CN112979766B - SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白及其亚单位疫苗 - Google Patents

SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白及其亚单位疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种SARS‑ConV‑2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白及其亚单位疫苗，编码所述重组蛋白的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14所示中的一条；所述新型冠状病毒亚单位疫苗包含所述的重组蛋白以及药学上接受的佐剂。本发明对S蛋白膜外结构域表面抗原决定簇进行筛选，找到能够刺激细胞产生强免疫反应的Sn1‑Sn7肽段基因序列，进行密码子优化后克隆到含有白喉毒素T结构的质粒载体上，分泌表达和纯化，获得的重组蛋白经实验验证可诱导特异性细胞反应，安全高效，具有良好的开发和应用前景。

Description

SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白及 其亚单位疫苗
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白及其亚单位疫苗。
背景技术
SARA-Cov-2属于冠状病毒科β-冠状病毒属，与严重急性呼吸综合征(severeacute respiratory syndrome，SARS)冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MiddleEast respiratory syndrome，MERS)冠状病毒(MERS-CoV)为同一属。SARA-Cov-2为正链单链 RNA病毒，基因组为29.9kd，对RNA病毒来说，基因组较大，共编码9860个氨基酸。基因组包括5’端的帽状结构和3’的Ploy A尾巴，编码16个非结构蛋白的复制酶基因靠近5’端，约占整个基因组的2/3，其余1/3基因组编码4种结构蛋白。将已知的多种冠状病毒的基因组进行序列比对，发现在全基因组水平上同源性为54％，结构蛋白和非结构蛋白的编码基因同源性分别为58％和43％，这表明结构蛋白更加多样化。冠状病毒的S蛋白是病毒体外壳上的I类病毒融合蛋白，通过识别宿主细胞表面受体并介导病毒与细胞膜融合，在病毒感染中发挥重要作用。S蛋白含有S1和S2两个亚基，研究发现SARS-Cov-2与SARS-Cov病毒表面的S蛋白S1亚基具有较高的同源性，主要体现在SARS-Cov-2的受体结合域(receptor bindingdomain，RBD)拥有与SARS-Cov几乎相同的三维空间结构，这表明两种病毒结合的受体相同，即都是通过ACE2受体感染支气管上皮细胞和肺上皮细胞。基于S蛋白在SARS-Cov-2病毒在感染中的关键作用，其可以成为治疗药物设计的靶点。
mRNA疫苗虽然研发很快，避免了体外繁琐的病毒培养或重组蛋白表达的过程，只需进行特定mRNA序列的合成，再利用脂质体包埋后注射到人体肌肉组织，mRNA进入组织细胞后表达出病原蛋白引发人体免疫应急反应，但mRNA 疫苗因各种问题造成没有一株疫苗通过临床实验。例如：有的人对外源性RNA很敏感，还没表达就降解了；有的人又不敏感，能长期表达，结果造成抗原耐受，产生不了抗体；还有人因病原性抗原的细胞内表达，通过与细胞内蛋白的相互作用产生强烈的毒副作用等。在临床研究中这些严重的副反应，不仅位于注射部位的副反应，还包括全身的副反应。研究认为mRNA疫苗在体内持续表达产生抗原蛋白，可能打破机体本身的免疫平衡，引发免疫耐受。除了潜在的副作用，一些临床研究结果还证明mRNA疫苗在人体中的药效比动物体内低的多，表明还需要进一步研究动物与人对mRNA疫苗的应答差异，到底人体中哪条免疫通路最为有效？是否可以通过改变疫苗的免疫刺激表达来改善药效？这些都是需要解决的问题，mRNA疫苗还有很长的路要走。
而与mRNA疫苗相比，重组蛋白亚单位疫苗在某些方面也具有一定的优势。首先，所需设备简单，易于大规模生产，且避开了对毒株的灭活或减毒等步骤，安全性高；其次，重组蛋白疫苗属于主动免疫，具有长效预防作用，是对治疗型mRNA疫苗的一种绝好补充；另外，重组蛋白疫苗不存在像mRNA疫苗类似的在体内持续表达的问题，不会造成免疫耐受；而且，与mRNA疫苗相比，重组蛋白疫苗的保质期更长，更利于战略性储备；最后，重组蛋白亚单位疫苗仅有几种主要表面蛋白质，避免产生许多无关抗原诱发的抗体，从而减少疫苗的副反应和疫苗引起的相关疾病。
随着生物技术的发展，重组蛋白疫苗也进入了精准时代。重组蛋白疫苗最重要的精髓在于所要重组的蛋白能准确高效的引发对外源性细菌或病毒的免疫应急反应，因此，用作疫苗的抗原的选择则至关重要。我们更希望重组蛋白疫苗仅在体内诱导产生针对致病菌或病毒表面抗原的抗体，这样我们的免疫系统才可以少走弯路，高效准确地清除这些致病菌或病毒。因此我们需要选择致病菌或病毒粒子最外层的包膜蛋白或衣壳蛋白作为免疫原。而这些蛋白往往是膜蛋白，因此我们还需要去除这些蛋白的膜内部分，甚至为了更准确更高效的产生针对性抗体，直接提取这些蛋白膜外部分的抗原决定簇作为免疫原，而在这些抗原决定簇中还要剔除掉蛋白分子结构内部的抗原决定簇，只保留蛋白分子表面的抗原决定簇。
多靶位重组蛋白疫苗因采用的是多个特殊抗原决定簇序列的融合表达，并非完整的病原体蛋白，因此不会产生急剧的毒副作用，具有很高的安全性。并且，多靶位重组蛋白疫苗的抗原决定簇的选取应尽量选取Th靶位序列，能有效激活人体的杀伤性T细胞，进一步杀死病原体。而且，多靶位重组蛋白疫苗是模式疫苗，疫苗的结构模式稳定一致，由免疫强激活区和抗原决定簇区组成，可免临床。最后，作为模式疫苗，多靶位重组蛋白疫苗易于标准化生产，建立小规模生产的标准厂房。
