ES2862139T3 - Procedimientos de uso de Interleucina 10 para el tratamiento de enfermedades y trastornos - Google Patents

Abstract

Un agente de PEG-IL-10 que comprende al menos una molécula de PEG unida covalentemente a al menos un residuo de aminoácido de al menos una subunidad de IL-10 para su uso en el tratamiento de una afección proliferativa en un sujeto mamífero, en el que el agente de PEG-IL-10 se administra a dicho sujeto de manera que una concentración mínima media de IL-10 en suero de al menos 1 ng/ml se mantiene durante el 90% del período de tiempo de administración y en el que el sujeto también se trata con una cantidad biológicamente eficaz de al menos un inhibidor del punto de control inmunitario, en el que el inhibidor del punto de control inmunitario se dirige a un punto de control inmunitario seleccionado del grupo que consiste en CTLA4, PD1, PDL1, LAG3 y BTLA.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos de uso de Interleucina 10 para el tratamiento de enfermedades y trastornos

Campo de la invención

Esta invención se refiere a procedimientos de uso de IL-10 en combinación con otros agentes en el tratamiento o prevención de una serie diversa de enfermedades y trastornos, que incluyen cánceres y trastornos relacionados con el sistema inmunitario.

Introducción

La citocina interleucina 10 (IL-10) es una citocina pleiotrópica que regula múltiples respuestas inmunes a través de acciones sobre células T, células B, macrófagos y células presentadoras de antígeno (APC). IL-10 puede suprimir las respuestas inmunes al inhibir la expresión de IL-1a, IL-lp, IL-6, IL-8, TNF-a, GM-CSF y G-CSF en monocitos activados y macrófagos activados, y también suprime la producción de el IFN-y por células NK. Aunque IL-10 se expresa predominantemente en macrófagos, también se ha detectado la expresión en células T activadas, células B, mastocitos y monocitos. Además de suprimir las respuestas inmunitarias, IL-10 exhibe propiedades inmunoestimuladoras, que incluyen estimular la proliferación de timocitos tratados con IL-2 e IL-4, mejorar la viabilidad de las células B y estimular la expresión del MHC de clase II.

La IL-10 humana es un homodímero que se vuelve biológicamente inactivo tras la interrupción de las interacciones no covalentes entre las dos subunidades de monómeros. Los datos obtenidos a partir de la estructura cristalina publicada de IL-10 indican que el dímero funcional exhibe ciertas similitudes con IFN-y (Zdanov et al., (1995) Structure (Lond) 3: 591-601).

Como resultado de su actividad pleiotrópica, la IL-10 se ha relacionado con una amplia gama de enfermedades, trastornos y afecciones, que incluyen afecciones inflamatorias, trastornos relacionados con el sistema inmunitario, trastornos fibróticos, trastornos metabólicos y cáncer. Las evaluaciones clínicas y preclínicas con IL-10 para varias de estas enfermedades, trastornos y afecciones han solidificado su potencial terapéutico. Además, se ha demostrado que la IL-10 pegilada es más eficaz que la IL-10 no pegilada en determinados entornos terapéuticos.

En vista de la diversa gama de enfermedades, trastornos y afecciones susceptibles de tratamiento o prevención con IL-10 y formas modificadas de la misma (por ejemplo, IL-10 pegilada), combinaciones de IL-10 con otros agentes que tienen eficacia en el tratamiento de los trastornos fibróticos y el cáncer, ofrecen la posibilidad de regímenes terapéuticos complementarios, aditivos o incluso sinérgicos.

Sumario

La presente divulgación contempla procedimientos para usar IL-10, IL-10 modificada (por ejemplo, pegilada) y agentes asociados descritos en el presente documento, y composiciones de los mismos, en combinación con otros agentes para tratar y/o prevenir diversas enfermedades, trastornos y condiciones, y/o los síntomas de las mismos. Dichas combinaciones brindan la oportunidad de efectos aditivos o sinérgicos en el tratamiento y/o prevención de las enfermedades, trastornos y afecciones descritos en el presente documento. Además, dicha terapia de combinación a menudo permite reducciones en las cantidades y/o frecuencias de administración de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) y el otro u otros agentes en los que se combina, lo que puede resultar en lo minimización o eliminación de cualquier efecto adverso. En realizaciones particulares, se administran uno o más inhibidores del punto de control inmunitario en combinación con un agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10).

Los puntos de control inmunitarios se refieren a una gran colección de vías inhibidoras integradas en el sistema inmunológico que son cruciales para mantener la auto-tolerancia y modular la duración y amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas en los tejidos periféricos para minimizar el daño tisular colateral. El crecimiento del tumor está íntimamente relacionado con la regulación de los puntos de control inmunitarios. Los tumores asumen el control de ciertas vías de puntos de control inmunitarios como un mecanismo principal de resistencia inmunitaria, en particular contra las células T que son específicas de los antígenos tumorales. [Véase, por ejemplo, Stagg y Allard, (2013) Ther. Adv. Med. Oncol. 5 (3): 169-81].

Debido a que la señalización a través de muchos de los puntos de control inmunitarios se inicia mediante interacciones ligando-receptor, puede ser bloqueada fácilmente por anticuerpos o modulada por formas recombinantes de ligandos o receptores. Los antagonistas de moléculas pequeñas también se pueden utilizar como inhibidores del punto de control inmunitario.

En realizaciones particulares, la presente invención contempla la administración de un agente PEG-IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) que comprende al menos una molécula de PEG unida covalentemente a al menos un residuo de aminoácido de al menos una subunidad de IL-10 para su uso en el tratamiento de una afección proliferativa en un sujeto mamífero, en el que el agente de PEG-IL-10 se administra a dicho sujeto de manera que una concentración mínima media en suero de IL-10 de al menos el agente de IL-10 sea superior a 1 ng/ml se mantiene durante más del 90% del período de tiempo de administración y en el que el sujeto también se trata con una cantidad biológicamente eficaz de al menos un inhibidor del punto de control inmunitario, en el que el inhibidor del punto de control inmunitario se dirige a un punto de control inmunitario seleccionado del grupo que consiste en CTLA4 , PD1, PDL1, LAG3 y BTLA. Dichas combinaciones pueden ser ventajosas porque el agente de IL-10 y el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario tienen distintos mecanismos de acción, lo que brinda la oportunidad de atacar la enfermedad, trastorno o afecciones subyacentes desde múltiples ángulos terapéuticos distintos. Las ventajas adicionales de dicha terapia de combinación se describen en otra parte del presente documento.

Como se comenta en detalle a continuación, se han identificado varios puntos de control inmunitario. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, PD1 (proteína 1 de muerte celular programada; también conocida como CD279); PDL1 (ligando PD1; también conocido como B7-H1); BTLA (atenuador de linfocitos B y T; también conocido como CD272); CTLA4 (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos; también conocido como CD152); TIM3 (proteína 3 de la membrana de células T; también conocida como HAVcr2); y LAG3 (gen 3 de activación de linfocitos; también conocido como CD233). Se contempla el uso de inhibidores de c TlA4, PD1, PDL1, LAG3 y BTLA de acuerdo con la presente invención. Múltiples ligandos y receptores de puntos de control inmunitarios adicionales, algunos de los cuales se sobrerregulan de forma selectiva en varios tipos de células tumorales, son candidatos para el bloqueo y, por lo tanto, son particularmente adecuados para la terapia de combinación con agentes como IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) que mejoran la activación de respuestas antitumorales (Pardoll, (abril de 2012) Nature Rev. Cancer 12: 252-64).

La presente divulgación también contempla procedimientos para identificar inhibidores del punto de control inmunitario que son particularmente adecuados para su uso en combinación con IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) para el tratamiento y/o prevención de las enfermedades, trastornos y afecciones descritos en este documento (por ejemplo, cáncer). Los procedimientos y modelos para optimizar los regímenes de dosificación para los agentes de IL-10 y los inhibidores del punto de control inmunitario descritos en el presente documento también se contemplan en las realizaciones de la presente divulgación. En otras realizaciones, la presente divulgación contempla procedimientos para la identificación de poblaciones de pacientes específicos que pueden adaptarse óptimamente a las terapias de combinación descritas en este documento. En algunas realizaciones, la existencia y/o extensión de ciertos biomarcadores puede encontrar utilidad en tales procedimientos.

Como se comenta más adelante, la IL-10 humana es un homodímero y cada monómero comprende 178 aminoácidos, los primeros 18 de los cuales comprenden un péptido señal. Realizaciones particulares de la presente divulgación comprenden polipéptidos IL-10 humanos maduros que carecen del péptido señal (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No 6.217.857) o PEG-IL-10 humana madura. En realizaciones particulares adicionales, el agente de IL-10 es una variante de una IL-10 humana madura específicamente un agente de PEG-IL-10 que comprende al menos una molécula de PEG unida covalentemente a al menos un residuo de aminoácido de al menos una subunidad de IL-10. La variante puede exhibir una actividad menor, comparable o mayor que la actividad de la IL-10 humana madura; en determinadas realizaciones, la actividad es comparable o mayor que la actividad de la IL-10 humana madura.

En el presente documento se divulgan modificaciones de IL-10 que mejoran una o más propiedades (por ejemplo, parámetros farmacocinéticos, eficacia, etc.). Tales modificaciones de IL-10 incluyen pegilación, glicosilación, conjugación y fusión de albúmina (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA)) y hesilación. En realizaciones particulares, IL-10 está pegilada. En realizaciones adicionales, la modificación de IL-10 no da como resultado un efecto perjudicial terapéuticamente relevante sobre la inmunogenicidad, y aún en realizaciones adicionales, la IL-10 modificada es menos inmunogénica que la IL-10 sin modificar. Los términos "IL-10", "polipéptido o polipéptidos IL-10", "agente o agentes" y similares están destinados a interpretarse de manera amplia e incluyen, por ejemplo, polipéptidos relacionados con IL-10 humana y no humana, incluidos homólogos, variantes (incluidas muteínas) y fragmentos de los mismos, así como polipéptidos IL-10 que tienen, por ejemplo, una secuencia líder (por ejemplo, el péptido señal) y versiones modificadas de los anteriores. En otras realizaciones particulares, los términos "IL-10", "polipéptido o polipéptidos IL-10", agente o agentes" son agonistas. Realizaciones particulares se refieren a IL-10 pegilada, que también se denomina en el presente documento "PEG-IL-10”. La presente divulgación también contempla moléculas de ácido nucleico que codifican lo anterior.

Realizaciones particulares de la presente invención se refieren a un agente de PEG-IL-10 como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una afección proliferativa en un sujeto mamífero (por ejemplo, un ser humano), en el que el agente de PEG-IL-10 se administra a dicho sujeto de tal manera que se mantenga una concentración mínima media en suero de IL-10 de al menos 1 ng/ml durante el 90% del período de tiempo de administración, y en el que el sujeto también se trate con una cantidad biológicamente eficaz de al menos un inhibidor del punto de control inmunitario, en el que el inhibidor del punto de control inmunitario se dirige a un punto de control inmunitario seleccionado del grupo que consiste en CTLA4, PD1, PDL1, LAG3 y BTLA. En algunas realizaciones de la presente invención, la concentración mínima media en suero de IL-10 es de al menos 1,5 ng/ml, o al menos 2,0 ng/ml y/o en la que la concentración mínima media en suero de IL-10 se mantiene durante al menos el 95% del período de tiempo.

Como se describe en el presente documento, la concentración mínima media en suero de IL-10 está en el intervalo de 1,0 pg/ml a 100 pg/ml; de 0,1 ng/ml a 1,0 ng/ml; de 1,0 ng/ml a 10 ng/ml; de 0,5 ng/ml a 5,0 ng/ml; de 0,75 ng/ml a 1,25 ng/ml o de 0,9 ng/ml a 1,1 ng/ml. Como se divulga adicionalmente en el presente divulgación, la concentración mínima media en suero de IL-10 es de al menos 1,25 ng/ml, al menos 1,5 ng/ml, al menos 1,6 ng/ml, al menos 1,7 ng/ml, al menos 1,8 ng/ml, al menos 1,85 ng/ml, al menos 1,9 ng/ml, al menos 1,95 ng/ml, al menos 1,97 ng/ml y al menos 1,98 ng/ml, al menos 1,99 ng/ml, al menos 2,0 ng/ml o más de 2 ng/ml.

En otras realizaciones de la presente invención, el período de tiempo antes mencionado es de al menos 48 horas. Como se divulga en el presente documento, el período de tiempo antes mencionado es al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 1 mes, al menos 6 semanas, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 9 meses o más de 12 meses.

Como se divulga en el presente documento, la concentración mínima media en suero de IL-10 se mantiene durante al menos el 85% del período de tiempo, al menos el 90%, al menos el 96%, al menos el 98%, al menos 99 % o 100% del período de tiempo.

Se prevé que un régimen de dosificación suficiente para mantener una concentración mínima deseada en suero en estado estacionario (por ejemplo, 1 ng/ml) puede dar como resultado una concentración en suero inicial que es más alta que la concentración deseada en suero en estado estacionario. Debido a las características farmacodinámicas y farmacocinéticas de IL-10 en un sujeto mamífero, una concentración mínima inicial (lograda, por ejemplo, mediante la administración de una o más dosis de carga seguidas de una serie de dosis de mantenimiento) disminuye gradual pero continuamente durante un período de tiempo incluso cuando los parámetros de dosificación (cantidad y frecuencia) se mantienen constantes. Después de ese período, termina la disminución gradual pero continua y se mantiene una concentración mínima en suero en estado estable.

A modo de ejemplo, es necesaria una administración parenteral (por ejemplo, SC e IV) de ~ 0,1 mg/kg/día de un agente de IL-10 (por ejemplo, mIL-10) a un ratón (por ejemplo, un ratón C57BL/6) para mantener una concentración mínima en suero en estado estable de 2,0 ng/ml. Sin embargo, esa concentración mínima en suero de IL-10 en estado estacionario no se puede alcanzar hasta aproximadamente 30 días después del inicio de la dosificación a razón de 0,1 mg/kg/día (y también después de cualquier dosis o dosis de carga). Más bien, después de que se ha alcanzado una concentración mínima inicial en suero de IL-10 (por ejemplo, 2,5 ng/ml), esa concentración disminuye de forma gradual pero continua en el transcurso de, por ejemplo, el período de aproximadamente 30 días, después de lo cual se mantiene la concentración mínima deseada en suero en estado estacionario (2,0 ng/ml). Un experto en la técnica podrá determinar la dosis necesaria para mantener la concentración mínima deseada en estado estacionario utilizando, por ejemplo, ADME y parámetros específicos del paciente.

Ciertas realizaciones de la presente divulgación están dirigidas a parámetros de dosificación, regímenes y similares para los inhibidores del punto de control inmunitario cuando se administran en combinación con IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10). En general, los parámetros de dosificación y los regímenes de tratamiento asociados con la monoterapia con inhibidores del punto de control inmunitario son aplicables cuando dichos agentes se usan junto con un agente de IL-10 descrito en este documento.

La presente invención contempla un agente de IL-10 para uso como se describe en el presente documento en el que el agente de IL-10 comprende al menos una modificación para formar un agente de IL-10 modificado, en el que la modificación no altera la secuencia de aminoácidos del agente de IL-10. En particular, el agente de IL-10 modificado es un agente de PEG-IL-10. El agente de PEG-IL-10 puede comprender al menos una molécula de PEG unida covalentemente a al menos un residuo de aminoácido de al menos una subunidad de IL-10 o comprende una mezcla de IL-10 monopegilado y dipegilado en otras realizaciones. Como se divulga en el presente documento el componente de PEG del agente de PEG-IL-10 puede tener una masa molecular mayor de aproximadamente 5 kDa, mayor de aproximadamente 10 kDa, mayor de aproximadamente 15 kDa, mayor de aproximadamente 20 kDa, mayor de aproximadamente 30 kDa, mayor de aproximadamente 40 kDa o mayor de aproximadamente 50kDa. En algunas realizaciones de la presente invención, la masa molecular es de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 10 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 15 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 20 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 15 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 20 kDa. Como se divulga en el presente documento, la masa molecular es de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 25 kDa o desde aproximadamente 10 kDa hasta aproximadamente 30 kDa.

Como se divulga en el presente documento, el agente de IL-10 modificado comprende al menos una molécula de fusión Fc, al menos una albúmina de suero (por ejemplo, HSA o BSA), una molécula de fusión HSA o un conjugado de albúmina. Como se divulga adicionalmente en el presente documento, el agente de IL-10 modificado está glicosilado, está hesilado o comprende al menos un dominio de unión a albúmina. Algunos agentes de IL-10 modificados pueden comprender más de un tipo de modificación. En realizaciones particulares, la modificación es específica del sitio. Algunas realizaciones comprenden un enlazador. Los agentes de IL-10 modificados se describen en detalle a continuación.

Ciertas realizaciones de la presente invención contemplan la administración de un agente de PEG-IL-10 en combinación con un inhibidor del punto de control inmunitario, otras realizaciones contemplan la administración de un agente de IL-10 en combinación con dos inhibidores del punto de control inmunitario y en aún otras realizaciones se contempla la administración de un agente de IL-10 en combinación con tres o más inhibidores del punto de control inmunitario. Dichas combinaciones pueden ser ventajosas porque el agente de IL-10 y el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario tienen distintos mecanismos de acción, lo que brinda la oportunidad de atacar la enfermedad, trastorno o afecciones subyacentes desde múltiples ángulos terapéuticos distintos. Las ventajas adicionales de dicha terapia de combinación se describen en otra parte del presente documento.

La IL-10 específica y el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario (junto con, por ejemplo, la diana terapéutica) influyen en los regímenes, parámetros de dosificación, etc., cuando se usan en combinación. En algunas realizaciones de la presente invención, el agente de PEG-IL-10 se administra diariamente durante un período de tiempo de administración de al menos 1 semana. Como se describe en este documento, PEG-IL-10 se puede administrar a un sujeto al menos dos veces al día, al menos una vez al día, al menos una vez cada 48 horas, al menos una vez cada 72 horas, al menos una vez a la semana, al menos una vez cada dos semanas, al menos una vez al mes, al menos una vez cada 2 meses, o al menos una vez cada 3 meses o más. En determinadas realizaciones, PEG-IL-10 se puede administrar en combinación con el inhibidor del punto de control inmunitario ipilimumab (YERVOY, Bristol-Myers Squibb), un anticuerpo monoclonal humano recombinante que se une al antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA4). La dosis recomendada de ipilimumab es de 3 mg/kg administrados por vía intravenosa cada 3 semanas hasta un total de 4 dosis. En una realización ejemplar, la terapia de combinación que comprende PEG-1L-10 e ipilimumab puede iniciarse al mismo tiempo o aproximadamente al mismo tiempo. En otra realización ejemplar que comprende la terapia de combinación con PEG-IL-10 e ipilimumab, la terapia con ipilimumab (administración cada 3 semanas) puede iniciarse primero, y la terapia semanal con PEG-IL-10 puede iniciarse una semana después, dos semanas después de lo cual se administra la segunda dosis de ipilimumab. En algunas realizaciones, el régimen terapéutico comprende un período de lavado ("descanso del fármaco") en el que el nivel en suero de PEG-IL-10, ipilimumab, o ambos, disminuye hasta un nivel deseado para permitir que el sujeto se recupere de cualquier efecto adverso asociado con el ipilimumab (por ejemplo, reacciones adversas relacionadas con el sistema inmunitario). El experto en la materia (por ejemplo, un oncólogo) podrá diseñar un régimen de tratamiento que tenga en cuenta las características de la IL-10 y los agentes inhibidores del punto de control inmunitario (por ejemplo, sus parámetros farmacocinéticos), características específicas del paciente (por ejemplo, función renal) y las dianas terapéuticas.

Las realizaciones particulares de la presente divulgación contemplan la administración de uno o más agentes adicionales (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos) con las combinaciones de un agente de IL-10 y uno o más inhibidores del punto de control inmunitario descritos en el presente documento. La identidad del agente o agentes adicionales dependerá en gran medida de la naturaleza de la afección subyacente que se esté tratando (por ejemplo, la adición de un agente alquilante tal como cisplatino puede ser apropiada en el tratamiento del cáncer de vejiga). Las realizaciones en las que uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos) se administran junto con las combinaciones de un agente de IL-10 y uno o más inhibidores del punto de control inmunitario se describen más adelante.

El agente de IL-10 se puede administrar mediante cualquier ruta eficaz. En algunos realizaciones, se administra mediante inyección parenteral, incluida la inyección subcutánea en ciertas realizaciones. El uno o más inhibidores del punto de control inmunitario también se pueden administrar por cualquier ruta eficaz en vista de la naturaleza del inhibidor. En algunas realizaciones, el agente de IL-10 y el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario pueden administrarse por la misma ruta (por ejemplo, SC), mientras que en otras realizaciones pueden administrarse por diferentes vías (por ejemplo, el agente de IL-10 puede administrarse por vía subcutánea y el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario pueden administrarse por vía intravenosa).

Las realizaciones particulares de la presente divulgación están dirigidas a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente aceptable de un agente de IL-10 en combinación con una cantidad terapéuticamente aceptable de uno o más inhibidores de puntos de control inmunitario, junto con uno o más diluyentes, vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, una solución de inyección isotónica). La composición farmacéutica es generalmente adecuada para la administración en humanos. Además, en algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende al menos un agente profiláctico o terapéutico adicional.

Ciertas realizaciones de la presente divulgación contemplan un recipiente estéril que contiene una de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente y opcionalmente uno o más componentes adicionales. A modo de ejemplo, el recipiente estéril puede ser una jeringa. En otras realizaciones más, el recipiente estéril es un componente de un kit; el kit también puede contener, por ejemplo, un segundo recipiente estéril que comprende al menos un agente profiláctico o terapéutico, cuyos ejemplos se exponen en este documento.

Descripción detallada

Antes de que la presente invención se describa con más detalle, debe entenderse que cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, está incluido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también están incluidos dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Debe observarse que, como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cabe señalar además que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración está destinada a servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva como "únicamente", "solo" y similares en relación con la mención de elementos de la reivindicación o el uso de una limitación "negativa".

Las publicaciones discutidas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, que pueden necesitar una confirmación independiente.

Visión general

La gran mayoría de las células cancerosas tienen un gran número de cambios genéticos y epigenéticos inherentes que proporcionan numerosos antígenos asociados a tumores que el sistema inmunológico del huésped puede reconocer, requiriendo así que los tumores desarrollen mecanismos de resistencia inmunológica específicos para proliferar. Los puntos de control inmunitario, también conocidos como vías inmunoinhibidoras, son un importante mecanismo de resistencia inmunitaria que normalmente media la tolerancia inmunitaria y mitiga el daño tisular colateral.

En los seres humanos que padecen cáncer, la inmunidad antitumoral a menudo es ineficaz debido a la estricta regulación asociada con el mantenimiento de la homeostasis inmunitaria. Una de las principales limitaciones es el proceso de "agotamiento de las células T", que resulta de la exposición crónica a antígenos y se caracteriza por la sobrerregulación de los receptores inhibidores. Estos receptores inhibidores sirven como puntos de control inmunitario para prevenir reacciones inmunes incontroladas. Se ha demostrado que el bloqueo de uno o más de estos puntos de control inmunitario con anticuerpos monoclonales (mAb) rescata las células T antitumorales que de otro modo estarían agotadas y se ha asociado con respuestas clínicas objetivas en pacientes con cáncer (Stagg y Allard, (2013) Ther. Adv. Med Oncol. 5 (3): 169-81). Por lo tanto, la inhibición de los puntos de control inmunitarios ofrece una nueva y prometedora vía para el tratamiento de ciertos cánceres.

La presente divulgación contempla el uso de los agentes de IL-10 descritos en este documento, y sus composiciones, en combinación con uno o más inhibidores del punto de control inmunitario para tratar una afección proliferativa en un sujeto mamífero y/o sus síntomas. En ciertos aspectos de la presente divulgación, tal tratamiento o prevención se efectúa utilizando parámetros de dosificación particulares que sirven para minimizar cualquier efecto adverso asociado con la administración de las terapias individuales por sí mismas. A modo de ejemplo, la adición de un régimen de PEG-IL-10 a un régimen que comprende ipilimumab (un mAb anti-CTLA4) podría permitir una reducción de la cantidad de ipilimumab necesaria para alcanzar el objetivo terapéutico, reduciendo de este modo (o incluso eliminando) las reacciones adversas graves y fatales de ipilimumab mediadas por el sistema inmunológico que llevaron a la FDA a exigir una "advertencia de recuadro negro".

