CN117651564A - 脑血管事件和神经系统疾病的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种妊娠特异性糖蛋白(例如PSG1)，在治疗神经系统疾病或刺激受试者因脑血管事件或脑创伤而损伤的组织的存活或恢复的方法中的用途。PSG1可以是Fc标记的PSG1。

Description

脑血管事件和神经系统疾病的治疗

技术领域

本发明涉及胎盘表达蛋白在治疗脑血管事件，例如急性缺血性脑卒中和神经系统疾病中的用途。

背景技术

妊娠特异性糖蛋白(PSG)被认为参与调节妊娠期间母胎界面和母体循环中的免疫、血管生成和血小板反应。PSG蛋白是癌胚抗原细胞粘附分子(CEACAM)家族的一部分，该家族本身是免疫球蛋白超家族的一员。灵长类动物、马科动物和啮齿类动物的PSG蛋白在结构上差异很大，但都保留了保守功能(Aleksic D等人.Convergent evolution ofpregnancy-specific glycoproteins in human and horse.Reproduction.2016年9月；152(3):171-84.doi:10.1530/REP-16-0236.Epub 2016年6月8日.Moore T,DvekslerGS.Pregnancy-specific glycoproteins:complex gene families regulatingmaternal-fetal interactions.Int J Dev Biol.2014；58(2-4):273-80.doi:10.1387/ijdb.130329gd.综述.PMID:25023693.)。在人类和小鼠中分别有11种和17种不同的PSG基因编码的PSG蛋白。人类PSG由一个N-末端免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域(N结构域)和两种不同类型的2至3个Ig恒定区(IgC)样结构域(命名为A和B)组成，而啮齿类动物PSG包含2至9个连续的N结构域和一个IgC样结构域。7种马科动物CEACAM衍生的PSG样蛋白具有单个N结构域和A2结构域(Aleksic等人，2016)。

PSG1是11种不同的人类PSG基因大量表达的成员，并且在一项研究中，预估在妊娠的第三孕期的总PSG蛋白浓度大于100μg/mL。在妊娠期，转化生长因子β(TGF-β)调节滋养细胞侵袭、血管生成和细胞外基质的产生。用PSG1或其它PSG处理不同的细胞增加了上清中总TGF-β1的分泌(如通过ELISA测定的)和潜在TGF-β1的激活[Ballesteros A,Mentink-KaneMM,Warren J,Kaplan GG,Dveksler GS.Induction and activation of latenttransforming growth factor-β1are carried out by two distinct domains ofpregnancy-specific glycoprotein 1(PSG1).JBiol Chem.2015年二月13日；290(7):4422-31.doi:10.1074/jbc.M114.597518.Epub 2014年11月29日]。

WO2017049082描述了一种特异性PSG蛋白PSG1，及其参与诱导免疫耐受的途径。PSG1参与转化生长因子-β1(TGFβ1)的激活，TGFβ1是抑制炎症T细胞的必要细胞因子且对诱导耐受的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Tregs)分化具有重要作用，该细胞群被证明在预防移植物抗宿主病(GvDH)中具有重要作用。

发明内容

申请人发现了PSG1能够改变哺乳动物中小胶质细胞的表型，由M1促炎表型转变为M2抗炎表型(图1)。小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的固有免疫细胞，参与多种神经退行性疾病的发病机制，例如阿尔茨海默病、帕金森病、朊病毒疾病以及多发性硬化症和肌萎缩侧索硬化症。因此，本发明涉及PSG1在治疗神经功能疾病中的用途。申请人还发现，PSG1在治疗后的小鼠脑卒中模型中提供了行为结果的改善(错步实验)(图2)，因此其适用于治疗哺乳动物的脑卒中和其它脑血管事件以及创伤性脑损伤。

在第一个方面，本发明提供了一种妊娠特异性糖蛋白(例如PSG1)，用于刺激由脑血管事件或创伤性脑损伤而受损的组织的存活或恢复的方法。

在另一方面，本发明涉及在妊娠特异性糖蛋白(例如PSG1)作为神经保护剂在受试者中的用途。

在任意实施方案中，PSG1是Fc标记的PSG1(PSG1-Fc)。

在任意实施方案中，脑血管事件是急性缺血性脑卒中。

在任意实施方案中，脑血管事件是出血性脑卒中。

在任意实施方案中，脑血管事件是短暂性脑缺血发作(TIA)。

在任意实施方案中，PSG1静脉施用于受试者。

在任意实施方案中，使用给药导管将PSG1局部施用于脑损伤部位。

在任意实施方案中，使用Pharm Res 2013Oct；30(10):2429-44中描述的药物递送系统进行PSG1给药。

在任意实施方案中，PSG1以0.01至100、通常为0.01至0.1、0.1至1.0、1.0至10或10-100mg每Kg体重的剂量施用给受试者。

在任意实施方案中，PSG1在脑血管事件72、48、24、优选地18、更优选地12、更优选地6、更优选地4、以及理想地2小时内施用给受试者。

在任意实施方案中，所述方法包括施用另一种药物，例如血栓溶解药物、血液稀释剂或抗血小板药物。血液稀释剂的示例包括阿哌沙班(Eliquis)、达比加群(Pradaxa)、依度沙班(Savaysa)、磺达肝癸钠(Arixtra)、肝素(Fragmin、Innohep和Lovenox)、利伐沙班(Xarelto)、华法林(Coumadin、Jantoven)和抗血小板药物。血栓溶解药物的示例包括组织纤溶酶原激活剂(tPA)、替奈普酶、阿替普酶、尿激酶、瑞替普酶和链激酶。

在任意实施方案中，所述方法包括对受试者行血管内血栓切除术。

在任意实施方案中，所述方法使脑血管事件或脑创伤中的一种或多种症状得到改善。症状的示例包括：

行走困难；

头晕；

平衡性和协调性丧失；

言语困难或他人语言理解困难；

面部、腿部或手臂麻痹或瘫痪(很可能只在身体的一侧)；

视力模糊或变暗；以及

突发性头痛，尤其是同时伴有恶心、呕吐或头晕。

在另一方面，本发明提供了用于治疗哺乳动物中的神经功能疾病/紊乱的方法的妊娠特异性糖蛋白1(PSG1)，例如以神经退行、神经元细胞死亡或脱髓鞘为特征的疾病或病症。示例包括以神经干细胞或辅助细胞(例如小胶质细胞和少突细胞)调节改变而导致的神经元细胞死亡或脱髓鞘为特征的疾病。PSG1可以通过直接作用于包括干细胞在内的神经细胞系，通过调节辅助细胞(例如小胶质细胞和少突细胞)的表型(包括细胞因子的产生)，以及通过调节中枢和外周免疫系统来促进神经元修复。可以发现，经PSG1处理的Jurkat和小胶质细胞表现出与更慢的疾病进展一致的细胞因子谱的变化。在一个实施方案中，PSG1是Fc标记的妊娠特异性糖蛋白1(PSG1-Fc)。

在一个实施方案中，以神经退行为特征的疾病或病症导致了神经元细胞死亡。在一个实施方案中，神经退行性疾病是ALS(也被称为运动神经元病或Lou Gehrig病)或其变体，包括原发性侧索硬化症和脊髓性肌萎缩症。其它神经退行性疾病包括阿尔茨海默病和其它记忆障碍、共济失调、亨廷顿氏病、帕金森病、多系统萎缩、进行性核上性麻痹。

在一个实施方案中，以神经退行为特征的疾病或病症是脱髓鞘疾病。在一个实施方案中，神经退行性疾病是MS(也被称为多发性硬化症)或其变体。

在任意实施方案中，所述神经功能紊乱是癫痫性疾病，例如癫痫。

在一方面，本发明提供了PSG1，特别是Fc标记的PSG1，用于在哺乳动物中通过维持轴突细胞髓鞘形成的完整性以对与中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)脱髓鞘相关的疾病或病症进行因果治疗或预防。

在本说明书中，术语“维持轴突细胞髓鞘形成的完整性”应当理解为是指影响轴突细胞的髓鞘再生、抑制或预防轴突细胞的脱髓鞘、或两者兼具。术语“因果”治疗应当理解为是指将脱髓鞘作为疾病的根本原因的治疗，而不包括旨在直接解决疾病的临床症状的治疗(对症治疗)。

在另一方面，本发明广泛涉及在哺乳动物中通过维持轴突细胞髓鞘形成的完整性来治疗或预防与中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)的脱髓鞘相关的疾病或病症的方法，该方法包括将临床有效量的PSG1，特别是Fc标记的PSG1施用给需要的个体的步骤。

在另一方面，本发明涉及在哺乳动物中通过维持轴突细胞髓鞘形成的完整性来治疗与中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)的脱髓鞘相关的疾病或病症的复发，特别是急性复发的方法，该方法包括在疾病或病症复发时对哺乳动物施用临床有效量的PSG1，特别是Fc标记的PSG1的步骤。优选地，在该疾病或病症复发期间继续施用临床有效量的活性药物，并优选地在所述疾病或病症缓解时停止(施用)。

在另一方面，本发明涉及在哺乳动物中通过维持轴突细胞髓鞘形成的完整性来延长与中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)的脱髓鞘相关的疾病或病症的缓解期的方法，该方法包括在疾病或病症的缓解期向哺乳动物施用临床有效量的PSG1，特别是Fc标记的PSG1的步骤。优选地，在疾病或病症复发期间继续施用临床有效量的活性药物。

在另一方面，本发明涉及哺乳动物中与中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)的脱髓鞘相关的疾病或病症的非免疫介导治疗(优选地非免疫介导的因果治疗)，特别是多发性硬化症(MS)，特别是原发性进行性MS，该方法包括对哺乳动物施用临床有效量的PSG1，特别是Fc标记的PSG1的步骤，该量足以在哺乳动物的轴突鞘导致临床上显著的髓鞘再生或抑制脱髓鞘。术语“非免疫介导治疗”应当理解为是指不以抑制哺乳动物的免疫反应为目的的治疗。

在另一方面，本发明提供了妊娠特异性糖蛋白(例如PSG1)，用于治疗哺乳动物的创伤性脑损伤的方法，例如刺激由创伤性脑损伤而受损的组织的存活或恢复。在任意实施方案中，妊娠特异性糖蛋白施用于由创伤性脑损伤而受损的组织。

在另一方面，本发明提供了妊娠特异性糖蛋白(例如PSG1)，用于治疗哺乳动物的脊髓损伤的方法，例如刺激因创伤性脊髓损伤或疾病而损伤的脊髓组织的存活或恢复。在任意实施方案中，该方法是治疗由创伤性脊髓损伤或疾病导致的脊髓损伤，例如脊髓中的胶质瘢痕的方法。在任意实施方案中，所述方法是在受损脊髓中再生脊髓组织的方法。

在另一方面，本发明提供了一种组合物，包含Fc标记的妊娠特异性糖蛋白1(PSG1-Fc)和包括神经干细胞和间充质干细胞的细胞移植。

在一个实施方案中，PSG1通过肌肉内、鞘内、皮下、静脉或腹腔内递送，或通过注射到患处给药。

在一个实施方案中，通过PSG1(或PSG1-Fc)表达载体转染哺乳动物将PSG1施用于哺乳动物。

在一个实施方案中，通过施用已转染PSG1(或PSG1-Fc)表达载体的细胞给哺乳动物，将PSG1施用于哺乳动物。在一个实施方案中，该细胞是干细胞。在一个实施方案中，该细胞是脑细胞(例如神经元、少突细胞、星形胶质细胞或小胶质细胞)或间充质干细胞。在一个实施方案中，供体细胞获得自受体。在一个实施方案中，供体细胞获得自不同的哺乳动物(例如人类)至受体(同种异体细胞治疗)。在一个实施方案中，细胞被离体转染。

