KR20200103681A - Il-2 개변체 - Google Patents

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KR20200103681A
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마사히로 이케다
신페이 야마구치
마스미 무라카미
히데유키 오노데라
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쿄와 기린 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되고, 또한 Treg를 선택적으로 활성화하는 신규 IL-2 개변체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 IL-2 개변체, 해당 IL-2 개변체의 제조 방법, 해당 IL-2 개변체를 포함하는 조성물 및 면역 질환의 치료제, IL-2의 IL-2Rαβγ에 대한 선택성을 증가시키는 방법, IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2의 친화성을 향상시키는 방법, IL-2Rβ 및 γ 서브유닛의 적어도 어느 하나에 대한 IL-2의 친화성을 저하시키는 방법, 그리고 제어성 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

IL-2 개변체
본 발명은 IL-2 개변체, 해당 IL-2 개변체의 제조 방법, 해당 IL-2 개변체를 포함하는 조성물 및 치료제, IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2의 친화성을 향상시키는 방법, IL-2Rβ 및 γ 서브유닛의 적어도 어느 하나에 대한 IL-2의 친화성을 저하시키는 방법, 그리고 제어성 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 방법에 관한 것이다.
제어성 T 세포(Treg)는 전사 인자 Foxp3(forkhead box P3; 포크헤드 박스 P3)을 발현하는 것을 특징으로 하는 CD4 양성 T 세포 서브셋이다. Treg는 IL-10이나 TGF-β 등 억제성 사이토카인의 산생, 퍼포린이나 그랜자임 등 세포 상해성 단백질을 통한 세포 용해, CTLA-4 등을 통한 항원 제시 세포의 기능 조절, IL-2의 이용 경합에 의한 고갈 등 다양한 메커니즘에 의해 이펙터 T 세포(Teff)의 활성화를 저해하고, 과잉의 면역 응답을 음으로 제어하고 있다(비특허문헌 1).
Foxp3의 변이에 의한 Treg의 결손은 위독한 전신성의 자기 면역 반응을 나타내는 IPEX(immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked; 면역 조절이상, 다발성 내분비병증, 장병증, X-연관) 증후군을 발병한다. 또한, 복수의 자기 면역 질환에 있어서 Treg의 양이나 질이 저하되어 있는 점에서, Treg를 통한 면역 제어의 파탄이 병태 발병에 기여하고 있는 것으로 생각된다(비특허문헌 2, 비특허문헌 3).
IL-2(인터류킨(Interleukin)-2)는 주로 활성화 T 세포로부터 산생되는 사이토카인이며, 여러가지 면역 세포의 증식 및 활성화에 기여한다. 인간에게 있어서의 성숙체의 분자량은 약 15kDa(133 잔기)이며, 4개의 α-헬릭스로 구성되는 4-헬릭스 다발(4-four-helix bundle) 구조를 갖고 있다(비특허문헌 4).
IL-2 수용체(IL-2R)는 CD25(IL-2Rα), CD122(IL-2Rβ), CD132(γc)의 3개의 분자로 구성되어 있고, IL-2에 대하여 중친화성(KD≒10-9M)을 나타내는 이종이량체형 수용체(IL-2Rβγ)나, 고친화성(KD≒10-11M)을 나타내는 이종삼량체형 수용체(IL-2Rαβγ)가 형성된 경우에 시그널을 전달한다. CD25는 그 단체로도 IL-2와 저친화성(KD≒10-8M)으로 결합하지만, 시그널을 전달할 수는 없다(비특허문헌 5).
IL-2R의 발현 패턴은 면역 세포마다 다르다. CD56lowNK 세포나 나이브 T 세포에서는 CD25의 발현은 매우 낮고, IL-2R은 IL-2Rβγ로서 기능하고 있다. 한편, Treg나 CD56highNK 세포에서는 CD25가 발현하고 있고, IL-2R은 IL-2Rαβγ로서 기능한다(비특허문헌 6).
IL-2와 IL-2Rαβγ의 결합에서는, IL-2는 처음에 CD25에 결합한 후에, CD122, CD132와 순차 결합해 감으로써 IL-2R의 삼량체화를 일으킨다. IL-2에 의한 CD122와 CD132의 이량체화는 CD122 세포 내 영역으로의 JAK1의 리크루트 및 CD132 세포 내 영역으로의 JAK3의 리크루트를 촉진시키고, 이어서 STAT5의 인산화를 일으킨다. 인산화 STAT5(pSTAT5)는 이량체를 형성한 후에 핵 내로 이행하고, 표적 유전자의 전사를 재촉한다(비특허문헌 7, 비특허문헌 8).
IL-2 시그널은 Treg의 항상성 유지에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다. IL-2 자극에 의해 발생하는 pSTAT5는 직접적으로 Foxp3의 발현을 재촉함으로써 Treg의 증식 촉진, 안정화 및 Teff의 활성화 억제 기능을 향상시킨다. Treg는 고친화성 수용체인 IL-2Rαβγ을 발현하고 있는 데다가, IL-2 시그널을 양으로 제어하는 단백질 포스파타아제 1(Protein phosphatase 1(PP) 1) 및 PP 2A 활성이 높기 때문에, IL-2 자극에 의한 Treg의 STAT5의 인산화나 그의 하류의 유전자 발현은, 기억 T 세포의 그것보다도 10 내지 100배 정도 낮은 농도 영역에서 야기된다(비특허문헌 6, 비특허문헌 9).
IL-2 유전자나 IL-2R 유전자를 결손한 마우스에서는, Treg의 감소와 위독한 자기 면역 반응을 나타낸다. 인간에게 있어서도 마찬가지로, CD25 유전자의 결손은 자기 반응성 T 세포의 증식이나 IPEX 증후군과 유사한 증상을 나타낸다. SLE(systemic lupus erythematosus; 전신 홍반성 루푸스) 환자나 I형 당뇨병 환자에서는, T 세포에 의한 IL-2 산생능의 저하와, 그에 수반한 Treg의 감소가 보인다(비특허문헌 10, 비특허문헌 11, 비특허문헌 12).
IL-2 시그널의 활성화는 Treg 기능을 증강한다. SLE 유사의 증상을 나타내는 MRL/lpr 마우스로의 IL-2의 투여는, 염증 반응을 억제하여 병태를 개선한다. 또한, GVHD(graft-versus-host disease; 이식편 대 숙주병) 환자나 SLE 환자로의 IL-2의 투여는 Treg의 증폭을 재촉하고, 병태를 개선한다(비특허문헌 13, 비특허문헌 14, 비특허문헌 15).
그러나, 야생형 IL-2의 투여는 종종 NK 세포나 호산구의 증가를 야기하고, 투여 부위 반응이나 발열 및 인플루엔자 유사 증상 등을 야기한다. 또한, IL-2의 혈중 반감기는 약 1시간으로 매우 짧은 점에서, 저용량 IL-2 요법에서는, IL-2를 연일 투여할 필요가 있다(비특허문헌 14, 비특허문헌 15, 비특허문헌 16).
상기 과제의 해결을 위해서, Treg를 선택적으로 활성화하고, 또한 혈중 반감기가 연장된 IL-2 개변체의 창제가 시도되고 있다.
IL-2의 IL-2Rαβγ 선택성을 향상시키는 시도가 행하여지고 있다. 한 수법으로는, IL-2Rβγ와 상호 작용하는 아미노산 잔기에 변이를 도입하거나, 항IL-2 항체와 면역 복합체를 형성시키거나 하는 방법이 시도되고 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2, 특허문헌 3, 특허문헌 4, 특허문헌 5, 특허문헌 6, 비특허문헌 17).
그러나, 아미노산 변이의 도입은 변이에 기인한 면역원성 증가가 발생한다. 아미노산 변이를 실시한 인간 IL-2 개변체의 게잡이 원숭이에게의 투여는, 항약물 항체가 산생되어 있다. 항IL-2 항체에 의한 IL-2로의 IL-2Rαβγ 선택성의 부여는, 벨 모양과 같은 활성이 된다(특허문헌 2, 특허문헌 6).
IL-2의 혈중 반감기를 향상시키는 시도가 행하여지고 있다. 한 수법에서는, 항체 유래 Fc 서열을 부가하는 방법이 시도되고 있다(특허문헌 2, 특허문헌 4, 특허문헌 7, 비특허문헌 18). 다른 방법에서는, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비독성 수용성 폴리머를 부가하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 8, 특허문헌 9, 특허문헌 10, 특허문헌 11, 비특허문헌 19, 비특허문헌 20). 또한, 당쇄를 도입하는 방법도 시도되고 있다(특허문헌 12, 특허문헌 13, 특허문헌 14).
그러나, IL-2의 폴리에틸렌글리콜에 의한 수식은, 생물 활성의 저하가 발생한다(비특허문헌 19).
국제 공개 제2010/085495호 국제 공개 제2014/153111호 미국 특허 출원 공개 제2015/0374788호 명세서 미국 특허 제7186804호 명세서 국제 공개 제2014/028748호 국제 공개 제2015/109212호 미국 특허 출원 공개 제2017/0051029호 명세서 국제 공개 제2016/025385호 일본 특허 공개 제2016-202187호 공보 미국 특허 제4902502호 명세서 미국 특허 제5206344호 명세서 미국 특허 제5153310호 명세서 미국 특허 제5312903호 명세서 미국 특허 제5417970호 명세서
Front Immunol, 2013. 4(378) Nat Rev Immunol, 2014. 14(5): 343-349 Autoimmun Rev, 2015. 14(2): 105-116 Annu Rev Immunol, 2008. 26: 453-479 Immunity, 2013. 38(1): 13-25 Diabetes, 2015. 64(6): 2172-2183 J Biol Chem, 1997. 272(50): 31821-31828 Nat Rev Immunol. 2012 Feb 17; 12(3): 180-90 Nat Rev Immunol. 2015 May; 15(5): 283-94 Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(7): 3168-3171 N Engl J Med, 2011. 365(22): 2110-2121 Curr Diab Rep, 2014. 14(12): 553 J Immunol, 2014. 193(5): 2168-2177 N Engl J Med, 2011. 365(22): 2055-2066 Ann Rheum Dis, 2015. 74(4): 791-792 Blood. 2014 Dec 4; 124(24): 3572-6. Curr Pharm Des, 2002. 8(24): 2171-83 J Autoimmun, 2015. 56: 66-80 American College of Rheumatology Annual Meeting, San Diego, CA, 2017. Poster Abstract 2715: NKTR-358: A Selective, First-in-Class IL-2 Pathway Agonist Which Increases Number and Suppressive Function of Regulatory T Cells for the Treatment of Immune Inflammatory Disorders, Langowski, J.,et al. http://www.nektar.com/application/files/6315/1001/4171/NKTR-358 _2017ACR_ABS2715.pdf Biotechnology(N Y), 1990. 8(4): 343-346
본 발명은 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되고, 또한 Treg를 선택적으로 활성화하는 신규 IL-2 개변체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 예의 검토한 결과, 본 발명자들은, IL-2에 당쇄 또는 PEG를 결합시킴으로써 개변한 IL-2 개변체에 의해 상기 과제를 해결할 수 있음을 알아내고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 인터류킨-2(이하, IL-2라고 약기한다) 개변체.
(2) 당쇄가 결합한 IL-2 개변체 및/또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합한 IL-2 개변체인, (1)에 기재된 IL-2 개변체.
(3) IL-2 수용체(이하 IL-2R)αβγ에 대한 선택성이 향상되어 있는, (1) 또는 (2)에 기재된 IL-2 개변체.
(4) IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 당쇄가 결합하고 있는, (2) 또는 (3)에 기재된 IL-2 개변체.
(5) 당쇄가 하기 (식 4) 내지 (식 8), (식 Y1), (식 Y2) 또는 (식 Y3)으로 표시되는 구조를 갖는 당쇄로부터 선택되는 적어도 하나인, (2) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
(6) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는, (2) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(7) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 12, 15, 16, 19, 88, 91 및 119번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는, (2) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(8) 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기가, 하기 (식 1)로 표시되는 구조를 갖는, (6) 또는 (7)에 기재된 IL-2 개변체.
Figure pct00009
[(식 1) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.]
(9) 당쇄가 결합한 아스파라긴 잔기 유래의 기가, 하기 (식 2)로 표시되는 구조를 갖는, (6) 또는 (7)에 기재된 IL-2 개변체.
Figure pct00010
[(식 2) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.]
(10) 당쇄가 결합한 IL-2 개변체에 추가로 PEG가 결합한 IL-2 개변체인, (2) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(11) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 1, 3, 51 및 78번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는, (2) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(12) IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 4, 5, 6, 7, 8, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 PEG가 결합하고 있는, (2) 또는 (3)에 기재된 IL-2 개변체.
(13) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 4, 5, 6, 7, 8, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는, (2), (3) 및 (12) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(14) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의 4, 5, 8, 78 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합하고 있는 아미노산 잔기로 치환되어 있는, (2), (3), (12) 및 (13) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(15) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의 4, 5, 8, 78 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2개의 아미노산 잔기가, PEG가 결합하고 있는 아미노산 잔기로 치환되어 있는, (2), (3), (12) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(16) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 4, 5 및 8번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기, 그리고, 78번째 또는 129번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합하고 있는 아미노산 잔기로 치환되어 있는, (2), (3), (12) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(17) PEG가 결합한 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기인, (2), (3), (12) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(18) PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 티올기(-SH)를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기, 또는 PEG가 결합한 아지드기를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기인, (17)에 기재된 IL-2 개변체.
(19) PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기가, N6-[{(o-아지도벤질)옥시}카르보닐]-L-리신(o-Az-Z-Lys) 잔기 유래의 기, N6-[{(m-아지도벤질)옥시}카르보닐]-L-리신(m-Az-Z-Lys) 잔기 유래의 기 또는 시스테인 잔기 유래의 기인, (17) 또는 (18)에 기재된 IL-2 개변체.
(20) PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기가, 하기 (식 11) 및/또는 (식 12)로 표시되는 구조를 갖는, (19)에 기재된 IL-2 개변체.
Figure pct00011
Figure pct00012
(21) PEG가 결합한 m-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기가, 하기 (식 X4) 및/또는 (식 X5)로 표시되는 구조를 갖는, (19)에 기재된 IL-2 개변체.
Figure pct00013
Figure pct00014
(22) PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기가, 하기 (식 X11) 및/또는 (식 X12) 및/또는 (식 X13)으로 표시되는 구조를 갖는, (19)에 기재된 IL-2 개변체.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
(23) PEG가 직쇄상인, (2), (10) 내지 (22) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(24) PEG가 분지상인, (2), (10) 내지 (22) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(25) PEG가, 평균 분자량 10kDa 이상의 PEG인, (2), (10) 내지 (24) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(26) 결합하고 있는 PEG가, 평균 분자량 10kDa, 20kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa 또는 80kDa의 PEG인, (2), (10) 내지 (25) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(27) 결합하고 있는 PEG가, 하기 (식 13), (식 14), (식 15), (식 16), (식 X7), (식 X8), (식 X9), (식 X10), (식 X11), (식 X13), (식 X14) 또는 (식 X15)의 적어도 하나의 식으로 표시되는 구조를 갖는, (2), (10) 내지 (26) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
(28) IL-2의 N 말단에 추가로 메티오닌 잔기가 결합하고 있는, (1) 내지 (27) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(29) IL-2의 N 말단의 알라닌이 결손되어 있는, (1) 내지 (28) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체.
(30) IL-2의 N 말단의 알라닌이 결손되고, 추가로 메티오닌이 결합하고 있는, (1) 내지 (29)에 기재된 IL-2 개변체.
(31) (1) 내지 (30) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체의 제조 방법.
(32) (1) 내지 (30) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체를 포함하는 조성물.
(33) (1) 내지 (30) 중 어느 하나에 기재된 IL-2 개변체를 포함하는, 면역 질환의 치료제.
(34) IL-2의 IL-2Rαβγ에 대한 선택성을 향상시키는 방법.
(35) IL-2에 당쇄 및/또는 PEG를 결합시키는 것을 포함하는, (34)에 기재된 방법.
(36) IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에, 당쇄를 결합시키는 것을 포함하는, (35)에 기재된 방법.
(37) 당쇄가, 하기 (식 4) 내지 (식 8), (식 Y1), (식 Y2) 또는 (식 Y3)으로 표시되는 구조를 갖는 당쇄로부터 선택되는 적어도 하나인, (35) 또는 (36)에 기재된 방법.
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
(38) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열을 포함하는 IL-2에 있어서, 해당 아미노산 서열의 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기를, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환하는 것을 포함하는, (35) 내지 (37) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(39) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 12, 15, 16, 19, 88, 91 및 119번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환하는 것을 포함하는, (35) 내지 (38) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(40) 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기가, 하기 (식 1)로 표시되는 구조를 갖는, (38) 또는 (39)에 기재된 방법.
Figure pct00038
[(식 1) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.]
(41) 당쇄가 결합한 아스파라긴 잔기 유래의 기가, 하기 (식 2)로 표시되는 구조를 갖는, (38) 또는 (39)에 기재된 방법.
Figure pct00039
[(식 2) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.]
(42) 당쇄가 결합한 IL-2 개변체에 추가로 PEG를 결합시키는 것을 포함하는, (35) 내지 (41) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(43) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 1, 3, 51 및 78번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는, (42)에 기재된 방법.
(44) IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 4, 5, 6, 7, 8, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 PEG가 결합하고 있는, (35)에 기재된 방법.
(45) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 4, 5, 6, 7, 8, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는, (35) 또는 (44)에 기재된 방법.
(46) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의 4, 5, 8, 78 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합하고 있는 아미노산 잔기로 치환되어 있는, (35), (44) 및 (45) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(47) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의 4, 5, 8, 78 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2개의 아미노산 잔기가, PEG가 결합하고 있는 아미노산 잔기로 치환되어 있는, (35), (44) 내지 (46) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(48) PEG가 결합한 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기인, (35), (42) 내지 (47) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(49) PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 티올기(-SH)를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기, 또는 PEG가 결합한 아지드기를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기인, (48)에 기재된 방법.
(50) PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기가, N6-[{(o-아지도벤질)옥시}카르보닐]-L-리신(o-Az-Z-Lys) 잔기 유래의 기, N6-[{(m-아지도벤질)옥시}카르보닐]-L-리신(m-Az-Z-Lys) 잔기 유래의 기 또는 시스테인 잔기 유래의 기인, (48) 또는 (49)에 기재된 방법.
(51) PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기가, 하기 (식 11) 및/또는 (식 12)로 표시되는 구조를 갖는, (50)에 기재된 방법.
Figure pct00040
Figure pct00041
(52) PEG가 결합한 m-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기가, 하기 (식 X4) 및/또는 (식 X5)로 표시되는 구조를 갖는, (50)에 기재된 방법.
Figure pct00042
Figure pct00043
(53) PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기가, 하기 (식 X11) 및/또는 (식 X12) 및/또는 (식 X13)으로 표시되는 구조를 갖는, (50)에 기재된 방법.
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
(54) PEG가 직쇄상인, (35), (42) 내지 (53) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(55) PEG가 분지상인, (35), (42) 내지 (53) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(56) PEG가, 평균 분자량 10kDa 이상의 PEG인, (35), (42) 내지 (55) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(57) PEG가, 평균 분자량 10kDa, 20kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa 또는 80kDa의 PEG인 (35), (42) 내지 (56) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(58) 결합하고 있는 PEG가, 하기 (식 13), (식 14), (식 15), (식 16), (식 X7), (식 X8), (식 X9), (식 X10), (식 X11), (식 X13), (식 X14) 또는 (식 X15)의 적어도 하나의 식으로 표시되는 구조를 갖는, (35), (42) 내지 (57) 중 어느 하나에 기재된 방법.
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
(59) IL-2의 N 말단에 추가로 메티오닌 잔기가 결합하고 있는, (34) 내지 (58) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(60) IL-2의 N 말단의 알라닌이 결손되어 있는, (34) 내지 (59) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(61) IL-2의 N 말단의 알라닌이 결손되고, 추가로 메티오닌이 결합하고 있는, (34) 내지 (60) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(62) 제어성 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 방법.
(63) IL-2Rβ 및 γ 서브유닛의 적어도 한쪽에 대한 IL-2의 친화성을 저하시키는 방법.
(64) IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2의 친화성을 향상시키는 방법.
본 발명의 IL-2 개변체는, Treg에 고발현하고 있는 IL-2Rαβγ에 선택적으로 결합하여 Treg를 선택적으로 활성화한다. 본 발명에 따르면, IL-2 개변체, 해당 IL-2 개변체의 제조 방법, 해당 IL-2 개변체를 포함하는 조성물 및 면역 질환의 치료제, IL-2의 IL-2Rαβγ로의 선택성을 증가시키는 방법, IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2의 친화성을 향상시키는 방법, IL-2Rβ 및 γ 서브유닛의 적어도 어느 하나에 대한 IL-2의 친화성을 저하시키는 방법, 그리고 제어성 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 방법을 제공할 수 있다.
도 1a는 각종 당쇄 결합 IL-2 개변체의 Treg 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 Peprotech사제 IL-2[이하, IL-2(P)라고 기재], 흑색 삼각은 H16C-2, 흑색 사각은 L19C-9, 흑색 가로줄은 N88C-2의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 1b는 각종 당쇄 결합 IL-2 개변체의 Treg 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 E15C-11, 흑색 삼각은 L19C-11*, 흑색 사각은 L12C-11/V91C-11, 흑색 마름모꼴은 V91C-11/V115C-11, 흑색 가로줄은 V91C-11/N119C-11, 백색 동그라미는 A1C-11/T3C-11/S5C-11/L12C-11/V91C-11의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 1c는 각종 Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체의 Treg 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 A1C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, 흑색 삼각은 T3C-Li20(IAc)/L12C-11/V91C-11, 흑색 사각은 T3C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, 흑색 마름모꼴은 T3C-Y50(IAc)/E15C-11, 흑색 막대는 T3C-V40(IAc)/E15C-11, 백색 동그라미는 T3C-V80(Mal)/E15C-11, 백색 삼각은 F78C-V40(IAc)/L12C-11의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 1d는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 Treg 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-IL-2, 흑색 삼각은 8His-F78(oAzZK)-Li20, 흑색 사각은 8His-I129(oAzZK)-Li20의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 1e는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 Treg 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-S4(oAzZK)-Li20, 흑색 삼각은 8His-S5(oAzZK)-Li20, 흑색 사각은 8His-S6(oAzZK)-Li20, 흑색 마름모꼴은 8His-T7(oAzZK)-Li20, 흑색 가로줄은 8His-K8(oAzZK)-Li20의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 1f는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 Treg 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-E60(oAzZK)-Li20, 흑색 삼각은 8His-H79(oAzZK)-Li20, 흑색 사각은 8His-R81(oAzZK)-Li20, 흑색 마름모꼴은 8His-L94(oAzZK)-Li20의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 1g는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 Treg 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-S99(oAzZK)-Li20, 흑색 삼각은 8His-E100(oAzZK)-Li20, 흑색 사각은 8His-T101(oAzZK)-Li20, 흑색 마름모꼴은 8His-Q126(oAzZK)-Li20의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 1h는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 Treg 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-F78(oAzZK)-V40, 흑색 삼각은 8His-F78(oAzZK)-W40, 흑색 사각은 8His-I129(oAzZK)-Li40, 흑색 마름모꼴은 8His-I129(oAzZK)-V40, 흑색 막대는 8His-I129(oAzZK)-W40, 백색 동그라미는 8His-I129(oAzZK)-Y50, 백색 삼각은 I129(oAzZK)-V40, 백색 사각은 I129(oAzZK)-W80, 백색 마름모꼴은 I129C-V40(Mal)의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 1i는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 Treg 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-S4(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 흑색 삼각은 S4(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 흑색 사각은 8His-S5(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 흑색 마름모꼴은 S5(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 흑색 막대는 8His-K8(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 백색 동그라미는 K8(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 백색 삼각은 8His-F78(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 백색 사각은 8His-H79(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 백색 마름모꼴은 8His-S99(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 1j는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 Treg 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-S4(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 흑색 삼각은 8His-S5(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 흑색 사각은 8His-K8(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 흑색 마름모꼴은 8His-F78(oAzZK)-Li30/H79(oAzZK)-Li30, 흑색 막대는 8His-F78(oAzZK)-Li30/S99(oAzZK)-Li30의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 2a는 각종 당쇄 결합 IL-2 개변체의 NK 세포 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 마름모꼴은 IL-2(P), 흑색 사각은 H16C-2, 흑색 삼각은 L19C-9, 흑색 동그라미는 N88C-2의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 2b는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 NK 세포 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-IL-2, 흑색 삼각은 8His-F78(oAzZK)-Li20, 흑색 사각은 8His-I129(oAzZK)-Li20의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 2c는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 NK 세포 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-S4(oAzZK)-Li20, 흑색 삼각은 8His-S5(oAzZK)-Li20, 흑색 사각은 8His-S6(oAzZK)-Li20, 흑색 마름모꼴은 8His-T7(oAzZK)-Li20, 흑색 가로줄은 8His-K8(oAzZK)-Li20의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 2d는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 NK 세포 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-S99(oAzZK)-Li20, 흑색 삼각은 8His-E100(oAzZK)-Li20, 흑색 사각은 8His-T101(oAzZK)-Li20, 흑색 마름모꼴은 8His-Q126(oAzZK)-Li20의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 2e는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 NK 세포 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-E60(oAzZK)-Li20, 흑색 삼각은 8His-H79(oAzZK)-Li20, 흑색 사각은 8His-R81(oAzZK)-Li20, 흑색 마름모꼴은 8His-L94(oAzZK)-Li20의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 2f는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 NK 세포 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-F78(oAzZK)-V40, 흑색 삼각은 8His-F78(oAzZK)-W40, 흑색 사각은 8His-I129(oAzZK)-Li40, 흑색 마름모꼴은 8His-I129(oAzZK)-V40, 흑색 가로줄은 8His-I129(oAzZK)-W40, 백색 동그라미는 8His-I129(oAzZK)-Y50, 백색 삼각은 I129(oAzZK)-W80, 백색 사각은 I129C-V40(Mal)의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 2g는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 NK 세포 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-S4(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 흑색 삼각은 S4(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 흑색 사각은 8His-S5(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 흑색 마름모꼴은 S5(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 흑색 가로줄은 8His-K8(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 백색 동그라미는 K8(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 2h는 각종 당쇄 결합 IL-2 개변체 및 각종 Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체의 NK 세포 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 L12C-11/V91C-11, 흑색 삼각은 A1C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, 흑색 사각은 T3C-Li20(IAc)/L12C-11/V91C-11, 흑색 마름모꼴은 T3C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, 흑색 막대는 T3C-Y50(IAc)/E15C-11, 백색 동그라미는 T3C-V40(IAc)/E15C-11, 백색 삼각은 T3C-V80(Mal)/E15C-11, 백색 사각은 F78C-V40(IAc)/L12C-11의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 2i는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 NK 세포 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 IL-2(P), 흑색 삼각은 I129(oAzZK)-V40, 흑색 사각은 8His-F78(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 흑색 마름모꼴은 8His-H79(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 흑색 막대는 8His-S99(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 2j는 각종 PEG 결합 IL-2 개변체의 NK 세포 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 8His-S4(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 흑색 삼각은 8His-S5(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 흑색 사각은 8His-K8(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 흑색 마름모꼴은 8His-F78(oAzZK)-Li30/H79(oAzZK)-Li30, 흑색 막대는 8His-F78(oAzZK)-Li30/S99(oAzZK)-Li30의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 2k는 각종 당쇄 결합 IL-2 개변체의 NK 세포 증식 촉진 활성을 도시하는 도면이다. 흑색 동그라미는 E15C-11, 흑색 삼각은 L19C-11*, 흑색 사각은 V91C-11/V115C-11, 흑색 마름모꼴은 V91C-11/N119C-11, 흑색 막대는 A1C-11/T3C-11/S5C-11/L12C-11/V91C-11의 활성을 나타낸다. 횡축에 IL-2 농도(pM), 종축에 IL-2 의존성 세포 증식률(％)을 기재한다.
도 3은 미자극 Treg 또는 각종 IL-2 개변체 자극 Treg 공존 하에서의 반응자 T 세포(Tresp)의 증식률을 도시하는 도면이다. 도 3의 (A)는 CD4 양성 Tresp의 증식률, 도 3의 (B)는 CD8 양성 Tresp의 증식률이다. 어느 도면이든 횡축에 Tresp과 Treg의 존재비, 종축에 Tresp의 증식률(％)을 기재한다. 백색 마름모꼴은 미자극, 흑색 마름모꼴은 IL-2(P), 흑색 사각은 H16C-2, 흑색 삼각은 L19C-9, 흑색 동그라미는 N88C-2를 나타낸다.
도 4의 (A) 내지 도 4의 (E)는 자기 혈장으로 재구성한 인간 PBMC에 각종 IL-2 개변체를 첨가하여 배양했을 때의 배양 상청 중의 사이토카인 농도를 도시하는 도면이다. 도 4의 (A)는 IL-4 농도, 도 4의 (B)는 IL-6 농도, 도 4의 (C)는 IL-10 농도, 도 4의 (D)는 IFNγ 농도 및 도 4의 (E)는 TNFα 농도이다. 어느 도면이든 횡축에 첨가한 IL-2 농도(pM), 종축에 사이토카인 산생량(pg/mL)을 기재한다. 도 4의 (F)는 Treg 선택적 증식 활성을 평가한 결과를 도시하는 도면이다. 종축에, CD4 양성 분획 중, CD25+Foxp3high 분획을 Treg, CD25+Foxp3low 분획을 이펙터 T 세포(Teff)로 한 때의, 그 비[Treg(％)/Teff(％)]를 나타냈다. 횡축에, 첨가한 IL-2 농도를 나타낸다. 어느 도면이든, 백색 마름모꼴은 미자극, 흑색 마름모꼴은 IL-2(P), 흑색 사각은 H16C-2, 흑색 삼각은 L19C-9, 흑색 동그라미는 N88C-2를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
「Treg」 또는 「Treg 세포」란, 제어성 T 세포를 나타낸다. 제어성 T 세포란, 다른 면역 세포의 활성을 억제하는 T 세포의 클래스이며, 플로우 사이토메트리를 사용하고, 세포 마커 표현형인 CD4+CD25+FOXP3+에 의해 규정된다.
FOXP3은, 세포 내 단백질이며, 염색을 위해서, 세포의 고정과 투과 처리를 필요로 하는 점에서, 생존하는 Treg를 규정하기 위해서는, 세포 표면 표현형인, CD4+CD25+CD127low를 사용할 수 있다.
Treg는 또한, tTreg(흉선 유래) 및 pTreg(말초 유래이며, 말초의 나이브 T 세포로부터 분화시켰다) 등, 다양한 Treg 서브클래스도 포함한다. 모든 Treg는, IL-2Rαβγ을 발현하고, IL-2 의존적으로 증식하지만, 본 발명의 IL-2 개변체는, 적어도 하나의 Treg 서브클래스를 선택적으로 활성화할 수 있고, 바람직하게는 어느 서브클래스이든 선택적으로 활성화할 수 있다.
「IL-2」란, 야생형 IL-2, IL-2 개변체의 어느 경우든 있다.
「야생형 IL-2」란, 하기 1) 내지 3)의 IL-2의 어느 것이든 포함한다.
1) 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 유래 야생형 성숙 IL-2.
2) 상기 1)의 유전자 재조합체를 제작할 때에 첨가할 수 있는 아미노산 개변을 갖는 IL-2.
3) 상기 1) 및 상기 2)의 IL-2의 N 말단의 아미노산 잔기가 결실된 IL-2.
상기 2)의 아미노산 개변이란, 예를 들어 대장균에서 IL-2를 발현시키기 위하여 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에 개시 코돈에 의해 코드되는 메티오닌 잔기를 결합시키는 개변이나, 대장균에서 IL-2를 발현시키고, 또한 간편하게 정제하기 위하여 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에, MHHHHHHHH로 표현되는 아미노산 서열(메티오닌이 결합한 폴리히스티딘)을 결합시키는 개변이나, IL-2의 물성을 높이기 위하여 인간 유래 야생형 성숙 IL-2에 125번째의 아미노산 잔기를 알라닌 잔기 또는 세린 잔기로 치환하는 개변 등을 들 수 있다.
상기 3)의 IL-2의 N 말단의 아미노산 잔기가 결실된 IL-2란, 예를 들어, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단의 알라닌 잔기, 또는 알라닌 잔기 및 프롤린 잔기가 결실된 아미노산 서열을 갖는 IL-2 등을 들 수 있다.