Cabe señalar que cualquier referencia a "humano" en relación con los polipéptidos y moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación no pretende ser limitante con respecto a la forma en que se obtiene el polipéptido o ácido nucleico o la fuente, sino que es sólo con referencia a la secuencia, ya que puede corresponder a una secuencia de un polipéptido o molécula de ácido nucleico humano de origen natural. Además de los polipéptidos humanos y las moléculas de ácido nucleico que los codifican, la presente divulgación contempla polipéptidos relacionados con IL-10 y moléculas de ácido nucleico correspondientes de otras especies.

Definiciones

A menos que se indique lo contrario, se pretende que los siguientes términos tengan el significado que se expone a continuación. Otros términos se definen en otras partes de la memoria descriptiva.

Los términos "paciente" o "sujeto" se usan indistintamente para referirse a un ser humano o un animal no humano (por ejemplo, un mamífero).

Los términos "administración", "administrar" y similares, como se aplican a, por ejemplo, un sujeto, célula, tejido, órgano o fluido biológico, se refieren al contacto de, por ejemplo, IL-10 o PEG-IL-10, un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la IL-10 humana nativa); una composición farmacéutica que comprende lo anterior, o un agente de diagnóstico para el sujeto, célula, tejido, órgano o fluido biológico. En el contexto de una célula, la administración incluye el contacto (por ejemplo, in vitro o ex vivo) de un reactivo a la célula, así como el contacto de un reactivo con un fluido, en el que el fluido está en contacto con la célula.

Los términos "tratar", "que trata", "tratamiento" y similares se refieren a un curso de acción (tal como administrar IL-10 o una composición farmacéutica que comprende IL-10) iniciado después de una enfermedad, trastorno o afección, o un síntoma del mismo, que ha sido diagnosticado, observado y similares para eliminar, reducir, suprimir, mitigar o mejorar, ya sea temporal o permanentemente, al menos una de las causas subyacentes de una enfermedad, trastorno o afección que aflige a un sujeto, o al menos uno de los síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o afección que aflige a un sujeto. Por lo tanto, el tratamiento incluye inhibir (por ejemplo, detener el desarrollo o desarrollo adicional de la enfermedad, trastorno o afección o asociación de síntomas clínicos con la misma) una enfermedad activa. Los términos también pueden usarse en otros contextos, tales como situaciones en las que IL-10 o PEG-IL-10 entran en contacto con un receptor de IL-10 en, por ejemplo, la fase fluida o la fase coloidal.

El término "que necesita tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a un juicio realizado por un médico u otro cuidador de que un sujeto requiere o se beneficiará del tratamiento. Este juicio se basa en una variedad de factores que están en el ámbito de la experiencia del médico o cuidador.

Los términos "prevenir", "que previene", "prevención" y similares se refieren a un curso de acción (tal como administrar IL-10 o una composición farmacéutica que comprende IL-10) iniciado de una manera (por ejemplo, antes de la aparición de una enfermedad, trastorno, afección o síntoma del mismo) para prevenir, suprimir, inhibir o reducir, ya sea temporal o permanentemente, el riesgo de un sujeto de desarrollar una enfermedad, trastorno, afección o similar (según lo determinado, por ejemplo, por la ausencia de síntomas clínicos) o retrasar la aparición de los mismos, generalmente en el contexto de un sujeto predispuesto a tener una enfermedad, trastorno o afección particular. En ciertos casos, los términos también se refieren a ralentizar la progresión de la enfermedad, trastorno o afección o inhibir la progresión de la misma a un estado nocivo o no deseado.

El término "necesidad de prevención", como se usa en el presente documento, se refiere a un juicio realizado por un médico u otro cuidador de que un sujeto requiere o se beneficiará de la atención preventiva. Este juicio se basa en una variedad de factores que están en el ámbito de la experiencia de un médico o cuidador.

La frase "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la administración de un agente a un sujeto, ya sea solo o como parte de una composición farmacéutica y en una sola dosis o como parte de una serie de dosis, en una cantidad capaz de tener cualquier efecto positivo detectable sobre cualquier síntoma, aspecto o característica de una enfermedad, trastorno o afección cuando se administra al sujeto. La cantidad terapéuticamente eficaz se puede determinar midiendo los efectos fisiológicos relevantes, y se puede ajustar en relación con el régimen de dosificación y el análisis de diagnóstico del estado del sujeto y similares. A modo de ejemplo, la medición de la cantidad de citocinas inflamatorias producidas después de la administración puede ser indicativa de si se ha utilizado una cantidad terapéuticamente eficaz.

La frase "en una cantidad suficiente para efectuar un cambio" significa que hay una diferencia detectable entre un nivel de un indicador medido antes (por ejemplo, un nivel de referencia) y después de la administración de una terapia particular. Los indicadores incluyen cualquier parámetro objetivo (por ejemplo, concentración en suero de IL-10) o parámetro subjetivo (por ejemplo, la sensación de bienestar de un sujeto).

El término "moléculas pequeñas" se refiere a compuestos químicos que tienen un peso molecular que es menos de aproximadamente 10 kDa, menos de aproximadamente 2 kDa o menos de aproximadamente 1 kDa. Las moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas, moléculas orgánicas que contienen un componente inorgánico, moléculas que comprenden un átomo radiactivo y moléculas sintéticas. Terapéuticamente, una molécula pequeña puede ser más permeable a las células, menos susceptible a la degradación y es menos probable que provoque una respuesta inmune que las moléculas grandes.

El término "ligando" se refiere, por ejemplo, a péptido, polipéptido, molécula asociada a la membrana o unida a la membrana, o un complejo de los mismos, que puede actuar como agonista o antagonista de un receptor. "Ligando" abarca ligandos naturales y sintéticos, por ejemplo, citocinas, variantes de citocinas, análogos, muteínas y composiciones de unión derivadas de anticuerpos. "Ligando" también incluye moléculas pequeñas, por ejemplo, péptidos miméticos de citocinas y péptidos miméticos de anticuerpos. El término también abarca un agente que no es ni agonista ni antagonista, pero que puede unirse a un receptor sin influir significativamente en sus propiedades biológicas, por ejemplo, señalización o adhesión. Además, el término incluye un ligando unido a membrana que se ha cambiado, por ejemplo, mediante procedimientos químicos o recombinantes, a una versión soluble del ligando unido a membrana. Un ligando o receptor puede ser completamente intracelular, es decir, puede residir en el citosol, núcleo o algún otro compartimiento intracelular. El complejo de ligando y receptor se denomina "complejo ligando-receptor".

Los términos "inhibidores" y "antagonistas", o "activadores" y "agonistas", se refieren a moléculas inhibidoras o activadoras, respectivamente, por ejemplo, para la activación de, por ejemplo, un ligando, receptor, cofactor, gen, célula, tejido u órgano. Los inhibidores son moléculas que disminuyen, bloquean, previenen, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o subregulan, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor o célula. Los activadores son moléculas que aumentan, activan, facilitan, mejoran la activación, sensibilizan o sobrerregulan, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor o célula. Un inhibidor también puede definirse como una molécula que reduce, bloquea o inactiva una actividad constitutiva. Un "agonista" es una molécula que interactúa con una diana para provocar o promover un aumento en la activación de la diana. Un "antagonista" es una molécula que se opone a la acción o acciones de un agonista. Un antagonista previene, reduce, inhibe o neutraliza la actividad de un agonista, y un antagonista también puede prevenir, inhibir o reducir la actividad constitutiva de una diana, por ejemplo, un receptor diana, incluso cuando no hay un agonista identificado.

Los términos "modular", "modulación" y similares se refieren a la capacidad de una molécula (por ejemplo, un activador o un inhibidor) para aumentar o disminuir la función o actividad de un agente de IL-10 (o las moléculas de ácido nucleico que los codifican), ya sea directa o indirectamente; o para mejorar la capacidad de una molécula para producir un efecto comparable al de un agente de IL-10. El término "modulador" pretende referirse ampliamente a moléculas que pueden efectuar las actividades descritas anteriormente. A modo de ejemplo, un modulador de, por ejemplo, un gen, un receptor, un ligando o una célula, es una molécula que altera una actividad del gen, receptor, ligando o célula, en el que la actividad puede activarse, inhibirse, o alterarse en sus propiedades reguladoras. Un modulador puede actuar solo o puede utilizar un cofactor, por ejemplo, una proteína, un ión metálico o una molécula pequeña. El término "modulador" incluye agentes que operan a través del mismo mecanismo de acción que la IL-10 (es decir, agentes que modulan la misma vía de señalización que la IL-10 de una manera análoga a la misma) y son capaces de provocar una respuesta biológica comparable a (o mayor que) la de IL-10.

Los ejemplos de moduladores incluyen compuestos de moléculas pequeñas y otras moléculas bioorgánicas. Numerosas bibliotecas de compuestos de moléculas pequeñas (por ejemplo, bibliotecas combinatorias) están disponibles comercialmente y pueden servir como punto de partida para identificar un modulador. El experto en la materia puede desarrollar uno o más ensayos (por ejemplo, ensayos bioquímicos o basados en células) en los que dichas bibliotecas de compuestos pueden cribarse para identificar uno o más compuestos que tienen las propiedades deseadas; a partir de entonces, el químico farmacéutico experto puede optimizar tal uno o más compuestos, por ejemplo, sintetizando y evaluando análogos y derivados de los mismos. Los estudios de modelado sintético y/o molecular también se pueden utilizar en la identificación de un activador.

La "actividad" de una molécula puede describir o referirse a la unión de la molécula a un ligando o un receptor; a la actividad catalítica; a la capacidad de estimular la expresión génica o la señalización, diferenciación o maduración celular; a la actividad antigénica; a la modulación de actividades de otras moléculas; y similares. El término también puede referirse a la actividad para modular o mantener interacciones célula a célula (por ejemplo, adhesión), o actividad para mantener la estructura de una célula (por ejemplo, una membrana celular). "Actividad" también puede significar actividad específica, por ejemplo, [actividad catalítica]/[mg de proteína], o [actividad inmunológica]/[mg de proteína], concentración en un compartimiento biológico o similar. El término "actividad proliferativa" abarca una actividad que promueve, que es necesaria para, o que está específicamente asociada con, por ejemplo, la división celular normal, así como cáncer, tumores, displasia, transformación celular, metástasis y angiogénesis.

Como se usa en este documento, "comparable", "actividad comparable", "actividad comparable a", "efecto comparable", "efecto comparable a" y similares son términos relativos que se pueden ver cuantitativa y/o cualitativamente. El significado de los términos depende con frecuencia del contexto en el que se utilizan. A modo de ejemplo, se puede considerar que dos agentes que activan un receptor tienen un efecto comparable desde una perspectiva cualitativa, pero los dos agentes pueden verse como que carecen de un efecto comparable desde una perspectiva cuantitativa si un agente solo puede lograr 20% de la actividad del otro agente según se determina en un ensayo aceptado en la técnica (por ejemplo, un ensayo de respuesta a la dosis) o en un modelo animal aceptado en la técnica. Cuando se compara un resultado con otro resultado (por ejemplo, un resultado con un estándar de referencia), "comparable" frecuentemente significa que un resultado se desvía de un estándar de referencia en menos del 35%, en menos del 30%, en menos del 25%, menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 7%, menos del 5%, menos del 4%), menos del 3%, menos del 2%, o en menos del 1%. En realizaciones particulares, un resultado es comparable a un estándar de referencia si se desvía en menos del 15%, en menos del 10% o en menos del 5% del estándar de referencia. A modo de ejemplo, pero no de limitación, la actividad o efecto puede referirse a la eficacia, estabilidad, solubilidad o inmunogenicidad.

El término "respuesta", por ejemplo, de una célula, tejido, órgano u organismo, abarca un cambio en el comportamiento bioquímico o fisiológico, por ejemplo, concentración, densidad, adhesión o migración dentro de un compartimiento biológico, tasa de expresión génica, o estado de diferenciación, cuando el cambio se correlaciona con la activación, estimulación o tratamiento, o con mecanismos internos tal como la programación genética. En ciertos contextos, los términos "activación", "estimulación" y similares se refieren a la activación celular regulada por mecanismos internos, así como por factores externos o ambientales; mientras que los términos "inhibición", "subregulación" y similares se refieren a los efectos opuestos.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína", usados indistintamente en el presente documento, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados genéticamente y no codificados genéticamente, química o bioquímicamente modificados o derivatizados y polipéptidos que tienen cadenas principales polipeptídicas modificadas. Los términos incluyen proteínas de fusión, que incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga; proteínas de fusión con secuencias líder heterólogas y homólogas; proteínas de fusión con o sin residuos de metionina en el terminal N; proteínas de fusión con proteínas marcadas inmunológicamente; y similares.

Se apreciará que a lo largo de esta descripción se hace referencia a los aminoácidos de acuerdo con los códigos de una sola letra o de tres letras. Para comodidad del lector, los códigos de aminoácidos de una y tres letras se proporcionan a continuación:

G Glicina Gly P Prolina Pro

A Alanina Ala V Valina Val

L Leucina Leu I Isoleucina Ile

M Metionina Met C Cisteína Cys

F Fenilalanina Phe Y Tirosina Tyr

W Triptófano Trp H Histidina His

K Lisina Lys R Arginina Arg

Q Glutamina Gln N Asparagina Asn

E Ácido glutámico Glu D Ácido Aspártico Asp

S Serina Ser T Treonina Thr

Como se usa en el presente documento, el término "variante" abarca variantes de origen natural y variantes de origen no natural. Las variantes de origen natural incluyen homólogos (polipéptidos y ácidos nucleicos que difieren en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, de una especie a otra) y variantes alélicas (polipéptidos y ácidos nucleicos que difieren en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, de un individuo a otro dentro de una especie). Las variantes de origen no natural incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que comprenden un cambio en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, en las que el cambio en la secuencia se introduce artificialmente (por ejemplo, muteínas); por ejemplo, el cambio se genera en el laboratorio por la intervención humana ("mano del hombre"). Por lo tanto, en el presente documento una "muteína" se refiere ampliamente a proteínas recombinantes mutadas que habitualmente llevan sustituciones de aminoácidos únicos o múltiples y que con frecuencia derivan de genes clonados que se han sometido a mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio, o de genes completamente sintéticos.

Los términos "ADN", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "polinucleótido" y similares se usan indistintamente en el presente documento para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen ácidos nucleicos lineales y circulares, ARN mensajero (ARNm), ADN complementario (ADNc), polinucleótidos recombinantes, vectores, sondas, cebadores y similares.

Como se usa en este documento en el contexto de la estructura de un polipéptido, "terminal N" (o "terminal amino") y "terminal C" (o "terminal carboxilo") se refieren a los extremos terminales amino y carboxilo del polipéptido, respectivamente, mientras que los términos "terminal N" y "terminal C" se refieren a posiciones relativas en la secuencia de aminoácidos del polipéptido hacia el terminal N y el terminal C, respectivamente, y puede incluir los residuos en el terminal N y terminal C, respectivamente. "Inmediatamente terminal N" o "inmediatamente terminal C" se refiere a una posición de un primer residuo de aminoácido con respecto a un segundo residuo de aminoácido en el que el primer y segundo residuos de aminoácidos se unen covalentemente para proporcionar una secuencia de aminoácidos contigua.

"Derivado de", en el contexto de una secuencia de aminoácidos o secuencia de polinucleótidos (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos "derivada de" un polipéptido IL-10), pretende indicar que el polipéptido o ácido nucleico tiene una secuencia que se basa en el de un polipéptido o ácido nucleico de referencia (por ejemplo, un polipéptido IL-10 de origen natural o un ácido nucleico que codifica IL-10), y no pretende ser limitante en cuanto a la fuente o procedimiento en el que se elabora la proteína o ácido nucleico. A modo de ejemplo, el término "derivado de" incluye homólogos o variantes de secuencias de ADN o aminoácidos de referencia.

En el contexto de un polipéptido, el término "aislado" se refiere a un polipéptido de interés que, si se produce de forma natural, se encuentra en un entorno diferente de aquel en el que puede producirse de forma natural. "Aislado" pretende incluir polipéptidos que están dentro de muestras que están sustancialmente enriquecidas con el polipéptido de interés y/o en las que el polipéptido de interés está parcial o sustancialmente purificado. Cuando el polipéptido no se produce de forma natural, "aislado" indica que el polipéptido se ha separado de un entorno en el que se preparó por medios sintéticos o recombinantes.

"Enriquecido" significa que una muestra no se manipula de forma natural (por ejemplo, por un científico) de modo que un polipéptido de interés está presente en a) una concentración mayor (por ejemplo, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 64 veces mayor o más) que la concentración del polipéptido en la muestra de partida, tal como una muestra biológica (por ejemplo, una muestra en la que el polipéptido está presente en forma natural o en la que está presente después de la administración), o b) una concentración mayor que el entorno en el que se fabricó el polipéptido (por ejemplo, como en una célula bacteriana).

"Sustancialmente puro" indica que un componente (por ejemplo, un polipéptido) constituye más de aproximadamente el 50% del contenido total de la composición, y típicamente más de aproximadamente el 60% del contenido total de polipéptido. Más típicamente, "sustancialmente puro" se refiere a composiciones en las que al menos el 75%, al menos el 85%, al menos el 90% o más de la composición total es el componente de interés. En algunos casos, el polipéptido constituirá más de aproximadamente el 90%, o más de aproximadamente el 95% del contenido total de la composición.

Los términos "se une específicamente" o "se une selectivamente", cuando se refieren a un ligando/receptor, anticuerpo/antígeno u otro par de unión, indican una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por tanto, en las condiciones designadas, un ligando específico se une a un receptor particular y no se une en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. El anticuerpo, o composición de unión derivada del sitio de unión al antígeno de un anticuerpo, del procedimiento contemplado se une a su antígeno, o una variante o muteína del mismo, con una afinidad que es al menos dos veces mayor, al menos diez veces mayor, al menos 20 veces mayor, o al menos 100 veces mayor que la afinidad con cualquier otro anticuerpo o composición de unión derivada del mismo. En una realización particular, el anticuerpo tendrá una afinidad superior a aproximadamente 109 litros/mol, según se determina mediante, por ejemplo, análisis de Scatchard (Munsen, et al., 1980 Analyt. Biochem. 107: 220-239).

IL-10 y PEG-IL-10

La citocina antiinflamatoria IL-10, también conocida como factor inhibidor de la síntesis de citocinas humanas (CSIF), se clasifica como una citocina de tipo (clase) 2, un conjunto de citocinas que incluye IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 (Mda-7) e IL-26, interferones (IFN-a, -p, -y, -8, -£, -k, -O, y -^t ) y moléculas de tipo interferón (limitina, IL-28A, IL-28B e IL-29).

La IL-10 es una citocina con efectos pleiotrópicos en la inmunorregulación y la inflamación. Es producida por mastocitos, contrarrestando el efecto inflamatorio que tienen estas células en el lugar de una reacción alérgica. Si bien es capaz de inhibir la síntesis de citocinas proinflamatorias como IFN-y, IL-2, IL-3, TNFa y GM-CSF, la IL-10 también estimula ciertas células T y mastocitos y estimula la maduración de células B, la proliferación y producción de anticuerpos. IL-10 puede bloquear la actividad de NF-kB y participa en la regulación de la vía de señalización JAK-STAT. También induce la actividad citotóxica de las células T CD8+ y la producción de anticuerpos de las células B, y suprime la actividad de los macrófagos y la inflamación promotora de tumores. La regulación de las células T CD8+ depende de la dosis, en la que dosis más altas inducen respuestas citotóxicas más fuertes.

La IL-10 humana es un homodímero con una masa molecular de 37 kDa, en la que cada monómero de 18,5 kDa comprende 178 aminoácidos, los primeros 18 de los cuales comprenden un péptido señal y dos residuos de cisteína que forman dos enlaces disulfuro intramoleculares. El dímero de IL-10 se vuelve biológicamente inactivo tras la interrupción de las interacciones no covalentes entre las dos subunidades de monómero.

La presente divulgación contempla la IL-10 humana pegilada (NP_000563) y la IL-10 murina (NP_034678), que exhiben un 80% de homología, y su uso como se describe en el presente documento. Además, el alcance de la presente divulgación incluye ortólogos de IL-10 pegilados, y formas modificadas de los mismos, de otras especies de mamíferos, incluida rata (acceso NP_036986.2; GI 148747382); vaca (accesión NP_776513.1; GI 41386772); oveja (acceso NP_001009327.1; GI 57164347); perro (acceso ABY86619.1; GI 166244598); y conejo (acceso AAC23839.1; GI 3242896).

Como se mencionó anteriormente, los términos "IL-10", "polipéptido o polipéptidos IL-10", "molécula o moléculas de IL-10", "agente o agentes de IL-10" y similares están destinados a ser interpretados de manera amplia e incluyen, por ejemplo, polipéptidos relacionados con IL-10 humana y no humana, incluidos homólogos, variantes (incluidas muteínas), y fragmentos de los mismos, así como polipéptidos IL-10 que tienen, por ejemplo, una secuencia líder (por ejemplo, el péptido señal), y versiones modificadas de los anteriores. En realizaciones particulares adicionales, IL-10, polipéptido o polipéptidos IL-10 y agente o agentes de IL-10 son agonistas.

El receptor de IL-10, un receptor de citocinas de tipo II, consta de subunidades alfa y beta, que también se denominan R1 y R2, respectivamente. La activación del receptor requiere la unión tanto a alfa como a beta. Un homodímero de un polipéptido IL-10 se une a alfa y el otro homodímero del mismo polipéptido IL-10 se une a beta.

La utilidad de la IL-10 humana recombinante está frecuentemente limitada por su semivida en suero relativamente corta, que puede deberse, por ejemplo, a la depuración renal, la degradación proteolítica y la monomerización en el torrente sanguíneo. Como resultado, se han explorado varios enfoques para mejorar el perfil farmacocinético de IL-10 sin alterar su estructura dimérica y, por tanto, afectar negativamente a su actividad. La pegilación de IL-10 da como resultado una mejora de ciertos parámetros farmacocinéticos (por ejemplo, la semivida en suero) y/o una mejora de la actividad.

Como se usa en este documento, los términos "IL-10 pegilada" y "PEG-IL-10" se refieren a una molécula de IL-10 que tiene una o más moléculas de polietilenglicol unidas covalentemente a al menos un residuo de aminoácido de la proteína IL-10, generalmente a través de un enlazador, de modo que el anexo sea estable. Los términos "IL-10 monopegilada" y "mono-PEG-IL-10" indican que una molécula de polietilenglicol está unida covalentemente a un único residuo de aminoácido en una subunidad del dímero de IL-10, generalmente mediante un enlazador. Como se usa en este documento, los términos "IL-10 dipegilada" y "di-PEG-IL-10" indican que al menos una molécula de polietilenglicol está unida a un solo residuo en cada subunidad del dímero de IL-10, generalmente a través de un enlazador.

En determinadas realizaciones, la PEG-IL-10 utilizada en la presente divulgación es una mono-PEG-IL-10 en la que de una a nueve moléculas de PEG se unen covalentemente mediante un enlazador al grupo alfa amino del residuo de aminoácido en el terminal N de una subunidad del dímero de IL-10. La monopegilación en una subunidad de IL-10 generalmente da como resultado una mezcla no homogénea de IL-10 no pegilada, monopegilada y dipegilada debido a la mezcla de subunidades. Además, permitir que una reacción de pegilación prosiga hasta su finalización generalmente dará como resultado una IL-10 no específica y multipegilada, reduciendo así su bioactividad. Por tanto, realizaciones particulares de la presente divulgación comprenden la administración de una mezcla de IL-10 mono y dipegilada producida mediante los procedimientos descritos en el presente documento.

