在空间构象上更接近于天然蛋白，因此构建了真核表达S273R蛋白来代替病毒用于检测。将真核表达质粒5’Flag-S273R和5’Flag-B125R质粒转染HEK 293T细胞，24h后收样，用于Western Blot检测，结果如图8。
间接免疫荧光鉴定单克隆抗体：
(1)转染：将5’Flag-S273R质粒转染至HEK 293T细胞，置于37℃、5％ CO2培养箱，转染24h后，细胞密度约为40％-60％时进行IFA。
(2)固定：弃培养基，经PBS清洗1次后，用4％多聚甲醛固定细胞，800μL/孔，室温20min。
(3)通透：用0.1％ Triton X-100溶液通透细胞膜，800μL/孔，室温15min。
(4)封闭：用5％ BSA封闭，800μL/孔，室温1h。
(5)一抗：分别加入筛选的ASFV S273R的阳性单克隆抗体、鼠源Flag单抗，300μL/孔，37℃、1h，PBST清洗3次。
(6)二抗：加入FITC-山羊抗小鼠IgG抗体，300μL/孔，避光37℃、1h，PBST清洗3次。
(7)染核：滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)室温染色细胞核8min，弃去，ddH2O清洗3次。
(8)观察结果：荧光显微镜下观察染色细胞并拍照，蓝色荧光为核，绿色荧光为ASFV的S273R蛋白，结果如图9。
单克隆抗体亚型鉴定：
使用Proteintech公司的抗体亚型鉴定试剂盒，参照说明书进行亚型鉴定。
由图6可知，免疫S273R纯化蛋白的小鼠的血清效价均达到了1:25600，显著高于阴性组，选择了免疫效果最好的2号小鼠进行细胞融合。
间接ELISA法以S273R原核表达蛋白为抗原，检测阳性单克隆细胞分泌的单克隆抗体4A10，结果如图7所示，单克隆抗体4A10与S273R原核表达蛋白反应性良好。
由图8可知，在分子量约35kDa处出现特异性条带，与预期一致，其中单克隆抗体4A10与非洲猪瘟病毒S273R真核表达蛋白能够发生特异性结合反应，而不与ASFV的另一种真核表达蛋白B125R反应，这表明单克隆抗体4A10特异性较好，具有抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的特性。
由图9可知，单克隆抗体4A10可以与真核表达的S273R蛋白发生反应，产生特异性的绿色荧光，而阴性对照孔则无荧光信号，说明制备的单克隆抗体4A10可以特异性的识别并结合S273R蛋白。
由图10可知，单克隆抗体4A10重链恒定区为IgG2b型，轻链恒定区为Kappa型。
三、单克隆抗体抗原表位鉴定
为了确定单克隆抗体4A10识别的表位，使用DNAStar软件对S273R蛋白的氨基酸序列分析截短为4段即S273R-1(1-80AA)、S273R-2(70-150AA)、S273R-3(140-220AA)和S273R-4(210-273AA)，各个片段插入pET-32a载体中，构建的所有质粒均经测序鉴定。鉴定正确的阳性重组质粒转化擎科生物TSsetta(DE3)感受态细胞，原核表达截短蛋白，进行SDS-PAGE检测，4A10单克隆抗体作为一抗通过WB特异性反应鉴定表位，单抗4A10识别的表位区域是S273R-2(70-150AA)。同上所述，再将S273R-2(70-150AA)截短为5段即S273R-2-1(75-105AA)、S273R-2-2(85-115AA)、S273R-2-3(95-125AA)、S273R-2-4(105-135AA)和S273R-2-5(115-145AA)，再次表达鉴定后，表位进一步缩小为S273R-2-5(115-145AA)。再将S273R-2-5(115-145AA)截短为9段(图11)，WB鉴定发现单抗4A10与S273R-2-5-4(134-143AA)、S273R-2-5-5(135-144AA)和S273R-2-5-6(136-145AA)反应(图12D)，这3段重叠136-143AA，说明单抗识别的表位位于第136-143位氨基酸。
单克隆抗体抗原表位的精确鉴定：
为了精确定位单克隆抗体识别的区域，构建136-143AA(S273R-2-5-10)截短体，并且将136-143AA通过丙氨酸定点突变的方式逐步截短，用丙氨酸代替单个氨基酸(具体截短示意图如图11)。结果显示，Mab 4A10与S273R-2-5-10、13、14和15反应，重叠136-140AA，但当S273R-2-5-12即140AA突变为丙氨酸时不与Mab 4A10反应。结合上一步实验结果，表明136E和140Y是参与抗体识别的关键氨基酸位点，Mab 4A10识别的最小抗原表位位于第136-140位氨基酸，多肽序列为136EELQY140(如SEQ ID NO：3所示)。
图11为截短的S273R蛋白的位置和长度示意图。构建截短蛋白后，通过WesternBlot检测截短蛋白与单克隆抗体4A10的反应性(图12)。
单克隆抗体抗原表位的保守性分析：