야생형 IL-2는, 구체적으로는, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에 MHHHHHHHH로 표현되는 아미노산 서열이 결합한 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단의 알라닌 잔기가 결실된 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단의 알라닌 잔기가 결실되고, 또한 메티오닌이 결합한 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단의 알라닌 잔기 및 프롤린 잔기가 결실된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에 MHHHHHHHH로 표현되는 아미노산 서열이 결합한 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단의 알라닌 잔기가 결실된 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단의 알라닌 잔기가 결실되고, 또한 메티오닌이 결합한 아미노산 서열, 혹은 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단의 알라닌 잔기 및 프롤린 잔기가 결실된 아미노산 서열에 있어서, 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기 혹은 알라닌 잔기로 치환한 아미노산 서열을 갖는 IL-2를 들 수 있다. 상술, N 말단측의 아미노산 서열 및 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 세린 잔기는, IL-2의 활성에 영향을 줄 일 없이, 단백질 발현 또는 단백질 안정성의 관점에서 허용되는 아미노산 서열의 베리에이션이며, 본 발명의 IL-2 개변체에 있어서도 본 아미노산 서열의 베리에이션이 포함된다.
부언하면, 본 발명에 있어서 기재되는 IL-2의 아미노산 잔기의 번호는, 모두 서열 번호 1로 표현되는 IL-2의 아미노산 서열을 기준으로 했을 때의 아미노산 잔기 번호(위치)를 나타낸다. 따라서, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단의 알라닌 잔기가 1번째, 프롤린 잔기가 2번째, N 말단에 결합한 메티오닌 잔기는 -1번째로서 정의된다.
「IL-2 개변체」란, 야생형 IL-2에 어떠한 개변을 가하여 제작된, 야생형 IL-2의 기능을 갖는 모든 단백질을 포함한다. 개변체로서는, 예를 들어 아미노산 개변(예를 들어, 치환, 결실, 부가 등)에 의해 야생형 IL-2가 개변된 IL-2 개변체, 당쇄 수식에 의해 야생형 IL-2가 개변된 IL-2 개변체, 화학 수식에 의해 야생형 IL-2가 개변된 IL-2 개변체 등을 들 수 있다. 상기 개변은, 자연스럽게 발생하는 개변 및 인위적인 개변의 어느 개변이든 포함한다.
「야생형 IL-2의 기능」이란, IL-2Rαβγ로의 결합, IL-2Rβγ로의 결합, CD122 및 CD132의 세포 내 영역을 통한 세포 내 시그널 전달 경로의 활성화, JAK1의 인산화, JAK3의 인산화, STAT5의 인산화, STAT3의 인산화, PI3K의 인산화, MEK의 인산화, Foxp3 발현 촉진, Foxp3에 의해 전사가 제어되어 있는 유전자군의 발현 촉진, Foxp3 유전자의 TSDR(Treg-specific demethylation region; Treg-특이적 탈메틸화 영역) 영역의 DNA 탈메틸화 촉진, IL-2Rβγ를 발현하는 면역 세포의 증식 및 생존 촉진, IL-2Rβγ를 발현하는 면역 세포의 사이토카인 산생 촉진, IL-2Rαβγ를 발현하는 면역 세포의 증식 및 생존 촉진, IL-2Rαβγ를 발현하는 면역 세포의 사이토카인 산생 촉진, Treg 증식 및 생존 촉진, 그리고 Treg의 Teff 활성화 억제능의 향상으로부터 선택되는 적어도 하나의 기능을 나타낸다.
본 발명의 IL-2 개변체의 일 형태로서는, IL-2의 소정의 영역에 당쇄가 결합한 IL-2 개변체, 및 IL-2의 소정의 영역에 PEG가 결합한 IL-2 개변체, 및 IL-2의 소정의 영역에 당쇄 및 PEG가 결합한 IL-2 개변체를 들 수 있다. 결합으로서는, 예를 들어, 공유 결합, 비공유 결합 등을 들 수 있지만, 결합 양식은 가리지 않는다.
「아미노산 잔기」는 천연 아미노산 잔기와 비천연 아미노산 잔기의 어느 경우든 있다.
「천연 아미노산 잔기」란, 셀레노시스테인 잔기, 및 이하의 20종의 α-아미노산 잔기: 알라닌 잔기, 아스파라긴 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루타민 잔기, 글루탐산 잔기, 글리신 잔기, 히스티딘 잔기, 이소류신 잔기, 류신 잔기, 리신 잔기, 메티오닌 잔기, 페닐알라닌 잔기, 프롤린 잔기, 세린 잔기, 트레오닌 잔기, 트립토판 잔기, 티로신 잔기, 발린 잔기, 또는 시스테인 잔기를 들 수 있다. 천연 아미노산 잔기는 L체와 D체의 양쪽을 포함하고, 인간에게 있어서는 L체 쪽이 바람직하다.
「비천연 아미노산 잔기」란, 천연 아미노산 잔기 이외의 모든 아미노산 잔기를 말한다. 비천연 아미노산 잔기로서는, 예를 들어, 천연 아미노산 잔기를 수식한 아미노산 잔기, 인공적으로 디자인된 아미노산 잔기를 들 수 있다.
「수식」이란, 화학 수식, 번역 후 수식 등, 모든 수식을 포함한다.
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되어 있는 IL-2 개변체를 들 수 있다. IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되어 있는 IL-2 개변체에 의해, IL-2Rαβγ를 발현하고 있는 Treg를 선택적으로 활성화시킬 수 있다.
「IL-2Rαβγ에 대한 선택성」이란, IL-2가 IL-2Rβγ보다도 IL-2Rαβγ에 선택적으로 결합하는 성질을 말한다. 또한, 「IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되어 있는」이란, 야생형 IL-2와 비교하여, IL-2 개변체의 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되어 있는 것을 말한다.
IL-2Rαβγ에 대한 선택성, 또는 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되어 있는 것은, 예를 들어 이하에 기재하는 방법으로 판단할 수 있다.
(1) 각종 IL-2에 대해서, IL-2Rαβγ에 대한 결합 활성의 EC50값과, IL-2Rβγ에 대한 결합 활성의 EC50값을 측정한다. IL-2Rαβγ의 EC50이 IL-2Rβγ의 EC50보다도 작거나, 또는 EC50 ratio값(IL-2Rβγ EC50/IL-2Rαβγ EC50)이 1보다 크면, 당해 IL-2는 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 있다고 판단할 수 있다.
또한, 야생형 IL-2의 EC50 ratio값보다도 IL-2 개변체의 EC50 ratio값이 크거나, 또는 표준화 EC50 ratio값(IL-2 개변체의 EC50 ratio값/야생형 IL-2의 EC50 ratio값)이 1보다 큰 경우, 당해 IL-2 개변체는 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되어 있다고 판단할 수 있다. 표준화 EC50 ratio값은, 1보다 큰, 5 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 25 이상, 26 이상, 27 이상, 28 이상, 29 이상, 30 이상의 순으로 바람직하다. 야생형 IL-2 대신에 야생형 IL-2와 동등한 EC50 ratio값을 갖는 IL-2 개변체를 사용해도 된다.
EC50값의 측정 방법으로서는, 구체적으로는 예를 들어, 하기 (A) 내지 (C)에 나타내는 수순에 의한 방법을 들 수 있다. 보다 구체적인 방법으로서는, 실시예에 있어서 후술하는 방법을 들 수 있다.
(A) 포유 동물 세포에 인간 IL-2Rαβγ, 또는 인간 IL-2Rβγ을 발현시켜서, 인간 IL-2 의존성 생존 세포주를 제작하고, 각 세포주를 96웰 플레이트에 파종한다.
(B) 컨트롤의 IL-2를 1000ng/ml로 첨가한 웰의 상대 형광 단위(relative fluorescence units; RLU)값을 100％, IL-2를 포함하지 않는 배지를 첨가한 웰의 RLU값을 0％로 하여, 피검 물질인 IL-2 개변체의 IL-2 의존성 세포 증식률을 산출한다.
(C) (A)에서 얻어진 데이터를 바탕으로 통계 해석 소프트웨어(예를 들어, IBDS사제 XLfit5 version 5.3.1.3)를 사용하여 EC50값을 산출한다.
(2) 야생형 IL-2와 IL-2 개변체 각각에서, IL-2R 세포외 도메인(ECD)-Fc 융합 단백질인 CD25ECD-Fc, IL-2RβγECD-Fc에 대한 친화성을 Biacore로 측정한다. 야생형보다도 IL-2 개변체에서, CD25ECD-Fc의 KD값이 작고/작거나 IL-2RβγECD-Fc의 KD값이 클 때, 당해 IL-2 개변체는 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되어 있다고 판단할 수 있다. 또한, CD25ECD-Fc의 KD값에 대한 IL-2RβγECD-Fc의 KD값의 상대값이, 야생형보다도 IL-2 개변체에서 증가하고 있을 때, 당해 IL-2 개변체는 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되어 있다고 판단할 수도 있다.
「Treg를 선택적으로 활성화시키는」이란, 하기 (a) 내지 (c)의 적어도 어느 하나를 말한다.
(a) 야생형 IL-2보다도 IL-2 개변체의 Treg 증식 활성이 높고/높거나 NK 세포 증식 활성이 낮다.
(b) 야생형 IL-2보다도 IL-2 개변체에서, 세포 집단 중의 이펙터 T 세포(Teff)의 비율에 대한 Treg의 비율의 비[Treg(％)/Teff(％)]가 높다.
(c) 야생형 IL-2보다도 IL-2 개변체에서 염증성 사이토카인의 산생량이 저하되어 있고/있거나 항염증성 사이토카인의 산생량이 증가하고 있다.
상기 (a) 내지 (c)의 어느 경우든, 야생형 IL-2 대신 야생형 IL-2와 동등한 활성을 갖는 IL-2 개변체를 사용해도 된다.
Treg 증식 활성, 및 NK 세포 증식 활성은, 예를 들어 이하에 기재하는 방법으로 측정할 수 있다. Treg 또는 NK 세포를 96웰 플레이트에 파종하고, 컨트롤의 IL-2를 첨가한 웰의 RLU값을 100％, IL-2를 포함하지 않는 배지를 첨가한 웰의 RLU값을 0％로 하여, 피검 물질인 IL-2 개변체의 Treg 또는 NK 세포 증식률을 산출한다. 보다 구체적인 방법으로서는, 실시예에 있어서 후술하는 방법을 들 수 있다.
Treg(％)/Teff(％)는 예를 들어, 이하에 기재하는 방법으로 측정할 수 있다. 인간 말초혈 단핵 세포(이하, PBMC라고도 약칭한다)를 자기 혈장에 현탁하고, 거기에 항CD3 항체 OKT3을 첨가하여 96웰 플레이트에 파종 후, 각종 IL-2를 첨가하여 배양한다. 얻어진 인간 PBMC와, 형광 표지 항인간 CD4 항체, 형광 표지 CD25 항체, 형광 표지 항Foxp3 항체와 반응시킨 후, 플로우 사이토미터(예를 들어, BD Biosciences사제 LSRFortessa)로 각종 형광 강도를 측정한다.
얻어진 데이터를, 데이터 해석 소프트웨어(예를 들어, TreeStar사제 FLowJo, version7.6.5)를 사용하여 해석하고, CD4 양성 분획의 중에서, CD25+Foxp3high 분획을 Treg, CD25+Foxp3low 분획을 이펙터 T 세포(Teff)로 하여, 그의 존재비[Treg(％)/Teff(％)]를 산출한다. 보다 구체적인 방법으로서는, 실시예에 있어서 후술하는 방법을 들 수 있다.
각종 사이토카인의 산생량은, 예를 들어, 이하에 기재하는 방법으로 측정할 수 있다. 인간 PBMC를 자기 혈장에 현탁하고, 항CD3 항체 OKT3을 첨가하여 96웰 플레이트에 파종 후, 각종 IL-2를 첨가하여 배양하고, 상청 중의 사이토카인 산생량을 정량한다. 보다 구체적인 방법으로서는, 실시예에 있어서 후술하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 IL-2 개변체의 일 형태로서는, IL-2에 당쇄가 결합함으로써 개변된 IL-2 개변체(이하, 당쇄 결합 IL-2 개변체라고도 약칭한다.), IL-2에 PEG가 결합함으로써 개변된 IL-2 개변체(이하, PEG 결합 IL-2 개변체라고도 약칭한다.)를 들 수 있다. 이하, 각 개변체에 대하여 설명한다.
[당쇄 결합 IL-2 개변체]
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 당쇄가 결합하고 있는 IL-2 개변체가 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 「당쇄」란, 단당 또는 2 이상의 단당이 글리코시드 결합과 같은 결합을 통해서 결합한 것을 말하고, 어느 당쇄를 사용할 수도 있다.
IL-2에 결합하는 당쇄로서는, 구체적으로는 예를 들어, 하기 (식 4) 내지 (식 8) 및 (식 Y1) 내지 (식 Y3)으로 표시되는 구조를 갖는 당쇄로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1을 들 수 있다. IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 상기 아미노산 잔기에 해당 당쇄를 결합시킴으로써, IL-2Rαβγ에 대한 선택성을 향상시킬 수 있다. 또한, (식 6)의 α1-6 암, α1-3 암의 만노스(Man)의 각각에 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)이 하나 결합한 당쇄, (식 7)의 α1-6 암, α1-3 암의 Man-GlcNAc 각각으로부터 갈락토오스(Gal)가 하나 제거된 당쇄(G1), (식 8)의 비환원 말단의 시알산(Sial)이 하나 제거된 당쇄, 및 (식 Y3)의 비환원 말단의 시알이 1 내지 4개 제거된 당쇄도 본 발명의 IL-2 개변체의 당쇄에 사용할 수 있다.
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체가 바람직하고, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 12, 13, 15, 16, 19, 88, 91 및 119번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체가 보다 바람직하다.
본 실시 형태에 있어서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열은, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기 또는 알라닌 잔기로 치환한 아미노산 서열이 보다 바람직하다.
시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기란, 각각 시스테인 잔기의 측쇄 티올 또는 아스파라긴 잔기의 측쇄 아미드가 수식되어 있는 기를 말한다.
당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기란, 시스테인 잔기의 측쇄 티올 또는 아스파라긴 잔기의 측쇄 아미드에 화학 수식에 의해 당쇄가 결합한 기를 말한다. 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기는, 링커 등에 의해 수식되어 있어도 되고, 링커를 통하여 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기와 당쇄가 결합하고 있어도 된다.
당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로서는, 예를 들어, 하기 (식 1)에 나타내는 바와 같이, 시스테인 잔기의 측쇄 티올에 CH2CONH 링커를 통하여 당쇄가 결합한 구조를 갖는 아미노산 잔기를 들 수 있다. 시스테인 잔기의 측쇄 티올과 당쇄는, 링커를 통하지 않고 결합하고 있어도 된다.
Figure pct00067
상기 (식 1) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.
당쇄가 결합한 아스파라긴 잔기 유래의 기로서는, 예를 들어, 하기 (식 2)에 나타내는 바와 같이, 아스파라긴 잔기의 측쇄 아미드에 화학 수식에 의해 당쇄가 결합한 구조를 들 수 있다. 아스파라긴 잔기의 측쇄 아미드와 당쇄는, 링커를 통하여 결합하고 있어도 된다.
Figure pct00068
상기 (식 2) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, 예를 들어 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체를 들 수 있다.
야생형 IL-2에 당쇄가 하나 결합한 IL-2 개변체의 예로서는, 이하에 기재하는 물질을 들 수 있다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 11번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 13번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 15번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 16번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 18번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 19번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 20번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 84번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 87번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 88번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 91번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 92번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 108번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 115번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 119번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 122번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 123번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 130번째의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
상기 IL-2 개변체에 있어서, 결합하고 있는 당쇄는 어느 당쇄여도 되지만, 예를 들어 (식 4), (식 5), (식 6), (식 7), (식 8) 또는 (식 Y3)으로 표시되는 구조를 갖는 당쇄를 들 수 있다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 11번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 7) 또는 (식 8)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 13번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4) 또는 (식 8)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 15번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4), (식 8) 또는 (식 Y3)으로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 16번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4), (식 5), (식 6) 또는 (식 7)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 18번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4) 또는 (식 8)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 19번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4), (식 7), (식 8), 또는 (식 Y3)으로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 20번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4) 또는 (식 8)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 84번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 87번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4) 또는 (식 8)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 88번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4), (식 7) 또는 (식 8)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 91번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4), (식 7) 또는 (식 8)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 92번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 108번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4) 또는 (식 7)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 115번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 119번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4) 또는 (식 7)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 122번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 123번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 130번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4) 또는 (식 7)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
본 발명의 일 실시 형태로서는, 야생형 IL-2에 적어도 2개의 당쇄를 결합시킨 IL-2 개변체도 들 수 있다. 야생형 IL-2에 2개의 당쇄를 결합시킨 예로서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 1, 3, 4, 5, 8, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 23, 32, 38, 51, 76, 84, 87, 88, 91, 92, 100, 102, 104, 108, 115, 119, 122, 123, 127 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2개의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체를 들 수 있다.
야생형 IL-2에 당쇄가 2개 결합한 IL-2 개변체의 예로서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 1, 3, 4, 5, 8, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 23, 32, 38, 51, 76, 84, 87, 88, 91, 92, 100, 102, 104, 108, 115, 119, 122, 123, 127 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 잔기, 및 11, 12, 18, 20, 84, 87, 88, 91, 108, 115, 119, 122 및 123번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체가 바람직하다.
본 발명의 구체적인 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, 이하에 나타내는 것을 들 수 있다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 8번째 및 19번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 16번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 15번째 및 119번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 19번째 및 23번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 91번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 115번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 119번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 13번째 및 91번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 13번째 및 115번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 13번째 및 119번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 19번째 및 115번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 91번째 및 115번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 91번째 및 119번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
상기 IL-2 개변체에 있어서, 결합하고 있는 당쇄는 어느 당쇄여도 되지만, 예를 들어 (식 4) 또는 (식 8)로 표시되는 구조를 갖는 당쇄를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 구체적인 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, 이하에 나타내는 것도 들 수 있다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 8번째 및 19번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 16번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 12번째로 결합하는 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)이며, 또한 16번째로 결합하는 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4)인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 15번째 및 119번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 19번째 및 23번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 91번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 115번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 119번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 13번째 및 91번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 13번째 및 115번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 13번째 및 119번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 19번째 및 115번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 91번째 및 115번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 91번째 및 119번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
본 발명의 일 실시 형태로서는, 야생형 IL-2에 적어도 3개 당쇄를 결합시킨 IL-2 개변체도 들 수 있다. 야생형 IL-2에 3개의 당쇄를 결합시킨 예로서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 1, 3, 4, 5, 8, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 23, 32, 38, 51, 76, 84, 87, 88, 91, 92, 100, 102, 104, 108, 115, 119, 122, 123, 127 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 3개의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체를 들 수 있다.
또한, 야생형 IL-2에 당쇄가 3개 결합한 예로서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 1, 3, 4, 5, 8, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 23, 32, 38, 51, 76, 84, 87, 88, 91, 92, 100, 102, 104, 108, 115, 119, 122, 123, 127 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기와, 11, 12, 18, 20, 84, 87, 88, 91, 108, 115, 119, 122 및 123번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체가 보다 바람직하다.
본 발명의 일 실시 형태로서는, 야생형 IL-2에 적어도 4개 당쇄를 결합시킨 IL-2 개변체도 들 수 있다. 야생형 IL-2에 4개의 당쇄를 결합시킨 예로서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 1, 3, 4, 5, 8, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 23, 32, 38, 51, 76, 84, 87, 88, 91, 92, 100, 102, 104, 108, 115, 119, 122, 123, 127 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 4개의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체를 들 수 있다.
또한, 야생형 IL-2에 당쇄가 4개 결합한 예로서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 1, 3, 4, 5, 8, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 23, 32, 38, 51, 76, 84, 87, 88, 91, 92, 100, 102, 104, 108, 115, 119, 122, 123, 127 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기와, 11, 12, 18, 20, 84, 87, 88, 91, 108, 115, 119, 122 및 123번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체가 보다 바람직하다.
본 발명의 일 실시 형태로서는, 야생형 IL-2에 적어도 5개 당쇄를 결합시킨 IL-2 개변체도 들 수 있다. 야생형 IL-2에 5개의 당쇄를 결합시킨 예로서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 1, 3, 4, 5, 8, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 23, 32, 38, 51, 76, 84, 87, 88, 91, 92, 100, 102, 104, 108, 115, 119, 122, 123, 127 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 5개의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체를 들 수 있다.
또한, 야생형 IL-2에 당쇄가 5개 결합한 예로서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 1, 3, 4, 5, 8, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 23, 32, 38, 51, 76, 84, 87, 88, 91, 92, 100, 102, 104, 108, 115, 119, 122, 123, 127 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기와, 1, 3, 5, 12, 32, 51, 76, 91, 100, 102 및 104번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체가 보다 바람직하다.
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, 이하에 나타내는 것을 들 수 있다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 3번째, 12번째, 32번째, 76번째 및 91번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 1번째, 3번째, 5번째, 12번째 및 91번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 3번째, 12번째, 51번째, 91번째 및 100번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 3번째, 12번째, 76번째, 91번째 및 100번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째, 91번째, 100번째, 102번째 및 104번째의 아미노산 잔기가, 각각 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
상기 IL-2 개변체에 있어서, 결합하고 있는 당쇄는 어느 당쇄여도 되지만, 예를 들어 (식 8)로 표시되는 구조를 갖는 당쇄를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, 이하에 나타내는 것도 들 수 있다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 3번째, 12번째, 32번째, 76번째 및 91번째의 아미노산 잔기가, (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 1번째, 3번째, 5번째, 12번째 및 91번째의 아미노산 잔기가, (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 3번째, 12번째, 51번째, 91번째 및 100번째의 아미노산 잔기가, (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 3번째, 12번째, 76번째, 91번째 및 100번째의 아미노산 잔기가, (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째, 91번째, 100번째, 102번째 및 104번째의 아미노산 잔기가, (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)인 IL-2 개변체.
본 실시 형태에 있어서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열은, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기 또는 알라닌 잔기로 치환한 아미노산 서열이 보다 바람직하다.
[당쇄 결합 IL-2 개변체의 제조 방법]
당쇄 결합 IL-2 개변체의 제조 방법으로서는, 당쇄 결합 펩티드를 화학 합성한 후에 폴딩시키는 방법(화학 합성법), 또는 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 당쇄 도입 위치의 아미노산 잔기를 당쇄가 결합할 수 있는 아미노산 잔기로 치환한 IL-2 개변체를 대장균 등의 숙주 세포에 의해 발현시킨 후에, 당쇄가 결합할 수 있는 아미노산 잔기에 당쇄를 결합시키는 방법(발현법)을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「펩티드」란, 복수의 아미노산 잔기가 펩티드 결합을 통하여 쇄상에 연결된 것을 말한다. 특별히 기재가 없는 경우에는, 각 아미노산 잔기의 측쇄에는 보호기를 포함하고 있어도 되고, N 말단의 아미노기, C 말단의 카르복실기가 수식되어 있어도 된다.
당쇄 결합 IL-2 개변체는, 화학 합성법 및 발현법의 조합에 의해 제조되어도 된다. 이하, 각 방법에 대하여 설명한다.
(화학 합성법에 의한 당쇄 결합 IL-2 개변체의 제조)
화학 합성법에 있어서는, 적어도 하나 이상의 당쇄 결합 펩티드 프래그먼트와 펩티드 프래그먼트를 순차 연결시킨 후에 폴딩시킴으로써 당쇄 결합 IL-2 개변체를 제조하는 것이 바람직하다.
연결시키는 펩티드 프래그먼트와 당쇄 결합 펩티드 프래그먼트의 총 수로서, 바람직하게는 2 내지 15개의 프래그먼트, 보다 바람직하게는 2 내지 5개의 프래그먼트를 사용하는 것이 바람직하다. 당쇄 결합 펩티드 프래그먼트 및 펩티드 프래그먼트는 티오에스테르화하고, 당쇄 결합 펩티드 티오에스테르 및 펩티드 티오에스테르로서 연결시켜도 된다.
펩티드 프래그먼트, 펩티드 티오에스테르를 합성하는 방법으로서는, 예를 들어, 펩티드 합성에서 상용되는 방법[예를 들어, 제5판 실험 화학 강좌 16 유기 화합물의 합성 IV: 카르복실산·아미노산·펩티드(일본 화학회 편, 마루젠 가부시키가이샤, 2005년), Chemical Ligation: Tools for Biomolecule Synthesis and Modification(Luca D. DiAndrea 등 저, Wiley, 2017년) 등에 기재된 방법]을 들 수 있다.
이때, 펩티드의 용해성을 향상시키는 등을 위해서, 2아미노산 대신 슈도프롤린(J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 9218-9227) 또는 이소펩티드(Angew. Chem. Int. Ed., 2015, 54, 8226-8230)를 사용할 수도 있다.
또한, 펩티드 프래그먼트, 펩티드 티오에스테르를 합성하는 방법으로서는, 예를 들어, 펩티드 고상 합성법 대신 다카하시 등에 의해 개발된 Ajiphase 기술(Tetrahedron Lett., 2012, 53, 1936.), 및 오카다 등에 의해 개발된 Molecular Hiving 기술(J. Org. Chem., 2013, 78, 320-327) 등의 액상 합성법을 들 수 있다.
또한, 펩티드 프래그먼트를 합성하는 방법으로서는, 예를 들어, 종래 공지된 방법에 따라서, 예를 들어, 폴리메라아제 연쇄 증폭 반응(PCR), 플라스미드 DNA의 조제, 제한 효소에 의한 DNA의 절단, 올리고뉴클레오티드의 조제, DNA의 라이게이션, mRNA의 단리, 적절한 숙주 세포로의 DNA의 도입에 의한 형질 전환체의 취득, 형질 전환체의 배양을 포함하는 재조합 DNA법에 의해 제조하는 방법, 또는 무세포 단백질 발현법(Current Opinion in Biotechnology 2002, 13:297-303) 등에 기재된 방법을 들 수 있다. 펩티드 티오에스테르를 합성하는 방법으로서는, 예를 들어, (Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:6705-6710) 등에 기재된 방법을 들 수 있다.
펩티드 프래그먼트, 펩티드 티오에스테르 등에 당쇄를 결합시키는 방법으로서는, 예를 들어, 펩티드 프래그먼트의 시스테인 잔기의 측쇄 티올에 당쇄를 결합시키는 경우, 일본 특허 제4607017호 공보 등에 기재된 방법을 들 수 있다. 또한, 예를 들어, 펩티드 프래그먼트의 아스파라긴 잔기의 측쇄 아미드에 당쇄를 결합시키는 경우, 일본 특허 제4119428호 공보 등에 기재된 방법을 들 수 있다. 또한, 당쇄의 제조 방법으로서는, 예를 들어, 국제 공개 제03/008431호에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
펩티드 프래그먼트 및/또는 당쇄 결합 펩티드 프래그먼트를 연결하는 방법으로서는, 펩티드 합성에서 상용되는 방법[예를 들어, 제5판 실험 화학 강좌 16 유기 화합물의 합성 IV: 카르복실산·아미노산·펩티드(일본 화학회 편, 마루젠 가부시키가이샤, 2005년), Chemical Ligation: Tools for Biomolecule Synthesis and Modification(Luca D. DiAndrea 등 저, Wiley, 2017년), Chemoselective and Bioorthogonal Ligation Reactions Volume 1, 2(W.Russ Algar 등 저, Wiley, 2017년) 등에 기재된 방법]을 들 수 있고, C 말단을 티오에스테르로 한 펩티드 프래그먼트와, N 말단이 시스테인 잔기인 다른 펩티드 프래그먼트와의 네이티브 케미컬 라이게이션(NCL)법이 바람직하다.
펩티드 프래그먼트 및/또는 당쇄 결합 펩티드 프래그먼트의 연결은 임의의 개소에서 행할 수 있지만, NCL법을 사용하는 경우에는, C 말단측 펩티드 프래그먼트의 N 말단 아미노산 잔기로서는 시스테인 잔기 및 알라닌 잔기가 바람직하고, 보다 바람직하게는 시스테인 잔기이다.
펩티드 프래그먼트 및/또는 당쇄 결합 펩티드 프래그먼트를 연결하는 방법으로서는, 구체적으로는 예를 들어, C 말단측 프래그먼트의 N 말단 아미노산 잔기로서 알라닌 잔기를 사용하는 경우에는, 통상적인 방법[Chemical Ligation: Tools for Biomolecule Synthesis and Modification(Luca D. DiAndrea 등 저, Wiley, 2017년) 등에 기재된 방법]에 따라서, 알라닌 잔기를 시스테인으로 잔기와 치환한 C 말단측 펩티드 프래그먼트와 N 말단측 펩티드 티오에스테르 프래그먼트를 NCL법에 의해 연결한 후에 탈황 반응에 의해 시스테인 잔기를 알라닌으로 잔기와 변환하는 방법을 들 수 있다.
당쇄 결합 펩티드를 폴딩하는 방법으로서는, 예를 들어, 펩티드의 폴딩에서 상용되는 방법[예를 들어, 제5판 실험 화학 강좌 16 유기 화합물의 합성 IV: 카르복실산·아미노산·펩티드(일본 화학회 편, 마루젠 가부시키가이샤, 2005년), Chemical Ligation: Tools for Biomolecule Synthesis and Modification(Luca D. DiAndrea 등 저, Wiley, 2017년) 등에 기재된 방법]을 들 수 있다.
(발현법에 의한 당쇄 결합 IL-2 개변체의 제조)
발현법에 있어서는, 당쇄 결합 IL-2 개변체는, 종래 공지된 방법에 따라서, 예를 들어, 폴리메라아제 연쇄 증폭 반응(PCR), 플라스미드 DNA의 조제, 제한 효소에 의한 DNA의 절단, 올리고뉴클레오티드의 조제, DNA의 라이게이션, mRNA의 단리, 적절한 숙주 세포로의 DNA의 도입에 의한 형질 전환체의 취득, 형질 전환체의 배양을 포함하는 재조합 DNA법, 및 화학 수식에 의한 당쇄 도입에 의해 제조할 수 있다.
당쇄 결합 IL-2 개변체는, 예를 들어, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 당쇄가 결합할 수 있는 아미노산 잔기를 포함하도록 변이가 도입된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 발현 카세트를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 숙주 세포에 해당 발현 벡터를 도입하고, 얻어진 단백질에 화학 수식으로 당쇄를 결합시킴으로써, 당쇄 결합 IL-2 개변체를 얻을 수 있다.
상기 발현 벡터의 제작에 사용하는 야생형 IL-2를 코딩하는 염기 서열로서는, NCBI 수탁 No. NM_000586으로 표현되는 염기 서열로부터 시그널 서열을 코딩하는 염기 서열을 제외한 염기 서열, 서열 번호 1에 기재되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열 등을 들 수 있다.
IL-2를 코딩하는 염기 서열은, 인공 유전자 합성이나, 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ) 등 유전자 뱅크에 등록된 서열로부터 적당한 프라이머를 설계하고, 당해 동물의 세포 또는 조직 등으로부터 추출한 mRNA로부터 RT-PCR을 행함으로써 취득할 수 있다.
또한, 당쇄 결합 IL-2 개변체는, 상기 발현 벡터를 목적으로 하는 당쇄를 생합성할 수 있는 숙주 세포에 도입함으로써 얻을 수도 있다.
상기 발현 벡터는, 구체적으로는 예를 들어, 상기 변이가 도입된 IL-2를 코딩하는 염기 서열을 원하는 위치(예를 들어, 5'말단)에 삽입한 발현에 적합한 벡터 중의 프로모터의 하류에 연결함으로써, 발현 벡터를 얻을 수 있다. 당해 발현 벡터는, 숙주에 맞춰서 분비 시그널을 갖고 있어도 된다.
당쇄가 결합할 수 있는 아미노산 잔기를 포함하도록 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 부위 특이적으로 변이를 도입하는 방법으로서는, 공지된 방법을 사용할 수 있다(미국 특허 출원 공개 제2004/0171154호 명세서; Storici et al, 2001, Nature Biotechnology, 19, p.773-776: Kren et al, 1998, Nat. Med., vol.4, p.285-290; Calissano and Macino, 1996, Fungal Genet. News lett., Vol.43, p.15-16). 또한, 부위 특이적인 변이의 도입에는, 시판하고 있는 키트를 사용해도 된다.
구체적으로는, 예를 들어, 당쇄가 결합할 수 있는 아미노산 잔기로서 시스테인 잔기를 사용하는 경우, 야생형 IL-2의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 IL-2 개변체는, 미국 특허 제5206344호 명세서, 국제 공개 제2016/025385호 등에 기재된 방법에 따라서 조제할 수 있고, 해당 IL-2 개변체로의 당쇄의 결합은, 일본 특허 제4607017호 공보에 기재된 방법에 따라서 행할 수 있다.
IL-2를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 영역은, 5'말단에 번역 개시 코돈을 갖고, 또한 3'말단에는 번역 시종 코돈을 갖고 있어도 된다. 또한, IL-2를 코딩하는 염기 서열을 발현시키기 위해서는, 그의 상류에 프로모터를 접속하는 것이 바람직하다.
프로모터로서는, 유전자의 발현에 사용하는 숙주에 대응한 프로모터이면 특별히 제한되지 않는다. 형질 전환하는 숙주가 고초균일 경우에는, 예를 들어, SP01, SP02 및 PenP 프로모터를 들 수 있다. 숙주가 효모인 경우에는, 예를 들어, PH05, PGK, GAP 및 ADH 프로모터를 들 수 있다. 숙주가 대장균인 경우에는, trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터 등을 들 수 있다. 숙주가 동물 세포인 경우에는, 예를 들어, SV40 유래의 프로모터 및 레트로바이러스의 프로모터를 들 수 있다.
IL-2 단백질은 이. 콜라이 내에서 시그널 서열을 수반하지 않고 발현시킬 수도 있고, 해당 단백질은, 봉입체로부터 회수하고, 활성 형태로 리폴딩시킬 수 있다. 이러한 발현계는 미국 특허 제7105653호 명세서에 기재되어 있다.
시그널 서열을 사용하여, IL-2 단백질의 발현을 용이하게 할 수도 있다. 포유 동물 세포의 시그널 서열로서는, 예를 들어, 천연 인간 IL-2 시그널 서열, TCR 코딩 서열과 상동의 시그널 서열, 마우스 IL-2 코딩 서열과 상동의 시그널 서열을 들 수 있다. 또한, 다른 적절한 시그널 서열/숙주 세포쌍으로서는, 예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 내에서 분비되게 하기 위한 비. 서브틸리스 sacB 시그널 서열, 및 피. 파스토리스(P. pastoris)에 의한 분비를 위한 사카로미세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) α 접합 인자 시그널 서열, 또는 피. 파스토리스산 포스파타아제 phoI 시그널 서열을 포함한다. 시그널 서열은, 시그널 펩티다아제 절단 부위를 코딩하는 서열을 통하여, 단백질 코딩 서열에 직접 접속할 수도 있고, 짧은 뉴클레오티드 가교를 통하여 접속할 수도 있다.
진핵 생물 단백질 발현계의 전사 및 번역을 증강하기 위한 엘리먼트를 사용해도 되고, 예를 들어, 이종 프로모터의 양측 1000bp의 위치에, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 프로모터를 두는 것에 의해, 식물 세포 내의 전사 레벨을, 10 내지 400배 높일 수 있다.
숙주 세포로서는, 특별히 한정되지 않고 원핵 세포 및 진핵 세포를 들 수 있다. 바람직한 숙주 세포로서는, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtillus) 등의 원핵 세포, 그리고 HEK, J558, NSO, SP2-O, CHO, COS, KB, NIH3T3, BALB/c3T3, 탯줄 정맥 내피 세포 등의 동물 세포 및 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 등의 효모주 및 Sf9 또는 Tn 등의 곤충 세포를 들 수 있다.
숙주 세포는, 목적으로 하는 당쇄의 생합성을 할 수 있도록 개변된 것이어도 된다.
숙주의 형질 전환은, 각각의 숙주에 대하여 일반적으로 행하여지고 있는 방법 또는 적응 가능한 방법이면 된다. 예를 들어, 숙주가 대장균이나 효모이면, 리튬법 등으로 제작한 적격 세포에 재조합 DNA를 포함하는 발현 벡터를 온도 쇼크법 또는 일렉트로포레이션법에 의해 도입한다. 숙주가 동물 세포이면, 증식기 등의 세포에 재조합 DNA를 포함하는 발현 벡터를 인산칼슘법, 리포펙션법 또는 일렉트로포레이션법에 의해 도입한다.