En realizaciones particulares, el peso molecular promedio de la fracción de PEG está entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 20 kDa. Como se divulga en el presente documento, el peso molecular promedio de la fracción de PEG está entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa. Aunque el procedimiento o sitio de unión de PEG a IL-10 no es crítico, en ciertas realizaciones la pegilación no altera, o sólo altera mínimamente, la actividad del agente de IL-10. En ciertas realizaciones, el aumento de la semivida es mayor que cualquier disminución de la actividad biológica. La actividad biológica de PEG-IL-10 se mide típicamente evaluando los niveles de citocinas inflamatorias (por ejemplo, TNF-a o IFN-y) en el suero de sujetos desafiados con un antígeno bacteriano (lipopolisacárido (LPS)) y tratados con PEG-IL-10, como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 7.052.686.

Las variantes de IL-10 se pueden preparar con varios objetivos en mente, incluido el aumento de la semivida en suero, la reducción de la respuesta inmune contra la IL-10, la facilitación de la purificación o preparación, la disminución de la conversión de IL-10 en sus subunidades monoméricas, la mejora de la eficacia terapéutica y la disminución de la gravedad o aparición de efectos secundarios durante el uso terapéutico. Las variantes de la secuencia de aminoácidos suelen ser variantes predeterminadas que no se encuentran en la naturaleza, aunque algunas pueden ser variantes postraduccionales, por ejemplo, variantes glicosiladas. Puede usarse cualquier variante de IL-10 siempre que conserve un nivel adecuado de actividad de IL-10.

La frase "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a sustituciones que preservan la actividad de la proteína reemplazando uno o varios aminoácidos en la proteína con un aminoácido con una cadena lateral de similar acidez, basicidad, carga, polaridad, o tamaño de la cadena lateral. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos generalmente implican la sustitución de residuos de aminoácidos dentro de los siguientes grupos: 1) L, I, M, V, F; 2) R, K; 3) F, Y, H, W, R; 4) G, A, T, S; 5) Q, N; y 6) D, E. La guía para sustituciones, inserciones o eliminaciones puede basarse en alineamientos de secuencias de aminoácidos de diferentes proteínas variantes o proteínas de diferentes especies. Por tanto, además de cualquier polipéptido IL-10 de origen natural, la presente divulgación contempla tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, normalmente no más de 20, 10 o 5 sustituciones de aminoácidos, en las que la sustitución suele ser una sustitución conservadora de aminoácidos.

La presente divulgación también contempla fragmentos activos (por ejemplo, subsecuencias) de IL-10 madura que contiene residuos de aminoácidos contiguos derivados de la IL-10 madura. La longitud de los residuos de aminoácidos contiguos de un péptido o una subsecuencia de polipéptido varía dependiendo de la secuencia de aminoácidos específica de origen natural de la que se deriva la subsecuencia. En general, los péptidos y polipéptidos pueden ser de aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos, de aproximadamente 40 aminoácidos a aproximadamente 60 aminoácidos, de aproximadamente 60 aminoácidos a aproximadamente 80 aminoácidos, de aproximadamente 80 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos, de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 120 aminoácidos, de aproximadamente 120 aminoácidos a aproximadamente 140 aminoácidos, de aproximadamente 140 aminoácidos a aproximadamente 150 aminoácidos, de aproximadamente 150 aminoácidos a aproximadamente 155 aminoácidos, de aproximadamente 155 aminoácidos ácidos hasta el péptido o polipéptido de longitud completa.

Además, los polipéptidos IL-10 pueden tener una identidad de secuencia definida en comparación con una secuencia de referencia en una longitud definida de aminoácidos contiguos (por ejemplo, una "ventana de comparación"). Los procedimientos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Madison, Wis.), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. complemento de 1995)).

Como ejemplo, un polipéptido IL-10 adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99%, de identidad de secuencia de aminoácidos con un tramo contiguo de aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos, de aproximadamente 40 aminoácidos a aproximadamente 60 aminoácidos, de aproximadamente 60 aminoácidos a aproximadamente 80 aminoácidos, de aproximadamente 80 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos, de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 120 aminoácidos, de aproximadamente 120 aminoácidos a aproximadamente 140 aminoácidos, de aproximadamente 140 aminoácidos a aproximadamente 150 aminoácidos, de aproximadamente 150 aminoácidos a aproximadamente 155 aminoácidos, de aproximadamente 155 aminoácidos hasta el péptido o polipéptido de longitud completa.

Como se analiza más adelante, los polipéptidos IL-10 pueden aislarse de una fuente natural (por ejemplo, un entorno diferente a su entorno natural) y también pueden fabricarse de forma recombinante (por ejemplo, en una célula huésped modificada genéticamente, tal como bacterias, levadura, Pichia, células de insecto y similares), en el que la célula huésped modificada genéticamente se modifica con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Los polipéptidos IL-10 también pueden producirse sintéticamente (por ejemplo, mediante síntesis química libre de células).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los agentes de IL-10 se contemplan en la presente descripción, incluidas sus isoformas de origen natural y no natural, variantes alélicas y variantes de empalme. La presente divulgación también abarca secuencias de ácidos nucleicos que varían en una o más bases de una secuencia de ADN de origen natural pero que aún se traducen en una secuencia de aminoácidos que corresponde a un polipéptido IL-10 debido a la degeneración del código genético.

Inhibidores de puntos de control inmunitario

El tremendo número de alteraciones genéticas y epigenéticas que son característica de todos los cánceres proporciona un conjunto diverso de antígenos que el sistema inmunológico puede usar para distinguir las células tumorales de sus contrapartes normales. En el caso de las células T, la amplitud final (por ejemplo, niveles de producción o proliferación de citocinas) y la calidad (por ejemplo, el tipo de respuesta inmune generada, tal como el patrón de producción de citocinas) de la respuesta, que se inicia mediante el reconocimiento de antígenos por el receptor de células T (TCR), está regulado por un equilibrio entre las señales coestimuladoras e inhibidoras (puntos de control inmunitario). Por debajo de las condiciones fisiológicas normales, los puntos de control inmunitario son cruciales para la prevención de la autoinmunidad (es decir, el mantenimiento de la autotolerancia) y también para la protección de los tejidos del daño cuando el sistema inmunológico está respondiendo a una infección por patógenos. Los tumores pueden desregular la expresión de las proteínas de los puntos de control inmunitarios como un importante mecanismo de resistencia inmunitaria.

Las células T han sido el foco principal de los esfuerzos para manipular terapéuticamente la inmunidad antitumoral endógena debido a i) su capacidad para el reconocimiento selectivo de péptidos derivados de proteínas en todos los compartimientos celulares; ii) su capacidad para reconocer y destruir directamente las células que expresan antígenos (mediante células T efectoras CD8+; también conocidas como linfocitos T citotóxicos (CTL)); y iii) su capacidad para orquestar diversas respuestas inmunitarias mediante células T colaboradoras CD4+, que integran mecanismos efectores adaptativos e innatos. En el entorno clínico, el bloqueo de los puntos de control inmunitarios, que da como resultado la amplificación de las respuestas de las células T específicas de antígeno, ha demostrado ser un enfoque prometedor en la terapéutica del cáncer humano.

La inmunidad mediada por células T incluye múltiples etapas secuenciales, cada uno de las cuales está regulada contrabalanceando las señales estimulantes e inhibidoras con el fin de optimizar la respuesta. Si bien casi todas las señales inhibidoras en la respuesta inmune modulan en última instancia las vías de señalización intracelular, muchas se inician a través de receptores de membrana, cuyos ligandos están unidos a la membrana o son solubles (citocinas). Si bien los receptores y ligandos coestimuladores e inhibidores que regulan la activación de las células T con frecuencia no se sobreexpresan en los cánceres en relación con los tejidos normales, los ligandos inhibidores y los receptores que regulan las funciones efectoras de las células T en los tejidos suelen sobreexpresarse en las células tumorales o células transformadas asociadas con el microambiente tumoral. Las funciones de los puntos de control inmunitarios receptor-ligando solubles y unidos a la membrana se pueden modular utilizando anticuerpos agonistas (para las vías coestimuladoras) o anticuerpos antagonistas (para las vías inhibidoras). Por lo tanto, a diferencia yde la mayoría de los anticuerpos aprobados actualmente para la terapia del cáncer, los anticuerpos que bloquean los puntos de control inmunitarios no se dirigen directamente a las células tumorales, sino que se dirigen a los receptores de linfocitos o sus ligandos para potenciar la actividad antitumoral endógena. [Véase Pardoll, (abril de 2012) Nature Rev. Cancer 12: 252-64].

Se ha demostrado que la IL-10 activa directamente la citotoxicidad de células T CD8+ de humanos y murinos a través de la sobrerregulación directa de las enzimas citotóxicas granzima A, granzima B y perforina. Además, en condiciones apropiadas, la exposición de estas células a IL-10 potencia la acumulación intracelular de IFNy, que puede secretarse tras la ligación del receptor de células T con anti-CD3 soluble o MHC I afín cargado con antígeno peptídico. Mientras que IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) mejora directamente la función de las células T CD8+, como se indicó anteriormente, los inhibidores del punto de control inmunitario generalmente lo hacen de manera indirecta. Los mecanismos divergentes por los cuales la IL-10 y los inhibidores del punto de control inmunitario ejercen sus efectos sobre la función de las células T CD8+ ofrecen una oportunidad sin explotar para que la terapia de combinación tenga resultados terapéuticos potencialmente poderosos.

Los ejemplos de puntos de control inmunes (ligandos y receptores), algunos de los cuales están sobrerregulados de forma selectiva en varios tipos de células tumorales, que son candidatos para el bloqueo incluyen PD1, PDL1, BTLA, CTLA4, TIM3, LAG3; A2aR; y receptores inhibidores asesinos. Cada uno de estos se analiza a continuación. La presente divulgación contempla el uso de agentes de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) en combinación con inhibidores de CTLA4, PD1, PDL1, LAG3 y BTLA. En el entorno tumoral, un objetivo terapéutico principal de estas combinaciones de inhibidores del punto de control inmunitario de IL-10 es dirigir el compartimiento de CD8+ para destruir el tumor.

CTLA4 (antígeno 4 asociado a linfocitos T citotóxicos; también conocido como CD152). El receptor de punto de control inmunitario CTLA4 pertenece a la superfamilia de receptores de inmunoglobulinas, que también incluye PD1; BTLA; atenuador de linfocitos; TIM3 y supresor de inmunoglobulina de dominio V de la activación de células T. CD80 (también conocido como B7.1) y CD86 (también conocido como B7.2) se han identificado como ligandos del receptor CTLA4. CTLA4, el primer receptor de punto de control inmunitario que se dirige clínicamente, se expresa exclusivamente en las células T, en las que regula principalmente la amplitud de las primeras etapas de la activación de las células T. Se ha demostrado que contrarresta la actividad del receptor coestimulador de células T CD28. Tras el reconocimiento del antígeno, la señalización de CD28 amplifica fuertemente la señalización del receptor de células T para activar las células T [Véase, por ejemplo, Riley et al., (2002) Proc. Natl Acad. Sci. USA 99: 11790 - 95].

CTLA4 se induce transcripcionalmente después de la activación de las células T. A pesar de que CTLA4 es expresado por células T efectoras CD8+ activadas, se cree que su función fisiológica primaria se manifiesta a través de efectos distintos en los dos principales subconjuntos de células T CD4+: i) submodulación de la actividad de las células T colaboradoras, y ii) mejora de la actividad inmunosupresora de las células T reguladoras. Específicamente, el bloqueo de CTLA4 da como resultado una mejora de la respuesta inmune dependiente de las células T colaboradoras, mientras que la participación de CTLA4 de las células T reguladoras aumenta su función supresora [Véase, por ejemplo, Fontenot et al., (2003) Nat. Immunol. Proc. 4: 330-36].

Se han descrito varios enfoques experimentales dirigidos a la vía de señalización de CTLA4 usando anticuerpos antagonistas anti-CTLA4. Estos enfoques se han evaluado para discernir la utilidad potencial de dichos anticuerpos en el cáncer (por ejemplo, un tumor) y en afecciones infecciosas. Por ejemplo, la IL-10 se ha implicado previamente en la supresión de respuestas inmunes antitumorales mediada por CTLA4 (Jovasevic et al., (2004) J. Immunol. 172: 1449-54). Cuando se aprobó para el tratamiento del melanoma en 2011, el anticuerpo monoclonal CTLA4 totalmente humanizado ipilimumab (YERVOY; Bristol-Myers Squibb) se convirtió en el primer inhibidor de puntos de control inmunitario en recibir aprobación regulatoria en los Estados Unidos. Otro agente, tremelimumab (anteriormente ticilimumab; Medlmmune) se encuentra actualmente en ensayos clínicos para, por ejemplo, carcinoma hepatocelular, melanoma y mesotelioma.

La vía de señalización de CD28 también ha sido dirigida usando CTLA4-Ig antagonista para su utilidad potencial en condiciones autoinmunes y de trasplante (Wu et al., (2012) Int. J. Biol. Sci. 8: 1420-30). Proteínas de fusión que comprenden CTLA4 y un anticuerpo (CTLA4-Ig; abatcept (ORENCIA; Bristol-Myers Squibb)) han sido utilizadas para el tratamiento de la artritis reumatoide, y se ha demostrado que otras proteínas de fusión son eficaces en pacientes con trasplante renal que están sensibilizados al virus de Epstein Barr.

Aunque prometedores, los enfoques de tratamiento relacionados con CTLA4 no están exentos de defectos. A modo de ejemplo, se ha informado que el tratamiento de melanomas metastásicos con un Ab antagonista anti-CTLA4 humanizado causa ciertas toxicidades autoinmunes (por ejemplo, Inflamación intestinal y dermatitis), lo que impulsa la determinación de una ventana terapéutica tolerada (Wu et al., (2012) Int. J. Biol. Sci. 8: 1420-30). La combinación de un agente anti-CTLA4 (por ejemplo, un anticuerpo como ipilimumab) con IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) ofrece el potencial para un medio único de maximizar la eficacia terapéutica en condiciones de respuesta sin inducir efectos adversos intolerables. Por consiguiente, las realizaciones particulares de la presente divulgación comprenden tales combinaciones.

PD1 (proteína 1 de muerte celular programada; también conocida como CD279) y PDL1 (ligando de PD1; también conocido como B7-H1) y PDL2. PD1 es un regulador negativo de la activación de células T que comparte propiedades estructurales con miembros de la familia CD28. PD1 limita las funciones efectoras de las células T dentro de los tejidos. Mediante la sobrerregulación de los ligandos para PD1, las células tumorales bloquean las respuestas inmunitarias antitumorales en el microambiente tumoral. Como ocurre con muchos otros inhibidores de los puntos de control inmunitarios, el bloqueo de PD1 revierte el agotamiento de las células T, restaura la producción de citocinas y aumenta la expansión de las células T dependientes de antígenos. PDL1 y PDL2 son los dos ligandos que se sabe que activan la vía de PD1.

Se ha demostrado que el bloqueo de la vía PD1-PDL1/PDL2 retrasa el crecimiento tumoral y prolonga la supervivencia de los ratones portadores de tumores. Además, los resultados de los ensayos clínicos en etapa temprana sugirieron que el bloqueo de la vía de PD1 inducía una regresión tumoral sostenida en una variedad de tipos de tumores. Para PD1 y PDL1/PDL2, se cree que la interacción más importante se da en el sitio del tumor, en lugar de más ampliamente en todo el sistema inmunológico, como ocurre con CTLA-4.

Se han evaluado varios enfoques inmunoterapéuticos que modulan la vía PD1-PDL1/PDL2 usando transferencia génica y/o anticuerpos antagonistas. Dichos enfoques se han mostrado prometedores en varias enfermedades, trastornos y afecciones, que incluyen trasplantes, infecciones, tumores y enfermedades autoinmunes (Wu et al., (2012) Int. J. Biol. Sci. 8: 1420-30). Se ha demostrado que el dominio V de inmunoglobulina (Ig) extracelular de PD1 es importante para la interacción entre PD1 y PDL1/PDL2, lo que sugiere que hPD1-IgV puede ser una estrategia prometedora para la inmunoterapia tumoral específica (Zhang et al., (2008) Cytotherapy 10 (7): 711-10). Los anticuerpos p D1 están en desarrollo (por ejemplo, Nivolumab (Bristol-Myers Squibb), pidilizumab (CT-011; CureTech) y lambrolizumab (Merck)). Nivolumab se ha mostrado prometedor en pacientes con melanoma, cáncer de pulmón y riñón. La terapia combinada que comprende nivolumab y el modulador de CTLA-4 ipilimumab también se está evaluando en el cáncer de pulmón. También se están evaluando anticuerpos anti-PDL1 (por ejemplo, BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb), MPDL3280A (Genentech/Roche) y MEDI4736 (Medlmmune)), al igual que los anticuerpos anti-PDL2 (por ejemplo, AMP-224 (Amplimmune/GlaxoSmithKline)).

Se ha implicado a IL-10 en los efectos inhibidores de la ligadura de PD1/PDL1 (vease Said et al., (2010) Nat. Med. 16: 452-59; Wolfle et al., (2011) Eur. J. Immunol. 41: 413-24; Rodríguez-García et al., (abril de 2011) J. Leukoc. Biol. 89 (4): 507-15; y Getts et al., (2011) J. Immunol. 187: 2405-17). En contraste con las sugerencias en la bibliografía, la presente divulgación contempla un enfoque terapéutico prometedor que comprende la combinación de un agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) con un inhibidor de PD1, PD1L o la interacción directa entre PD1/PDL1.

BTLA (atenuador de linfocitos B y T; también conocido como CD272). BTLA es una molécula coinhibidora relacionada estructural y funcionalmente con CTLA-4 y PD-1. Aunque BTLA se expresa en células T CD8+ humanas específicas del virus, se subregula progresivamente después de su diferenciación de un fenotipo no modificado con respecto al efector (Paulos et al., (enero de 2010) J. Clin. Invest. 120 (l): 76- 80). El mediador de entrada del virus del herpes (HVEM; también conocido como TNFRSF14), que se expresa en ciertos tipos de células tumorales (por ejemplo, Melanoma) y células endoteliales asociadas a tumores, se ha identificado como el ligando BTLA. Debido a que las interacciones entre BTLA y HVEM son complejas, las estrategias de inhibición terapéutica son menos sencillas para BTLA que para otros ligandos y receptores inhibidores de puntos de control inmunitario. [Pardoll, (abril de 2012) Nature Rev. Cancer 12: 252-64].

Se han evaluado varios enfoques experimentales dirigidos a la vía BTLA/HVEM utilizando anticuerpos anti-BTLA y HVEM-Ig antagonista, y dichos enfoques han sugerido una utilidad prometedora en una serie de enfermedades, trastornos y afecciones, incluidos trasplantes, infecciones, tumores y enfermedades autoinmunes (Wu et al., (2012) Int. J. Biol. Sci. 8: 1420-30).

Se ha demostrado que el entrecruzamiento de BTLA con un anticuerpo agonista limita la proliferación de células T, la secreción de IFNy e IL-10 (Otsuki et al., (2006) BBRC 344: 1121-27). Además, se demostró que la exposición a IL-10 subregulaba consistentemente la expresión del mensaje de BTLA en las células T CD8+. En conjunto, estos datos sugieren una posible regulación inversa de IL-10 y BTLA, y realizaciones particulares de la presente divulgación contemplan administrar una combinación de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) y un agente anti-BTLA a un sujeto que tiene una respuesta a una enfermedad, trastorno o afección a dicha terapia de combinación.

TIM3 (proteína 3 de la membrana de células T; también conocida como HAVcr2). TIM3 inhibe las respuestas de las células T colaboradoras 1 (TH1) y se ha demostrado que los anticuerpos TIM3 mejoran la inmunidad antitumoral. El ligando de TIM3, galectina 9, está sobrerregulado en varios tipos de cáncer, incluido el cáncer de mama.

Se ha informado que TIM3 se coexpresa con PD1 en células T CD8+ específicas del tumor. Cuando es estimulado por el antígeno de cáncer de testículo NY-ESO-1, el bloqueo dual de ambas moléculas mejora significativamente la proliferación in vitro y la producción de citocinas de las células T humanas. Además, en modelos animales, se informó que el bloqueo coordinado de PD1 y TIM3 mejora las respuestas inmunitarias antitumorales en circunstancias en las que solo se observaron efectos modestos del bloqueo de cada molécula individual. [Véase, por ejemplo, Pardoll, (abril de 2012) Nature Rev. Cancer 12: 252-64; Zhu et al., (2005) Nature Immunol. 6: 1245-52; Ngiow et al., (2011) Cancer Res. 71: 3540-51)].

Se ha demostrado que el bloqueo de TIM-3 sobrerregula IL-10 (véase Zhang, (2012) J. Leukoc. Biol. 91 (2): 189-96; Anderson, (2010) Eur. J. Immunol. 40: 859-66). Aunque no se describe ni se sugiere en la bibliografía, este hallazgo apoya la posibilidad de que pueda existir una sinergia potente cuando se administra un agente anti-TIM3 (por ejemplo, un Ab neutralizante) como parte de un régimen terapéutico que comprende IL-10.

LAG3 (gen 3 de activación de linfocitos; también conocido como CD233). Se ha demostrado que LAG3 desempeña un papel en la mejora de la función de las células T reguladoras (TReg) e independientemente en la inhibición de las funciones de las células T efectoras CD8+. Las moléculas de MHC de clase II, el ligando para LAG3, se sobrerregulan en algunos cánceres epiteliales (a menudo en respuesta a IFNy) y también se expresan en macrófagos infiltrantes de tumores y células dendríticas. Aunque el papel de la interacción LAG3-MHC de clase II no se ha dilucidado definitivamente, la interacción puede ser un componente clave en el papel de LAG3 en la mejora de la función de las células TReg.

LAG3 es uno de varios receptores de puntos de control inmunitarios que están sobrerregulados de manera coordinada tanto en las células TReg como en las células T anérgicas. El bloqueo simultáneo de LAG3 y PD1 puede provocar una mayor inversión del estado anérgico en comparación con el bloqueo de un receptor solo. De hecho, se ha demostrado que el bloqueo de LAG3 y PD1 revierte sinérgicamente la anergia entre las células T CD8+ específicas del tumor y las células T CD8+ específicas del virus en el contexto de una infección crónica. IMP321 (ImmuFact) se está evaluando en melanoma, cáncer de mama y carcinoma de células renales [Véase en general Woo et al., (2012) Cancer Res 72: 917-27; Goldberg et al., (2011) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 344: 269-78; Pardoll, (abril de 2012) Nature Rev. Cancer 12: 252-64; Grosso et al., (2007) J. Clin. Invertir. 117: 3383-392].

También se ha demostrado que LAG3 es un marcador para las células TReg que expresan IL-10 (Camisaschi et. al., (2010) J. Immunol. 184). Se ha demostrado que estas células positivas para LAG3 aumentan en pacientes con cáncer y existe la creencia de que la IL-10 está involucrada en la promoción de la supresión inmunitaria. Una realización particular de la presente divulgación contempla la terapia de combinación que comprende LAG3 e IL-10.

A2aR (receptor A2aR de adenosina A2a; también conocido como Adora2a). A2aR inhibe las respuestas de las células T estimulando las células T CD4+ para que se conviertan en células TReg. El A2aR es particularmente importante en la inmunidad tumoral porque la tasa de muerte celular en los tumores por recambio celular es alta y las células moribundas liberan adenosina, que es el ligando para A2aR. Además, la eliminación de A2aR se ha asociado con respuestas inflamatorias mejoradas y en ocasiones patológicas a la infección.

La inhibición de A2aR puede efectuarse mediante anticuerpos que bloquean la unión de adenosina o mediante análogos de adenosina. Dichos agentes pueden ser útiles en trastornos tales como el cáncer y la enfermedad de Parkinson [Véase en general, Zarek et al., (2008) Blood 111: 251-59; Waickman et al., (25 de noviembre de 2011) Cancer Immunol. Immunother. (doi: 10. 1007/s00262-011-1155-7)]. La terapia de combinación con tales agentes e IL-10 se contempla específicamente en la presente divulgación.

