JPWO2019131964A1 - Il−2改変体 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)Interleukin−2(以下、IL−2と略記する)改変体。
(2)糖鎖が結合したIL−2改変体および/またはポリエチレングリコール(PEG)が結合したIL−2改変体である(1)に記載のIL−2改変体。
(3)IL−2受容体(以下IL−2R)αβγに対する選択性が向上している、(1)または(2)に記載のIL−2改変体。
(4)IL−2のアミノ酸配列における、11、12、13、15、16、18、19、20、84、87、88、91、92、108、115、119、122、123および130番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基に糖鎖が結合している、(2)または(3)に記載のIL−2改変体。
(5)糖鎖が下記(式4)〜(式8)、(式Y1)、(式Y2)または(式Y3)で表される構造を有する糖鎖より選ばれる少なくとも1つである、(2)〜(4)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(7)配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、12、15、16、19、88、91および119番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されているアミノ酸配列を含む、(2)〜(6)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(8)糖鎖が結合したシステイン残基由来の基が、下記(式1)で表される構造を有する、(6)または(7)に記載のIL−2改変体。
(9)糖鎖が結合したアスパラギン残基由来の基が、下記(式2)で表される構造を有する、(6)または(7)に記載のIL−2改変体。
(10)糖鎖が結合したIL−2改変体にさらにPEGが結合したIL−2改変体である、(2)〜(9)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(11)配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、1、3、51および78番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、PEGが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含む、(2)〜(10)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(12)IL−2のアミノ酸配列における、4、5、6、7、8、60、78、79、99、100、101および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基にPEGが結合している、(2)または(3)に記載のIL−2改変体。
(13)配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、4、5、6、7、8、60、78、79、99、100、101および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、PEGが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含む、(2)、(3)および(12)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(14)配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における4、5、8、78および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、PEGが結合しているアミノ酸残基に置換されている、(2)、(3)、(12)および(13)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(15)配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における4、5、8、78および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも2つのアミノ酸残基が、PEGが結合しているアミノ酸残基に置換されている、(2)、(3)、(12)〜(14)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(16)配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、4、5および8番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基、ならびに、78番目または129番目のアミノ酸残基が、PEGが結合しているアミノ酸残基に置換されている、(2),(3)、(12)〜(15)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(17)PEGが結合したアミノ酸残基が、PEGが結合した非天然アミノ酸残基である、(2)、(3)、(12)〜(16)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(18)PEGが結合した非天然アミノ酸残基が、PEGが結合したチオール基(−SH)を有するアミノ酸残基由来の基、またはPEGが結合したアジド基を有するアミノ酸残基由来の基である、(17)に記載のIL−2改変体。
(19)PEGが結合した非天然アミノ酸残基が、N6−[{(o−azidobenzyl)oxy}carbonyl]−L−lysine(o−Az−Z−Lys)残基由来の基、N6−[{(m−azidobenzyl)oxy}carbonyl]−L−lysine(m−Az−Z−Lys)残基由来の基またはシステイン残基由来の基である、(17)または(18)に記載のIL−2改変体。
(20)PEGが結合したo−Az−Z−Lys残基由来の基が、下記(式11)および/または(式12)で表される構造を有する、(19)に記載のIL−2改変体。
(24)PEGが分岐状である、(2)、(10)〜(22)いずれか1に記載のIL−2改変体。
(25)PEGが、平均分子量10kDa以上のPEGである、(2)、(10)〜(24)いずれか1に記載のIL−2改変体。
(26)結合しているPEGが、平均分子量10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDaまたは80kDaのPEGである(2)、(10)〜(25)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(27)結合しているPEGが、下記(式13)、(式14)、(式15)、(式16)、(式X7)、(式X8)、(式X9)、(式X10)、(式X11)、(式X13)、(式X14)または(式X15)の少なくとも1つの式で表される構造を有する、(2)、(10)〜(26)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(29)IL−2のN末端のアラニンが欠損している、(1)〜(28)のいずれか1に記載のIL−2改変体。
(30)IL−2のN末端のアラニンが欠損し、さらにメチオニンが結合している、(1)〜(29)に記載のIL−2改変体。
(31)(1)〜(30)のいずれか1に記載のIL−2改変体の製造方法。
(32)(1)〜(30)のいずれか1に記載のIL−2改変体を含む組成物。
(33)(1)〜(30)のいずれか1に記載のIL−2改変体を含む、免疫疾患の治療剤。
(34)IL−2のIL−2Rαβγに対する選択性を向上させる方法。
(35)IL−2に糖鎖および/またはPEGを結合させることを含む、(34)に記載の方法。
(36)IL−2のアミノ酸配列における、11、12、13、15、16、18、19、20、84、87、88、91、92、108、115、119、122、123および130番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基に、糖鎖を結合させることを含む、(35)に記載の方法。
(37)糖鎖が、下記(式4)〜(式8)、(式Y1)、(式Y2)または(式Y3)で表される構造を有する糖鎖より選ばれる少なくとも1つである、(35)または(36)に記載の方法。
(39)配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、12、15、16、19、88、91および119番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換することを含む、(35)〜(38)のいずれか1に記載の方法。
(40)糖鎖が結合したシステイン残基由来の基が、下記(式1)で表される構造を有する、(38)または(39)に記載の方法。
(41)糖鎖が結合したアスパラギン残基由来の基が、下記(式2)で表される構造を有する、(38)または(39)に記載の方法。
(42)糖鎖が結合したIL−2改変体にさらにPEGを結合させることを含む(35)〜(41)のいずれか1に記載の方法。
(43)配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、1、3、51および78番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、PEGが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含む、(42)に記載の方法。
(44)IL−2のアミノ酸配列における、4、5、6、7、8、60、78、79、99、100、101および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基にPEGが結合している、(35)に記載の方法。
