ES2941234T3 - Métodos de uso de la interleucina-10 para el tratamiento de enfermedades y trastornos - Google Patents

Métodos de uso de la interleucina-10 para el tratamiento de enfermedades y trastornos Download PDF

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Abstract

Se proporcionan métodos para tratar sujetos que tienen una enfermedad o trastorno que responde a IL-10, incluidos métodos de administración y regímenes de dosificación asociados con los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de uso de la interleucina-10 para el tratamiento de enfermedades y trastornos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos de uso de la IL-10 y agentes relacionados en el tratamiento o la prevención del cáncer.
Introducción
La citocina interleucina-10 (IL-10) es una citocina pleiotrópica que regula múltiples respuestas inmunitarias a través de acciones sobre los linfocitos T, linfocitos B, macrófagos y células presentadoras de antígenos (APC, del inglés antigen presenting cells). La IL-10 puede suprimir respuestas inmunitarias mediante la inhibición de la expresión de IL-1a, IL-1p, IL-6, IL-8, TNF-a, GM-CSF y G-CSF en monocitos activados y macrófagos activados, y también suprime la producción de IFN-y por parte de las células NK. Aunque la IL-10 se expresa predominantemente en macrófagos, también se ha detectado expresión en linfocitos T activados, linfocitos B, mastocitos y monocitos. Además de suprimir las respuestas inmunitarias, la IL-10 presenta propiedades inmunoestimuladoras, que incluyen la estimulación de la proliferación de timocitos tratados con IL-2 e IL-4, el aumento de la viabilidad de los linfocitos B y la estimulación de la expresión del MHC de clase II.
La IL-10 humana es un homodímero que se vuelve biológicamente inactiva tras la interrupción de las interacciones no covalentes entre las dos subunidades monoméricas. Los datos obtenidos de la estructura cristalina publicada de la IL-10 indican que el dímero funcional muestra determinadas similitudes con el IFN-y (Zdanov et al., (1995) Structure (Lond) 3:591-601).
Como resultado de su actividad pleiotrópica, la IL-10 se ha relacionado con una amplia gama de enfermedades, trastornos y afecciones, incluyendo afecciones inflamatorias, trastornos relacionados con el sistema inmunitario, trastornos fibróticos y cáncer. Las evaluaciones clínicas y preclínicas con IL-10 para varias de estas enfermedades, trastornos y condiciones han consolidado su potencial terapéutico. Además, se ha demostrado que la IL-10 pegilada es más eficaz que la IL-10 no pegilada en determinados entornos terapéuticos.
Mumm J. B. et al. (Cancer Cell 20, 781-796, 13 de diciembre de 2011) divulga que la IL-10 induce varios mecanismos esenciales para una vigilancia inmunitaria antitumoral eficaz. Infiltración y activación de linfocitos T CD8+ citotóxicos específicos de tumor intratumorales, expresión de la citocina Th1 interferón-Y (IFN-y) y grancimas en linfocitos T CD8+, y moléculas de presentación de antígenos intratumorales. La vigilancia inmunitaria tumoral se debilita en ratones con deficiencia de IL-10, mientras que la sobreexpresión transgénica de IL-10 protege a los ratones de la carcinogénesis. El tratamiento con IL-10 pegilada restablece la función de los linfocitos T CD8+ intratumorales específicos del tumor y controla el crecimiento del tumor.
Emmerich J et al. (Cancer Research, Vol. 72, n.° 14, páginas 3570 - 3581, julio de 2012) divulgan que el tratamiento con la citocina pleiotrópica interleucina-10 (IL-10) induce la activación específica de los linfocitos T CD8t> residentes en el tumor, así como su expansión intratumoral en varios modelos de tumores en ratones. Los autores concluyen que sus datos indican que la IL-10 activa el control tumoral mediado por linfocitos T CD8t> y sugieren que la IL-10 puede representar una posible inmunoterapia tumoral en pacientes humanos con cáncer.