Receptores inhibidores asesinos. Los receptores inhibidores asesinos se pueden dividir en dos clases según sus características estructurales: i) receptores similares a inmunoglobulinas de células asesinas (KIR) y ii) receptores de lectina de tipo C (miembros de la familia de receptores transmembrana tipo II). Aunque todavía se están investigando las funciones de estos receptores, se sabe que son reguladores importantes de la actividad destructora de las células NK, y la activación de las células NK puede proporcionar una potente actividad antitumoral. También se cree que desempeñan un papel inhibidor sobre las células T y las APC (por ejemplo, células dendríticas). KIR IgG4 (lirilumab; Bristol-Myers Squibb) se está investigando en el cáncer de pulmón.

Aunque la mayoría de los receptores inhibidores asesinos son específicos para subconjuntos de antígenos leucocitarios humanos (por ejemplo, HLA) y poseen especificidad de alelo, otros reconocen moléculas de expresión amplia. La inhibición de miembros de la familia de células NK puede presentar un enfoque único para modular las respuestas inmunes antitumorales, y la terapia de combinación que comprende un agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) se divulga en la presente divulgación [Véase Raulet, (2006) Semm. Immunol. 18: 145-50; Plougastel et al., (2006) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 298: 77-89].

Puntos de control inmunitario adicionales. En la bibliografía se han descrito otros puntos de control inmunitario menos definidos. Incluyen tanto receptores (por ejemplo, el receptor 2B4 (también conocido como CD244)) como ligandos (por ejemplo, ciertos ligandos inhibidores de la familia B7 como B7-H3 (también conocido como CD276) y B7-H4 (también conocido como B7-S1, B7x y VCTN1)). [Véase Pardoll, (abril de 2012) Nature Rev. Cancer 12: 252-64]. B7-H3 y B7-H4 son miembros de la superfamilia B7 que incluye CTLA4 y PD1. B7-H3, un ligando que inhibe la activación de las células T, se está evaluando en varios cánceres refractarios (MGA271; MacroGenics).

La IDO (indolamina 2,3-dioxigenasa) es una enzima reguladora inmunitaria que normalmente se expresa en células tumorales y en células inmunes activadas. IDO subregula la respuesta inmune mediada a través de la oxidación del triptófano. Esto da como resultado la inhibición de la activación de las células T y la inducción de la apoptosis de las células T, creando un entorno en el que los linfocitos T citotóxicos específicos del tumor se vuelven funcionalmente inactivos o ya no pueden atacar las células cancerosas de un sujeto. Indoximod (NewLink Genetics) es un inhibidor de IDO que se está evaluando en el cáncer de mama metastásico.

La presente divulgación contempla el uso de inhibidores de estos y otros puntos de control inmunitarios, conocidos y aún por dilucidar y/o identificados por completo, en combinación con los agentes de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) como se describe en este documento.

Consideraciones terapéuticas. Muchas células tumorales expresan múltiples ligandos inhibidores y los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) expresan múltiples receptores inhibidores. Al considerar los mecanismos de acción de los inhibidores de varios puntos de control inmunitario, entra en juego la diversidad de funciones inmunes que regulan. Por ejemplo, CTLA4 y PD1 regulan las respuestas inmunitarias a diferentes niveles y mediante diferentes mecanismos.

Por lo tanto, la inmunidad antitumoral se puede potenciar en múltiples niveles y se pueden generar estrategias combinatorias en vista de diversas consideraciones mecánicas.

En vista de lo anterior, en muchos casos la inmunidad antitumoral puede mejorarse mediante un bloqueo doble o triple (o posiblemente más) de los puntos de control inmunitarios. Se han descrito en la técnica anticuerpos multiespecíficos. Por ejemplo, la publicación de la patente de los Estados Unidos 2013/0156774 describe agentes biespecíficos y multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos), y procedimientos para su uso, para dirigirse a células que coexpresan PD1 y TIM3. Además, se ha demostrado que el bloqueo dual de BTLA y PD1 mejora la inmunidad antitumoral (Pardoll, (abril de 2012) Nature Rev. Cancer 12: 252-64).

La presente divulgación contempla el uso de un agente de PEG-IL-10 en la forma descrita en el presente documento en combinación con las estrategias descritas anteriormente para dirigirse a múltiples inhibidores del punto de control inmunitario.

Las respuestas terapéuticas a los inhibidores del punto de control inmunitario generalmente se manifiestan mucho más tarde que las respuestas a las quimioterapias tradicionales y los inhibidores de tirosina quinasa. De hecho, pueden pasar seis meses o más después del inicio del tratamiento con inhibidores del punto de control inmunitario antes de que se observen indicios objetivos de una respuesta terapéutica. Además, en algunos casos que involucran la terapia con anticuerpos anti-CTLA4, las lesiones metastásicas en realidad aumentan de tamaño en la tomografía computarizada (TC) o las imágenes por resonancia magnética (IRM) antes de experimentar regresión posterior; esto parece deberse a una mayor infiltración de células inmunitarias [Véase, por ejemplo, Pardoll, (abril de 2012) Nature Rev. Cancer 12: 252-64]. Por lo tanto, la determinación de si el tratamiento con un inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario en combinación con un agente de IL-10 de la presente divulgación (por ejemplo, PEG-IL-10) debe realizarse durante un tiempo de progresión que es frecuentemente más tiempo que con las terapias convencionales.

Procedimientos y modelos asociados con inhibidores del punto de control inmunitario. En el presente documento se divulgan diversos procedimientos y modelos para identificar poblaciones de sujetos candidatos (o sujetos individuales) que tienen una enfermedad o enfermedades, trastorno o trastornos o afección o afecciones que pueden responder a las terapias de combinación descritas en este documento (es decir, IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) en combinación con uno o más inhibidores del punto de control inmunitario). Como se divulga en el presente documento, los procedimientos y modelos permiten determinar si la administración de la combinación da como resultado un efecto aditivo o sinérgico. En otras realizaciones, los procedimientos y modelos permiten determinar si la administración de la combinación da como resultado menos efectos adversos. El uso de procedimientos y/o modelos in vitro, ex vivo e in vivo se divulga en el presente documento. La población de sujetos (o un sujeto individual) es un animal no humano (por ejemplo, un roedor) o un ser humano.

A modo de ejemplo, pero no de limitación, un aspecto de la presente divulgación contempla un procedimiento para determinar si un sujeto de prueba que tiene una enfermedad, trastorno o afección descrita en este documento (por ejemplo, una afección cancerosa) es un candidato para el tratamiento con una combinación de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) y uno o más inhibidores del punto de control inmunitario, comprendiendo el procedimiento a) proporcionar a un sujeto de prueba que tenga indicios de dicha enfermedad, trastorno o afección, b) coadministrar la combinación al sujeto de prueba, en la que la combinación es suficiente para lograr una respuesta deseada en una población de referencia, y c) determinar si el sujeto de prueba exhibe la respuesta deseada; en la que la determinación de la respuesta deseada indica que el sujeto de prueba es un candidato para el tratamiento con la combinación.

La respuesta deseada puede ser cualquier resultado que se considere favorable bajo las circunstancias. Como se divulga en el presente documento, la respuesta deseada es la prevención de la progresión de la enfermedad, trastorno o afección, mientras que en otras realizaciones la respuesta deseada es una regresión o estabilización de una o más características de la enfermedad, trastorno o afecciones (por ejemplo, reducción del tamaño del tumor). Como se divulga adicionalmente en el presente documento, la respuesta deseada es la reducción o eliminación de uno o más efectos adversos asociados con uno o más agentes de la combinación.

Como se indicó anteriormente, la presente divulgación también contempla varios modelos. Se puede utilizar cualquier modelo que proporcione resultados confiables y reproducibles. El experto en la materia está familiarizado con modelos que pueden usarse junto con el tema de la presente divulgación; como se divulga en el presente documento, la combinación se evalúa en un modelo que comprende un sujeto no humano (por ejemplo, un ratón). En el presente documento se divulga además un modelo para determinar si una combinación de IL-10 y uno o más inhibidores del punto de control inmunitario es un candidato para tratar una enfermedad, trastorno o afección descrita en este documento (por ejemplo, una afección cancerosa).

En el presente documento se divulga un procedimiento o modelo para determinar la cantidad óptima de un agente o agentes en una combinación. Una cantidad óptima puede ser, por ejemplo, una cantidad que logre un efecto óptimo en un sujeto o población de sujetos, o una cantidad que logre un efecto terapéutico mientras minimiza o elimina los efectos adversos asociados con uno o más de los agentes. Como se divulga en el presente documento, se sabe que la combinación de IL-10 e inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario en sí misma es, o se ha determinado que es, eficaz para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección descrita en este documento (por ejemplo, una afección cancerosa) en un sujeto (por ejemplo, un ser humano) o en una población de sujetos, y se titula una cantidad de un agente mientras que la cantidad del otro u otros agentes se mantiene constante. Al manipular las cantidades del agente o agentes de esta manera, un médico puede determinar la proporción de agentes más eficaces para, por ejemplo, tratar una enfermedad, trastorno o afección en particular, o eliminar los efectos adversos o reducir los efectos adversos de tal manera que sean aceptables dadas las circunstancias.

Biomarcadores asociados con inhibidores del punto de control inmunitario. La presente divulgación también contempla el uso de biomarcadores junto con los procedimientos y modelos descritos en este documento. El término "biomarcador o biomarcadores" se refiere a una característica que se mide y evalúa objetivamente como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patógenos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica. El indicador puede ser cualquier sustancia, estructura o proceso que pueda medirse en el cuerpo o sus productos e influya o prediga la incidencia del resultado o enfermedad.

Como se divulga en el presente documento, se usa un biomarcador o biomarcadores para predecir una respuesta o respuestas clínicas a la terapia de combinación con IL-10-inhibidor de punto de control inmunitario. En algunos casos, se puede usar un biomarcador previo al tratamiento en tal terapia en la que el biomarcador se ha validado hasta el punto en el que podría aplicarse como parte de la toma de decisiones terapéuticas estándar de atención.

En el presente documento se divulga el uso de cualquier biomarcador que pueda proporcionar información reproducible útil en cualquier aspecto de la terapia con lL-10-inhibidor de punto de control inmunitario, incluida la existencia y extensión de la respuesta de un sujeto a dicha terapia y la existencia y extensión de efectos adversos causados por dicha terapia. A modo de ejemplo, pero no de limitación, los biomarcadores asociados con PD1/PDL1 incluyen la potenciación de IFNy y la sobrerregulación de granzima A, granzima B y perforina; los biomarcadores asociados con BTLA incluyen un aumento en el número y la función de células T CD8+; los biomarcadores asociados con CTLA4 incluyen potenciación de IFNy, sobrerregulación de granzima A, granzima B y perforina, y un incremento en la expresión de ICOS en células T CD8+; los biomarcadores asociados con TIM3 incluyen sobrerregulación de granzima A, granzima B y perforina; y los biomarcadores asociados con LAG3 incluyen la potenciación de las células TReg que expresan IL-10. La expresión de las moléculas efectoras IP-10 (proteína inducible 10) y MIG (monocina inducida por IFNy) se sabe que aumentan en ciertos tumores que expresan IL-10 ya sea por LPS o IFNy; estas moléculas efectoras también pueden aprovecharse como posibles biomarcadores en suero que pueden potenciarse mediante las terapias combinatorias descritas en el presente documento.

Concentraciones en suero

Los niveles de IL-10 en plasma sanguíneo en los procedimientos descritos en este documento se pueden caracterizar de varias maneras, que incluyen: (1) una concentración mínima media de IL-10 en suero por encima de algún nivel especificado o en un intervalo de niveles; (2) una concentración mínima media en suero de IL-10 por encima de un nivel especificado durante un período de tiempo; (3) un nivel de concentración en suero de Il-10 estacionario por encima o por debajo de un nivel especificado o en un intervalo de niveles; o (4) una Cmáx. del perfil de concentración por encima o por debajo de algún nivel especificado o en algún intervalo de niveles. Como se expone en el presente documento, se ha encontrado que las concentraciones mínimas medias de IL-10 en suero son de particular importancia para la eficacia en ciertas indicaciones.

En algunas realizaciones de la presente invención, los perfiles de concentración de nivel en suero que se pueden producir incluyen: una concentración mínima media en suero de IL-10 superior a aproximadamente 1,0 ng/ml. Como se divulga en el presente documento, los perfiles de concentración de nivel en suero o plasma sanguíneo que pueden ser producidos incluyen: una concentración mínima media en plasma y/o suero de IL-10 superior a aproximadamente 1,0 pg/ml, superior a aproximadamente 10,0 pg/ml, superior a aproximadamente 20,0 pg/ml, superior a aproximadamente 30 pg/ml, superior a aproximadamente 40 pg/ml, superior a aproximadamente 50,0 pg/ml, superior a aproximadamente 60,0 pg/ml, superior a aproximadamente 70,0 pg/ml, superior a aproximadamente 80,0 pg/ml, superior a aproximadamente 90 pg/ml, superior a aproximadamente 0,1 ng/ml, superior a aproximadamente 0,2 ng/ml, superior a aproximadamente 0,3 ng/ml, superior a aproximadamente 0,4 ng/ml, superior a aproximadamente 0,5 ng/ml, superior a aproximadamente 0,6 ng/ml, superior a aproximadamente 0,7 ng/ml, superior a aproximadamente 0,8 ng/ml, superior a aproximadamente 0,9 ng/ml, superior a aproximadamente 1,0 ng/ml, superior a aproximadamente 1,5 ng/ml, superior a aproximadamente 2,0 ng/ml, superior a aproximadamente 2,5 ng/ml, superior a aproximadamente 3,0 ng/ml, superior a aproximadamente 3,5 ng/ml, superior a aproximadamente 4,0 ng/ml, superior a aproximadamente 4,5 ng/ml, superior a aproximadamente 5,0 ng/ml, superior a aproximadamente 5,5 ng/ml, superior a aproximadamente 6,0 ng/ml, superior a aproximadamente 6,5 ng/ml, superior a aproximadamente 7,0 ng/ml, superior a aproximadamente 7,5 ng/ml, superior a aproximadamente 8,0 ng/ml, superior a aproximadamente 8,5 ng/ml, superior a aproximadamente 9,0 ng/ml, superior a aproximadamente 9,5 ng/ml o superior a aproximadamente 10,0 ng/ml.

En realizaciones particulares de la presente invención, la concentración mínima media en suero de IL-10 es al menos 1,5 ng/ml, o al menos 2,0 ng/ml, y/o en el que la concentración mínima media en suero de IL-10 se mantiene durante al menos 95% del periodo de tiempo de administración. Como se divulga en el presente documento una concentración mínima media en suero de IL-10 está en el intervalo de 1,0 pg/ml a 10 ng/ml. Como se divulga adicionalmente en el presente documento, la concentración mínima media en suero de IL-10 está en el intervalo de 1,0 pg/ml a 100 pg/ml.

Como se divulga adicionalmente en el presente documento, la concentración mínima media en suero de IL-10 está en el intervalo de 0,1 ng/ml a 1,0 ng/ml. Como se divulga adicionalmente en el presente documento la concentración mínima media en suero de IL-10 está en el intervalo de 1,0 ng/ml a 10 ng/ml. Debe entenderse que la presente invención contempla intervalos que incorporan cualquier concentración comprendida por las expuestas en el presente documento, incluso si dichos intervalos no se mencionan explícitamente. A modo de ejemplo, la concentración media en suero de IL-10 como se divulga en el presente documento puede estar en el intervalo de 0,5 ng/ml a 5 ng/ml. A modo de ejemplos adicionales, en el presente documento se divulga, una concentración mínima media en suero de IL-10 en un intervalo de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 10,5 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 10,0 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 9,0 ng/ml, de aproximadamente 1.0 ng/ml a aproximadamente 8,0 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 7,0 ng/ml, de aproximadamente 1,5 ng/ml a aproximadamente 10,0 ng/ml, de aproximadamente 1,5 ng/ml a aproximadamente 9,0 ng/ml, de aproximadamente 1,5 ng/ml a aproximadamente 8,0 ng/ml, de aproximadamente 1,5 ng/ml a aproximadamente 7,0 ng/ml, de aproximadamente 2,0 ng/ml a aproximadamente 10,0 ng/ml, desde aproximadamente 2.0 ng/ml hasta aproximadamente 9,0 ng/ml, desde aproximadamente 2,0 ng/ml hasta aproximadamente 8,0 ng/ml y desde aproximadamente 2,0 ng/ml hasta aproximadamente 7,0 ng/ml.

Como se divulga en el presente documento, una concentración mínima media en suero de IL-10 de 1-2 ng/ml se mantiene durante la duración del tratamiento. Como se divulga adicionalmente en el presente documento la concentración máxima media en suero de IL-10 es menor o igual a aproximadamente 10,0 ng/ml durante la duración del tratamiento. En el presente documento se divulga además una concentración mínima media en suero de IL-10 mayor o igual a aproximadamente 1,0 pg/ml. La concentración óptima media en suero es generalmente aquella a la que se logra el efecto terapéutico deseado sin introducir efectos adversos no deseados.

En el presente documento se divulga un procedimiento para monitorizar a un sujeto que recibe terapia con IL-10 para predecir, y así potencialmente evitar, efectos adversos, comprendiendo el procedimiento: (1) medir la concentración máxima de IL-10 en el sujeto; (2) medir la concentración mínima de IL-10 en el sujeto; (3) calcular una fluctuación máxima-mínima; y (4) usar la fluctuación máxima-mínima calculada para predecir los efectos adversos potenciales en el sujeto. En poblaciones de sujetos particulares, una fluctuación de máxima-mínima más pequeña indica una menor probabilidad de que el sujeto experimente efectos adversos relacionados con la IL-10. Además, en algunos realizaciones, las fluctuaciones particulares máxima-mínima se determinan para el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones particulares usando parámetros de dosificación particulares, y esas fluctuaciones se usan como patrones de referencia.

Para la mayoría de los fármacos, las concentraciones en plasma del fármaco disminuyen de una manera multiexponencial. Inmediatamente después de la administración intravenosa, el fármaco se distribuye rápidamente a través de un espacio inicial (mínimo definido como el volumen plasmático) y luego ocurre una distribución equilibrada más lenta a los espacios extravasculares (por ejemplo, ciertos tejidos). La administración intravenosa de IL-10 está asociada con dicho modelo cinético de dos compartimientos (vease Rachmawati, H. et al., (2004) Pharm. Res. 21 (11): 2072-78). También se ha estudiado la farmacocinética de la hIL-10 recombinante subcutánea (Radwanski, E. et al., (1998) Pharm. Res. 15 (12): 1895-1901). Por lo tanto, las consideraciones sobre el volumen de distribución son pertinentes cuando se evalúan los parámetros apropiados relacionados con la dosificación de IL-10. Además, se han explorado los esfuerzos para dirigir agentes de IL-10 a tipos de células específicos (véase, por ejemplo, Rachmawati, H. (mayo de 2007) Drug Met. Dist. 35 (5): 814-21), y el aprovechamiento de los principios farmacocinéticos y de dosificación de IL-10 pueden resultar invaluables para el éxito de tales esfuerzos.

La presente invención contempla la administración de cualquier dosis y régimen de dosificación que dé como resultado el mantenimiento de cualquiera de las concentraciones mínimas en suero de IL-10 establecidas anteriormente. A modo de ejemplo, cuando el sujeto es un ser humano, se puede administrar hlL-10 no pegilado a una dosis mayor de 0,5 pg/kg/día, mayor de 1,0 pg/kg/día, mayor de 2,5 pg/kg/día, mayor de 5 pg/kg/día, mayor a 7,5 pg/kg/día, mayor de 10.0 pg/kg/día, mayor de 12,5 pg/kg/día, mayor de 15 pg/kg/día, mayor de 17,5 pg/kg/día, mayor de 20 pg/kg/día, mayor de 22,5 pg/kg/día, mayor de 25 pg/kg/día, mayor de 30 pg/kg/día o mayor de 35 pg/kg/día. Además, a modo de ejemplo, pero no de limitación, cuando el sujeto es un ser humano, la hIL-10 pegilada que comprende un PEG relativamente pequeño (por ejemplo, mono o di-PEG-hlL-10 de 5 kDa) se puede administrar a una dosis mayor de 0,5 pg/kg/día, mayor de 0,75 pg/kg/día, mayor de 1,0 pg/kg/día, mayor de 1,25 pg/kg/día, mayor de 1,5 pg/kg/día, mayor de 1,75 pg/kg/día, mayor de 2,0 pg/kg/día, mayor de 2,25 pg/kg/día, mayor de 2,5 pg/kg/día, mayor de 2,75 pg/kg/día, mayor de 3,0 pg/kg/día, mayor de 3,25 pg/kg/día, mayor de 3,5 pg/kg/día, mayor de 3,75 pg/kg/día, mayor de 4,0 pg/kg/día, mayor de 4,25 pg/kg/día, mayor de 4,5 pg/kg/día, mayor de 4,75 pg/kg/día o mayor de 5,0 pg/kg/día.

Aunque la discusión anterior referente a las concentraciones en suero de IL-10, las dosis y los protocolos de tratamiento que son necesarios para lograr concentraciones en suero particulares de IL-10, etc., se refiere a la monoterapia con un agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10), en determinadas realizaciones tales dosis, protocolos de tratamiento, etc. también son relevantes para regímenes terapéuticos que comprenden un agente de IL-10 en combinación con uno o más inhibidores del punto de control inmunitario. Por ejemplo, un régimen de dosificación de PEG-IL-10 puede ser el mismo cuando se administra solo o cuando se administra en combinación con un antagonista de PD1 porque el antagonista de PEG-IL-10 y PD1 tienen distintos mecanismos de acción que permiten que los agentes se combinen sin modificaciones en sus parámetros de dosificación. Sin embargo, tales combinaciones pueden permitir modificaciones al régimen de dosificación normal de PEG-IL-10 y/o el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario. Por ejemplo, se puede reducir la dosis terapéutica de uno o ambos agentes, se puede reducir la frecuencia de dosificación de uno o ambos agentes, y/o se puede acortar la duración de la terapia de uno o ambos agentes, mientras se retiene el efecto terapéutico deseado.

El experto en la materia (por ejemplo, un farmacólogo) es capaz de determinar el régimen o los regímenes de dosificación óptimos cuando se administra un agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) en combinación con un inhibidor o inhibidores de punto de control inmunitario. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, el régimen de dosificación óptimo de PEG-IL-10 puede requerir una reducción en la cantidad de PEG-IL-10 administrada por dosis (por ejemplo, menos de 1,0 pg/kg/día, menos de 0,75 pg/kg/día, menos de 0,5 pg/kg/día, menos de 0,25 pg/kg/día o menos de 0,125 pg/kg/día). En ciertas realizaciones ejemplares de la presente invención, se mantiene una concentración mínima media en suero de IL-10 de al menos el agente de IL-10 mayor de 1 ng/ml durante e 90% del periodo de tiempo de administración. Como se divulga en el presente documento una concentración mínima media en suero de IL_10 puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 9,5 ng/ml, de aproximadamente 0,25 ng/ml a aproximadamente 8,0 ng/ml, de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 7,0 ng/ml, de aproximadamente 0,75 ng/ml a aproximadamente 6,0 ng/ml, o de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 5,0 ng/ml.

Cuando se administra un agente de IL-10 en combinación con un inhibidor del punto de control inmunitario, uno o más de los parámetros de dosificación del agente de IL-10 aplicable a la monoterapia pueden modificarse mientras que los parámetros de dosificación del inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario aplicable a la monoterapia puede permanecer igual; uno o más de los parámetros de dosificación del agente de IL-10 aplicables a la monoterapia pueden permanecer iguales mientras que uno o más de los parámetros de dosificación del inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario aplicables a la monoterapia pueden modificarse; uno o más de los parámetros de dosificación del agente de IL-10 y el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario aplicables a la monoterapia se pueden modificar; o los parámetros de dosificación de cada uno del agente de IL-10 y el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario aplicables a la monoterapia pueden permanecer iguales.

Procedimientos de producción de IL-10

Un polipéptido de la presente invención se puede producir mediante cualquier procedimiento adecuado, incluidos los procedimientos no recombinantes (por ejemplo, síntesis química) y recombinantes.