(45)配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、4、5、6、7、8、60、78、79、99、100、101および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、PEGが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含む、(35)または(44)に記載の方法。
(46)配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における4、5、8、78および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、PEGが結合しているアミノ酸残基に置換されている、(35)、(44)および(45)のいずれか1に記載の方法。
(47)配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における4、5、8、78および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも2つのアミノ酸残基が、PEGが結合しているアミノ酸残基に置換されている、(35)、(44)〜(46)のいずれか1に記載の方法。
(48)PEGが結合したアミノ酸残基が、PEGが結合した非天然アミノ酸残基である、(35)、(42)〜(47)のいずれか1に記載の方法。
(49)PEGが結合した非天然アミノ酸残基が、PEGが結合したチオール基(−SH)を有するアミノ酸残基由来の基、またはPEGが結合したアジド基を有するアミノ酸残基由来の基である、(48)に記載の方法。
(50)PEGが結合した非天然アミノ酸残基が、N6−[{(o−azidobenzyl)oxy}carbonyl]−L−lysine(o−Az−Z−Lys)残基由来の基、N6−[{(m−azidobenzyl)oxy}carbonyl]−L−lysine(m−Az−Z−Lys)残基由来の基またはシステイン残基由来の基である、(48)または(49)に記載の方法。
(51)PEGが結合したo−Az−Z−Lys残基由来の基が、下記(式11)および/または(式12)で表される構造を有する、(50)に記載の方法。
(55)PEGが分岐状である、(35)、(42)〜(53)のいずれか1に記載の方法。
(56)PEGが、平均分子量10kDa以上のPEGである、(35)、(42)〜(55)のいずれか1に記載の方法。
(57)PEGが、平均分子量10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDaまたは80kDaのPEGである(35)、(42)〜(56)のいずれか1に記載の方法。
(58)結合しているPEGが、下記(式13)、(式14)、(式15)、(式16)、(式X7)、(式X8)、(式X9)、(式X10)、(式X11)、(式X13)、(式X14)または(式X15)の少なくとも1つの式で表される構造を有する、(35)、(42)〜(57)のいずれか1に記載の方法。
(60)IL−2のN末端のアラニンが欠損している、(34)〜(59)のいずれか1に記載の方法。
(61)IL−2のN末端のアラニンが欠損し、さらにメチオニンが結合している、(34)〜(60)のいずれか1に記載の方法。
(62)制御性T細胞を選択的に活性化させる方法。
(63)IL−2Rβおよびγサブユニットの少なくとも一方に対するIL−2の親和性を低下させる方法。
(64)IL−2Rαサブユニットに対するIL−2の親和性を向上させる方法。
「野生型IL−2」とは、下記1)〜3)のIL−2いずれのものも含む。
1)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるヒト由来野生型成熟IL−2。
2)上記1)の遺伝子組換え体を作製する際に加え得るアミノ酸改変を有するIL−2。
3)上記1)および上記2)のIL−2のN末端のアミノ酸残基が欠失したIL−2。
(A)哺乳動物細胞にヒトIL−2Rαβγ、又はヒトIL−2Rβγを発現させて、ヒトIL−2依存性生存細胞株を作製し、各細胞株を96穴プレートに播種する。
(B)コントロールのIL−2を1000ng/mlで添加したウェルのrelative fluorescence units(RLU)値を100%、IL−2を含まない培地を添加したウェルのRLU値を0%として、被験物質であるIL−2改変体のIL−2依存性細胞増殖率を算出する。
(C)(A)で得られたデータを元に統計解析ソフト(例えば、IBDS社製XLfit5 version 5.3.1.3)を用いてEC50値を算出する。
(a)野生型IL−2よりもIL−2改変体のTreg増殖活性が高い、および/またはNK細胞増殖活性が低い。
(b)野生型IL−2よりもIL−2改変体で、細胞集団中のエフェクターT細胞(Teff)の割合に対するTregの割合の比[Treg(%)/Teff(%)]が高い。
(c)野生型IL−2よりもIL−2改変体で炎症性サイトカインの産生量が低下している、および/または抗炎症性サイトカインの産生量が増加している。
本発明のIL−2改変体の一実施形態としては、IL−2のアミノ酸配列における11、12、13、15、16、18、19、20、84、87、88、91、92、108、115、119、122、123および130番目のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基に糖鎖が結合しているIL−2改変体が好ましい。
糖鎖結合IL−2改変体の製造方法としては、糖鎖結合ペプチドを化学合成した後にフォールディングさせる手法(化学合成法)、または野生型IL−2のアミノ酸配列における糖鎖導入位置のアミノ酸残基を糖鎖が結合し得るアミノ酸残基へと置換したIL−2改変体を大腸菌などの宿主細胞により発現させた後に、糖鎖が結合し得るアミノ酸残基へ糖鎖を結合させる方法(発現法)が挙げられる。
化学合成法においては、少なくとも一つ以上の糖鎖結合ペプチドフラグメントとペプチドフラグメントとを順次連結させた後にフォールディングさせることにより糖鎖結合IL−2改変体を製造することが好ましい。
発現法においては、糖鎖結合IL−2改変体は、従来公知の方法に従い、例えば、ポリメラーゼ連鎖増幅反応(PCR)、プラスミドDNAの調製、制限酵素によるDNAの切断、オリゴヌクレオチドの調製、DNAのライゲーション、mRNAの単離、適切な宿主細胞へのDNAの導入による形質転換体の取得、形質転換体の培養を含む組換えDNA法、および化学修飾による糖鎖導入により製造できる。
本発明のIL−2改変体の一実施形態としては、IL−2のアミノ酸配列における、4、5、6、7、8、60、78、79、99、100、101および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基にPEGが結合している改変体が好ましく、78および129番目の少なくとも一方のアミノ酸残基にPEGが結合しているIL−2改変体がより好ましい。
PEG結合IL−2改変体の製造方法としては、化学合成法と発現法が挙げられる。PEG結合IL−2改変体は、化学合成法および発現法の組み合わせによって製造されてもよい。以下、各方法について説明する。
化学合成法によるPEG結合IL−2改変体の製造方法としては、例えば、野生型IL−2のアミノ酸配列におけるPEG導入位置のアミノ酸残基をタンパク質の部位特異的なPEG化を可能とする化学的反応性を有するアミノ酸残基へと置換したペプチドを化学合成した後に、フォールディングさせて得られるIL−2改変体に対し、PEGを結合させてPEG結合IL−2改変体を製造する手法、およびPEG結合ペプチドフラグメントを化学合成した後にフォールディングさせることによりPEG結合IL−2改変体を製造する方法が挙げられる。
発現法によるPEG結合IL−2改変体の製造方法としては、例えば、野生型IL−2のアミノ酸配列におけるPEG導入位置のアミノ酸残基をタンパク質の部位特異的なPEG化を可能とする化学的反応性を有するアミノ酸残基に置換したIL−2改変体を大腸菌などの宿主細胞により発現させた後に、該IL−2改変体における該アミノ酸残基へ化学修飾によってPEGを結合させることによりPEG結合IL−2改変体を製造する方法が挙げられる。
上述した糖鎖結合IL−2改変体は、さらにPEGが結合していてもよい。また、上述したPEG結合IL−2改変体も、さらに糖鎖が結合していてもよい。これらIL−2改変体は、上述の[糖鎖結合IL−2改変体の製造方法]、および[PEG結合IL−2改変体の製造方法]を組み合わせて製造することができる。また、国際公開第2012/065086号などに従い、N末端のアミノ基に選択的にPEGを導入することもできる。
IL−2改変体の生物活性は、当該技術分野における公知の任意の適した方法によって評価することができる。評価方法には後述する実施例において記載のものを含む。IL−2改変体の生物活性を評価する方法としては、具体的には例えば、以下の(a)〜(e)の方法が挙げられる。これらの方法は、IL−2改変体の治療効果、効能および薬力学的特性の測定にも使用できる。
IL−2改変体または野生型IL−2を添加した培地でTreg細胞を培養し、Treg細胞の増殖率を測定する。他に、Treg細胞の増殖活性を測定する方法としては、例えば、フローサイトメトリーにより、混合細胞集団内のTreg細胞数の増大を測定する方法、およびCD4+CD25+FOXP3+マーカー表現型またはCD4+CD25+CD127lowマーカー表現型の存在比率を測定する方法;分離したTreg細胞へのトリチウム化チミジンの取り込みにより測定する方法;Ki−67などの増殖に関連する細胞周期タンパク質のTreg細胞内の発現の増大を測定する方法;Treg細胞内のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)などの生体蛍光色素の細胞分裂に関連する希釈をフローサイトメトリーにより測定する方法が挙げられる。
IL−2改変体または野生型IL−2を添加した培地でNK細胞を培養し、NK細胞の増殖率を測定する。他に、NK細胞の増殖活性を測定する方法としては、例えば、フローサイトメトリーにより、混合細胞集団内のNK細胞数の増大を測定する方法、およびCD56+マーカー表現型の存在比率を測定する方法;分離したNK細胞へのトリチウム化チミジンの取り込みにより測定する方法;Ki−67などの増殖に関連する細胞周期タンパク質のNK細胞内の発現の増大を測定する方法;NK細胞内のCFSEなどの生体蛍光色素の細胞分裂に関連する希釈をフローサイトメトリーにより測定する方法が挙げられる。
