CN112851824A

CN112851824A - 一种融合蛋白及其在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用

Info

Publication number: CN112851824A
Application number: CN202110180894.7A
Authority: CN
Inventors: 周展; 周晶晶; 蒋健敏; 朱函坪; 孙一晟; 姚萍萍; 陈晨; 赵文彬; 陈枢青
Original assignee: Zhejiang University ZJU; Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang University ZJU; Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2021-02-09
Filing date: 2021-02-09
Publication date: 2021-05-28

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白及其在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用。所述融合蛋白包括融合表达的SARS‑CoV‑2病毒S蛋白的RBD区域和IgG抗体的Fc区域。本发明通过将SARS‑CoV‑2的棘突蛋白的RBD结构域与免疫球蛋白Fc进行融合表达获得重组融合蛋白，Fc的铰链区以及恒定区能通过二硫键将IgG抗体的两条重链相结合，实现RBD的二聚体，制备的重组融合蛋白可用于作为针对新型冠状病毒肺炎的重组蛋白疫苗。该重组蛋白疫苗可在小鼠体内诱导产生高滴度的特异性IgG抗体和中和抗体，抗体水平可维持3个月以上，该疫苗能同时诱导小鼠产生细胞免疫。

Description

一种融合蛋白及其在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，特别是涉及一种融合蛋白及其在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用。

背景技术

冠状病毒属于尼多病毒目，冠状病毒科的一种具有包膜的单股正链的RNA病毒(+ss RNA)，又可分为α、β、γ、δ属。其中，α、β属主要感染哺乳动物，而γ、δ属主要感染禽类，少数情况下也感染哺乳动物。新型冠状病毒肺炎(COVID-19)则是由β属的SARS-CoV-2病毒所引起。

SARS-CoV-2病毒其基因组编码四种结构蛋白，分别为棘突蛋白，包膜蛋白，膜蛋白以及核衣壳蛋白。其中，S蛋白的受体结合结构域(Receptor binding domain，RBD)通过结合宿主细胞膜上的血管紧张素转化酶2(ACE2)感染人体。在缺乏特效药的情况下，疫苗仍然是保护人群的最有效的防控手段。S蛋白在介导病毒感染的初期发挥重要作用，是产生中和抗体的主要区域。成熟的S蛋白是以三聚体形式构成病毒表面的“皇冠状”外形。S蛋白的膜远端S1结构域包括了RBD结构域，主要与宿主细胞膜上的ACE2受体结合。膜近端S2结构域包括了FP(Fusion peptide，融合肽)成分。S蛋白三聚体在未结合受体之前，2个RBD结构域处于“向下”状态，1个RBD结构域处于“向上”状态。在与受体结合之后，蛋白酶体识别并切割弗林蛋白酶切位点，继而导致S1结构脱落，接着触发S2亚基构象的改变，S2的FP成分暴露有利于病毒包膜和宿主细胞膜的融合，最终实现病毒包膜和宿主细胞膜的融合。当宿主感染SARS-CoV-2之后，体内会产生多种结合S蛋白的中和抗体，大部分靶向RBD结构域，少部分靶向NTD结构域。由于RBD结构域相比全长S蛋白，S1结构域，S2结构域，诱导产生的中和抗体能力显著强于其他结构，之前关于MERS和SARS的RBD重组蛋白已证明其作为重组蛋白疫苗开发的理想的候选抗原。

