CN111533809A

CN111533809A - 针对新型冠状病毒的亚单位疫苗及应用

Info

Publication number: CN111533809A
Application number: CN202010316204.1A
Authority: CN
Inventors: 龚睿; 肖庚富; 张海伟; 张哲�; 赵少娟; 张化俊; 张晓晴; 潘晓彦; 詹焱程; 彭诚; 高晓霄
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2020-04-21
Filing date: 2020-04-21
Publication date: 2020-08-14

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白及应用。本发明通过将新型冠状病毒囊膜蛋白S的RBD结构域与抗体Fc片段融合得到融合蛋白(SARS2‑RBD‑Fc)，作为亚单位疫苗，通过滴鼻免疫、肌肉注射都可诱导机体产生高效的中和抗体，表明SARS2‑RBD‑Fc可以作为候选疫苗用于防治新冠病毒感染。

Description

针对新型冠状病毒的亚单位疫苗及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种针对新型冠状病毒的亚单位疫苗及应用。

背景技术

新型冠状病毒(2019-nCoV，SARS-CoV-2)是一种β属的冠状病毒，感染该病毒后可导致患者出现发热、干咳、乏力等症状；部分患者会产生严重的肺炎，进而发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等，甚至死亡。 SARS-CoV-2病毒通过其表面的囊膜蛋白吸附和进入宿主细胞，从而感染人的呼吸道上皮细胞及肺泡细胞。SARS-CoV-2的囊膜蛋白即刺突蛋白(Spike protein,S)是一种糖蛋白，主要作用于细胞粘附和细胞膜融合。S蛋白由S1和S2两个亚基组成，其中S1亚基中包含受体结合结构域(Receptor Binding Domain,RBD)介导吸附作用，S2亚基主要体现融合活性。RBD与细胞表面血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，是病毒和受体相互作用以及病毒入侵细胞的关键因素。RBD是宿主中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。由于目前没有效果非常好的药物、治疗性抗体、疫苗等用于SARS-CoV-2病毒感染的治疗和预防，因此开发针对SARS-CoV-2 病毒的疫苗对于健康人的保护及应对病毒的再次爆发是至关重要的。

发明内容

本发明的目的在于体外获得新型冠状病毒S蛋白RBD结构域的重组融合蛋白，从而提供一种针对新型冠状病毒的亚单位疫苗 (SARS2-RBD-Fc)及应用。

为实现上述目的，本发明提供了一种新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白，它是SARS-CoV-2病毒RBD结构域的融合蛋白，由 SARS-CoV-2病毒囊膜蛋白S的RBD结构域与人源IgG1抗体的Fc 片段组成的融合蛋白。

上述方案中，优选地，所述融合蛋白的编码基因序列是通过搭桥PCR的方法将SARS-CoV-2病毒囊膜蛋白S的RBD结构域的基因与人源IgG1抗体的Fc片段的基因融合得到。

优选地，新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白的氨基酸全长序列为Seq ID No.2，命名为SARS2-RBD-Fc。

可选地，上述融合蛋白的编码基因序列为Seq ID No.1。

优选地，所述融合蛋白包含SARS-CoV-2病毒囊膜蛋白S的 RBD结构域中第319～541位的氨基酸序列。

本发明还揭示了新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白在制备抗病毒抗体和疫苗中的应用。新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白在制备免疫滴鼻剂或疫苗型滴鼻剂中的用途。作为滴鼻剂应用时，其中包含前述新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白，其剂量为 1～20mg(按照20g小鼠与70kg人的体表面积0.0026:1换算，小鼠剂量20μg/只相当于7.7mg/人。因此，推荐人使用时在1-20mg 范围内。)。

本发明的有益效果：

(1)将SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD结构域与人源抗体IgG1 的Fc片段进行融合，在Fc片段天然二聚化的作用下，增加RBD 的免疫原性，提高其稳定性，同时通过Fc片段和新生Fc受体 (neonatal Fc receptor，FcRn)相互作用而延长其血浆半衰期，有利于减少免疫次数。

(2)相对于直接表达的SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD结构域， SARS2-RBD-Fc含有的Fc片段通过FcRn相互作用，介导 SARS2-RBD-Fc通过粘膜途径进入体内，产生粘膜免疫效应。这样拓展了该疫苗的给药途径：既能够通过注射免疫，也可以通过滴鼻途径进行免疫，后者会使疫苗更加安全。

(3)相对于直接表达的SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD结构域， SARS2-RBD-Fc含有的Fc片段可以增强其体内的体液免疫和细胞免疫效应。

附图说明

图1为SARS2-RBD-Fc蛋白的构建示意图。

图2为SARS2-RBD-Fc蛋白表达纯化后SDS-PAGE电泳图。

图3为SARS2-RBD-Fc蛋白的表达纯化后蛋白免疫印迹检测图。

图4为SARS2-RBD和SARS2-RBD-Fc蛋白分别免疫小鼠后，小鼠血清中抗体产生滴度的ELISA检测图。

图5为SARS2-RBD-Fc蛋白不同方式免疫小鼠后，小鼠血清中抗体中和SARS-CoV-2病毒分析图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：扩增SARS2-RBD和SARS2-RBD-Fc片段基因