이와 같이 하여 얻어진 형질 전환체는, 각각의 숙주에 일반적으로 사용되고 있는 배지, 혹은 적용 가능한 배양액을 사용하여 배양하여 단백질을 발현시키고, 필요에 따라 추가로 화학 수식으로 당쇄를 결합시킴으로써, 당쇄 결합형 IL-2 단백질을 제조할 수 있다. 배양액으로서는, 예를 들어, 숙주가 대장균일 경우에는 LB 배지 등의 배양액, 숙주가 효모일 경우에는 YPD 배지 등의 배양액, 숙주가 동물 세포일 경우에는 Dulbecco's MEM에 소태아혈청을 첨가한 배양액을 들 수 있다.
배양은, 각각의 숙주에 대하여 일반적으로 사용되고 있는 조건 혹은 적용 가능한 조건이면 된다. 예를 들어, 숙주가 효모이면, 약 25 내지 37℃에서 약 12시간 내지 2주일 배양을 행하고, 필요에 따라, 통기나 교반을 가할 수 있다. 숙주가 동물 세포인 경우에는, 37℃에서, 5％ 탄산 가스, 100％ 습도의 조건에서 약 24시간 내지 2주일 배양을 행하고, 필요에 따라, 기상의 조건을 변화 또는 교반해도 된다.
[PEG 결합 IL-2 개변체]
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 4, 5, 6, 7, 8, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 PEG가 결합하고 있는 개변체가 바람직하고, 78 및 129번째의 적어도 한쪽의 아미노산 잔기에 PEG가 결합하고 있는 IL-2 개변체가 보다 바람직하다.
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 4, 5, 6, 7, 8, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체가 바람직하고, 78 및 129번째의 적어도 한쪽의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체가 보다 바람직하다.
본 실시 형태에 있어서, 야생형 IL-2의 아미노산 서열은, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손된 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손되고 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열 혹은 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손된 아미노산 서열, 및 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손되고 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열에 있어서, 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기 또는 알라닌 잔기로 치환한 아미노산 서열이 보다 바람직하다.
「PEG」란, 「-(CH2CH2O)n-」(n은 2 이상)으로 표시되는 에틸렌글리콜이 중합한 구조를 포함하는 수용성 폴리머인, 폴리(에틸렌글리콜) 분자이다. PEG로서는, PEG4, 평균 분자량 10kDa 이상의 것이 바람직하고, 예를 들어, 평균 분자량 10kDa, 20kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa, 80kDa, 90kDa, 100kDa, 200kDa 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다. 또한 PEG의 형상으로서는, 직쇄상이어도 되고, 분지쇄상이어도 되지만, 이들에 한정되지 않는다. IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 상기 아미노산 잔기에 PEG를 화학적으로 결합시킴으로써, IL-2Rαβγ에 대한 선택성을 향상시킬 수 있다. IL-2Rαβγ에 대한 선택성을 향상시킨 IL-2 개변체에 의해, Treg를 선택적으로 활성화시킬 수 있다.
PEG가 결합한 아미노산 잔기로서는, 예를 들어 PEG가 결합한 시스테인 잔기 및 비천연 아미노산 잔기를 들 수 있다.
PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기로서는, 예를 들어, PEG가 결합한 티올기를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기 그리고 PEG가 결합한 아지드기를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기를 들 수 있다. 티올기를 갖는 아미노산 잔기로서는, 구체적으로는 예를 들어, 아세틸시스테인, 호모시스테인 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 아지드기를 갖는 아미노산 잔기로서는, 구체적으로는 예를 들어, o-Az-Z-Lys 잔기, m-Az-Z-Lys 잔기, N6-디아조리신, p-아지드페닐알라닌을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 비천연 아미노산 잔기로서는, 이외에, 국제 공개 제2017/030156호, [Nature. 2017 Nov 29; 551(7682): 644-647.], 국제 공개 제2013/068874호, 미국 출원 공개 제2014/0046030호 명세서, [Bioconj. Chem., 2014, 25(2), pp351-361], 국제 공개 제2014/044872호, [Bioconj. Chem. 2015 Nov 18; 26(11): 2249-60], 국제 공개 제2014/124258호, [Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28; 108(26): 10437-42] 등에 기재되는 비천연 아미노산 잔기여도 된다. PEG와 상기 비천연 아미노산 잔기란, 링커를 통하여 결합하고 있어도 된다. 당해 링커는 PEG나 비천연 아미노산 잔기의 종류에 따라 적절히 변경할 수 있다.
상기 o-Az-Z-Lys 잔기는, 하기 (식 10)으로 표시되는 구조를 갖는 아미노산 잔기이다.
Figure pct00069
상기 m-Az-Z-Lys 잔기는, 하기 (식 XX1)로 표시되는 구조를 갖는 아미노산 잔기이다.
Figure pct00070
PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기 또는 PEG가 결합한 m-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기란, o-Az-Z-Lys 잔기 또는 m-Az-Z-Lys의 아지드기에 아세틸렌을 반응시켜서 생긴 링커를 통하여, PEG가 결합한 구조를 들 수 있다. 아세틸렌으로서는, 예를 들어, 디벤질시클로옥틴(DBCO), 비시클로[6.1.0]노닌(BCN) 등을 들 수 있다. 또한, 아세틸렌 대신에 [J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, pp8820], [Org. Lett. 2000, 2, pp2141], [Org. Lett. 2000, 2, pp1939.] 등에 기재된 방법에 따라서, 아미드 결합을 통하여, PEG가 결합한 구조 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기 또는 m-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기는, 구체적으로는 예를 들어, 하기 (식 11) 및/또는 (식 12), 또는 하기 (식 Y4) 및/또는 (식 Y5)로 표시되는 구조를 들 수 있다.
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
식 중 PEG로서는, PEG의 평균 분자량이나 구조에 따라 다양한 PEG를 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들어, 하기 (식 13), 평균 분자량 20kDa인 경우의 하기 식 (14), 평균 분자량 30kDa인 경우의 하기 식 (14), 평균 분자량 40kDa인 경우의 하기 (식 X0), 평균 분자량 50kDa인 경우의 하기 (식 15), 평균 분자량 40kDa인 경우의 하기 (식 16), 평균 분자량 80kDa인 경우의 하기 (식 16), 평균 분자량 40kDa인 경우의 하기 (식 X1), 평균 분자량 80kDa인 경우의 하기 (식 X2) 또는 평균 분자량 40kDa인 경우의 하기 (식 X3)으로 표시되는 구조를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 식 중 PEG가 하기 (식 X3)으로 표시되는 경우, O(CH2CH2O)nCH3의 4 분지쇄에 한하지 않고, 2 분지쇄 또는 3 분지쇄의 것도 마찬가지로 사용할 수 있다.
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기란, 구체적으로는 예를 들어, 시스테인 잔기의 티올기에 말레이미드를 반응시켜서 생긴 링커를 통하여 PEG가 결합한 하기 (식 Y6) 및/또는 (식 Y7) 및/또는 (식 Y8)로 표시되는 구조, 시스테인 잔기의 티올기에 할로아세틸기를 반응시켜서 생긴 링커를 통하여 PEG가 결합한 하기 (식 Y9)로 표시되는 구조 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
Figure pct00083
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
식 중 PEG란, 구체적으로는 예를 들어, 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X7) 또는 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X7) 또는 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X8)로 표시되는 구조를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
Figure pct00087
Figure pct00088
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, 이하에 기재하는 IL-2 개변체가 바람직하다.
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, 예를 들어 IL-2에 하나의 PEG가 결합한, 이하에 기재하는 IL-2 개변체를 들 수 있다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 4번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 5번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 6번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 7번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 8번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 60번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 78번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 79번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 99번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 100번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 101번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 129번째의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
상기 IL-2 개변체에 있어서, 결합하는 PEG의 크기로서는, 평균 분자량 20kDa 이상의 PEG가 바람직하고, 예를 들어 평균 분자량 20, 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80kDa의 PEG를 들 수 있다.
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, 예를 들어 IL-2에 하나의 PEG가 결합한, 이하에 기재하는 IL-2 개변체도 들 수 있다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 4번째의 아미노산 잔기가, 평균 분자량 20kDa 또는 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 5번째의 아미노산 잔기가, 평균 분자량 20kDa 또는 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 6번째의 아미노산 잔기가, 평균 분자량 20kDa 또는 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 7번째의 아미노산 잔기가, 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 8번째의 아미노산 잔기가, 평균 분자량 20kDa 또는 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 60번째의 아미노산 잔기가, 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 78번째의 아미노산 잔기에 평균 분자량 20kDa 또는 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14), 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X0), 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 15), 평균 분자량 40kDa 또는 80kDa인 경우의 (식 16), 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X1), 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X2) 또는 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X3)으로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 79번째의 아미노산 잔기가, 평균 분자량 20kDa 또는 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 99번째의 아미노산 잔기가, 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 100번째의 아미노산 잔기가, 평균 분자량 20kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 101번째의 아미노산 잔기가, 평균 분자량 20kDa 또는 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 129번째의 아미노산 잔기에 (식 13), 혹은 평균 분자량 20kDa 또는 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14), 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X0), 평균 분자량 40kDa 또는 80kDa인 경우의 (식 16), 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X1), 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X2), 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 15) 또는 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X3)으로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 129번째의 아미노산 잔기가, 40kDa인 경우의 (식 16)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 129번째의 아미노산 잔기가, 평균 분자량 40kDa 또는 80kDa인 경우의 (식 X7) 및/또는 (식 X8)로 표시되는 PEG가 결합하고 스테인 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, IL-2에 적어도 2개의 PEG가 결합한 이하에 기재하는 IL-2 개변체가 바람직하다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 4번째 및 78번째의 아미노산 잔기가, 각각 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 5번째 및 78번째의 아미노산 잔기가, 각각 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 8번째 및 78번째의 아미노산 잔기가, 각각 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 78번째 및 79번째의 아미노산 잔기가, 각각 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 78번째 및 99번째의 아미노산 잔기가, 각각 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 78번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 4번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 5번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 8번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 79번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 99번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환된 IL-2 개변체.
상기 IL-2 개변체에 있어서, 결합하는 PEG의 크기로서는, 평균 분자량 20kDa 이상의 PEG가 바람직하고, 예를 들어 평균 분자량 20, 30, 40, 50, 60, 70, 혹은 80kDa의 PEG를 들 수 있다.
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, IL-2에 적어도 2개의 PEG가 결합한, 이하에 기재하는 IL-2 개변체도 바람직하다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 4번째 및 78번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 4번째 및 78번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X0)으로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 4번째 및 78번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 15)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 5번째 및 78번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 5번째 및 78번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X0)으로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 8번째 및 78번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14), 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X0)으로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 78번째 및 79번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 78번째 및 99번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 78번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 4번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14), 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X0) 또는 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 15)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 5번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14), 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X0) 또는 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 15)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 8번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14), 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X0) 또는 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 15)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 79번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 99번째 및 129번째의 아미노산 잔기가, 각각 평균 분자량 30kDa인 경우의 (식 14)로 표시되는 PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기로 치환된 IL-2 개변체.
본 실시 형태에 있어서, 야생형 IL-2의 아미노산 서열은, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손된 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손되고 또한 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열 혹은 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손된 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손되고 또한 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열에 있어서, 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기 또는 알라닌 잔기로 치환한 아미노산 서열이 바람직하다.
[PEG 결합 IL-2 개변체의 제조법]
PEG 결합 IL-2 개변체의 제조 방법으로서는, 화학 합성법과 발현법을 들 수 있다. PEG 결합 IL-2 개변체는, 화학 합성법 및 발현법의 조합에 의해 제조되어도 된다. 이하, 각 방법에 대하여 설명한다.
(화학 합성법에 의한 PEG 결합 IL-2 개변체의 제조)
화학 합성법에 의한 PEG 결합 IL-2 개변체의 제조 방법으로서는, 예를 들어, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 PEG 도입 위치의 아미노산 잔기를 단백질의 부위 특이적인 PEG화를 가능하게 하는 화학적 반응성을 갖는 아미노산 잔기로 치환한 펩티드를 화학 합성한 후에, 폴딩시켜서 얻어지는 IL-2 개변체에 대하여 PEG를 결합시켜서 PEG 결합 IL-2 개변체를 제조하는 방법, 및 PEG 결합 펩티드 프래그먼트를 화학 합성한 후에 폴딩시킴으로써 PEG 결합 IL-2 개변체를 제조하는 방법을 들 수 있다.
PEG 결합 펩티드 프래그먼트는, 펩티드 프래그먼트에 있어서의 단백질의 부위 특이적인 PEG화를 가능하게 하는 화학적 반응성을 갖는 아미노산 잔기에 PEG를 도입하는 방법에 의해 제조할 수 있다.
PEG 결합 펩티드 프래그먼트를 화학 합성한 후에 폴딩시키는 방법으로서는, 적어도 하나 이상의 PEG 결합 펩티드 프래그먼트와 펩티드 프래그먼트를 순차 연결시킨 후에 폴딩하는 방법, 또는 화학 합성한 IL-2 전체 길이 펩티드 프래그먼트에 대하여 PEG를 도입한 후에 폴딩시키는 방법 등을 들 수 있다.
펩티드 프래그먼트를 합성하는 방법, 및 펩티드 프래그먼트를 순차 연결시킨 후에 폴딩시키는 방법으로서는, 예를 들어, (화학 합성법에 의한 당쇄 결합 IL-2 개변체의 제조)의 항에 있어서 상기한 방법과 마찬가지의 방법을 들 수 있다.
야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 PEG 도입 위치의 아미노산 잔기를 단백질의 부위 특이적인 PEG화를 가능하게 하는 화학적 반응성을 갖는 아미노산 잔기로 치환한 펩티드를 합성한 뒤, 폴딩에 의해 얻어지는 IL-2 개변체에 대하여 PEG를 도입하는 방법으로서는, 예를 들어, 미국 특허 제5206344호 명세서, 국제 공개 제2012/065086호에 기재된 방법을 들 수 있다. 또한, 펩티드 프래그먼트에 있어서의 단백질의 부위 특이적인 PEG화를 가능하게 하는 화학적 반응성을 갖는 아미노산 잔기에 PEG를 도입하는 방법으로서는 [Biomaterials 22(2001) 405-417], [Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 25831-25864], [J. Pharm. Sci., 105(2016) 460-475]에 기재된 방법을 들 수 있다.
단백질의 부위 특이적인 PEG화를 가능하게 하는 화학적 반응성을 갖는 아미노산 잔기로서는, 예를 들어, 티올기를 갖는 아미노산 잔기 그리고 아지드기를 갖는 아미노산 잔기를 들 수 있다. 티올기를 갖는 아미노산 잔기로서는, 예를 들어, 시스테인, 아세틸시스테인, 호모시스테인 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
아지드기를 갖는 아미노산 잔기로서는, 예를 들어, o-Az-Z-Lys 잔기, m-Az-Z-Lys 잔기, N6-아지드리신, p-아지드페닐알라닌을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 다른 것은, 국제 공개 제2017/030156호, [Nature. 2017 Nov 29; 551(7682): 644-647.], 국제 공개 제2013/068874호, 미국 특허 출원 공개 제2014/0046030호 명세서, [Bioconj. Chem., 2014, 25(2), pp351-361], 국제 공개 제2014/044872호, [Bioconj. Chem. 2015 Nov 18; 26(11): 2249-60], 국제 공개 제2014/124258호, [Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28; 108(26): 10437-42]에 기재되는 비천연 아미노산 잔기여도 된다. PEG와 상기 비천연 아미노산 잔기란, 링커를 통하여 결합하고 있어도 된다.
상기 링커란, 탄소수 1 내지 20의 탄화수소기이며, 탄소가 산소, 질소, 황 등으로 수식되어 있어도 되고, 또한 탄소가 산소, 질소, 황으로 치환되어 있어도 된다. 당해 링커는 PEG나 비천연 아미노산 잔기의 종류에 따라 적절히 변경할 수 있다.
화학 합성법으로서는, 구체적으로는 예를 들어, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 PEG 도입 위치의 아미노산 잔기를, 시스테인 등 티올기를 갖는 아미노산 잔기 및/또는 o-Az-Z-Lys 잔기 등 아지드기를 갖는 아미노산 잔기로 치환한 펩티드를 화학 합성한 뒤, 폴딩에 의해 얻어지는 IL-2 개변체에 대하여 PEG를 도입하여 PEG 결합 IL-2 개변체를 제조하는 방법을 들 수 있다. 시스테인 잔기를 도입한 IL-2 개변체에 PEG를 결합시키는 방법으로서는, 미국 특허 제5206344호 명세서에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
또한, 구체적으로는 예를 들어, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 PEG 도입 위치의 아미노산 잔기를, 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기로 치환한 펩티드를 화학 합성한 뒤, 폴딩에 의해 얻어지는 IL-2 개변체에 대하여 PEG를 도입하여 PEG 결합 IL-2 개변체를 제조하는 방법을 들 수 있다.
PEG 결합 IL-2 개변체의 합성에는, 하기 (식 XX2)로 표시되는 PEG 시약을 사용할 수 있다.
Figure pct00089
식 중, X는, 티올기와 반응성을 갖는 관능기, 아지드기와 반응성을 갖는 관능기, N 말단 아미노기와 선택적으로 반응하는 관능기를 나타낸다.
티올과 반응성을 갖는 관능기로서는, 구체적으로는 예를 들어, 티올기, 말레이미드기, 아크릴기, 요오도아세틸기, 브로모아세틸기, 클로로아세틸기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 요오도아세틸기, 말레이미드기가 좋다.
아지드와 반응성을 갖는 관능기로서는, 구체적으로는 예를 들어, 아세틸렌기, DBCO기, DBN기, 중원환 구조 상에 헤테로 원자를 포함하는 시클로알킨(Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 1190-1194), 티오에스테르기 등을 들 수 있고, 바람직하게는 DBCO를 들 수 있다.
N 말단 아미노기와 선택적으로 반응하는 관능기로서는, 구체적으로는 예를 들어 알데히드 등을 들 수 있다.
식 중, Linker로서는, 탄소수 1 내지 20의 탄화수소기이며, 탄소가 산소, 질소, 황 등으로 수식되어 있어도 되고, 탄소가 산소, 질소, 황으로 치환되어 있어도 된다.
식 중, n은 0 또는 1을 나타낸다.
식 중, PEG란, 「-(CH2CH2O)m-」(m은 2 이상)로 표현되는 에틸렌글리콜이 중합한 구조를 포함하는 수용성 폴리머인, 폴리(에틸렌글리콜) 분자이다. PEG의 분자량은, 예를 들어, PEG4, 평균 분자량 20kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa, 80kDa, 90kDa, 100kDa, 또는 200kDa 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다. 또한 PEG의 형상으로서는, 직쇄상이어도 되고, 분지쇄상이어도 되지만, 이들에 한정되지 않는다.
사용하는 PEG 시약에 의해, 입체 이성체, 광학 이성체, 기하 이성체 등이 형성되는 경우가 있지만, 이들 이성체는 공지된 방법으로 분리하여 사용해도 되고, 혼합물로서 사용해도 된다. 얻어지는 IL-2 개변체는 거대 분자이기 때문에 이들 부분 구조의 이성체의 구조적 상이는 거의 영향을 미치지 않는 것으로 생각된다.
상기 PEG 시약은, 시판하고 있는 PEG 시약 이외에도, 시판하고 있는 PEG 시약으로부터 조제한 PEG 시약을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 말단에 카르복실기나 N-히드록시숙신이미드에스테르 등의 카르복실산 등가체를 갖는 PEG 시약에 대하여 티올기 또는 아지드기와 반응성을 갖는 아민을 축합시킴으로써, PEG 시약을 조제할 수 있다. 또한, 말단에 아미노기를 갖는 PEG 시약에 대하여 티올기 또는 아지드기와 반응성을 갖는 카르복실기나 N-히드록시숙신이미드에스테르 등의 카르복실산 등가체를 축합하는 것 등에 의해서도 합성할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
(발현법에 의한 PEG 결합 IL-2 개변체의 제조)
발현법에 의한 PEG 결합 IL-2 개변체의 제조 방법으로서는, 예를 들어, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 PEG 도입 위치의 아미노산 잔기를 단백질의 부위 특이적인 PEG화를 가능하게 하는 화학적 반응성을 갖는 아미노산 잔기로 치환한 IL-2 개변체를 대장균 등의 숙주 세포에 의해 발현시킨 후에, 해당 IL-2 개변체에 있어서의 해당 아미노산 잔기에 화학 수식에 의해 PEG를 결합시킴으로써 PEG 결합 IL-2 개변체를 제조하는 방법을 들 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어, (발현법에 의한 당쇄 결합 IL-2 개변체의 제조)의 항에 있어서 상기한 방법과 마찬가지로 하여, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 PEG 도입 위치에, 단백질의 부위 특이적인 PEG화를 가능하게 하는 화학적 반응성을 갖는 아미노산 잔기로의 치환이 도입된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 발현 카세트를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 대장균 등의 숙주 세포에 도입하여 형질 전환체를 얻고, 해당 형질 전환체에 IL-2 개변체를 발현시키고, 해당 IL-2 개변체의 시스테인 잔기 또는 비천연 아미노산 잔기에 화학 수식에 의해 PEG를 결합시킴으로써, PEG 결합 IL-2 개변체를 얻는 방법을 들 수 있다.
대장균을 숙주 세포로 하는 경우, 발현 효율 또는 제작한 단백질의 정제 등을 위해서, 야생형 IL-2의 N 말단에 링커를 도입하여 발현 카세트를 구성해도 된다. 해당 링커로서는, 예를 들어, 메티오닌 잔기, 8개의 폴리히스티딘, 및 메티오닌 잔기를 포함하는 8개의 폴리히스티딘 등을 들 수 있다.
IL-2의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 IL-2 개변체의 조제 방법으로서는, 예를 들어, 미국 특허 제5206344호 명세서, 국제 공개 제2016/025385호 등에 기재된 방법을 들 수 있다.
IL-2의 아미노산 잔기를 단백질의 부위 특이적인 PEG화를 가능하게 하는 화학적 반응성을 갖는 비천연 아미노산 잔기로 치환한 IL-2 개변체의 조제 방법으로서는, 국제 공개 제2017/030156호, [Nature. 2017 Nov 29; 551(7682): 644-647.], 국제 공개 제2013/068874호, 미국 특허 출원 공개 제2014/0046030호 명세서, [Bioconj. Chem.,2014, 25(2), pp351-361], 국제 공개 제2014/044872호, [Bioconj. Chem. 2015 Nov 18; 26(11): 2249-60], 국제 공개 제2014/124258호, [Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28; 108(26): 10437-42]에 기재되는 방법을 들 수 있다.
또한, IL-2의 아미노산 잔기를 o-Az-Z-Lys 잔기 또는 m-Az-Z-Lys 잔기 o-Az-Z-Lys 잔기로 치환한 IL-2 개변체의 제조 방법, 및 당해 IL-2 개변체에 PEG를 결합시키는 방법으로서는, 예를 들어, 국제 공개 제2017/030156호에 기재된 방법을 들 수 있다.
IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 PEG 도입 위치의 아미노산 잔기를 단백질의 부위 특이적인 PEG화를 가능하게 하는 화학적 반응성을 갖는 아미노산 잔기로 치환한 IL-2 개변체 대하여 PEG를 도입하는 방법으로서는, 일본 특허 제5206344호 공보, 국제 공개 제2012/065086호, 국제 공개 제2017/030156호, [Nature. 2017 Nov 29; 551(7682): 644-647.], 국제 공개 제2013/068874호, 미국 출원 공개 제2014/0046030호 명세서, [Bioconj. Chem., 2014, 25(2), pp351-361], 국제 공개 제2014/044872호, [Bioconj. Chem. 2015 Nov 18; 26(11): 2249-60], 국제 공개 제2014/124258호, [Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28; 108(26): 10437-42]에 기재된 방법 등에 따라서 PEG를 도입할 수 있다.
[당쇄 결합 IL-2 개변체 또는 PEG 결합 IL-2 개변체에, 추가로 PEG 또는 당쇄를 결합시킨 IL-2 개변체, 및 그의 제조 방법]
상술한 당쇄 결합 IL-2 개변체는, 추가로 PEG가 결합하고 있어도 된다. 또한, 상술한 PEG 결합 IL-2 개변체도, 추가로 당쇄가 결합하고 있어도 된다. 이들 IL-2 개변체는, 상술한 [당쇄 결합 IL-2 개변체의 제조 방법], 및 [PEG 결합 IL-2 개변체의 제조 방법]을 조합하여 제조할 수 있다. 또한, 국제 공개 제2012/065086호 등에 따라서, N 말단의 아미노기에 선택적으로 PEG를 도입할 수도 있다.
PEG 결합 IL-2 개변체에 대하여 추가로 당쇄를 도입하는 경우, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 당쇄가 결합하고 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체가 바람직하고, 12, 115 및 119번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 당쇄가 결합하고 있는 IL-2 개변체가 보다 바람직하다.
당쇄 결합 IL-2 개변체에 대하여 추가로 PEG를 도입하는 경우, 야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 51, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체가 바람직하고, 1, 3, 51 및 78번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 IL-2 개변체가 보다 바람직하다.
PEG가 결합한 아미노산 잔기로서는, 예를 들어 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기, N 말단 아미노산 잔기 유래의 기 및 비천연 아미노산 잔기를 들 수 있다.
시스테인 잔기 유래의 기 또는 N 말단 아미노산 잔기 유래의 기란, 시스테인 잔기의 측쇄 티올기 또는 N 말단 아미노산 잔기의 주쇄 아미노기에 화학 수식 등에 의해 PEG가 결합한 기를 말한다. PEG와, 시스테인 잔기 유래의 기 또는 N 말단 아미노산 잔기 유래의 기란, 링커를 통하여 결합하고 있어도 된다. 당해 링커는 PEG나 비천연 아미노산 잔기의 종류에 따라 적절히 변경할 수 있다.
PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기로서는, 예를 들어 티올기를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기 또는 아지드기를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기에 화학 수식 등에 의해 PEG가 결합한 기 등을 들 수 있다. 티올기를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기로서는, 예를 들어, PEG가 결합한 아세틸시스테인 잔기 유래의 기, PEG가 결합한 호모시스테인 잔기 유래의 기 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
PEG가 결합한 아지드기를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기로서는, 예를 들어, PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기, PEG가 결합한 m-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기, PEG가 결합한 N6-디아조리신 잔기 유래의 기, PEG가 결합한 p-아지드페닐알라닌 잔기 유래의 기 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
비천연 아미노산 잔기로서는, 이외에, 국제 공개 제2017/030156호, [Nature. 2017 Nov 29; 551(7682): 644-647.], 국제 공개 제2013/068874호, 미국 출원 공개 제2014/0046030호 명세서, [Bioconj. Chem., 2014, 25(2), pp351-361], 국제 공개 제2014/044872호, [Bioconj. Chem. 2015 Nov 18; 26(11): 2249-60], 국제 공개 제2014/124258호, [Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jun 28; 108(26): 10437-42] 등에 기재되는 비천연 아미노산 잔기여도 된다. PEG와 상기 비천연 아미노산 잔기란, 링커를 통하여 결합하고 있어도 된다. 당해 링커는 PEG나 비천연 아미노산 잔기의 종류에 따라 적절히 변경할 수 있다.
야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 1번째의 아미노산 잔기를, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환하는 경우, PEG가 결합한 N 말단 아미노산 잔기 유래의 기, PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기, PEG가 결합한 아세틸시스테인 잔기 유래의 기, PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기, PEG가 결합한 m-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기가 바람직하고, PEG가 결합한 N 말단 아미노산 잔기 유래의 기, PEG가 결합한 아세틸시스테인 잔기 유래의 기가 보다 바람직하다.
야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 51, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환하는 경우, PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기, PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기, PEG가 결합한 m-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기가 바람직하고, PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기가 보다 바람직하다.
PEG가 결합한 N 말단 아미노산 잔기 유래의 기란, 구체적으로는 예를 들어, 알라닌 잔기의 주쇄 아미노기에 대하여 알데히드를 반응시켜서 생긴 링커를 통하여 PEG가 결합된 하기 (식 Z0)으로 표시되는 구조 등을 들 수 있다.
Figure pct00090
식 중 PEG란, 구체적으로는 예를 들어, 평균 분자량 20kDa인 경우의 하기 (식 X00)으로 표시되는 구조를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
Figure pct00091
PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기란, 구체적으로는 예를 들어, 시스테인 잔기의 측쇄 티올기에 대하여 할로아세틸기를 반응시켜서 생긴 링커를 통하여 PEG가 결합된 하기 (식 X4)로 표시되는 구조, 말레이미드를 반응시켜서 생긴 링커를 통하여 PEG가 결합된 하기 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7) 등을 들 수 있다.
Figure pct00092
Figure pct00093
Figure pct00094
Figure pct00095
식 중 PEG로서 구체적으로는, 평균 분자량 20kDa인 경우의 하기 (식 X11), 평균 분자량이 40kDa인 경우의 하기 (식 X11), 평균 분자량이 40kDa인 경우의 하기 (식 X13), 평균 분자량이 80kDa인 경우의 하기 (식 X13), 평균 분자량이 40kDa인 경우의 하기 (식 X14), 평균 분자량이 80kDa인 경우의 하기 (식 X14), 평균 분자량이 50kDa인 경우의 하기 (식 X15)로 표시되는 구조를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
PEG가 결합한 아세틸시스테인 잔기 유래의 기란, 구체적으로는 예를 들어, 아세틸시스테인 잔기의 측쇄 티올기에 대하여 할로아세틸기를 반응시켜서 생긴 링커를 통하여 PEG가 결합된 하기 (식 XX3)으로 표시되는 구조, 말레이미드를 반응시켜서 생긴 링커를 통하여 PEG가 결합된 하기 (식 X8) 및/또는 (식 X9) 및/또는 (식 X10) 등을 들 수 있다.
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
식 중 PEG란, 구체적으로는 예를 들어, 평균 분자량이 40kDa인 경우의 상기 (식 X11), 평균 분자량이 40kDa인 경우의 상기 (식 X13), 평균 분자량이 80kDa인 경우의 상기 (식 X13), 평균 분자량이 80kDa인 경우의 상기 (식 X14), 평균 분자량이 50kDa인 경우의 상기 (식 X15)로 표시되는 구조를 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 IL-2 개변체의 일 실시 형태로서는, 이하에 기재하는 IL-2 개변체가 바람직하다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 11번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 19번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 38번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 91번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 91번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 91번째 및 119번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 91번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 3번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 15번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 3번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 119번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 3번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 91번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 51번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 78번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 119번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 78번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 15번째의 아미노산 잔기가 당쇄가 결합한 아미노산 잔기로 치환되고, 또한 78번째의 아미노산 잔기가 PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 IL-2 개변체.