重组蛋白疫苗生产技术成熟，已经在医学和兽药领域取得了许多显著的成果，例如人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗、抗肿瘤重组蛋白疫苗、猪带绦虫重组疫苗等均已上市。随着我们项目的开展和研究的深入，2019-nCoV病毒和SARS病毒双效多靶位重组蛋白疫苗的研究定会取得成功。
因此，亟需开发一种新的有效的针对新型冠状病毒的疫苗。
发明内容
为了解决所述技术问题，本发明提供了一种SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白和亚单位疫苗，所述重组蛋白可诱导特异性细胞反应，适用于制备新型基因工程重组蛋白疫苗，安全高效，具有良好的开发和应用前景。
在本发明的第一方面，提供了一种SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白，编码所述重组蛋白的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：14所示中的一条。
在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14所示中的一条。
在本发明的第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体能够表达所述的 SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白，所述重组表达载体含有所述的核酸分子。
进一步地，所述重组表达载体包括表达质粒载体、噬菌体载体和病毒载体中的一种。
进一步地，所述表达质粒载体的表达区的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：8、SEQ IDNO： 9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14所示中的一条。
进一步地，所述表达质粒载体包括pET28a-DTT-Sn1、pET28a-DTT-Sn2、 pET28a-DTT-Sn4和pET28a-DTT-Sn7中的至少一种。
在本发明的第四方面，提供了一种工程菌或者工程化细胞，所述工程菌或者工程化细胞包含任一所述的重组表达载体。
在本发明的第五方面，提供了一种SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白的制备方法，所述方法包括：
获得SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域的抗原决定簇Sn1、Sn2、Sn4和Sn7，所述Sn1、Sn2、Sn4和Sn7的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO： 4和SEQID NO：7所示；
构建并获得所述Sn1、Sn2、Sn4和Sn7的表达质粒，其中，所述Sn1、Sn2、Sn4和Sn7 表达质粒的表达区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11 和SEQ IDNO：14所示；
将所述Sn1、Sn2、Sn4和Sn7的表达质粒分别进行分泌表达和纯化，获得纯化的重组SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白。
在本发明的第六方面，提供了一种新型冠状病毒亚单位疫苗，所述新型冠状病毒亚单位疫苗包含所述的重组蛋白以及药学上接受的佐剂。
进一步，所述佐剂包括氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、MPL TM、IL-12、氢氧化铝联合CpG ODN复合佐剂、ISA51VG、ISA720VG、MF59、QS21、AS03佐剂中的至少一种。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的抗SARS-COV-2病毒S蛋白RBD结构域的纳米抗体；
本发明提供的SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白、重组表达载体、工程菌或者工程化细胞和亚单位疫苗，本发明方法利用SARS-Cov-2和SARS-Cov 病毒S蛋白的同源性，对S蛋白膜外结构域表面抗原决定簇进行筛选，找到能够刺激细胞产生强免疫反应的序列，具体为Sn1、Sn2、Sn4和Sn7肽段基因序列，为了进一步提高ADn 的免疫应激能力，密码子优化后克隆到含有白喉毒素T结构的质粒载体上，分泌表达和纯化，获得纯化的重组SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白，经实验验证表明该重组蛋白可诱导特异性细胞反应，该方法适用于制备新型基因工程重组蛋白疫苗，安全高效，具有良好的开发和应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为SARA-Cov-2病毒S蛋白三维模型。A为SARA-Cov-2病毒和SARS-Cov病毒S 蛋白的氨基酸对比；B为SARA-Cov-2病毒3个S蛋白构成的棘突的三维结构模型；C为 SARA-Cov-2病毒S蛋白三维结构模型；
图2为SARA-Cov-2病毒S蛋白膜外N端结构域在Domain I/II上潜在的抗原决定簇(按打分由高到低排列)；
图3为pET28a-DTT-Sn1、pET28a-DTT-Sn2、pET28a-DTT-Sn3、pET28a-DTT-Sn4、pET28a-DTT-Sn5、pET28a-DTT-Sn6、pET28a-DTT-Sn7重组蛋白质粒设计示意图；
图4为15％SDS-PAGE分析DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn3、DTT-Sn4、DTT-Sn5、 DTT-Sn6、DTT-Sn7蛋白纯化；