疫苗开发五大类型：减毒活疫苗、灭活疫苗、病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、核酸疫苗。

重组蛋白疫苗可细分为重组S蛋白疫苗、重组RBD疫苗和类病毒颗粒疫苗(VLPs)。这些重组蛋白可以通过不同的表达系统表达，包括昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母、原核细胞以及植物。不同表达体系的差异体现在翻译后修饰。原核细胞不具有翻译后修饰的功能，因此丧失了对S蛋白或者RBD蛋白糖基化的修饰。但是，目前发现SARS-CoV-2的棘突蛋白表面存在许多糖基化修饰，也许这些糖基化修饰参与稳定RBD构，也可能作为是免疫原性的一部分。但是，有些糖基化修饰也可能掩蔽表位区域。因此，即便对于相同的重组蛋白疫苗，不同的表达体系也有可能导致其免疫原性的差异。一般来说，哺乳动物表达的RBD重组蛋白疫苗比昆虫和大肠杆菌中表达的RBD重组蛋白疫苗能够诱导更强的中和抗体反应。另一方面，重组蛋白疫苗通常仅包含中和表位产生的结构域，因此，这些疫苗大多数都含有全长S蛋白或者部分结构，比起S蛋白，RBD结构域可能缺乏了其他中和表位，比如靶向NTD区域。但是，全长S蛋白疫苗可能能够诱导不必要的免疫反应，导致抗体介导的疾病增强。RBD作为单体形式直接应用于疫苗，其免疫原性较弱。所以往往要结合适合的佐剂或者引入额外的蛋白形成二聚体以增加其免疫原性。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种免疫效果更好、由SARS-CoV-2的棘突蛋白的RBD结构域与免疫球蛋白Fc进行融合表达的重组融合蛋白，可用于作为针对新型冠状病毒肺炎的重组蛋白疫苗。

一种融合蛋白，包括融合表达的SARS-CoV-2病毒S蛋白的RBD区域和IgG抗体的Fc区域。

优选的，RBD区域的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，该序列为棘突蛋白的330-583aa。

优选的，IgG抗体为人源IgG抗体或鼠源IgG抗体。更优选的，人源IgG抗体的Fc区域氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；鼠源IgG抗体的Fc区域氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，RBD区域与Fc区域之间通过柔性连接接头进行连接，柔性连接接头的氨基酸序列为GGGGS。柔性连接接头的作用在于避免RBD结构域和Fc结构域可能出现的相互影响，当然除了Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)序列外，其中Gly与Ser的数量、位置等均可以再调整，或者使用其他常用的柔性连接接头，柔性连接接头本身对RBD结构域和Fc结构域的结构没有影响。

本发明又提供了编码所述融合蛋白的基因。

优选的，编码RBD区域的序列如SEQ ID No.4所示，编码Fc区域的序列如SEQ IDNo.5或6所示。

所述的基因，还包括位于编码RBD区域的序列上游的信号肽编码序列以及位于信号肽编码序列上游的Kozak序列，信号肽编码序列如SEQ ID No.7所示，Kozak序列为ACCACC。Kozak序列是位于真核生物mRNA5’端帽子结构后面的一段核酸序列，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始，用来增强真核基因的翻译效率的。信号肽用于在真核细胞表达系统中做分泌表达，一般使用HEK293细胞进行表达的话，使用HEK293细胞的信号肽，如果用其他细胞表达系统，就相应使用其他细胞对应的信号肽即可。

本发明还提供了所述融合蛋白在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用。

一种新型冠状病毒亚单位疫苗，包含所述融合蛋白。

本发明通过将SARS-CoV-2的棘突蛋白的RBD结构域与免疫球蛋白Fc进行融合表达获得重组融合蛋白，已知Fc的铰链区以及恒定区能通过二硫键将IgG抗体的两条重链相结合，因此，利用这一特性，将其应用于RBD二聚体蛋白的设计上，制备的重组融合蛋白可用于作为针对新型冠状病毒肺炎的重组蛋白疫苗。另外，Fc通过FcRn受体途径，可以将Fc融合药物从溶酶体的降解中拯救出来，从而有效延长药物的半衰期。

本发明制备的重组蛋白疫苗可在小鼠体内诱导产生高滴度的特异性IgG抗体和中和抗体，抗体水平可维持3个月以上，该疫苗能同时诱导小鼠产生细胞免疫。

附图说明

图1为连接鼠源Fc或者人源Fc的RBD重组蛋白疫苗示意图。

图2为分子筛纯化RBD重组蛋白疫苗的结果，其中，图A为RBD-hFc，图B为RBD-mFc。

图3为SDS-PAGE分析分子筛纯化后RBD重组蛋白疫苗的结果，其中，图A为RBD-hFc样品且为非还原性SDS-PAGE，图B为RBD-hFc样品且为还原性SDS-PAGE，图C为RBD-mFc样品且为非还原性SDS-PAGE，图D为RBD-mFc样品且为还原性SDS-PAGE，图E为S1-hFc样品且为还原性SDS-PAGE。