상술한 본 발명의 PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체에 결합시키는 당쇄, PEG는, 상술한 다양한 것을 조합하여 사용할 수 있다.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 11번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 7)로 표시되는 구조이며, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 (식 X0)에 나타내는 PEG가 결합한 N 말단 아미노산 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X0)의 PEG의 구조가 평균 분자량 20kDa인 경우의 (식 X00)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 7)로 표시되는 구조이며, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 (식 X0)에 나타내는 PEG가 결합한 N 말단 아미노산 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X0)의 PEG의 구조가 평균 분자량 20kDa인 경우의 (식 X00)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 38번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 7)로 표시되는 구조이며, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 (식 X0)에 나타내는 PEG가 결합한 N 말단 아미노산 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X0)의 PEG의 구조가 평균 분자량 20kDa인 경우의 (식 X00)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 91번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 7)로 표시되는 구조이며, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 (식 X0)에 나타내는 PEG가 결합한 N 말단 아미노산 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X0)의 PEG의 구조가 평균 분자량 20kDa인 경우의 (식 X00)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기 및 91번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 (식 XX3)으로 표시되는 PEG가 결합한 아세틸시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 XX3)의 PEG의 구조가 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X13) 또는 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 X15)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기 및 91번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 (식 X8) 및/또는 (식 X9) 및/또는 (식 X10)으로 표시되는 PEG가 결합한 아세틸시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X8) 및/또는 (식 X9) 및/또는 (식 X10)의 PEG의 구조가 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X13), 또는 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 X15), 또는 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X14)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 19번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 (식 XX3)으로 표시되는 PEG가 결합한 아세틸시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 XX3)의 PEG의 구조가 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 X15), 또는 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X13)으로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 91번째 및 119번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 1번째의 아미노산 잔기가 (식 XX3)으로 표시되는 PEG가 결합한 아세틸시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 XX3)의 PEG의 구조가 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 X15)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기 및 91번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 3번째의 아미노산 잔기가 (식 X4)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X4)의 PEG의 구조가 평균 분자량 20kDa인 경우의 (식 X11), 또는 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X11), 또는 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X13), 또는 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X14), 또는 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 X15)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기 및 91번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 3번째의 아미노산 잔기가 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)의 PEG의 구조가 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 X15)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 91번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4)로 표시되는 구조이며, 또한 3번째의 아미노산 잔기가 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)의 PEG의 구조가 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X14)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 91번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 4)로 표시되는 구조이며, 또한 3번째의 아미노산 잔기가 (식 X4)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X4)의 PEG의 구조가 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 X15)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 15번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 3번째의 아미노산 잔기가 (식 X4)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X4)의 PEG의 구조가 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X13) 또는 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 X15)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 15번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 3번째의 아미노산 잔기가 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)의 PEG의 구조가 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X13)으로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기 및 119번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 3번째의 아미노산 잔기가 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)의 PEG의 구조가 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X13), 또는 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X14)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기 및 119번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 3번째의 아미노산 잔기가 (식 X4)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X4)의 PEG의 구조가 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 X15)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기 및 91번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 51번째의 아미노산 잔기가 (식 X4)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X4)의 PEG의 구조가 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X11), 또는 평균 분자량 50kDa인 경우의 (식 X15)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 78번째의 아미노산 잔기가 (식 X4)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X4)의 PEG의 구조가 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X11), 또는 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X13)으로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 78번째의 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)의 PEG의 구조가 평균 분자량 40kDa 또는 80kDa인 경우의 (식 X13), 또는 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X14)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 119번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 78번째의 아미노산 잔기가 (식 X4)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X4)의 PEG의 구조가 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X13)으로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 12번째 및 119번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 78번째의 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X5) 및/또는 (식 X6) 및/또는 (식 X7)의 PEG의 구조가 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X13), 또는 평균 분자량 80kDa인 경우의 (식 X14)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
·야생형 IL-2의 아미노산 서열에 있어서, 15번째의 아미노산 잔기가 (식 1)에 나타내는 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 1)의 Saccharide의 구조가 (식 8)로 표시되는 구조이며, 또한 78번째의 아미노산 잔기가 (식 X4)로 표시되는 PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기로 치환되어 있고, 또한 (식 X4)의 PEG의 구조가 평균 분자량 40kDa인 경우의 (식 X12)로 표시되는 구조인, IL-2 개변체.
본 실시 형태에 있어서, 야생형 IL-2의 아미노산 서열은, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손된 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손되고 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열 혹은 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단에 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손된 아미노산 서열, 및 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단 알라닌 잔기가 결손되고 메티오닌 잔기가 결합한 아미노산 서열에 있어서, 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기 또는 알라닌 잔기로 치환한 아미노산 서열이 바람직하다.
본 발명의 IL-2 개변체에는, 일반적으로 체내 동태를 개선하는 것이 알려져 있는 동태 개선 소자를 결합시킴으로써, 혈중 반감기를 제어할 수 있다. 동태 개선 소자로서는, 당쇄, 펩티드, 단백질, 지질 등을 들 수 있고, [Therapeutic Proteins(Roland Kontermann편, Wiley Blackwell, 2012년)]에 기재된 방법을 조합하여 사용할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 IL-2 개변체의 Treg 세포 증식 활성의 선택성에 영향을 주지 않도록, 시알릴화, HESylation, O-그리코실화, PEG 미믹으로서의 펩티드, 단백질의 융합, 항체의 정상 영역 또는 Fc 영역의 융합, 알부민 등의 혈청 단백질과의 융합(지질 도입하여 알부민과 융합시키는 방법도 포함한다), 또는 인지질, 나노 입자와의 결합, 나노 입자로의 봉중 등의 방법에 의해 혈중 반감기를 제어할 수 있다.
[IL-2 개변체가 갖는 생물 활성의 평가]
IL-2 개변체의 생물 활성은, 당해 기술분야에 있어서의 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 평가할 수 있다. 평가 방법에는 후술하는 실시예에 있어서 기재된 것을 포함한다. IL-2 개변체의 생물 활성을 평가하는 방법으로서는, 구체적으로는 예를 들어, 이하의 (a) 내지 (e)의 방법을 들 수 있다. 이들 방법은, IL-2 개변체의 치료 효과, 효능 및 약역학적 특성의 측정에도 사용할 수 있다.
(a) IL-2 개변체에 의해 자극받는 Treg 세포의 증식 활성을 측정하는 방법
IL-2 개변체 또는 야생형 IL-2를 첨가한 배지에서 Treg 세포를 배양하고, Treg 세포의 증식률을 측정한다. 이외에, Treg 세포의 증식 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, 플로우 사이토메트리에 의해, 혼합 세포 집단 내의 Treg 세포수의 증대를 측정하는 방법, 및 CD4+CD25+FOXP3+ 마커 표현형 또는 CD4+CD25+CD127low 마커 표현형의 존재 비율을 측정하는 방법; 분리한 Treg 세포로의 트리튬화 티미딘의 도입에 의해 측정하는 방법; Ki-67 등의 증식에 관련하는 세포 주기 단백질의 Treg 세포 내의 발현의 증대를 측정하는 방법; Treg 세포 내의 카르복시플루오레세인숙신이미딜에스테르(CFSE) 등의 생체 형광 색소의 세포 분열에 관련하는 희석을 플로우 사이토메트리에 의해 측정하는 방법을 들 수 있다.
(b) IL-2 개변체에 의해 자극받는 NK 세포의 증식 활성을 측정하는 방법
IL-2 개변체 또는 야생형 IL-2를 첨가한 배지에서 NK 세포를 배양하고, NK 세포의 증식률을 측정한다. 이외에, NK 세포의 증식 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, 플로우 사이토메트리에 의해, 혼합 세포 집단 내의 NK 세포수의 증대를 측정하는 방법, 및 CD56+ 마커 표현형의 존재 비율을 측정하는 방법; 분리한 NK 세포로의 트리튬화 티미딘의 도입에 의해 측정하는 방법; Ki-67 등의 증식에 관련하는 세포 주기 단백질의 NK 세포 내의 발현의 증대를 측정하는 방법; NK 세포 내의 CFSE 등의 생체 형광 색소의 세포 분열에 관련하는 희석을 플로우 사이토메트리에 의해 측정하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 IL-2 개변체는, 야생형 IL-2와 비교하여, Treg 증식 활성이 높고/높거나 NK 세포 증식 활성이 낮은 것이 바람직하다. 야생형 IL-2 대신에 야생형 IL-2와 동등한 Treg 증식 활성 및/또는 NK 세포 증식 활성을 갖는 IL-2 개변체를 사용해도 된다.
(c) IL-2 개변체에 의해 자극받은 Treg에 의한 반응자 T 세포(Tresp)의 증식 저해 활성을 측정하는 방법
IL-2 개변체 또는 야생형 IL-2를 첨가한 배지에서 Treg를 배양하고, 이것과 적당한 TCR 자극 존재 하에서 Tresp(CD4+Tresp, CD8+Tresp)와 공배양했을 때의 Tresp의 증식률을 측정하고, 야생형 IL-2와 비교하여 IL-2 개변체에 의한 Tresp의 증식 저해율을 평가한다. 본 발명의 IL-2 개변체는, 야생형 IL-2와 비교하여, 적어도 동등한 Tresp의 증식 저해 활성을 갖는 Treg를 증식시키는 것이 바람직하다. 야생형 IL-2 대신에 야생형 IL-2와 동등한 Tresp의 증식 저해 활성을 갖는 Treg를 증식시키는 IL-2 개변체를 사용해도 된다.
(d) 생체외(Ex vivo) 어세이
Teff나 NK 세포의 기능적 이펙터 분자인 IL-4, IL-6, IFNγ 또는 TNFα 등의 염증성 사이토카인에 대해서, IL-2 개변체 또는 야생형 IL-2를 첨가한 배지에서 PBMC를 배양하고, 배양 상청 중의 사이토카인 산생량을 측정한다. 또한, 마찬가지의 방법으로 항염증성 사이토카인의 산생량을 측정해도 된다. 본 발명의 IL-2 개변체는, 야생형 IL-2와 비교하여, 염증성 사이토카인의 산생량을 감소시키고/시키거나 항염증성 사이토카인의 산생량이 증가시키는 것이 바람직하다. 야생형 IL-2 대신에 야생형 IL-2와 동등한 염증성 사이토카인 및/또는 항염증성 사이토카인을 산생시키는 IL-2 개변체를 사용해도 된다.
(e) Treg/Teff비의 측정
IL-2 개변체 또는 야생형 IL-2를 첨가한 배지에서 배양한 PMBC을 항인간 CD4 항체, 항인간 CD25 항체, 항인간 Foxp3 항체와 반응시켜, 플로우 사이토메트리에 의한 CD4 양성 분획 중에서 CD25+FOXP3high 분획을 Treg, CD25+FOXP3low 분획을 이펙터 T 세포(Teff)로 하고, 그의 존재비[Treg(％)/Teff(％)](Treg/Teff비)를 산출한다. 데이터의 해석은 시판하고 있는 데이터 해석 소프트웨어(예를 들어, TreeStar사제 Flowjo, version7.6.5)에 의해 행한다. 본 발명의 IL-2 개변체는, 야생형 IL-2와 비교하여, Treg/Teff비가 향상되어 있는 것이 바람직하다. 야생형 IL-2 대신에 야생형 IL-2와 동등한 Treg/Teff비를 갖는 IL-2 개변체를 사용해도 된다.
[조성물]
본 발명의 일 실시 형태는, 유효량의 본 발명의 IL-2 개변체를 포함하는 조성물이다. 조성물의 형태로서는, 예를 들어, 의약 조성물 및 시약을 들 수 있다.
후술하는 실시예에 있어서 나타내는 바와 같이, 본 발명의 IL-2 개변체에 의해 Treg를 선택적으로 활성화시키는 점에서, 본 발명의 IL-2 개변체를 포함하는 조성물은, 면역 제어 작용을 갖는 조성물로서 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시 형태로서, 본 발명의 IL-2 개변체를 포함하는 면역 질환의 치료제가 제공된다.
본 발명의 조성물이 사용되는 병태 또는 질환으로서는, 예를 들어, 전신성 에리테마토데스, 건선, 만성 이식편 대 숙주병, 급성 이식편대숙주병, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 복강병, 특발성 혈전성 혈소판 감소성 자반병, 중증 근무력증, 시그렌 증후군, 강피증, 천식, 포도막염, 표피 과형성, 원형 탈모증, 베체트병, 다카야스 동맥염, 연골 염증, 뼈 분해, 관절염, 약년성 관절염, 약년성 관절 류머티즘, 소관절형 약년성 관절 류머티즘, 다관절형 약년성 관절 류머티즘, 전신성 발병 약년성 관절 류머티즘, 약년성 강직성 척추염, 약년성 장질환성 관절염, 약년성 반응성 관절염, 약년성 라이터 증후군, SEA 증후군(혈청 음성, 건부착부증, 관절증 증후군), 약년성 피부근염, 약년성 건선성 관절염, 약년성 강피증, 약년성 전신성 에리테마토데스, 약년성 맥관염, 소관절형 관절 류머티즘, 다관절형 관절 류머티즘, 전신성 발병 관절 류머티즘, 강직성 척추염, 장질환성 관절염, 반응성 관절염, 라이터 증후군, 피부근염, 건선성 관절염, 맥관염, 근염, 다발성 근염, 피부근염, 변형성 관절증, 결절성 다발동맥염, 베게너 육아종, 동맥염, 류마티스성 다발 근육통, 사르코이도시스, 경화증, 원발성 담즙성 간경변, 경화성 담관염, 피부염, 아토피성 피부염, 아테롬성 동맥경화증, 스틸병, 만성 폐색성 폐질환, 길랭-바레 증후군, 1형 당뇨병, 그레이브스병, 에디슨병, 레이노 현상, 자기 면역성 간염, 위스콧·알드리치 증후군 등 염증성 질환, 자기 면역 질환, 알레르기성 질환 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 조성물은, 공지된 제제학적 방법에 의해 제제화할 수 있다. 예를 들어, 캡슐제, 정제, 환제, 액제, 산제, 과립제, 세립제, 필름 코팅제, 펠릿제, 트로키제, 설하제, 저작제, 버컬제, 페이스트제, 시럽제, 현탁제, 엘릭시르제, 유제, 도포제, 연고제, 경고제, 찜질제, 경피 흡수형 제제, 로션제, 흡인제, 에어로졸제, 주사제 및 좌제 등으로서, 경구적 또는 비경구적으로 사용할 수 있다.
이들 제제화에 있어서는, 약리학상 허용되는 담체, 구체적으로는 예를 들어, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 용제, 기제, 유화제, 현탁제, 계면 활성제, 안정제, 향미제, 방향제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제, 희석제, 등장화제, 무통화제, 증량제, 붕괴제, 완충제, 코팅제, 활택제, 착색제, 감미제, 점조제, 교미 교취제, 용해 보조제 혹은 기타의 첨가제 등과 적절히 조합할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 조성물의 투여에는 시린지를 사용해도 되지만, 다른 디바이스를 사용해도 된다. 디바이스로서는, 예를 들어 인젝터 펜, 오토인젝터 디바이스, 무바늘 디바이스, 또는 피하 패치 디바이스 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은, 인간을 포함하는 동물을 대상으로서 사용할 수 있지만, 인간 이외의 동물로서는 특별히 제한은 없고, 여러가지 가축, 가금, 애완동물, 실험용 동물 등을 대상으로 할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 돼지, 소, 말, 양, 염소, 닭, 오리, 타조, 집오리, 개, 고양이, 토끼, 햄스터, 마우스, 래트, 원숭이 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 또한, 건강 상태여도 되고, 이환 상태여도 된다. 단, 본 발명의 조성물이 의약 조성물일 경우에는, 이환 상태의 동물을 대상으로서 사용한다.
조성물에 있어서의 IL-2 개변체의 유효량은, 예를 들어, 치료의 상황 및 목적에 의존한다. 적절한 투여량은, IL-2 개변체가 사용되는 적응증, 투여의 루트, 그리고 투여하는 대상의 사이즈(체중, 체표면 또는 기관 사이즈) 및/또는 상태(연령 및 건강 상태)에 의존하여 조정할 수 있다.
예를 들어, 1회당 투여량 또는 섭취량은, 일반적으로 1ng/kg체중 내지 100mg/kg체중이며, 바람직하게는 0.01μg/kg체중 내지 1mg/kg체중이다.
본 발명의 조성물의 제품(의약품, 시약) 또는 그의 설명서는, 면역을 억제하기 위하여 사용되는 등의 취지의 표시를 한 것일 수 있다. 여기서 「제품 또는 설명서에 표시를 한」이란, 제품의 본체, 용기, 포장 등에 표시를 한 것, 혹은 제품의 정보를 개시하는 설명서, 첨부 문서, 선전물, 기타의 인쇄물 등에 표시를 한 것을 의미한다.
[IL-2R에 대한 선택성]
본 발명의 일 실시 형태는, IL-2Rαβγ에 대한 IL-2의 선택성을 향상시키는 방법이다. 본 실시 형태에 있어서는, 상기한 방법에 의해 IL-2에 당쇄 또는 PEG를 결합시켜서 개변함으로써, IL-2Rαβγ에 대한 IL-2의 선택성을 향상시킬 수 있다.
IL-2Rαβγ에 대한 IL-2의 선택성이 향상되어 있을 때, IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2 개변체의 친화성이, 야생형 IL-2의 친화성보다도 향상되어 있는 경우와, IL-2Rβ 및 γ 서브유닛의 적어도 한쪽에 대한 IL-2 개변체의 친화성이, 야생형 IL-2의 친화성보다도 저하되어 있는 경우가 있을 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태는, IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2의 친화성을 향상시키는 방법이다. 「IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2의 친화성이 향상되는」이란, 야생형 IL-2와 비교하여, IL-2 개변체의 IL-2Rα 서브유닛에 대한 친화성이 향상되어 있는 것을 말한다. 본 실시 형태에 있어서는, 상기한 방법에 의해 IL-2에 당쇄 또는 PEG를 결합시켜서 개변함으로써, 야생형 IL-2보다도, 제작된 IL-2 개변체의 IL-2Rα 서브유닛에 대한 친화성을 향상시켜, IL-2Rαβγ에 대한 IL-2의 선택성을 향상시킬 수 있다.
IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2의 친화성은, IL-2Rα(CD25)에 대한 IL-2의 결합성을 Biacore에 의해 측정하고, 정상 상태(steady state) 모델을 사용하여 해리상수 KD를 구함으로써 평가할 수 있다. Biacore에 의한 IL-2Rα에 대한 IL-2의 결합성은, 실시예에 있어서 후술하는 방법에 의해 측정할 수 있다. 본 실시 형태에 있어서는, IL-2Rα에 대한 IL-2 개변체의 KD는, 야생형 IL-2의 개변체보다도 낮은 것이 바람직하다. 야생형 IL-2 대신에 야생형 IL-2와 동등한 IL-2Rα로의 친화성을 갖는 IL-2 개변체를 사용해도 된다.
본 발명의 일 실시 형태는, IL-2Rβ 및 γ 서브유닛의 적어도 한쪽에 대한 IL-2의 친화성을 저하시키는 방법이다. 「IL-2Rβ 및 γ 서브유닛의 적어도 한쪽에 대한 IL-2의 친화성이 저하되는」이란, 야생형 IL-2와 비교하여, IL-2 개변체의 IL-2Rβ 및 γ 서브유닛의 적어도 한쪽에 대한 친화성이 저하되어 있는 것을 말한다. 본 실시 형태에 있어서는, 상기한 방법에 의해 IL-2에 당쇄 또는 PEG를 결합시켜서 개변함으로써, 야생형 IL-2와 비교하여, 제작된 IL-2 개변체의 IL-2Rβ 및 γ 서브유닛의 적어도 한쪽에 대한 친화성을 저하시켜서, IL-2Rαβγ에 대한 IL-2의 선택성을 향상시킬 수 있다.
예를 들어, IL-2Rβγ 서브유닛에 대한 IL-2의 친화성은, IL-2의 IL-2Rβγ에 대한 결합성을 Biacore에 의해 측정하고, 1:1 결합 모델(binding model)을 사용하여 해리상수 KD를 구함으로써 평가할 수 있다. Biacore에 의한 IL-2Rβγ에 대한 IL-2의 결합성은, 실시예에 있어서 후술하는 방법에 의해 측정할 수 있다. 본 실시 형태에 있어서는, IL-2Rβγ에 대한 IL-2의 KD는 야생형 IL-2와 비교하여 높은 것이 바람직하다. 야생형 IL-2 대신에 야생형 IL-2와 동등한 IL-2Rβγ 서브유닛에 대한 친화성을 갖는 IL-2 개변체를 사용할 수 있다.
[제어성 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 방법]
본 발명의 일 실시 형태는, 본 발명의 IL-2 개변체를 사용하여 제어성 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 방법이다. 본 실시 형태에 있어서는, 본 발명의 IL-2 개변체를 피검 대상에게 투여하고, 제어성 T 세포를 선택적으로 활성화시킬 수 있다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 당쇄 결합 IL-2 개변체의 합성
표 1 내지 5에 나타내는 각종 IL-2 개변체를 하기에 기재된 방법으로 제작하였다.
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
<표 1 내지 5의 설명>
·당쇄 결합 위치: 야생형 성숙 인간 IL-2의 아미노산 서열(서열 번호 1)(이하, 간단히 야생형 IL-2라고도 기재한다)의 N 말단으로부터의 위치
·Cys 변이 위치: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터의 위치
·125 위치 변이: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 125번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 나타낸다. 변이를 가하고 있지 않은 경우에는 -, 시스테인으로부터 세린으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 경우에는 S라고 기재한다.
표 중, 당쇄 결합 위치의 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 구조에 대하여 이하에 나타내었다.
C-당(GlcNAc, glucose, lactose, trisaccharide, pentasaccharide, asialo, disialo, tetrasialo)이란, 시스테인의 측쇄 티올에 CH2CONH 링커를 통하여 당쇄가 도입된 하기 (식 1)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00109
상기 (식 1) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.
N-당(GlcNAc, disialo)이란, 아스파라긴의 측쇄 아미드에 당쇄가 도입된 하기 (식 2)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00110
상기 (식 2) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.
GlcNAc란 하기 (식 Y1)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00111
Glucose란 하기 (식 Y2)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00112
lactose란 하기 (식 4)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00113
trisaccharide란 하기 (식 5)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00114
pentasaccharide란 하기 (식 6)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00115
asialo란 하기 (식 7)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00116
disialo란 하기 (식 8)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00117
tetrasialo란 하기 (식 Y3)으로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00118
·표 중, Cys 변이 위치의 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 AcC는 하기 (식 XXX)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00119
Figure pct00120
<표 6의 설명>
·변이 위치: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터의 위치
·125 위치 변이: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 125번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 나타낸다. 변이를 가하고 있지 않은 경우에는 -, 시스테인으로부터 세린으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 경우에는 S라고 기재한다.
표 중, 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 C-acetamide란, 하기 (식 9)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00121
(공정 1) 펩티드 세그먼트 1의 합성
IL-2 아미노산 서열 1 내지 57의 펩티드 티오에스테르 또는 당쇄 결합 펩티드 티오에스테르를 이하의 방법으로 조제하였다.
(공정 1-1a-1) 펩티드히드라지드의 합성
[Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 6978-6981]에 기재되는 방법에 따라서 얻어지는 트리틸히드라진 수지에, Fmoc-Gln(Trt)-OH(5 당량), 1-히드록시벤조트리아졸(5 당량), N,N'-디이소프로필카르보디이미드(5 당량)를 사용하여 DMF 중에서 1 잔기째의 아미노산 잔기를 수지에 담지하였다. 통상적인 방법에 따라서, DMF 중에서의, Fmoc 아미노산(5.3 당량), HCTU(5 당량), N-메틸모르폴린(5 당량) 또는 2,4,6-트리메틸피리딘(5 당량)을 사용한 아미노산의 신장과, 20％ 피페리딘-DMF 용액에 의한 탈보호를 반복함으로써, 2 잔기째 이후의 아미노산을 신장하였다. 신장한 펩티드는, 트리플루오로아세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIPS), 물을 사용하여 수지로부터의 탈리와 측쇄 보호기를 제거한 후, 빙냉한 에테르 중에 적하하고, 발생한 침전을 원심 분리에 의해 회수하였다. 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, 펩티드히드라지드를 합성하였다.
이때, 시스테인에 당쇄를 도입하는 경우에는 당쇄를 도입하는 위치를 시스테인으로 변이시킨 펩티드히드라지드를 조제하였다. 또한, 2종류의 당쇄를 도입하는 경우에는, 한쪽을 시스테인, 다른 한쪽을 S-아세트아미도메틸시스테인으로 변이시킨 펩티드히드라지드를 조제하였다.
또한, 아미노산 서열 3 위치 또는 51 위치를 시스테인으로 변이시킨 IL-2 개변체를 제조할 때에는, 당쇄를 도입하는 위치를 시스테인, 아미노산 서열 3 위치 또는 51 위치를 S-아세트아미도메틸시스테인으로 변이시킨 펩티드히드라지드를 조제하였다.
또한, 아미노산 서열 1 위치를 아세틸시스테인으로 변이시킨 아날로그를 제조할 때에는, 당쇄를 도입하는 위치를 시스테인, 아미노산 서열 1 위치를 S-아세트아미도메틸시스테인으로 변이시킨 펩티드를 수지 상에서 신장한 후, N 말단 아미노기를 무수 아세트산, 피리딘을 사용하여 아세틸화하고, 상기 방법에 따라서 수지로부터의 탈리와 측쇄 보호기의 제거, 정제를 행하고, 1 위치를 아세틸시스테인으로 변이시킨 펩티드히드라지드를 조제하였다.
(공정 1-1a-2) Cys-당쇄 결합 펩티드히드라지드 또는 Cys-아세트아미드 결합 펩티드히드라지드의 합성
(공정 1-1a-1)에서 얻어지는 펩티드히드라지드로의 브로모아세틸 당쇄(국제 공개 제2005/010053호에 기재되는 방법에 따라서 조제)를 사용한 당쇄 도입은, [Tetrahedron Lett., 2004, 45, 3287-3290, Carbohydr. Res. 2009, 344, 762-770]에 기재되는 방법으로 실시하여, 목적으로 하는 당쇄 결합 펩티드히드라지드를 합성하였다.
브로모아세틸 당쇄 대신에 브로모아세트아미드를 사용하여, 상기와 마찬가지의 방법으로 Cys-아세트아미드 결합 펩티드히드라지드를 합성하였다.
(공정 1-1b) Asn-당쇄 결합 펩티드히드라지드의 합성
[Angew. Chem. Int. Ed. 2014,53,6978-6981]에 기재되는 방법에 따라서 얻어지는 트리틸히드라진 수지에, Fmoc-Gln(Trt)-OH(5 당량), 1-히드록시벤조트리아졸(5 당량), N,N'-디이소프로필카르보디이미드(5 당량)를 사용하여 DMF 중에서 1 잔기째의 아미노산 잔기를 수지에 담지하였다. 통상적인 방법에 따라서, DMF 중에서의, Fmoc 아미노산(5.3 당량), HCTU(5 당량), N-메틸모르폴린(5 당량)을 사용한 아미노산의 신장과, 20％ 피페리딘-DMF 용액에 의한 탈보호를 반복함으로써, 2 잔기째 이후의 당쇄 결합 Asn 이외의 아미노산을 신장하였다.
당쇄 결합 Asn(국제 공개 제2004/005330호에 기재되는 방법에 따라서 조제)은 국제 공개 제2004/005330호에 기재되는 방법으로 신장하였다. 신장한 펩티드는, 트리플루오로아세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIPS), 물을 사용하여 수지로부터의 탈리와 측쇄 보호기를 제거한 후, 빙냉한 에테르 중에 적하하고, 발생한 침전을 원심 분리에 의해 회수하였다. 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, Asn-당쇄 결합 펩티드히드라지드를 합성하였다.
(공정 1-2a) 펩티드 티오에스테르 또는 당쇄 결합 펩티드 티오에스테르의 합성
(공정 1-1a-1)에서 얻어지는 펩티드히드라지드 또는 (공정 1-1a-2)에서 얻어지는 Cys-당쇄 결합 펩티드히드라지드 또는 Cys-아세트아미드 결합 펩티드히드라지드 또는 (공정 1-1b)에서 얻어지는 Asn-당쇄 결합 펩티드히드라지드를 6mol/L 구아니딘염산염, 200mmol/L 인산 완충액(pH3)에 용해하고 -20℃로 냉각한 후, 200mmol/L 아질산나트륨, 6mol/L 구아니딘염산염, 200mmol/L 인산 완충액(pH7)을 첨가하고 5분간 교반하였다. 400mmol/L 2-머캅토에탄술폰산나트륨, 6mol/L 구아니딘염산염, 200mmol/L 인산 완충액(pH6)을 첨가하고 -15℃에서 1시간반 교반한 후, 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, 펩티드 티오에스테르 또는 당쇄 결합 펩티드 티오에스테르를 얻었다.
(공정 1-2b) 2종류의 당쇄 결합 펩티드 티오에스테르의 합성
2종류의 당쇄를 도입하는 경우, (공정 1-1a-2)에서 얻어지는 당쇄 결합 펩티드히드라지드의 반응 용액에, 아세트산에 현탁시킨 아세트산은을 첨가하고 6시간 교반하여 S-아세트아미드메틸기를 제거하였다. 디티오트레이톨을 첨가한 후, 원심 분리하여 얻어지는 상청을 겔 여과(Superdex G-75)에 의해 4mol/L 구아니딘염산염, 5mmol/L 인산 완충액(pH5)으로 용매 교환하였다. 용출액에, 6mol/L 구아니딘염산염, 200mmol/L 인산 완충액(pH3)을 첨가하고, 2mol/L 염산을 사용하여 pH3으로 조정한 후, -15℃로 냉각하였다.
6mol/L 구아니딘염산염, 200mmol/L 아질산나트륨, 50mmol/L 인산 완충액(pH7)을 첨가하고, -15℃에서 5분간 교반한 후, 6mol/L 구아니딘염산염, 400mmol/L 2-머캅토에탄술폰산나트륨, 200mmol/L 인산 완충액(pH6)을 첨가하고, -15℃에서 1시간반 교반하고, 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, 당쇄 결합 펩티드 티오에스테르를 얻었다.
얻어진 당쇄 결합 펩티드 티오에스테르에 대하여, (공정 1-1a-2)에 기재된 방법에 따라서, 2종류째의 당쇄를 도입하고, 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, 2종류의 당쇄 결합 펩티드 티오에스테르를 얻었다.
(공정 2) 펩티드 세그먼트 2의 합성
IL-2 아미노산 서열 58-104의 펩티드히드라지드 또는 당쇄 결합 펩티드히드라지드를 이하의 방법으로 조제하였다.
(공정 2-1a-1) 펩티드히드라지드의 합성
[Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 6978-6981]에 기재되는 방법에 따라서 얻어지는 트리틸히드라진 수지에, Fmoc-Met-OH(5 당량), 1-히드록시벤조트리아졸(5 당량), N,N'-디이소프로필카르보디이미드(5 당량)를 사용하여 DMF 중에서 1 잔기째의 아미노산 잔기를 수지에 담지하였다.
통상적인 방법에 따라서, DMF 중에서의, Fmoc 아미노산(5.3 당량), HCTU(5 당량), N-메틸모르폴린(5 당량) 또는 2,4,6-트리메틸피리딘(5 당량)을 사용한 아미노산의 신장과, 20％ 피페리딘-DMF 용액에 의한 탈보호를 반복함으로써, 2 잔기째 이후의 아미노산을 신장하였다.
신장한 펩티드는, 트리플루오로아세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIPS), 물을 사용하여 수지로부터의 탈리와 측쇄 보호기를 제거한 후, 빙냉한 에테르 중에 적하하고, 발생한 침전을 원심 분리에 의해 회수하였다. 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, 펩티드히드라지드를 합성하였다.
이때, 당쇄를 도입하는 경우에는 당쇄를 도입하는 위치를 시스테인으로 변이하고, 추가로 아미노산 서열 58을 티오프롤린으로 변이시킨 펩티드히드라지드를 조제하였다. 아미노산 서열 78 위치를 시스테인으로 변이시킨 아날로그를 제조할 때에는, 아미노산 서열 78 위치를 시스테인으로 변이시킨 펩티드히드라지드를 조제하였다. 아미노산 서열 91 위치에 당쇄를 도입하고, 아미노산 서열 78 위치를 시스테인으로 변이한 아날로그를 제조할 때는, 아미노산 서열 91 위치를 시스테인, 아미노산 서열 78 위치를 S-아세트아미도메틸시스테인으로 변이시킨 펩티드히드라지드를 조제하였다.
(공정 2-1a-2) Cys-당쇄 결합 펩티드히드라지드 또는 Cys-아세트아미드 결합 펩티드히드라지드의 합성의 합성
(공정 2-1a-1)에서 얻어지는 펩티드히드라지드로의 브로모아세틸 당쇄(국제 공개 제2005/010053호에 기재되는 방법으로 조제)를 사용한 당쇄 도입을, [Tetrahedron Lett., 2004, 45, 3287-3290, Carbohydr. Res. 2009, 344, 762-770]에 기재되는 방법에 따라서 실시한 반응 용액에 대하여, 브로모아세틸 당쇄에 대하여 10 당량의 2-머캅토에탄술폰산나트륨을 첨가한 후, 8mol/L 구아니딘염산염 수용액, 2mol/L 염산, 메톡시아민염산염을 첨가하여 pH4로 조정하고, 실온에서 20분 반응시켰다. 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, Cys-당쇄 결합 펩티드히드라지드를 합성하였다.
브로모아세틸 당쇄 대신에 브로모아세트아미드를 사용하여, 상기와 마찬가지의 방법으로 Cys-브로모아세트아미드 결합 펩티드히드라지드를 합성하였다.
(공정 2-1b) Asn-당쇄 결합 펩티드히드라지드의 합성
(공정 1-1b)와 마찬가지의 방법으로 Asn-당쇄 결합 펩티드히드라지드를 조제하였다.
(공정 3) 펩티드 세그먼트 3의 합성
IL-2 아미노산 서열 105-133의 펩티드 또는 당쇄 결합 펩티드를 이하의 방법으로 조제하였다.
(공정 3-1) 가용화 태그(H-C(Npys)RRRRR-NH2)의 조정
Rink-아미드 수지에, DMF 중에서의 Fmoc 아미노산(5.3 당량), HCTU(5 당량), N-메틸모르폴린(5 당량)을 사용한 아미노산의 신장과, 20％ 피페리딘-DMF 용액에 의한 탈보호를 반복함으로써 아미노산을 신장하였다. 신장한 펩티드는, 트리플루오로아세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIPS), 물을 사용하여 수지로부터의 탈리와 측쇄 보호기를 제거한 후, 빙냉한 에테르 중에 적하하고, 발생한 침전을 원심 분리에 의해 회수하여, 가용화 태그(H-C(Npys)RRRRR-NH2)를 조제하였다.
(공정 3-2) 가용화 태그 도입 펩티드의 합성
IL-2 아미노산 서열 105-133의 펩티드를 이하의 방법으로 조제하였다.
HMPB-ChemMatrix 수지에, Fmoc-Thr(tBu)-OH(5 당량), 1-(메시틸렌-2-술포닐)-3-니트로-1,2,4-트리아졸(5 당량), 1-메틸이미다졸(3.5 당량)을 사용하여 1 잔기째의 아미노산 잔기를 수지에 담지하였다. 통상적인 방법에 따라서, DMF 중에서의, Fmoc 아미노산(5.3 당량), HCTU(5 당량), N-메틸모르폴린(5 당량) 또는 2,4,6-트리메틸피리딘(5 당량)을 사용한 아미노산의 신장과, 20％ 피페리딘-DMF 용액에 의한 탈보호를 반복함으로써, 2 잔기째 이후의 아미노산을 신장하였다.
신장한 펩티드는, 트리플루오로아세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIPS), 물을 사용하여 수지로부터의 탈리와 측쇄 보호기를 제거한 후, 빙냉한 에테르 중에 적하하고, 발생한 침전을 원심 분리에 의해 회수하여 펩티드의 조 정제물을 얻었다. 이때, 시스테인에 당쇄를 도입하는 경우에는 당쇄를 도입하는 위치를 시스테인으로 변이하고, 추가로 아미노산 서열 105를 티오프롤린으로 변이시킨 펩티드를 조제하였다.
(공정 3-1)에서 얻어지는 가용화 태그(펩티드 조 생성물에 대하여 3 당량)를 6.8mol/L 구아니딘염산염, 310mmol/L 인산 완충액(pH7)에 용해하고, 5 당량의 무수 아세트산을 첨가하고 실온 하 1시간 교반하였다. 10 당량의 아르기닌염산염을 첨가한 후, 8mol/L 구아니딘염산염, 250mmol/L 트리스히드록시메틸아미노메탄염산염 수용액(pH8)에 용해한 상기 펩티드 조 생성물을 첨가하고 실온 하 1시간 교반하였다. 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, 가용화 태그 도입 펩티드를 합성하였다.
(공정 3-3) 가용화 태그 도입 펩티드로의 당쇄 도입
(공정 3-2)에서 얻어지는 가용화 태그 도입 펩티드를 8mol/L 구아니딘염산염, 5mmol/L 트리스(2-카르복시에틸)포스핀, 200mmol/L 인산 완충액(pH6)에 용해하고, 브로모아세틸 당쇄(5 당량, 국제 공개 제2005/010053호에 기재되는 방법으로 조제)의 6mol/L 구아니딘염산염, 200mmol/L 인산 완충액(pH7) 용액을 첨가하고 5시간 반응시켰다.
브로모아세틸 당쇄에 대하여 4 당량의 2-머캅토에탄술폰산나트륨을 첨가하고 1시간 교반한 후, 6mol/L 구아니딘염산염, 200mmol/L 인산 완충액(pH7)에 용해한 메톡시아민염산염(300 당량)을 첨가하고, 2mol/L 염산을 사용하여 pH4로 조정하고 1시간 반응시켰다. 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, 당쇄 결합 펩티드를 합성하였다.
(공정 4) IL-2 개변체, 당쇄 결합 IL-2 개변체의 합성
(공정 4-1) 펩티드 세그먼트 1과 2의 연결 반응
상기 (공정 1)에서 얻어지는 펩티드 세그먼트 1과 상기 (공정 2)에서 얻어지는 펩티드 세그먼트 2(1.1 당량)를 8mol/L 구아니딘염산염, 100mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀, 100mM 아스코르브산, 50mmol/L 4-머캅토페닐아세트산, 200mmol/L 인산 완충액(pH7)에 용해하고, 반응시킨 후, 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, 펩티드 세그먼트 1과 2의 연결체를 합성하였다.
(공정 4-2) 펩티드 세그먼트 1과 2의 연결체의 티오에스테르화
상기 (공정 4-1)에서 얻어지는 펩티드 세그먼트 1과 2의 연결체를, (공정 1-2a)와 마찬가지의 방법으로 티오에스테르화하였다.
(공정 4-3) 펩티드 세그먼트 3과의 연결
상기 (공정 4-2)에서 얻어지는 펩티드 티오에스테르와 상기 (공정 3)에서 얻어지는 펩티드 세그먼트 3(1 당량)을 8mol/L 구아니딘염산염, 100mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀, 100mM 아스코르브산, 50mmol/L 4-머캅토페닐아세트산, 200mmol/L 인산 완충액(pH7)에 용해하고, 반응시킨 후, 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, 펩티드 세그먼트 1, 2 및 3의 연결체를 합성하였다.
(공정 4-4) 아세트아미드메틸기의 탈보호
상기 (공정 4-3)에서 얻어지는 펩티드 세그먼트 1, 2 및 3의 연결체의 시스테인이 아세트아미드메틸기로 보호되어 있는 경우, 이하에 나타내는 방법으로 아세트아미드메틸기를 제거하였다.
펩티드 세그먼트 1, 2 및 3의 연결체를, 6mol/L 요소, 5mmol/L 인산 완충액(pH5)에 용해하고, 아세트산에 현탁시킨 아세트산은(420 당량)을 첨가하고 5시간 교반하였다. 과잉량의 디티오트레이톨을 첨가한 후, 원심 분리하여 얻어지는 상청을 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, 탈아세트아미드메틸체를 취득하였다.
(공정 4-5) 시알산벤질에스테르의 탈보호
상기 (공정 4-3)에서 얻어지는 펩티드 세그먼트 1, 2 및 3의 연결체의 당쇄 상의 시알산 측쇄 카르복실산이 벤질기로 보호되어 있는 경우, 국제 공개 제2004/005330호에 기재되는 방법에 따라서, 벤질기를 제거한 후, 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, 탈 벤질체를 취득하였다.
(공정 4-6) IL-2 개변체, 당쇄 결합 IL-2 개변체의 합성
(공정 4-3) 또는 (공정 4-4) 또는 (공정 4-5)에서 합성한 펩티드 세그먼트 1, 2 및 3의 연결체를, 6mol/L 구아니딘염산염, 100mmol/L 트리스히드록시메틸아미노메탄염산염(pH8)에 용해한 후, 100mmol/L 트리스히드록시메틸아미노메탄염산염, 10mmol/L 환원형 글루타티온, 1mmol/L 산화형 글루타티온(pH8)을 첨가하고, 실온 하 18시간 교반하였다. 역상 HPLC 칼럼[프로테오나비(상품명), 시세이도사제]으로 정제하여, IL-2 개변체, 당쇄 결합 IL-2 개변체를 취득하였다.
얻어진 IL-2 개변체, 당쇄 결합 IL-2 개변체는, 질량 분석에서 계산값과 실측값이 일치하고 있는 점, 및/또는 CD 스펙트럼이 야생형 IL-2와 일치하는 점, 및/또는 SDS-PAGE에서 검출되는 밴드가 상정 분자량의 밴드 위치인 것을 확인할 수 있었던 점에서, 품질 및 순도가 문제 없는 것을 확인하였다.
[실시예 2] N말 PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체의 합성
표 7에 나타내는 N말 PEG화, 당쇄 결합 IL-2를 하기에 기재된 방법으로 제작하였다.
Figure pct00122
<표 7의 설명>
·당쇄 결합 위치, PEG 결합 위치: 야생형 성숙 인간 IL-2의 아미노산 서열(서열 번호 1)(이하, 간단히 야생형 IL-2라고도 기재한다)의 N 말단으로부터의 위치
·125 위치 변이: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 125번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 나타낸다. 변이를 가하고 있지 않은 경우에는 -, 시스테인으로부터 세린으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 경우에는 S라고 기재한다.