图5为抗血清反应；NC1为negative control 1:ELISA实验中使用牛血清白蛋白做二抗， NC2为negative control 2：ELISA实验中使用DTT-2Sc中和的微粒做二抗；
图6为DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn3、DTT-Sn4、DTT-Sn5、DTT-Sn6、DTT-Sn7疫苗激发的细胞反应检测；将小鼠第三次免疫后7天，用DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn3、 DTT-Sn4、DTT-Sn5、DTT-Sn6、DTT-Sn7刺激脾脏细胞，通过CCK8试剂盒检测细胞增殖；
图7为DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn3、DTT-Sn4、DTT-Sn5、DTT-Sn6、DTT-Sn7疫苗激发的细胞反应检测；将小鼠第三次免疫后7天，用DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn3、 DTT-Sn4、DTT-Sn5、DTT-Sn6、DTT-Sn7刺激脾脏细胞，加入一定比例的效应细胞共培养，通过LDH细胞毒性检测试剂盒检测细胞增殖。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供一种SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白，编码所述重组蛋白的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14所示中的一条。
本发明方法通过构建SARS-ConV-2病毒S蛋白的三维结构模型，对单个S蛋白进行解析，确定其膜外结构域为抗体和疫苗研发的靶标位点。SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域抗原决定簇分析得出SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域的抗原决定簇Sn1、 Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、Sn6、Sn7，所述Sn1、Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、Sn6、Sn7的核苷酸序列分别如SEQ IDNO：1-SEQ ID NO：7所示；
为了进一步提高ADn的免疫应激能力，我们还将在ADn的N末端偶联上白喉毒素T结构域(DTT)。DTT具有很强地激活人体免疫应激反应的能力，且表面本身具有很多激活人体CD4和CD8 T细胞的抗原决定簇，能有效激活人体的杀伤性T细胞对病毒的清除作用。具体地，合成Sn1、Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、Sn6、Sn7的肽段基因序列(Sn1、Sn2、Sn3、 Sn4、Sn5、Sn6、Sn7的核苷酸序列分别如如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：7所示)，克隆到含有白喉毒素T结构的pET-28a质粒载体上，为了方便串联多肽的可溶性表达，需要将编码抗原肽段的核酸序列进行密码子优化，便于在大肠杆菌中表达，优化后构建的质粒命名为pET28a-DTT-Sn1、pET28a-DTT-Sn2、pET28a-DTT-Sn3、pET28a-DTT-Sn4、 pET28a-DTT-Sn5、pET28a-DTT-Sn6、pET28a-DTT-Sn7七个质粒，DTT为白喉毒素T结构域，在DTT和Sn1、Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、Sn6、Sn7之间加入无免疫原性GS Linker：核苷酸序列为GGTGGTGGTGGTAGTGGTGGTGGTGGTAGT-3’。所述Sn1、Sn2、Sn3、Sn4、 Sn5、Sn6、Sn7表达质粒的表达区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：14所示；
将所述质粒进行分泌表达和纯化，获得纯化的重组SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白。
通过疫苗效力评价实验发现，DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn4、DTT-Sn7疫苗可诱导特异性细胞反应。
综上可知，本发明在充分分析冠状病毒S蛋白膜外结构域和重组蛋白疫苗最新研究成果基础上，通过开展蛋白表达、诱导动物免疫，建立了一种新型SARS-Cov-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组疫苗的制备方法，该方法适用于制备新型基因工程重组蛋白疫苗，安全高效，具有良好的开发和应用前景。
根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供一种核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14所示中的一条。含有所述核酸分子的生物材料也在本发明的保护范围之内，所述生物材料包括重组DNA、质粒载体、噬菌体载体和病毒载体中的一种。
根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体能够表达所述的SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白，所述重组表达载体含有所述的核酸分子。所述重组表达载体包括表达质粒载体、噬菌体载体和病毒载体中的一种。本发明实施例中，所述表达质粒载体的表达区的核苷酸序列选自如SEQID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14所示中的一条。所述表达质粒载体包括pET28a-DTT-Sn1、pET28a-DTT-Sn2、pET28a-DTT-Sn4和pET28a-DTT-Sn7中的至少一种。