本发明方法提供了上述PSG1，以及PSG1的修饰版本，例如PSG1-Fc。然而，本发明还涉及PSG1以外的PSG蛋白(及其修饰版本)在上述治疗方法中的用途。

在一个实施方案中，PSG1(或PSG)修饰有功能基团。该功能基团可以配置为增加经修饰的PSG1的血浆半衰期。该功能基团可以配置为增加经修饰的PSG1的细胞渗透功能。该功能基团可以配置为增加经修饰的PSG1的活性。所述功能基团可以配置为促进修饰的PSG1的纯化。以下提供了PSG1多肽的修饰的示例，包括添加抗体片段，例如Fc基团，添加PEG功能基团，用L-异构体替代天然氨基酸。在一个实施方案中，该功能基团是Fc基团。在一个实施方案中，Fc基团被修饰为与天然Fc基团相比具有增加的血浆半衰期。经修饰的Fc标签描述于以下文章中：Algirdas Grevys、Malin Bern、Stian Foss、Diane Bryant、TerjeBratlie、Anders Moen、KristinGunnarsen、Audun Aase、Terje Einar、Michaelsen、Inger Sandlie和Jan Andersen。Fc Engineering of Human IgG1 for Altered Bindingto the Neonatal Fc Receptor Affects Fc Effec-tor Functions.Journal ofImmunology June 1,2015,194(11)5497-5508。Dall’Acqua WF,Kiener PA,WuH.Properties of human IgG1s engineered for enhanced binding to the neonatalFc receptor(FcRn).The Journal of Biological Chemistry.281:23514-23524(2006)。Abhishek Saxena和Donghui Wu.Advances in Therapeutic Fc Engineering–Modulationof IgG-Associated Effector Functions and Serum Half-life.Frontiers inImmunology.2016；7:580。对人Fc标签的示例性修饰包括CH2结构域中的三重取代YTE(M252Y/S254T/T256E)和CH3结构域中的(H433K/N434F)，以增加稳定性和半衰期(SEQUENCEID NO:3)。可以使用位点定向诱变来进行这些修饰。在一个实施方案中，本发明提供了与SEQUENCE ID NO:3编码的Fc标签偶联的PSG1蛋白。

本发明的其它方面和优选实施方案在以下列出的其它权利要求中进行了定义和描述。

附图说明

图1：用50μg/mL的重组PSG1-V5His蛋白调节C20小胶质细胞系(Garcia-Mesa等人，2017)表型5小时。

图2：用100μg重组PSG1-Fc治疗后的小鼠脑卒中模型的行为结果的改善(错步实验)。

具体实施方式

出于所有目的，本申请中提及的所有出版物、专利、专利申请和其它参考文献均以引用的方式完整地纳入本申请中，如每个单独的出版物、专利或专利申请都被明确地单独指出，并以引用的方式纳入本申请中，并且其内容被完整地引用。

定义和通用偏好

在本申请所用的情况下，除非另有特别说明，以下术语除了在本领域可能享有的任何更广泛(或更狭窄)的含义之外，还意在具有以下含义：

除非上下文另有要求，本申请中所用的单数应当理解为包括复数，反之亦然。就一个实体所使用的术语“a”或“an”应当理解为是指该实体中的一个或多个。因此，术语“一个(a)”(或“一个(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本申请中互换使用。

如本申请所用，术语“包括”或其变体，例如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”应当理解为表示包括任何所引用的整体(例如特点、要素、特征、属性、方法/工艺步骤或限定)或整体(例如特点、要素、特征、属性、方法/工艺步骤或限定)的组，但不排除任何其它整体或整体的组。因此，如本申请所用，术语“包括”是广泛的或开放式的，并且不排除其他的、未引用的整体或方法/工艺步骤。

如本申请所用，术语“疾病”用于定义损害生理功能并与特定症状相关的任何异常状况。该术语广泛用于涵盖任意生理功能受损的病症、疾病、异常、病理、不健康、病状或综合征，而不考虑病因的性质(或者是否确实建立了疾病的病因学基础)。因此，其包括由感染、创伤、损伤、手术、放射消融、衰老、中毒或营养缺乏引起的病状。

如本申请所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指治愈、改善或减轻疾病症状或消除(或减轻影响)其原因(例如，减少溶酶体酶的病理水平的积累)的干预(例如向受试者施用药物)。在这种情况下，该术语与术语“疗法(therapy)”同义使用。

此外，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指预防或延迟疾病的发作或进展，或减少(或根除)其在所治疗的人群中的发病率的干预(例如向受试者施用药物)。在这种情况下，术语治疗与术语“预防”同义使用。

如本申请所用，药物的有效量或治疗有效量定义为可以施用于受试者而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症的量，其符合合理的收益/风险比例，但其足以提供所需效果，例如，通过受试者病症的永久或暂时性改善而表现出的治疗或预防。取决于个体的年龄和一般情况、给药方式和其它因素，该量会因受试者而异。因此，虽然其不可能指定确切的有效量，但本领域技术人员将能够使用常规实验和背景常识在任何个案中确定适当的“有效”量。在这种背景下的治疗结果包括消除或减轻症状、减轻疼痛或不适、延长生存期、改善活动能力和其它临床标志的改善。治疗结果不需要是完全治愈。改善可以是在生物/分子标记、临床上或观察上观察到的改善。在优选实施方案中，本发明的方法适用于人类、大型竞技动物(马、骆驼、狗)和家养伴侣动物(猫和狗)。

在如上所定义的治疗和有效量的背景下，术语受试者(在上下文允许的情况下，其被理解为包括“个体”、“动物”、“患者”或“哺乳动物”)定义为需要治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人类、家养动物、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、骆驼、野牛、牛、奶牛；灵长类动物，例如猿、猴子、猩猩和黑猩猩；犬科动物，例如狗和狼；猫科动物，例如猫、狮子和老虎；马科动物，例如马、驴和斑马；食用动物，例如奶牛、猪和羊；有蹄类动物，例如鹿和长颈鹿；以及啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。在优选实施方案中，受试者是人类。如本申请所用，术语“马”是指马科的哺乳动物，包括马、驴(donkeys)、驴(asses)、野驴(kiang)和斑马。

如本申请所用，术语“脑血管事件”或“CVA”是指在受试者中引起神经性症状或症候群的脑缺血或出血。其通常也被称为“脑卒中”。主要临床特征为突发或亚急性发作，以及(除蛛网膜下腔出血外的)局灶性神经功能缺损。根据患者就诊时间和根本原因，缺损可以是稳定的、进行性的、或被完全消融的。除这些常见特征外，脑血管疾病是一组非常多样化的疾病，可以根据病因、部位和症状持续时间进一步分类。脑血管疾病细分为缺血性事件和脑出血，每种疾病都有多种病因。根据症状是发生在颈动脉或脊椎基底动脉分布以及通过症状持续时间，对缺血性事件进行进一步分类。短暂性脑缺血发作(TIA)很少持续超过几分钟，并且从不超过24小时。在缺血性脑卒中中，神经功能缺损存在超过24小时，并且可以是进行性的、稳定的或正在消融的。

如本申请所用，术语PSG蛋白是指缺乏细胞膜锚点的CEACAM相关蛋白，并主要表达于胎盘组织中。这种蛋白质被发现于哺乳动物的子集中，包括例如，灵长类动物、啮齿类动物、马科动物、蝙蝠，但未发现于，例如有蹄类动物和犬科动物(Robert Kammerer,WolfgangZimmermann.Coevolution of activating and inhibitory receptors withinmammalian carcinoembryonic antigen families.BMC Biol.2010；8:12.线上公开于2010Feb 4.doi:10.1186/1741-7007-8-12)中。PSG基因和蛋白质序列的示例是现有的(McLellan AS,Fischer B,Dveksler G,Hori T,Wynne F,Ball M,Okumura K,Moore T,Zimmermann W.Structure and evolution of the mouse pregnancy-specificglycoprotein(Psg)gene locus.BMC Genomics.2005Jan 12；6:4.PMID:15647114；Kammerer&Zimmermann,2010；Aleksic et al.,2016)。一般来说，PSG(即PSG1)是重组蛋白。

如本申请所用，术语“妊娠特异性糖蛋白1”或“PSG1”是指由以下SEQUENCE ID NO:1所代表的全长蛋白，其包括信号序列(氨基酸残基1-34)、成熟肽(残基35-419)。该术语还包括无信号序列的成熟肽。

SEQUENCE ID NO: 1:

PSG1

MGTLSAPPCTQRIKWKGLLLTASLLNFWNLPTTAQVTIEAEPTKVSEGKDVLLLVHNLPQNLTGYIWYKGQMRDLYHYITSYVVDGEIIIYGPAYSGRETAYSNASLLIQNVTREDAGSYTLHIIKGDDGTRGVTGRFTFTLHLETPKPSISSSNLNPRETMEAVSLTCDPETPDASYLWWMNGQSLPMTHSLKLSETNRTLFLLGVTKYTAGPYECEIRNPVSASRSDPVTLNLLPKLPKPYITINNLNPRENKDVLNFTCEPKSENYTYIWWLNGQSLPVSPRVKRPIENRILILPSVTRNETGPYQCEIRDRYGGIRSDPVTLNVLYGPDLPRIYPSFTYYRSGEVLYLSCSADSNPPAQYSWTINEKFQLPGQKLFIRHITTKHSGLYVCSVRNSATGKESSKSMTVEVSDWTVP。

术语“PSG1”还包括Fc标记的PSG1蛋白(PSG1-Fc)，以下SEQUENCE ID NO:2提供了其的一个示例，其中通过位点定向诱变对Fc标签进行了修饰，以引入MTS突变体M252Y/S254T/T256E和HN突变体H433K/N434F：

SEQUENCE ID NO:2

PSG1-Fc ORF

ATGGGAACCCTCTCAGCCCCTCCCTGCACACAGCGCATCAAATGGAAGGGGCTCCTGCTCACAGCATCACTTTTAAACTTCTGGAACCTGCCCACCACTGCCCAAGTCACGATTGAAGCCGAGCCAACCAAAGTTTCCGAGGGGAAGGATGTTCTTCTACTTGTCCACAATTTGCCCCAGAATCTTACCGGCTACATCTGGTACAAAGGGCAAATGAGGGACCTCTACCATTACATTACATCATATGTAGTAGACGGTGAAATAATTATATATGGGCCTGCATATAGTGGACGAGAAACAGCATATTCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAATGTCACCCGGGAGGACGCAGGATCCTACACCTTACACATCATAAAGGGAGATGATGGGACTAGAGGAGTAACTGGACGTTTCACCTTCACCTTACACCTGGAGACTCCTAAGCCCTCCATCTCCAGCAGCAACTTAAATCCCAGGGAGACCATGGAGGCTGTGAGCTTAACCTGTGACCCTGAGACTCCAGACGCAAGCTACCTGTGGTGGATGAATGGTCAGAGCCTCCCTATGACTCACAGCTTGAAGCTGTCCGAAACCAACAGGACCCTCTTTCTATTGGGTGTCACAAAGTATACTGCAGGACCCTATGAATGTGAAATACGGAACCCAGTGAGTGCCAGCCGCAGTGACCCAGTCACCCTGAATCTCCTCCCGAAGCTGCCCAAGCCCTACATCACCATCAACAACTTAAACCCCAGGGAGAATAAGGATGTCTTAAACTTCACCTGTGAACCTAAGAGTGAGAACTACACCTACATTTGGTGGCTAAATGGTCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGGTAAAGCGACCCATTGAAAACAGGATCCTCATTCTACCCAGTGTCACGAGAAATGAAACAGGACCCTATCAATGTGAAATACGGGACCGATATGGTGGCATCCGCAGTGACCCAGTCACCCTGAATGTCCTCTATGGTCCAGACCTCCCCAGAATTTACCCTTCATTCACCTATTACCGTTCAGGAGAAGTCCTCTACTTGTCCTGTTCTGCGGACTCTAACCCACCGGCACAGTATTCTTGGACAATTAATGAAAAGTTTCAGCTACCAGGACAAAAGCTCTTTATCCGCCATATTACTACAAAGCATAGCGGGCTCTATGTTTGCTCTGTTCGTAACTCAGCCACTGGCAAGGAAAGCTCCAAATCCATGACAGTCGAAGTCTCTGACTGGACAGTTCCCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAACCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGAAGTTCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA。