·표 중, 당쇄 결합 위치의 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 구조에 대하여 이하에 나타내었다.
C-당(asialo)이란, 시스테인의 측쇄 티올에 CH2CONH 링커를 통하여 당쇄가 도입된 하기 (식 1)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00123
상기 (식 X1)에 있어서, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.
asialo란 하기 (식 7)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00124
표 중, PEG 결합 위치의 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 구조에 대하여 이하에 나타내었다.
A1-PEG(CHO)[Li20(CHO)]란, 알라닌 주쇄 아미노기에 (CH2)3 링커를 통하여 PEG가 도입된 하기 (식 Z0)으로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00125
Li20이란, 상기 (식 Z0) 중, PEG가 평균 분자량 약 20kDa의 하기 (식 X00)으로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00126
당쇄 결합 IL-2 개변체의 1mM EDTA, 20mmol/L 인산 완충액(pH5.5)에, 실온 하에서 PEG-알데히드(10 당량, PJK-241; Creative PEG Works)의 20mmol/L 인산 완충액(pH5.5)을 첨가하고 실온 하 30분 교반한 후, NaBH3(CN)(1000 당량)을 첨가하고 3시간 교반하였다.
Amicon Ultra-0.5(10kDa)를 사용한 한외 여과에 의해 0.05％ 트리플루오로아세트산, 2％ 아세토니트리릴 수용액으로 용매 치환한 후, 크기 배제 크로마토그래피(칼럼; Waters제, XBridge BEH450A, 3.5㎛, 7.8×150㎜과 XBridge BEH200A, 3.5㎛, 7.8×150㎜을 연결)로 정제하고, N말 PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체를 합성하였다.
정제한 N말 PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체의 순도를 SDS-PAGE로 확인하였다. 그 결과 모든 개변체에 있어서, PEG의 분자량이 증가한 단일의 밴드가 보여서, 고순도의 N말 PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체가 얻어진 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 3] Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체의 합성
표 8에 나타내는 Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2를 하기에 기재된 방법으로 제작하였다.
Figure pct00127
<표 8의 설명>
·PEG 결합 위치, 당쇄 결합 위치 1 및 2: 야생형 성숙 인간 IL-2의 아미노산 서열(서열 번호 1)(이하, 간단히 야생형 IL-2라고도 기재한다)의 N 말단으로부터의 위치
·125 위치 변이: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 125번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 나타낸다. 변이를 가하고 있지 않은 경우에는 -, 시스테인으로부터 세린으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 경우에는 S라고 기재한다.
·표 중, 당쇄 결합 위치의 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 구조에 대하여 이하에 나타내었다.
C-당(lactose, disialo)이란, 시스테인의 측쇄 티올에 CH2CONH 링커를 통하여 당쇄가 도입된 하기 (식 1)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00128
상기 (식 1)에 있어서, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.
lactose란 하기 (식 4)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00129
disialo란 하기 (식 8)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00130
표 중, PEG 결합 위치의 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 구조에 대하여 이하에 나타내었다.
C-PEG(IAc)[Li20(IAc), Li40(IAc), V40(IAc), W40(IAc), Y50(IAc)]란, 시스테인 측쇄에 CH2CONH(CH2)3O 링커를 통하여 PEG가 도입된 하기 (식 X4)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00131
C-PEG(Mal)[V40(Mal), V80(Mal), W80(Mal), Y50(Mal)]이란, 시스테인 측쇄에 3-(3-티오-2,5-디옥소피롤리딘-1-일)-프로필옥시 링커를 통하여 PEG가 도입된 하기 (식 X5)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다. 이때, C-PEG(Mal)는 디옥소피롤리딘환이 개환한 (식 X6) 또는 (식 X7)로 표시되는 구조여도 된다.
Figure pct00132
Figure pct00133
Figure pct00134
AcC-PEG(IAc)[Li40(IAc), Y50(IAc)]란, 아세틸시스테인 측쇄에 CH2CONH(CH2)3O 링커를 통하여 PEG가 도입된 하기 (식 XX3)으로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00135
AcC-PEG(Mal)[V80(Mal), W80(Mal), Y50(Mal)]이란, N-아세틸시스테인 측쇄에 3-(3-티오-2,5-디옥소피롤리딘-1-일)-프로필옥시 링커를 통하여 PEG가 도입된 하기 (식 X8)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다. 이때, AcC-PEG(Mal)는 디옥소피롤리딘환이 개환한 (식 X9) 또는 (식 X10)으로 표시되는 구조여도 된다.
Figure pct00136
Figure pct00137
Figure pct00138
Li20이란, 상기 (식 X4) 내지 (식 X10) 중, PEG가 평균 분자량 약 20kDa의 하기 (식 X11)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00139
Li40이란, 상기 (식 X4) 내지 (식 X10) 중, PEG가 평균 분자량 약 40kDa의 상기 (식 X11)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
V40이란, 상기 (식 X4) 내지 (식 X10) 중, PEG가 평균 분자량 약 40kDa의 하기 (식 X13)으로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00140
V80이란, 상기 (식 X4) 내지 (식 X10) 중, PEG가 평균 분자량 약 80kDa인 상기 (식 X13)으로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
W40이란, 상기 (식 X4) 내지 (식 X10) 중, PEG가 (CH2CH2O)m의 평균 분자량이 5kDa이며, (CH2CH2O)n의 평균 분자량이 7.5kDa인 하기 (식 X14)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00141
W80이란, 상기 (식 X4) 내지 (식 X10) 중, PEG가 (CH2CH2O)m의 평균 분자량이 5kDa이며, (CH2CH2O)n의 평균 분자량이 17.5kDa인 상기 (식 X14)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Y50이란, 상기 (식 X4) 내지 (식 X10) 중, PEG가 (CH2CH2O)m의 평균 분자량이 10kDa이며, (CH2CH2O)n의 평균 분자량이 20kDa인 하기 (식 X15)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00142
(공정 1) PEG-할로아세틸의 조제
PEG-아민(SUNBRIGHT GL2-400PA; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT GL3-400PA100U; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT GL4-400PA; 니찌유 가부시끼가이샤)을 클로로포름에 용해하고, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(5 당량), 4-디메틸아미노피리딘(5 당량), 요오도아세트산(5 당량)을 첨가하고 실온 하 90시간 교반하였다. 에테르/이소프로판올=1/1을 첨가하고, 석출한 고체를 여과취출하였다. 잔사를 물에 용해하고, Amicon Ultra-0.5(10kDa)를 사용한 한외 여과에 의해 요오도아세트산을 제거하고, 동결 건조함으로써 PEG-IAc를 합성하였다.
(공정 2) Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체의 합성
표 5에 나타내는 당쇄 결합 IL-2 개변체의 1mmol/L EDTA, 20mmol/L 인산 완충액(pH5.5)에, 실온 하에서 PEG-할로아세틸(5 당량, 상기 공정 1에서 합성한 화합물 또는 SUNBRIGHT ME-200IA; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT ME-400IA; 니찌유 가부시끼가이샤) 또는 PEG-말레이미드(5.0㎚ol, SUNBRIGHT GL2-800MA; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT GL4-400MA100U; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT GL4-800MA; 니찌유 가부시끼가이샤)의 1mmol/L EDTA, 20mmol/L 인산 완충액(pH5.5)을 첨가한 후, 0.1mol/L 수산화나트륨 수용액을 사용하여 pH7.2 내지 7.4로 조정하고, 2시간 교반하였다. 크기 배제 크로마토그래피(칼럼; Waters제, XBridge BEH450A, 3.5㎛, 7.8×150㎜과 XBridge BEH200A, 3.5㎛, 7.8×150㎜을 연결)로 정제하여, Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체를 합성하였다.
정제한 Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체의 순도를 SDS-PAGE로 확인하였다. 그 결과 모든 개변체에 있어서, PEG의 분자량이 증가한 단일의 밴드가 보여서, 고순도의 Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체가 얻어진 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] 대장균용 8His-IL-2 및 o-Az-Z-Lys 도입 인간 IL-2 및 m-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 발현 벡터의 조제
표 9에 나타내는 대장균용 8His-IL-2 발현 벡터 및 o-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 발현 벡터 및 m-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 발현 벡터를 이하의 방법에 의해 제작하였다.
Figure pct00143
<표 9의 설명>
·Az-Z-Lys 도입 위치: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터의 위치
·1 위치 수식: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 알라닌 잔기의 수식을 나타낸다. MHHHHHHHHA란, N 말단 알라닌 잔기에 메티오닌 및 폴리히스티딘 서열(HHHHHHHH) 태그가 결합하고 있는 것을 나타낸다.
·125 위치 변이: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 125번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 나타낸다. 변이를 가하고 있지 않은 경우에는 -, 시스테인으로부터 세린으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 경우에는 S라고 기재한다.
표 중, 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 o-Az-Z-Lys란 하기 (식 10)으로 표시되는 구조를 나타내고,
Figure pct00144
m-Az-Z-Lys란 하기 (식 XX1)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00145
IL-2로서는, 서열 번호 1로 표현되는 야생형 성숙 인간 IL-2 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로부터 세린으로 치환하고, 또한 N 말단에 메티오닌 및 폴리히스티딘 서열(HHHHHHHH) 태그가 결합한 아미노산 서열을 포함하는 8His-IL-2(아미노산 서열: 서열 번호 2, 당해 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열: 서열 번호 3)를 바탕으로 하여, 상기 발현 벡터를 제작하였다.
pFLAG-CTS(SIGMA사제)의 lac 리프레서 유전자 lacI의 직하류에, 피롤리딘 tRNA의 염기 서열 및 피롤리딜 tRNA 합성 효소(이하 Pyl tRNA, tRNAPyl이라고도 기재한다)를 코딩하는 염기 서열이 삽입된 pFLAG-CTS-Pyl TS(국제 공개 제2017/030156호)의 NdeI 제한 효소 사이트와 SalI 제한 효소 사이트의 사이에, 8His-IL-2를 코딩하는 염기 서열(서열 번호 3)을 삽입함으로써, 대장균용의 8His-IL-2 발현 벡터(이하 pFLAG-CTS-Pyl TS_8His-hIL-2라고 기재한다)를 제작하였다.
8His-IL-2의 염기 서열을 기로 하여, o-Az-Z-Lys 또는 m-Az-Z-Lys를 도입하는 부위에 상당하는 코돈을 앰버(TAG) 코돈으로 치환한 염기 서열(서열 번호 4 내지 18, 27 내지 37)을 PCR법 또는 인공 유전자 합성(니혼 진위즈 가부시키가이샤)으로 제작하였다. 얻어진 염기 서열을, pFLAG-CTS-Pyl TS-8His-hIL-2의 8His-IL-2의 염기 서열과 치환하였다.
[실시예 5] 8His-IL-2 및 o-Az-Z-Lys 도입 IL-2 및 m-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2의 조제
표 10에 나타내는 8His-IL-2 및 o-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 및 m-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2를 이하의 방법에 의해 제작하였다.
Figure pct00146
<표 10의 설명>
·Az-Z-Lys 도입 위치: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터의 위치
·1 위치 수식: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 알라닌 잔기의 수식을 나타낸다. MHHHHHHHHA란, N 말단 알라닌 잔기에 메티오닌 및 폴리히스티딘 서열(HHHHHHHH) 태그가 결합하고 있는 것을 나타낸다.
·125 위치 변이: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 125번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 나타낸다. 변이를 가하고 있지 않은 경우에는 -, 시스테인으로부터 세린으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 경우에는 S라고 기재한다.
표 중, 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 o-Az-Z-Lys란 하기 (식 10)으로 표시되는 구조를 나타내고,
Figure pct00147
m-Az-Z-Lys란 하기 (식 XX1)로 표시되는 구조를 나타낸다.
Figure pct00148
실시예 4에서 제작한 대장균용 8His-IL-2 발현 벡터 및 o-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 발현 벡터 또는 m-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 발현 벡터를 대장균 B-95. delA [Sci Rep,2015. 5(9699)]에 도입하였다. 8His-IL-2 발현 벡터 및 각종 o-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 발현 벡터 또는 m-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 발현 벡터100ng을 100μL의 적격 세포에 첨가하여 천천히 혼화하고, 빙상에서 30분간 정치하였다.
계속해서, 42℃의 온욕에 30초간 가온한 후, 다시 빙상에 2분간 정치하였다. LB 배지 500μL를 첨가하여 37℃로 설정한 인큐베이터에서 60분간 진탕 배양을 행한 후, 최종 농도 100μg/mL의 암피실린(와코준야쿠사제)을 포함하는 LB 플레이트(1.5w/v％ 아가로오스)에 전량을 플레이팅하였다. 37℃로 설정한 인큐베이터에서 밤새 배양을 행한 후, 플레이트에서 생육해 온 대장균을 유전자 도입주로서 선발하였다.
얻어진 유전자 도입주를 전량 회수하고, 최종 농도 1mM의 o-Az-Z-Lys 또는 m-Az-Z-Lys(국제 공개 제2017/030156호에 기재된 방법에 따라서 GVK Biosciences사에서 합성), 최종 농도 100μg/mL의 암피실린을 첨가한 800mL의 Super Broth [MOPS(나카라이테스크사제) 1w/v％, 트립톤(DIFCO사제) 3w/v％, 효모 추출물(Yeast Extract)(DIFCO사제) 2w/v％]에 파종하고, 37℃로 설정한 바이오 셰이커에서, 165rpm으로 진탕 배양하였다.
균체 용액의 600㎚의 흡광도의 값이 1.5 내지 2.0이 된 단계에서 최종 농도 1.0mmol/L의 이소프로필-β-티오갈락토피라노시드(IPTG)(나카라이테스크사제)를 첨가하고, 42℃로 설정한 바이오 셰이커에서, 165rpm으로 3시간 진탕 배양하여 각 인간 IL-2를 발현시켰다.
배양 후의 균체 용액을 원심 분리[CR21E(히다치 세이사꾸쇼사제), 7000rpm, 4℃, 5분간]함으로써 대장균 균체를 회수 후, 40mL의 B-PER 박테리아 단백질 추출 시약(Bacterial Protein Extraction Reagent)(Thermo Scientific사제)을 첨가하고 용균시키고, 원심 분리(12000×g, 4℃, 5분간)함으로써 봉입체를 얻었다.
얻어진 봉입체를 32mL의 봉입체 가용화 시약(Inclusion Body Solubilization Reagent)(Thermo Scientific사제)으로 용해 후, 다시 원심 분리(12000×g, 4℃, 30분간)하고, 상청을 회수하였다.
봉입체 가용화액을 6mol/L 구아니딘염산염(와코준야쿠사제)을 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(와코준야쿠사제)(pH8.0)으로 3배 용량으로 희석 후, TALON 금속 친화성 수지(Metal Affinity Resin)(Clontech사제)에 첨가하였다. 6mol/L 구아니딘염산염을 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)으로 세정 후, 250mmol/L 이미다졸 및 6mol/L 구아니딘염산염을 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)으로 용출하였다. 280㎚의 흡광도를 측정함으로써, 용출액의 단백질 농도를 측정하였다.
리폴딩 버퍼[1mmol/L 산화형 글루타티온(Sigma-Aldrich사제)을 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)]로 상기 용출액을 3배 희석하고, 4℃에서 밤새 정치하였다. 그 후, Amicon Ultra-4(3kDa)(머크 밀리포아사제)로 농축하였다.
AKTA FPLC(GE 헬스케어사제)에 Superdex75 10/300GL(GE 헬스케어사제)을 접속하고, 이동상으로서 2mol/L 구아니딘염산염을 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)을 송액하였다. 상기 농축액을 SEC 칼럼에 첨가하고, 단량체 분획을 회수하였다.
얻어진 분획은 D-PBS(나카라이테스크사제)로 2배 희석하고 실온에서 6시간 정치 후, Amicon Ultra-4(3kDa)를 사용한 한계 여과에 의해 D-PBS에 버퍼 치환하였다.
제작한 모든 o-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 또는 m-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2는, SDS-PAGE에서 8His-IL-2와 동일한 분자량의 밴드인 것을 확인하였다.
[실시예 6] 대장균용 o-Az-Z-Lys 도입 IL-2 발현 벡터의 조제
표 11에 나타내는 대장균용 o-Az-Z-Lys 도입 IL-2 발현 벡터를 이하의 방법에 의해 제작하였다.
Figure pct00149
<표 11의 설명>
·Az-Z-Lys 도입 위치: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터의 위치
·1 위치 수식: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 알라닌 잔기의 수식을 나타낸다. MA란, N 말단 알라닌 잔기에 메티오닌이 결합하고 있는 것을 나타낸다. M이란, 알라닌으로부터 메티오닌으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 것을 나타낸다.
·125 위치 변이: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 125번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 나타낸다. 변이를 가하고 있지 않은 경우에는 -, 시스테인으로부터 세린으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 경우에는 S라고 기재한다.
표 중, 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 o-Az-Z-Lys란 하기 (식 10)으로 표시되는 구조를 말한다.
Figure pct00150
IL-2로서는, 서열 번호 1로 표현되는 야생형 성숙 인간 IL-2 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로부터 세린으로 치환하고, 또한 N 말단에 메티오닌 결합한 아미노산 서열을 포함하는 IL-2(아미노산 서열: 서열 번호 38, 당해 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열: 서열 번호 39), 또는 서열 번호 1로 표현되는 야생형 성숙 인간 IL-2 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로부터 세린으로 치환하고, 1번째의 알라닌 잔기를 결손하고, 또한 N 말단에 메티오닌 결합한 아미노산 서열(아미노산 서열: 서열 번호 40, 당해 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열: 서열 번호 41)을 포함하는 IL-2를 바탕으로 하여, 상기 발현 벡터를 제작하였다.
pFLAG-CTS-Pyl TS의 NdeI 제한 효소 사이트와 SalI 제한 효소 사이트의 사이에, o-Az-Z-Lys를 도입하는 부위에 상당하는 코돈을 앰버(TAG) 코돈으로 치환한 염기 서열(서열 번호 42 내지 50)을 삽입함으로써, 대장균용의 각종 o-Az-Z-Lys 도입 IL-2 발현 벡터(이하 pFLAG-CTS-Pyl TS_hIL-2라고 기재한다)를 제작하였다.
[실시예 7] o-Az-Z-Lys 도입 IL-2의 조제
표 12에 나타내는 IL-2의 임의의 아미노산 잔기를 o-Az-Z-Lys 잔기로 치환한 o-Az-Z-Lys 도입 IL-2는 이하의 방법으로 제작하였다.
Figure pct00151
<표 12의 설명>
·o-Az-Z-LysK 도입 위치: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터의 위치
·1 위치 수식: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 알라닌 잔기의 수식을 나타낸다. MA란, N 말단 알라닌 잔기에 메티오닌이 결합하고 있는 것을 나타낸다. M이란, 알라닌으로부터 메티오닌으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 것을 나타낸다.
·125 위치 변이: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 125번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 나타낸다. 변이를 가하고 있지 않은 경우에는 -, 시스테인으로부터 세린으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 경우에는 S라고 기재한다.
표 중, 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 o-Az-Z-Lys란 하기 (식 10)으로 표시되는 구조를 말한다.
Figure pct00152
실시예 6에서 제작한 대장균용 o-Az-Z-Lys 도입 IL-2 발현 벡터를 대장균 B-95. delA[Sci Rep, 2015. 5(9699)]에 도입하고, 실시예 5에 기재된 방법으로 봉입체 가용화액을 조제하였다.
AKTA FPLC에 HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR(GE 헬스케어사제)을 접속하고, 이동상으로서 2mol/L 구아니딘염산염을 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)을 송액하였다. 상기 봉입체 가용화액을 SEC 칼럼에 첨가하고, 단량체 분획을 회수하였다.
산화형 글루타티온을 2mmol/L이 되도록 첨가하고, 4℃에서 밤새 정치하였다. 그 후, Amicon Ultra-4(3kDa)(머크 밀리포아사제)로 농축하고 NAP 칼럼(GE 헬스케어사제)을 사용하여 0.4mol/L 아르기닌염산염, 5w/v％ 트레할로오스를 포함하는 10mmol/L 아세트산 완충액(pH4.5)에 버퍼 치환하였다.
제작한 o-Az-Z-Lys 도입 IL-2는, SDS-PAGE에서 아미노산 서열로부터 예상되는 분자량을 갖는 것을 확인하였다.
[실시예 8] o-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 또는 m-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 또는 o-Az-Z-Lys 도입 IL-2의 PEG화
표 13 내지 15에 나타내는 o-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 또는 m-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 또는 o-Az-Z-Lys 도입 IL-2의 PEG화체(이하 PEG 결합 IL-2 개변체라고 기재한다)를 이하의 방법으로 조제하였다.
Figure pct00153
Figure pct00154
Figure pct00155
<표 13, 14 및 15의 설명>
·PEG 도입 위치: 서열 번호 1의 N 말단으로부터의 위치
·1 위치 수식: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 알라닌 잔기의 수식을 나타낸다. MA란, N 말단 알라닌 잔기에 메티오닌이 결합하고 있는 것을 나타내고, MHHHHHHHHA란, N 말단 알라닌 잔기에 메티오닌 및 폴리히스티딘 서열(HHHHHHHH) 태그가 결합하고 있는 것을 나타낸다.
·125 위치 변이: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 125번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 나타낸다. 아미노산 잔기의 변이를 가하고 있지 않은 경우에는 -, 시스테인으로부터 세린으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 경우에는 S라고 기재한다.
표 중, 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 구조에 대하여 이하에 나타내었다.
(oAzZK)-PEG(PEG4, Li20, Li30, Li40, V40, V80, W40, W80, Y50, IIII40)란, 리신의 측쇄 아미노기에, 링커를 통하여 PEG가 도입된 하기 (식 11) 또는 (식 12)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00156
Figure pct00157
(mAzZK)-PEG(V40)란, 리신의 측쇄 아미노기에, 링커를 통하여 PEG가 도입된 하기 (식 XX4) 또는 (식 XX5)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00158
Figure pct00159
PEG4란 하기 (식 13)으로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00160
Li20이란, 평균 분자량 약 20kDa인 경우의 하기 (식 15)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00161
Li30이란, 평균 분자량 약 30kDa인 경우의 상기 (식 15)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Li40이란, 평균 분자량 약 40kDa의 하기 (식 X105)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00162
Y50이란, (CH2CH2O)m의 평균 분자량이 10kDa이며, (CH2CH2O)n의 평균 분자량이 20kDa인 하기 (식 X107)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00163
V40이란, 평균 분자량이 40kDa인 하기 (식 X109)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00164
V80이란, 평균 분자량이 80kDa인 상기 (식 X109)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
W40이란, (CH2CH2O)m의 평균 분자량이 5kDa이며, (CH2CH2O)n의 평균 분자량이 7.5kDa인 하기 (식 X111)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00165
W80이란, (CH2CH2O)m의 평균 분자량이 5kDa이며, (CH2CH2O)n의 평균 분자량이 17.5kDa인 하기 (식 X112)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00166
IIII40이란, 평균 분자량이 40kDa인 하기 (식 X113)으로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00167
(공정 1a) PEG-DBCO의 조제 1
PEG-카르복실산(mPEG-AA 40K; Creative PEG Works사제)을 클로로포름에 용해하고, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(5 당량), 4-디메틸아미노피리딘(5 당량), 디벤조시클로옥틴-아민(5 당량, A2763; 도꾜 가세이 고교)을 첨가하고 실온 하 3시간 교반하였다. 에테르/이소프로판올=1/1을 첨가하고, 석출한 고체를 여과취출함으로써 PEG-DBCO를 합성하였다.
(공정 1b) PEG-DBCO의 합성 2
PEG-NHS(SUNBRIGHT GL2-400GS2; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT GL2-800GS2; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT GL4-400GS2; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT GL4-800TS; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT GL2-400GS100U; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT XY4-400TS; 니찌유 가부시끼가이샤)를 클로로포름에 용해하고, 디벤조시클로옥틴-아민(5 당량, A2763; 도꾜 가세이 고교)을 첨가하고 실온 하 3시간 교반하였다. 에테르/이소프로판올=1/1을 첨가하고, 석출한 고체를 여과취출함으로써 PEG-DBCO를 합성하였다.
(공정 2) PEG 결합 IL-2 개변체의 조제
PEG-DBCO(DBCO-PEG4-FLAG(DYKDDDDK)(Jena Bioscience사제), DBCO-PEG 20kDa(Click Chemistry Tools사제), DBCO-PEG 30kDa(Click Chemistry Tools사제) 또는 공정 1a 혹은 공정 1b에서 조제한 PEG-DBCO를 D-PBS로 용해하고, 이것을 o-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 또는 m-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 또는 o-Az-Z-Lys 도입 IL-2에 20mol 당량 첨가하고, 실온에서 밤새 정치하였다.
DBCO-PEG4-FLAG을 결합시킨 PEG 결합 IL-2 개변체는 ANTI-FLAG M2 친화성 아가로스 겔(Affinity Agarose Gel)(Sigma-Aldrich사제)을 사용하여, 메이커 매뉴얼에 기재된 수순으로 목적 단백질을 정제하였다.
DBCO-PEG4-FLAG 이외의 PEG를 결합시킨 PEG 결합 IL-2 개변체는, 처음에 MonoS 5/50GL(GE 헬스케어사제)을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 미반응된 PEG를 제거하였다. 이동상에는 50mmol/L 인산 완충액(pH3.0)을 사용하였다. 계속하여 Superrose 6 increase 10/30GL(GE 헬스케어사제)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 PEG 결합 IL-2 개변체를 분취하였다. 이동상에는, 2mol/L 구아니딘염산염을 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)을 사용하였다.
얻어진 PEG 결합 IL-2 개변체는, Amicon Ultra-4(3kDa)를 사용한 한계 여과, 또는 NAP 칼럼에 의해 D-PBS 또는 5w/v％ 트레할로오스를 포함하는 10mM 아세트산 버퍼(pH4.5) 또는 0.4mol/L 아르기닌염산염, 5w/v％ 트레할로오스를 포함하는 10mM 아세트산 완충액(pH4.5)에 버퍼 치환하였다.
정제한 PEG 결합 IL-2 개변체의 순도를 SDS-PAGE로 확인하였다. 그 결과 모든 PEG 결합 IL-2 개변체에 있어서, o-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 또는 m-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 또는 o-Az-Z-Lys 도입 IL-2에 대하여 PEG의 분자량이 증가한 단일의 밴드가 보여서, 고순도의 PEG 결합 IL-2 개변체가 얻어진 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 9] I129C 변이 IL-2 발현 벡터의 조제
서열 번호 1로 표현되는 야생형 성숙 인간 IL-2 아미노산 서열의 1번째의 알라닌을 결손하고, 125번째의 아미노산 잔기를 시스테인으로부터 세린으로, 129번째의 아미노산 잔기를 이소류신으로부터 시스테인으로 치환하고, 또한 N 말단에 메티오닌이 결합한 아미노산 서열을 포함하는 IL-2(아미노산 서열: 서열 번호 51, 당해 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열: 서열 번호 52, 이하 IL-2_I129C라고 기재한다)를 바탕으로 하여, 상기 발현 벡터를 제작하였다.
IL-2_I129C의 염기 서열(서열 번호 52)을 인공 유전자 합성(가부시키가이샤라구아스 재팬)으로 조제하고, pET-22b(+)(Novagen사제)의 NdeI 제한 효소 사이트와 BamHI 제한 효소 사이트의 사이에 삽입함으로써, 대장균용의 IL-2_I129C 발현 벡터(이하 pET-22b(+)-hIL-2_I129C라고 기재한다)를 제작하였다.
Figure pct00168
<표 16의 설명>
·Cys 변이 위치: 서열 번호 1의 N 말단으로부터의 위치
·1 위치 수식: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 알라닌 잔기의 수식을 나타낸다. M이란, 알라닌으로부터 메티오닌으로 아미노산 잔기를 치환하고 있는 것을 나타낸다.
·125 위치 변이: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 125번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 나타낸다. 아미노산 잔기의 변이를 가하고 있지 않은 경우에는 -, 시스테인으로부터 세린으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 경우에는 S라고 기재한다.
[실시예 10] IL-2_I129C의 조제
IL-2_I129C를 하기에 기재된 방법으로 제작하였다. 실시예 9에서 제작한 대장균용 pET-22b(+)-hIL-2_I129C를 대장균 BL21(DE3)(Novagen사제)에 도입하고, 실시예 5에 기재된 방법으로 봉입체를 얻었다.
얻어진 봉입체를 15mL의 6mol/L 구아니딘염산염, 5mmol/L DTT, 5mmol/L EDTA를 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)으로 용해 후, 60℃에서 30분간 가온하고, 원심 분리(19000×g, 4℃, 30분간)함으로써 상청을 회수했다(봉입체 가용화액).
봉입체 가용화액에 15mL의 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)을 첨가하고 실온에서 10분간 정치 후, 원심 분리(19000×g, 4℃, 30분간)함으로써 침전을 회수하였다.
얻어진 침전을 다시 6mol/L 구아니딘염산염, 5mmol/L DTT, 5mmol/L EDAT를 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)으로 용해했다(침전 가용화액).
AKTA FPLC에 HiPrep 26/60 Sephacryl S-100HR(GE 헬스케어사제)을 접속하고, 이동상으로서 6mol/L 구아니딘염산염, 5mmol/L DTT, 5mmol/L EDTA를 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)을 송액하였다. 상기 침전 가용화액을 SEC 칼럼에 첨가하고, 단량체 분획을 회수하였다.
리폴딩은 이하의 방법으로 실시하였다. 상기에서 조제한 단량체 IL-2_I129C를 NAP 칼럼을 사용하여 6mol/L 구아니딘염산염을 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)에 버퍼 교환 후, 2mol/L 구아니딘염산염, 10vol％ 글리세롤, 6.9mmol/L 환원형 글루타티온, 0.7mmol/L 산화형 글루타티온을 포함하는 100mmol/L Tris-HCl 완충액(pH8.0)으로 하여, 실온에서 밤새 정치하였다. 그 후, Proteovavi(시세이도사제)를 사용한 역상 HPLC로 리폴딩 분획을 분취하고, 동결 건조하였다.
제작한 IL-2_I129C의 순도를 SDS-PAGE로 확인하였다. 그 결과, 아미노산 서열로부터 예상되는 분자량을 갖는 단일의 밴드를 확인하였다.
[실시예 11] IL-2_I129C의 PEG화
표 17에 나타내는 IL-2_I129C의 PEG화체(이하 PEG 결합 IL-2 개변체라고 기재한다)를 이하의 방법으로 조제하였다.
Figure pct00169
<표 17의 설명>
·PEG 도입 위치: 서열 번호 1의 N 말단으로부터의 위치.
·1 위치 수식: 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 1번째의 알라닌 잔기의 수식을 나타낸다. M이란, 알라닌으로부터 메티오닌으로 아미노산 잔기를 치환하고 있는 것을 나타낸다.
·125 위치 변이: 서열 번호 1의 N 말단으로부터 125번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 나타낸다. 아미노산 잔기의 변이를 가하고 있지 않은 경우에는 -, 시스테인으로부터 세린으로 아미노산 잔기를 치환하는 변이를 가하고 있는 경우에는 S라고 기재한다.
표 중, 치환 후의 아미노산 잔기의 열에 기재한 구조에 대하여 이하에 나타내었다.
C-PEG(Mal)(V40, V80, W80)란, 시스테인 측쇄에 3-(3-티오-2,5-디옥소피롤리딘-1-일)-프로필옥시 링커를 통하여 PEG가 도입된 하기 (식 X119)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다. 이때, C-PEG(Mal)는 디옥소피롤리딘환이 개환한 (식 X120) 또는 (식 X121)로 표시되는 구조여도 된다.
Figure pct00170
Figure pct00171
Figure pct00172
V40이란, 상기 (식 X119) 내지 (식 X121) 중, PEG가 평균 분자량 약 40kDa의 하기 (식 X122)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
Figure pct00173
V80이란, 상기 (식 X119) 내지 (식 X121) 중, PEG가 평균 분자량 약 80kDa인 상기 (식 X122)로 표시되는 구조인 것을 나타내고,
W80이란, 상기 (식 X119) 내지 (식 X121) 중, PEG가 (CH2CH2O)m의 평균 분자량이 5kDa이며, (CH2CH2O)n의 평균 분자량이 17.5kDa인 하기 (식 X128)로 표시되는 구조인 것을 나타낸다.
Figure pct00174
실시예 10에서 조제한 IL-2_I129C의 동결 건조품을 2mol/L 구아니딘염산염, 1mmol/L EDTA를 포함하는 20mmol/L Tris-HCl 완충액(pH7.0)으로 용해하였다. PEG-말레이미드(SUNBRIGHT GL2-400MA; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT GL2-800MA; 니찌유 가부시끼가이샤 또는 SUNBRIGHT GL4-800MA; 니찌유 가부시끼가이샤)를 D-PBS로 용해하고, 이것을 IL-2_I129C에 대하여 20mol 당량 첨가하고, 실온에서 밤새 정치하였다. PEG 결합 IL-2_I129C는, 실시예 8에 기재된 방법으로 정제하였다. 얻어진 PEG 결합 IL-2_I129C는, NAP 칼럼을 사용하여 0.4mol/L 아르기닌염산염, 5w/v％ 트레할로오스를 포함하는 10mM 아세트산 완충액(pH4.5)에 버퍼 치환하였다.
정제한 PEG 결합 IL-2 개변체의 순도를 SDS-PAGE로 확인하였다. 그 결과 모든 PEG 결합 IL-2 개변체에 있어서, IL-2_I129C에 대하여 PEG의 분자량이 증가한 단일의 밴드가 보여서, 고순도의 PEG 결합 IL-2 개변체가 얻어진 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 12] IL-2Rαβγ 선택성의 평가
제작한 IL-2 개변체의 인간 IL-2Rαβγ에 대한 선택성을 이하의 방법으로 평가하였다.
마우스 pro B 세포주 Ba/F3(RCB0805)에 인간 IL-2Rαβγ, 또는 인간 IL-2Rβγ을 발현시킴으로써, 인간 IL-2 의존성 생존 세포주를 제작하였다. 각 세포는, 인간 CD25, 인간 CD122, 인간 CD132 및 모노머 Azami-Green을 푸린 절단 서열(RAKR)과 구제역(foot-and-mouth-disease) 바이러스 유래 2A 펩티드 서열(APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP)을 통하여 연결한 인간 IL-2Rαβγ-Azamigreen 융합체의 아미노산 서열(서열 번호 19)을 코딩하는 유전자 서열(서열 번호 20) 또는 인간 CD122, 인간 CD132 및 모노머 Azami-Green을 푸린 절단 서열과 구제역 바이러스 유래 2A 펩티드 서열을 통하여 연결한 인간 IL-2Rβγ-Azamigreen 융합체의 아미노산 서열(서열 번호 21)을 코딩하는 유전자 서열(서열 번호 22)을 갖는 pDELTA 벡터를 Nucleofector 2b(Lonza사제)를 사용하여 Ba/F3에 유전자 도입하고, 인간 IL-2에 의존성을 나타내는 클론을 선발함으로써 얻었다. 얻어진 세포는 각각 Ba/F3-hIL-2Rαβγ 및 Ba/F3-hIL-2Rβγ로 하였다.
Ba/F3-hIL-2Rαβγ 및 Ba/F3-hIL-2Rβγ을 원심관에 회수하고, 1200rpm으로 3분간 원심 분리 후, 상청을 흡인 제거하였다. D-PBS로 4회 세정 후, 어세이용 배지[RPMI 1640 배지(나카라이테스크사제) 500mL에 비동화 FBS 50mL(GIBCO사제) 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액(나카라이테스크사제) 5mL를 첨가한 배지]에서 세포를 5.0×104cells/mL에 현탁하고, 96웰 백색 평평한 밑바닥 플레이트(스미토모 베이크라이트사제)에 100μL/well씩 파종하였다.
어세이용 배지(0％ 컨트롤), 어세이용 배지에서 390㎚ol/L로 희석한 시판 IL-2 용액(최종 농도 65㎚ol/L, 100％ 컨트롤) 및 어세이용 배지에서 최종 농도의 6배 농도로 희석한 시판 IL-2인 Peprotech사제 IL-2[이하, IL-2(P)라고 기재한다] 및 Thermo Fisher Scientific사제 IL-2[이하, IL-2(T)라고 기재한다] 또는 각종 당쇄 결합 IL-2 용액(최고 최종 농도 65nM, 10배의 희석 계열에서 9 조건)을 20μL/well씩 첨가하고, 37℃, 5％ CO2 하에서 24 내지 48시간 배양하였다.
Celltiter-Glo 용액(Promega사제)을 80μL/well씩 첨가하고, 실온에서 10분간 정치 후, 멀티플레이트 리더 ARVO(Perkin Elmer사제)에서 발광값을 측정하였다.
IL-2(P) 또는 IL-2(T)를 최종 농도 65㎚ol/mL로 첨가한 웰의 상대 형광 단위(RLU)값을 100％, IL-2를 포함하지 않는 배지를 첨가한 웰의 RLU값을 0％로 하고, 각종 개변체의 IL-2 의존성 세포 증식률(％ of IL-2-dependent proliferation)을 산출하였다. 얻어진 데이터를 기초로, 통계 해석 소프트웨어 XLfit5 version 5.3.1.3(IBDS사제)을 사용하여 EC50값의 산출을 행하였다.
IL-2(P) 또는 IL-2(T) 및 각종 당쇄 결합 IL-2 개변체에 관하여, Ba/F3-hIL-2Rαβγ에 대한 EC50값(EC50αβγ)과 Ba/F3-hIL-2Rβγ의 EC50값(EC50βγ)의 비(EC50βγ/EC50αβγ)를 EC50 ratio값으로 정의하고, IL-2Rαβγ 선택성의 지표로서 사용하였다.
IL-2(P) 또는 IL-2(T)의 EC50 ratio값을 1로 한 때의, 각종 당쇄 결합 IL-2 개변체의 EC50 ratio값을 표준화 EC50 ratio 값으로 하고, 표 18 내지 20에 나타내었다.
Figure pct00175
Figure pct00176
Figure pct00177
표 18 내지 20에 있어서, 표준화 EC50 ratio값이 5 이상인 당쇄 결합 IL-2 개변체 및 N말 PEG화, 당쇄 결합 IL-2 및 Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2를, 컨트롤인 IL-2(P) 또는 IL-2(T)보다도 IL-2Rαβγ 선택성이 높은 개변체라고 판단하였다.
표 18 내지 20에 나타내는 바와 같이, 다수의 당쇄 결합 IL-2 개변체 및 N말 PEG화, 당쇄 결합 IL-2 및 Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2가 IL-2(P) 또는 IL-2(T)보다도 IL-2Rαβγ 선택성이 높은 개변체인 것을 확인할 수 있었다. 또한, Q13C-2, Q13C-11, E15C-2, E15C-11, H16C-2, H16C-3, H16C-5, H16C-9, L19C-2, L19C-9, L19C-11, L19C-11*, N88C-2, I92C-2, S130C-2, S130C-9, E15C-17, L19C-17, L12C-11/V91C-11, L12C-11/V115C-11, L12C-11/N119C-11, Q13C-11/V91C-11, Q13C-11/V115C-11, Q13C-11/N119C-11, L19C-11/V115C-11, V91C-11/V115C-11, V91C-11/N119C-11, A1C-11/T3C-11/S5C-11/L12C-11/V91C-11, T3C-11/L12C-11/T51C-11/V91C-11/E100C-11, T3C-11/L12C-11/K76C-11/V91C-11/E100C-11, L12C-11/V91C-11/E100C-11/T102C-11/M104C-11, A1-Li20(CHO)/Q11C-9, A1-Li20(CHO)/L12C-9, A1-Li20(CHO)/R38C-9, A1-Li20(CHO)/V91C-9, A1C-Li40(IAc)/L12C-11/V91C-11, A1C-V80(Mal)/L12C-11/V91C-11, A1C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, A1C-Y50(Mal)/L12C-11/V91C-11, A1C-W80(Mal)/L12C-11/V91C-11, A1C-Y50(IAc)/L19C-11, A1C-V40(IAc)/L19C-11, A1C-Y50(IAc)/V91C-11/N119C-11, T3C-Li20(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Li40(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-2, T3C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(Mal)/L12C-11/V91C-11, T3C-V40(IAc)/E15C-11, T3C-V80(Mal)/E15C-11, T3C-Y50(IAc)/E15C-11, F78C-Li40(IAc)/L12C-11, F78C-V40(IAc)/L12C-11, F78C-V40(Mal)/L12C-11, F78C-V80(Mal)/L12C-11, F78C-W80(Mal)/L12C-11, F78C-Li40(IAc)/E15C-11은 표준화 EC50 ratio값이 30보다 크고, 컨트롤인 IL-2(P) 또는 IL-2(T)보다도 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 매우 높은 당쇄 결합 IL-2 개변체 및 N말 PEG화, 당쇄 결합 IL-2 및 Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2인 것을 확인할 수 있었다.