A. Síntesis química

Cuando un polipéptido se sintetiza químicamente, la síntesis puede proceder a través de fase líquida o fase sólida. La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) permite la incorporación de aminoácidos no naturales y/o la modificación de la estructura de péptidos/proteínas. Varias formas de SPPS, tales como 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) y tbutiloxicarbonilo (Boc), están disponibles para sintetizar polipéptidos de la presente divulgación. Los detalles de las síntesis químicas se conocen en la técnica (por ejemplo, Ganesan A. (2006) Mini Rev. Med. Chem. 6: 3-10; y Camarero JA et al., (2005) Protein Pept Lett. 12: 723-8).

La síntesis de péptidos en fase sólida se puede realizar como se describe a continuación. Las funciones alfa (Na) y cualquier cadena lateral reactiva están protegidas con grupos lábiles a ácidos o lábiles a bases. Los grupos protectores son estables en las condiciones para unir enlaces amida, pero pueden escindirse fácilmente sin dañar la cadena peptídica que se ha formado. Los grupos protectores adecuados para la función a-amino incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: Boc, benciloxicarbonilo (Z), O-clorbenciloxicarbonilo, bi-fenilisopropiloxicarbonilo, tercamiloxicarbonilo (Amoc), a ,a-dimetil-3,5-dimetoxi-benciloxicarbonilo, o-nitrosulfenilo, 2-ciano-t-butoxicarbonilo, Fmoc, 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxocilohex-1-iliden)etilo (Dde) y similares.

Los grupos protectores adecuados de cadena lateral incluyen, pero no se limitan a: acetilo, alilo (All), aliloxicarbonilo (Alloc), bencilo (Bzl), benciloxicarbonilo (Z), t-butiloxicarbonilo (Boc), benciloximetilo (Bom), o-bromobencil oxicarbonilo, t-butilo (tBu), t-butildimetilsililo, 2-clorobencilo, 2-clorobenciloxicarbonilo, 2,6-diclorobencilo, ciclohexilo, ciclopentilo, 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo (Dde), isopropilo, 4-metoxi-2,3-6-trimetilbencilsulfonilo (Mtr), 2,3,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc), pivalilo, tetrahidropiran-2-ilo, tosilo (Tos), 2,4,6-trimetoxibencilo, trimetilsililo y tritilo (Trt).

En la síntesis en fase sólida, el aminoácido del terminal C se acopla a un material de soporte adecuado. Los materiales de soporte adecuados son aquellos que son inertes frente a los reactivos y las condiciones de reacción para las reacciones de condensación y escisión escalonadas del proceso de síntesis y que no se disuelven en los medios de reacción que se utilizan. Ejemplos de los materiales de soporte disponibles comercialmente incluyen copolímeros de estireno/divinilbenceno que se han modificado con grupos reactivos y/o polietilenglicol; copolímeros de estireno/divinilbenceno clorometilados; copolímeros de estireno/divinilbenceno hidroximetilados o aminometilados y similares. Cuando se desea la preparación del ácido peptídico, se puede utilizar poliestireno (1%) - divinilbenceno o TentaGel® derivatizado con alcohol 4-benciloxibencílico (ancla de Wang) o cloruro de 2-clorotritilo. En el caso de la amida peptídica, se puede usar poliestireno (1%) - divinilbenceno o TentaGel® derivatizado con ácido 5-(4'aminometil)-3',5'-dimetoxifenoxi)valérico (ancla de PAL) o un grupo p-(2,4-dimetoxifenil-amino-metil)-fenoxi (ancla de amida de Rink).

El enlace con el soporte polimérico se puede lograr haciendo reaccionar el aminoácido protegido con Fmoc del terminal C con el material de soporte mediante la adición de un reactivo de activación en etanol, acetonitrilo, N,N-dimetilformamida (DMF), diclorometano, tetrahidrofurano, N-metilpirrolidona o disolventes similares a temperatura ambiente o temperaturas elevadas (por ejemplo, entre 40 °C y 60 °C) y con tiempos de reacción de, por ejemplo, 2 a 72 horas.

El acoplamiento del aminoácido protegido con Na (por ejemplo, el aminoácido Fmoc) al ancla PAL, Wang o Rink se puede realizar, por ejemplo, con la ayuda de reactivos de acoplamiento tales como N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) u otras carbodiimidas, tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1, 3,3-tetrametiluronio (TBTu ) u otras sales de uronio, O-acil-ureas, hexafluorofosfato de benzotriazol1-il-tris-pirrolidinofosfonio (PyBOP) u otras sales de fosfonio, N-hidroxisuccinimidas, otras N-hidroxiimidas u oximas en presencia o ausencia de 1-hidroxibenzotriazol o 1-hidroxi-7-azabenzotriazol, por ejemplo, con la ayuda de TBTU con la adición de HOBt, con o sin la adición de una base tal como, por ejemplo, diisopropiletilamina (DIEA), trietilamina o N-metilmorfolina, por ejemplo, diisopropiletilamina con tiempos de reacción de 2 a 72 horas (por ejemplo, 3 horas en un exceso de 1,5 a 3 veces el aminoácido y los reactivos de acoplamiento, por ejemplo, en un exceso de 2 veces y a temperaturas entre aproximadamente 10 °C y 50 °C, por ejemplo, 25 °C en un disolvente tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidona o diclorometano, por ejemplo, dimetilformamida).

En lugar de los reactivos de acoplamiento, también es posible usar los ésteres activos (por ejemplo, pentafluorofenilo, p-nitrofenilo o similares), el anhídrido simétrico del aminoácido Na-Fmoc, su cloruro de ácido o fluoruro de ácido, en las condiciones descritas anteriormente.

El aminoácido protegido con Na (por ejemplo, el aminoácido Fmoc) se puede acoplar a la resina de 2-clorotritilo en diclorometano con la adición de DIEA y con tiempos de reacción de 10 a 120 minutos, por ejemplo, 20 minutos, pero sin limitarse al uso de este disolvente y esta base.

El acoplamiento sucesivo de los aminoácidos protegidos se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos convencionales en la síntesis de péptidos, típicamente en un sintetizador de péptidos automatizado. Después de la escisión del grupo protector Na-Fmoc del aminoácido acoplado en la fase sólida mediante tratamiento con, por ejemplo, piperidina (10% a 50%) en dimetilformamida durante 5 a 20 minutos, por ejemplo, 2 x 2 minutos con piperidina al 50% en DMF y 1 x 15 minutos con piperidina al 20% en DMF, el siguiente aminoácido protegido en un exceso de 3 a 10 veces, por ejemplo, en un exceso de 10 veces, se acopla al aminoácido anterior en un disolvente polar inerte, no acuoso, tal como diclorometano, DMF o mezclas de los dos y a temperaturas entre aproximadamente 10 °C y 50 °C, por ejemplo, a 25 °C. Los reactivos mencionados anteriormente para acoplar el primer aminoácido Na-Fmoc al ancla PAL, Wang o Rink son adecuados como reactivos de acoplamiento. También se pueden utilizar como alternativa ésteres activos del aminoácido protegido, o cloruros o fluoruros o anhídridos simétricos de los mismos.

Al final de la síntesis en fase sólida, el péptido se escinde del material de soporte mientras se escinden simultáneamente los grupos protectores de la cadena lateral. La escisión se puede llevar a cabo con ácido trifluoroacético u otros medios fuertemente ácidos con adición de 5% - 20% V/V de depuradores tales como dimetilsulfuro, etilmetilsulfuro, tioanisol, tiocresol, m-cresol, anisol etanoditiol, fenol o agua, por ejemplo, 15% v/v dimetilsulfuro/etanoditiol/m-cresol 1:1:1, dentro de 0,5 a 3 horas, por ejemplo, 2 horas. Los péptidos con cadenas laterales totalmente protegidas se obtienen escindiendo el ancla de 2-clorotritilo con ácido acético glacial/trifluoroetanol/diclorometano 2:2:6. El péptido protegido se puede purificar mediante cromatografía en gel de sílice. Si el péptido se une a la fase sólida mediante el ancla de Wang y si se pretende obtener un péptido con una alquilamidación del terminal C, la escisión se puede realizar mediante aminólisis con una alquilamina o fiuoroalquilamina. La aminólisis se lleva a cabo a temperaturas entre aproximadamente -10 °C y 50 °C (por ejemplo, aproximadamente 25 °C) y tiempos de reacción entre aproximadamente 12 y 24 horas (por ejemplo, aproximadamente 18 horas). Además, el péptido puede separarse del soporte mediante reesterificación, por ejemplo, con metanol.

La solución ácida que se obtiene se puede mezclar con una cantidad de 3 a 20 veces de éter frío o n-hexano, por ejemplo, un exceso de 10 veces de éter dietílico, para precipitar el péptido y, por lo tanto, separar los depuradores y grupos protectores escindidos que permanecen en el éter. Puede llevarse a cabo una purificación adicional volviendo a precipitar el péptido varias veces a partir de ácido acético glacial. El precipitado que se obtiene puede recogerse en agua o terc-butanol o mezclas de los dos disolventes, por ejemplo, una mezcla 1:1 de terc-butanol/agua, y liofilizarse.

El péptido obtenido se puede purificar mediante varios procedimientos cromatográficos, incluido el intercambio iónico sobre una resina débilmente básica en forma de acetato; cromatografía de adsorción hidrófoba sobre copolímeros de poliestireno/divinilbenceno no derivatizados (por ejemplo, Amberlite® XAD); cromatografía de adsorción sobre gel de sílice; cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, en carboximetilcelulosa; cromatografía de distribución, por ejemplo, en Sephadex® G-25; cromatografía de distribución en contracorriente; o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), por ejemplo, HPLC de fase reversa en fases de octilo u octadecil-silil-sílice (ODS).

B. Producción recombinante

Se pueden encontrar procedimientos que describen la preparación de IL-10 humana y de ratón, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5.231.012, que enseña procedimientos para la producción de proteínas que tienen actividad de IL-10, incluidas técnicas recombinantes y otras técnicas de síntesis. La IL-10 puede ser de origen viral, y la clonación y expresión de una IL-10 viral del virus de Epstein Barr (proteína BCRF1) se describe en Moore et al., (1990) Science 248: 1230. Puede obtenerse IL-10 de varias formas usando técnicas estándar conocidas en el arte, tales como las descritas en este documento. La IL-10 humana recombinante también está disponible comercialmente, por ejemplo, a través de PeproTech, Inc., Rocky Hill, N.J.

Cuando se produce un polipéptido usando técnicas recombinantes, el polipéptido se puede producir como una proteína intracelular o como una proteína secretada, usando cualquier constructo adecuada y cualquier célula huésped adecuada, que puede ser una célula procariota o eucariota, tal como una célula huésped bacteriana (por ejemplo, E. coli) o de levadura, respectivamente. Otros ejemplos de células eucariotas que pueden usarse como células huésped incluyen células de insectos, células de mamíferos y/o células vegetales. Cuando se utilizan células huésped de mamífero, pueden incluir células humanas (por ejemplo, células HeLa, 293, H9 y Jurkat); células de ratón (por ejemplo, NIH3T3, células L y células C127); células de primates (por ejemplo, Cos 1, Cos 7 y CV1); y células de hámster (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO)).

Puede emplearse una variedad de sistemas huésped-vector adecuados para la expresión de un polipéptido de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989 Current Protocols in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, Nueva York; y Ausubel et al., 1995 Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Wiley and Sons. Los procedimientos para la introducción de material genético en las células huésped incluyen, por ejemplo, procedimientos de transformación, electroporación, conjugación, fosfato de calcio y similares. El procedimiento de transferencia puede seleccionarse para proporcionar una expresión estable del ácido nucleico que codifica el polipéptido introducido. El ácido nucleico que codifica el polipéptido puede proporcionarse como un elemento episómico heredable (por ejemplo, un plásmido) o puede integrarse genómicamente. Están disponibles comercialmente una variedad de vectores apropiados para su uso en la producción de un polipéptido de interés.

Los vectores pueden proporcionar el mantenimiento extracromosómico en una célula huésped o pueden proporcionar la integración en el genoma de la célula huésped. El vector de expresión proporciona secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales, y puede proporcionar una expresión inducible o constitutiva en la que la región codificante está unida operativamente bajo el control transcripcional de la región de inicio de la transcripción y una región de terminación de la transcripción y la traducción. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, sitios de unión al ribosoma, secuencias de inicio y detención de la transcripción, secuencias de inicio y detención de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles y pueden ser un promotor constitutivo fuerte (por ejemplo, T7).

Los constructos de expresión generalmente tienen sitios de restricción convenientes ubicados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la inserción de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de interés. Puede estar presente un marcador seleccionable operativo en el huésped de expresión para facilitar la selección de células que contienen el vector. Además, el constructo de expresión puede incluir elementos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresión puede tener uno o dos sistemas de replicación, lo que permite que se mantenga en organismos, por ejemplo, en células de mamíferos o insectos para la expresión y en un huésped procariótico para la clonación y amplificación. Además, el constructo de expresión puede contener un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células huésped transformadas. Los genes seleccionables son bien conocidos en la técnica y variarán con la célula huésped utilizada.

El aislamiento y la purificación de una proteína se puede lograr de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una proteína puede aislarse de un lisado de células genéticamente modificadas para expresar la proteína de manera constitutiva y/o por inducción, o de una mezcla de reacción de sintética mediante purificación por inmunoafinidad, que generalmente implica poner en contacto la muestra con un anticuerpo antiproteína, lavado para eliminar el material unido de forma no específica y eluir la proteína unida específicamente. La proteína aislada puede purificarse adicionalmente mediante diálisis y otros procedimientos normalmente empleados en la purificación de proteínas. En una realización, la proteína se puede aislar usando procedimientos de cromatografía de quelatos metálicos. Las proteínas pueden contener modificaciones para facilitar el aislamiento.

Los polipéptidos se pueden preparar en forma sustancialmente pura o aislada (por ejemplo, libres de otros polipéptidos). Los polipéptidos pueden estar presentes en una composición que está enriquecida con el polipéptido en relación con otros componentes que pueden estar presentes (por ejemplo, otros polipéptidos u otros componentes de la célula huésped). Por ejemplo, se puede proporcionar un polipéptido purificado de tal manera que el polipéptido esté presente en una composición que esté sustancialmente libre de otras proteínas expresadas, por ejemplo, menos de aproximadamente 90%, menos de aproximadamente 60%, menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 5% o menos de aproximadamente 1%.

Se puede generar un polipéptido IL-10 usando técnicas recombinantes para manipular diferentes ácidos nucleicos relacionados con IL-10 conocidos en la técnica para proporcionar constructos capaces de codificar el polipéptido IL-10. Se apreciará que, cuando se proporciona una secuencia de aminoácidos particular, el experto en la materia reconocerá una variedad de moléculas de ácido nucleico diferentes que codifican dicha secuencia de aminoácidos en vista de sus antecedentes y experiencia, por ejemplo, en biología molecular.

Sustituciones de enlaces amida

En algunos casos, IL-10 incluye uno o más enlaces distintos de los enlaces peptídicos, por ejemplo, al menos dos aminoácidos adyacentes se unen mediante un enlace distinto de un enlace amida. Por ejemplo, para reducir o eliminar la proteólisis no deseada u otros medios de degradación, y/o para aumentar la estabilidad en suero, y/o para restringir o aumentar la flexibilidad conformacional, se pueden sustituir uno o más enlaces amida dentro del esqueleto de IL-10.

En otro ejemplo, uno o más enlaces amida (-CO-NH-) en IL-10 se pueden reemplazar con un enlace que es un isóstero de un enlace amida, tal como -CH2NH-, -CH2S-, - CH2CH2-, -CH=CH-(cis y trans), -COCH2-, -CH(OH) CH2- o -CH2SO-. Uno o más enlaces amida en IL-10 también pueden ser reemplazados por ejemplo, por un enlace pseudopeptídico isóstero reducido. Véase Couder et al., (1993) Int. J. Peptide Protein Res. 41: 181-184. Dichos reemplazos y cómo realizarlos son conocidos por los expertos en la técnica.

Sustituciones de aminoácidos

Se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos en un polipéptido IL-10. Los siguientes son ejemplos:

a) sustitución de aminoácidos hidrófobos sustituidos con alquilo, que incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, norleucina, ácido (S)-2-aminobutírico, (S)-ciclohexilalanina u otros alfa-aminoácidos simples sustituidos por una cadena lateral alifática de carbonos C1-C10 que incluyen sustituciones de alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal, cíclica y ramificada;

b) sustitución de aminoácidos hidrófobos sustituidos con aromáticos, incluyendo fenilalanina, triptófano, tirosina, sulfotirosina, bifenilalanina, 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, 2-benzotienilalanina, 3-benzotienilalanina, histidina, incluyendo formas sustituidas con amino, alquilamino dialquilamino, aza, halogenadas (flúor, cloro, bromo o yodo) o alcoxi (de C1-C4) de los aminoácidos aromáticos enumerados anteriormente, ejemplos ilustrativos de los cuales son: 2-, 3- o 4-aminofenilalanina, 2-, 3- o 4-clorofenilalanina, 2-, 3- o 4- metilfenilalanina, 2-, 3- o 4-metoxifenilalanina, 5-amino-, 5-cloro-, 5-metil- o 5-metoxitriptófano, 2' -, 3'- o 4'-amino-, 2'-, 3'- o 4'-cloro-, 2, 3 o 4-bifenilalanina, 2'-, 3'- o 4'-metilo -, 2-, 3- o 4-bifenilalanina y 2- o 3-piridilalanina;

c) sustitución de aminoácidos que contienen cadenas laterales básicas, que incluyen arginina, lisina, histidina, ornitina, ácido 2,3-diaminopropiónico, homoarginina, que incluye derivados sustituidos con alquilo, alquenilo o arilo de los aminoácidos anteriores ya sea que el sustituyente esté en los heteroátomos (tal como el nitrógeno alfa, o el nitrógeno o nitrógenos distales, o en el carbono alfa, en la posición pro-R por ejemplo. Los compuestos que sirven como ejemplos ilustrativos incluyen: N-épsilon-isopropil-lisina, 3-(4-tetrahidropiridil)-glicina, 3-(4-tetrahidropiridil)-alanina, N,N-gamma, gamma'-dietil-homoarginina. También se incluyen compuestos tales como alfa-metilarginina, ácido alfa-metil-2,3-diaminopropiónico, alfa-metil-histidina, alfa-metil-ornitina en los que el grupo alquilo ocupa la posición pro-R del carbono alfa. También se incluyen las amidas formadas a partir de alquilo, aromático, heteroaromático (en las que el grupo heteroaromático tiene uno o más nitrógenos, oxígenos o átomos de azufre solos o en combinación), ácidos carboxílicos o cualquiera de los muchos derivados activados bien conocidos tales como cloruros de ácido, ésteres activos, azólidos activos y derivados relacionados, y lisina, ornitina o ácido 2,3-diaminopropiónico;

d) sustitución de aminoácidos ácidos, incluyendo ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homoglutámico, tirosina, alquil, aril, arilalquil y heteroaril sulfonamidas de ácido 2,4-diaminopriopiónico, ornitina o lisina y alquil aminoácidos sustituidos con tetrazol;

e) sustitución de residuos amida de cadena lateral, incluyendo asparagina, glutamina y derivados sustituidos con alquilo o aromáticos de asparagina o glutamina; y

f) sustitución de aminoácidos que contienen hidroxilo, incluyendo serina, treonina, homoserina, ácido 2,3-diamino propiónico y derivados sustituidos con alquilo o aromáticos de serina o treonina.

En algunos casos, IL-10 comprende uno o más L-aminoácidos no codificados genéticamente de origen natural, L-aminoácidos sintéticos o D-enantiómeros de un aminoácido. Por ejemplo, IL-10 puede comprender solamente D-aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido IL-10 puede comprender uno o más de los siguientes residuos: hidroxiprolina, p-alanina, ácido o-aminobenzoico, ácido m-aminobenzoico, ácido p-aminobenzoico, ácido maminometilbenzoico, ácido 2,3-diaminopropiónico , ácido a-aminoisobutírico, N-metilglicina (sarcosina), ornitina, citrulina, t-butilalanina, t-butilglicina, N-metilisoleucina, fenilglicina, ciclohexilalanina, norleucina, naftilalanina, piridilalanina, 3-benzotienil alanina, 4-clorofenilalanina, 2-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, p-2-tienilalanina, sulfóxido de metionina, homoarginina, N-acetil lisina, ácido 2,4-diamino butírico, rho-aminofenilalanina, N-metilvalina, homocisteína, homoserina, ácido £aminohexanoico, ácido w-aminohexanoico, ácido w-aminoheptanoico, ácido w-aminooctanoico, ácido w aminodecanoico, ácido w-aminotetradecanoico, ciclohexilalanina, ácido aj-diaminobutírico, ácido a,pdiaminopropiónico, ácido 8-aminovalérico y ácido 2,3-diaminobutírico.

Modificaciones adicionales

Puede introducirse un residuo de cisteína o un análogo de cisteína en un polipéptido IL-10 para proporcionar el enlace a otro péptido mediante un enlace disulfuro o para proporcionar la ciclación del polipéptido IL-10. Los procedimientos para introducir una cisteína o un análogo de cisteína se conocen en la técnica; véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 8.067.532.

Se puede ciclar un polipéptido IL-10. Se pueden introducir una o más cisteínas o análogos de cisteína en un polipéptido IL-10, en el que la cisteína o análogo de cisteína introducido puede formar un enlace disulfuro con una segunda cisteína o análogo de cisteína introducido. Otros medios de ciclación incluyen la introducción de un enlazador de oxima o un enlazador de lantionina; véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 8.044.175. Puede usarse y/o introducirse cualquier combinación de aminoácidos (o fracciones que no son aminoácidos) que puedan formar un enlace de ciclación. Se puede generar un enlace de ciclación con cualquier combinación de aminoácidos (o con un aminoácido y -(CH2VCO- o -(CH2)n-C6H4-CO-) con grupos funcionales que permitan la introducción de un puente. Algunos ejemplos son disulfuros, miméticos de disulfuro tales como el puente carba -(CH2)n-, puentes tioacetal, tioéter (cistationina o lantionina) y puentes que contienen ésteres y éteres. En estos ejemplos, n puede ser cualquier número entero, pero frecuentemente es menor que diez.

Otras modificaciones incluyen, por ejemplo, una sustitución de N-alquilo (o arilo) (Y[CONR]), o entrecruzamiento de la cadena principal para construir lactamas y otras estructuras cíclicas. Otros derivados incluyen derivados hidroximetilo en el terminal C, derivados modificados en O (por ejemplo, hidroximetil bencil éter en el terminal C), derivados modificados en el terminal N que incluyen amidas sustituidas tales como alquilamidas e hidrazidas.

En algunos casos, uno o más L-aminoácidos en un polipéptido IL-10 se reemplazan con uno o más D-aminoácidos.

En algunos casos, un polipéptido IL-10 es un análogo retroinverso (véase, por ejemplo, Sela y Zisman (1997) FASEB J. 11: 449). Los análogos de péptidos retroinversos son isómeros de polipéptidos lineales en los que la dirección de la secuencia de aminoácidos se invierte (retro) y la quiralidad, D- o L-, de uno o más aminoácidos en los mismos se invierte (inverso), por ejemplo, usando D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos [Véase, por ejemplo, Jameson et al., (1994) Nature 368: 744; y Brady et al., (1994) Nature 368: 692].