IL−2改変体または野生型IL−2を添加した培地でTregを培養し、これと適当なTCR刺激存在下でTresp(CD4+Tresp、CD8+Tresp)と共培養したときのTrespの増殖率を測定し、野生型IL−2と比較してIL−2改変体によるTrespの増殖阻害率を評価する。本発明のIL−2改変体は、野生型IL−2と比較して、少なくとも同等のTrespの増殖阻害活性を有するTregを増殖させることが好ましい。野生型IL−2の代わりに、野生型IL−2と同等のTrespの増殖阻害活性を有するTregを増殖させるIL−2改変体を用いてもよい。
TeffやNK細胞の機能的エフェクター分子であるIL−4、IL−6、IFNγまたはTNFα等の炎症性サイトカインについて、IL−2改変体または野生型IL−2を添加した培地でPBMCを培養し、培養上清中のサイトカイン産生量を測定する。また、同様の方法で抗炎症性サイトカインの産生量を測定してもよい。本発明のIL−2改変体は、野生型IL−2と比較して、炎症性サイトカインの産生量を減少させる、および/または、抗炎症性サイトカインの産生量が増加させることが好ましい。野生型IL−2の代わりに、野生型IL−2と同等の炎症性サイトカインおよび/または抗炎症性サイトカインを産生させるIL−2改変体を用いてもよい。
IL−2改変体または野生型IL−2を添加した培地で培養したPMBCを抗ヒトCD4抗体、抗ヒトCD25抗体、抗ヒトFoxp3抗体と反応させ、フローサイトメトリーによるCD4陽性画分の中でCD25+FOXP3high画分をTreg、CD25+FOXP3low画分をエフェクターT細胞(Teff)とし、その存在比[Treg(%)/Teff(%)](Treg/Teff比)を算出する。データの解析は市販のデータ解析ソフト(例えば、TreeStar社製Flowjo、version7.6.5)により行う。本発明のIL−2改変体は、野生型IL−2と比較して、Treg/Teff比が向上していることが好ましい。野生型IL−2の代わりに、野生型IL−2と同等のTreg/Teff比を有するIL−2改変体を用いてもよい。
本発明の一実施形態は、有効量の本発明のIL−2改変体を含む組成物である。組成物の形態としては、例えば、医薬組成物および試薬が挙げられる。
本発明の一実施形態は、IL−2Rαβγに対するIL−2の選択性を向上させる方法である。本実施形態においては、上記した方法によりIL−2に糖鎖またはPEGを結合させて改変することにより、IL−2Rαβγに対するIL−2の選択性を向上できる。
本発明の一実施形態は、本発明のIL−2改変体を用いて制御性T細胞を選択的に活性化させる方法である。本実施形態においては、本発明のIL−2改変体を被験対象に投与して、制御性T細胞を選択的に活性化させることができる。
・糖鎖結合位置:野生型成熟ヒトIL−2のアミノ酸配列(配列番号1)(以下、単に野生型IL−2とも記載する)のN末端からの位置
・Cys変異位置:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端からの位置
・125位変異:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から125番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は−、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はSと記載する。
・変異位置:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端からの位置
・125位変異:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から125番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は−、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はSと記載する。
IL−2アミノ酸配列1−57のペプチドチオエステルまたは糖鎖結合ペプチドチオエステルを以下の方法にて調製した。
[Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 6978-6981]に記載される方法に従い得られるトリチルヒドラジン樹脂に、Fmoc−Gln(Trt)−OH(5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(5当量)、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(5当量)を用いてDMF中で1残基目のアミノ酸残基を樹脂へ担持した。定法に従い、DMF中での、Fmocアミノ酸(5.3当量)、HCTU(5当量)、N−メチルモルホリン(5当量)または2,4,6−トリメチルピリジン(5当量)を用いたアミノ酸の伸長と、20%ピペリジン−DMF溶液による脱保護を繰り返すことで、2残基目以降のアミノ酸を伸長した。伸長したペプチドは、トリフルオロ酢酸(TFA)、トリイソプロピルシラン(TIPS)、水を用いて樹脂からの脱離と側鎖保護基を除去した後、氷冷したエーテル中に滴下し、生じた沈殿を遠心分離によって回収した。逆相HPLCカラム[プロテオナヴィ(商品名)、資生堂社製]にて精製し、ペプチドヒドラジドを合成した。
(工程1−1a−1)にて得られるペプチドヒドラジドへのブロモアセチル糖鎖(国際公開第2005/010053号に記載される方法に従い調製)を用いた糖鎖導入は、[Tetrahedron Lett., 2004, 45, 3287-3290, Carbohydr. Res. 2009, 344, 762-770]に記載される方法で実施し、目的の糖鎖結合ペプチドヒドラジドを合成した。
[Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 6978-6981]に記載される方法に従い得られるトリチルヒドラジン樹脂に、Fmoc−Gln(Trt)−OH(5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(5当量)、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(5当量)を用いてDMF中で1残基目のアミノ酸残基を樹脂へ担持した。定法に従い、DMF中での、Fmocアミノ酸(5.3当量)、HCTU(5当量)、N−メチルモルホリン(5当量)を用いたアミノ酸の伸長と、20%ピペリジン−DMF溶液による脱保護を繰り返すことで、2残基目以降の糖鎖結合Asn以外のアミノ酸を伸長した。
(工程1−1a−1)にて得られるペプチドヒドラジドまたは(工程1−1a−2)にて得られるCys−糖鎖結合ペプチドヒドラジドまたはにて得られるCys−アセタミド結合ペプチドヒドラジドまたは(工程1−1b)にて得られるAsn−糖鎖結合ペプチドヒドラジドを6mol/L グアニジン塩酸塩、200mmol/L リン酸緩衝液(pH3)に溶解し―20℃に冷却した後、200mmol/L 亜硝酸ナトリウム、6mol/L グアニジン塩酸塩、200mmol/L リン酸緩衝液(pH7)を加え5分間撹拌した。400mmol/L 2−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム、6mol/L グアニジン塩酸塩、200mmol/L リン酸緩衝液(pH6)を加え―15℃で1時間半撹拌した後、逆相HPLCカラム[プロテオナヴィ(商品名)、資生堂社製]にて精製し、ペプチドチオエステルまたは糖鎖結合ペプチドチオエステルを得た。
2種類の糖鎖を導入する場合、(工程1−1a−2)にて得られる糖鎖結合ペプチドヒドラジドの反応溶液に、酢酸に懸濁させた酢酸銀を加え6時間撹拌しS−アセタミドメチル基を除去した。ジチオトレイトールを加えた後、遠心分離して得られる上清をゲル濾過(Superdex G−75)によって4mol/L グアニジン塩酸塩、5mmol/L リン酸緩衝液(pH5)へと溶媒交換した。溶出液に、6mol/L グアニジン塩酸塩、200mmol/L リン酸緩衝液(pH3)を加え、2mol/L 塩酸を用いてpH3に調整した後、−15℃に冷却した。
IL−2アミノ酸配列58−104のペプチドヒドラジドまたは糖鎖結合ペプチドヒドラジドを以下の方法にて調製した。
[Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 6978-6981]に記載される方法に従い得られるトリチルヒドラジン樹脂に、Fmoc−Met−OH(5当量)、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(5当量)、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(5当量)を用いてDMF中で1残基目のアミノ酸残基を樹脂へ担持した。
(工程2−1a−1)にて得られるペプチドヒドラジドへのブロモアセチル糖鎖(国際公開第2005/010053号に記載される方法で調製)を用いた糖鎖導入を、[Tetrahedron Lett., 2004, 45, 3287-3290, Carbohydr. Res. 2009, 344, 762-770]に記載される方法に従い実施した反応溶液に対し、ブロモアセチル糖鎖に対して10当量の2−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウムを加えた後、8mol/L グアニジン塩酸塩水溶液、2mol/L 塩酸、メトキシアミン塩酸塩を加えてpH4に調整し、室温にて20分反応させた。逆相HPLCカラム[プロテオナヴィ(商品名)、資生堂社製]にて精製し、Cys−糖鎖結合ペプチドヒドラジドを合成した。
(工程1−1b)と同様の手法にてAsn−糖鎖結合ペプチドヒドラジドを調製した。
IL−2アミノ酸配列105−133のペプチドまたは糖鎖結合ペプチドを以下の方法にて調製した。