Tilg H et al. (Gut, Vol. 50, páginas 191-195, 2002) divulgan que la IL-10 ejerce acciones antinflamatorias al contrarrestar muchos efectos biológicos del interferón Y (IFN-y) y estudiaron (i) los efectos de la administración de IL-10 recombinante humana en la producción del iFN-y por los leucocitos de pacientes y (ii) los niveles séricos de neopterina y nitrito/nitrato de la molécula inducible de IFN-y, que son indicativos de la formación de óxido nítrico endógeno. El estudio se realizó en pacientes con enfermedad de Crohn activa crónica (CACD, del inglés chronic active Crohn's disease) y en pacientes con enfermedad de Crohn de leve a moderada (MCD, del inglés mild to moderate Crohn's disease) tratados con IL-10 subcutánea o placebo. Los autores señalaron que las dosis elevadas de IL-10 aumentan la producción de IFN-y y neopterina y que este fenómeno puede ser responsable de la falta de eficacia de las dosis elevadas de IL-10 en el tratamiento de la CACD y de la MCD.
Tilg H et al. (Cytokine, Vol. 7, n.° 7, páginas 734-739, 1995) divulgan un estudio que investigó la producción in vivo de interleucina 10 (IL-10) en pacientes con cáncer sometidos a inmunoterapia con IL-1a, IL-2 o IL-6. Los resultados del estudio sugieren que las citocinas proinflamatorias IL-1a e IL-2 inducen la citocina antinflamatoria IL-10 in vitro e in vivo, mientras que la IL-6 no es capaz de estimular la síntesis de IL-10.
El documento US 2011/0091419 A1 divulga un método para inhibir o reducir el crecimiento de un tumor o cáncer que comprende poner en contacto el tumor con una cantidad eficaz de interleucina-10 pegilada (PEG-IL-10).
Alvarez H. M. et al. (Drug Metabolism and Disposition, Vol. 40, n.° 2, páginas 360-373, 2012) divulgan los efectos de la PEGilación y la formación de complejos inmunitarios de IL-10 humana (hIL-10)/IL-10 antihumana humanizada (hahIL-10) en la farmacocinética, biodistribución y biotransformación de la IL-10 en ratones. El análisis de cromatografía de exclusión por tamaño de plasma indicó que la IL-10 murina pegilada (PEG-mIL-10) y nativa marcada con flúor son estables en la circulación. La PEGilación de la IL-10 dio como resultado una exposición 21 veces mayor, un aumento de 2,7 veces en la semivida y una reducción de 20 veces en el aclaramiento.
En vista de la prevalencia y la intensidad de las enfermedades, trastornos y afecciones asociadas a la IL-10, los nuevos regímenes de dosificación y parámetros que optimizan la eficacia, la tolerancia del paciente y similares serían de enorme valor para aumentar la utilidad terapéutica de la IL-10 y la IL-10 pegilada, y de los agentes relacionados con las mismas.
Sumario
La presente divulgación contempla métodos de uso de IL-10, IL-10 modificada (por ejemplo, pegilada) y agentes asociados descritos en el presente documento, y a composiciones de la misma, para tratar y/o prevenir diversas enfermedades, trastornos y afecciones, y/o los síntomas de las mismas. De manera más particular, la presente invención se refiere a parámetros de dosificación optimizados para lograr y mantener la eficacia en el tratamiento y/o la prevención de diversas enfermedades, trastornos y afecciones en un sujeto, mientras se minimizan los efectos indeseables asociados con las mismas. Como se establece en detalle a continuación, dicha optimización de los parámetros de dosificación implica, por ejemplo, la evaluación de los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos asociados con la absorción, distribución, metabolismo y excreción ("ADME"), teniendo en cuenta la vía de administración y otros factores. Se entiende que, a menos que se indique de otro modo en el presente documento, los términos relacionados con la ADME y otros parámetros pretenden tener sus significados comúnmente aceptados en los campos científicos pertinentes. Como ejemplo, la expresión "semivida en suero" o "tW, se refiere a la semivida de eliminación (es decir, el momento en que la concentración en suero de un agente ha alcanzado la mitad de su valor inicial o máximo).
Según los métodos descritos en el presente documento, la enfermedad, trastorno o afección, y/o los síntomas de las mismas, puede ser un trastorno proliferativo, tal como el cáncer o un trastorno relacionado con el cáncer. Como se divulga en el presente documento, la enfermedad, trastorno o afección puede ser un trastorno fibrótico, tal como cirrosis, NASH y NAFLD. Aunque no se limita a cánceres particulares, el cáncer puede ser un tumor sólido, incluidos los tumores asociados con el cáncer de colon, melanoma y carcinoma epidermoide, o puede ser un trastorno hemático.