SEQUENCE ID NO:3提供了包含MTS突变体M252Y/S254T/T256E和HN突变体H433K/N434F的经修饰的Fc标签的开放阅读框：

SEQUENCE ID NO:3

经修饰的人Fc ORF

GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCTACATCACCCGGGAACCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGAAGTTCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA。

术语“PSG1”还包括变体，这些变体是具有与野生型PSG1蛋白(通常是人类野生型PSG1蛋白)基本相同的氨基酸序列的蛋白质。因此，例如，该术语应当被取意为包括就一个或多个氨基酸残基发生改变的蛋白质或多肽。优选地，这种改变涉及5个或更少的氨基酸、更优选地4个或更少、甚至更优选地3个或更少、最优选地仅1或2个氨基酸的插入、添加、删减和/或替换。设想用天然和经修饰的氨基酸插入、添加和取代。变体可以具有保守的氨基酸变化，其中所引入的氨基酸在结构、化学性质或功能上与被取代的氨基酸相似。通常，通过取代或删减具有催化作用的重要残基而改变的蛋白质将被排除在术语“变体”之外。这些具有催化作用的重要残基的详细信息对于蛋白质建模领域的技术人员来说是众所周知的。通常，变体与野生型蛋白质(不包括以上提及的信号肽)具有至少70％的氨基酸序列同源性，优选地至少80％的序列同源性，更优选地至少90％的序列同源性，以及理想地至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性。在这种背景下，序列同源性包括序列同一性和相似性，即与野生型蛋白质共有70％氨基酸同源性的多肽序列是，其中任意70％的经比对的残基与野生型蛋白质中的相应残基相同，或者是野生型蛋白质中的相应残基的保守取代。对于PSG1，在本发明范围内的具体变体包括在国际专利申请公开号WO2017049082第25至38段中给出的突变型PSG1蛋白。该术语还包括PSG1或使用标签(例如Fc标签，包括人Fc标签)修饰的蛋白质。可以对Fc标签进行修饰以显示出增加的血浆半衰期和/或稳定性；这类Fc标签是在文献中已知的，并在本申请中进行了描述。对人Fc标签的修饰的示例包括在CH2结构域中的三重取代MST(M252Y/S254T/T256E)和CH3结构域中的H433K/N434F，以增加稳定性和半衰期。

用于本发明的PSG1可以全部或部分通过化学合成或通过核酸表达(即重组)产生。例如，本发明的蛋白质和用于本发明的蛋白质可以根据公知的标准液体轻易制备，或者优选地，根据固相蛋白质合成方法轻易制备(参见例如，J.M.Stewart和J.D.Young,SolidPhase Peptide Synthesis,2nd edition,Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois(1984)；M.Bodanzsky和A.Bodanzsky,The Practice of Peptide Synthesis,SpringerVerlag,New York(1984))。必要时，本发明中使用的任何蛋白质都可以进行化学修饰以增加其稳定性。经化学修饰的蛋白质或蛋白质类似物包括该蛋白质的任何功能性化学等价物，特征在于就本发明实践而言其在体内或体外增加了稳定性和/或有效性和/或半衰期。术语蛋白质类似物还指如本申请中所描述的蛋白质的任意氨基酸衍生物。蛋白质类似物可以通过，包括但不限于对侧链进行修饰、在蛋白质合成过程中引入非天然氨基酸和/或其衍生物，以及使用交联剂和其它对蛋白质或其类似物施加构象约束的方法等步骤产生。侧链修饰的示例包括氨基的修饰，例如通过与醛反应的还原性烷基化，然后用NaBH₄进行还原；用乙亚氨酸甲酯进行酰胺化；用乙酸酐进行乙酰化；用氰酸盐进行氨基的氨甲酰化；用2,4,6,三硝基苯磺酸(TNBS)进行氨基的三硝基苄基化；用琥珀酸酐和四氢苯酐的氨基的烷基化；以及用5-磷酸吡哆醛进行的赖氨酸的吡哆酰基化，然后用NaBH进行还原。精氨酸残基的胍基可以通过与试剂(例如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛)形成杂环缩聚物来修饰。羧基可以通过经由形成o-acylisourea的碳化二亚胺活化，然后进行后续衍生化(例如衍生为相应的酰胺)来修饰。巯基可以通过诸如用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化；过甲酸氧化为磺基丙氨酸；与其它硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其它取代马来酰亚胺反应；使用4-氯汞基苯甲酸盐、4-氯汞苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞剂形成汞衍生物；在碱性pH下与氰酸盐进行氨甲酰化等方法进行修饰。色氨酸残基可以通过例如用N-溴代琥珀酰亚胺进行氧化或用2-羟基-5-硝基溴化苄或磺酰剂卤化物进行吲哚环烷基化来修饰。酪氨酸残基可以用四硝基甲烷硝化改变以形成3-硝基酪氨酸衍生物。组氨酸残基的咪唑环的修饰可以通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用焦碳酸二乙酯进行N-乙氧羰基化来完成。在蛋白质合成中引入非天然氨基酸和衍生物的示例包括但不限于，使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩丙氨酸和/或这些氨基酸的D-异构体。蛋白质结构修饰包括生成包含D-氨基酸编码的反向序列的逆反(retro-inverso)蛋白。变化可以是降低对蛋白质水解的敏感性、降低对氧化的敏感性、改变变体序列的结合亲和力(通常期望增加亲和力)、和/或赋予或修饰相关变体/类似物蛋白的其它物理化学或功能特性的变化。

在本说明书中，术语“序列同一性”应当理解为包括序列同一性和相似性，即与参考序列共有70％序列同一性的变体(或同源物)是指其中任意70％的比对残基在跨越序列的整个长度上与参考序列中的相应残基相同或者是其保守取代的序列。序列同一性是指两个不同序列之间完全匹配的字符数量。因此，不计算间隔，就两个序列中更短的序列进行测量。对于术语“序列同源性”，该术语应当理解为是指，当变体(或同源物)的比对残基的百分比与参考序列中的相应残基相同，或者是其保守取代，并且该变体(或同源物)与参考序列共有相同的功能时，与参考序列共有所定义的相似性百分比或同一性的变体(或同源物)。这种比对和同源性百分比或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序确定，例如，一种比对程序是BLAST，使用默认参数。这些程序的详细内容可以在以下网址找到：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi。

术语“PSG1”还包括除通过以插入、删减、或经由用功能基团修饰的氨基酸残基的取代(经修饰的蛋白)之外的方式修饰的PSG1蛋白。

医生将根据需要治疗或护理的具体病况、疾病或病症，以及患者的年龄、体重和/或健康状况，来确定最适合患者的实际剂量。其将取决于多种因素，包括所使用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、药物组合、具体病况的严重程度以及接受治疗的个体。当然，可以存在应当更高或更低剂量范围的个例，并且这些个例在本发明的范围内。例如，该组合物可以0.01至50mg/kg体重的剂量施用，例如从0.01至1.0mg/kg、通常为0.1至30mg/kg、更优选地，从0.1至20mg/kg体重、更优选地，从0.1至10mg/kg体重、优选地，0.1至5mg/kg体重。在示例性实施方案中，向患者施用10至300mg/天或更优选地10至150mg/天的一种或多种剂量。该量和频率是最适合于该目的的。根据每个受试者的需要，应用或给药的频率可以变化很大，应用或给药的推荐范围从每月一次至每天十次，优选地，从每周一次到每天四次，更优选地，从每周三次到每天三次，甚至更优选地，每天一次或两次。在本发明的实施方案中，乳剂含有脂质或油。乳剂可以是但不限于水包油、油包水、水包油包水和水包油包硅酮乳液。该乳剂可以含有保湿剂。该乳剂可以含有消泡剂，例如硅酮。该乳剂可以具有任何合适的粘度。乳剂可以进一步含有乳化剂和/或消泡剂。制备乳剂的方法是本领域技术人员已知的。

活性剂(PSG1)在本发明的药物组合物中以药学上或治疗上有效的浓度使用，以达到所需的效果；以相对于组合物的总重量0.00000001％(以重量计)和100％(以重量计)之间的优选形式；通常，在0.00000001％(以重量计)至40％(以重量计)之间；优选地在0.000001％(以重量计)至15％(以重量计)之间，更优选地在0.0001％(以重量计)到10％(以重量计)之间，以及甚至更优选地在0.0001％(以重量计)和5％(以重量计)之间。理想地，该PSG1优选地以组合物的约0.00001％w/w至约0.5％w/w，以及更优选地从0.00005w/w至约0.05w/w，以及最优选地从约0.0001w/w至约0.01w/w使用。理想地，该PSG1最优选地以组合物的约0.0001％w/w至约0.004％w/w使用。

本发明的组合物可以单独或与其它药理学活性药物联合施用。应当理解的是，这种联合治疗包括不同的治疗方案，包括但不限于以单一剂型或以不同的独立剂型对多种药剂一起施用。如果药剂以不同的剂型存在，则可以同时或几乎同时给药，或者可以遵循包含不同药物给药方案的任何预定方案。合适的活性剂可以如本申请所述。

在本发明的一些实施方案中，该组合物可以通过脂质体、混合脂质体、油质体、niosome、醇质体、微胶囊、胶囊、大胶囊、纳米胶囊、纳米结构脂质载体、海绵体(sponge)、环糊精、囊泡、胶束、表面活性剂的混合胶束、表面活性剂-磷脂混合胶束、微球、球、脂球、颗粒、纳米球、纳米粒、微颗粒(milliparticle)、固体纳米粒以及微乳液，包括具有反胶束内部结构和纳米乳液微球、微粒的油包水微乳液。

现有多种制备脂质体的方法。参见例如，Szoka et al,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)、美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028、4,946,787、PCT公开号WO 91/17424、Deamer&Bangham,Biochim.Biophys.Acta 443:629-634(1976)；Fraley,et al,PNAS 76:3348-3352(1979)；Hope et al,Biochim.Biophys.Acta 812:55-65(1985)；Mayer et al,Biochim.Biophys.Acta 858:161-168(1986)；Williams et al,PNAS 85:242-246(1988)；Liposomes(Ostro(ed.),1983,Chapter 1)；Hope et al,Chem.Phys.Lip.40:89(1986)；Gregoriadis,Liposome Technology(1984)and Lasic,Liposomes:from Physics toApplications(1993))。合适的方法包括，例如，超声、挤压、高压/均质、微流化、洗涤剂透析、小脂质体载体的钙诱导融合和乙醚融合法，所有这些都是本领域众熟知的。

这些递送系统可以被调整以实现本发明化合物和/或肽的更强穿透性。这可以改善药代动力学和药效动力学特性。该递送系统可以是持续释放系统，其中本发明的化合物或肽在一段时间内逐渐释放，并优选地在一段时间内以恒定的释放速率释放。该递送系统通过本领域已知方法制备。在该缓释系统中所含的肽的量将取决于该组合物递送至何处，和释放的持续时间，以及待治疗或护理的病况、疾病和/或病症的类型。

本发明的化合物可以通过口服给药施用。该化合物(以及其它成分，如需要)也可以被包裹于硬壳或软壳的明胶胶囊中、压制成片剂、或直接加入至受试者的饮食中。对于口服治疗给药，该化合物可以与赋形剂组合并以可摄入的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、晶片(wafer)等形式使用。该化合物可以被材料包被或与材料共同施用以防止其失活。包被可以被配置成在通过胃的运输过程中保护该活性剂并在回肠中释放该活性剂。

本发明的方法可以涉及施用经配制的、以在体内表达活性剂(PSG1)的核酸构建体。如本申请所用，术语“PSG1表达载体”可以是任何合适的载体，包括适合于在细胞内表达PSG1(或其修饰版本，例如Fc标记的蛋白质)的染色体载体、非染色体载体和合成核酸载体(包含一组合适的表达控制元件的核酸序列)。此类载体的示例包括SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、由质粒和噬菌体DNA的组合衍生的载体以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，编码PSG1氨基酸序列的核酸分子包含在裸DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(例如，如在Sykes和Johnston,Nat Biotech 12,355-59(1997)中所描述的)、压缩核酸载体(例如，如在美国专利号6,077,835和/或WO 00/70087中所描述的)、或如pBR322、pUC 19/18或pUC 118/119的质粒载体。这类核酸载体及其用法是本领域中是熟知的(例如，参见美国专利号5,589,466和美国专利号5,973,972)。在一个实施方案中，DNA包含表达控制序列。