각종 PEG 결합 IL-2 개변체에 대해서도, 마찬가지의 방법으로 IL-2 의존성 세포 증식률을 측정하여 표준화 EC50 ratio값을 산출한 결과를, 표 21 및 표 22에 나타내었다. 단, 당쇄 결합 IL-2 개변체의 컨트롤은 IL-2(P) 또는 IL-2(T)였던 것에 반해, PEG 결합 IL-2 개변체의 컨트롤은 IL-2(P) 또는 8His-IL-2를 사용하였다.
Figure pct00178
Figure pct00179
표 21 및 표 22에 있어서, 표준화 EC50 ratio값이 5 이상인 PEG 결합 IL-2 개변체를, 컨트롤인 8His-IL-2보다도 IL-2Rαβγ 선택성이 높은 개변체라고 판단하였다.
표 21 및 표 22에 나타내는 바와 같이, 다수의 PEG 결합 IL-2 개변체가 8His-IL-2보다도 IL-2Rαβγ 선택성이 높은 개변체인 것을 확인할 수 있었다. 또한 8His-F78(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li40, 8His-F78(oAzZK)-V40, 8His-F78(oAzZK)-W40, 8His-F78(oAzZK)-Y50, F78(oAzZK)-Li40, F78(oAzZK)-V40, F78(oAzZK)-W40, F78(oAzZK)-IIII40, F78(oAzZK)-V80, F78(oAzZK)-W80, 8His-I129(oAzZK)-Li30, 8His-I129(oAzZK)-Li40, 8His-I129(oAzZK)-V40, 8His-I129(mAzZK)-V40, 8His-I129(oAzZK)-W40, 8His-I129(oAzZK)-Y50, I129(oAzZK)-Li30, I129(oAzZK)-Li40, I129(oAzZK)-V40, I129(oAzZK)-W40, I129(oAzZK)-IIII40, I129(oAzZK)-V80, I129(oAzZK)-W80, desAla-I129(oAzZK)-V40, desAla-I129(oAzZK)-W80, desAla-I129(oAzZK)-V80, I129C-V40(Mal), I129C-V80(Mal), I129C-W80(Mal), 8His-S4(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, S4(oAzZK)-Li40/F78(oAzZK)-Li40, S4(oAzZK)-Y50/F78(oAzZK)-Y50, 8His-S5(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, S5(oAzZK)-Li40/F78(oAzZK)-Li40, 8His-K8(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, K8(oAzZK)-Li40/F78(oAzZK)-Li40, 8His-F78(oAzZK)-Li30/H79(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/S99(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 8His-S4(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 8His-S4(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, S4(oAzZK)-Li40/I129(oAzZK)-Li40, S4(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-S5(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, S5(oAzZK)-Li40/I129(oAzZK)-Li40, S5(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-K8(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 8His-K8(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, K8(oAzZK)-Li40/I129(oAzZK)-Li40, K8(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-H79(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30 및 8His-S99(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30은 표준화 EC50 ratio값이 30보다 크고, 컨트롤인 IL-2(P) 또는 8His-IL-2보다도 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 매우 높은 PEG 결합 IL-2 개변체인 것을 확인할 수 있었다.
상기 실험에 있어서, IL-2(P), IL-2(T), 야생형 IL-2 및 8His-IL-2의 EC50 ratio값이 동 정도인 것을 확인하고 있다. 따라서, 표 18 내지 20에 있어서 표준화 EC50 ratio값이 5 이상인 당쇄 결합 IL-2 개변체, 및 PEG화 당쇄 결합 IL-2 개변체, 그리고 표 21 및 표 22에 있어서 표준화 EC50 ratio값이 5 이상인 PEG 결합 IL-2 개변체는, 야생형 IL-2보다도 IL-2Rαβγ 선택성이 높은 개변체이다.
[실시예 13] Treg 증식 활성
각종 IL-2의 인간 Treg에 대한 세포 증식 활성을 이하의 방법으로 측정하였다. 각종 IL-2로서, 당쇄 결합 IL-2 개변체로서 H16C-2, E15C-11, L19C-9, L19C-11, N88C-2, L12C-11/V91C-11, V91C-11/V115C-11, V91C-11/N119C-11 및 A1C-11/T3C-11/S5C-11/L12C-11/V91C-11, Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체로서, A1C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Li20(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(IAc)/E15C-11, T3C-V40(IAc)/E15C-11, T3C-V80(Mal)/E15C-11 및 F78C-V40(IAc)/L12C-11, PEG 결합 IL-2 개변체로서, 8His-S4(oAzZK)-Li20, 8His-S5(oAzZK)-Li20, 8His-S6(oAzZK)-Li20, 8His-T7(oAzZK)-Li20, 8His-K8(oAzZK)-Li20, 8His-E60(oAzZK)-Li20, 8His-F78(oAzZK)-Li20, 8His-F78(oAzZK)-V40, 8His-F78(oAzZK)-W40, 8His-H79(oAzZK)-Li20, 8His-R81(oAzZK)-Li20, 8His-L94(oAzZK)-Li20, 8His-S99(oAzZK)-Li20, 8His-E100(oAzZK)-Li20, 8His-T101(oAzZK)-Li20, 8His-Q126(oAzZK)-Li20, 8His-I129(oAzZK)-Li20, 8His-I129(oAzZK)-Li40, 8His-I129(oAzZK)-V40, 8His-I129(oAzZK)-W40, 8His-I129(oAzZK)-Y50, I129(oAzZK)-V40, I129(oAzZK)-W80, I129C-V40(Mal), 8His-S4(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-S5(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-K8(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/H79(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/S99(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 8His-S4(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, S4(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-S5(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, S5(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-K8(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, K8(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-H79(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30 및 8His-S99(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30 그리고 컨트롤로서 IL-2(P) 및 8His-IL-2를 사용하였다.
동결 인간 말초혈단핵구 세포(PBMC)(AllCells사제)를 37℃의 온욕에서 용해 후, 배양용 배지[X-vivo15 SFM(Lonza사제) 1000mL, 비동화 인간 AB 혈청(SIGMA사제) 150mL] 10mL에 현탁하고, 접착용 T-75 플라스크(greiner bio-one사제)에 파종하여 24시간 정치 배양했다(37℃, 95vol％ air/5vol％ CO2 하). 세포를 전량 회수하고, EasySep 인간 CD4+ T 세포 풍부화 키트(Enrichment kit)(STEMCELL Technologies사제)를 사용하여 CD4+T 세포를 농축하였다.
항-인간 CD4-Alexa 488(Biolegend사제), 항-인간 CD25-PE(BD Pharmingen사제), 항-인간 CD127-BV421(Biolegend사제)로 염색 후(빙상, 30분간), 셀 소터 SH800(SONY사제)으로 CD4+CD25+CD127low 분획(Treg)을 분리하였다.
분리한 Treg 및 배양용 배지에서 3회 세정한 CD3/CD28 Dynabeads(Thermo Fischer SCIENTIFIC사제)를 혼합하고, 각각 3.4×104개/mL로 되도록 배양용 배지에서 현탁하고, 96웰 U 바닥 플레이트(corning사제)에 150μL/well씩 파종하였다. 배양용 배지에서 최종 농도의 4배 농도로 희석한 각종 IL-2 용액을 50μL/well씩 첨가하고, 37℃, 5％ CO2 하에서 배양을 개시하였다.
5 내지 7일간 배양한 후, 각 웰의 전액량 중 50μL를, 96웰 백색 플레이트에 옮겼다. Celltiter-Glo 용액을 50μL/well씩 첨가하고, 실온에서 10분간 정치한 후, 루미노미터(TURNER BIOSYSTEMS사제)로 발광값을 측정하였다.
컨트롤의 IL-2(P) 또는 8His-IL-2를 최종 농도 65㎚ol/L로 첨가한 웰의 RLU값을 100％, IL-2를 포함하지 않는 배지를 첨가한 웰의 RLU값을 0％로 하여, 각종 IL-2의 Treg 증식률을 산출하였다.
얻어진 결과를 도 1a 내지 1j에 나타내었다. 도 1a 내지 1c에 도시하는 바와 같이, IL-2(P)는 IL-2 농도 650pmol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타낸 것에 비해, 당쇄 결합 IL-2 개변체인 H16C-2, E15C-11, L19C-9, L19C-11*, N88C-2, L12C-11/V91C-11, V91C-11/V115C-11 및 V91C-11/N119C-11, Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체인 T3C-Y50(IAc)/E15C-11은, IL-2 농도 650 내지 6500pmol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타냈다.
또한, Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체인, L12C-11/F78C-V40(IAc)은 IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타냈다. 당쇄 결합 IL-2 개변체인, A1C-11/T3C-11/S5C-11/L12C-11/V91C-11, Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체인, A1C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Li20(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-V40(IAc)/E15C-11 및 T3C-V80(Mal)/E15C-11은, IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서도 IL-2 의존성 세포 증식률은 80％ 이하였다.
또한, 도 1d 내지 1j에 도시하는 바와 같이, 컨트롤인 8His-IL-2는 IL-2 농도 6500pmol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타낸 것에 비해, PEG 결합 IL-2 개변체인 8His-S4(oAzZK)-Li20, 8His-S5(oAzZK)-Li20, 8His-S6(oAzZK)-Li20, 8His-T7(oAzZK)-Li20, 8His-K8(oAzZK)-Li20, 8His-E60(oAzZK)-Li20, 8His-F78(oAzZK)-Li20, 8His-F78(oAzZK)-V40, 8His-F78(oAzZK)-W40, 8His-H79(oAzZK)-Li20, 8His-R81(oAzZK)-Li20, 8His-L94(oAzZK)-Li20, 8His-S99(oAzZK)-Li20, 8His-E100(oAzZK)-Li20, 8His-T101(oAzZK)-Li20, 8His-Q126(oAzZK)-Li20, 8His-I129(oAzZK)-Li20, 8His-I129(oAzZK)-Li40, 8His-I129(oAzZK)-V40, 8His-I129(oAzZK)-W40, 8His-I129(oAzZK)-Y50, I129(oAzZK)-V40, I129C-V40(Mal), 8His-S4(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-S5(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-K8(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/S99(oAzZK)-Li30, 8His-S4(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 8His-S5(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 8His-K8(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 및 8His-S99(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30은, IL-2 농도 650 내지 6500pmol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타냈다.
또한, PEG 결합 IL-2 개변체인 I129(oAzZK)-W80, 8His-F78(oAzZK)-Li30/H79(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, S4(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, S5(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, K8(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50 및 8His-H79(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30은, IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타냈다.
이상의 결과로부터, 평가한 모든 IL-2 개변체가 Treg의 세포 증식 활성을 갖는 것이 확인되었다. 또한, 컨트롤인 IL-2(P) 또는 8His-IL-2(P)에 대하여 각종 IL-2 개변체, 당쇄 결합 IL-2 개변체인 H16C-2, E15C-11, L19C-9, L19C-11*, N88C-2, L12C-11/V91C-11, V91C-11/V115C-11 및 V91C-11/N119C-11, Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체인 T3C-Y50(IAc)/E15C-11, 그리고 PEG 결합 IL-2 개변체인 8His-S4(oAzZK)-Li20, 8His-S5(oAzZK)-Li20, 8His-S6(oAzZK)-Li20, 8His-T7(oAzZK)-Li20, 8His-K8(oAzZK)-Li20, 8His-E60(oAzZK)-Li20, 8His-F78(oAzZK)-Li20, 8His-F78(oAzZK)-V40, 8His-F78(oAzZK)-W40, 8His-H79(oAzZK)-Li20, 8His-R81(oAzZK)-Li20, 8His-L94(oAzZK)-Li20, 8His-S99(oAzZK)-Li20, 8His-E100(oAzZK)-Li20, 8His-T101(oAzZK)-Li20, 8His-Q126(oAzZK)-Li20, 8His-I129(oAzZK)-Li20, 8His-I129(oAzZK)-Li40, 8His-I129(oAzZK)-V40, 8His-I129(oAzZK)-W40, 8His-I129(oAzZK)-Y50, I129(oAzZK)-V40, I129C-V40(Mal), 8His-S4(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-S5(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-K8(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/S99(oAzZK)-Li30, 8His-S4(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 8His-S5(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 8His-K8(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 및 8His-S99(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30의 Treg 증식 활성은 유지되어 있었다.
또한, 컨트롤인 IL-2(P) 또는 8His-IL-2(P)에 대하여 각종 IL-2 개변체, 당쇄 결합 IL-2 개변체인 A1C-11/T3C-11/S5C-11/L12C-11/V91C-11, Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체인 A1C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Li20(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-V40(IAc)/E15C-11, T3C-V80(Mal)/E15C-11 및 F78C-V40(IAc)/L12C-11, PEG 결합 IL-2 개변체인, I129(oAzZK)-W80, 8His-F78(oAzZK)-Li30/H79(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, S4(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, S5(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, K8(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50 및 8His-H79(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30의 Treg 증식 활성은 저하되었다.
[실시예 14] NK 세포 증식 활성
각종 IL-2의 인간 NK 세포의 세포 증식 활성을 이하의 방법으로 측정하였다. 각종 IL-2 개변체로서, 당쇄 결합 IL-2 개변체로서, H16C-2, E15C-11, L19C-9, L19C-11*, N88C-2, L12C-11/V91C-11, V91C-11/V115C-11, V91C-11/N119C-11 및 A1C-11/T3C-11/S5C-11/L12C-11/V91C-11, Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체로서, A1C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Li20(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(IAc)/E15C-11, T3C-V40(IAc)/E15C-11, T3C-V80(Mal)/E15C-11 및 F78C-V40(IAc)/L12C-11, PEG 결합 IL-2 개변체로서, 8His-S4(oAzZK)-Li20, 8His-S5(oAzZK)-Li20, 8His-S6(oAzZK)-Li20, 8His-T7(oAzZK)-Li20, 8His-K8(oAzZK)-Li20, 8His-E60(oAzZK)-Li20, 8His-F78(oAzZK)-Li20, 8His-F78(oAzZK)-V40, 8His-F78(oAzZK)-W40, 8His-H79(oAzZK)-Li20, 8His-R81(oAzZK)-Li20, 8His-L94(oAzZK)-Li20, 8His-S99(oAzZK)-Li20, 8His-E100(oAzZK)-Li20, 8His-T101(oAzZK)-Li20, 8His-Q126(oAzZK)-Li20, 8His-I129(oAzZK)-Li20, 8His-I129(oAzZK)-Li40, 8His-I129(oAzZK)-V40, 8His-I129(oAzZK)-W40, 8His-I129(oAzZK)-Y50, I129(oAzZK)-V40, I129(oAzZK)-W80, I129C-V40(Mal), 8His-S4(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-S5(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-K8(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/H79(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/S99(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 8His-S4(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, S4(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-S5(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, S5(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-K8(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, K8(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-H79(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30 및 8His-S99(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30 그리고 컨트롤로서 IL-2(P) 및 8His-IL-2를 사용하였다.
인간 PBMC로부터의 NK 세포의 분리는 하기 방법으로 실시하였다. 실시예 13에 기재된 방법으로 동결 인간 PBMC를 해동(압축 해제)하고, NK 세포 단리 키트(Isolation Kit) 인간(Miltenyi Biotech사제)을 사용하여 CD56+ NK 세포를 분리하였다. 분리한 세포를 배양용 배지에서 3회 세정 후(1500rpm, 실온, 5분간), 하기의 증식 어세이에 제공하였다.
분리한 NK 세포를 1.3×105cells/mL로 되도록 배양용 배지 또는 X-vivo 10 SFM(Lonza사제)에서 현탁하고, 96웰 U 바닥 플레이트에 150μL/well(2×104cells/well)씩 파종하였다. 배양용 배지 또는 X-vivo 10 SFM에서 최종 농도의 4배 농도로 희석한 IL-2 용액을 50μL/well씩 첨가하고, 37℃, 5％ CO2 하에서 4 내지 6일간 배양하였다. 그 후, 각종 IL-2의 NK 세포 증식률을 실시예 13에 기재된 방법으로 산출하였다.
증식용 배지를 사용하여 얻어진 결과를 도 2a 내지 2h에, X-vivo 10 SFM을 사용하여 얻어진 결과를 도 2i 내지 2k에 나타내었다.
도 2a, 2h 및 2k에 도시하는 바와 같이, IL-2(P)는 증식용 배지에서는 IL-2 농도 6500pmol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타낸 것에 비해, 당쇄 결합 IL-2 개변체인, H16C-2 및 L19C-9는, IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서도 IL-2 의존성 세포 증식률은 20％ 이상 80％ 미만이고, 당쇄 결합 IL-2 개변체인, N88C-2 및 L12C-11/V91C-11, Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체인, A1C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Li20(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(IAc)/E15C-11, T3C-V40(IAc)/E15C-11, T3C-V80(Mal)/E15C-11 및 L12C-11/F78C-V40(IAc)은 IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서도 IL-2 의존성 세포 증식률은 20％ 미만을 나타냈다.
또한, IL-2(P)는 X-vivo 10 SFM에서는 IL-2 농도 65pmol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타낸 것에 비해, 당쇄 결합 IL-2 개변체인, E15C-11은 IL-2 농도 6500pmol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타내고, 당쇄 결합 IL-2 개변체인, L19C-11*, V91C-11/V115C-11 및 V91C-11/N119C-11은, IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타내고, 당쇄 결합 IL-2 개변체인, A1C-11/T3C-11/S5C-11/L12C-11/V91C-11은 IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서도 IL-2 의존성 세포 증식률은 20％ 이하였다.
이어서 도 2b 내지 2g 및 2i 내지 2j에 도시하는 바와 같이, 8His-IL-2는 증식용 배지에서는 IL-2(P)와 마찬가지로 IL-2 농도 6500pmol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타낸 것에 비해, PEG 결합 IL-2 개변체인, 8His-S4(oAzZK)-Li20, 8His-S5(oAzZK)-Li20, 8His-S6(oAzZK)-Li20, 8His-T7(oAzZK)-Li20, 8His-K8(oAzZK)-Li20, 8His-E60(oAzZK)-Li20, 8His-F78(oAzZK)-Li20, 8His-H79(oAzZK)-Li20, 8His-R81(oAzZK)-Li20, 8His-L94(oAzZK)-Li20, 8His-S99(oAzZK)-Li20, 8His-E100(oAzZK)-Li20, 8His-T101(oAzZK)-Li20 및 8His-Q126(oAzZK)-Li20 은 IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타내고, PEG 결합 IL-2 개변체인, 8His-I129(oAzZK)-Li20, 8His-F78(oAzZK)-V40, 8His-F78(oAzZK)-W40, 8His-I129(oAzZK)-Li40, 8His-I129(oAzZK)-V40, 8His-I129(oAzZK)-W40 및 8His-I129(oAzZK)-Y50은 IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 20％ 이상 80％ 미만이고, PEG 결합 IL-2 개변체인, I129(oAzZK)-W80, I129C-V40(Mal), 8His-S4(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, S4(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-S5(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, S5(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-K8(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30 및 K8(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50은 IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서도 IL-2 의존성 세포 증식률은 20％ 미만이었다. 또한, IL-2(P)는 X-vivo 10 SFM에서는 IL-2 농도 65pmol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타낸 것에 비해, PEG 결합 IL-2 개변체인, I129(oAzZK)-V40, 8His-S5(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30 및 8His-F78(oAzZK)-Li30/S99(oAzZK)-Li30은 IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률이 80％ 이상을 나타내고, PEG 결합 IL-2 개변체인, 8His-S4(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-K8(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/H79(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30 및 8His-H79(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30은 IL-2 농도 65㎚ol/L에 있어서도 IL-2 의존성 세포 증식률은 20％ 이상 80％ 미만이었다. 8His-S99(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30은 최대 첨가 농도 6500pmol/L에 있어서 IL-2 의존성 세포 증식률은 30％였다.
이상의 결과로부터, 평가한 모든 IL-2 개변체에 있어서 NK 세포에 대한 세포 증식 활성이 저하되어 있는 것이 확인되었다. 특히, 당쇄 결합 IL-2 개변체인 H16C-2, E15C-11, L19C-9, L19C-11*, N88C-2, L12C-11/V91C-11, V91C-11/V115C-11, V91C-11/N119C-11 및 A1C-11/T3C-11/S5C-11/L12C-11/V91C-11, Cys-PEG화, 당쇄 결합 IL-2 개변체인 A1C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Li20(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(IAc)/L12C-11/V91C-11, T3C-Y50(IAc)/E15C-11, T3C-V40(IAc)/E15C-11, T3C-V80(Mal)/E15C-11 및 L12C-11/F78C-V40(IAc), PEG 결합 IL-2 개변체인 8His-F78(oAzZK)-V40, 8His-F78(oAzZK)-W40, 8His-I129(oAzZK)-Li20, 8His-I129(oAzZK)-Li40, 8His-I129(oAzZK)-V40, 8His-I129(oAzZK)-W40, 8His-I129(oAzZK)-Y50, I129(oAzZK)-V40, I129(oAzZK)-W80, I129C-V40(Mal), 8His-S4(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-S5(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-K8(oAzZK)-Li30/F78(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/H79(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/S99(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, 8His-S4(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, S4(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-S5(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, S5(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-K8(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30, K8(oAzZK)-Y50/I129(oAzZK)-Y50, 8His-H79(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30 및 8His-S99(oAzZK)-Li30/I129(oAzZK)-Li30은, 컨트롤인 IL-2(P) 및 8His-IL-2보다도 크게 세포 증식 활성이 저하되어 있는 것이 확인되었다.
Treg는 IL-2Rαβγ을 발현하고 있고, NK 세포는 IL-2Rβγ을 발현하고 있다. 실시예 13 및 14의 결과로부터, 평가한 모든 IL-2 개변체는, IL-2Rβγ을 발현하는 NK 세포가 아니라, IL-2Rαβγ을 발현하는 Treg를 선택적으로 증식시키는 것이 명확해졌다.
[실시예 15] IL-2 자극 Treg에 의한, Tresp의 증식 저해 활성
이하에 기재하는 방법으로, 각종 IL-2로 자극하여 증식시킨 인간 Treg에 의한, 인간 Tresp의 증식 저해 활성을 측정하였다. 모든 세포는 동일 로트의 동결 인간 PBMC로부터 분리하였다. 각종 IL-2로서는, 당쇄 결합 IL-2 개변체 H16C-2, L19C-9, 및 N88C-2 그리고 컨트롤로서 IL-2(P)를 사용하였다.
어세이 7일 전에, 실시예 13에 기재된 방법으로, 동결 인간 PBMC로부터 Treg를 분리하였다. 얻어진 Treg를 CD3/CD28 Dynabeads(Treg:beads=1:1) 및 각종 IL-2(최종 농도 65nM) 존재 하에서 7일간 배양하였다. 얻어진 세포를 IL-2 자극 Treg로 하였다.
시험 당일의 세포 조제는 다음과 같이 실시하였다. 실시예 13에 기재된 방법으로 동결 인간 PBMC로부터 Treg를 분리하고, 이것을 미자극 Treg으로 하였다. 동결 인간 PBMC로부터 EasySep 인간 T 세포 풍부화 키트(STEMCELL Technologies사제) 및 EasySep 인간 Pan-CD25 양성 선택 및 고갈 키트(Positive Selection and Depletion Kit)(STEMCELL Technologies사제)를 사용하여 CD3+CD25-T 세포를 분리 후, 10％ FBS 함유 RPMI1640 배지에서 40㎛ol/L로 희석한 Celltrace violet(Thermo Fischer SCIENTIFIC사제)을 실온에서 5분간 반응시킴으로써 세포를 라벨링하였다.
얻어진 세포는 반응자 T 세포(Tresp)로 하였다. 동결 인간 PBMC로부터 항-HLA-DR 마이크로비드(MicroBeads), 인간(Miltenyi Biotec사제)을 사용하여 HLA-DR+ 세포를 분리하였다. 얻어진 세포는 APC(Antigen presenting cell; 항원 제시 세포)로 하였다.
얻어진 세포는 항CD3 항체 OKT3(Biolegend사제)을 최종 농도 0.5μg/mL로 되도록 첨가한 X-vivo 15 SFM으로 현탁 후, Tresp은 2×104cells/well(50μL), APC는 1×105cells/well(50μL), Treg는 1.6×102 내지 5×103cells/well(50μL)(Tresp: Treg=4:1 내지 128:1)로 96웰 V 바닥 플레이트(스미토모 베이크라이트사제)에 파종하고, 37℃, 5％ CO2 하에서 4일간 배양하였다.
그 후, 세포를 항-인간 CD4-APC(BD Pharmingen사제) 및 항-인간 CD8-PE(BD Pharmingen사제)로 염색(실온에서 15분간)한 후에, 플로우 사이토미터 FACS Canto II(BD Biosciences사제)로 각종 형광 강도를 측정하였다.
얻어진 데이터는, FCS 파일로서 출력한 후에, 데이터 해석 소프트웨어FLowJo(TreeStar, version7.6.5)를 사용하여 CD4+Tresp 또는 CD8+Tresp에 있어서의 세포의 평균 분열 횟수인 분열 지수(division index)값에 대하여 해석을 행하였다.
APC와 Tresp을 첨가하고, Treg 무첨가의 웰의 분열 지수값을 100％ 컨트롤, Tresp만 첨가한 웰의 분열 지수값을 0％ 컨트롤로 하고, 미자극 Treg, 또는 IL-2 자극 Treg 첨가 시의 Tresp의 세포 증식률을 산출하였다. 얻어진 결과를 도 3의 (A) 및 도 3의 (B)에 도시하였다.
도 3의 (A) 및 도 3의 (B)에 도시하는 바와 같이, CD4+Tresp 및 CD8+Tresp의 세포 증식은, 미자극 Treg를 사용한 경우, Treg를 최대량의 5×103cells/well(Tresp:Treg=4:1)로 첨가한 경우에도 저해되지 않았다.
한편, IL-2(P), 당쇄 결합 IL-2 개변체 H16C-2, L19C-9, 및 N88C-2를 사용하여 자극하고, 증식시킨 IL-2 자극 Treg를 첨가한 경우에는, 모두 미자극 Treg를 첨가했을 때보다도 Tresp의 증식이 저해되었다.
IL-2 자극 Treg에 의해, CD4+Tresp의 증식은 최대 40 내지 60％ 정도, CD8+Tresp의 증식은 최대 30 내지 40％ 정도 저해되었다. 시판 IL-2로 자극한 Treg과, 당쇄 결합 IL-2 개변체로 자극한 Treg는, Tresp의 증식 저해율은 동등하였다.
이상의 결과로부터, 제작한 당쇄 결합 IL-2 개변체는, Treg의 억제 활성을 IL-2(P)와 동일 정도로 증강하는 것이 명확해졌다.
[실시예 16] 생체외 어세이
각종 IL-2로 자극한 인간 PBMC의 각종 사이토카인의 산생량을 이하에 기재하는 방법으로 측정하였다. 각종 IL-2로서는, 당쇄 결합 IL-2 개변체 H16C-2, L19C-9, 및 N88C-2 그리고 포지티브 컨트롤로서 IL-2(P)를 사용하였다.
인간 말초혈을 15mL 원심관에 분주 후, 2000rpm으로 10분간 원심 분리하고, 상청을 회수함으로써 인간 혈장을 얻었다. 얻어진 혈장은 0.22㎛ 필터를 사용하여 여과 멸균하였다. 회수한 혈장과 등량의 PBS를 말초혈에 첨가하여 희석 후, Ficoll Paque plus(GE 헬스케어사제)를 사용한 밀도 구배 원심법에 의해 인간 PBMC를 얻었다.
얻어진 인간 PBMC를 자기 혈장에서 5×106cells/mL로 현탁하고, 거기에 항CD3 항체 OKT3을 최종 농도 0.5μg/mL로 되도록 첨가하였다. 96웰 U 바닥 플레이트에 180μl/well로 파종 후, 0.1％ BSA-PBS에서 최종 농도의 10배 농도로 희석한 각종 IL-2를 20μl/well씩 첨가하였다. 37℃, 5％ CO2 하에서 5일간 배양 후, 배양 상청을 회수하고, 상청 중의 사이토카인 산생량을 Human Th1/2/17 CBA 키트(BD Biosciences사제)를 사용하여 정량하였다.
또한 얻어진 인간 PBMC를 사용하여, 이하에 기재하는 방법으로 각종 IL-2의 Treg 선택적 증식 활성을 측정하였다. 인간 PBMC와, 항-인간 CD4-Alexa 488을 반응 후, PerFix-EXPOSE 포스포 에피토프 노출 키트(Phospho Epitope Exposure Kit)(Beckman Coulter사제)의 PerFix EXPOSE 버퍼 1 및 PerFix EXPOSE 버퍼 2를 사용하여 세포의 고정 및 투과 처리를 행한 후에, 항-인간 CD25-PE(BD Biosciences사제)와 항-인간 Foxp3 Alexa 647(Biolegend사제, Cat#320214)을 포함하는 PerFix EXPOSE 버퍼 3을 첨가하고, 세포를 염색했다(차광, 실온, 60분간).
또한, PerFix EXPOSE 버퍼 4를 첨가하여 세포를 2회 세정 후(2500rpm, 3분간 원심 분리), 플로우 사이토미터 LSRFortessa(BD Biosciences사제)에서 각종 형광 강도를 측정하였다.
얻어진 데이터는, FCS 파일로서 출력한 후에, 데이터 해석 소프트웨어FLowJo(TreeStar사제, version7.6.5)를 사용하여 해석을 행하였다. CD4 양성 분획의 중에서, CD25+Foxp3high 분획을 Treg, CD25+Foxp3low 분획을 이펙터 T 세포(Teff)로서, 그의 존재비[Treg(％)/Teff(％)]를 산출하고, Treg 선택적 증식 활성의 지표로 하였다.
측정된 사이토카인 산생량의 결과를 도 4의 (A) 내지 도 4의 (E)에 도시하였다. 도 4의 (A) 내지 도 4의 (E)에 도시하는 바와 같이, IL-2(P)는 측정한 사이토카인 중, IL-4, IL-6, IL-10, IFNγ 및 TNFα의 모든 사이토카인의 산생을 촉진하고 있었다.
한편, 당쇄 결합 IL-2 개변체에서는 IL-6 및 IL-10 산생량은 시판 IL-2와 동일 정도였지만, IL-4, IFNγ 및 TNFα의 산생량이 저하되어 있었다. IL-17A의 산생은 어느 배양 조건에서도 검출 한계 이하였다.
IL-10은 항염증성 사이토카인이며, IL-6, IL-4, IFNγ, 및 TNFα은 염증성 사이토카인이다.
이상의 결과로부터, 제작한 당쇄 결합 IL-2 개변체의 염증성 사이토카인의 산생 촉진 활성은, IL-2(P)보다도 대폭으로 저하되어 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 얻어진 Treg/Teff비를 도 4의 (F)에 도시하였다. 도 4의 (F)에 도시하는 바와 같이, IL-2(P)에서 자극한 경우의 Treg/Teff비는 0.2 내지 0.3 정도였다. 한편, 당쇄 결합 IL-2 개변체 H16C-2, L19C-9, 및 N88C-2로 자극한 경우의 Treg/Teff비는, 모두 0.3 내지 0.5 정도였다.
이상의 결과로부터, 생체 내의 환경에 가까운 다양한 면역 세포가 존재하는 배양 조건 하에 있어서, 제작한 당쇄 결합 IL-2 개변체는 IL-2(P)와 비교하여, Teff보다도 Treg를 선택적으로 증식시키는 것이 명확해졌다. Treg 및 Teff는 모두 IL-2Rαβγ을 발현하고 있지만, 당해 IL-2 개변체는, Teff보다도 Treg를 선택적으로 증식시키는 성질을 갖고, 염증을 진정화시키기에 바람직한 IL-2 개변체이다.
[실시예 17] 친화성 해석
하기의 방법으로, 각종 IL-2의 인간 CD25ECD-Fc 및 인간 IL-2RβγECD-Fc에 대한 친화성을 측정하였다. 각종 IL-2로서, 당쇄 결합 IL-2 개변체 L12C-2, L12C-9, L12C-11, H16C-2, L19C-9, L12C-11, N88C-2 및 V91C-11, 그리고 컨트롤로서 야생형 IL-2, 8His-IL-2 및 IL-2(P)를 사용하였다.
인간 CD25ECD-Fc 및 인간 IL-2RβγECD-Fc 인간 CD25의 세포외 영역과 C 말단에 Avitag 서열(GLNDIFEAQKIEWHE)을 갖는 인간 IgG1 유래 Fc를 포함하는 CD25ECD-Fc-Avitag의 아미노산 서열(서열 번호 23)을 기초로 설계한 염기 서열(서열 번호 24)을 INPEP4 벡터의 BglII 제한 효소 사이트와 BamHI 제한 효소 사이트에 삽입함으로써, 포유류 세포용의 인간 CD25ECD-Fc-Avitag 발현 벡터를 제작하였다.
또한, 인간 CD122의 세포외 영역과 Y354C/T366W 변이 및 C 말단에 Avitag 서열 및 폴리히스티딘 태그 서열(HHHHHHHH)을 갖는 인간 IgG1 유래 Fc 영역을 포함하는 CD122ECD-Fc(knob)-Avitag-8His와, 인간 CD132의 세포외 영역과 Y349C/T366S/L368A/Y407V 변이 및 C 말단에 FLAG 태그 서열을 갖는 인간 IgG1 유래 Fc 영역을 포함하는 CD132ECD-Fc(hole)-FLAG을 푸린 절단 서열과 구제역 바이러스 유래 2A 펩티드 서열을 통하여 연결한 인간 CD122ECD-Fc-Avitag-8His_인간 CD132ECD-Fc-FLAG의 아미노산 서열(서열 번호 25)을 기초로 설계한 염기 서열(서열 번호 26)을 INPEP4 벡터의 BglII 제한 효소 사이트와 BamHI 제한 효소 사이트에 삽입함으로써, 포유류 세포용의 인간 IL-2RβγECD-Fc 발현 벡터를 제작하였다.
얻어진 플라스미드와 Expi293 발현 시스템(Expression System)(ThermoFisher SCIENTIFIC사제)을 사용하여, 각종 Fc 융합 단백질을 배양 상청 중에 발현시켰다. CD25ECD-Fc는 Mabselect sure(GE 헬스케어사제)를 사용하여 조 정제 후, Superdex200 10/300GL(GE 헬스케어사제)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 모노머 분획을 분취했다(이동상: D-PBS).
한편, IL-2RβγECD-Fc는 Mabselect sure를 사용하여 조 정제 후, Superdex200 10/300GL을 사용한 크기 배제 크로마토그래피(이동상: D-PBS) 및 ANTI-FLAG M2 친화성 아가로스 겔을 사용한 정제에 의해 모노머 분획을 분취하였다.
Series S Sensor chip CM5(GE 헬스케어사제)를 Biacore T-100(GE 헬스케어사제)에 세트하고, 인간 항체 포획 키트(Human Antibody Capture Kit)(GE 헬스케어사제)를 사용하여, 친화성 측정용 플로우 셀 및 레퍼런스용 플로우 셀에 항-인간 Fc를 고정화하였다.
이어서, HBS-EP(+) 버퍼(GE 헬스케어사제)로 유로를 치환한 후, 리간드로서, HBS-EP(+)로 희석한 CD25ECD-Fc 또는 IL-2RβγECD-Fc를, 친화성 측정용 플로우 셀에만 첨가했다(고정화량: 200 내지 900RU).
그 후, 애널라이트로서, HBS-EP(+) 버퍼로 지적(至適) 농도로 희석한 IL-2(P)를 친화성 측정용 플로우 셀 및 레퍼런스용 플로우 셀에 첨가하여, 센서 그램을 얻었다. 플로우 셀의 재생 반응에는 3mol/L MgCl2를 사용하였다.
얻어진 센서 그램으로부터의 속도론 상수의 산출에는 Biacore T-100 평가 소프트웨어를 사용하였다. CD25ECD-Fc에 대한 결합의 해석에는 정상 상태 모델을 사용하고, 해리상수 KD를 구하였다. IL-2RβγECD-Fc에 대한 결합의 해석에는 1:1 결합 모델을 사용하고, 결합 속도 상수 ka, 해리 속도 상수 kd 및 KD를 각각 구하였다. 얻어진 KD를 표 23에 나타내었다.
Figure pct00180
표 23에 나타내는 바와 같이, CD25에 대한 KD값은, 당쇄 결합 IL-2 개변체와 IL-2(P)로 동일 정도였다. 한편, IL-2Rβγ에 대한 KD값은, 당쇄 결합 IL-2 개변체가 IL-2(P)보다도 높았다.
표 18 내지 20의 결과와 합하면, IL-2Rβγ에 대한 KD값이 높은 것일수록, IL-2Rαβγ 선택성이 높아지는 경향을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터, 당쇄 결합 IL-2 개변체는, CD25에 대한 친화성을 유지하고 있는 한편, IL-2Rβγ에 대한 친화성이 저하됨으로써 IL-2Rαβγ 선택성이 향상되었다고 생각되었다.
[실시예 18] 당쇄·PEG 구조의 영향
IL-2에 아미노산 개변을 행하는 것이나, 당쇄 또는 PEG를 결합시키는 것이 IL-2Rαβγ 선택성에 끼치는 영향을 평가하기 위해서, 실시예 1에서 제작한 L19C, L19C-acetamide, L19N, 및 실시예 5에서 제작한 각종 o-Az-z-Lys 도입 8His-IL-2를 실시예 12에 기재된 방법과 마찬가지의 방법으로 표준화 EC50 ratio값을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 24에 나타내었다.
Figure pct00181
표 24에 나타내는 바와 같이, L19C, L19C-acetamide, L19N의 표준화 EC50 ratio값이 5 내지 30이었다. 표 18에 나타내는 바와 같이, L19C-2, L19C-9, L19C-11 및 L19C-11*의 표준화 EC50 ratio값은 30 이상이었던 점에서, L19C-2, L19C-9, L19C-11 및 L19C-11*은 당쇄 결합에 의해 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되어 있는 것이 밝혀졌다.