Además, se divulga en el presente documento que la enfermedad, trastorno o afección es un trastorno vírico, que incluye, pero sin limitación, el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis B o C, o el citomegalovirus. Además también se divulga en el presente documento que la enfermedad, trastorno o afección es un trastorno inmunitario o inflamatorio, que puede ser agudo o crónico. Los ejemplos de trastornos inmunitarios e inflamatorios incluyen la enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, artritis reumatoide, esclerosis múltiple y la enfermedad de Alzheimer.
Además también se divulga en el presente documento que la enfermedad, trastorno o afección es un trastorno cardiovascular, incluida la ateroesclerosis. El sujeto que tiene un trastorno cardiovascular puede tener el colesterol elevado.
Además también se divulga en el presente documento que la enfermedad, trastorno o afección es trombosis o una afección trombótica.
Como se analiza más adelante, la IL-10 humana es un homodímero y cada monómero comprende 178 aminoácidos, de los cuales los primeros 18 comprenden un péptido señal. Realizaciones particulares de la presente divulgación comprenden polipéptidos IL-10 humanos maduros que carecen del péptido señal (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.217.857) o PEG-IL-10 humana madura. En otras realizaciones particulares, el agente IL-10 es una variante de la IL-10 humana madura. La variante puede presentar una actividad inferior, comparable o superior a la actividad de la IL-10 humana madura; en determinadas realizaciones, la actividad es comparable o superior a la actividad de la IL-10 humana madura.
Determinadas realizaciones de la presente divulgación contemplan la modificación de la IL-10 para mejorar una o más propiedades (por ejemplo, parámetros farmacocinéticos, eficacia, etc.). En realizaciones particulares, la IL-10 se modifica mediante, por ejemplo, pegilación, glucosilación, conjugación con albúmina (por ejemplo, seroalbúmina humana (HSA)) y hesilación. En realizaciones adicionales, la modificación de la IL-10 no da como resultado un efecto perjudicial terapéuticamente relacionado sobre la inmunogenicidad, y en otras realizaciones adicionales, la IL-10 modificada es menos inmunogénica que la IL-10 no modificada. Los términos "IL-10", "polipéptido(s) IL-10", "agente(s)" y similares están destinados a ser interpretados en sentido amplio e incluyen, por ejemplo, polipéptidos relacionados con la IL-10 humana y no humana, incluidos homólogos, variantes (incluidas muteínas) y fragmentos de los mismos, así como polipéptidos IL-10 que tengan, por ejemplo, una secuencia líder (por ejemplo, el péptido señal), y versiones modificadas de lo anterior. En otras realizaciones particulares, los términos "IL-10", "polipéptido(s) IL-10", "agente(s)" son agonistas. Realizaciones particulares se refieren a IL-10 pegilada, que también se denomina en el presente documento "PEG-IL-10". La presente divulgación también contempla moléculas de ácido nucleico que codifican lo anterior.
Como se describe en la sección experimental, la evaluación del efecto de PEG-hIL-10 en pacientes con tumores sólidos (por ejemplo, tumores de ovario, tumores renales, tumores colónicos o tumores pancreáticos) indicó que es ventajoso alcanzar concentraciones en suero de PEG-hIL-10 superiores a las contempladas inicialmente para optimizar la tasa de control de la enfermedad (TCE). En términos de oncología, la TCE se refiere a la proporción total de pacientes que demuestran una respuesta al tratamiento; la TCE es la suma de remisiones completas (RC) remisiones parciales (RP) enfermedad estable (EE). Debe observarse, sin embargo, que esa utilidad clínica también se observa a concentraciones más bajas.
Además, un análisis del efecto de la PEG-hIL-10 sobre el marcador tumoral CEA (CarcinoembryonicAntigen, antígeno carcinoembrionario) en pacientes con carcinoma colorrectal indicó que dosis más elevadas, junto con concentraciones en suero simultáneas más elevadas, que las inicialmente contempladas para dichos pacientes con cáncer fueron necesarias para lograr y mantener la enfermedad estable.