Rink−アミド樹脂に、DMF中でのFmocアミノ酸(5.3当量)、HCTU(5当量)、N−メチルモルホリン(5当量)を用いたアミノ酸の伸長と、20%ピペリジン−DMF溶液による脱保護を繰り返すことでアミノ酸を伸長した。伸長したペプチドは、トリフルオロ酢酸(TFA)、トリイソプロピルシラン(TIPS)、水を用いて樹脂からの脱離と側鎖保護基を除去した後、氷冷したエーテル中に滴下し、生じた沈殿を遠心分離によって回収し、可溶化タグ(H−C(Npys)RRRRR−NH2)を調製した。
IL−2アミノ酸配列105−133のペプチドを以下の方法にて調製した。
HMPB−ChemMatrix樹脂に、Fmoc−Thr(tBu)−OH(5当量)、1−(メシチレン−2−スルホニル)−3−ニトロ−1,2,4−トリアゾール(5当量)、1−メチルイミダゾール(3.5当量)を用いて1残基目のアミノ酸残基を樹脂に担持した。定法に従い、DMF中での、Fmocアミノ酸(5.3当量)、HCTU(5当量)、N−メチルモルホリン(5当量)または2,4,6−トリメチルピリジン(5当量)を用いたアミノ酸の伸長と、20%ピペリジン−DMF溶液による脱保護を繰り返すことで、2残基目以降のアミノ酸を伸長した。
(工程3−2)にて得られる可溶化タグ導入ペプチドを8mol/L グアニジン塩酸塩、5mmol/L トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン、200mmol/Lリン酸緩衝液(pH6)に溶解し、ブロモアセチル糖鎖(5当量、国際公開第2005/010053号に記載される方法で調製)の6mol/L グアニジン塩酸塩、200mmol/L リン酸緩衝液(pH7)溶液を加え5時間反応させた。
(工程4−1)ペプチドセグメント1と2の連結反応
上記(工程1)にて得られるペプチドセグメント1と上記(工程2)にて得られるペプチドセグメント2(1.1当量)とを、8mol/L グアニジン塩酸塩、100mM トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン、100mM アスコルビン酸、50mmol/L 4−メルカプトフェニル酢酸、200mmol/L リン酸緩衝液(pH7)に溶解し、反応させた後、逆相HPLCカラム[プロテオナヴィ(商品名)、資生堂社製]にて精製し、ペプチドセグメント1と2の連結体を合成した。
上記(工程4−1)にて得られるペプチドセグメント1と2の連結体を、(工程1−2a)と同様の手法にてチオエステル化した。
上記(工程4−2)にて得られるペプチドチオエステルと上記(工程3)にて得られるペプチドセグメント3(1当量)とを、8mol/L グアニジン塩酸塩、100mM トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン、100mM アスコルビン酸、50mmol/L 4−メルカプトフェニル酢酸、200mmol/L リン酸緩衝液(pH7)に溶解し、反応させた後、逆相HPLCカラム[プロテオナヴィ(商品名)、資生堂社製]にて精製し、ペプチドセグメント1、2および3の連結体を合成した。
上記(工程4−3)にて得られるペプチドセグメント1、2および3の連結体のシステインがアセタミドメチル基で保護されている場合、以下に示す方法でアセタミドメチル基を除去した。
上記(工程4−3)にて得られるペプチドセグメント1、2および3の連結体の糖鎖上のシアル酸側鎖カルボン酸がベンジル基で保護されている場合、国際公開第2004/005330号に記載される方法に従い、ベンジル基を除去した後、逆相HPLCカラム[プロテオナヴィ(商品名)、資生堂社製]にて精製し、脱ベンジル体を取得した。
(工程4−3)または(工程4−4)または(工程4−5)で合成したペプチドセグメント1、2および3の連結体を、6mol/L グアニジン塩酸塩、100mmol/L トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩(pH8)に溶解した後、100mmol/L トリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、10mmol/L 還元型グルタチオン、1mmol/L酸化型グルタチオン(pH8)を加え、室温下18時間撹拌した。逆相HPLCカラム[プロテオナヴィ(商品名)、資生堂社製]にて精製し、IL−2改変体、糖鎖結合IL−2改変体を取得した。
表7に示すN末PEG化、糖鎖結合IL−2を下記に記載の方法で作製した。
・糖鎖結合位置、PEG結合位置:野生型成熟ヒトIL−2のアミノ酸配列(配列番号1)(以下、単に野生型IL−2とも記載する)のN末端からの位置
・125位変異:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から125番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は−、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はSと記載する。
・表中、糖鎖結合位置の置換後のアミノ酸残基の列に記載した構造について以下に示す。
表8に示すCys−PEG化、糖鎖結合IL−2を下記に記載の方法で作製した。
・PEG結合位置、糖鎖結合位置1および2:野生型成熟ヒトIL−2のアミノ酸配列(配列番号1)(以下、単に野生型IL−2とも記載する)のN末端からの位置
・125位変異:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から125番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は−、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はSと記載する。
・表中、糖鎖結合位置の置換後のアミノ酸残基の列に記載した構造について以下に示す。
PEG−アミン(SUNBRIGHT GL2−400PA;日油株式会社またはSUNBRIGHT GL3−400PA100U;日油株式会社またはSUNBRIGHT GL4−400PA;日油株式会社)をクロロホルムに溶解し、1−Ethyl−3−(3−dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride(5当量)、4−ジメチルアミノピリジン(5当量)、ヨード酢酸 (5当量)を加え室温下90時間撹拌した。エーテル/イソプロパノール=1/1を加え、析出した固体をろ取した。残渣を水に溶解し、Amicon Ultra−0.5(10kDa)を用いた限外濾過によりヨード酢酸を除去し、凍結乾燥することでPEG−IAcを合成した。
表5に示す糖鎖結合IL−2改変体の 1mmol/L EDTA、20 mmol/L リン酸緩衝液(pH5.5)に、室温下でPEG−ハロアセチル(5当量、上記工程1で合成した化合物またはSUNBRIGHT ME−200IA;日油株式会社またはSUNBRIGHT ME−400IA;日油株式会社)またはPEG−マレイミド (5.0nmol、SUNBRIGHT GL2−800MA;日油株式会社またはSUNBRIGHT GL4−400MA100U;日油株式会社またはSUNBRIGHT GL4−800MA;日油株式会社)の1mmol/L EDTA、20mmol/L リン酸緩衝液(pH5.5)を加えた後、0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH7.2〜7.4に調整し、2時間撹拌した。サイズ排除クロマトグラフィー(カラム;Waters製、XBridge BEH450A、3.5μm、7.8×150mmとXBridge BEH200A、3.5μm、7.8×150mmを連結)にて精製し、Cys−PEG化、糖鎖結合IL−2改変体を合成した。
表9に示す大腸菌用8His−IL−2発現ベクターおよびo−Az−Z−Lys導入8His−IL−2発現ベクターおよびm−Az−Z−Lys導入8His−IL−2発現ベクターを以下の方法により作製した。
・Az−Z−Lys導入位置:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端からの位置
・1位修飾:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のアラニン残基の修飾を表す。MHHHHHHHHAとは、N末端アラニン残基にメチオニンおよびポリヒスチジン配列(HHHHHHHH)タグが結合していることを表す。
・125位変異:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から125番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は−、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はSと記載する。
表10に示す8His−IL−2およびo−Az−Z−Lys導入8His−IL−2およびm−Az−Z−Lys導入8His−IL−2を以下の方法により作製した。
・Az−Z−Lys導入位置:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端からの位置
・1位修飾:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のアラニン残基の修飾を表す。MHHHHHHHHAとは、N末端アラニン残基にメチオニンおよびポリヒスチジン配列(HHHHHHHH)タグが結合していることを表す。
・125位変異:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から125番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は−、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はSと記載する。
表11に示す大腸菌用o−Az−Z−Lys導入IL−2発現ベクターを以下の方法により作製した。
・Az−Z−Lys導入位置:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端からの位置