为了分析单克隆抗体4A10识别表位在不同非洲猪瘟毒株中的保守性，将鉴定出的表位序列(NCBI登录号：MK128995.1)与17株国内外ASFV毒株的氨基酸序列进行比对。结果显示，在不同毒株间单克隆抗体4A10识别表位136EELQY140高度保守(图13)，能够识别大多数ASFV毒株。
单克隆抗体抗原表位的结构特性：
利用PyMOL软件模拟136EELQY140的空间结构分布。表位136-140AA如黑色区域显示结果，136EELQY140位于S273R蛋白的β-折叠上，并分布于S273R蛋白表面(图14)。DNAStar软件预测的结果表明，136EELQY140具有较高的抗原指数(图15)。
综上可知，本发明首次明确了ASFV S273R蛋白的一个线性B细胞表位，并且本发明提供的抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体能够特异性地识别并结合S273R蛋白的136-140位特定的线性B细胞表位区域，该表位截止目前尚未报道，并且在不同毒株间高度保守，这也表明本发明提供的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株可以识别大多数ASFV毒株，这都为研究S273R蛋白功能以及研发S273R新型疫苗和药物靶标奠定了基础。
虽然上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验例对本发明的技术方案做了详尽的描述，但需要说明的是，实施例和实验例仅用于说明本发明的技术方案和技术效果，而不应视为对本发明保护范围的任何限制。基于本发明技术构思所做的简单变形、修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒抗原表位肽，其特征在于：所述非洲猪瘟病毒抗原表位肽包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
2.一种如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒抗原表位肽的编码核酸。
3.一种包含如权利要求1所述的抗原表位肽、或者如权利要求2所述的编码核酸的生物材料。
4.一种如权利要求1所述的抗原表位肽、或者如权利要求2所述的编码核酸、或者如权利要求3所述的生物材料的用途，其特征在于：所述用途包括以下任一种或多种：
(1)在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用；
(2)在制备检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。
5.一种预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物、或者检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂，其特征在于：所述药物或试剂包含以下一种或多种：
(1)如权利要求1所述的抗原表位肽的氨基酸序列；
(2)如权利要求2所述的编码核酸的序列；
(3)如权利要求3所述的生物材料；
(4)根据权利要求2所述的编码核酸的序列设计合成的引物和/或探针。
6.一种抗非洲猪瘟病毒S273R蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体由保藏在中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：C202336的杂交瘤细胞株ASFV-S273R-4A10(Hybridoma cell line ASFV-S273R-4A10)分泌产生，所述单克隆抗体特异性识别并结合如权利要求1所述的抗原表位肽。
7.一种用于制备如权利要求6所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C202336，保藏在中国典型培养物保藏中心。
8.一种如权利要求6所述的单克隆抗体、或者如权利要求7所述的杂交瘤细胞株的用途，其特征在于：所述用途包括以下任一种或多种：
(1)在制备预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物中的应用；
(2)在制备检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂中的应用。
9.一种预防和/或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物，其特征在于：所述药物包含以下一种或多种：
(1)如权利要求6所述的单克隆抗体的氨基酸序列；
(2)如权利要求7所述的杂交瘤细胞株。
10.一种检测和/或诊断非洲猪瘟病毒感染的试剂，其特征在于：所述试剂为免疫检测和/或诊断试剂，包含以下一种或多种：
(1)如权利要求6所述的单克隆抗体的氨基酸序列；
(2)如权利要求7所述的杂交瘤细胞株。
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