Las realizaciones particulares de la presente invención se refieren a un agente PEG-IL-10 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente PEG-IL-10, en donde el agente iL-10 es IL-10 humana madura o una variante de la IL-10 humana madura en donde la variante presenta una actividad comparable a la actividad de la IL-10 humana, en donde la variante incluye variantes de origen natural, variantes de origen no natural y variantes postraduccionales, en donde las variantes de origen natural incluyen homólogos de la IL-10 humana madura que difieren en aminoácidos de una especie a otra y variantes alélicas que difieren en aminoácidos de un individuo a otro dentro de una especie, en donde las variantes de origen no natural incluyen polipéptidos que comprenden cambios únicos o múltiples en aminoácidos donde el cambio(s) en la secuencia se introduce de manera artificial, en donde el agente PEG-IL-10 es un agente IL-10 que tiene una o más moléculas de PEG unidas covalentemente a al menos un resto de aminoácido del agente IL-10, en donde la modificación del agente IL-10 mediante unión covalente al PEG no modifica la secuencia de aminoácidos del agente IL-10, en donde la cantidad administrada al sujeto es suficiente para lograr una concentración mínima media de IL-10 en suero de al menos 10,0 ng/ml.
Preferentemente, el agente PEG-IL-10 comprende al menos una molécula de PEG unida covalentemente a al menos un resto de aminoácido de al menos una subunidad de la IL-10.
Además, preferentemente, el agente PEG-IL-10 comprende una mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada.
Aún más preferentemente, el componente de PEG del agente PEG-IL-10 tiene una masa molecular de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 20 kDa.
Preferentemente como alternativa, el componente de PEG del agente PEG-IL-10 tiene una masa molecular superior a aproximadamente 20 kDa.
Preferentemente como alternativa, el componente de PEG del agente PEG-IL-10 tiene una masa molecular de al menos aproximadamente 30 kDa.
Aún más preferentemente, la unión covalente del PEG a al menos un resto de aminoácido de al menos una subunidad de la IL-10 comprende un enlazador.
Aún más preferentemente, el agente IL-10 se administra al sujeto por vía subcutánea al menos una vez al día.
Preferentemente como alternativa, el agente IL-10 se administra al sujeto por vía subcutánea al menos cada 72 horas.
Preferentemente como alternativa, el agente IL-10 se administra al sujeto por vía subcutánea al menos una vez a la semana.
Aún más preferentemente, el uso en el tratamiento del cáncer comprende además administrar al menos un agente profiláctico o terapéutico adicional.
Aún más preferentemente, el agente profiláctico o terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo antirreceptor del factor de crecimiento epidérmico, un anticuerpo monoclonal contra el antígeno tumoral y una vacuna.
Aún más preferentemente, el agente profiláctico o terapéutico adicional es uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en complejos de coordinación de platino, análogos de ácido fólico y análogos de purina.
Aún más preferentemente, el análogo de ácido fólico es ácido folínico y el análogo de purina es 5-FU.
Aún más preferentemente, el tratamiento da como resultado una mejora en los criterios de respuesta inmunitaria (irRC, del inglés Immune-Related Response Criteria) en dicho sujeto.
Las realizaciones particulares divulgadas en el presente documento se refieren a métodos para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente IL-10, en donde la cantidad es suficiente para lograr una concentración mínima media en suero de IL-10 de al menos 6,0 ng/ml. Los métodos de tratamiento o prevención pueden estar mediados por linfocitos T CD8+.
Además, en el presente documento se divulgan métodos para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto (por ejemplo, un ser humano), que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente IL-10, en donde la cantidad es suficiente para mantener una concentración mínima media en suero de IL-10 durante un período de tiempo, en donde la concentración mínima media en suero de IL-10 es de al menos 6.0 ng/ml, y en donde la concentración mínima media en suero de IL-10 se mantiene durante al menos un 90 % del período de tiempo. En realizaciones particulares de la presente divulgación, la concentración mínima media en suero de IL-10 es de al menos 7,0 ng/ml, al menos 8,0 ng/ml y al menos 9,0 ng/ml, al menos 10,0 ng/ml, al menos 11,0 ng/ml, al menos 12,0 ng/ml, al menos 13,0 ng/ml, al menos 14,0 ng/ml, al menos 15,0 ng/ml, al menos 16,0 ng/ml, al menos 17.0 ng/ml, al menos 18,0 ng/ml, al menos 19,0 ng/ml, al menos 20,0 ng/ml, al menos 21,0 ng/ml, al menos 22,0 ng/ml o superior a 22,0 ng/ml.
Además también se divulga en el presente documento que el periodo de tiempo es de al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 1 mes, al menos 6 semanas, al menos 2 meses, al menos 3 meses o superior a 3 meses.