根据已报到的临床分离的SARS-CoV-2病毒(GenBank: QHR63250.2)基因序列设计SARS2-RBD基因正、反向引物扩增目的片段，以人源IgG1的Fc片段基因(GenBank:CAC20454.1)的基因序列设计引物扩增Fc片段，并进行重组：

正向引物：

注：SEQ No.3中横线标注为载体上重组部分。

反向引物：

注：SEQ No.7中横线标注为载体上重组部分。

分别用正向引物(1)/(2)与反向引物(1)以SARS-CoV-2 病毒和用正向引物(3)与反向引物(2)以IgG1的Fc片段基因的碱基序列为模板进行PCR，分别得到SARS2-RBD和Fc基因片段，并利用正向引物(1)和反向引物(2)进行搭桥PCR，得到 SARS2-RBD-Fc基因。

琼脂糖凝胶电泳回收SARS2-RBD-Fc基因片段，用EcoRI和 NotI酶切载体pCAGGS，将载体线性化，胶回收后将SARS2-RBD-Fc 基因与载体pCAGGS同源重组(

-BasicSeamless Cloning and Assembly Kit，货号：CU201)并进行转化E.coli Top10感受态，随后挑取单克隆送测序。根据测序结果，挑取序列正确的单克隆用于后续实验(图1)。

SARS2-RBD-Fc的基因序列为：Seq ID No.1，其编码的氨基酸序列为Seq IDNo.2。

实施例2：SARS2-RBD-Fc蛋白的表达和纯化

采用哺乳动物细胞293F表达体系表达。转染前1天将293F细胞(控制细胞密度为5×10⁵个/ml)40mL接种于125mL悬浮细胞培养瓶。将40μg质粒(pCAGGS-SARS2-RBD-Fc)稀释于4mL培养基中轻轻混匀，再将60μL PEI(polyethylenimine货号24765-1)稀释于培养液中，轻轻浑匀。室温孵育20分钟后将它们逐滴加入细胞中。将细胞放入悬浮培养箱中，250转/分钟，37℃8％CO₂悬浮培养。

培养120小时后收集培养基上清，用Goat Anti-human-IgG Fc Antibody作为抗体通过蛋白免疫印迹(Western Blot)检测 pCAGGS-SARS2-RBD-Fc的表达(图3)。

在检测到pCAGGS-SARS2-RBD-Fc表达后，扩大细胞培养与转染规模，大量表达受体结合域蛋白。收集培养基上清，用ProteinA 填料纯化目的蛋白，随后用截留分子量为10kDa的超滤离心管超滤置换缓冲液，经SDS-PAGE验证其纯度(图2)。

表达纯化的SARS2-RBD-Fc蛋白通过Thrombin酶切掉Fc片段，并通过ProteinA填料去除切掉的Fc片段，得到SARS2-RBD蛋白。

实施例3：SARS2-RBD-Fc蛋白的小鼠免疫

将融合蛋白SARS2-RBD-Fc和SARS2-RBD分别与Imject Alum 佐剂(ThermoScientific)混合均匀，蛋白终浓度为1mg/ml。将4-6 周龄的雌性BABL/c小鼠分为4组，每组4只。第一组为以滴鼻的方式给与小鼠SARS2-RBD+佐剂20μl/只免疫；第二组为以滴鼻的方式给与小鼠SARS2-RBD-Fc+佐剂20μl/只免疫；第三组为以后腿肌肉注射的方式给与SARS2-RBD-Fc+佐剂小鼠20μl/只；第四组为以滴鼻的方式给与小鼠PBS+佐剂20μl/只免疫。两周后用同等剂量进行第二次免疫。在第二次免疫两周(总共免疫28天)后从小鼠眼眶静脉丛取一定的血液，用ELISA测定血清中的特异性抗体滴度(ELISA包被SARS2-RBD蛋白)。结果如图4所示，用融合蛋白SARS2-RBD-F滴鼻免疫、SARS2-RBD-Fc肌肉注射免疫小鼠均能产生特异性抗体，SARS2-RBD滴鼻免疫小鼠和PBS对照组基本不能产生抗体。

实施例4：SARS2-RBD-Fc蛋白小鼠免疫血清中和实验

细胞铺板：将Vero细胞以3×10⁵个每孔接种到12孔板中，置于37℃5％CO₂培养箱中培养过夜。

血清梯度稀释：取一块48孔板，向A1孔中添加450μL含2.5％ FBS的DMEM培养基(2.5％FBS+DMEM)，其他孔中加300μL培养基。实验设置没有抗体的孔作为对照，向所有对照孔中加300μL 培养基。在A1孔中加入9μL受测试抗体，混匀后取150μL加到下一个孔中并混匀，按照相同方式稀释到最后一孔，并从最后一孔中弃掉150μL稀释液。