・1位修飾:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のアラニン残基の修飾を表す。MAとは、N末端アラニン残基にメチオニンが結合していることを表す。Mとは、アラニンからメチオニンにアミノ酸残基を置換する変異を加えていることを表す。
・125位変異:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から125番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は−、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はSと記載する。
表12に示すIL−2の任意のアミノ酸残基をo−Az−Z−Lys残基に置換したo−Az−Z−Lys導入IL−2は以下の方法で作製した。
・o−Az−Z−LysK導入位置:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端からの位置
・1位修飾:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のアラニン残基の修飾を表す。MAとは、N末端アラニン残基にメチオニンが結合していることを表す。Mとは、アラニンからメチオニンにアミノ酸残基を置換する変異を加えていることを示す。
・125位変異:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から125番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。変異を加えていない場合は−、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はSと記載する。
表13〜15に示すo−Az−Z−Lys導入8His−IL−2またはm−Az−Z−Lys導入8His−IL−2またはo−Az−Z−Lys導入IL−2のPEG化体(以下PEG結合IL−2改変体と記載する)を以下の方法で調製した。
・PEG導入位置:配列番号1のN末端からの位置
・1位修飾:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のアラニン残基の修飾を表す。MAとは、N末端アラニン残基にメチオニンが結合していることを表し、MHHHHHHHHAとは、N末端アラニン残基にメチオニンおよびポリヒスチジン配列(HHHHHHHH)タグが結合していることを表す。
・125位変異:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から125番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。アミノ酸残基の変異を加えていない場合は−、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はSと記載する。
PEG―カルボン酸(mPEG−AA 40K;Creative PEG Works社製)をクロロホルムに溶解し、1−Ethyl−3−(3―dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride (5当量)、4−ジメチルアミノピリジン(5当量)、Dibenzocyclooctyne―amine (5当量、A2763;東京化成工業)を加え室温下3時間撹拌した。エーテル/イソプロパノール=1/1を加え、析出した固体をろ取することで、PEG−DBCOを合成した。
PEG−NHS(SUNBRIGHT GL2−400GS2;日油株式会社またはSUNBRIGHT GL2−800GS2;日油株式会社またはSUNBRIGHT GL4−400GS2;日油株式会社またはSUNBRIGHT GL4−800TS;日油株式会社またはSUNBRIGHT GL2−400GS100U;日油株式会社またはSUNBRIGHT XY4−400TS;日油株式会社)をクロロホルムに溶解し、Dibenzocyclooctyne―amine (5当量、A2763;東京化成工業)を加え室温下3時間撹拌した。エーテル/イソプロパノール=1/1を加え、析出した固体をろ取することで、PEG−DBCOを合成した。
PEG−DBCO(DBCO−PEG4−FLAG(DYKDDDDK)(Jena Bioscience社製)、DBCO−PEG 20kDa(Click Chemistry Tools社製)、DBCO−PEG 30kDa(Click Chemistry Tools社製)または工程1aもしくは工程1bにて調製したPEG−DBCOをD−PBSで溶解し、これをo−Az−Z−Lys導入8His−IL−2またはm−Az−Z−Lys導入8His−IL−2またはo−Az−Z−Lys導入IL−2に20mol当量添加し、室温にて一晩静置した。
配列番号1で表される野生型成熟ヒトIL−2アミノ酸配列の1番目のアラニンを欠損し、125番目のアミノ酸残基をシステインからセリンに、129番目のアミノ酸残基をイソロイシンからシステインに置換し、かつN末端にメチオニンが結合したアミノ酸配列からなるIL−2(アミノ酸配列:配列番号51、当該アミノ酸配列をコードする塩基配列:配列番号52、以下IL−2_I129Cと記載する)をもとにして、上記発現ベクターを作製した。
・Cys変異位置:配列番号1のN末端からの位置
・1位修飾:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のアラニン残基の修飾を表す。Mとは、アラニンからメチオニンにアミノ酸残基を置換していることを示す。
・125位変異:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から125番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。アミノ酸残基の変異を加えていない場合は−、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はSと記載する。
IL−2_I129Cを下記に記載の方法で作製した。実施例9で作製した大腸菌用pET−22b(+)−hIL−2_I129Cを大腸菌BL21(DE3)(Novagen社製)に導入し、実施例5に記載の方法にて封入体を得た。
表17に示すIL−2_I129CのPEG化体(以下PEG結合IL−2改変体と記載する)を以下の方法で調製した。
・PEG導入位置:配列番号1のN末端からの位置。
・1位修飾:配列番号1で表されるアミノ酸配列のN末端から1番目のアラニン残基の修飾を表す。Mとは、アラニンからメチオニンにアミノ酸残基を置換していることを示す。
・125位変異:配列番号1のN末端から125番目のアミノ酸残基の変異の有無を示す。アミノ酸残基の変異を加えていない場合は−、システインからセリンにアミノ酸残基を置換する変異を加えている場合はSと記載する。
作製したIL−2改変体のヒトIL−2Rαβγに対する選択性を以下の方法で評価した。
各種IL−2のヒトTregに対する細胞増殖活性を以下の方法で測定した。各種IL−2として、糖鎖結合IL−2改変体としてH16C−2、E15C−11、L19C−9、L19C−11、N88C−2、L12C−11/V91C−11、V91C−11/V115C−11、V91C−11/N119C−11およびA1C−11/T3C−11/S5C−11/L12C−11/V91C−11、Cys−PEG化、糖鎖結合IL−2改変体として、A1C−Y50(IAc)/L12C−11/V91C−11、T3C−Li20(IAc)/L12C−11/V91C−11、T3C−Y50(IAc)/L12C−11/V91C−11、T3C−Y50(IAc)/E15C−11、T3C−V40(IAc)/E15C−11、T3C−V80(Mal)/E15C−11およびF78C−V40(IAc)/L12C−11、PEG結合IL−2改変体として、8His−S4(oAzZK)−Li20、8His−S5(oAzZK)−Li20、8His−S6(oAzZK)−Li20、8His−T7(oAzZK)−Li20、8His−K8(oAzZK)−Li20、8His−E60(oAzZK)−Li20、8His−F78(oAzZK)−Li20、8His−F78(oAzZK)−V40、8His−F78(oAzZK)−W40、8His−H79(oAzZK)−Li20、8His−R81(oAzZK)−Li20、8His−L94(oAzZK)−Li20、8His−S99(oAzZK)−Li20、8His−E100(oAzZK)−Li20、8His−T101(oAzZK)−Li20、8His−Q126(oAzZK)−Li20、8His−I129(oAzZK)−Li20、8His−I129(oAzZK)−Li40、8His−I129(oAzZK)−V40、8His−I129(oAzZK)−W40、8His−I129(oAzZK)−Y50、I129(oAzZK)−V40、I129(oAzZK)−W80、I129C−V40(Mal)、8His−S4(oAzZK)−Li30/F78(oAzZK)−Li30、8His−S5(oAzZK)−Li30/F78(oAzZK)−Li30、8His−K8(oAzZK)−Li30/F78(oAzZK)−Li30、8His−F78(oAzZK)−Li30/H79(oAzZK)−Li30、8His−F78(oAzZK)−Li30/S99(oAzZK)−Li30、8His−F78(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30、8His−S4(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30、S4(oAzZK)−Y50/I129(oAzZK)−Y50、8His−S5(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30、S5(oAzZK)−Y50/I129(oAzZK)−Y50、8His−K8(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30、K8(oAzZK)−Y50/I129(oAzZK)−Y50、8His−H79(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30および8His−S99(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30ならびにコントロールとしてIL−2(P)および8His−IL−2を使用した。