根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供一种工程菌或者工程化细胞，所述工程菌或者工程化细胞包含所述的重组表达载体。所述工程菌或者工程化细胞可选用悬浮细胞，包括CHO系列和293、293FT等人用疫苗哺乳动物细胞株都在本发明的保护范围之内。
根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供一种SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N 端结构域高靶向性重组蛋白的制备方法，所述方法包括：
获得SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域的抗原决定簇Sn1、Sn2、Sn4和Sn7，所述Sn1、Sn2、Sn4和Sn7的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO： 4和SEQID NO：7所示；
构建并获得所述Sn1、Sn2、Sn4和Sn7的表达质粒，其中，所述Sn1、Sn2、Sn4和Sn7 表达质粒的表达区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11 和SEQ IDNO：14所示；
将所述Sn1、Sn2、Sn4和Sn7的表达质粒分别进行分泌表达和纯化，获得纯化的重组SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白。
根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供一种新型冠状病毒亚单位疫苗，所述新型冠状病毒亚单位疫苗包含所述的重组蛋白以及药学上接受的佐剂。
所述佐剂包括氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、MPL TM、IL-12、氢氧化铝联合CpG ODN复合佐剂、ISA51VG、ISA720VG、MF59、QS21、AS03佐剂中的至少一种。在其他实施方式中，所述佐剂也可选用其他形式的佐剂。
所述新型冠状病毒亚单位疫苗可以制备成滴鼻剂、喷雾剂和肌肉注射剂。
本发明应用所述亚单位疫苗，免疫小鼠后结果显示DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn4、DTT-Sn7疫苗可诱导特异性细胞反应。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的效果进行详细说明。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等书中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 SARS-Cov-2病毒S蛋白N端膜外结构域抗原决定簇的分析和设计
1.构建SARA-Cov-2病毒S蛋白三维模型
从美国国家生物信息技术中心数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索SARA-Cov-2 和SARS-Cov两种冠状病毒S蛋白的氨基酸序列，在GenBank中的检索号分别为QHD43416 和P59594。通过Clustal软件对SARS-Cov-2和SARS-Cov S蛋白的氨基酸序列进行对比，它们的氨基酸一致性为76％，具有较高的同源性。两个病毒的S蛋白的高同源序列主要集中在中部到C末端。进一步构建2019-nCoV病毒S蛋白的三维结构模型。2019-nCoV病毒通过3个S蛋白的聚合构成了病毒粒子包膜表面的刺突结构。进一步对单个S蛋白结构进行解析可以发现，S蛋白的Domain I和Domain II是刺突结构的膜外部分，而Domain III 则是膜内部分，因此Domain I和Domain II是抗体和疫苗研发的靶标位点。(图1A、B)
进一步解析2019-nCoV病毒S蛋白Domain I和Domain II的抗原决定簇。我们预测出 24个潜在的抗原决定簇，而其中第2、3、5、6、9、11、14、15、18、20、21、23和24号肽段、共13个肽段均位于Domain I或II的分子表面，是潜在的抗体识别位点。将这些抗原识别位点进一步和SARS的S蛋白的序列相比对，发现3、11、14、21和23号肽段、共 5个肽段与SARS的S蛋白具有很高的同源性，因此，这5个肽段是2019-nCoV病毒和SARS 病毒免疫型检测试剂和疫苗研发的关键抗原决定簇位点(图2)。
2.设计SARS-Cov-2 S蛋白N端结构域抗原决定簇
进一步解析S蛋白N端结构域的抗原决定簇。我们预测出14个潜在的抗原决定簇，而其中第3、7、8、11、14号肽段均位于蛋白质结构内部，无法形成有力的结合位点，不予考虑。其中4号肽段则位于N末端蛋白结构底部，靠近膜结合位点，可以作为候选抗原靶点，但需要进一步的验证。而1、2、5、9、10、12、13号肽段均位于N端分子表面，其中， 1号肽段位于N末端结构的头部，属于loop结构，命名为Sn1；2号肽段也位于N末端结构的头部，结构为两个β片层通过一个loop连接，位于表面凹穴内，命名为Sn2；10号肽段位于分子表面，属于N端结构域的头部，命名为Sn3；12号肽段位于分子表面，属于N 端结构域的侧面，将其重新定位为第20-29个氨基酸，命名为Sn4；第13号肽段位于分子表面，但是其受到一个肽段的空间阻碍，不利于分子间的结合，但可以尝试将其作为候选抗原决定簇靶点，命名为Sn5；第5号肽段位于N端结构域的头部，但其序列的高活性的N 末端位于分子内部，将其重新定位为第66-80个氨基酸，命名为Sn6；第9号肽段虽然位于分子内部，但其肽段的C末端位于分子表面，将其重新设计为第244-258个氨基酸，命名为Sn7。这7个肽段分别作为S蛋白膜外N末端抗原决定簇的分子靶点。同时为进一步提高靶点的免疫应激能力，将抗原肽段靶点的N末端与白喉毒素T结构(DTT)进行连接，白喉毒素T结构本身已经应用于疫苗的绳厂，具有很强地激活人体免疫应激反应的能力，且白喉毒素结构表面本身具有很多激活人体CD+4和CD+8T细胞的抗原决定簇，能有效激活人体的杀伤性T细胞对病毒的清除作用(图2)。