在一个实施方案中，载体适合在细菌细胞中表达蛋白质。这类载体的示例包括表达载体，例如BlueScript(Stratagene)、pIN载体(Van Heeke&Schuster,1989,J Biol Chem264,5503-5509)、pET载体(Novagen,Madison,Wis.)等。在一个实施方案中，表达载体还可以或替代性地为适合在酵母系统中表达的载体。可以使用任何适合在酵母系统中表达的载体。合适的载体包括，例如，包含组成型或诱导型启动子的载体，例如酵母α因子、醇氧化酶和PGH(综述于：F.Ausubel et al.，ed.,1987,Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley InterScience New York；和Grant et al.,1987,Methods in Enzymol 153,516-544)。在其它实施方案中，表达载体适合在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达(Kost,T；和Condreay,J P,1999,Current Opinion inBiotechnology 10(5):428-33.)。

表达控制序列被设计成控制和驱动目的基因的转录，并随后在多种细胞系统中表达蛋白质。质粒将可表达的目的基因与表达控制序列(即表达盒)结合，表达控制序列包含需要的元件，例如启动子、增强子、选择性标记、操纵子等。在本发明的表达载体中，编码PSG1氨基酸序列的核酸分子可以包含或由任意合适的启动子、增强子、选择性标记、操纵子、抑制蛋白、polyA终止序列和其它促表达元件组成。

如本申请所用的“启动子”是指足以引导与其可操作地连接(即当存在适当信号时，以此类允许转录编码蛋白质的核苷酸序列的方式连接)的DNA序列的转录的DNA序列。编码蛋白质的核苷酸序列的表达可置于本领域已知的任何启动子或增强子元件的控制之下。这类元件的示例包括强表达启动子(例如，人CMV IE启动子/增强子或CMV major IE(CMV-MIE)启动子、以及RSV、SV40晚期启动子、SL3-3、MMTV、泛素(Ubi)、泛素C(UbC)和HIV LTR启动子)。在一些实施方案中，载体包括选自由SV40、CMV、CMV-IE、CMV-MIE、RSV、SL3-3、MMTV、Ubi、UbC和HIV LTR组成的组中的启动子。

本发明的核酸分子还可以可操作地与有效的poly(A)终止序列、大肠杆菌中的质粒产物的复制起点、作为选择性标记的抗生素抗性基因、和/或方便克隆位点(例如，多聚接头)连接。核酸还可以包含可调节的诱导型启动子(诱导型、抑制型、发育调控型)，而非诸如CMV IE的组成型启动子(技术人员将认识到这些术语实际上是在特定条件下的基因表达程度的描述词)。

选择性标记是本领域熟知的元素。在选择条件下，只有表达恰当的选择性标记的细胞可以存活。通常，选择性标记基因表达在细胞培养中赋予对各种抗生素的抗性的蛋白质，通常是酶。在其它选择条件下，表达荧光蛋白标记的细胞是可见的，因此是选择性的。实施方案包括β-内酰胺酶(bla)(β-内酰胺类抗生素抗性或氨苄青霉素抗性基因或ampR)、bls(杀稻瘟菌素抗性乙酰转移酶基因)、bsd(杀稻瘟菌素-S脱氨酶抗性基因)、bsr(杀稻瘟菌素-S抗性基因)、Sh ble(抗性基因)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)(潮霉素抗性基因)、tetM(四环素抗性基因或tetR)、新霉素磷酸转移酶II(npt)(新霉素抗性基因或neoR)、kanR(卡那霉素抗性基因)和pac(嘌呤霉素抗性基因)。

在某些实施方案中，载体包含选自由bla、bls、bsd、bsr、Sh ble、hpt、tetR、tetM、npt、kanR和pac组成的组中的一种或多种选择性标记基因。在其它实施方案中，载体包含一种或多种编码绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、青色荧光蛋白(CFP)、增强型青色荧光蛋白(eCFP)、或黄色荧光蛋白(YFP)的选择性标记基因。

为了本发明的目的，真核细胞中的基因表达可以使用强启动子严格调控，强启动子是由操纵子控制，操纵子又由调控蛋白调控。调控蛋白可以是重组的“调控融合蛋白”(RFP)。RFP主要由转录阻断结构域和调节其活性的配体结合域组成。这类表达系统的示例描述于US20090162901A1中，本申请通过引用将其完整地纳入其中。

如本申请所用，“操纵子”是指以此类方式(基因可以通过RFP与操纵子的结合来调节)被引入基因中或基因附近的DNA序列，并由此阻止或允许目的基因(即编码本发明多肽的核苷酸)的转录。原核细胞和噬菌体中的大量操纵子已被很好地表征(Neidhardt,ed.,Escherichia coli and Salmonella；Cellular and Molecular Biology 2d.Vol 2ASMPress,Washington D.C.1996)。这些操纵子包括但不限于，大肠杆菌LexA基因的操纵子区域，其结合LexA肽，以及乳糖和色氨酸操纵子，其与由大肠杆菌的Lad和trpR基因编码的抑制蛋白结合。这些操纵子还包括来自lambda PR和噬菌体P22 ant/mnt基因的噬菌体操纵子，其结合由lambda cl和P22 arc编码的抑制蛋白。在一些实施方案中，当RFP的转录阻断结构域是限制性内切酶时，例如NotI，操纵子是该酶的识别序列。本领域中技术人员能意识到的是，操纵子必须位于相邻于启动子或启动子的3’，使得其能够通过启动子控制转录。例如，通过引用并入本申请的美国专利号5,972,650，其说明了tetO序列在距离TATA盒的特定距离内。在具体实施方案中，优选地将操纵子被置于紧邻启动子的下游。在其它实施方案中，操纵子被置于启动子的10个碱基对内。

在示例性的细胞表达系统中，细胞被工程化为表达四环素抑制蛋白(TetR)，且目的蛋白质被置于启动子的转录控制下，启动子的活性由TetR调节。两个串联的TetR操纵子(tetO)被置于紧邻载体中的CMV-MIE启动子/增强子的下游。在没有四环素或一些其它合适的诱导剂(如多西环素)的情况下，由这类载体中的CMV-MIE启动子引导的编码目标蛋白的基因的转录可能被TetR阻断。在诱导剂存在的情况下，TetR蛋白不能结合tetO，因此发生目的蛋白的转录和之后的翻译(表达)。(参见，例如美国专利号7,435,553，本申请通过引用将其完整地纳入其中)。

本发明的载体还可以使用Cre-lox重组工具，以促进将目的基因整合到宿主基因组中。Cre-lox策略需要至少两个组成部分：1)Cre重组酶，一种催化两个loxP位点之间重组的酶；和2)loxP位点(例如，由发生重组的8bp核心序列和两侧的13bp的反向重复序列组成的特异性34个碱基对的序列)或突变lox位点。(参见，例如Araki et al.,1995,PNAS 92:160-4；Nagy,A.et al.,2000,Genesis 26:99-109；Araki et al.,2002,Nuc Acids Res 30(19):e103；和US20100291626A1，所有这些都通过引用并入本申请)。在另一重组策略中，酵母衍生的FLP重组酶可以与共有序列FRT一起使用(还参见，例如Dymecki,S.M.,1996,PNAS93(12):6191-6196)。

如本申请所用，术语“宿主细胞”包括适用于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如啤酒酵母、裂殖酵母、毕赤酵母(P.pastoris)、P.methanolica等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人类动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞或细胞融合(例如杂交瘤或四倍体)的细胞。在具体实施方案中，细胞是人、马、犬、猫、牛、猴子、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在其它实施方案中，细胞是真核细胞，并选自以下细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾脏(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431(表皮的)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、肿瘤细胞和从上述细胞衍生的细胞系。在一些实施方案中，所述细胞包括一个或多个病毒基因，例如，表达病毒基因的视网膜细胞(例如细胞)。在一些实施方案中，所述细胞是CHO细胞。在其它实施方案中，所述细胞是CHO K1细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌。

如本申请所用，术语“转化细胞”是指包含稳定整合到细胞基因组中的核酸的宿主细胞，基因组包含编码PSG1蛋白表达的核苷酸序列。在另一实施方案中，本发明提供了一种包含非整合(即附加体)的核酸的细胞，例如质粒、黏粒、噬菌粒或线性表达元件，其包含编码PSG1蛋白表达的序列。在其它实施方案中，本发明提供了通过用包含本发明的表达载体的质粒稳定转染宿主细胞而产生的细胞系。

如本申请所用，应用于细胞的术语“工程化的”是指使用重组DNA技术进行基因工程，并且通常涉及合成合适的表达载体(见上文)，然后将表达载体转染到宿主细胞(通常是稳定转染)的步骤。

如本申请所用，术语“异源表达”是指核酸在自然下不具有该核酸的宿主细胞中的表达。通过重组DNA技术将核酸插入到异源宿主中。

如本申请所用，术语“神经干细胞”是指产生神经系统神经元和神经胶质细胞的自我更新的多能细胞。它们被描述于：

Clarke,D et al.(2000)."Generalized Potential of Adult Neural StemCells".Science.288(5471):1660–63.Bibcode:2000Sci...288.1660C.doi:10.1126/science.288.5471.1660.PMID 10834848；

Gilbert et al.Helsinki,the University of(2014).Developmental biology(Tenth edition.ed.).Sunderland,Mass.:Sinauer.ISBN 978-0878939787；和

Temple et al.(1989)."Division and differentiation of isolated CNSblast cells in microculture".Nature.340(6233):471–73.Bibcode:1989Natur.340..471T.doi:10.1038/340471a0.PMID 2755510。

如本申请所用，在治疗神经退行性病变的背景下，术语“给药”应当包括能够将活性剂递送至CNS或PNS的任何形式的递送，包括静脉递送、口服递送、肌内递送、鞘内递送和吸入递送。实现这些递送手段的方法对于药物递送领域的技术人员来说是熟知的，并包括：

·通过微型渗透泵鞘内注射递送。(参见：Ignacio et al,Ann.N.Y.Acad.Sci.2005,1053:121–136)。

·通过注射器或微型渗透泵直接肌内递送(Azzouz et al,Nat Med.2005；11(4):429-33)。

·通过注射器或微型渗透泵腹腔-用于全身给药-直接给药至腹膜(Kieran etal,Nat Med2004；10(4):402)。

·通过注射器皮下-用于全身给药-直接在皮肤下给药(Reinholz et al,ExpNeurol.1999；159(1):204-16)。

·通过注射或使用连接渗透泵的小导管脑室内-直接给药至脑室(Sathasivam etal,2005Neuropath App Neurobiol；31(5):467)。

·植入-可以在释放活性物的植入物(例如小型硅植入物)中制备。植入物可以被置于肌肉或直接置于脊髓上(Kieran和Greensmith,2004Neurosci 125(2):427-39)。

经修饰的蛋白

在一个实施方案中，PSG1蛋白(包括蛋白片段和变体)可以是经修饰的蛋白。术语“经修饰的蛋白”与术语“蛋白质衍生物”互换使用。在一个实施方案中，术语“经修饰的蛋白”是指与未修饰的蛋白质相比，经修饰以表现出以下一种或多种特性的蛋白质：增加血浆半衰期；增加蛋白质的亲脂性；降低经修饰的蛋白的肾脏清除率；增加经修饰的蛋白的活性，并增加经修饰的蛋白对蛋白水解降解(即通过哺乳动物的，且尤其是人的胃肠道蛋白酶)的抗性。本申请公开了修饰本发明蛋白质以表现出这些特性的各种方法，包括将蛋白质与结合配体(例如白蛋白结合小分子、大聚合物、长效血浆蛋白或抗体或抗体片段)偶联、环化、N端或C端或侧链上的添加、保护基团、用D-异构体替代一个或多个L-氨基酸、氨基酸修饰、增加血浆蛋白结合、增加白蛋白结合。所述经修饰的蛋白包括但不限于已经用本申请所定义的一种或多种基团取代、或与结合配体偶联、或环化的蛋白质。通常对该蛋白质进行修饰以增加其在动物体内的半衰期。以下提供了各种修饰方法。