各種IL−2のヒトNK細胞の細胞増殖活性を以下の方法で測定した。各種IL−2改変体として、糖鎖結合IL−2改変体として、H16C−2、E15C−11、L19C−9、L19C−11*、N88C−2、L12C−11/V91C−11、V91C−11/V115C−11、V91C−11/N119C−11およびA1C−11/T3C−11/S5C−11/L12C−11/V91C−11、Cys−PEG化、糖鎖結合IL−2改変体として、A1C−Y50(IAc)/L12C−11/V91C−11、T3C−Li20(IAc)/L12C−11/V91C−11、T3C−Y50(IAc)/L12C−11/V91C−11、T3C−Y50(IAc)/E15C−11、T3C−V40(IAc)/E15C−11、T3C−V80(Mal)/E15C−11およびF78C−V40(IAc)/L12C−11、PEG結合IL−2改変体として、8His−S4(oAzZK)−Li20、8His−S5(oAzZK)−Li20、8His−S6(oAzZK)−Li20、8His−T7(oAzZK)−Li20、8His−K8(oAzZK)−Li20、8His−E60(oAzZK)−Li20、8His−F78(oAzZK)−Li20、8His−F78(oAzZK)−V40、8His−F78(oAzZK)−W40、8His−H79(oAzZK)−Li20、8His−R81(oAzZK)−Li20、8His−L94(oAzZK)−Li20、8His−S99(oAzZK)−Li20、8His−E100(oAzZK)−Li20、8His−T101(oAzZK)−Li20、8His−Q126(oAzZK)−Li20、8His−I129(oAzZK)−Li20、8His−I129(oAzZK)−Li40、8His−I129(oAzZK)−V40、8His−I129(oAzZK)−W40、8His−I129(oAzZK)−Y50、I129(oAzZK)−V40、I129(oAzZK)−W80、I129C−V40(Mal)、8His−S4(oAzZK)−Li30/F78(oAzZK)−Li30、8His−S5(oAzZK)−Li30/F78(oAzZK)−Li30、8His−K8(oAzZK)−Li30/F78(oAzZK)−Li30、8His−F78(oAzZK)−Li30/H79(oAzZK)−Li30、8His−F78(oAzZK)−Li30/S99(oAzZK)−Li30、8His−F78(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30、8His−S4(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30、S4(oAzZK)−Y50/I129(oAzZK)−Y50、8His−S5(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30、S5(oAzZK)−Y50/I129(oAzZK)−Y50、8His−K8(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30、K8(oAzZK)−Y50/I129(oAzZK)−Y50、8His−H79(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30および8His−S99(oAzZK)−Li30/I129(oAzZK)−Li30ならびにコントロールとしてIL−2(P)および8His−IL−2を使用した。
以下に記載する方法で、各種IL−2で刺激して増殖させたヒトTregによる、ヒトTrespの増殖阻害活性を測定した。すべての細胞は同一ロットの凍結ヒトPBMCより分離した。各種IL−2としては、糖鎖結合IL−2改変体H16C−2、L19C−9、およびN88C−2ならびにコントロールとしてIL−2(P)を使用した。
各種IL−2で刺激したヒトPBMCの各種サイトカインの産生量を以下に記載する方法で測定した。各種IL−2としては、糖鎖結合IL−2改変体H16C−2、L19C−9、およびN88C−2ならびにポジティブコントロールとしてIL−2(P)を使用した。
下記の方法で、各種IL−2のhuman CD25ECD−Fcおよびhuman IL−2RβγECD−Fcに対する親和性を測定した。各種IL−2として、糖鎖結合IL−2改変体L12C−2、L12C−9、L12C−11、H16C−2、L19C−9、L12C−11、N88C−2およびV91C−11、ならびにコントロールとして野生型IL−2、8His−IL−2およびIL−2(P)を使用した。
IL−2にアミノ酸改変を行うことや、糖鎖またはPEGを結合させることがIL−2Rαβγ選択性に与える影響を評価するため、実施例1で作製したL19C、L19C−acetamide、L19N、および実施例5で作製した各種o−Az−z−Lys導入8His−IL−2を実施例12に記載の方法と同様の手法で標準化EC50 ratio値を測定した。得られた結果を表24に示す。
配列番号2:8His−IL−2のアミノ酸配列
配列番号3:8His−IL−2の塩基配列
配列番号4:8His−S4(oAzZK)の塩基配列
配列番号5:8His−S5(oAzZK)の塩基配列
配列番号6:8His−S6(oAzZK)の塩基配列
配列番号7:8His−T7(oAzZK)の塩基配列
配列番号8:8His−K8(oAzZK)の塩基配列
配列番号9:8His−E60(oAzZK)の塩基配列
配列番号10:8His−F78(oAzZK)の塩基配列
配列番号11:8His−H79(oAzZK)の塩基配列
配列番号12:8His−R81(oAzZK)の塩基配列
配列番号13:8His−L94(oAzZK)の塩基配列
配列番号14:8His−S99(oAzZK)の塩基配列
配列番号15:8His−E100(oAzZK)の塩基配列
配列番号16:8His−T101(oAzZK)の塩基配列
配列番号17:8His−Q126(oAzZK)の塩基配列
配列番号18:8His−I129(oAzZK), 8His−I129(mAzZK)の塩基配列
配列番号19:ヒトIL−2Rαβγ−Azamigreen融合体のアミノ酸配列
配列番号20:ヒトIL−2Rαβγ−Azamigreen融合体の塩基配列
配列番号21:ヒトIL−2Rβγ−Azamigreen融合体のアミノ酸配列
配列番号22:ヒトIL−2Rβγ−Azamigreen融合体の塩基配列
配列番号23:ヒトCD25ECD−Fc−Avitagのアミノ酸配列
配列番号24:ヒトCD25ECD−Fc−Avitagの塩基配列
配列番号25:ヒトCD122ECD−Fc−Avitag−8His_ヒトCD132ECD−Fc−FLAGのアミノ酸配列
配列番号26:ヒトCD122ECD−Fc−Avitag−8His_ヒトCD132ECD−Fc−FLAGの塩基配列
配列番号27:8His−S4(oAzZK)/ F78(oAzZK)の塩基配列
配列番号28:8His−S5(oAzZK)/F78(oAzZK) の塩基配列
配列番号29:8His−K8(oAzZK)/F78(oAzZK) の塩基配列
配列番号30:8His−F78(oAzZK)/H79(oAzZK) の塩基配列
配列番号31:8His−F78(oAzZK)/S99(oAzZK) の塩基配列
配列番号32:8His−F78(oAzZK)/I129(oAzZK) の塩基配列
配列番号33:8His−S4(oAzZK)/I129(oAzZK) の塩基配列
配列番号34:8His−S5(oAzZK)/I129(oAzZK) の塩基配列
配列番号35:8His−K8(oAzZK)/I129(oAzZK) の塩基配列
配列番号36:8His−H79(oAzZK)/I129(oAzZK) の塩基配列
配列番号37:8His−S99(oAzZK)/I129(oAzZK) の塩基配列
配列番号38:N末端メチオニン付加IL−2 C125Sのアミノ酸配列
配列番号39:N末端メチオニン付加IL−2 C125Sの塩基配列
配列番号40:desAla_IL−2 C125Sのアミノ酸配列
配列番号41:desAla_IL−2 C125Sの塩基配列
配列番号42:F78(oAzZK) の塩基配列
配列番号43:I129(oAzZK) の塩基配列
配列番号44:desAla_I129(oAzZK) の塩基配列
配列番号45:S4(oAzZK)/ F78(oAzZK) の塩基配列
配列番号46:S5(oAzZK)/F78(oAzZK) の塩基配列
配列番号47:K8(oAzZK)/F78(oAzZK) の塩基配列
配列番号48:S4(oAzZK)/I129(oAzZK) の塩基配列
配列番号49:S5(oAzZK)/I129(oAzZK) の塩基配列
配列番号50:K8(oAzZK)/I129(oAzZK) の塩基配列
配列番号51:I129Cのアミノ酸配列
配列番号52:I129Cの塩基配列
Claims (57)
- Interleukin−2(以下、IL−2と略記する)改変体。
- 糖鎖が結合したIL−2改変体および/またはポリエチレングリコール(PEG)が結合したIL−2改変体である請求項1に記載のIL−2改変体。
- IL−2受容体(以下IL−2R)αβγに対する選択性が向上している、請求項1または2に記載のIL−2改変体。
- IL−2のアミノ酸配列における、11、12、13、15、16、18、19、20、84、87、88、91、92、108、115、119、122、123および130番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基に糖鎖が結合している、請求項2または3に記載のIL−2改変体。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、11、12、13、15、16、18、19、20、84、87、88、91、92、108、115、119、122、123および130番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されているアミノ酸配列を含む、請求項2〜5のいずれか1項に記載のIL−2改変体。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、12、15、16、19、88、91および119番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換されているアミノ酸配列を含む、請求項6に記載のIL−2改変体。