또한, 표 24에 나타내는 바와 같이, 8His-Q126(oAzZK) 이외의 o-Az-Z-Lys 도입 8His-IL-2 개변체의 표준화 EC50 ratio값이 5 이하였다. 표 21 및 표 22에 나타내는 바와 같이, 8His-S4(oAzZK)-Li20, 8His-S4(oAzZK)-Li30, 8His-S5(oAzZK)-Li20, 8His-S5(oAzZK)-Li30, S6(oAzZK)-Li20, 8His-S6(oAzZK)-Li30, 8His-T7(oAzZK)-Li30, 8His-K8(oAzZK)-Li20, 8His-K8(oAzZK)-Li30, 8His-E60(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li20, 8His-F78(oAzZK)-Li30, 8His-F78(oAzZK)-Li40, 8His-F78(oAzZK)-V40, 8His-F78(oAzZK)-W40, 8His-F78(oAzZK)-Y50, 8His-H79(oAzZK)-Li20, 8His-H79(oAzZK)-Li30, 8His-S99(oAzZK)-Li30, 8His-E100(oAzZK)-Li20, 8His-T101(oAzZK)-Li20, 8His-T101(oAzZK)-Li30, 8His-I129(oAzZK)-PEG4, 8His-I129(oAzZK)-Li20, 8His-I129(oAzZK)-Li30, 8His-I129(oAzZK)-Li40, 8His-I129(oAzZK)-V40, 8His-I129(oAzZK)-W40 및 8His-I129(oAzZK)-Y50의 표준화 EC50 ratio값은 5 이상이었던 점에서, 이들 PEG 결합 IL-2 개변체는 PEG가 결합됨으로써 IL-2Rαβγ에 대한 선택성이 향상되어 있는 것이 밝혀졌다.
본 발명을 특정한 양태를 사용하여 상세하게 설명했지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나는 일 없이 여러가지 변경 및 변형이 가능한 것은, 당업자에게 있어서 명확하다. 부언하면, 본 출원은, 2017년 12월 27일자로 출원된 일본 특허 출원(특원 2017-252224)에 기초하고 있어, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
서열 번호 1: 야생형 성숙 인간 IL-2의 아미노산 서열
서열 번호 2: 8His-IL-2의 아미노산 서열
서열 번호 3: 8His-IL-2의 염기 서열
서열 번호 4: 8His-S4(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 5: 8His-S5(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 6: 8His-S6(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 7: 8His-T7(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 8: 8His-K8(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 9: 8His-E60(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 10: 8His-F78(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 11: 8His-H79(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 12: 8His-R81(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 13: 8His-L94(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 14: 8His-S99(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 15: 8His-E100(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 16: 8His-T101(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 17: 8His-Q126(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 18: 8His-I129(oAzZK), 8His-I129(mAzZK)의 염기 서열
서열 번호 19: 인간 IL-2Rαβγ-Azamigreen 융합체의 아미노산 서열
서열 번호 20: 인간 IL-2Rαβγ-Azamigreen 융합체의 염기 서열
서열 번호 21: 인간 IL-2Rβγ-Azamigreen 융합체의 아미노산 서열
서열 번호 22: 인간 IL-2Rβγ-Azamigreen 융합체의 염기 서열
서열 번호 23: 인간 CD25ECD-Fc-Avitag의 아미노산 서열
서열 번호 24: 인간 CD25ECD-Fc-Avitag의 염기 서열
서열 번호 25: 인간 CD122ECD-Fc-Avitag-8His_인간 CD132ECD-Fc-FLAG의 아미노산 서열
서열 번호 26: 인간 CD122ECD-Fc-Avitag-8His_인간 CD132ECD-Fc-FLAG의 염기 서열
서열 번호 27: 8His-S4(oAzZK)/F78(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 28: 8His-S5(oAzZK)/F78(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 29: 8His-K8(oAzZK)/F78(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 30: 8His-F78(oAzZK)/H79(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 31: 8His-F78(oAzZK)/S99(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 32: 8His-F78(oAzZK)/I129(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 33: 8His-S4(oAzZK)/I129(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 34: 8His-S5(oAzZK)/I129(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 35: 8His-K8(oAzZK)/I129(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 36: 8His-H79(oAzZK)/I129(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 37: 8His-S99(oAzZK)/I129(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 38: N 말단 메티오닌 부가 IL-2 C125S의 아미노산 서열
서열 번호 39: N 말단 메티오닌 부가 IL-2 C125S의 염기 서열
서열 번호 40: desAla_IL-2 C125S의 아미노산 서열
서열 번호 41: desAla_IL-2 C125S의 염기 서열
서열 번호 42: F78(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 43: I129(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 44: desAla_I129(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 45: S4(oAzZK)/F78(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 46: S5(oAzZK)/F78(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 47: K8(oAzZK)/F78(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 48: S4(oAzZK)/I129(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 49: S5(oAzZK)/I129(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 50: K8(oAzZK)/I129(oAzZK)의 염기 서열
서열 번호 51: I129C의 아미노산 서열
서열 번호 52: I129C의 염기 서열
SEQUENCE LISTING <110> KYOWA KIRIN CO., LTD. <120> IL-2 variant <130> W526126 <150> JP2017-252224 <151> 2017-12-27 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of 8His-IL-2 <400> 2 Met His His His His His His His His Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr 1 5 10 15 Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met 20 25 30 Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met 35 40 45 Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His 50 55 60 Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn 65 70 75 80 Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser 85 90 95 Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe 100 105 110 Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn 115 120 125 Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 130 135 140 <210> 3 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of 8His-IL-2 <400> 3 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 4 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of S4 (o-Az-Z-Lys) <400> 4 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgacctaga gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 5 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of S5 (o-Az-Z-Lys) <400> 5 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagct agagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 6 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of S6 (o-Az-Z-Lys) <400> 6 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gctagaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 7 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of T7 (o-Az-Z-Lys) <400> 7 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagctagaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 8 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of K8 (o-Az-Z-Lys) <400> 8 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccta gaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 9 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of E60 (o-Az-Z-Lys) <400> 9 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctgtaggaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 10 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of F78 (o-Az-Z-Lys) <400> 10 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaacta gcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 11 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of H79 (o-Az-Z-Lys) <400> 11 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt ttagctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 12 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of R81 (o-Az-Z-Lys) <400> 12 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgtag ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 13 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of L94 (o-Az-Z-Lys) <400> 13 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgtagg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 14 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of S99 (o-Az-Z-Lys) <400> 14 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg ttaggagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 15 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of E100 (o-Az-Z-Lys) <400> 15 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagctagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 16 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of T101 (o-Az-Z-Lys) <400> 16 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagtag accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 17 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of Q126 (o-Az-Z-Lys) <400> 17 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cctagagcat catcagtacc 420 ctgacc 426 <210> 18 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of I129 (o-Az-Z-Lys) <400> 18 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat ctagagtacc 420 ctgacc 426 <210> 19 <211> 1502 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of human IL-2R???-Azamigreen fusion <400> 19 Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val 1 5 10 15 Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro 20 25 30 His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn 35 40 45 Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr 50 55 60 Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys 65 70 75 80 Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro 85 90 95 Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro 100 105 110 Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro 115 120 125 Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val 130 135 140 Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His 145 150 155 160 Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg 165 170 175 Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln 180 185 190 Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu 195 200 205 Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr 210 215 220 Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln 225 230 235 240 Val Ala Val Ala Gly Cys Val Phe Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Leu 245 250 255 Ser Gly Leu Thr Trp Gln Arg Arg Gln Arg Lys Ser Arg Arg Thr Ile 260 265 270 Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu 275 280 285 Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Ala Pro 290 295 300 Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu Leu Pro Leu Ala 305 310 315 320 Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys 325 330 335 Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly 340 345 350 Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg 355 360 365 Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp 370 375 380 Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr 385 390 395 400 Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp 405 410 415 Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu 420 425 430 Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu Thr His Arg Cys 435 440 445 Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His 450 455 460 Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu 465 470 475 480 Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu 485 490 495 Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro 500 505 510 Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala 515 520 525 Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu 530 535 540 Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu 545 550 555 560 Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys 565 570 575 Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu 580 585 590 Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe 595 600 605 Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro 610 615 620 Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln 625 630 635 640 Asp Lys Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr 645 650 655 Ser Cys Phe Thr Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala 660 665 670 Leu Glu Ile Glu Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser 675 680 685 Glu Glu Asp Pro Asp Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser 690 695 700 Pro Gln Pro Leu Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr 705 710 715 720 Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly 725 730 735 Gly Pro Ser Pro Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu 740 745 750 Glu Arg Met Pro Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp 755 760 765 Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp 770 775 780 Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val Leu 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Thr Asn Phe Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr 1400 1405 1410 Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr Glu Lys Met Tyr Val Glu Asp Gly 1415 1420 1425 Val Leu Lys Gly Asp Val Asn Met Arg Leu Leu Leu Glu Gly Gly 1430 1435 1440 Gly His Tyr Arg Cys Asp Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys 1445 1450 1455 Glu Val Arg Leu Pro Asp Ala His Lys Ile Asp His Arg Ile Glu 1460 1465 1470 Ile Leu Lys His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu 1475 1480 1485 Asn Ala Val Ala Arg Tyr Ser Met Leu Pro Ser Gln Ala Lys 1490 1495 1500 <210> 20 <211> 4506 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of human IL-2R???-Azamigreen fusion <400> 20 atggattcat acctgcttat gtggggtctc ctcaccttca ttatggtccc cggatgtcaa 60 gccgagctct gtgacgatga tccacctgaa atcccccatg caacttttaa ggccatggcc 120 tataaggaag gtaccatgct gaactgtgaa tgcaagcgtg gcttccgcag gattaagagc 180 ggctccctgt acatgctgtg caccgggaac tcttcccatt caagttggga caaccagtgt 240 cagtgtacct cctccgcaac aagaaatacc accaaacagg tgactcccca gccagaggag 300 cagaaggagc ggaagacaac agaaatgcaa agtccaatgc agcccgtgga tcaggccagc 360 ctcccaggcc actgtcggga accaccccct tgggaaaacg aggccacaga acggatatac 420 cacttcgttg tcggtcaaat ggtgtattat cagtgtgtgc agggctacag ggccctgcat 480 cgaggccccg cagaatcagt ctgcaaaatg actcacggca agactcgctg gacccagcct 540 cagctgatat gtaccggaga gatggaaact tctcaattcc ccggggagga gaaaccccag 600 gcatctcctg aagggaggcc tgagtccgaa acctcttgtc tggttaccac aaccgacttc 660 cagatccaga ccgagatggc cgcaaccatg gaaacaagta ttttcactac agagtatcag 720 gtggccgtag caggctgtgt cttcctgttg atttccgtgc tgctgttgtc tgggctgacc 780 tggcaaagaa gacagagaaa gtctaggcgc actatccgag caaagcgggc tccagtgaag 840 cagacattga attttgatct gttgaaactt gccggcgacg ttgagtctaa ccctggccct 900 atggctgcac cagccctgtc ctggcgtttg cctctcctta tattgctgct tcctcttgct 960 acctcttggg cttccgctgc agtgaatggg acctcccaat ttacatgctt ctacaacagt 1020 agagccaaca tttcatgtgt gtggagccag gatggcgctc tgcaagatac atcttgccag 1080 gtccacgcct ggccagatag acggcggtgg aatcagacct gtgagcttct gcccgtgtcc 1140 caggcaagtt gggcttgcaa ccttatactg ggcgctcccg atagtcagaa gctgaccact 1200 gtggacatcg tgaccctgcg ggtgctttgt agggagggcg tccggtggag agtcatggct 1260 atacaggatt ttaaaccctt cgagaacctt cgcctcatgg cccccatctc tctgcaagtc 1320 gtgcatgtag agacacatag gtgtaacatc tcttgggaaa tctctcaggc ttcacactac 1380 tttgagaggc acctggagtt tgaggcccgt actctgagcc caggacatac ttgggaggag 1440 gcacccctgc tcaccctcaa gcagaagcag gagtggatat gtctggagac tttgactccc 1500 gacactcagt atgagttcca ggtgagagtg aaacccctgc agggggagtt tacaacctgg 1560 tcaccatgga gtcagcccct tgcctttcga actaaacctg ccgccctcgg caaggacaca 1620 atcccctggc tcggtcacct gcttgtcggc ctttccggcg cttttggttt tatcatcctg 1680 gtctaccttc tcatcaactg ccgcaatact gggccttggc tgaagaaagt ccttaagtgt 1740 aacaccccag atccaagtaa gttcttctct cagctgtcca gtgagcacgg tggcgatgtc 1800 cagaagtggt tgagcagtcc cttcccctcc tccagtttca gccccggggg cctggctcca 1860 gagattagtc cccttgaggt gctggagcga gacaaggtaa ctcagctgtt gctgcagcaa 1920 gataaggtgc cagagcctgc atctctcagc agtaatcatt ccctgaccag ctgttttact 1980 aaccagggat acttcttttt ccacctgcca gatgctctgg agattgaggc atgtcaagtc 2040 tattttacat acgaccccta cagtgaggaa gacccagatg agggggtcgc aggagctccc 2100 acaggttcat ccccacagcc actccagcct ttgtcaggcg aggatgacgc atactgcaca 2160 tttccaagcc gcgatgatct ccttctgttc tcaccaagcc tgctgggggg acctagtcct 2220 cctagcaccg ctccaggagg gtctggcgca ggagaggaac gaatgcctcc aagtcttcag 2280 gagcgggtcc cccgggattg ggaccctcag cccctgggcc cccccacccc tggagtccct 2340 gacctcgtgg acttccaacc cccacccgag ttggtgctta gagaagccgg agaggaggtg 2400 cctgacgccg gccctagaga gggagtcagt tttccatgga gtcggccacc aggacagggc 2460 gaatttcgag ctctcaacgc tcgtctgcct ttgaacaccg atgcctattt gtctctccag 2520 gaactgcagg ggcaagatcc tacccacctc gtcagagcca aaagagctcc tgtgaagcag 2580 actctgaact ttgatttgct caaactggct ggcgacgtgg aatctaatcc aggcccaatg 2640 ctgaaaccca gtctgccatt cacctctttg ctcttcctgc agctccctct gttgggtgtc 2700 gggctgaaca caactattct gactccaaat gggaacgagg acaccaccgc cgatttcttc 2760 cttactacca tgcccaccga ctccctcagc gtgagtactt tgcccctccc agaagtgcag 2820 tgcttcgtct tcaacgtcga gtacatgaac tgtacttgga acagctcttc agagcctcag 2880 cctaccaacc tcacattgca ctattggtac aagaacagcg ataacgataa agtgcagaag 2940 tgctcccact atctgtttag tgaagagatc accagtgggt gccagctgca gaagaaggaa 3000 attcacctct atcagacttt tgtggtgcag ttgcaagatc cccgggagcc taggaggcag 3060 gccacccaaa tgcttaagct gcaaaatctc gttattcctt gggctcccga gaatctcaca 3120 ttgcacaagc tctccgagtc acagctcgaa ctgaattgga ataataggtt cctgaaccac 3180 tgcctcgagc acctggtgca gtaccggaca gactgggacc acagttggac tgagcaatct 3240 gtggactata gacataaatt ctccctgcct agcgtcgacg ggcagaaacg ttacaccttt 3300 agggtgcggt ctcgttttaa tccactgtgt gggtctgccc agcactggtc agagtggtca 3360 caccctattc attggggtag taatacatct aaggagaatc cattcctctt cgccctcgag 3420 gctgtggtga tcagcgtggg aagtatgggc ctcatcattt ctctcctgtg cgtgtacttt 3480 tggctggaac ggactatgcc tcgtatccct acactcaaaa atctcgagga tctggtgact 3540 gagtatcacg gcaacttttc agcctggtca ggagtgtcaa agggattggc cgaatctctc 3600 cagcccgact atagtgagag gctttgtctg gtttccgaaa tccccccaaa aggcggagca 3660 ttgggtgagg gccccggagc ttcaccctgt aaccaacact ccccttactg ggcaccccct 3720 tgttacactc tgaagccaga aactagagca aagagggctc cagtgaaaca gactttgaat 3780 ttcgacctgc tgaagctggc aggtgacgta gagtcaaacc ccggccccat ggtgtctgtc 3840 attaagcctg aaatgaaaat taagctctgc atgaggggta ctgtgaacgg ccacaatttt 3900 gtgatcgagg gcgaaggaaa aggaaatccc tacgaaggga ctcagattct tgacctgaac 3960 gttactgaag gggctcctct cccctttgct tacgacatcc tgaccaccgt gtttcagtat 4020 ggtaaccgag cttttacaaa gtatcctgct gatatacagg actattttaa gcaaacattc 4080 ccagagggct accactggga gcggtctatg acctatgaag accaaggtat ttgcaccgct 4140 accagcaaca tctcaatgcg aggcgactgt ttcttttacg atatcagatt cgatggaaca 4200 aacttccccc ccaacggacc cgttatgcaa aagaaaacac tgaaatggga acccagcaca 4260 gagaagatgt atgttgagga cggggttctg aagggggacg tgaatatgcg gctcttgctg 4320 gaaggcggag gccactatag atgtgatttc aagacaactt acaaggctaa gaaggaagtg 4380 aggttgcctg acgcccataa gatcgatcat cgaatcgaga ttttgaagca tgacaaggat 4440 tataataagg tgaaactgta cgagaacgcc gtggcccggt actccatgct ccccagtcaa 4500 gctaaa 4506 <210> 21 <211> 1202 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of human IL-2R??-Azamigreen fusion <400> 21 Met Ala Ala Pro Ala Leu Ser Trp Arg Leu Pro Leu Leu Ile Leu Leu 1 5 10 15 Leu Pro Leu Ala Thr Ser Trp Ala Ser Ala Ala Val Asn Gly Thr Ser 20 25 30 Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile Ser Cys Val Trp 35 40 45 Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln Val His Ala Trp 50 55 60 Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu Leu Pro Val Ser 65 70 75 80 Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala Pro Asp Ser Gln 85 90 95 Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val Leu Cys Arg Glu 100 105 110 Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe Lys Pro Phe Glu 115 120 125 Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val Val His Val Glu 130 135 140 Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln Ala Ser His Tyr 145 150 155 160 Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg 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aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat ctagagtacc 420 ctgacc 426 <210> 36 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of 8His-H79(oAzZK) / I129(oAzZK) <400> 36 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt ttagctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg tagcgagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat ctagagtacc 420 ctgacc 426 <210> 37 <211> 426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of 8His-S99(oAzZK) / I129(oAzZK) <400> 37 atgcatcatc atcaccatca tcatcacgcc ccgaccagca gcagcaccaa aaagacccag 60 ctgcagctgg aacatctgct gctggatctg cagatgatcc tgaatggcat taacaactat 120 aaaaacccga agctgacccg catgctgacc tttaaatttt atatgccgaa aaaagccacc 180 gagctgaagc atctgcagtg cctggaagaa gaactgaaac cgctggaaga ggtgctgaac 240 ctggcccaga gcaaaaactt tcacctgcgc ccgcgtgacc tgatcagcaa catcaacgtg 300 atcgtgctgg aactgaaggg ttaggagacc accttcatgt gcgaatatgc cgacgagacc 360 gccaccatcg tggaattcct gaaccgctgg atcacctttt cccagagcat ctagagtacc 420 ctgacc 426 <210> 38 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of IL-2 C125S Nter-Met <400> 38 Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 1 5 10 15 His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60 Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 65 70 75 80 Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu 85 90 95 Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 100 105 110 Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser 115 120 125 Ile Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 39 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of IL-2 C125S Nter-Met <400> 39 atggcaccta cttcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 60 gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 120 ctcacattta agttttacat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 180 gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatttag ctcaaagcaa aaactttcac 240 ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 300 gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 360 agatggatta ccttttcaca aagcatcatc tcaacactga ct 402 <210> 40 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: amino acid sequence of desAla_IL-2 C125S <400> 40 Met Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 41 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of desAla_IL-2 C125S <400> 41 atgcctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct tttcacaaag catcatctca acactgact 399 <210> 42 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of F78(oAzZK) <400> 42 atggcaccta cttcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 60 gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 120 ctcacattta agttttacat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 180 gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatttag ctcaaagcaa aaactagcac 240 ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 300 gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 360 agatggatta ccttttcaca aagcatcatc tcaacactga ct 402 <210> 43 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of I129(oAzZK) <400> 43 atggcaccta cttcaagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 60 gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 120 ctcacattta agttttacat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 180 gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatttag ctcaaagcaa aaactttcac 240 ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 300 gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 360 agatggatta ccttttcaca aagcatctag tcaacactga ct 402 <210> 44 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of desAla_I129(oAzZK) <400> 44 atgcctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct tttcacaaag catctagtca acactgact 399 <210> 45 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of S4(oAzZK)/ F78(oAzZK) <400> 45 atggcaccta cttagagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 60 gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 120 ctcacattta agttttacat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 180 gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatttag ctcaaagcaa aaactagcac 240 ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 300 gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 360 agatggatta ccttttcaca aagcatcatc tcaacactga ct 402 <210> 46 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of S5(oAzZK) / F78(oAzZK) <400> 46 atggcaccta cttcatagtc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 60 gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 120 ctcacattta agttttacat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 180 gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatttag ctcaaagcaa aaactagcac 240 ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 300 gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 360 agatggatta ccttttcaca aagcatcatc tcaacactga ct 402 <210> 47 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of K8(oAzZK) / F78(oAzZK) <400> 47 atggcaccta cttcaagttc tacatagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 60 gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 120 ctcacattta agttttacat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 180 gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatttag ctcaaagcaa aaactagcac 240 ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 300 gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 360 agatggatta ccttttcaca aagcatcatc tcaacactga ct 402 <210> 48 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of S4(oAzZK) / I129(oAzZK) <400> 48 atggcaccta cttagagttc tacaaagaaa acacagctac aactggagca tttactgctg 60 gatttacaga tgattttgaa tggaattaat aattacaaga atcccaaact caccaggatg 120 ctcacattta agttttacat gcccaagaag gccacagaac tgaaacatct tcagtgtcta 180 gaagaagaac tcaaacctct ggaggaagtg ctaaatttag ctcaaagcaa aaactttcac 240 ttaagaccca gggacttaat cagcaatatc aacgtaatag ttctggaact aaagggatct 300 gaaacaacat tcatgtgtga atatgctgat gagacagcaa ccattgtaga atttctgaac 360 agatggatta ccttttcaca aagcatctag tcaacactga ct 402 <210> 49 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: base sequence of S5(oAzZK) / I129(oAzZK) <400> 49 atggcaccta cttcatagtc tacaaagaaa acacagctac 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tggagcattt actgctggat 60 ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120 acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180 gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240 agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300 acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360 tggattacct tttcacaaag catctgttca acactgact 399