Además también se divulga en el presente documento que la concentración mínima media en suero de IL-10 se mantiene durante al menos un 85 % del período de tiempo, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o el 100 % del período de tiempo.
Se prevé que un régimen de dosificación suficiente para mantener una concentración mínima en suero en estado estacionario particular (por ejemplo, 10 ng/ml) puede dar como resultado una concentración mínima en suero inicial que es superior a la concentración mínima en suero en estado estacionario deseada. Debido a las características farmacodinámicas y farmacocinéticas de la IL-10 en un sujeto mamífero, una concentración mínima inicial (lograda, por ejemplo, mediante la administración de una o más dosis de carga seguidas de una serie de dosis de mantenimiento) disminuye de forma gradual pero continua durante un período de tiempo, incluso cuando los parámetros de dosificación (cantidad y frecuencia) se mantienen constantes. Después de ese período de tiempo, la disminución gradual pero continua finaliza y se mantiene una concentración mínima en suero en estado estacionario.
Como ejemplo, se necesita la administración parenteral (por ejemplo, s.c. e i.v.) de ~0,1 mg/kg/día de un agente IL-10 (por ejemplo, mIL-10) a un ratón (por ejemplo, un ratón C57BL/6) para mantener una concentración mínima en suero en estado estacionario de, por ejemplo, 2,0 ng/ml. Sin embargo, la concentración mínima en suero en estado estacionario puede no alcanzarse hasta aproximadamente 30 días después del inicio de la dosificación de 0,1 mg/kg/día (y también después de una o más dosis de carga cualquiera). En su lugar, después de que se haya alcanzado una concentración mínima en suero inicial (por ejemplo, 2,5 ng/ml), esa concentración disminuye de forma gradual pero continua en el transcurso de, por ejemplo, el período de aproximadamente 30 días, después de lo cual se mantiene la concentración mínima en suero en estado estacionario deseada (por ejemplo, 2,0 ng/ml). Un experto en la materia podrá determinar la dosis necesaria para mantener la concentración mínima deseada en estado estacionario usando, por ejemplo, ADME y parámetros específicos del paciente.
También se divulgan en el presente documento métodos para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente IL-10, en donde la cantidad es suficiente para lograr una concentración mínima media en suero de IL-10 de al menos la CE50 del agente IL-10. En otras realizaciones, la cantidad es suficiente para lograr una concentración mínima media en suero de IL-10 de al menos la CE60, de al menos la CE70, de al menos la CE80 o de al menos la CE90 del agente IL-10.
Como se utiliza en el presente documento, el término "CE50" y la expresión "la mitad de la concentración eficaz máxima" tienen su significado generalmente aceptado; es decir, la CE50 es la concentración de un agente terapéutico (por ejemplo, un agente IL-10) que induce una respuesta a mitad de camino entre el valor inicial y el máximo después de un tiempo de exposición especificado. El experto en la materia está familiarizado con los medios para determinar la CE50 de un agente terapéutico. Por ejemplo, la CE50 puede determinarse mediante un programa informático disponible comercialmente (por ejemplo, Graphpad Software, Inc.; La Jolla, CA) después de medir determinados parámetros relacionados con la concentración del agente terapéutico en un ensayo basado en células.
Además, en el presente documento se divulgan métodos en donde el agente IL-10 puede comprender al menos una modificación para formar un agente IL-10 modificado, en donde la modificación no altera la secuencia de aminoácidos del agente IL-10. En algunas realizaciones, el agente IL-10 modificado es un agente PEG-IL-10. El agente PEG-IL-10 puede comprender al menos una molécula de PEG unida covalentemente a al menos un resto de aminoácido de al menos una subunidad de la IL-10 o comprender una mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada en otras realizaciones.
El componente de PEG del agente PEG-IL-10 puede tener una masa molecular superior a aproximadamente 5 kDa, superior a aproximadamente 10 kDa, superior a aproximadamente 15 kDa, superior a aproximadamente 20 kDa, superior a aproximadamente 30 kDa, superior a aproximadamente 40 kDa o superior a aproximadamente 50 kDa. En algunas realizaciones, la masa molecular es de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 10 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 15 kDa, de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 20 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 15 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 20 kDa, de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 25 kDa o de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 30 kDa.