在一个实施方案中，所述修饰可以是提供使本发明的蛋白质和或组合物具有增加的穿透细胞的能力的任何修饰。在一个实施方案中，该修饰可以是增加本发明的组合物或蛋白质的半衰期的任何修饰。在一个实施方案中，该修饰可以是增加组合物或蛋白质活性的任何修饰。在一个实施方案中，该修饰可以是增加组合物或蛋白质的选择性的任何修饰。

在一个实施方案中，基团是保护基团。该保护基团可以是N-端保护基团、C-端保护基团或侧链保护基团。该蛋白质可以具有一个或多个这样的保护基团。

本领域技术人员知晓使氨基酸与这些保护基团反应的合适的技术。这些基团可以通过本领域已知的制备方法添加，例如在US2014120141第[0104]至[0107]段中概述的方法。该基团可以保留在蛋白质上，或可以被去除。在合成过程中可以加入该保护基团。

在本发明的实施方案中，蛋白质可以选自被直链或支链、长或短链、饱和或不饱和中的一个或多个的基团取代，被羟基、氨基、氨基酰基、硫酸盐或硫化物基团取代，或具有1至29个碳原子的未取代基团。N-酰基衍生物包括衍生自乙酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、辛酸、棕榈酸、硬脂酸、山萮酸、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、异硬脂酸、反油酸、2-乙基己烯酸、椰子油脂肪酸、动物脂肪酸、硬化动物脂肪酸、棕榈仁脂肪酸、羊毛脂脂肪酸或类似酸的酰基。其可以是取代的或无取代的。当被取代时，其优选地被羟基或含硫基团，例如但不限于SO₃H、SH或S-S取代。

在本发明的实施方案中，该蛋白质为R1-X-R2。

R1和/或R2基团分别与蛋白质序列的氨基端(N-端)和羧基端(C-端)连接。

在一个实施方案中，该蛋白质是R1-X。或者，该蛋白质是X-R2。

优选地，R1为H、C1-4烷基、乙酰基、苯甲酰或三氟乙酰基；

X为本发明的蛋白质；

R2为OH或NH₂。

在一实施方案中，R1选自由H、非环的取代或未取代的脂肪基团、取代或未取代的脂环基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂芳烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的烷芳基、叔丁氧羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)和R5-CO-形成的基团，其中R5选自由H、非环的取代或未取代的脂肪基团、取代或未取代的脂环基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基和取代或未取代的杂芳烷基形成的基团。

R2选自由-NR3R4、-OR3和-SR3形成的基团，其中R3和R4独立选自由H、非环的取代或未取代的脂肪基团、取代或未取代的脂环基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂芳烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基；且在R1和R2不是α-氨基酸的条件下。

根据另一优选实施方案，R2为-NR3R4、-OR3或-SR3，其中R3和R4独立选自由H、取代或未取代的C1-C24烷基、取代或未取代的C2-C24烯基、叔丁氧羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、取代或未取代的C2-C24炔基、取代或未取代的C3-C24环烷基、取代或未取代的C5-C24环烯基、取代或未取代的C8-C24环炔基、取代或未取代的C6-C30芳基，取代或未取代的C7-C24芳烷基，取代或未取代的3-10元杂环基，以及取代或未取代的2至24个碳原子和1至3个除碳之外的原子的杂芳烷基，其中烷基链为1至6个碳原子。可选地，R3和R4可以通过饱和或不饱和碳-碳键连接，与氮原子形成环。更优选地，R2为-NR3R4或-OR3，其中R3和R4独立选自由H、取代或未取代的C1-C24烷基、取代或未取代的C2-C24烯基、取代或未取代的C2-C24炔基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C6-C15芳基、和取代或未取代的3-10元杂环基、取代或未取代的3-10元杂芳烷环，以及1-6个碳原子的烷基链形成的组。更优选地，R3和R4选自由H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基形成的组。甚至更优选地，R3为H且R4选自由H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基组成的组。甚至根据更优选的实施方案，R2选自-OH和-NH₂。

根据本发明的另一实施方案，R1选自由H、乙酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基或棕榈酰基组成的组，并且R2为-NR3R4或-OR3，其中R3和R4独立选自H、甲基、乙基、己基、十二烷基和十六烷基，优选地，R2为-OH或-NH₂。更优选地，R1是乙酰基或棕榈酰基且R2是-NH₂。

在优选的实施方案中，酰基(或乙酰基)与蛋白质的至少一个氨基酸的N-端连接。

在本发明的实施方案中，该蛋白质被修饰为包含侧链保护基团。该侧链保护基团可以是包含苄基或基于苄基的基团、叔丁基、苄氧羰基(Z)和烯丙氧羰基(alloc)保护基的基团中的一个或多个。侧链保护基团可以衍生自非手性氨基酸，例如非手性甘氨酸。使用非手性氨基酸有助于稳定所得到的蛋白质，也有利于本发明的合成路线。优选地，所该蛋白质进一步包括经修饰的C-端，优选地为酰胺化的C-端。非手性残基可以是α-氨基异丁酸(甲基丙氨酸)。应当理解，所使用的具体侧链保护基团将取决于蛋白质序列和所使用的N-端保护基团的类型。在本发明的一个实施方案中，蛋白质与一种或多种聚乙二醇聚合物或其它化合物(例如增加分子量的化合物)偶联、连接或融合。增加分子量的化合物是任意能增加分子量的化合物，通常是增加所得偶联物的分子量的10％至90％、或20％至50％，并且可以具有200至20,000之间的分子量，优选地在500至10,000之间。增加分子量的化合物可以是PEG、任何水溶性(两亲性或亲水性)聚合物基团、PEG的同质或共聚物、PEG的单甲基取代聚合物(mPEG)和聚氧乙烯甘油(POG)、聚氨基酸(例如聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸，特别是L构象的(聚氨基酸))、药理学上无活性的蛋白质(例如白蛋白、明胶、脂肪酸、多糖、脂质氨基酸和右旋糖酐)。聚合物基团可以是直链或支链的，且其可以具有500～40000道尔顿(DA)、5000～10000Da、10000～5000Da的分子量。该化合物可以是任何合适的细胞穿透化合物，例如tat蛋白、penetratin、pep-1。该化合物可以是抗体分子。该化合物可以是亲脂性基团或聚合基团。

亲脂取代基和聚合取代基是本领域已知的。亲脂取代基包括酰基、磺酰基、构成酯、磺酰酯、硫酯、酰胺或磺胺的一部分的N原子、O原子或S原子。亲脂性基团可以包括具有4至30个碳原子的烃链，优选地8至12个碳原子。其可以是线性的或分支的、饱和的或不饱和的。该烃链可以进一步被取代。其可以是环烷烃或杂环烷烃。可以在N-端、C-端或两者上修饰该蛋白质。该聚合物或化合物优选与氨基、羧基或巯基连接，并且可以通过任何氨基酸残基的侧链的N-端或C-端连接。该聚合物或化合物可以偶联到任何合适残基的侧链上。

该聚合物或化合物可以通过间隔子(spacer)偶联。间隔子可以是天然或非天然的氨基酸、琥珀酸、赖氨酰、谷氨酰、天冬酰胺、甘氨酰、β-丙氨酰、γ-氨基丁酰。该聚合物或化合物可以通过酯、磺酰酯、硫酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲、磺胺偶联。

本领域技术人员知晓制备所述的偶联物的合适方法。

例如，蛋白质可以通过与聚合物的共价偶联进行化学修饰，以增加其循环半衰期。示例性的聚合物和将这些聚合物与蛋白质连接的方法描述于，例如，美国专利号4,766,106、4,179,337、4,495,285和4,609,546。其它说明性的聚合物包括聚氧乙烯多元醇和聚乙二醇(PEG)基团。

可以对本发明的蛋白质进行一种或多种修饰，以调控蛋白质的储存稳定性、药代动力学和/或生物活性中的任何方面，例如，效力、选择性和药物相互作用。可对蛋白质进行的化学修饰包括但不限于，聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇、右旋糖酐、聚-(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烯/环氧乙烷共聚物、聚丙二醇、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇、多聚乙酰神经氨酸(colominic acids)或其它基于碳水化合物的聚合物、氨基酸的聚合物和生物素衍生物中的一种或多种与蛋白质偶联。蛋白质在Cys残基处的PEG偶联公开于，例如，Goodson,R.J.&Katre,N.V.(1990)Bio/Technology 8,343andKogan,T.P.(1992)Synthetic Comm.22,2417。

经修饰的蛋白质还可以包括在其中经一个或多个残基修饰的序列(即通过磷酸化、磺化、酰化、酰胺化、PEG化等)，以及相对于亲本序列包含一个或多个经修饰的残基的突变体。氨基酸序列也可以用能够直接或间接提供可检测信号的标记进行修饰，包括但不限于放射性同位素、荧光和酶标记。荧光标记包括，例如，Cy3、Cy5、Alexa、BODIPY、荧光素(例如，FluorX、DTAF和FITC)、罗丹明(例如，TRITC)、金胺、德克萨斯红、AMCA蓝和荧光黄。优选的同位素标记包括3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和286Re。优选的酶标记包括过氧化物酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶(参见，例如，美国专利号3,654,090、3,850,752和4,016,043)。酶可以通过与桥接分子，例如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等反应来偶联。酶标记可以目测、或通过量热法、分光光度法、荧光分光光度法、安培法或气体定量技术测量。其它标记系统，例如亲和素/生物素，酪胺信号放大(TSA^TM)是本领域已知的，且是可市售的(参见，例如，ABC试剂盒，Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,Calif.；LifeScience Products,Inc.,Boston,Mass.)。

在实施方案中，对蛋白质、变体和/或组合物进行修饰以增加药物性能能力。在实施方案中，对蛋白质、变体和/或组合物进行修饰以增加稳定性、渗透性、保持效力、避免毒性和/或增加半衰期。修饰可以是如上所述的。例如，修饰可以是保护N和C-端，其可以是经修饰的氨基酸、环化、氨基酸取代，和/或与大分子或大聚合物或长效血浆蛋白偶联。延长半衰期的策略可以如Strohl et al(BioDrugs,2015)、Schlapschy et al(Protein Eng DesSel.2013)、Podust,VN et al(Protein Eng Des Sel.2013)、Zhang,L et al(Curr MedChem.2012)、Gaberc-Porekar,V et al(Curr Opin Drug Discov Devel.2008)所述。示例包括使用PEG化、脂化(脂肪酸与蛋白质侧链的共价连接)、Fc结构域与人血清白蛋白融合、与亲水性氨基酸聚合物融合，例如XTEN或PAS，和/或与半衰期延长的蛋白质融合。

一种或多种蛋白质可以在其序列中包含的弱位点，其在蛋白质水解富集的环境中，例如在血液或胃肠道中，容易发生蛋白质水解断裂。在一个实施方案中，蛋白质、变体和/或组合物包括一个或多个弱位点的修饰，使得与未修饰的一种或多种蛋白质相比，该蛋白质、变体和/或组合物不经历蛋白质水解断裂/裂解，或经历减少了量的蛋白质水解断裂/裂解。因此，可以对蛋白质进行修饰，以增加经修饰的蛋白质对哺乳动物胃肠道蛋白酶的蛋白质水解降解的抗性。Diao et al(Clinical pharmacokinetics 52.10(2013):855-868)描述了合适的修饰。

文献中描述了对蛋白质进行修饰以延长蛋白质的体内半衰期，例如：

Strategies to improve plasma half-life time of protein and proteindrugs.Werle M,Bernkop-Schnürch A.Amino Acids.2006Jun；30(4):351-67。