- 糖鎖が結合したIL−2改変体にさらにPEGが結合したIL−2改変体である、請求項2〜9のいずれか1項に記載のIL−2改変体。
- IL−2のアミノ酸配列における、4、5、6、7、8、60、78、79、99、100、101および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基にPEGが結合している、請求項2または3に記載のIL−2改変体。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、4、5、6、7、8、60、78、79、99、100、101および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、PEGが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含む、請求項2、3および11のいずれか1項に記載のIL−2改変体。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における4、5、8、78および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、PEGが結合しているアミノ酸残基に置換されている、請求項2,3,11および12のいずれか1項に記載のIL−2改変体。
- PEGが結合したアミノ酸残基が、PEGが結合した非天然アミノ酸残基である、請求項2、3、11〜13のいずれか1項に記載のIL−2改変体。
- PEGが結合した非天然アミノ酸残基が、PEGが結合したチオール基(-SH)を有するアミノ酸残基由来の基、またはPEGが結合したアジド基を有するアミノ酸残基由来の基である、請求項14に記載のIL−2改変体。
- PEGが結合した非天然アミノ酸残基が、N6−[{(o−azidobenzyl)oxy}carbonyl]−L−lysine(o−Az−Z−Lys)残基由来の基、N6−[{(m−azidobenzyl)oxy}carbonyl]−L−lysine(m−Az−Z−Lys)残基由来の基またはシステイン残基由来の基である、請求項14または15に記載のIL−2改変体。
- PEGが直鎖状である、請求項2、3、10〜19いずれか1項に記載のIL−2改変体。
- PEGが分岐状である、請求項2、3、10〜19いずれか1項に記載のIL−2改変体。
- PEGが、平均分子量10kDa以上のPEGである、請求項2、3、10〜21いずれか1項に記載のIL−2改変体。
- PEGが、平均分子量10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDaまたは80kDaのPEGである請求項2、3、10〜22のいずれか1項に記載のIL−2改変体。
- IL−2のN末端にさらにメチオニン残基が結合している、請求項1〜24のいずれか1項に記載のIL−2改変体。
- IL−2のN末端のアラニンが欠損している、請求項1〜25のいずれか1項に記載のIL−2改変体。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載のIL−2改変体の製造方法。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載のIL−2改変体を含む組成物。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載のIL−2改変体を含む、免疫疾患の治療剤。
- IL−2のIL−2Rαβγに対する選択性を向上させる方法。
- IL−2に糖鎖および/またはPEGを結合させることを含む、請求項30に記載の方法。
- IL−2のアミノ酸配列における、11、12、13、15、16、18、19、20、84、87、88、91、92、108、115、119、122、123および130番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基に、糖鎖を結合させることを含む、請求項31に記載の方法。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列を含むIL−2において、該アミノ酸配列の11、12、13、15、16、18、19、20、84、87、88、91、92、108、115、119、122、123および130番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基を、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換することを含む、請求項31〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、12、15、16、19、88、91または119番目のアミノ酸残基のうち少なくとも1つのアミノ酸残基を、糖鎖が結合したシステイン残基またはアスパラギン残基由来の基に置換することを含む、請求項31〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 糖鎖が結合したIL−2改変体にさらにPEGを結合させることを含む請求項31〜37のいずれか1項に記載の方法。
- IL−2のアミノ酸配列における、4、5、6、7、8、60、78、79、99、100、101および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基にPEGが結合している、請求項31に記載の方法。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1のアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における、4、5、6、7、8、60、78、79、99、100、101および129番目のアミノ酸残基からなる群より選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、PEGが結合したアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列を含む、請求項31または39に記載の方法。
- 配列番号1で表されるアミノ酸配列、または配列番号1で表されるアミノ酸配列の125番目のアミノ酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列における4、5、8、78および129番目のうちから選ばれる少なくとも1つのアミノ酸残基が、PEGが結合しているアミノ酸残基に置換されている、請求項31,39および40のいずれか1項に記載の方法。
- PEGが結合したアミノ酸残基が、PEGが結合した非天然アミノ酸残基である、請求項31、39〜41のいずれか1項に記載の方法。
- PEGが結合した非天然アミノ酸残基が、PEGが結合したチオール基(-SH)を有するアミノ酸残基由来の基、またはPEGが結合したアジド基を有するアミノ酸残基由来の基である、請求項42に記載の方法。
- PEGが結合した非天然アミノ酸残基が、N6−[{(o−azidobenzyl)oxy}carbonyl]−L−lysine(o−Az−Z−Lys)残基由来の基、N6−[{(m−azidobenzyl)oxy}carbonyl]−L−lysine(m−Az−Z−Lys)残基由来の基またはシステイン残基由来の基である、請求項42または43に記載の方法。
- PEGが直鎖状である、請求項31、38〜47のいずれか1項に記載の方法。
- PEGが分岐状である、請求項31、38〜47のいずれか1項に記載の方法。
- PEGが、平均分子量10kDa以上のPEGである、請求項31、38〜49のいずれか1項に記載の方法。
- PEGが、平均分子量10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDaまたは80kDaのPEGである請求項31、38〜50のいずれか1項に記載の方法。
- IL−2のN末端にさらにメチオニン残基が結合している、請求項30〜52のいずれか1項に記載の方法。
- IL−2のN末端のアラニンが欠損している、請求項30〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 制御性T細胞を選択的に活性化させる方法。
- IL−2Rβおよびγサブユニットの少なくとも一方に対するIL−2の親和性を低下させる方法。
- IL−2Rαサブユニットに対するIL−2の親和性を向上させる方法。
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JP2022544591A (ja) * | 2019-08-15 | 2022-10-19 | サイティム セラピューティクス, インコーポレイテッド | 改変インターロイキン2(il-2)ポリペプチド、コンジュゲート及びそれらの使用 |
CN114478743A (zh) * | 2019-12-17 | 2022-05-13 | 北京志道生物科技有限公司 | 白介素-2衍生物 |
CN113121671A (zh) * | 2020-01-15 | 2021-07-16 | 天津键凯科技有限公司 | 一种制备结合位点可控的peg化生物分子的方法 |
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TW202203973A (zh) * | 2020-04-22 | 2022-02-01 | 美商默沙東藥廠 | 對介白素-2受體βγc二聚體具偏性且結合至非肽、水溶性聚合物之人類介白素-2結合物 |