3.含SARS-Cov-2 S蛋白N端抗原肽段基因表达质粒pET-28a-DTT构建
合成步骤2分析的Sn1、Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、Sn6、Sn7肽段基因序列，克隆到含有白喉毒素T结构的pET-28a质粒载体上，其基因序列分别是：
(1)Sn1，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
(2)Sn2，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(3)Sn3，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(4)Sn4，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(5)Sn5，核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
(6)Sn6，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
(7)Sn7，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
构建pET28a-DTT-Sn1、pET28a-DTT-Sn2、pET28a-DTT-Sn3、pET28a-DTT-Sn4、pET28a-DTT-Sn5、pET28a-DTT-Sn6、pET28a-DTT-Sn7七个质粒，DTT为白喉毒素T结构域，在DTT和Sn1、Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、Sn6、Sn7之间加入无免疫原性GS Linker。为了方便串联多肽的可溶性表达，需要将编码抗原肽段的核酸序列进行密码子优化，便于在大肠杆菌中表达。(图3)
所述pET28a-DTT-Sn1、pET28a-DTT-Sn2、pET28a-DTT-Sn3、pET28a-DTT-Sn4、pET28a-DTT-Sn5、pET28a-DTT-Sn6、pET28a-DTT-Sn7质粒构建的具体步骤为：
pET28a载体利用限制性内切酶Nde I以及BamH I(Thermo Fisher)酶切，DTT基因则用Nde I以及BamH I(Thermo Fisher)酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳分别回收已经酶切好的载体以及DTT基因，再利用T4连接酶(New England Biolabs)链接，随后转化进感受态DH5，挑单克隆并鉴定正确的克隆，获得pET28a-DTT载体；
将所述pET28a-DTT载体利用限制性内切酶BamH I以及HindIII(Thermo Fisher)酶切，
分别将Sn1、Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、Sn6、Sn7基因(含GS Linker)则用BamH I以及HindIII(Thermo Fisher)酶切，然后通过琼脂糖凝胶电泳分别回收已经酶切好的载体以及Sn1-Sn7基因，再利用T4连接酶(New England Biolabs)链接，随后转化进感受态DH5，挑单克隆并鉴定正确的克隆，即得到所述7个表达质粒。所述Sn1、Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、 Sn6和Sn7表达质粒的表达区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。
实施例2 S蛋白N端相关抗原决定肽段的表达和纯化
1.Sn1、Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、Sn6、Sn7的表达
将构建好的质粒分别转化到BL21(DE3)表达感受态细胞中，在含有卡那抗性的LB平板进行涂布，放入37℃培养箱，过夜培养，长出单克隆。分别挑选4个单克隆，在5ml 卡那抗性的LB培养基中，200rpm，37℃，培养5h。当OD600达到0.6～0.8时，取出500μL 放入新的1.5mL EP管中标记为诱导前。剩余菌液加入IPTG(终浓度1mM)诱导，标记为诱导前的样品和诱导后的样品均置于37℃，培养4h。诱导前后的菌液各吸出200μL， 12000rpm，离心5min。去除上清液，加入50μL的PBS重悬，加入2*loading buffer混匀，置于沸水中煮样10min。进行15％SDS-PAGE电泳分析。
分别挑选两个高表达的阳性克隆，接种于100mL含卡那抗生素的LB培养基中，180rpm， 37℃过夜培养。第二天将100mL菌液接种于2L的LB培养基中，调整温度为30℃，扩大培养。当培养至OD600为0.6～0.8时，加入0.4mL 500mmol/L的IPTG，将温度调整为16℃，160rpm培养过夜。
将菌液倒入清洗后的1mL离心管中，配平，5000rpm，离心20min，弃上清，收集菌体至50mL离心管。分别加入30mL Buffer A(25mM Tris,500mM NaCl,10％(v/v)Glycerol, pH7.5)重悬菌体，5000rpm，离心15min，弃上清，再加入50mL Buffer A重悬菌体，将重悬后的菌液放入-80℃，过夜。
2.Sn1、Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、Sn6、Sn7蛋白的纯化