Un polipéptido IL-10 puede incluir un "Dominio de transducción de proteínas" (PTD), que se refiere a un polipéptido, polinucleótido, carbohidrato o molécula orgánica o inorgánica que facilita atravesar una bicapa lipídica, micela, membrana celular, membrana de orgánulos, o membrana de vesícula. Un PTD unido a otra molécula facilita que la molécula atraviese una membrana, por ejemplo yendo del espacio extracelular al espacio intracelular, o del citosol al interior de un orgánulo. En algunas realizaciones, un PTD se une covalentemente al terminal amino de un polipéptido IL-10, mientras que en otras realizaciones, un PTD se une covalentemente al terminal carboxilo de un polipéptido IL-10. Los dominios ejemplares de transducción de proteínas incluyen, pero no se limitan a, un dominio de transducción mínimo de proteína undecapéptido (correspondiente a los residuos 47-57 de TAT de VIH-1 que comprende YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 1); una secuencia de poliarginina que comprende varios residuos de arginina suficientes para la entrada directa en una célula (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 10-50 argininas); un dominio VP22 (Zender et al., (2002) Cancer Gene Ther. 9 (6): 489-96); un dominio de transducción de proteínas de Drosophila Antennapedia (Noguchi et al., (2003) Diabetes 52 (7): 1732-1737); un péptido de calcitonina humana truncado (Trehin et al., (2004) Pharm. Research 21: 1248-1256); polilisina (Wender et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 13003­ 13008); RRQRRTSKLMKR (SEQ ID NO: 2); Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAK IL (SEQ ID NO: 3); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO: 4); y RQIKIWFQNRRMKWK (SEQ ID NO: 5). Los PTD ejemplares incluyen, pero no se limitan a, YGRKKRRQRRR (Se Q ID NO: 1), RKKRRQRRR (SEQ ID No : 6); un homopolímero de arginina de 3 residuos de arginina a 50 residuos de arginina; las secuencias ejemplares de aminoácidos del dominio PTD incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de las siguientes: YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1); RKKR QR (SEQ ID NO: 7); YARAAARQARA (SEQ ID NO: 8); THRLPRRRRRR (SEQ ID NO: 9); y GGRRARRRRRR (SEQ ID NO: 10).

El grupo carboxilo COR3 del aminoácido en el extremo terminal C de un polipéptido IL-10 puede estar presente en forma libre (R3 = OH) o en forma de una sal alcalina o alcalinotérrea fisiológicamente tolerada tal como, por ejemplo, una sal de sodio, potasio o calcio. El grupo carboxilo también puede esterificarse con alcoholes primarios, secundarios o terciarios tales como, por ejemplo, metanol, alcoholes de alquilo C1-C6 ramificados o no ramificados, por ejemplo, alcohol etílico o terc-butanol. El grupo carboxilo también se puede amidar con aminas primarias o secundarias tales como amoniaco, alquilaminas C1-C6 ramificadas o no ramificadas o dialquilaminas C1-C6, por ejemplo, metilamina o dimetilamina.

El grupo amino del aminoácido NR1R2 en el terminal N de un polipéptido IL-10 puede estar presente en forma libre (R1 = H y R2 = H) o en forma de una sal fisiológicamente tolerada tal como, por ejemplo, un cloruro o acetato. El grupo amino también puede acetilarse con ácidos tales que Ri = H y R2 = acetilo, trifluoroacetilo o adamantilo. El grupo amino puede estar presente en una forma protegida por grupos protectores de amino usados convencionalmente en la química de péptidos, tales como los proporcionados anteriormente (por ejemplo, Fmoc, Benciloxicarbonilo (Z), Boc y Alloc). El grupo amino puede estar alquilado en N, en el que Ri y/o R2 = alquilo C1-C6 o alquenilo C2-C8 o aralquilo C7-C9. Los residuos de alquilo pueden ser de cadena lineal, ramificada o cíclica (por ejemplo, etilo, isopropilo y ciclohexilo, respectivamente).

Modificaciones particulares para mejorar y/o imitar la función de IL-10

Con frecuencia es beneficioso, y a veces imperativo, mejorar una o más propiedades físicas de las modalidades de tratamiento descritas en este documento (por ejemplo, IL-10) y/o la manera en que se administran. Las mejoras de las propiedades físicas incluyen, por ejemplo, modular la inmunogenicidad; procedimientos para aumentar la solubilidad en agua, la biodisponibilidad, la semivida en suero y/o la semivida terapéutica; y/o modular la actividad biológica. Ciertas modificaciones también pueden ser útiles, por ejemplo, para generar anticuerpos para su uso en ensayos de detección (por ejemplo, etiquetas de epítopo) y para facilitar la purificación de proteínas. Generalmente, tales mejoras deben impartirse sin afectar negativamente a la bioactividad de la modalidad de tratamiento y/o aumentar su inmunogenicidad.

La pegilación de IL-10 es una modificación particular contemplada por la presente divulgación, mientras que otras modificaciones incluyen, pero no se limitan a, glicosilación (enlazada a N y O); polisialilación; moléculas de fusión de albúmina que comprenden albúmina de suero ((por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), albúmina de suero cynomolgus o albúmina de suero bovino (BSA)); unión de albúmina a través, por ejemplo, de una cadena de ácidos grasos conjugados (acilación); y proteínas de fusión Fc.

Pegilación: la eficacia clínica de las terapias proteicas a menudo está limitada por una semivida plasmática corta y la susceptibilidad a degradación por proteasas. Los estudios de varias proteínas terapéuticas (por ejemplo, Filgrastim) han demostrado que tales dificultades pueden superarse mediante diversas modificaciones, incluida la conjugación o el enlace de la secuencia polipeptídica a cualquiera de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos. Esto se efectúa frecuentemente mediante una fracción de enlace unida covalentemente tanto a la proteína como al polímero no proteico, por ejemplo, un PEG. Se ha demostrado que dichas biomoléculas conjugadas con PEG poseen propiedades clínicamente útiles, que incluyen una mejor estabilidad física y térmica, protección contra la susceptibilidad a la degradación enzimática, mayor solubilidad, semivida más prolongada en circulación in vivo y menor eliminación, inmunogenicidad y antigenicidad reducidas y toxicidad reducida.

Además de los efectos beneficiosos de la pegilación sobre los parámetros farmacocinéticos, la propia pegilación puede potenciar la actividad. Por ejemplo, se ha demostrado que la PEG-IL-10 es más eficaz contra ciertos cánceres que la IL-10 no pegilada (véase, por ejemplo, el documento e P 206636A2).

Los PEG adecuados para la conjugación con una secuencia polipeptídica son generalmente solubles en agua a temperatura ambiente y tienen la fórmula general R(O-CH2-CH2)nO-R, en la que R es hidrógeno o un grupo protector tal como un alquilo o un grupo alcanol, y en la que n es un número entero de 1 a 1000. Cuando R es un grupo protector, generalmente tiene de 1 a 8 carbonos. El PEG conjugado con la secuencia polipeptídica puede ser lineal o ramificado. Los derivados de PEG ramificados, los "PEG en estrella" y los PEG de brazos múltiples se contemplan en la presente descripción. El peso molecular del PEG utilizado en la presente divulgación no está restringido a ningún intervalo particular, y los ejemplos se exponen en otra parte del presente documento; a modo de ejemplo, ciertas realizaciones tienen pesos moleculares entre 5 kDa y 20 kDa, mientras que otras realizaciones tienen pesos moleculares entre 4 kDa y 10 kDa.

La presente invención también contempla composiciones de conjugados en los que los PEG tienen valores n diferentes y, por lo tanto, los diferentes PEG están presentes en proporciones específicas. Por ejemplo, algunas composiciones comprenden una mezcla de conjugados en los que n = 1, 2, 3 y 4. En algunas composiciones, el porcentaje de conjugados en los que n = 1 es 18-25%, el porcentaje de conjugados en los que n = 2 es 50- 66%, el porcentaje de conjugados en los que n = 3 es 12-16%) y el porcentaje de conjugados en los que n = 4 es hasta 5%. Dichas composiciones se pueden producir mediante condiciones de reacción y procedimientos de purificación conocidos en la técnica. Las condiciones de reacción ejemplares se describen a lo largo de la memoria descriptiva. Puede usarse cromatografía de intercambio catiónico para separar conjugados, y luego se identifica una fracción que contiene el conjugado que tiene, por ejemplo, el número deseado de PEG unidos, purificados libres de secuencias de proteínas no modificadas y de conjugados que tienen otros números de PEG unidos.

La pegilación se produce con mayor frecuencia en el grupo alfa amino en el terminal N del polipéptido, el grupo épsilon amino en la cadena lateral de los residuos de lisina y el grupo imidazol en la cadena lateral de los residuos de histidina. Dado que la mayoría de los polipéptidos recombinantes poseen un solo grupo alfa y varios grupos épsilon amino e imidazol, se pueden generar numerosos isómeros posicionales dependiendo de la química del enlazador. Se pueden aplicar en el presente documento estrategias de pegilación generales conocidas en la técnica.

Dos monometoxi PEG activados de primera generación (mPEG) ampliamente utilizados son carbonato succinimidilo-PEG (SC-PEG; véase, por ejemplo, Zalipsky, et al., (1992) Biotechnol. Appl. Biochem 15: 100-114; y Miron y Wilcheck (1993) Bio-conjug. Chem. 4: 568-569) y carbonato de benzotriazol-PEG (BTC-PEG; véase, por ejemplo, Dolence, et al., patente de los Estados Unidos No. 5,650,234), que reaccionan preferentemente con residuos de lisina para formar un enlace carbamato, pero también se sabe que reaccionan con residuos de histidina y tirosina. Se ha demostrado que el enlace con residuos de histidina en ciertas moléculas (por ejemplo, IFNa) es un enlace imidazolcarbamato hidrolíticamente inestable (véase, por ejemplo, Lee y McNemar, patente de los Estados Unidos No. 5.985.263). La tecnología de pegilación de segunda generación se ha diseñado para evitar estos enlaces inestables, así como la falta de selectividad en la reactividad de los residuos. El uso de un enlazador de PEG-aldehído se dirige a un único sitio en el terminal N de un polipéptido mediante aminación reductora.

El PEG puede unirse a un polipéptido de la presente divulgación a través de un grupo reactivo terminal (un "espaciador") que media un enlace entre los grupos amino o carboxilo libres de una o más de las secuencias polipeptídicas y polietilenglicol. El PEG que tiene el espaciador que puede unirse al grupo amino libre incluye polietilenglicol N-hidroxisuccinilimida, que se puede preparar activando éster de ácido succínico de polietilenglicol con N-hidroxisuccinilimida. Otro polietilenglicol activado que puede unirse a un grupo amino libre es 2,4-bis(O-metoxipolietilenglicol)-6-cloro-s-triazina, que puede prepararse haciendo reaccionar monometiléter de polietilenglicol con cloruro cianúrico. El polietilenglicol activado que está unido al grupo carboxilo libre incluye polioxietilendiamina.

La conjugación de una o más de las secuencias polipeptídicas de la presente divulgación con PEG que tiene un espaciador se puede llevar a cabo mediante varios procedimientos convencionales. Por ejemplo, la reacción de conjugación se puede llevar a cabo en solución a un pH de 5 a 10, a una temperatura de 4 °C a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 20 horas, utilizando una relación molar de reactivo a proteína de 4:1 a 30:1. Las condiciones de reacción pueden seleccionarse para dirigir la reacción hacia la producción predominante de un grado de sustitución deseado. En general, la temperatura baja, el pH bajo (por ejemplo, pH = 5) y el tiempo de reacción corto tienden a disminuir la cantidad de PEG adheridos, mientras que la temperatura alta, el pH neutro a alto (por ejemplo, pH > 7) y el tiempo de reacción más largo tiende a aumentar el número de PEG adheridos. Se pueden usar varios medios conocidos en la técnica para terminar la reacción. En algunas realizaciones, la reacción se termina acidificando la mezcla de reacción y congelando a, por ejemplo, -20 °C. La pegilación de diversas moléculas se analiza, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.252.714; 5.643.575; 5.919.455; 5.932.462; y 5.985.263. La PEG-IL-10 se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 7.052.686. Las condiciones de reacción específicas contempladas para su uso en el presente documento se establecen en la sección Experimental.

En el presente documento se divulga el uso de miméticos de PEG. Se han desarrollado miméticos de PEG recombinantes que retienen los atributos de PEG (por ejemplo, una semivida en suero mejorada) al tiempo que confieren varias propiedades ventajosas adicionales. A modo de ejemplo, las cadenas polipeptídicas simples (que comprenden, por ejemplo, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser y Thr) capaces de formar una conformación extendida similar a PEG pueden producirse recombinantemente ya fusionadas con el fármaco peptídico o proteico de interés (por ejemplo, tecnología XTEN de Amunix; Mountain View, CA). Esto evita la necesidad de una etapa de conjugación adicional durante el proceso de fabricación. Además, las técnicas de biología molecular establecidas permiten el control de la composición de la cadena lateral de las cadenas polipeptídicas, lo que permite optimizar la inmunogenicidad y las propiedades de fabricación.

Glicosilación: para los propósitos de la presente divulgación, "glicosilación" se refiere en general al proceso enzimático que une los glicanos a proteínas, lípidos u otras moléculas orgánicas. El uso del término "glicosilación" junto con la presente divulgación generalmente significa agregar o eliminar una o más fracciones de carbohidratos (ya sea eliminando el sitio de glicosilación subyacente o eliminando la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que pueden estar presentes o no en la secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de las diversas fracciones de carbohidratos presentes.

La glicosilación puede afectar drásticamente las propiedades físicas (por ejemplo, solubilidad) de polipéptidos tales como IL-10 y también puede ser importante en la estabilidad, secreción y localización subcelular de proteínas. Los polipéptidos glicosilados también pueden exhibir una estabilidad mejorada o pueden mejorar una o más propiedades farmacocinéticas, tales como la semivida. Además, las mejoras en la solubilidad pueden, por ejemplo, permitir la generación de formulaciones más adecuadas para la administración farmacéutica que las formulaciones que comprenden el polipéptido no glicosilado.

La adición de sitios de glicosilación se puede lograr alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración del polipéptido se puede realizar, por ejemplo, mediante la adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina (para sitios de glicosilación enlazados a O) o residuos de asparagina (para sitios de glicosilación enlazados a N). Las estructuras de los oligosacáridos enlazados a N y enlazados a O y los residuos de azúcar que se encuentran en cada tipo pueden ser diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es el ácido N-acetilneuramínico (en lo sucesivo, ácido siálico). El ácido siálico suele ser el residuo terminal tanto de oligosacáridos enlazados a N como enlazados a O y, en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas a la glicoproteína. Una realización particular de la presente divulgación comprende la generación y uso de variantes de glicosilación de N.

Las secuencias de polipéptidos de la presente divulgación pueden alterarse opcionalmente mediante cambios a nivel de ácido nucleico, particularmente mutando el ácido nucleico que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.

Polisialilación: La presente divulgación también contempla el uso de polisialilación, la conjugación de polipéptidos con el ácido polisiálico enlazado a a -(2^8 ) biodegradable natural ("PSA") para mejorar la estabilidad de los polipéptidos y la farmacocinética in vivo. El PSA es un polímero natural biodegradable, no tóxico y altamente hidrófilo, lo que le confiere un alto peso molecular aparente en la sangre que aumenta su semivida en suero. Además, la polisialilación de una variedad de terapias de péptidos y proteínas ha llevado a una proteólisis notablemente reducida, retención de la actividad in vivo y reducción de la inmunogenicidad y antigenicidad (véase, por ejemplo, G. Gregoriadis et al., Int. J. Pharmaceutics 300 (1-2): 125-30). Se encuentran disponibles varias técnicas para la polisialilación específica del sitio (véase, por ejemplo, T. Lindhout et al., PNAS 108 (18) 7397-7402 (2011)).

Fusión de albúmina: componentes y moléculas adecuados adicionales para la conjugación incluyen albúmina tales como albúmina de suero humano (HSA), albúmina de suero cynomolgus y albúmina de suero bovino (BSA).

Como se divulga en el presente documento, la albúmina se puede conjugar con una molécula de fármaco (por ejemplo, un polipéptido descrito en este documento) en el terminal carboxilo, el terminal amino, tanto los terminales carboxilo como amino, e internamente (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos 5.876.969 y 7.056.701).

En los conjugados de moléculas de HSA-fármaco contemplados por la presente divulgación, se pueden usar varias formas de albúmina, tales como presecuencias de secreción de albúmina y variantes de las mismas, fragmentos y variantes de las mismas, y variantes de HSA. Tales formas generalmente poseen una o más actividades de albúmina deseadas. En el presente documento se divulgan proteínas de fusión que comprenden una molécula de fármaco polipeptídico fusionada directa o indirectamente a albúmina, un fragmento de albúmina y una variante de albúmina, etc., en las que la proteína de fusión tiene una mayor estabilidad en plasma que la molécula de fármaco no fusionada y/o la proteína de fusión retiene la actividad terapéutica de la molécula de fármaco no fusionada. Como se divulga en el presente documento, la fusión indirecta se efectúa mediante un enlazador, tal como un enlazador peptídico o una versión modificada del mismo.

Como se mencionó anteriormente, la fusión de albúmina con uno o más polipéptidos de la presente divulgación se puede lograr, por ejemplo, mediante manipulación genética, de modo que el ácido nucleico que codifica HSA, o un fragmento del mismo, se una al ácido nucleico que codifica una o más secuencias polipeptídicas.

Estrategias alternativas de unión a albúmina: Se han desarrollado varias estrategias de unión a albúmina como alternativas a la fusión directa y pueden usarse con los agentes de IL-10 descritos en el presente documento. A modo de ejemplo, la presente divulgación contempla la unión de albúmina a través de una cadena de ácido graso conjugado (acilación) y proteínas de fusión que comprenden una secuencia polipeptídica del dominio de unión a albúmina (ABD) y la secuencia de uno o más de los polipéptidos descritos en este documento.

Conjugación con otras moléculas: Los componentes y moléculas adecuados adicionales para la conjugación incluyen, por ejemplo, tiroglobulina; toxoide tetánico; toxoide diftérico; poliaminoácidos tales como poli-(D-lisina: ácido D-glutámico); polipéptidos VP6 de rotavirus; hemaglutinina del virus de la gripe, nucleoproteína del virus de la gripe; hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH); y proteína central y antígeno de superficie del virus de la hepatitis B; o cualquier combinación de los anteriores.

Por lo tanto, la presente divulgación contempla la conjugación de uno o más componentes o moléculas adicionales en el terminal N y/o el terminal C de una secuencia polipeptídica, tal como otro polipéptido (por ejemplo, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos heteróloga al polipéptido del sujeto), o una molécula portadora. Por lo tanto, se puede proporcionar una secuencia polipeptídica como un conjugado con otro componente o molécula.

Un polipéptido IL-10 también se puede conjugar con macromoléculas grandes, de metabolización lenta, tales como proteínas; polisacáridos como sefarosa, agarosa, celulosa o perlas de celulosa; aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico o polilisina; copolímeros de aminoácidos; partículas de virus inactivadas; toxinas bacterianas inactivadas tales como toxoide de difteria, tétanos, cólera o moléculas de leucotoxina; bacterias inactivadas; y células dendríticas. Tales formas conjugadas, si se desea, pueden usarse para producir anticuerpos contra un polipéptido como se divulga en el presente documento.

Los componentes y moléculas candidatos adicionales para la conjugación incluyen los adecuados para el aislamiento o la purificación. Los ejemplos particulares incluyen moléculas de unión, tales como biotina (par de unión específico de biotina-avidina), un anticuerpo, un receptor, un ligando, una lectina o moléculas que comprenden un soporte sólido, incluidas, por ejemplo, perlas de plástico o poliestireno, placas o perlas, perlas magnéticas, tiras reactivas y membranas.

Moléculas de fusión Fc: en el presente documento se divulga un terminal amino o carboxilo de una secuencia polipeptídica que se puede fusionar con una región Fc de inmunoglobulina (por ejemplo, Fc humana) para formar un conjugado de fusión (o molécula de fusión). Se ha demostrado que los conjugados de fusión Fc aumentan la semivida sistémica de los biofarmacéuticos y, por lo tanto, el producto biofarmacéutico puede requerir una administración menos frecuente.

Fc se une al receptor Fc neonatal (FcRn) en las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos y, al unirse, la molécula de fusión de Fc se protege de la degradación y se vuelve a liberar en la circulación, manteniendo la molécula en circulación durante más tiempo. Se cree que esta unión de Fc es el mecanismo por el cual la IgG endógena conserva su semivida plasmática prolongada. La tecnología de fusión de Fc más reciente vincula una única copia de un biofarmacéutico a la región Fc de un anticuerpo para optimizar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del biofarmacéutico en comparación con los conjugados tradicionales de fusión de Fc.

Otras modificaciones: La presente divulgación contempla el uso de otras modificaciones, actualmente conocidas o desarrolladas en el futuro, de IL-10 para mejorar una o más propiedades. Los ejemplos incluyen la hesilación, varios aspectos de los cuales se describen, por ejemplo, en la solicitudes de patente de los Estados Unidos Nos.

2007/0134197 y 2006/0258607, y moléculas de fusión que comprenden SUMO como etiqueta de fusión (LifeSensors, Inc .; Malvern, Pa ).

Enlazadores: Enlazadores y su uso se han descrito anteriormente. Cualquiera de los componentes y moléculas anteriores usados para modificar las secuencias polipeptídicas de la presente divulgación se pueden conjugar opcionalmente mediante un enlazador. Los enlazadores adecuados incluyen "enlazadores flexibles" que generalmente tienen una longitud suficiente para permitir cierto movimiento entre las secuencias polipeptídicas modificadas y los componentes y moléculas enlazados. Las moléculas enlazadoras tienen generalmente alrededor de 6-50 átomos de longitud. Las moléculas enlazadoras también pueden ser, por ejemplo, aril acetileno, oligómeros de etilenglicol que contienen 2-10 unidades monoméricas, diaminas, diácidos, aminoácidos o combinaciones de los mismos. Los enlazadores adecuados pueden seleccionarse fácilmente y pueden tener cualquier longitud adecuada, tal como 1 aminoácido (por ejemplo, Gly), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50 o más de 50 aminoácidos.

Los ejemplos de enlazadores flexibles incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (por ejemplo, (GS)n, GSGGSn (SEQ ID NO: 11) y GGGSn (SEQ ID NO: 12), en los que n es un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como un vínculo neutro entre los componentes.

Otros ejemplos de enlazadores flexibles incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina, polímeros de glicina-serina (por ejemplo, (GmSo)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 13) , (GmSoGm)n (SEQ ID NO: 14), (GmSoGmSoGm)n (SEQ ID NO: 15), (GSGGSm)n (SEQ ID NO: 16), (GSGSmG)n (SEQ ID NO: 17) y (GGGSm)n (SEQ ID NO: 18), y combinaciones de los mismos, en los que m, n y o se seleccionan cada uno independientemente de un número entero de al menos 1 a 20, por ejemplo, 1-18, 2-16, 3-14, 4-12, 5-10, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) y otros enlazadores flexibles. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como una unión neutra entre los componentes. Los ejemplos de enlazadores flexibles incluyen, pero no se limitan a GGSG (SEQ ID NO: 19), GGSGG (SeQ ID NO: 20), GSGSG (SEQ ID NO: 21), GSGGG (SEQ ID NO: 22), GGGSG (SEQ ID NO: 23) y GSSSG (SEQ ID NO: 24).

Los enlazadores flexibles adicionales incluyen polímeros de glicina (G)n o polímeros de glicina-serina (por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 25), (GGGS)n (SEQ ID NO: 26) y (GGGGS)n (SEQ ID NO: 27), en los que n = 1 a 50, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50. Los enlazadores flexibles ejemplares incluyen, pero no se limitan a, GGGS (SEQ ID NO: 28), GGGGS (SEQ ID NO: 29), GGSG (SEQ ID NO: 19), GGSGG (SEQ ID NO: 20), GSGSG (SEQ ID NO: 21), GSGGG (SEQ ID NO: 22), GGGSG (SEQ ID NO: 23) y GSSSG (SEQ ID NO: 24). Un multímero (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 o 30-50) de estas secuencias enlazadoras pueden unirse entre sí para proporcionar enlazadores flexibles que pueden usarse para conjugar una secuencia de aminoácidos heteróloga a los polipéptidos descritos en el presente documento .Como se describe en el presente documento, la secuencia de aminoácidos heteróloga puede ser una secuencia señal y/o una pareja de fusión, tal como albúmina, secuencia de Fc y similares.