图4为SEC-HPLC分析分子筛纯化后RBD重组蛋白疫苗的结果，其中，图A为RBD-hFc，图B为RBD-mFc。

图5为VERO E6细胞检测RBD重组蛋白疫苗亲和力检测图，其中，图A为RBD-hFc，图B为RBD-mFc；图A和B中，左侧的峰为对照组，即一抗加入的PBS溶液。

图6为RBD重组蛋白免疫后IgG滴度检测的结果。其中对照组分别为AL(OH)₃以及S1-hFc，其中，图A为RBD-hFc，图B为RBD-mFc，图C为S1-hFc。

图7为RBD重组蛋白免疫后中和抗体滴度检测的结果。其中对照组分别为AL(OH)₃以及S1-hFc，其中，图A为RBD-hFc，图B为RBD-mFc，图C为S1-hFc。

图8为RBD重组蛋白免疫后细胞因子释放的结果，对照组分别为AL(OH)₃以及S1-hFc，图A为IFN-γ释放量，图B为IL-4释放量，图C为IL-10释放量。

具体实施方式

实施例1：RBD重组蛋白的制备

(1)RBD序列源于SARS-CoV-2棘突蛋白330-583氨基酸范围。在本发明中，鼠源Fc来自于鼠源IgG1，人源Fc是在人源IgG1的基础上进行改造。人源Fc具体改造位点是在Asn297Ala以及Lys322Ala，对于疫苗而而言，Fc所介导的ADCC和CDC效应是多余的。为了增加疫苗在应用上的安全性，因此对这两个位点进行突变。

实验设计路线：先通过PCR分别扩增RBD片段(基因序列SEQ ID No.4，氨基酸序列SEQ ID No.1)，人源IgG1修饰后的Fc片段(以下简称为hFc，基因序列SEQ ID No.5，氨基酸序列SEQ ID No.2)，鼠源IgG1的Fc片段(以下简称为mFc，基因序列SEQ ID No.6，氨基酸序列SEQ ID No.3)。再通过重叠延伸PCR，将RBD与hFc以及mFc通过一段柔性连接区(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，基因序列SEQ ID No.10)进行拼接。第三步通过延伸PCR，在上游引入EcoR I酶切位点(GAATTC)、kozak序列(ACCACC)及HEK293细胞信号肽(氨基酸序列：MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC，基因序列SEQ ID No.7)，此外在下游引入终止密码子(TGA)及XhoI酶切位点(GCGGCCGC)。最后将双酶切后的PCR产物连接于pcdna3.1真核表达载体中，并将连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑选测序正确的单克隆并保菌。将上述重组质粒瞬转入人胚肾细胞(HEK293细胞)进行表达，将融合人源Fc的RBD重组蛋白命名为RBD-hFc，融合鼠源Fc的RBD重组蛋白命名为RBD-mFc。

RBD重组蛋白首先利用亲和层析法进行纯化：RBD-hFc利用protein A柱纯化，RBD-mFc利用protein G柱纯化。然后，将上一步纯化后的蛋白进一步利用分子筛(Superdex200Increase 10/300GL，GE)来纯化。由于受到Fc形成二聚体的能力，RBD-hFc产生两个邻近的峰，RBD-mFc主要产生一个峰(图2)。

(2)SDS-PAGE分析纯化产物如图3，RBD-hFc第一个峰的产物在还原条件下产生55KDa左右的条带，在非还原条件下产生170KDa左右的条带，因此峰1的产物符合理论蛋白分子量；RBD-mFc第二个峰的产物在还原条件下产生55KDa左右的条带，在非还原条件下产生170KDa左右的条带，因此峰2的产物符合理论蛋白分子量。同时，利用SEC-HPLC分析纯化产物(非还原条件下)，如图4，说明RBD重组蛋白可以达到较高纯度。