1)分别将收集的菌液从-80℃冰箱中取出，置于水浴中溶解30min，至溶解完全。溶解后的菌液到倒入烧杯，置于冰水混合中，进行超声破碎，超声条件设为：超声5s，停歇10s，功率为40％，每次超声体积不超过50mL，总超声时间为60min。
2)超声后的裂解液，放入预冷的离心机中，6000rpm，20min，4℃离心，将上清用0.45μm 的滤膜抽滤完成后倒入烧杯中，置于冰上。分别取沉淀、上清置于1.5mL EP管中。
3)上述上清液使用Ni预装柱亲和纯化，先用Buffer A(25mM Tris,500mM NaCl,10％ (v/v)Glycerol,pH 7.5)，以流速3mL/min，将5mL Ni柱平衡10个柱体积，然后将抽滤后的蛋白上样，流速控制为2mL/min，上样完成后，使用Buffer A洗杂，至少使用10个柱体积。然后用Buffer B(50mM Tris-HCl，500mM咪唑，pH7.0)分别设置不同咪唑浓度，25mM，125mM，250mM，500mM分别进行洗脱，流速为2mL/min，每个梯度下吸光度开始上升时进行收集，直至吸光度不再变化。500mM咪唑浓度洗脱下，吸光度数不变时，则洗脱结束。
4)分别取不同咪唑浓度洗脱后的蛋白样于1.5mL EP管中，进行15％SDS-PAGE电泳分析。将与预期大小一致且杂蛋白较少的蛋白样进行Q预装柱纯化，先用Buffer C(25mMTris， pH7.5)，以流速3mL/min，将5mL Q柱平衡10个柱体积。将预纯化的蛋白样用Buffer C稀释4倍，然后将稀释后的蛋白上样，流速控制为2mL/min，上样完成后，使用Buffer C洗杂，至少使用10个柱体积。然后用Buffer D(25mM Tris，1M NaCl，pH7.5)分别设置不同NaCl浓度，25mM，75mM，125mM，250mM，500mM分别进行洗脱，流速为2mL/min，每个梯度下吸光度开始上升时进行收集，直至吸光度不再变化。500mM NaCl浓度洗脱下，吸光度数不变时，则洗脱结束。
5)分别取不同NaCl浓度洗脱后的蛋白样于1.5mL EP管中，进行15％SDS-PAGE电泳分析。将与预期大小一致，且没有杂带的蛋白用3kD的浓缩管进行超滤浓缩。最后得到的蛋白1mL/管进行分装，液氮速冻，置于-80℃保存(图4)。
实施例3 SARS-Cov-2 S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白疫苗的功能检测
为了评价SARS-Cov-2 S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白疫苗的免疫效力，本发明采用BALB/c小鼠为动物模型。
1.SARS-Cov-2 S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白疫苗免疫
1)购买SPF级5-6周龄健康雌性BALB/c小鼠28只，随机分成7组，每组4只，DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn3、DTT-Sn4、DTT-Sn5、DTT-Sn6、DTT-Sn7为实验组。
2)疫苗制备：每只小鼠接受50μg抗原蛋白和300μg Alum，以及30μg CpG，总体积每只200μL，首先根据蛋白浓度计算好抗原蛋白和Alum以及CpG用量体积，然后将 Al(OH)3佐剂和抗原、CpG混匀，在冰上放置15min，尽量在2个小时内完成疫苗注射。
3)疫苗免疫注射：在第1、12、21天腋下淋巴结丰富的部位皮下四针注射免疫，每针剂量50μL，共200μL；
4)血清收集：采用眼眶取血，用无菌弯头镊夹取眼球，捻动拇指与食指，使血液从眼眶内以不同速度垂直流入1.5mL无菌离心管中，同时用左手中指轻按小鼠心脏部位，以加快心脏泵血速度，当血液流尽时，用脱臼法处死小鼠。每次每只小鼠采血量～100μL，注意避免交叉污染。采集获得的血清置于室温2h，再置4℃冰箱内3～4h，随后4000rpm离心 10min，离心结束。看到凝集血块在底部，上方是澄清的血清，迅速吸取上清，并进行分装(每管10μL)后冻存于-20℃备用。
2.SARS-Cov-2 S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白疫苗效力评价
1)抗血清检测
用ELISA法测定小鼠血清中抗体效价。具体步骤包括：
微球中和抗体：为了检测针对S蛋白N端膜外结构域的特异性的抗体，应该使用不含有载体蛋白的S蛋白N端结构域Sn1、Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、Sn6、Sn7作为检测蛋白，因此为了排除实验组DTT-Sn1蛋白的血清中对DTT的抗体，先使DTT-Sn1免疫小鼠的抗血清先与DTT-2Sc抗原(编码所述DTT-2Sc抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示)结合，将血清中的与DTT结合的抗体吸附然后吸出该血清转移到DTT-Sn1蛋白铺板的孔中，检测血清中针对Sn1的抗体。同样为了检测DTT-Sn2、DTT-Sn3、DTT-Sn4、DTT-Sn5、 DTT-Sn6、DTT-Sn7免疫小鼠的血清针对Sn2、Sn3、Sn4、Sn5、Sn6、Sn7的应答，先排除血清中对DTT的结合情况，先使DTT-Sn2、DTT-Sn3、DTT-Sn4、DTT-Sn5、DTT-Sn6、 DTT-Sn7免疫小鼠的抗血清先于DTT结合，将血清中的与DTT结合的抗体吸附掉，然后吸出该血清转移到DTT-Sn2、DTT-Sn3、DTT-Sn4、DTT-Sn5、DTT-Sn6、DTT-Sn7蛋白铺板的孔中。
包被：用包被缓冲液(0.05M PH 9.6的碳酸盐缓冲液)将DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn3、 DTT-Sn4、DTT-Sn5、DTT-Sn6、DTT-Sn7蛋白稀释至1μg/ml，包被96孔ELISA酶标板(NEST公司产品，下同)每孔100μl，4℃包被过夜；