Usos terapéuticos y profilácticos

En realizaciones particulares, la presente divulgación contempla el uso de las combinaciones de agentes de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) e inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario descritos en el presente documento en el tratamiento y/o prevención de una afección proliferativa en un sujeto mamífero en enfermedades, trastornos o afecciones particulares asociadas con cáncer, un tumor o una enfermedad, trastorno o afección precancerosa. Se contemplan realizaciones en las que el agente de IL-10 (y algunos de los inhibidores del punto de control inmunitario descritos en este documento) reducen la tolerancia a una célula tumoral o antígeno de célula cancerosa, por ejemplo, modulando la actividad de una célula T reguladora y/o una célula T CD8+ (véase, por ejemplo, Ramirez-Montagut, et al., (2003) Oncogene 22: 3180-87; y Sawaya, et al., (2003) New Engl. J. Med. 349: 1501 -09).

La frase "enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con el cáncer" y términos y frases similares se pretende que se refieran ampliamente a afecciones que están asociadas, directa o indirectamente, con el cáncer e incluyen, por ejemplo, angiogénesis y afecciones precancerosas tales como displasia.

De acuerdo con la presente invención, las combinaciones de un agente de IL-10 y un inhibidor o inhibidores de punto de control inmunitario se pueden usar para tratar o prevenir una afección o trastorno proliferativo, incluido un cáncer, por ejemplo, cáncer de útero, cuello uterino, mama, próstata, testículos, tracto gastrointestinal (por ejemplo, esófago, orofaringe, estómago, intestino delgado o grueso, colon o recto), riñón, célula renal, vejiga, hueso, médula ósea, piel, cabeza o cuello, hígado, vesícula biliar, corazón, pulmón, páncreas, glándula salival, glándula suprarrenal, tiroides, cerebro (por ejemplo, gliomas), ganglios, sistema nervioso central (SNC) y sistema nervioso periférico (SNP), y cánceres del sistema hematopoyético y del sistema inmunológico (por ejemplo, bazo o timo). La presente divulgación también proporciona procedimientos para tratar o prevenir otras enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con el cáncer, que incluyen, por ejemplo, tumores inmunogénicos, tumores no inmunogénicos, tumores latentes, cánceres inducidos por virus (por ejemplo, cánceres de células epiteliales, cánceres de células endoteliales, carcinomas de células escamosas y papilomavirus), adenocarcinomas, linfomas, carcinomas, melanomas, leucemias, mielomas, sarcomas, teratocarcinomas, cánceres inducidos químicamente, metástasis y angiogénesis. En realizaciones particulares, el tumor o cáncer es cáncer de células renales, cáncer pancreático, melanoma cáncer de pulmón, cáncer de riñón o cáncer de mama. Como se divulga en el presente documento el tumor o cáncer es cáncer de colon, cáncer de ovario, melanoma, glioblastoma o leucemia.

Las realizaciones particulares adicionales de la presente divulgación se refieren a enfermedades neoplásicas (relacionadas con el cáncer), trastornos y afecciones de células hematopoyéticas. Estas enfermedades, trastornos y afecciones se pueden clasificar en una de dos categorías amplias: neoplasias mieloides y neoplasias linfoides. Cada categoría contiene diferentes tipos de cáncer hematopoyético con características definitorias de morfología, patobiología, tratamiento y/o pronóstico. La clasificación correcta, junto con la identificación de factores adicionales que pueden influir en el pronóstico o la respuesta a la quimioterapia, es esencial para permitir un tratamiento óptimo.

Las neoplasias mieloides incluyen, pero no se limitan a, neoplasias mieloproliferativas, trastornos mieloides y linfoides con eosinofilia, neoplasias mieloproliferativas/mielodisplásicas, síndromes mielodisplásicos, leucemia mieloide aguda y neoplasias precursoras relacionadas, y leucemia aguda de linaje ambiguo. Las neoplasias linfoides incluyen, pero no se limitan a, neoplasias linfoides precursoras, neoplasias de células B maduras, neoplasias de células T maduras, linfoma de Hodgkin y trastornos linfoproliferativos asociados a inmunodeficiencia.

Otros cánceres del sistema hematopoyético incluyen, pero no se limitan a, neoplasias de células histiocíticas y dendríticas.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un agente de PEG-IL-10, un inhibidor de punto de control inmunitario y al menos una agente terapéutico adicional, para tratar un cáncer, tumor, afección precancerosa, o afección proliferativa, cuyos ejemplos se exponen en otra parte del presente documento.

Composiciones farmacéuticas

Los agentes de IL-10 y los inhibidores del punto de control inmunitario de la presente divulgación pueden estar en forma de composiciones adecuadas para la administración a un sujeto. En general, tales composiciones son "composiciones farmacéuticas" que comprenden IL-10 y/o un inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario, y uno o más diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables. En determinadas realizaciones, los agentes de IL-10 y los inhibidores del punto de control inmunitario están presentes cada uno en una cantidad terapéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden usarse en los procedimientos de la presente divulgación; Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar ex vivo o in vivo a un sujeto para llevar a cabo los procedimientos y usos terapéuticos y profilácticos descritos en este documento.

En la descripción de las composiciones farmacéuticas, y aspectos de las mismas, que sigue, las composiciones farmacéuticas se describen generalmente en el contexto de un agente 11-10. Sin embargo, debe entenderse que la descripción también se aplica al inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario de la presente divulgación, ya sea en composiciones farmacéuticas que comprenden combinaciones de un agente de IL-10 y un inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario, o en composiciones farmacéuticas que comprenden solo uno de los componentes (o, en el caso de los inhibidores del punto de control inmunitario, composiciones farmacéuticas que comprenden dos o más de tales inhibidores).

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se pueden formular para que sean compatibles con el procedimiento o vía de administración pretendida; en este documento se exponen vías de administración ejemplares. Además, las composiciones farmacéuticas pueden usarse en combinación con otros agentes o compuestos terapéuticamente activos como se describe en este documento para tratar o prevenir las enfermedades, trastornos y afecciones contempladas por la presente divulgación.

Las composiciones farmacéuticas comprenden típicamente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido IL-10 contemplado por la presente divulgación y uno o más agentes de formulación farmacéutica y fisiológicamente aceptables. Diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico y bisulfato de sodio), conservantes (por ejemplo, alcohol bencílico, metil parabenos, etilo o n-propilo, p-hidroxibenzoato), agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes dispersantes, disolventes, rellenos, agentes de carga, detergentes, tampones, vehículos, diluyentes y/o adyuvantes. Por ejemplo, un vehículo adecuado puede ser una solución salina fisiológica o una solución salina tamponada con citrato, posiblemente complementada con otros materiales comunes en las composiciones farmacéuticas para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos ejemplares adicionales. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de tampones que se pueden usar en las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación contempladas en este documento. Los tampones típicos incluyen, pero no se limitan a, ácidos débiles, bases débiles o mezclas de los mismos farmacéuticamente aceptables. Como ejemplo, los componentes tampón pueden ser materiales solubles en agua tales como ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido acético, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido glutámico y sales de los mismos. Los agentes tamponantes aceptables incluyen, por ejemplo, un tampón Tris, ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), Sal sódica del ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) y ácido N-tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS).

Después de que se ha formulado una composición farmacéutica, se puede almacenar en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones se pueden almacenar en una forma lista para usar, una forma liofilizada que requiere reconstitución antes de su uso, una forma líquida que requiere dilución antes de su uso u otra forma aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se proporciona en un recipiente de un solo uso (por ejemplo, un vial, ampolla, jeringa o autoinyector de un solo uso (similar a, por ejemplo, un EpiPen®)), mientras que un recipiente de usos múltiples (por ejemplo, un vial de múltiples usos) se proporciona en otras realizaciones. Puede usarse cualquier aparato de administración de fármacos para administrar IL-10, incluidos implantes (por ejemplo, bombas implantables) y sistemas de catéter, bombas y dispositivos de inyección lenta, todos los cuales son bien conocidos por el experto en la materia. Las inyecciones de depósito, que generalmente se administran por vía subcutánea o intramuscular, también se pueden utilizar para liberar los polipéptidos descritos en este documento durante un período de tiempo definido. Las inyecciones de depósito suelen ser de base sólida u oleosa y generalmente comprenden al menos uno de los componentes de la formulación establecidos en este documento. Un experto en la materia está familiarizado con posibles formulaciones y usos de inyecciones de depósito.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuoso u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular de acuerdo con la técnica conocida usando los agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados mencionados en este documento. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, tal como una solución en 1,3-butanodiol. Los diluyentes, solventes y medios de dispersión aceptables que se pueden emplear incluyen agua, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio, Cremophor ELMR (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS), etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. Además, se emplean convencionalmente aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este propósito se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables. La absorción prolongada de formulaciones inyectables particulares se puede lograr incluyendo un agente que retrase la absorción (por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina).

Las composiciones farmacéuticas que contienen el ingrediente activo pueden estar en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, como comprimidos, cápsulas, pastillas, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes, soluciones, microperlas o elixires. En realizaciones particulares, un ingrediente activo de un agente coadministrado con un agente de IL-10 descrito en este documento está en una forma adecuada para uso oral. Las composiciones farmacéuticas destinadas a uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier procedimiento conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes tales como, por ejemplo, agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes y conservantes para proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y apetitosas. Los comprimidos, cápsulas y similares contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes de granulación y desintegración, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o goma arábiga, y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Los comprimidos, cápsulas y similares adecuados para la administración oral pueden estar sin recubrir o recubiertos mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y, por lo tanto, proporcionar una acción sostenida. Por ejemplo, se puede emplear un material retardador tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. También se pueden recubrir mediante técnicas conocidas en el arte para formar comprimidos terapéuticos osmóticos para liberación controlada. Los agentes adicionales incluyen partículas biodegradables o biocompatibles o una sustancia polimérica tal como poliésteres, ácidos poliamina, hidrogel, polivinilpirrolidona, polianhídridos, ácido poliglicólico, acetato de etileno y vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, sulfato de protamina o copolímeros de lactida/glicólido, copolímeros de polilactida/glicólido o copolímeros de acetato de etileno y vinilo para controlar el suministro de una composición administrada. Por ejemplo, el agente oral se puede atrapar en microcápsulas preparadas mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, mediante el uso de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina o microcápsulas de poli (metilmetacrilato), respectivamente, o en un sistema coloidal de administración de fármacos. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, microperlas y sistemas basados en lípidos, que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Los procedimientos para la preparación de las formulaciones antes mencionadas resultarán evidentes para los expertos en la técnica.

Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura en las que el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio, caolín o celulosa microcristalina, o como cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para su fabricación. Dichos excipientes pueden ser agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes, por ejemplo, un fosfátido de origen natural (por ejemplo, lecitina), o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos (por ejemplo, estearato de polioxietileno), o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga (por ejemplo, para heptadecaetilenoxicetanol), o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitol), o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol (por ejemplo, monooleato polietilen sorbitán). Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes.

Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como la parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden añadirse agentes edulcorantes tales como los expuestos anteriormente y agentes saborizantes para proporcionar una preparación oral agradable.

Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados se ejemplifican en el presente documento.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo, parafina líquida, o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo, goma de acacia o goma de tragacanto; fosfátidos de origen natural, por ejemplo, soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos; anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán; y productos de condensación de ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietilensorbitán.

Las formulaciones también pueden incluir vehículos para proteger la composición contra la rápida degradación o eliminación del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, liposomas, hidrogeles, profármacos y sistemas de administración microencapsulados. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o estearato de glicerilo solo o en combinación con una cera.

La presente divulgación contempla la administración de los polipéptidos IL-10 en forma de supositorios para administración rectal. Los supositorios se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a temperaturas normales pero líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se derretirá en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen, pero no se limitan a, manteca de cacao y polietilenglicoles.

Los polipéptidos IL-10 contemplados por la presente divulgación pueden estar en forma de cualquier otra composición farmacéutica adecuada (por ejemplo, aerosoles para uso nasal o por inhalación) actualmente conocida o desarrollada en el futuro.

La concentración de un polipéptido o fragmento del mismo en una formulación puede variar ampliamente (por ejemplo, desde menos de aproximadamente 0,1%, normalmente al menos aproximadamente 2% hasta tanto como 20% a 50% o más en peso) y normalmente se seleccionará principalmente con base en los volúmenes de fluido, viscosidades y factores basados en el sujeto de acuerdo con, por ejemplo, el modo particular de administración seleccionado.

Rutas de administración

La presente divulgación contempla la administración de IL-10 y composiciones de los mismos, de cualquier manera apropiada. Las vías de administración adecuadas incluyen parenteral (por ejemplo, intramuscular, intravenosa, subcutánea (por ejemplo, inyección o implante), intraperitoneal, intracisternal, intraarticular, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa) e intracerebroventricular), oral, nasal, vaginal, sublingual, intraocular, rectal, tópico (por ejemplo, transdérmica), sublingual e inhalación. Las inyecciones de depósito, que generalmente se administran por vía subcutánea o intramuscular, también se pueden utilizar para liberar los polipéptidos IL-10 descritos en este documento durante un período de tiempo definido.

Las realizaciones particulares de la presente divulgación contemplan la administración parenteral y, en otras realizaciones particulares, la administración parenteral es subcutánea.

Terapia de combinación complementaria

La presente divulgación contempla el uso de las combinaciones de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) y uno o más inhibidores del punto de control inmunitario en combinación adicional con uno o más agentes terapéuticos activos u otras modalidades profilácticas o terapéuticas (por ejemplo, radiación). Para los fines de esta solicitud, dichas combinaciones adicionales pueden denominarse "combinaciones complementarias", "terapia de combinación complementaria" y similares, y los agentes que se añaden a combinaciones de IL-10 y un inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario pueden denominarse como "agentes complementarios" y similares. En dicha terapia de combinación complementaria, los diversos agentes activos complementarios frecuentemente tienen diferentes mecanismos de acción que IL-10 y/o el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario. Tal terapia de combinación complementaria puede ser especialmente ventajosa al permitir una reducción de la dosis de uno o más de los agentes, reduciendo o eliminando así los efectos adversos asociados con uno o más de los agentes; además, tal terapia de combinación complementaria puede tener un efecto terapéutico o profiláctico sinérgico sobre la enfermedad, trastorno o afección subyacente. Como se divulga en el presente documento, el agente o agentes complementarios es un agente o agentes de diagnóstico.

En presente documento se divulgan procedimientos para tratar y/o prevenir enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con cáncer, con los polipéptidos IL-10 descritos en el presente documento (por ejemplo, PEG-IL-10) y un inhibidor del punto de control inmunitario, y al menos un agente terapéutico o de diagnóstico adicional (es decir, agente o agentes complementarios). Las enfermedades, trastornos y afecciones pueden ser cáncer, tumor o enfermedad, trastorno o afección precancerosa. Aunque el enfoque de esta sección está en el tratamiento y/o prevención de enfermedades, trastornos o afecciones asociadas con el cáncer, el aumento adicional de la terapia de combinación complementaria descrita en este documento con agentes útiles en el tratamiento y/o prevención de cualquier enfermedad no asociada al cáncer, trastorno o condición.

En algunas realizaciones de la presente invención, cada uno de los agentes de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10), el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario y el agente o agentes complementarios pueden estar en una forma de dosificación separada. A modo de ejemplo, la PEG-IL-10 puede estar en una formulación adecuada para la administración subcutánea, el inhibidor del punto de control inmunitario puede estar en una formulación adecuada para la administración intravenosa y el agente complementario puede estar en una formulación adecuada para la administración oral; en este contexto, cada uno de los agentes se puede alojar por separado o dos o más de los agentes se pueden alojar juntos (por ejemplo, como componentes distintos de un kit). En otras realizaciones de la presente divulgación, dos o más del agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10), el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario y el agente o agentes complementarios están en la misma forma de dosificación. Por ejemplo, la PEG-IL-10, el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario y el agente o agentes complementarios se pueden formular para administración intravenosa; en este contexto, uno o más de los agentes pueden coformularse (por ejemplo, como agentes terapéuticos activos en una jeringa).

En ciertas realizaciones, el agente de IL-10, el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario y el agente o agentes complementarios (por ejemplo, un agente quimioterapéutico) se administran o aplican secuencialmente, por ejemplo, cuando se administra el agente de IL-10 en primer lugar, en segundo lugar se administra un inhibidor del punto de control inmunitario y en último lugar se administra un agente complementario. En otras realizaciones, el agente de IL-10, el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario y el agente o agentes complementarios se administran simultáneamente, por ejemplo, cuando dos de los agentes se administran simultáneamente y el tercero se administra antes o después. Independientemente de si el agente de IL-10, el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario y el agente o agentes complementarios se administran secuencialmente, simultáneamente, o alguna variación del mismo, se considera que se administran como terapia de combinación complementaria para los propósitos de la presente divulgación.

La presente divulgación contempla el uso de cualquier régimen de dosificación posible para la terapia de combinación complementaria que pueda ser aceptable, apropiada u óptima bajo las circunstancias. Los regímenes descritos a continuación son ejemplares, no excluyentes. En una realización, el tratamiento con el agente de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10), el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario y el agente o agentes complementarios se mantienen durante un período de tiempo. En otra realización, el tratamiento con el agente de IL-10, el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario y el agente o agentes complementarios se reducen o continúan durante un período de tiempo (por ejemplo, cuando el sujeto está estable). En otra realización, el tratamiento con el agente o agentes complementarios se reduce o interrumpe (por ejemplo, cuando el sujeto está estable), mientras que el tratamiento con el agente de IL-10 y el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario se mantienen en un régimen de dosificación constante. En una realización adicional, el tratamiento con el agente o agentes complementarios se reduce o se interrumpe (por ejemplo, cuando el sujeto está estable), el tratamiento con el agente de IL-10 se reduce (por ejemplo, dosis más baja, dosificación menos frecuente o régimen de tratamiento más corto), y el tratamiento con el inhibidor del punto de control inmunitario se mantiene en un régimen de dosificación constante. En una realización adicional, el tratamiento con el agente o agentes complementarios se reduce o se interrumpe (por ejemplo, cuando el sujeto está estable), el tratamiento con el agente de IL-10 se reduce (por ejemplo, dosis más baja, dosificación menos frecuente o régimen de tratamiento más corto) y el tratamiento con el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario se mantiene en un régimen de dosificación constante.

En otra realización más, el tratamiento con el agente o agentes complementarios y el agente de IL-10 se mantiene en un régimen de dosificación constante, mientras que el tratamiento con el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario se reduce o se suspende (por ejemplo, cuando el sujeto está estable). En otra realización más, el tratamiento con el agente o agentes complementarios y el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario se mantiene en un régimen de dosificación constante, mientras que el tratamiento con el agente de IL-10 se reduce o se interrumpe (por ejemplo, dosis más baja, dosis menos frecuente o régimen de tratamiento más corto). La identificación y el uso de otros regímenes de dosificación serán evidentes para el experto en la materia.

Aunque agentes particulares adecuados para su uso con las combinaciones de agentes de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) y el inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario descritos en el presente documento se exponen a continuación, debe entenderse que la presente divulgación no está tan limitada. Las realizaciones de la presente divulgación contemplan el uso de agentes complementarios (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos) para tratar y/o prevenir cáncer, tumor o enfermedad, trastorno o afección precancerosa o asociada al cáncer.

Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano menos frecuente; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluidas altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamima; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelorrubicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (Ara-C); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; platino y complejos de coordinación de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; Xeloda; ibandronato; CPT11; inhibidores de topoisomerasa; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Los agentes quimioterapéuticos también incluyen agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores tales como antiestrógenos, incluyendo por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, aromatasa que inhibe 4(5)-imidazoles, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, onapristona y toremifeno; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En determinadas realizaciones, la terapia de combinación comprende la administración de una hormona o agente hormonal relacionado.

Cualquier otro agente útil en el tratamiento o prevención de las afecciones cancerosas descritas en el presente documento se contempla como un agente complementario, que incluye, entre otros, una citocina o antagonista de citocina, tal como IL-12, INFa o receptor del factor de crecimiento antiepidérmico, radioterapia, un anticuerpo monoclonal contra otro antígeno tumoral, un complejo de un anticuerpo monoclonal y una toxina, un adyuvante de células T, trasplante de médula ósea o células presentadoras de antígenos (por ejemplo, terapia con células dendríticas). También se proporcionan en este documento vacunas (por ejemplo, como una proteína soluble o como un ácido nucleico que codifica la proteína).

La presente divulgación abarca sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Dosificación

Aunque la descripción de dosificación y tópicos relacionados con la dosificación que se viene a continuación se presenta en el contexto de IL-10, la descripción es aplicable en gran medida al inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario que se utilizan en la terapia de combinación descrita en este documento. Los parámetros de dosificación específicos pertinentes a los inhibidores del punto de control inmunitario descritos en este documento pueden determinarse fácilmente a partir de otras fuentes, tales como los prospectos que acompañan a los productos terminados para la venta.

Los agentes de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) de la presente divulgación se pueden administrar a un sujeto en una cantidad que depende, por ejemplo, del objetivo de la administración (por ejemplo, el grado de resolución deseado); la edad, peso, sexo y estado de salud y físico del sujeto al que se administra la formulación; la vía de administración; y la naturaleza de la enfermedad, trastorno, afección o síntoma de la misma. El régimen de dosificación también puede tener en cuenta la existencia, naturaleza y alcance de cualquier efecto adverso asociado con el agente o agentes que se administran. Las cantidades de dosificación y los regímenes de dosificación eficaces se pueden determinar fácilmente a partir de, por ejemplo, ensayos de seguridad y aumento de dosis, estudios in vivo (por ejemplo, modelos animales) y otros procedimientos conocidos por el experto en la materia.

Como se discute en detalle en otra parte, la presente divulgación contempla administración de IL-10 para alcanzar ciertas concentraciones mínimas en suero y/o mantener ciertas concentraciones mínimas medias en suero.

En general, los parámetros de dosificación dictan que la cantidad de dosificación sea menor que una cantidad que podría ser irreversiblemente tóxica para el sujeto (es decir, la dosis máxima tolerada, "MTD") y no menor que la cantidad requerida para producir un efecto medible en el sujeto. Dichas cantidades se determinan, por ejemplo, por los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos asociados con ADME, teniendo en cuenta la vía de administración y otros factores.

Una dosis eficaz (ED) es la dosis o cantidad de un agente que produce una respuesta terapéutica o el efecto deseado en alguna fracción de los sujetos que la toman. La "dosis media eficaz" o ED50 de un agente es la dosis o cantidad de un agente que produce una respuesta terapéutica o efecto deseado en el 50% de la población a la que se administra. Aunque la ED50 se usa comúnmente como una medida de expectativa razonable del efecto de un agente, no es necesariamente la dosis que un médico podría considerar apropiada teniendo en cuenta todos los factores relevantes. Por lo tanto, en algunas situaciones la cantidad eficaz puede ser mayor que la ED50 calculada, en otras situaciones la cantidad eficaz puede ser menor que la ED50 calculada y en otras situaciones la cantidad eficaz puede ser la misma que la ED50 calculada.

Además, una dosis eficaz de los agentes de IL-10 (PEG-IL-10) de la presente divulgación puede ser una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un sujeto, produce un resultado deseado en relación con un sujeto sano. Por ejemplo, para un sujeto que experimenta un trastorno particular, una dosis eficaz puede ser una que mejore un parámetro, medida, marcador y similares de diagnóstico de ese trastorno en al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 90%, o más del 90%, cuando el 100% se define como el parámetro de diagnóstico, medida, marcador y similares exhibidos por un sujeto normal.

La cantidad de PEG-IL-10 necesaria para tratar una enfermedad, trastorno o afección descrita en el presente documento se basa en la actividad de IL-10 de la proteína conjugada, que puede determinarse mediante ensayos de actividad de IL-10 conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, en el contexto del tumor, la actividad adecuada de IL-10 incluye, por ejemplo, infiltración de células T CD8+ en sitios tumorales, expresión de citocinas inflamatorias, tales como IFN-y, IL-4, IL-6, IL-10 y RANK-L, de estas células infiltrantes, y niveles aumentados de TNF-a o IFN-y en muestras biológicas.