AU2021286177A1 (en) * | 2020-06-03 | 2022-12-01 | Ascendis Pharma Oncology Division A/S | IL-2 sequences and uses thereof |
CA3195612A1 (en) * | 2020-10-14 | 2022-04-21 | Haining HUANG | Modified interleukin 2 (il-2) polypeptides, and methods of making and using the same |
CN113698468B (zh) * | 2021-09-01 | 2022-10-11 | 浙江新码生物医药有限公司 | 人白细胞介素2-聚乙二醇偶联物及其应用 |
WO2023045977A1 (zh) * | 2021-09-22 | 2023-03-30 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 白介素2突变体以及其融合蛋白 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62503171A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-12-17 | シタス コ−ポレイシヨン | ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化 |
US4902502A (en) * | 1989-01-23 | 1990-02-20 | Cetus Corporation | Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate |
JPH04503604A (ja) * | 1989-02-28 | 1992-07-02 | イー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー | N―連結グリコシル化部位含有il―2アナローグ |
WO2005007121A2 (en) * | 2003-07-18 | 2005-01-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides |
JP2011519882A (ja) * | 2008-05-08 | 2011-07-14 | アイクリス ゲーエムベーハー ウント コー.カーゲー | 自己免疫疾患の治療および/または予防のための薬剤、ならびに制御性t細胞形成のための薬剤 |
JP2012515778A (ja) * | 2009-01-21 | 2012-07-12 | アムジェン インコーポレイテッド | 炎症性疾患および自己免疫疾患の処置の組成物および方法 |
JP2014506116A (ja) * | 2010-11-12 | 2014-03-13 | ウェルズ ファーゴ バンク ナショナル アソシエイション | Il−2部分とポリマーとのコンジュゲート |
Family Cites Families (24)
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---|---|---|---|---|
GB1388836A (en) | 1971-06-01 | 1975-03-26 | Medisan Ab | Cosmetic compositions |
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US5312903A (en) | 1990-06-01 | 1994-05-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Lysine-glycosylated recombinant interleukin-2 |
EP1012184B1 (en) * | 1997-07-14 | 2007-10-10 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins |
US6955807B1 (en) | 1998-05-15 | 2005-10-18 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | IL-2 selective agonists and antagonists |
US7070959B1 (en) * | 1999-06-08 | 2006-07-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
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CA2529819A1 (en) * | 2003-06-30 | 2004-09-23 | Domantis Limited | Pegylated single domain antibodies |
EP2657255A1 (en) | 2003-07-28 | 2013-10-30 | Glytech, Inc. | Aminated complex-type sugar chain derivatives and process for the production thereof |
CN1930300A (zh) * | 2004-03-05 | 2007-03-14 | 希龙公司 | 预测患者治疗药物耐受性的体外试验系统 |
WO2013068874A1 (en) | 2011-11-11 | 2013-05-16 | Pfizer Inc. | Antibody-drug conjugates |
EP3505534A1 (en) | 2012-06-08 | 2019-07-03 | Sutro Biopharma, Inc. | Antibodies comprising sitespecific nonnatural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use |
WO2014028748A1 (en) | 2012-08-15 | 2014-02-20 | Irm Llc | Interleukin 2 antibodies and antibody complexes |
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WO2014124258A2 (en) | 2013-02-08 | 2014-08-14 | Irm Llc | Specific sites for modifying antibodies to make immunoconjugates |
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WO2015109212A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-07-23 | Pfizer Inc. | Anti-il-2 antibodies and compositions and uses thereof |
IL289475B2 (en) | 2014-07-21 | 2023-10-01 | Delinia Inc | Molecules that activate T cells are selectively regulated for the treatment of autoimmune diseases |
SI3180020T1 (sl) | 2014-08-11 | 2019-04-30 | Delinia, Inc. | Modificirane variante IL-2, ki selektivno aktivirajo regulatorne celice T, za zdravljenje avtoimunih bolezni |
WO2017030156A1 (ja) | 2015-08-19 | 2017-02-23 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 非天然アミノ酸導入抗体 |
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---|---|---|---|---|
JPS62503171A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-12-17 | シタス コ−ポレイシヨン | ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化 |
US4902502A (en) * | 1989-01-23 | 1990-02-20 | Cetus Corporation | Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate |
JPH04503604A (ja) * | 1989-02-28 | 1992-07-02 | イー・アイ・デュポン・ドゥ・ヌムール・アンド・カンパニー | N―連結グリコシル化部位含有il―2アナローグ |
WO2005007121A2 (en) * | 2003-07-18 | 2005-01-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides |
JP2011519882A (ja) * | 2008-05-08 | 2011-07-14 | アイクリス ゲーエムベーハー ウント コー.カーゲー | 自己免疫疾患の治療および/または予防のための薬剤、ならびに制御性t細胞形成のための薬剤 |
JP2012515778A (ja) * | 2009-01-21 | 2012-07-12 | アムジェン インコーポレイテッド | 炎症性疾患および自己免疫疾患の処置の組成物および方法 |
JP2014506116A (ja) * | 2010-11-12 | 2014-03-13 | ウェルズ ファーゴ バンク ナショナル アソシエイション | Il−2部分とポリマーとのコンジュゲート |
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