封闭：将包被抗原的ELISA酶标板用PBS-T(PBS含0.1％Tween-20，pH 7.5，下同)洗涤6次，每次5min；加入100μl封闭液(含3％BSA的PBST)，37℃封闭60min；PBST洗涤5次后。
加待检血清：微球中和后的小鼠血清用含1％BSA的PBST作1:100梯度稀释，将稀释血清加入ELISA酶标板各孔中(100μl/每孔)，37℃孵育60min；PBST洗涤5次。
加酶标二抗：二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体(ABclonal公司产品)，用含 1％BSA的PBST作1:5000稀释，加入ELISA板各孔中(100μl/每孔)，37℃作用60min；PBST洗涤5次。
加入显示底物溶液：向酶标板各孔中加入显色底溶液(含0.075％H2O2，1mg/ml四甲基联苯，TMB)，每孔100μl，常温下显色15min；每孔加入2M H2SO4 50μl终止反应。
OD450值测定：在酶标仪上波长450nm处测定每孔内光密度吸收值(OD450)
结果表明，本发明制备的S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组疫苗免疫接种小鼠能诱导机体产生高水平特异性抗体。(图5)
2)细胞增殖检测
为了评估抗原决定簇Sn1诱导产生细胞免疫应答的能力，将DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn3、DTT-Sn4、DTT-Sn5、DTT-Sn6、DTT-Sn7磁珠加载到DTT抗血清中，利用 DTT抗血清中的抗体对磁珠上的DTT蛋白进行封闭，再对磁珠进行离心清洗后加载到 DTT-Sn1免疫小鼠的脾脏细胞中，刺激培养72h，测定其细胞增殖。同时利用未封闭的 DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn3、DTT-Sn4、DTT-Sn5、DTT-Sn6、DTT-Sn7磁珠作为对照。
从免疫小鼠的脾脏中分离脾细胞，并用ACK裂解缓冲液处理。将细胞以1×105细胞/ 孔的浓度接种在96孔平皿中，加入100μL含有10％FBS的RPMI-1640培养基，并用30μg/mL相应的刺激蛋白刺激，置于37℃5％CO2的恒温恒湿培养箱中培养。72小时后，按照产品说明书，用CCK-8溶液处理细胞。测量波长450nm的光密度(OD)，以650处的 OD作为参考值。刺激指数(SI)计算为受刺激细胞与未受刺激细胞的450nm下光密度(OD) 之比。(图6)
结果表明，封闭后的DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn4、DTT-Sn7处理的小鼠脾脏细胞中可以观察到显著的细胞增殖，刺激指数比PBS组和微球组略高，且略低于未封闭的DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn4、DTT-Sn7组。封闭后的DTT-Sn3、DTT-Sn5、DTT-Sn6处理的小鼠脾脏细胞中未观察到显著的细胞增殖。
3)细胞毒性实验
进一步将刺激后的脾脏细胞作为效应细胞检测对靶细胞的杀伤作用。首先将S蛋白的N 端表达质粒pcDNA4-S(Nter)转染到A549细胞中，进行内源性瞬时表达，表达24h后利用甲醇固定，再用Triton X-100对细胞膜进行渗透穿孔后，建立靶标细胞。最后将DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn3、DTT-Sn4、DTT-Sn5、DTT-Sn6、DTT-Sn7免疫后的小鼠脾脏细胞按与靶标细胞一定的比例进行添加共培养(图7)。
结果显示DTT-Sn1、DTT-Sn2、DTT-Sn4、DTT-Sn7疫苗可诱导特异性细胞反应。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白及其亚单位疫苗
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catatgataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct 60
ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 120
gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa 180
ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg 240
gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag 300
acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt 360
gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg 420
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ggtggtggtg gtagtggtgg tggtggtagt accagaactc aattaccccc tgcatacact 660
taacaagctt 670
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catatgataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct 60
ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 120