La cantidad terapéuticamente eficaz de PEG-IL-10 puede variar de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 |jg de proteína/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0,1 a 20 |jg de proteína/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0,5 a 10 |jg de proteína/kg de peso corporal/día, o aproximadamente de 1 a 4 |jg de proteína/kg de peso corporal/día. En algunas realizaciones, PEG-IL-10 se administra mediante infusión continua para administrar aproximadamente 50 a 800 jg de proteína/kg de peso corporal/día (por ejemplo, aproximadamente 1 a 16 jg de proteína/kg de peso corporal/día de PEG-IL-10). La velocidad de infusión se puede variar basándose en la evaluación de, por ejemplo, efectos adversos y recuentos de células sanguíneas. Otros parámetros de dosificación específicos para los agentes de IL-10 se describen en otra parte del presente documento.

Para la administración de un agente oral, las composiciones se pueden proporcionar en forma de comprimidos, cápsulas y similares que contienen de 1,0 a 1000 miligramos del ingrediente activo, particularmente 1,0, 3,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0. , 50,0, 75,0, 100,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 400,0, 500,0, 600,0, 750,0, 800,0, 900,0 y 1000,0 miligramos del ingrediente activo.

En determinadas realizaciones, la dosis del polipéptido IL-10 descrito está contenida en una "forma de dosificación unitaria". La frase "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de un polipéptido IL-10 de la presente divulgación, ya sea solo o en combinación con uno o más agentes adicionales, suficiente para producir el efecto deseado. Se apreciará que los parámetros de una forma de dosificación unitaria dependerán del agente particular y del efecto a conseguir.

Kits

En el presente documento se divulgan kits que comprenden IL-10 y sus composiciones farmacéuticas. Los kits tienen generalmente la forma de una estructura física que aloja varios componentes, como se describe a continuación, y se pueden utilizar, por ejemplo, en la práctica de los procedimientos descritos anteriormente.

Un kit puede incluir uno o más agentes de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) descritos en este documento (proporcionados, por ejemplo, en un recipiente estéril), que pueden estar en forma de una composición farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. Los agentes de IL-10 se pueden proporcionar en una forma que esté lista para su uso o en una forma que requiera, por ejemplo, reconstitución o dilución antes de la administración. Cuando los agentes de IL-10 están en una forma que necesita ser reconstituida por un usuario, el kit también puede incluir tampones, excipientes farmacéuticamente aceptables y similares, empaquetados con o por separado de los agentes de IL-10. Cuando se contempla la terapia de combinación (por ejemplo, un agente de IL-10 y un inhibidor o inhibidores del punto de control inmunitario, el kit puede contener los diversos agentes por separado o pueden ya estar combinados en el kit. De manera similar, cuando la terapia complementaria (por ejemplo, se contempla un agente de IL-10, un inhibidor o inhibidores del punto de control inmunológico y un agente complementario), el kit puede contener varios agentes por separado o dos o más de ellos ya pueden estar combinados en el kit. Un kit de la presente divulgación puede estar diseñado para las condiciones necesarias para mantener adecuadamente los componentes alojados en él (por ejemplo, refrigeración o congelación).

Un kit puede contener una etiqueta o prospecto que incluya información de identificación de los componentes e instrucciones para su uso (por ejemplo, parámetros de dosificación, farmacología clínica del principio o principios activos, incluido el mecanismo o mecanismos de acción, farmacocinética y farmacodinámica, efectos adversos, contraindicaciones, etc.). Cada componente del kit puede incluirse dentro de un contenedor individual y todos los diversos contenedores pueden estar dentro de un solo paquete. Las etiquetas o prospectos pueden incluir información del fabricante, tal como números de lote y fechas de vencimiento. La etiqueta o el prospecto del envase pueden estar, por ejemplo, integrados en la estructura física que aloja los componentes, contenidos por separado dentro de la estructura física o fijados a un componente del kit (por ejemplo, una ampolla, jeringa o vial).

Las etiquetas o prospectos pueden incluir adicionalmente, o incorporarse en, un medio legible por ordenador, tal como un disco (por ejemplo, disco duro, tarjeta, disco de memoria), disco óptico tal como CD o DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, cinta magnética o un medio de almacenamiento eléctrico como RAM y ROM o híbridos de estos tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos, medios FLASH o tarjetas de tipo memoria. En algunas realizaciones, las instrucciones reales no están presentes en el kit, pero se proporcionan medios para obtener las instrucciones de una fuente remota, por ejemplo, a través de un sitio de Internet.

Parte experimental

Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar la presente invención. Se entiende que las descripciones ejemplares escritas en tiempo presente no fueron necesariamente realizadas sino que las descripciones se pueden realizar para generar los datos y similares descritos en ellas. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales.

A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio ponderado, la temperatura está en grados Celsius (°C) y la presión está en o cerca de la atmosférica. Se utilizan abreviaturas estándar, incluidas las siguientes: pb = par o pares de bases; kb = kilobase o kilobases; pi = picolitro o picolitros; s o seg. = segundo o segundos; min = minuto o minutos; h = hora o horas; aa = aminoácido o aminoácidos; kb = kilobase o kilobases; nt = nucleótido o nucleótidos; pg = picogramo; ng = nanogramo; |jg = microgramo; mg = miligramo; g = gramo; kg = kilogramo; dl o dL = decilitro; j l o jL = microlitro; ml o mL = mililitro; lo L = litro; jM = micromolar; mM = milimolar; M = molar; kDa = kiloDalton; im = intramuscular(mente); ip = intraperitoneal (mente); SC o SQ = subcutáneo (mente); QD = diario; BID = dos veces al día; QW = semanal; QM = mensual; HPLC = cromatografía líquida de alta resolución; BW = peso corporal; U = unidad; ns = no estadísticamente significativo; PBS = solución salina tamponada con fosfato; PCR = reacción en cadena de la polimerasa; NHS = N-hidroxisuccinimida; HSA = albúmina de suero humano; MSA = albúmina de suero de ratón; DMEM = modificación de Dulbecco del medio de Eagle; GC = copia del genoma; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético.

Materiales y procedimientos

Los siguientes materiales y procedimientos generales pueden usarse en la práctica de la presente divulgación y/o la realización de trabajos experimentales asociados con varios aspectos de la presente divulgación.

Los procedimientos estándar en biología molecular se describen en la bibliografía científica (véase, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; y Ausubel, et al., (2001) Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nueva York, NY, que describe la clonación en células bacterianas y mutagénesis del ADN (vol. 1), la clonación en células de mamíferos y levadura (vol. 2), glicoconjugados y expresión de proteínas (Vol. 3), y bioinformática (Vol. 4)).

La bibliografía científica describe procedimientos para la purificación de proteínas, que incluyen inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización, así como análisis químico, modificación química, modificación postraduccional, producción de proteínas de fusión y glicosilación de proteínas (véase, por ejemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Volúmenes 1-2, John Wiley and Sons, Inc., NY).

Se describen la producción, purificación y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales (por ejemplo, Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY); técnicas estándar para caracterizar las interacciones ligando/receptor están disponibles (véase, por ejemplo, Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., NY); están disponibles procedimientos para citometría de flujo, incluida la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (véase, por ejemplo, Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ); y reactivos fluorescentes adecuados para modificar ácidos nucleicos, incluidos cebadores y sondas de ácido nucleico, polipéptidos y anticuerpos, para su uso, por ejemplo, como reactivos de diagnóstico, están disponibles (catálogo de Molecular Probes (2003) Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.; Catálogo de Sigma-Aldrich (2003), St. Louis, MO.).

Se encuentran disponibles paquetes de software y bases de datos para determinar, por ejemplo, fragmentos antigénicos, secuencias líder, plegamiento de proteínas, dominios funcionales, sitios de glicosilación y alineamientos de secuencias (véase, por ejemplo, GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA) y DeCypherMR (TimeLogic Corp., Crystal Bay, NV).

Se describen procedimientos estándar de histología del sistema inmunológico (véase, por ejemplo, Louis et al., (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nueva York, NY). El agotamiento de las células inmunitarias (células T CD4+ y CD8+) puede efectuarse mediante eliminación mediada por anticuerpos. Por ejemplo, se pueden inyectar semanalmente 250 jg de anticuerpos específicos de CD4 o CD8, y se pueden verificar las reducciones de células mediante análisis FACS e IHC.

Se pueden usar cepas de diversos ratones y otros animales junto con las enseñanzas de la presente divulgación. Por ejemplo, pueden obtenerse ratones Balb/C inmunocompetentes o Balb/C deficientes en células B de The Jackson Lab., Bar Harbor, ME y utilizarse de acuerdo con procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Martin et al., (2001) Infect. Immun., 69 (11): 7067-73 y Compton et al., (2004) Comp. Med. 54 (6): 681-89). Otras cepas de ratones adecuadas para el trabajo experimental contemplado por la presente divulgación son conocidas por el experto en la materia y generalmente están disponibles en The Jackson Lab.

Los niveles de concentración de IL-10 en suero y los niveles de exposición pueden determinarse mediante procedimientos estándar usados en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de nivel de exposición en suero recolectando sangre completa (~50 jl/ratón) de cortes de cola de ratón en tubos capilares simples, separando el suero y las células sanguíneas por centrifugación y determinando los niveles de exposición a IL-10 mediante kits y técnicas estándar de ELISA.

Ensayos para determinar la bioactividad de formas modificadas de IL-10

La presente divulgación contempla el uso de cualquier ensayo y metodología conocida en la técnica para determinar la bioactividad de las moléculas de IL-10 descritas en el presente documento. Los ensayos descritos a continuación son representativos y no excluyentes.

Ensayo de inhibición de TNF La estimulación por PM A de las células U937 (línea de células linfoblásticas humanas de pulmón disponible en Sigma-Aldrich (# 85011440); St. Louis, MO) hace que las células secreten TNFa y el tratamiento posterior de estas células secretoras de TNFa con IL-10 humana provoca una disminución en la secreción de TNFa de una manera dependiente de la dosis. Se puede realizar un ensayo de inhibición de TNFa ejemplar usando el siguiente protocolo. Después de cultivar células u 937 en RMPI que contiene FBS/FCS al 10% y antibióticos, placa con 1 x 105 células U93790% viables en placas de fondo plano de 96 pocillos (se puede usar cualquier placa de cultivo de tejidos tratada con plasma (por ejemplo, Nunc; Thermo Scientific, EE. UU.) por triplicado por condición. Se siembran células en placa para proporcionar las siguientes condiciones (todas al menos por triplicado; para 'solo medio' el número de pocillos se duplica porque la mitad se usará para la viabilidad después de la incubación con PMA 10 j M): 5 ng/ml de LPS solo; 5 ng/ml de LPS 0,1 ng/ml de rhIL-10; 5 ng/ml de LPS 1 ng/ml de rhIL-10; 5 ng/ml de LpS 10 ng/ml de rhIL-10; 5 ng/ml de LPS 100 ng/ml de rhIL-10; 5 ng/ml de LPS 1000 ng/ml de rhIL-10; 5 ng/ml de LPS 0,1 ng/ml de PEG-rhIL-10; 5 ng/ml de LPS 1 ng/ml de PEG-rhIL-10; 5 ng/ml de LPS 10 ng/ml de PEG-rhIL-10; 5 ng/ml de LPS 100 ng/ml de PEG-rhIL-10; y 5 ng/ml de LPS 1000 ng/ml de PEG-rhIL-10. Se expone cada pocillo a PMA 10 j M en 200 durante 24 horas, cultivando a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5%, después de lo cual aproximadamente el 90% de las células deben ser adherentes. Los tres pocillos adicionales se resuspenden y las células se cuentan para evaluar la viabilidad (> 90% deberían ser viables). Se lava suavemente pero a fondo 3 veces con un medio fresco que no contenga PMA, asegurándose de que las células todavía estén en los pocillos. Se agregan 100 j l por pocillo de medio que contenga las concentraciones adecuadas (2X ya que el volumen se diluirá al 100%) de rhlL-10 o PEG-rhIL-10, se incuba a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 30 minutos. Se agregan 100 por pocillo de un patrón de LPS de 10 ng/ml para lograr una concentración final de 5 ng/ml de LPS en cada pocillo y se incuba a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 18 a 24 horas. Se retira el sobrenadante y se realiza el ELISA de TNFa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se procesa cada sobrenadante acondicionado por duplicado en ELISA.

Ensayo de proliferación celular MC/9. La administración de IL-10 a células MC/9 (línea celular murina con características de mastocitos disponible a través de Cell Signaling Technology; Danvers, MA) provoca un aumento de la proliferación celular de una manera dependiente de la dosis. Thompson-Snipes, L. et al. ((1991) J. Exp. Med. 173: 507-10) describen un protocolo de ensayo estándar en el que las células MC/9 se complementan con IL3 IL10 e IL3 IL4 IL10. Los proveedores (por ejemplo, R&D Systems, EE. UU.; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) utilizan el ensayo como un ensayo de liberación de lotes para rhIL10. Los expertos en la técnica podrán modificar el protocolo de ensayo estándar descrito en Thompson-Snipes, L. et al., de modo que las células solo se complementen con IL-10.

Ensayo de secreción de IFNy de células T CD8. Las células T CD8 humanas primarias activadas secretan IFNy cuando se tratan con PEG-IL-10 y luego con un anticuerpo anti-CD3. El siguiente protocolo proporciona un ejemplo de ensayo de secreción de IFNy de células T CD8. Las células mononucleares de sangre periférica primaria humana (PBMC) se pueden aislar de acuerdo con cualquier protocolo estándar (véase, por ejemplo, Fuss et al., (2009) Current Protocols in Immunology, Unidad 7.1, John Wiley, Inc., NY). Se pueden cultivar 2,5 ml de PBMC (a una densidad celular de 10 millones de células/ml) por pocillo con RPMI completo, que contiene RPMI (Life Technologies; Carlsbad, CA), HEPES 10 mM (Life Technologies; Carlsbad, CA), suero de ternero fetal al 10% (Hyclone Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA) y cóctel de penicilina/estreptomicina (Life Technologies; Carlsbad, CA), en cualquier placa de 6 pocillos tratada con cultivo de tejido estándar (BD; Franklin Lakes, NJ). Puede añadirse IL-10 pegilada humana a los pocillos a una concentración final de 100 ng/ml; también se puede añadir una concentración final de 10 pg/ml de anticuerpos que bloquean la función de los receptores inhibidores/puntos de control en combinación con IL-10 pegilada. Las células se pueden incubar en una incubadora humidificada a 37 °C con CO2 al 5% durante 6-7 días. Después de esta incubación, las células T CD8 se pueden aislar utilizando la tecnología de separación de células MACS de Miltenyi Biotec de acuerdo con el protocolo del fabricante (Miltenyi Biotec; Auburn, c A). Las células T CD8 aisladas se pueden cultivar con RPMI completo que contiene 1 pg/ml de anticuerpo anti-CD3 (Affymetrix eBioscience; San Diego, CA) en cualquier placa de cultivo de tejidos estándar durante 4 horas. Después de la incubación de 4 horas, los medios pueden recolectarse y analizarse para IFNy usando un kit de ELISA comercial y siguiendo el protocolo del fabricante (Affymetrix eBioscience; San Diego, CA).

Modelos de tumores y análisis de tumores. Puede usarse cualquier modelo de tumor, ensayo y similares aceptados en la técnica para evaluar el efecto de las moléculas de IL-10 descritas en el presente documento sobre varios tumores. Los modelos de tumores y los análisis de tumores que se describen a continuación son representativos de los que se pueden utilizar. Se inyectan células tumorales singénicas de ratón por vía subcutánea o intradérmica a razón de 104, 105 o 106 células por inoculación tumoral. Pueden usarse modelos de carcinoma mamario Ep2, carcinoma de colon CT26, carcinoma escamoso de piel PDV6 y carcinoma de mama 4T1 (véase, por ejemplo, Langowski et al., (2006) Nature 442: 461-465). Se pueden utilizar ratones Balb/C inmunocompetentes o Balb/C deficientes en células B. Se puede administrar PEG-mIL-10 a ratones inmunocompetentes, mientras que el tratamiento con PEG-hIL-10 se puede administrar a ratones deficientes en células B.

Se permite que los tumores alcancen un tamaño de 100-250 mm3 antes de iniciar el tratamiento. Se administran IL-10, PEG-mIL-10, PEG-hIL-10 o control de tampón por vía subcutánea en un sitio distante de la implantación del tumor. El crecimiento del tumor se controla típicamente dos veces por semana utilizando calibradores electrónicos. Los tejidos tumorales y los órganos linfáticos se recolectan en varios puntos finales para medir la expresión de ARNm para varios marcadores inflamatorios y para realizar inmunohistoquímica para varios marcadores de células inflamatorias. Los tejidos se congelan rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 °C. El crecimiento del tumor primario se controla típicamente dos veces por semana utilizando calibradores electrónicos. El volumen del tumor se puede calcular usando la fórmula (ancho2 x largo/2) en la que la longitud es la dimensión más larga. Se permite que los tumores alcancen un tamaño de 90-250 mm3 antes de iniciar el tratamiento.

Producción de IL-10 pegilada

La presente divulgación contempla la síntesis de IL-10 pegilada por cualquier medio conocido por el experto en la materia. La descripción a continuación de varios esquemas sintéticos alternativos para producir mono-PEG-IL-10 y una mezcla de mono-/di-PEG-IL-10 pretende ser solo ilustrativa. Si bien tanto mono-PEG-IL-10 como una mezcla de mono-/di-PEG-IL-10 tienen muchas propiedades comparables, una mezcla de mono- y di-PEG-IL-10 pegilada selectivamente mejora el rendimiento del producto pegilado final (véanse, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 7.052.686 y la publicación de la patente de los Estados Unidos No. 2011/0250163). Además de aprovechar sus propias habilidades en la producción y el uso de PEG (y otras tecnologías de administración de fármacos) adecuados en la práctica de la presente divulgación, el experto en la materia también está familiarizado con muchos proveedores comerciales de tecnologías relacionadas con PEG (y otras tecnologías de administración de fármacos). A modo de ejemplo, NOF America Corp (Irvine, CA) suministra PEG lineales monofuncionales, PEG bifuncionales, PEG de múltiples brazos, PEG ramificados, PEG heterofuncionales, PEG bifurcados y PEG liberables; y Parchem (New Rochelle, NY) es un distribuidor global de productos de PEG y otras materias primas especiales.

Esquema ejemplar de síntesis No 1 de PEG-IL-10. Se dializa IL-10 frente a fosfato de sodio 10 mM pH 7,0, NaCl 100 mM. La IL-10 dializada se diluye 3,2 veces hasta una concentración de aproximadamente 0,5 a 12 mg/ml usando el tampón de diálisis. Antes de la adición del enlazador, SC-PEG-12K (Delmar Scientific Laboratories, Maywood, Ill.), se agrega un volumen de tetraborato de sodio 100 mM a pH 9,1 en 9 volúmenes de IL-10 diluida para elevar el pH de la solución de IL-10 hasta 8,6. El enlazador SC-PEG-12K se disuelve en el tampón de diálisis y se añade el volumen apropiado de la solución del enlazador (1,8 a 3,6 moles de enlazador por mol de IL-10) a la solución de IL-10 diluida para iniciar la reacción de pegilación. La reacción se lleva a cabo a 5 °C para controlar la velocidad de la reacción, y la solución de reacción se agita suavemente. Cuando el rendimiento de mono-PEG-IL-10, según se determina mediante HPLC de exclusión por tamaño (SE-HPLC), se acerca al 40%, la reacción se detiene añadiendo una solución de glicina 1 M hasta una concentración final de 30 mM. El pH de la solución de reacción se ajusta lentamente a 7,0 usando una solución de HCl, y la reacción se filtra a través de 0,2 micrómetros y se almacena a -80°C.

Esquema ejemplar de síntesis No 2 de PEG-IL-10. Se prepara mono-PEG-IL-10 usando metoxi-PEG-aldehído (PALD-PEG) como enlazador (Inhale Therapeutic Systems Inc., Huntsville, AL; también disponible a través de NOF America Corp (Irvine, CA)). PALD-PEG puede tener pesos moleculares de 5 KDa, 12 KDa o 20 KDa. La IL-10 se dializa y diluye como se describió anteriormente, excepto que el pH del tampón de reacción está entre 6,3 y 7,5. El enlazador PALD-PEG activado se añade al tampón de reacción en una relación molar 1:1. Se añade cianoborohidruro acuoso a la mezcla de reacción hasta una concentración final de 0,5 a 0,75 mM. La reacción se lleva a cabo a temperatura ambiente (18-25 °C) durante 15-20 horas con agitación suave. La reacción se detiene con glicina 1M. Los rendimientos se analizan por SE-HPLC. Mono-PEG-IL-10 se separa de IL-10 sin reaccionar, enlazador de PEG y di-PEG-IL-10 mediante cromatografía de filtración en gel y se caracteriza por RP-HPLC y bioensayo (por ejemplo, estimulación de células o líneas celulares sensibles a IL-10).

Esquema ejemplar de síntesis No 3 de PEG-IL-10. Se dializa IL-10 (por ejemplo, de roedor o primate) frente a fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 100 mM en intervalos de pH de 5-7,4. A1: relación molar 1-1:7 de PEG-propilaldehído 5K reacciona con IL-10 a una concentración de 1-12 mg/ml en presencia de cianoborohidruro de sodio 0,75-30 mM. Alternativamente, la reacción se puede activar con picolina borano de una manera similar. La reacción se incuba a 5­ 30 °C durante 3-24 horas. El pH de la reacción de pegilación se ajusta a 6,3, se hacen reaccionar 7,5 mg/ml de hIL-10 con PEG para obtener la relación de IL-10 con respecto al enlazador PEG de 1:3,5. La concentración final de cianoborohidruro es ~ 25 mM y la reacción se lleva a cabo a 15 °C durante 12-15 horas. El mono- y di-PEG IL-10 son los productos más grandes de la reacción, con la concentración de cada uno a ~45-50% al final. La reacción se puede interrumpir usando un aminoácido tal como glicina o lisina o, alternativamente, tampones Tris. Pueden emplearse múltiples procedimientos de purificación tales como filtración en gel, cromatografías de intercambio aniónico y catiónico y HPLC de exclusión por tamaño (SE-HPLC) para aislar las moléculas de IL-10 pegiladas deseadas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un agente de PEG-IL-10 que comprende al menos una molécula de PEG unida covalentemente a al menos un residuo de aminoácido de al menos una subunidad de IL-10 para su uso en el tratamiento de una afección proliferativa en un sujeto mamífero, en el que el agente de PEG-IL-10 se administra a dicho sujeto de manera que una concentración mínima media de IL-10 en suero de al menos 1 ng/ml se mantiene durante el 90% del período de tiempo de administración y en el que el sujeto también se trata con una cantidad biológicamente eficaz de al menos un inhibidor del punto de control inmunitario, en el que el inhibidor del punto de control inmunitario se dirige a un punto de control inmunitario seleccionado del grupo que consiste en CTLA4, PD1, PDL1, LAG3 y BTLA.

2. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la concentración mínima media en suero de IL-10 es de al menos 1,5 ng/ml, o al menos 2,0 ng/ml, y/o en el que la concentración mínima media en suero de IL-10 se mantiene durante al menos el 95% del período de tiempo de administración.

3. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el período de tiempo de administración del agente de p EG-IL-10 es al menos 48 horas.

4. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el agente de PEG-IL-10 se administra diariamente durante un período de tiempo de administración de al menos 1 semana.

5. El agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el inhibidor del punto de control inmunitario que se dirige a un punto de control inmunitario es un anticuerpo monoclonal.

6. El agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de la reivindicación 5, en el que el inhibidor del punto de control inmunitario es un agente que inhibe la unión de PD1 a PDL1.

7. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el agente se selecciona del grupo que consiste en nivolumab, abatacept e ipilimumab.

8. El agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la afección proliferativa es un cáncer.

9. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de células renales, cáncer de páncreas, melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de riñón o cáncer de mama.

10. El agente para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9, en el que el agente de PEG-IL-10 comprende una mezcla de IL-10 monopegilado y dipegilado, y/o en el que el componente de PEG del agente de PEG-IL-10 tiene una masa molecular de 5 kDa a 20 kDa.

11. El agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la IL-10 es IL-10 humana.

12. El agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el inhibidor del punto de control inmunitario y el agente de PEG-IL-10 se administran simultáne o secuencialmente.

13. El agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además administrar al menos un agente profiláctico o terapéutico adicional, tal como un agente quimioterapéutico.

14. El agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el sujeto mamífero es un ser humano.