En algunas realizaciones, el agente IL-10 modificado comprende al menos una molécula de fusión Fc, al menos una seroalbúmina (por ejemplo, HSA o BSA), una molécula de fusión HSA o un conjugado de albúmina. En realizaciones adicionales, el agente IL-10 modificado está glucosilado, está hesilado o comprende al menos un dominio de unión a albúmina. Algunos agentes IL-10 modificados pueden comprender más de un tipo de modificación. En realizaciones particulares, la modificación es específica del sitio. Algunas realizaciones comprenden un enlazador. Los agentes IL-10 modificados se analizan en detalle a continuación.
El agente IL-10 puede administrarse por cualquier vía eficaz. En algunas realizaciones, se administra mediante inyección parenteral, incluida la inyección subcutánea.
Además, en el presente documento se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad de un agente IL-10 (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz), incluidos los agentes descritos anteriormente, junto con uno o más diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, una solución de inyección isotónica). En general, la composición farmacéutica es una que es adecuada para la administración a seres humanos. Además, en algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende al menos un agente profiláctico o terapéutico adicional.
Determinadas realizaciones divulgadas en el presente documento contemplan un recipiente estéril que contiene una de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente y, opcionalmente, uno o más componentes adicionales. Como ejemplo, pero sin limitación, el recipiente estéril puede ser una jeringuilla. En aún otras realizaciones divulgadas en el presente documento, el recipiente estéril es un componente de un kit; el kit también puede contener, por ejemplo, un segundo recipiente estéril que comprende al menos un agente profiláctico o terapéutico.
Además, en el presente documento se divulgan métodos en donde el agente IL-10 se administra al sujeto al menos dos veces al día, al menos una vez al día, al menos una vez cada 48 horas, al menos una vez cada 72 horas, al menos una vez por semana, al menos una vez cada 2 semanas, al menos una vez al mes, al menos una vez cada 2 meses o al menos una vez cada 3 meses. Algunas realizaciones también comprenden administrar el agente IL-10 con al menos un agente profiláctico o terapéutico adicional, cuyos ejemplos se exponen a continuación.
Aún más, en el presente documento se divulga el uso de terapia génica junto con las enseñanzas del presente documento. Para usos y métodos de terapia génica, una célula en un sujeto se puede transformar con un ácido nucleico que codifica un polipéptido relacionado con la IL-10 como se establece en el presente documento in vivo. De manera alternativa, una célula se puede transformar in vitro con un transgén o polinucleótido, y después trasplantarse en un tejido del sujeto para realizar el tratamiento. Además, un aislado celular primario o una estirpe celular establecida se puede transformar con un transgén o polinucleótido que codifica un polipéptido relacionado con la IL-10 y después, opcionalmente, trasplantarse en un tejido de un sujeto.
Realizaciones particulares adicionales de la presente divulgación se relacionan con métodos para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente IL-10, en donde la cantidad es suficiente para lograr una concentración mínima media en suero de IL-10 de al menos 0,1 ng/ml. Los métodos de tratamiento o prevención pueden estar mediados por linfocitos T CD8+.
Aún más en el presente documento se divulgan métodos para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o afección en un sujeto (por ejemplo, un ser humano), que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente IL-10, en donde la cantidad es suficiente para mantener una concentración mínima media en suero de IL-10 durante un período de tiempo, en donde la concentración mínima media en suero de IL-10 es de al menos 0,1 ng/ml, y en donde la concentración mínima media en suero de IL-10 se mantiene durante al menos un 90 % del período de tiempo. En realizaciones particulares de la presente divulgación, la concentración mínima media en suero de IL-10 es de al menos 0,2 ng/ml, al menos 0,3 ng/ml y al menos 0,4 ng/ml, al menos 0,5 ng/ml, al menos 0,6 ng/ml, al menos 0,7 ng/ml, al menos 0,8 ng/ml, al menos 0,9 ng/ml, al menos 1 ng/ml, al menos 1,2 ng/ml, al menos 1,25 ng/ml, al menos 1,3 ng/ml, al menos 1,4 ng/ml, al menos 1,5 ng/ml, al menos 1,6 ng/ml, al menos 1,7 ng/ml, al menos 1,8 ng/ml, al menos 1,85 ng/ml, al menos 1,9 ng/ml, al menos 1,95 ng/ml, al menos 1,97 ng/ml y al menos 1,98 ng/ml, al menos 1,99 ng/ml, al menos 2,0 ng/ml o superior a 2 ng/ml.