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aatgatggtg tttattttgc ttcctaacaa gctt 694
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<211> 700
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctgggacca atggtactaa gaggtttgat taacaagctt 700
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ggtggtggtg gtagtggtgg tggtggatcc ttacatagaa gttatttgac tcctggtgat 600
tcttcttcag gttggggtgg tggtggtagt ggtggtggtg gtagtttaca tagaagttat 660
ttgactcctg gtgattcttc ttcaggttgg taacaagctt 700
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 120
gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa 180
ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg 240
gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag 300
acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt 360
gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg 420
gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat 480
tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg 540
ggtggtggtg gtagtggtgg tggtggatcc ggttttaatt gttactttcc tttacaatca 600
tatggtttcg gtggtggtgg tagtggtggt ggtggtagtg gttttaattg ttactttcct 660
ttacaatcat atggtttcgg tggtggtggt agtggtggtg gtggtagtgg ttttaattgt 720
tactttcctt tacaatcata tggtttctaa caagctt 757

Claims (10)

1.一种SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白，其特征在于，编码所述重组蛋白的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14所示中的一条。
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：8、SEQID NO：11、SEQ ID NO：14所示中的一条。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体能够表达权利要求1所述的SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白，所述重组表达载体含有权利要求2所述的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括表达质粒载体、噬菌体载体和病毒载体中的一种。
5.根据权利要求4所述的一种重组表达载体，其特征在于，所述表达质粒载体的表达区的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14所示中的一条。
6.根据权利要求5所述的一种重组表达载体，其特征在于，所述表达质粒载体包括pET28a-DTT-Sn1、pET28a-DTT-Sn4和pET28a-DTT-Sn7中的至少一种。
7.一种工程菌或者工程化细胞，其特征在于，所述工程菌或者工程化细胞包含权利要求3-6任一所述的重组表达载体。
8.一种SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
获得SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域的抗原决定簇Sn1、Sn4和Sn7，所述Sn1、Sn4和Sn7的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：7所示；
构建并获得所述Sn1、Sn4和Sn7的表达质粒，其中，所述Sn1、Sn4和Sn7表达质粒的表达区的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14所示；
将所述Sn1、Sn4和Sn7的表达质粒分别进行分泌表达和纯化，获得纯化的重组SARS-ConV-2病毒S蛋白膜外N端结构域高靶向性重组蛋白。
9.一种新型冠状病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述新型冠状病毒亚单位疫苗包含权利要求1所述的重组蛋白以及药学上接受的佐剂。
10.根据权利要求9所述的一种新型冠状病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂包括氢氧化铝、卵磷脂、弗氏佐剂、MPL TM、IL-12、氢氧化铝联合CpG ODN复合佐剂、ISA51VG、ISA720VG、MF59、QS21、AS03佐剂中的至少一种。
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