由于长效蛋白和蛋白质药物的显著优势，延长这些化合物的血浆半衰期的策略存在高度需求。血浆半衰期时间短通常是由于快速的肾脏清除以及在系统循环中发生的酶降解。蛋白质/蛋白质的修饰可导致血浆半衰期时间延长。通过缩短生长激素抑制素的总氨基酸量，并用D-氨基酸代替L-氨基酸类似物，衍生物奥曲肽的血浆半衰期时间为1.5小时，相比下生长激素抑制素只有几分钟。与天然蛋白质相比，INF-α-2b的PEG(2,40K)偶联物显示血浆半衰期延长了330倍。这篇综述的目的在于提供可能延长血浆半衰期时间的策略的概述，例如N-端和C-端的修饰或聚乙二醇化，以及评估药物修饰有效性的方法。此外，还提供了人体血液、肝脏和肾脏中最重要的蛋白水解酶的基本数据，以及其裂解特异性和其抑制剂，以预测在系统循环中蛋白质和蛋白质药物的酶裂解。

Strategic Approaches to Optimizing Protein ADME Properties.Li Di AAPSJ.2015Jan；17(1):134–143。

对蛋白质水解稳定的蛋白质的策略

有许多方法可以通过结构修饰来提高蛋白质的稳定性。有些方法不仅改善了稳定性，还提高了其它ADME特性，例如，环化可以提高稳定性和渗透率；与大分子偶联可以提高稳定性并减少肾脏清除率。重要的是，在提高蛋白的稳定性和ADME特性的同时，保持效力和避免毒性。

·保护N-端和C-端

血液/血浆、肝脏或肾脏中的许多蛋白水解酶是外肽酶、氨基肽酶和羧肽酶，且其从N-端和C-端分解蛋白质序列。对N-端或/和C-端进行修饰通常可以提高蛋白质的稳定性。许多示例报道了N-乙酰化和C-酰胺化增加了对蛋白质水解的抗性。

·使用D-氨基酸替代L-氨基酸

用非天然的D-氨基酸取代天然的L-氨基酸降低了蛋白水解酶的底物识别和结合亲和力，并增加了稳定性。一个示例是加压素，其含有L-精氨酸，在人体内具有10-35分钟的半衰期。D-精氨酸类似物、去氨加压素在健康人志愿者中具有3.7小时的半衰期。在癌症相关的蛋白酶尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的双环蛋白抑制剂的研究中，使用D-丝氨酸替代特定的甘氨酸不仅将效力提高了1.8倍，还将在小鼠血浆中的稳定性提高了4倍。

·氨基酸的修饰

天然氨基酸的修饰可以通过引入空间位阻或干扰酶的识别来提高蛋白质的稳定性。例如，促性腺激素释放激素具有很短的半衰期(几分钟)，而布舍瑞林(buserelin)，在其中的一个Gly被叔丁基-D-丝氨酸取代且另一Gly被乙酰胺取代，在人体内具有更长的半衰期。

·环化

环化引入了构象约束，降低了蛋白质的柔性，并增加了稳定性和渗透性。根据官能团，蛋白质可以头对尾、头/尾对侧链或侧链对侧链进行环化。环化通常通过内酰胺化、内酯化和基于硫桥来完成。二硫化桥产生折叠和构象限制，其可以提高效力、选择性和稳定性。许多富含二硫化桥的蛋白质已上市或处于临床前或临床开发中，例如利那洛肽、来匹卢定和齐考诺肽。

·与大分子偶联

与大分子(例如聚乙二醇(PEG)、白蛋白)偶联是提高蛋白质稳定性和减少肾脏清除率的有效策略。

肾脏清除率

许多蛋白质在体外表现出良好的药理学活性，但由于在体内的半衰期非常短(几分钟)，未证明其体内功效。蛋白质的快速清除和短半衰期阻碍了其被开发为成功药物。蛋白质在系统循环中的快速清除的主要原因是酶促蛋白水解或/和肾脏清除。肾小球具有～8nm的孔径，且分子量<2-25kDa的亲水蛋白容易通过肾脏的肾小球快速过滤。由于蛋白质不容易通过肾小管重吸收，所以其通常具有高的肾脏清除率和短半衰期。蛋白质清除的其它次要途径是蛋白酶体和肝脏的内吞和降解。在动物模型中全身清除和肾脏清除的对比提供了对于肾脏清除是否可能是主要的清除途径的有用信息。

对于肾功能受损的患者，可能需要调整蛋白质药物的剂量，以避免积累和更多的药物暴露，因为在肾功能障碍的患者中，不恰当的剂量可以导致毒性或治疗无效。已经开发了多种策略以减少蛋白质的肾脏清除并延长半衰期。这些将在以下进行评论。

·增加血浆蛋白结合

当蛋白质与膜蛋白或血清蛋白结合时，其肾脏清除率降低。一个示例是治疗内分泌肿瘤的环状蛋白药物奥曲肽，由于与脂蛋白结合(未结合分数0.65)，其在人体内具有约100分钟的半衰期。

·与白蛋白结合小分子共价连接

将白蛋白结合小分子与蛋白质共价连接，可以通过高结合小分子与白蛋白间接相互作用，以减少肾小球滤过、提高蛋白水解稳定性，并延长半衰期。

·与大聚合物偶联

蛋白质与大的合成或天然聚合物或碳水化合物偶联可以增加其分子量和流体动力学体积，从而降低其肾脏清除率。用于蛋白质偶联的常见聚合物为PEG、聚唾液酸(PSA)和羟乙基淀粉(HES)。

·与长效血浆蛋白融合

血浆蛋白，例如白蛋白和免疫球蛋白(IgG)片段，在人体内具有19-21天的长半衰期。由于高分子量(67-150kDa)，这些蛋白具有低肾脏清除率，并且其与新生Fc受体(FcRn)结合减少了血管上皮细胞通过胞吞的清除。蛋白质与白蛋白或IgG片段的共价连接可以降低肾脏清除率并延长半衰期。

Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologics as a Strategy toMake Biobetters.William R.Strohl BioDrugs.2015；29(4):215–239。

Schlapschy,M,Binder,U,Borger,C等人.PASYlation:a biologicalalternative to PEGylation for extending the plasma half-life ofpharmaceutically active proteins.Protein Eng Des Sel.2013；26(8):489-501。

Podust,VN,Sim,BC,Kothari,D等人.Extension of in vivo half-life ofbiologically active proteins via chemical conjugation to XTEN proteinpolymer.Protein Eng Des Sel.2013；26(11):743-53。

Zhang,L,Bulaj,G.Converting Proteins into Drug Leads byLipidation.Curr Med Chem.2012；19(11):1602-18。

Gaberc-Porekar,V,Zore,I,Podobnik,B等人.Obstacles and pitfalls in thePEGylation of therapeutic proteins.Curr Opin Drug Discov Devel.2008；11(2):242-50。

Dr Ronald V.Swanson-Long live proteins evolution of protein half-lifeextension technologies and emerging hybrid approaches.From Drug DiscoveryWorld on line.Spring 2014。

聚乙二醇化

将亲水聚合物聚乙二醇的长链与目标分子连接，聚乙二醇化最初被认为是一种防止免疫系统识别外来蛋白质的修饰，并从而使其能够用作治疗应用。一旦形成，针对未修饰药物的抗体就能迅速中和并清除蛋白质药物。出乎意料的是，即使在没有抗药物抗体的情况下，聚乙二醇化也改善了蛋白质的药代动力学1。简单地通过使药物分子变大，聚乙二醇化导致药物被肾脏更慢地过滤。经验观察表明，增大尺寸或流体动力学半径导致了肾脏清除率的降低和半衰期增加，从而成为蛋白质和蛋白质药物聚乙二醇化的主要原理。聚乙二醇化可以对分子产生多种影响，包括使蛋白或蛋白质更具水溶性，并保护它们不被蛋白水解酶降解。聚乙二醇化也可以影响治疗性蛋白与其同源细胞受体的结合(通常降低亲和力)。PEG聚合物的尺寸、结构和结合方式的改变会影响被结合的药物的生物活性。第一代聚乙二醇化方法充满了挑战。然而，聚乙二醇化的化学过程是非常简单的。该过程涉及聚乙二醇链与蛋白或蛋白的活性侧链的共价结合。例如，聚乙二醇很容易结合到蛋白或蛋白质的表面上的赖氨酸的氨基上2。该反应是pH依赖的。在高pH(8.0或更高)情况下，赖氨酸侧链氨基通过N-羟基琥珀酰亚胺共价连接到聚乙二醇上。这种方法通常会产生一系列含有不同数量的聚乙二醇链的产物，聚乙二醇链连接在蛋白质的不同位点上，而不是单一的离散产物3。首先获批的聚乙二醇化药物是作为严重联合免疫缺陷的酶替代疗法的Pegademasebovine(聚乙二醇化的牛腺苷脱酰胺酶)和用于治疗急性淋巴细胞白血病的培门冬酶(聚乙二醇化的天冬酰胺酶)1。这些药物是各种聚乙二醇化的物类的复杂混合物，但相对于天然酶具有改善的治疗性能，包括增加血清半衰期和降低蛋白质的免疫原性。由于聚乙二醇固有的多分散性，质量和批次间的重现性很困难。尽管存在这种限制，两种聚乙二醇化干扰素(聚乙二醇化干扰素α-2b和聚乙二醇化干扰素α-2a)，作为多种单聚乙二醇位置异构体的异质群体，已被FDA批准用于治疗丙型肝炎。这些药物分别于2001年和2002年上市。

对于基础的聚乙二醇化技术已经做出了各种增强和改变。第二代聚乙二醇化工艺引入了支链结构的使用以及用于聚乙二醇连接的替代化学物质。特别是具有半胱氨酸反应基团(例如马来酰亚胺或碘乙酰胺)的聚乙二醇允许聚乙二醇化靶向蛋白或蛋白质内的单个残基，降低了最终产物的异质性，且由于聚乙二醇本身的多分散性而不消除异质性。

聚乙二醇化的最初原理是降低免疫原性；然而，已经有一些免疫原性的聚乙二醇化蛋白的示例。一个示例是聚乙二醇化的尿酸氧化酶，一种降低痛风患者的血浆尿酸水平的酶。在临床试验中，相对较高比例的痛风患者对该治疗无应答，并且产生对聚乙二醇特异的抗体，而不是针对尿酸酶蛋白2。聚乙二醇化的脂质体，通常也被认为是非免疫原性的，在一些研究中被发现是免疫原性的。聚乙二醇化的脂质体引发了强烈的抗聚乙二醇免疫球蛋白M(IgM)应答。此外，多次注射聚乙二醇-葡萄糖醛酸酶被证明引发了特异性抗聚乙二醇IgM抗体的产生，从而加速了经聚乙二醇修饰的蛋白从体内的清除。

使用聚乙二醇作为修饰物的主要潜在缺点为其是不可生物降解的。美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了聚乙二醇在药物中作为载体的用途，包括注射、外用、直肠和鼻腔制剂。聚乙二醇显示出很小的毒性，并通过肾脏(对于<30kDa的聚乙二醇)或粪便(对于>20kDa的聚乙二醇)从体内完整地消除1。一些聚乙二醇化的蛋白对动物的的重复给药导致观察到肾小管细胞空泡化。最近，在用蛋白与大聚乙二醇(≥40kDa)偶联的毒性研究中也发现了脉络丛上皮细胞的空泡化。脉络丛上皮细胞产生脑脊液并形成血CSF屏障。细胞空泡化的长期负面后果尚不清楚，但其确实代表了一些潜在治疗的不良后果。一种可能的替代方法是用可生物降解的聚合物代替聚乙二醇。例如羟乙基淀粉(HES)的聚合物是一种可能的替代品。HES是无毒且可生物降解，并用作血液扩张剂。羟乙基淀粉化工艺的作用类似于聚乙二醇化，通过增加蛋白质的流体动力学半径来降低肾脏清除率，但由于可生物降解性，羟乙基淀粉化可以具有更低的积累倾向。然而，HES和其它提出的可生物降解聚合物聚乙二醇替代品，如聚乙二醇，都是多分散的，使得最终产物和代谢物的表征变得困难。缓解这两种问题的一种新兴的解决方案是使用所定义的多聚蛋白质作为聚合物组分；本文稍后将讨论这种方法。