En realizaciones adicionales, el periodo de tiempo es de al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 1 semana, al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 1 mes, al menos 6 semanas, al menos 2 meses, al menos 3 meses o superior a 3 meses.
En realizaciones particulares de la presente divulgación, la concentración mínima media en suero de IL-10 se mantiene durante al menos un 85 % del período de tiempo, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o el 100 % del período de tiempo.
Otras realizaciones de la presente divulgación se describen en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
En la figura 1 están representadas las secuencias de aminoácidos de la IL-10 humana (SEQ ID NO: 28) y de ratón (SEQ ID NO: 29).
En la figura 2A está representada la concentración de MCP-1 (pg/ml) en PBMC a concentraciones crecientes de IL-10. A concentraciones de 1 ng/ml y superiores, la IL-10 aumentó la secreción de MCP-1.
En la figura 2B está representada la concentración de MCP-1 (pg/ml) en PBMC estimuladas con LPS a concentraciones crecientes de IL-10. La IL-10 es un inhibidor de la activación de PBMC mediada por LPS, y la adición de IL-10 a concentraciones de 1 ng/ml y superiores inhibió de manera significativa la secreción de MCP-1. En la figura 3 están representados los resultados de un estudio de aumento de la dosis en el que se administró PEG-hIL-10 a pacientes que tenían los tipos de tumor indicados. Los tamaños de los tumores individuales y la carga tumoral total se midieron después de siete semanas de tratamiento de acuerdo con los criterios de respuesta inmunitaria (irRC).
En la figura 4 está representada la concentración sérica promedio alcanzada en pacientes a los que se administró 1,2,5, 5, 10 o 20 |jg/kg de PEG-hIL-10 en comparación con un valor CE50 calculado.
En las figuras 5A y 5B está representada la concentración en suero de PEG-hIL-10 de cada paciente al que se administró 10 jg/kg (Figura 5A) y 20 jg/kg (Figura 5B) de la misma en comparación con un valor CE50 calculado basado en la actividad celular in vitro. En la figura 6 está representado el efecto de administrar cantidades crecientes de PEG-hIL-10 sobre el marcador tumoral CEA en dos pacientes con CRC.
En las figuras 7A a 7C está representado el efecto de la PEG-hIL-10 sobre el tamaño de las lesiones metastásicas en pacientes que tienen uno de los tres tipos de tumores primarios (melanoma (Figura 7A), RCC (Figura 7B) y CRC (Figura 7C)).
Descripción detallada
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en el intervalo indicado, está comprendido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en los intervalos más pequeños, y también están comprendidos dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención intervalos que excluyen alguno de los límites incluidos o ambos. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto familiarizado con la materia a la que pertenece la presente invención.
Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno/una", y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asimismo, cabe señalar que las reivindicaciones pueden redactarse de forma que excluyan cualquier elemento opcional. Por lo tanto, esta afirmación pretende servir de fundamento previo para el uso de dicha terminología exclusiva tal como "únicamente", "solamente" y similar, en relación con la exposición de los elementos de las reivindicaciones o el uso de una limitación "negativa".
Las publicaciones analizadas en el presente documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser distintas de las fechas de publicación reales, que pueden necesitar ser confirmadas de forma independiente.
Visión general
La presente divulgación contempla el uso de los agentes descritos en el presente documento y sus composiciones, para tratar y/o prevenir diversas enfermedades, trastornos y afecciones, y/o los síntomas de las mismas. En determinados aspectos de la presente divulgación, dicho tratamiento o prevención se realiza mediante parámetros de dosificación particulares. En algunas realizaciones, los agentes se administran para lograr una concentración mínima en suero que está optimizada para tratar, por ejemplo, trastornos inflamatorios y relacionados con el sistema inmunitario, trastornos fibróticos, cáncer y trastornos relacionados con el cáncer, o trastornos cardiovasculares (por ejemplo, ateroesclerosis).
En algunas realizaciones de la presente divulgación, a un sujeto que tiene, o que corre el riesgo de tener, una enfermedad o trastorno tratable con un agente IL-10 (por ejemplo, un polipéptido IL-10) se le administra el agente IL 10 en una cantidad suficiente para alcanzar una concentración mínima en suero superior a aproximadamente 6.0 ng/ml, en determinadas realizaciones, la concentración mínima en suero es superior a aproximadamente 10.0 ng/ml, mientras que en otras realizaciones la concentración mínima en suero es superior a aproximadamente 20.0 ng/ml.