Claims (57)

  1. 인터류킨(Interleukin)-2(이하, IL-2라고 약기한다) 개변체.
  2. 제1항에 있어서, 당쇄가 결합한 IL-2 개변체 및/또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합한 IL-2 개변체인, IL-2 개변체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, IL-2 수용체(이하 IL-2R)αβγ에 대한 선택성이 향상되어 있는, IL-2 개변체.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 당쇄가 결합하고 있는, IL-2 개변체.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 당쇄가 하기 (식 4) 내지 (식 8), (식 Y1), (식 Y2) 또는 (식 Y3)으로 표시되는 구조를 갖는 당쇄로부터 선택되는 적어도 하나인, IL-2 개변체.
    Figure pct00182

    Figure pct00183

    Figure pct00184

    Figure pct00185

    Figure pct00186

    Figure pct00187

    Figure pct00188

    Figure pct00189
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는, IL-2 개변체.
  7. 제6항에 있어서, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 12, 15, 16, 19, 88, 91 및 119번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는, IL-2 개변체.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기가, 하기 (식 1)로 표시되는 구조를 갖는, IL-2 개변체.
    Figure pct00190

    [(식 1) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.]
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 당쇄가 결합한 아스파라긴 잔기 유래의 기가, 하기 (식 2)로 표시되는 구조를 갖는, IL-2 개변체.
    Figure pct00191

    [(식 2) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.]
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 당쇄가 결합한 IL-2 개변체에 추가로 PEG가 결합한 IL-2 개변체인, IL-2 개변체.
  11. 제2항 또는 제3항에 있어서, IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 4, 5, 6, 7, 8, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 PEG가 결합하고 있는, IL-2 개변체.
  12. 제2항, 제3항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 4, 5, 6, 7, 8, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는, IL-2 개변체.
  13. 제2항, 제3항, 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의 4, 5, 8, 78 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합하고 있는 아미노산 잔기로 치환되어 있는, IL-2 개변체.
  14. 제2항, 제3항 및 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가 결합한 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기인, IL-2 개변체.
  15. 제14항에 있어서, PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 티올기(-SH)를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기, 또는 PEG가 결합한 아지드기를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기인, IL-2 개변체.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기가, N6-[{(o-아지도벤질)옥시}카르보닐]-L-리신(o-Az-Z-Lys) 잔기 유래의 기, N6-[{(m-아지도벤질)옥시}카르보닐]-L-리신(m-Az-Z-Lys) 잔기 유래의 기 또는 시스테인 잔기 유래의 기인, IL-2 개변체.
  17. 제16항에 있어서, PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기가, 하기 (식 11) 및/또는 (식 12)로 표시되는 구조를 갖는, IL-2 개변체.
    Figure pct00192

    Figure pct00193
  18. 제16항에 있어서, PEG가 결합한 m-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기가, 하기 (식 X4) 및/또는 (식 X5)로 표시되는 구조를 갖는, IL-2 개변체.
    Figure pct00194

    Figure pct00195
  19. 제16항에 있어서, PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기가, 하기 (식 X11) 및/또는 (식 X12) 및/또는 (식 X13)으로 표시되는 구조를 갖는, IL-2 개변체.
    Figure pct00196

    Figure pct00197

    Figure pct00198
  20. 제2항, 제3항 및 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가 직쇄상인, IL-2 개변체.
  21. 제2항, 제3항 및 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가 분지상인, IL-2 개변체.
  22. 제2항, 제3항 및 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가, 평균 분자량 10kDa 이상의 PEG인, IL-2 개변체.
  23. 제2항, 제3항 및 제10항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가, 평균 분자량 10kDa, 20kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa 또는 80kDa의 PEG인, IL-2 개변체.
  24. 제2항, 제3항 및 제10항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가, 하기 (식 13), (식 14), (식 15), (식 16), (식 X7), (식 X8), (식 X9), (식 X10), (식 X11), (식 X13), (식 X14) 또는 (식 X15) 중 적어도 하나의 식으로 표시되는 구조를 갖는, IL-2 개변체.
    Figure pct00199

    Figure pct00200

    Figure pct00201

    Figure pct00202

    Figure pct00203

    Figure pct00204

    Figure pct00205

    Figure pct00206

    Figure pct00207

    Figure pct00208

    Figure pct00209

    Figure pct00210
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2의 N 말단에 추가로 메티오닌 잔기가 결합하고 있는, IL-2 개변체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2의 N 말단의 알라닌이 결손되어 있는, IL-2 개변체.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 기재된 IL-2 개변체의 제조 방법.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 기재된 IL-2 개변체를 포함하는 조성물.
  29. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 기재된 IL-2 개변체를 포함하는, 면역 질환의 치료제.
  30. IL-2의 IL-2Rαβγ에 대한 선택성을 향상시키는 방법.
  31. 제30항에 있어서, IL-2에 당쇄 및/또는 PEG를 결합시키는 것을 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에, 당쇄를 결합시키는 것을 포함하는, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 당쇄가, 하기 (식 4) 내지 (식 8), (식 Y1), (식 Y2) 또는 (식 Y3)으로 표시되는 구조를 갖는 당쇄로부터 선택되는 적어도 하나인, 방법.
    Figure pct00211

    Figure pct00212

    Figure pct00213

    Figure pct00214

    Figure pct00215

    Figure pct00216

    Figure pct00217

    Figure pct00218
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열을 포함하는 IL-2에 있어서, 해당 아미노산 서열의 11, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 20, 84, 87, 88, 91, 92, 108, 115, 119, 122, 123 및 130번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기를, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환하는 것을 포함하는, 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 12, 15, 16, 19, 88, 91 또는 119번째의 아미노산 잔기 중 적어도 하나의 아미노산 잔기를, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 또는 아스파라긴 잔기 유래의 기로 치환하는 것을 포함하는, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 당쇄가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기가, 하기 (식 1)로 표시되는 구조를 갖는, 방법.
    Figure pct00219

    [(식 1) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.]
  37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 당쇄가 결합한 아스파라긴 잔기 유래의 기가, 하기 (식 2)로 표시되는 구조를 갖는, 방법.
    Figure pct00220

    [(식 2) 중, Saccharide는 당쇄를 나타낸다.]
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 당쇄가 결합한 IL-2 개변체에 추가로 PEG를 결합시키는 것을 포함하는, 방법.
  39. 제31항에 있어서, IL-2의 아미노산 서열에 있어서의, 4, 5, 6, 7, 8, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 PEG가 결합하고 있는, 방법.
  40. 제31항 또는 제39항에 있어서, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의, 4, 5, 6, 7, 8, 60, 78, 79, 99, 100, 101 및 129번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 아미노산 잔기로 치환되어 있는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  41. 제31항, 제39항 및 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1로 표현되는 아미노산 서열의 125번째의 아미노산 잔기를 세린 잔기로 치환한 아미노산 서열에 있어서의 4, 5, 8, 78 및 129번째 중으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기가, PEG가 결합하고 있는 아미노산 잔기로 치환되어 있는, 방법.
  42. 제31항 및 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가 결합한 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기가, PEG가 결합한 티올기(-SH)를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기, 또는 PEG가 결합한 아지드기를 갖는 아미노산 잔기 유래의 기인, 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, PEG가 결합한 비천연 아미노산 잔기가, N6-[{(o-아지도벤질)옥시}카르보닐]-L-리신(o-Az-Z-Lys) 잔기 유래의 기, N6-[{(m-아지도벤질)옥시}카르보닐]-L-리신(m-Az-Z-Lys) 잔기 유래의 기 또는 시스테인 잔기 유래의 기인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, PEG가 결합한 o-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기가, 하기 (식 11) 및/또는 (식 12)로 표시되는 구조를 갖는, 방법.
    Figure pct00221

    Figure pct00222
  46. 제44항에 있어서, PEG가 결합한 m-Az-Z-Lys 잔기 유래의 기가, 하기 (식 X4) 및/또는 (식 X5)로 표시되는 구조를 갖는, 방법.
    Figure pct00223

    Figure pct00224
  47. 제44항에 있어서, PEG가 결합한 시스테인 잔기 유래의 기가, 하기 (식 X11) 및/또는 (식 X12) 및/또는 (식 X13)으로 표시되는 구조를 갖는, 방법.
    Figure pct00225

    Figure pct00226

    Figure pct00227
  48. 제31항 및 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가 직쇄상인, 방법.
  49. 제31항 및 제38항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가 분지상인, 방법.
  50. 제31항 및 제38항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가, 평균 분자량 10kDa 이상의 PEG인, 방법.
  51. 제31항 및 제38항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가, 평균 분자량 10kDa, 20kDa, 30kDa, 40kDa, 50kDa, 60kDa, 70kDa 또는 80kDa의 PEG인, 방법.
  52. 제31항 및 제38항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, PEG가, 하기 (식 13), (식 14), (식 15), (식 16), (식 X7), (식 X8), (식 X9), (식 X10), (식 X11), (식 X13), (식 X14) 또는 (식 X15) 중 적어도 하나의 식으로 표시되는 구조를 갖는, 방법.
    Figure pct00228

    Figure pct00229

    Figure pct00230

    Figure pct00231

    Figure pct00232

    Figure pct00233

    Figure pct00234

    Figure pct00235

    Figure pct00236

    Figure pct00237

    Figure pct00238

    Figure pct00239
  53. 제30항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2의 N 말단에 추가로 메티오닌 잔기가 결합하고 있는, 방법.
  54. 제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2의 N 말단의 알라닌이 결손되어 있는, 방법.
  55. 제어성 T 세포를 선택적으로 활성화시키는 방법.
  56. IL-2Rβ 및 γ 서브유닛의 적어도 한쪽에 대한 IL-2의 친화성을 저하시키는 방법.
  57. IL-2Rα 서브유닛에 대한 IL-2의 친화성을 향상시키는 방법.
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