实施例2：流式亲和力测定

(1)收集1×10⁶个VERO E6细胞分别与RBD-hFc重组蛋白疫苗(10μg/ml)，RBD-mFc重组蛋白疫苗(10μg/ml)，并设置两组阴性对照(仅加入PBS)。在4℃孵育30min。

(2)PBS洗涤3次后，在孵育RBD-mFc的试管中加入FITC标记的山羊抗鼠的二抗(1:1000)200μl；在孵育RBD-mFc的试管中加入FITC标记的山羊抗鼠的二抗(1:1000)200μl；阴性对照组，分别加入FITC标记的山羊抗人的二抗(1:1000)200μl，FITC标记的山羊抗鼠的二抗(1:1000)200μl。4℃孵育30min之后，PBS洗涤3次后，用流式细胞仪检测。

(3)流式细胞仪检测RBD重组蛋白与VERO E6细胞(ACE2阳性)的亲和力主要通过二抗标记后的FITC的平均荧光强度来表达。

(4)如图5所示，RBD重组蛋白与VERO E6细胞的亲和力明显高于阴性对照组，因此Fc融合形式的RBD疫苗仍然保持其天然构象。

实施例3：重组蛋白免疫小鼠

选择健康的BALB/C雌性小鼠，8周龄(19-21g)，小鼠随机分成7组，每组4只，分别为F，G，H，I，J，K，L共7组，具体如下：F组为接种Al(OH)₃的佐剂组；G组为接种高剂量(8μg)RBD-hFc(RBD-hFc^High)，H组为接种低剂量(2μg)RBD-hFc(RBD-hFc^Low)；K组为接种高剂量(8μg)RBD-mFc(RBD-mFc^High)，L组为接种低剂量(2μg)RBD-mFc(RBD-mFc^Low)。此外，为了比较RBD和S1两种Fc融合形式的重组蛋白疫苗的免疫原性差异，因此设置了融合人源Fc的S1重组蛋白疫苗作为对照，S1-hFc(购自北京义翘神州公司，货号40591-V02H)中S1结构域选择S蛋白16-685aa，而其中的Fc为人源IgG1(Asn297以及Lys322两个位点未突变)。

具体如下：I组为接种高剂量(8μg)S1-hFc(S1-hFc^High)，J组为接种低剂量(2μg)S1-hFc(S1-hFc^Low)。

RBD以及对照的S1重组蛋白在结合Al(OH)₃佐剂之后，采用后肢肌肉注射，注射总体积为200μl/只，每次接种时两侧后腿各注射一半剂量即100μl。初次免疫在第0天，免疫之后的第七天进行第二次的加强免疫。并且在免疫后1，2，3，4，6，8，10，12周采血，最后第91天处死小鼠并提取脾脏细胞。

实施例4：IgG特异性抗体滴度检测

为了检测RBD-hFc、RBD-mFc和S1-hFc融合蛋白的免疫原性，用高、低剂量的融合蛋白对BALB/C小鼠进行了两次免疫(方法同实施例3)。在免疫后1～12周分别进行采血。

先将50ng RBD(购自Genscript，China)蛋白在ELISA平板中4℃包被过夜。第二日，在每个孔中添加10％FBS，在37℃下在含有0.5％吐温-20的PBS中封闭1个小时。封闭之后，将稀释后的血清样本加入每个孔中，在37℃下孵育1个小时。接着，使用PBST溶液洗涤每个平板3次后，往每个孔中加入兔抗小鼠IgG HRP抗体，在37℃下孵育1个小时。同样，使用PBST溶液洗涤每个平板6次，并添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物，37℃下反应10分钟。用1％H₂SO₄停止反应，并在450nm处检测吸光度。OD₄₅₀值大于背景值的2.1倍为阳性。