脂化

延长蛋白质半衰期的第二种主要化学修饰方法是脂化，其涉及脂肪酸与蛋白质侧链的共价结合4。作为最初被认为并开发为一种延长胰岛素半衰期的方法，脂化与聚乙二醇化共有相同的半衰期延长的基本机制，即增加流体动力学半径以减少肾脏过滤。然而，脂质基团本身相对较小，且其作用是通过脂质基团和循环白蛋白的非共价结合间接介导的。白蛋白是人体血清中的一种大(67KDa)且高度丰富(35-50g/L)的蛋白质，其天然在功能是在全身运输包括脂质的分子。与血浆蛋白结合也可以通过空间位阻保护蛋白质免受肽酶的攻击，这再次类似于聚乙二醇化。脂化的一个后果是它降低了蛋白质的水溶性，但是蛋白质和脂肪酸之间的连接子的工程化可以调节这一点，例如通过在连接子中使用谷氨酸或迷你聚乙二醇。连接子工程化和脂质基团的改变可以影响自聚集，其导致了由生物学分布减缓而增加了半衰期，而不依赖于白蛋白5。

继胰岛素的开创性工作后6，已经探索了多种蛋白质的脂化，特别是在糖尿病领域内的蛋白质，包括人胰高血糖素样蛋白-1(GLP-1)类似物、葡萄糖依赖性促胰岛素多聚蛋白和GLP-1R/胰高血糖素受体共激动剂等。目前FDA批准了两种脂化蛋白药物在人中的使用。GLP-1类似物利拉鲁肽和地特胰岛素两者都是长效抗糖尿病药物。

聚乙二醇化和脂化之间潜在的药理学相关差异为，治疗活性蛋白是与更大的聚乙二醇共价连接，而较小的脂肪酰基-蛋白偶联物是与更大的白蛋白非共价连接，结合和非结合形式平衡存在。这会导致生物分布的差异，从而可能导致药理学的不同，因为接触位于不同组织中的受体可能引发不同的影响。在某些情况下，可能需要更局限的生物分布，而在另一些情况下，更强的组织穿透性可能是重要的。Santi等人开发了一种解决这一问题的聚乙二醇方法的有趣变体，其中用具有可预测裂解率的可释放的聚乙二醇偶联物7。

聚乙二醇化和脂化都直接或间接地通过空间位阻的屏蔽提供抗蛋白酶和肽酶的保护，并通过增加流体动力学半径来延长循环半衰期。两种方法都利用化学偶联，并且其灵活性在于其对产生所修饰的蛋白质的方法是不可知的，无论是生物生产或是合成生产。使用合成蛋白质的优点是其可以引入设计用于解决多种特定问题的非天然氨基酸，包括因已知的蛋白质水解裂解能力的不稳定性。其在结合位点的选择上也可以更灵活，这在活性或效力高度依赖于游离末端或经修饰的残基(例如C端酰胺)的情况下是至关重要。

经典的遗传融合：Fc和HSA

长效血清蛋白的经典遗传融合提供了一种不同于与聚乙二醇或脂质的化学偶联的半衰期延长的替代方法。传统上，两种主要的蛋白质被用作融合配体：抗体Fc结构域(特别是人和马的IgG1 Fc标签)和人血清白蛋白(HAS)。Fc融合涉及多种蛋白质、多种蛋白质或受体外结构域与抗体Fc部分的融合。Fc和白蛋白两者的融合物不仅通过增加蛋白质药物的尺寸实现延长半衰期，而且还都利用了机体自然循环机制：新生Fc受体FcRn。这些蛋白与FcRn的pH依赖性结合防止了融合蛋白在核内体中的降解。基于这些蛋白的融合物可以具有3-16天范围内的半衰期，相比典型的聚乙二醇化或脂化的蛋白更加长。与抗体Fc融合可以提高蛋白质或蛋白质药物的溶解度和稳定性。蛋白质Fc融合的一个示例是杜拉鲁肽，一种GLP-1受体激动剂，目前处于后期临床试验中。人血清白蛋白，与脂肪酰化蛋白利用的相同蛋白质，是另一种流行的融合配体。阿必鲁肽是基于该平台的一种GLP-1受体激动剂。Fc和白蛋白的主要区别是相对于HAS的单体结构，Fc的二聚体性质导致了融合蛋白以二聚体或单体呈现，而这取决于融合配体的选择。如果靶标受体之间的空间足够近，或者靶标受体本身就是二聚体，则蛋白质Fc融合的二聚体特性可以产生亲和效应。取决于目标，这可以是合乎需要的，也可以不是。在一个实施方案中，Fc结构域被工程化为包括突变。Rath等人描述了将突变工程化至Fc结构域中的方法(2013；doi＝10.3109/07388551.2013.834293)。

设计的多聚蛋白融合：XTEN和PAS

重组融合概念的一个有趣变化是开发了设计的低复杂度序列作为融合配体，其基本上是非结构化的、亲水性的氨基酸聚合物，为聚乙二醇的功能类似物。多聚蛋白平台固有的可生物降解性使其作为潜在的更优良的聚乙二醇替代品具有吸引力。与聚乙二醇的多分散性相比，另一个优点是重组分子的精确分子结构。不同于在其中需要保持融合配体三维折叠的HSA和Fc蛋白融合，与非结构化配体的重组融合，在许多情况下，可以经受更高的温度或苛刻的条件，例如HPLC纯化。

最先进的这类多聚蛋白被称为XTEN(Amunix)，其为864个氨基酸长，并由6种氨基酸(A、E、G、P、S和T)组成。由于聚合物的可生物降解性，其比通常使用的40KDa聚乙二醇更大，并赋予了更长的延长半衰期。XTEN与蛋白质药物的融合导致了相比天然分子半衰期延长60至130倍。两种完全重组生产的XTEN化产品已经进入临床，命名为VRS-859(艾塞那肽-XTEN)和VRS-317(人生长激素-XTEN)。在Ia期研究中，VRS-859被发现在II型糖尿病患者中具有良好的耐受性和有效性。与先前研究的rhGH产品相比，VRS-317被报告出更优越的药代动力学和药效学特性，并且具有每月给药一次的潜力。基于类似概念考虑的第二种聚合物是PAS(XL-Protein GmbH)9。一种由一组更有限的仅三种小的不带电的氨基酸，脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成的无规则螺旋聚合物。PAS和带有高负电荷的XTEN的生物物理学特性差异是否会导致生物分布和/或体内活性的差异尚不清楚，但随着这些多聚蛋白被纳入更多的治疗以及融合行为的表征，其将被揭示。

无论配体是Fc、HSA、XTEN或PAS，所有的蛋白-蛋白融合都是基因编码的，并因此受到类似的限制。一个限制是，只有天然存在的氨基酸被纳入，不同于使用化学偶联的方法，其允许使用纳入非天然氨基酸的合成蛋白质。虽然例如Ambrx或Sutro的公司正在开发通过扩展遗传密码来克服该限制的方法，但其尚未得到广泛应用。第二个限制是蛋白质的N-或C-端需要与配体融合。通常，蛋白质末端参与受体相互作用且一个或两个末端的遗传融合会极大地损害活性。由于聚乙二醇或脂质偶联的位点可以在蛋白质上的任何地方，因此其可以优化以最大化所得治疗药物的生物活性。

合成蛋白与半衰期延长蛋白融合的杂交方法

虽然遗传融合在历史上提供了更好的半衰期延长潜力，但就连接位点的灵活性和对蛋白质骨架引入非天然氨基酸或修饰而言，其缺乏利用化学偶联、聚乙二醇化和脂化的方法所提供的优势。将遗传融合与化学偶联的优点融合以延长半衰期的第一批努力之一是由La Jolla的Scripps研究所的研究人员进行的，该技术后来成为生物技术公司CovX的基础。使用催化醛缩酶抗体，这些研究人员开发了一个平台，通过该平台，抗体的活性位点赖氨酸与引入到蛋白质或小分子中的β-二酮形成可逆的共价烯胺键。所产生的复合物被称为CovXBody^TM。这种方法将蛋白质药物或小分子的功能特性与抗体的长血清半衰期结合，不是通过基因融合，而是通过化学连接。在该技术的初步演示之后，研究人员扩展了CovX-Body^TM原型的用途，该原型基于整合素靶向拟肽药效团。至少三种基于这种结构的分子已经进入临床开发：CVX-096，一种Glp-1R激动剂；CVX-060，一种血管生成素-2结合蛋白；和CVX-045，一种血栓反应蛋白模拟物。

最近，XTEN多聚蛋白也被用于化学偶联模式12，使其更直接地类似于聚乙二醇。使用这种方法产生的第一个XTEN化蛋白质的示例是GLP2-2G-XTEN，其中该蛋白质使用马来酰亚胺-巯基化学法与XTEN蛋白聚合物化学偶联。化学偶联的GLP2-2G-XTEN分子表现出与重组融合的GLP2-2G-XTEN相当的体外活性、体外血浆稳定性和在大鼠中的药代动力学特性。

在XTEN或PAS多聚蛋白的全设计序列中，例如赖氨酸或半胱氨酸侧链的活性基团的数量和间距可以通过位点定向变化来精确控制，因为其由其所含的限定的氨基酸组成。与可能利用Fc或白蛋白的方法相比，其提供了额外的灵活度，Fc或白蛋白的序列天然地包含许多反应性基团，并且与依赖于高度特异性的活性位点中的反应性残基的CovX技术形成对比。此外，缺乏三级结构的XTEN或PAS应当提供比偶联和偶联物纯化中使用的条件和化学物质更大的灵活性。

综上所述，正在出现的杂交蛋白半衰期方法结合了化学偶联法和遗传融合法的优点并克服其各自的局限性。这些方法能够创造出基于重组的基于多聚蛋白配体的分子，其被赋予了更长的半衰期，并使治疗性蛋白质基团从仅由天然L-氨基酸组成或仅构建为在N-或C-端融合的线性、单向多聚蛋白的限制中解放出来，从而为广泛的长效的基于蛋白质的药物打开大门。

示例性剂量和给药策略

如上所述，本发明的组合物可以包括本发明蛋白质的“治疗有效量”或“预防有效量”(或者在包含本发明的蛋白质和第二组分的复合组合物情况下的第一和第二量；在包含本发明的两种蛋白质和一种第二药剂，或本发明的一种蛋白质和两种第二药剂的复合组合物的情况下的第一、第二和第三量等等)。为了更好地说明具体方面，在此进一步提供剂量原则的详细讨论。

在实施本发明时，所采用的蛋白质的量或剂量范围通常是有效诱导、促进或增强伤口上皮再生(在伤口治疗的背景下)的量或剂量范围，或者所采用的蛋白质的量或剂量范围通常是有效修饰神经系统的细胞的基因表达谱以减缓神经退行性病症进展的量或剂量范围。或者所使用的蛋白质的量或剂量范围通常是在马类哺乳动物中治疗组织退行性病症的背景下修饰基因表达谱的量或剂量范围。

在另一方面，向患者提供每千克体重下约0.01至100毫克的活性成分(例如本发明的蛋白质)的每日剂量。通常，以每天约1至约6次的分剂量或以持续释放形式给药每日每千克约1至约5或约1至约10毫克可以有效地获得所需结果。在一个实施方案中，剂量为10-100、30-70、40-60、以及在理想地，约50μg/mL。

作为非限制性示例，可以通过以约0.1-100mg/kg，例如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg的每日剂量给药提供，每天，或在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天的至少一次，或者在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周的至少一次，或其任意组合，使用每约24、12、8、6、4或2小时的单次或分次剂量，或其任意组合的量的本发明蛋白质的每日剂量，来提供对人类或动物疾病的治疗。

实施例

现在将参照具体实施例来描述本发明。这些实施例仅是示例性的，并且仅用于说明目的：其并不旨在以任何方式限制所要求的专利范围或所描述的发明。这些实施例构成了目前预期用于实施本发明的最佳方式。