病毒稀释：用2.5％FBS+DMEM培养基将SARS-CoV-2病毒液稀释至600PFU/mL。

抗体与病毒孵育：将稀释的病毒液每孔300μL加到稀释的抗体中，充分混合后置于37℃培养箱中孵育1小时。

病毒感染细胞：去除12孔板中Vero细胞的培养基，加入500μL 抗体-病毒混合液。将孔板置于37℃5％CO₂培养箱中孵育1小时。去除孵育后的抗体-病毒混合液，加入1mL用2.5％FBS+DMEM稀释的0.9％羧甲基纤维素，置于37℃5％CO₂培养箱中培养2-3天。

固定细胞：取1mL 20％甲醛-PBS加到培养好的细胞孔中孵育 1小时，灭活病毒和固定细胞。

染色：用自来水冲洗细胞去除甲醛-PBS。向每个孔中加入 500μL 0.5％的结晶紫溶液，孵育5分钟。用自来水冲洗孔板，直到水澄清为止，以去除结晶紫溶液。

统计分析：将12孔板倒置在纸巾上，使其完全干燥，拍照并统计噬斑数量。根据抗体稀释度计算抗体中和病毒的效价。

血清抗体中和实验显示，用融合蛋白SARS2-RBD-Fc滴鼻免疫、 SARS2-RBD-Fc肌肉注射免疫小鼠产生的抗体均能一定程度的中和 SARS-CoV-2病毒对Vero细胞的感染(图5)。因此，融合蛋白 SARS2-RBD-Fc有望成为有效的亚单位疫苗，并且除了传统的注射免疫方法外，还可通过滴鼻等黏膜免疫的方式使用。

序列表

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 针对新型冠状病毒的亚单位疫苗及应用

<130> 20200417

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1449

<212> DNA

<213> SARS2-RBD-Fc(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagtggg tgaccttcat cagcctgctg ttcctgttca gcagcgccta cagcagagtc 60

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 120

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 180

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 240

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 300

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 360

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 420

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 480

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 540

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 600

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 660

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 720

ttcatcagcg gccgcctggt gccccgcggc agcgagccca aatcttgtga caaaactcac 780

acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 840

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 900

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 960

cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1020

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1080

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1140

gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1200

ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1260

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1320

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1380

tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1440

ccgggtaaa 1449

<210> 2

<211> 483

<212> PRT

<213> SARS2-RBD-Fc(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile

20 25 30

Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala

35 40 45

Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp

50 55 60

Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr

65 70 75 80

Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr

85 90 95

Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro

100 105 110

Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp

115 120 125

Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys

130 135 140

Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn

145 150 155 160

Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly

165 170 175

Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu

180 185 190

Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr

195 200 205

Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val

210 215 220

Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn

225 230 235 240

Phe Ile Ser Gly Arg Leu Val Pro Arg Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys

245 250 255

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

260 265 270

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

275 280 285

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

290 295 300

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

305 310 315 320

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

325 330 335

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

340 345 350

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

355 360 365

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

370 375 380

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

385 390 395 400

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

405 410 415

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

420 425 430

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

435 440 445

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

450 455 460

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

465 470 475 480

Pro Gly Lys

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 正向引物1(Artificial Sequence)

<400> 3

tctcatcatt ttggcaaaat gaagtgggtg accttcatca gcctgctg 48

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 正向引物2(Artificial Sequence)

<400> 4

ttcatcagcc tgctgttcct gttcagcagc gcctacagca gagtccaacc aacag 55

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 正向引物3(Artificial Sequence)

<400> 5

gccgcctggt gccccgcggc agcgagccca aatcttgtg 39

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 反向引物1(Artificial Sequence)

<400> 6

gcggggcacc aggcggccgc tgatgaaatt gacacatttg tttttaac 48

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 反向引物2(Artificial Sequence)

<400> 7

ctagctaatt aagagctcct actatttacc cggagacagg ga 42

Claims

1.一种新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白，它是由SARS-CoV-2病毒囊膜蛋白S的RBD结构域与人源IgG1抗体的Fc片段组成的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因序列是通过搭桥PCR的方法将SARS-CoV-2病毒囊膜蛋白S的RBD结构域与人源IgG1抗体的Fc片段的基因融合得到。

3.权利要求1所述新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白，其氨基酸全长序列为Seq IDNo.2。

4.根据权利要求3所述新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因序列为Seq ID No.1。

5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包含SARS-CoV-2病毒囊膜蛋白S的RBD结构域中第319～541位的氨基酸序列。

6.权利要求1所述新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白在制备抗病毒抗体和疫苗中的应用。

7.权利要求1所述新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白在制备免疫滴鼻剂或疫苗型滴鼻剂中的用途。

8.一种新型冠状病毒疫苗的滴鼻剂，所述滴鼻剂中包含权利要求1所述新型冠状病毒囊膜蛋白的融合蛋白，其剂量为1～20mg。