加强接种一周后，RBD-hFc^High、RBD-hFc^Low、RBD-mFc^High、RBD-mFc^Low、S1-hFc^High和S1-hFc^Low组的IgG抗体几何平均滴度(GMT)分别为21527、18102、15222、15222、3805和3200。6组IgG血清转化率均为100％。随后，IgG抗体滴度上升，在接种后3～4周达到高峰。RBD-mFc^High组IgG抗体最高GMT超过10万。随着时间的推移，IgG抗体滴度略有下降，但在接种后12周仍维持在较高水平。RBD-hFc组和RBD-mFc组的IgG抗体水平均高于S1-hFc组。

实施例5：中和抗体滴度检测

首先用SARS-CoV-2病毒进行噬菌斑减少中和试验(PRNT)。来自免疫后小鼠的血清在56℃灭活0.5小时并连续稀释。将2倍稀释血清混合并与相同体积的病毒培养物(100TCID50)在37℃下培养1小时。将混合物添加到6孔板中的Vero E6细胞上，并在37℃下再培养1小时。然后，丢弃病毒培养物并用0.6％琼脂糖凝胶在病毒培养基中替换。孵育2天后，加入含0.1％中性红的第二层琼脂糖。一天后计算菌斑数量，并计算导致噬菌斑减少50％的血清稀释液(PRNT50)作为效价。

两次免疫后，除S1-hFc^Low组的一只小鼠外，所有组在接种后两周都能检测到中和抗体滴度。中和抗体滴度在接种后4周达到高峰。RBD-hFc^High、RBD-hFc^Low、RBD-mFc^High、RBD-mFc^Low和S1-hFc^High组的GMT分别为128、108、431、152和54。接种后12周后，RBD-hFc^High组、RBD-hFc^Low组、RBD-mFc^High组和S1-hFc^Low组GMT分别为最高值的35.4％、50％、35.4％和70.3％。而RBD-mFc^Low组和S1-hFc^Low组的中和抗体水平与峰值水平基本一致。结果表明，重组蛋白具有良好的免疫原性。

实施例6：细胞因子(IFN-γ、IL4以及IL10)检测

(1)取接种12周的RBD重组蛋白或AL佐剂免疫小鼠的血清标本。然后将各组小鼠等量的血清混合到一个样品中，使用Proteome ProfilerTM小鼠细胞因子阵列面板A对100μl血清样品进行分析。平均像素密度用Quantity One进行分析。

(2)从各组中随机抽取小鼠3只，处死后取脾脏细胞至组织培养皿。通过3ml注射器按压分离成单个细胞悬浮液。细胞在含有10％FBS的RPMI 1640培养基(5×105/孔)中培养，然后用SARS-CoV-2RBD(2μg/孔)刺激。在37℃，5％CO₂中培养24小时后，使用小鼠酶联免疫斑点试剂盒测量产生IFN-γ的脾细胞。应用ChemiDoc-XRS+成像系统对Spot-forming细胞(SFCs)进行成像，并用Quantity-One软件对相关数据进行统计分析。

为了评估RBD和S1融合蛋白的细胞免疫应答，从所有免疫小鼠中分离脾细胞并用RBD蛋白刺激。Elispot检测IFN-γ分泌水平明显高于对照组，其中RBD-mFc^High组最高。用ELISA法检测RBD刺激后，脾细胞产生的IL-4和IL-10产生量。RBD-hFc^High、RBD-mFc^High和S1-hFc^High组中脾细胞培养基的IL-4和IL-10浓度也显著高于对照组。三组IL-4浓度分别为18.6、19.9和16.3pg/ml，IL-10浓度分别为85.3、209和95.3pg/ml。这些结果表明，RBD重组蛋白能诱导小鼠产生细胞免疫应答。

序列表

<110> 浙江大学

浙江省疾病预防控制中心

<120> 一种融合蛋白及其在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 254

<212> PRT

<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)

<400> 1

Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr

1 5 10 15

Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys

20 25 30

Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe

35 40 45

Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr

50 55 60

Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln

65 70 75 80

Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu

85 90 95

Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu

100 105 110

Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg

115 120 125

Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr

130 135 140

Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr

145 150 155 160

Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr

165 170 175

Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro

180 185 190

Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys

195 200 205

Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr

210 215 220

Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile

225 230 235 240

Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu

245 250

<210> 2

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

1 5 10 15

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 3

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Val Arg Ser Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser

1 5 10 15

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr

20 25 30

Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp

35 40 45

Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr

50 55 60

Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser

65 70 75 80

Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

85 90 95

Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys

100 105 110

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr

115 120 125

Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr

130 135 140

Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln

145 150 155 160

Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met

165 170 175

Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys

180 185 190

Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu

195 200 205

Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly

210 215 220

Lys

225

<210> 4

<211> 762

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)

<400> 4

cctaacatta ccaacctctg cccatttgga gaggtgttta acgccacccg gttcgccagc 60

gtgtacgcct ggaaccggaa gaggatcagc aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac 120

aacagcgcct ccttcagcac cttcaagtgc tacggggtga gccccacaaa gctgaacgat 180

ctgtgcttca ccaacgtata cgccgatagc ttcgtgatcc ggggggatga ggtgaggcag 240

atcgcccccg gccagacagg caagatcgcc gattacaact acaagctgcc cgatgacttc 300

accggctgcg tgatcgcctg gaacagcaac aacctggact ccaaggtggg cggcaactac 360

aactacctgt accgcctgtt caggaagtcc aacctgaagc cttttgagag ggatatcagc 420

acagagatct accaggccgg ctccacaccc tgcaacggcg tggaggggtt caactgctac 480

ttccccctgc agagctatgg cttccagccc acaaacgggg tggggtacca gccctacagg 540

gtggtggtgc tgagcttcga gctgctgcac gcccccgcca cagtgtgcgg gcccaagaag 600

tccaccaacc tggtgaaaaa caagtgcgtg aacttcaact tcaacgggct gacagggacc 660

ggcgtgctga cagagagcaa caagaagttc ctgcccttcc agcagttcgg gcgggatatc 720

gccgacacca cagacgccgt gagggacccc cagacactgg ag 762

<210> 5

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgctggg 60

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 120

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 180

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 240

gccagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 300

aaggagtaca agtgcgccgt ctccaacaaa gccctcggag cccccatcga gaaaaccatc 360

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 420

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 480

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 540

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 600

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 660

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 696

<210> 6

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttagatctg gttgtaagcc ttgcatatgt acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc 60

ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt 120

gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg 180

gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca 240

gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac tggctcaatg gcaaggagtt caaatgcagg 300

gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga 360

ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca cctcccaagg agcagatggc caaggataaa 420

gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc ttccctgaag acattactgt ggagtggcag 480

tggaatgggc agccagcgga gaactacaag aacactcagc ccatcatgga cacagatggc 540

tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg cagaagagca actgggaggc aggaaatact 600

ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc 660

cactctcctg gtaaatga 678

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggatatga gggtgcctgc ccagctgctg ggactgctcc tgctgtggtt tcccggcgcc 60

agatgc 66

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Phe Pro Gly Ala Arg Cys

20

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaggaggcg gcagc 15

Claims

1.一种融合蛋白，包括融合表达的SARS-CoV-2病毒S蛋白的RBD区域和IgG抗体的Fc区域。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，RBD区域的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，IgG抗体为人源IgG抗体或鼠源IgG抗体。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，人源IgG抗体的Fc区域氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；鼠源IgG抗体的Fc区域氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，RBD区域与Fc区域之间通过柔性连接接头进行连接，柔性连接接头的氨基酸序列为GGGGS。

6.编码权利要求1～5任一所述融合蛋白的基因。

7.根据权利要求6所述的基因，其特征在于，编码RBD区域的序列如SEQ ID No.4所示，编码Fc区域的序列如SEQ ID No.5或6所示。

8.根据权利要求7所述的基因，其特征在于，还包括位于编码RBD区域的序列上游的信号肽编码序列以及位于信号肽编码序列上游的Kozak序列，信号肽编码序列如SEQ ID No.7所示，Kozak序列为ACCACC。

9.权利要求1～5任一所述融合蛋白在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用。

10.一种新型冠状病毒亚单位疫苗，其特征在于，包含权利要求1～5任一所述融合蛋白。