实施例1

pTT3表达载体的构建

所有载体均包含亚克隆到pTT3表达载体的相关PSG1开放阅读框(ORF)，pTT3表达载体框内有羧基端V5-His标签(获自pBlueBac4.5-V5-His载体)。表达全长PSG1的载体已在先描述。(Shanley et al.,2013；Houston et al.,2016)。

Fc标签克隆

从EB病毒(EBV)转化的淋巴细胞cDNA样品中PCR扩增人Fc标签。使用工程化至引物尾部的HindIII位点将人Fc标签亚克隆至pTT3载体中，并在PSG1的ORF的3'端插入框架。一旦Fc标签被插入，使用位点定向诱变去除内部的HindIII位点，以允许PSG1 ORF与Fc标签在框架内的转录。

使用位点定向诱变对人Fc标签(在CH2结构域中的三重取代YTE(M252Y/S254T/T256E)和在CH3结构域中的(H433K/N434F))进行修饰，以增加稳定性和半衰期(参见Rath等人,2015,用于Fc修饰https://doi.org/10.3109/07388551.2013.834293)。使用位点定向诱变(高保真DNA聚合酶位点定向诱变试剂盒，Thermo Fisher Scientific)对人Fc标签进行修饰。

实施例2

PSG1对人细胞系中基因表达的影响

用PSG1体外处理人小胶质细胞系细胞C20，并使用Qiagen Wound HealingProfiler qRT-PCR阵列分析基因表达变化。细胞以1×10⁵细胞/mL的密度与50μg/mL的重组PSG1-V5His接种于6孔板上5小时，并在处理后5小时或24小时制备cDNA并分析。结果如图1所示。

实施例3

PSG1对小鼠脑卒中模型的行为结果(错步实验)的影响

永久性大脑中动脉凝固

手术在无菌条件下进行。用异氟烷麻醉小鼠(3-4％用于诱导，1-3％用于维持)。在手术中，至少每间隔5分钟监测一次足底屈肌反射和自发性运动。诱导后，使用面罩用1-2％异氟烷维持麻醉。用恒温毯系统使直肠温度维持在37摄氏度。右耳和眼睛之间的皮肤在切开前使用0.5％丁哌卡因(0.1mL)浸润，颞肌收缩，暴露颞骨和顶骨。在动脉分叉处行小开颅术，切开脑膜，显露大脑中动脉(MCA)及其顶叶和额叶分支。使用小血管烧灼器结扎MCA远端部分。用单丝缝线对对切口进行间断缝合。停止麻醉，腹腔注射给药温热的乳酸林格氏液(0.5mL)，动物被允许在小型水套加热器中恢复，直至再灌注。在麻醉恢复期间，每间隔15分钟监测呼吸频率、运动和保持胸骨卧位的能力，直到动物能够活动。

皮下注射媒介物(PBS)或PSG1-Fc

使用无菌25-27号针和注射器，在室温下按无菌程序对小鼠注射50-100μL体积的无菌溶液：磷酸盐缓冲盐水(PBS)或从PBS中的从瞬时转染的HEK293细胞中纯化的100微克PSG1-Fc蛋白。

剪尾采血

轻轻人工束缚意识清醒的小鼠。用70％酒精预处理垫清洁尾部。用无菌手术刀在尖端切除不到1毫米的尾巴段进行剪尾。轻轻按摩尾部，收集0.1mL血液至肝素化毛细管中。在收集期间，允许动物在笼子里自由活动。一旦收集完成，轻轻按压伤口止血，并将动物送回其居住的笼子。该过程已经被证明是相对无压力的。(指南获自LAST课程手册(第164页；Handbook of Laboratory Animal Management&Welfare；Wolfensohn&Lloyd))。

网格爬行

小鼠被放置在一个铁丝网上，并允许其自由探索5分钟。对其进行录像，并在之后日子，一名对治疗组不知情的实验员对左前爪和右前爪前100步中的失足的百分比进行了记分。当爪子完全没有抓住格线，因此肢体落在格线之间时，或者当爪子正确地放在格线上，但在负重过程中滑出时，就会记为失足。这些动物不需要预先训练，但在手术前被放置在网格上一次，以适应并获得基线分数。

实验时间线

第-7天：接收小鼠和7天适应。

D0：永久性MCA凝固。

D0+1小时：皮下给药PSG1-Fc(21只小鼠)或媒介物(21只小鼠)。

D2：采血。

D3：网格爬行。

D5：网格爬行后安乐死。

等同

上述描述详细说明了本发明目前优选的实施方案。在考虑过这些描述后，本领域技术人员能够预期在其实践中会发生的许多修改和变化。这些修改和变化预期包含于本申请所附的权利要求中。

序列表

<110> 爱尔兰国立科克大学

<120> 脑血管事件和神经系统疾病的治疗

<130> P13759PC00

<150> EP21168469.1

<151> 2021-04-14

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Gly Thr Leu Ser Ala Pro Pro Cys Thr Gln Arg Ile Lys Trp Lys

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Asn Phe Trp Asn Leu Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Gln Val Thr Ile Glu Ala Glu Pro Thr Lys Val Ser Glu Gly

35 40 45

Lys Asp Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Asn Leu Thr Gly

50 55 60

Tyr Ile Trp Tyr Lys Gly Gln Met Arg Asp Leu Tyr His Tyr Ile Thr

65 70 75 80

Ser Tyr Val Val Asp Gly Glu Ile Ile Ile Tyr Gly Pro Ala Tyr Ser

85 90 95

Gly Arg Glu Thr Ala Tyr Ser Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val

100 105 110

Thr Arg Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Thr Leu His Ile Ile Lys Gly Asp

115 120 125

Asp Gly Thr Arg Gly Val Thr Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu His Leu

130 135 140

Glu Thr Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu Asn Pro Arg Glu

145 150 155 160

Thr Met Glu Ala Val Ser Leu Thr Cys Asp Pro Glu Thr Pro Asp Ala

165 170 175

Ser Tyr Leu Trp Trp Met Asn Gly Gln Ser Leu Pro Met Thr His Ser

180 185 190

Leu Lys Leu Ser Glu Thr Asn Arg Thr Leu Phe Leu Leu Gly Val Thr

195 200 205

Lys Tyr Thr Ala Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Arg Asn Pro Val Ser

210 215 220

Ala Ser Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Leu Leu Pro Lys Leu Pro

225 230 235 240

Lys Pro Tyr Ile Thr Ile Asn Asn Leu Asn Pro Arg Glu Asn Lys Asp

245 250 255

Val Leu Asn Phe Thr Cys Glu Pro Lys Ser Glu Asn Tyr Thr Tyr Ile

260 265 270

Trp Trp Leu Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Val Lys Arg

275 280 285

Pro Ile Glu Asn Arg Ile Leu Ile Leu Pro Ser Val Thr Arg Asn Glu

290 295 300

Thr Gly Pro Tyr Gln Cys Glu Ile Arg Asp Arg Tyr Gly Gly Ile Arg

305 310 315 320

Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Leu Pro Arg

325 330 335

Ile Tyr Pro Ser Phe Thr Tyr Tyr Arg Ser Gly Glu Val Leu Tyr Leu

340 345 350

Ser Cys Ser Ala Asp Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Thr Ile

355 360 365

Asn Glu Lys Phe Gln Leu Pro Gly Gln Lys Leu Phe Ile Arg His Ile

370 375 380

Thr Thr Lys His Ser Gly Leu Tyr Val Cys Ser Val Arg Asn Ser Ala

385 390 395 400

Thr Gly Lys Glu Ser Ser Lys Ser Met Thr Val Glu Val Ser Asp Trp

405 410 415

Thr Val Pro

<210> 2

<211> 1956

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PSG1-Fc ORF

<400> 2

atgggaaccc tctcagcccc tccctgcaca cagcgcatca aatggaaggg gctcctgctc 60

acagcatcac ttttaaactt ctggaacctg cccaccactg cccaagtcac gattgaagcc 120

gagccaacca aagtttccga ggggaaggat gttcttctac ttgtccacaa tttgccccag 180

aatcttaccg gctacatctg gtacaaaggg caaatgaggg acctctacca ttacattaca 240

tcatatgtag tagacggtga aataattata tatgggcctg catatagtgg acgagaaaca 300

gcatattcca atgcatccct gctgatccag aatgtcaccc gggaggacgc aggatcctac 360

accttacaca tcataaaggg agatgatggg actagaggag taactggacg tttcaccttc 420

accttacacc tggagactcc taagccctcc atctccagca gcaacttaaa tcccagggag 480

accatggagg ctgtgagctt aacctgtgac cctgagactc cagacgcaag ctacctgtgg 540

tggatgaatg gtcagagcct ccctatgact cacagcttga agctgtccga aaccaacagg 600

accctctttc tattgggtgt cacaaagtat actgcaggac cctatgaatg tgaaatacgg 660

aacccagtga gtgccagccg cagtgaccca gtcaccctga atctcctccc gaagctgccc 720

aagccctaca tcaccatcaa caacttaaac cccagggaga ataaggatgt cttaaacttc 780

acctgtgaac ctaagagtga gaactacacc tacatttggt ggctaaatgg tcagagcctc 840

ccggtcagtc ccagggtaaa gcgacccatt gaaaacagga tcctcattct acccagtgtc 900

acgagaaatg aaacaggacc ctatcaatgt gaaatacggg accgatatgg tggcatccgc 960

agtgacccag tcaccctgaa tgtcctctat ggtccagacc tccccagaat ttacccttca 1020

ttcacctatt accgttcagg agaagtcctc tacttgtcct gttctgcgga ctctaaccca 1080

ccggcacagt attcttggac aattaatgaa aagtttcagc taccaggaca aaagctcttt 1140

atccgccata ttactacaaa gcatagcggg ctctatgttt gctctgttcg taactcagcc 1200

actggcaagg aaagctccaa atccatgaca gtcgaagtct ctgactggac agttcccgag 1260

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 1320

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctctacat cacccgggaa 1380

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 1440

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 1500

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1560

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1620

tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1680

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1740

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1800

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1860

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgaa gttccactac 1920

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1956

<210> 3

<211> 699

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的人Fc ORF

<400> 3

gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcta catcacccgg 120

gaacctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gaagttccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 699

Claims (13)

1.妊娠特异性糖蛋白1(PSG1)，用于刺激由人类脑血管事件而损伤的组织的存活或恢复的方法。

2.根据权利要求1所述的PSG1，用于权利要求1，其中所述PSG1是Fc标记的PSG1(PSG1-Fc)。

3.根据权利要求1或2所述的PSG1，用于权利要求1，其中所述脑血管事件是急性缺血性脑卒中。

4.权利要求1或2所述的PSG1，用于权利要求1，其中所述脑血管事件是出血性脑卒中。

5.权利要求1或2所述的PSG1，用于权利要求1，其中所述脑血管事件是短暂性脑缺血发作(TIA)。

6.权利要求1或2所述的PSG1，用于权利要求1至5中的任一项，其中所述PSG1通过静脉或鞘内给药施用于受试者。

7.权利要求1或2所述的PSG1，用于权利要求1至6中的任一项，其中所述PSG1以每千克体重0.1至100mg的剂量施用于受试者。

8.权利要求1或2所述的PSG1，用于权利要求1至7中的任一项，其中所述PSG1在脑血管事件6小时内施用于受试者。

9.妊娠特异性糖蛋白1(PSG1)，用于治疗以小胶质细胞调节改变导致的神经元细胞死亡或脱髓鞘为特征的人类神经系统疾病的方法。

10.权利要求9所述的PSG1，用于权利要求9，其中所述PSG1是Fc标记的PSG1(PSG1-Fc)。

11.权利要求9或10所述的PSG1，用于权利要求9，其中所述以小胶质细胞调节改变导致的神经元细胞死亡或脱髓鞘为特征的神经系统疾病是一种神经退行性疾病。

12.妊娠特异性糖蛋白1(PSG1)，用于通过刺激因创伤性脑损伤而受损的组织的存活或恢复以治疗哺乳动物创伤性脑损伤的方法。

13.权利要求12所述的PSG1，用于权利要求12，其中所述PSG1是Fc标记的PSG1(PSG1-Fc)。