Cabe señalar que cualquier referencia a "humano/a" en relación con los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico de la presente divulgación no pretende ser limitante con respecto a la forma en que se obtiene el polipéptido o ácido nucleico o la fuente, sino que se refiere únicamente a la secuencia, ya que puede corresponder a una secuencia de un polipéptido o molécula de ácido nucleico humano de origen natural. Además de los polipéptidos humanos y las moléculas de ácido nucleico que los codifican, la presente divulgación contempla polipéptidos relacionados con IL-10 y moléculas de ácido nucleico correspondientes de otras especies.
Definiciones
A menos que se indique de otro modo, los siguientes términos pretenden tener el significado que se establece a continuación. Otros términos se definen en otras partes de la memoria descriptiva.
Los términos "paciente" o "sujeto" se usan indistintamente para referirse a un ser humano o a un animal no humano (por ejemplo, un mamífero).
Los términos "administración", "administrar" y similares, como se aplican a, por ejemplo, un sujeto, célula, tejido, órgano o líquido biológico, se refiere al contacto de, por ejemplo, IL-10 o PEG-IL-10, un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la IL-10 humana natural); una composición farmacéutica que lo comprende o un agente de diagnóstico con el sujeto, célula, tejido, órgano o líquido biológico. En el contexto de una célula, la administración incluye el contacto (por ejemplo, in vitro o ex vivo) de un reactivo con la célula, así como el contacto de un reactivo con un líquido, en que el líquido está en contacto con la célula.
Los términos "tratar", "que trata", "tratamiento" y similares se refieren a un curso de acción (tal como la administración de IL-10 o una composición farmacéutica que comprenda IL-10) iniciado después de que una enfermedad, trastorno o afección, o un síntoma de los mismos, se haya diagnosticado, observado y similares, para eliminar, reducir, suprimir, mitigar o mejorar, ya sea de manera temporal o permanente, al menos una de las causas subyacentes de una enfermedad, trastorno o afección que aqueja a un sujeto, o al menos uno de los síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o afección que aqueja a un sujeto. Por tanto, el tratamiento incluye inhibir (por ejemplo, detener el desarrollo o el desarrollo posterior de la enfermedad, trastorno o afección, o la asociación de síntomas clínicos con los mismos) una enfermedad activa. Los términos también pueden utilizarse en otros contextos, tales como situaciones en las que la IL-10 o la PEG-IL-10 entran en contacto con un receptor de IL-10 en, por ejemplo, la fase fluida o fase coloidal.
La expresión "que necesita tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere a la decisión, tomada por un médico u otro profesional sanitario, de que un sujeto necesita o se beneficiará del tratamiento. Esta decisión se basa en una diversidad de factores que están en el ámbito de la experiencia del médico o profesional sanitario.
Los términos "prevenir", "que previene", "prevención" y similares se refieren a un curso de acción (tal como administrar un inhibidor de la IL-10 o una composición farmacéutica que comprende IL-10) iniciado de una manera (por ejemplo, antes del inicio de una enfermedad, trastorno, afección o síntoma de la misma) que se evite, suprima, inhiba o reduzca, ya sea de manera temporal o permanente, el riesgo de un sujeto de padecer una enfermedad, trastorno, afección o similar (según lo determinado mediante, por ejemplo, la ausencia de síntomas clínicos) o se retrase su aparición, generalmente en el contexto de un sujeto predispuesto a tener una enfermedad, trastorno o afección particular. En determinados casos, los términos también se refieren a ralentizar la progresión de la enfermedad, trastorno o afección, o a inhibir la progresión de la misma a un estado nocivo o de otro modo no deseado.
La expresión "que necesita prevención", como se usa en el presente documento, se refiere a la decisión, tomada por un médico u otro profesional sanitario, de que un sujeto necesita o se beneficiará del tratamiento preventivo. Esta decisión se basa en una diversidad de factores que están en el ámbito de la experiencia de un médico o profesional sanitario.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la administración de un agente a un sujeto, ya sea solo o como parte de una composición farmacéutica y en una sola dosis o como parte de una serie de dosis, en una cantidad capaz de tener cualquier efecto positivo detectable sobre cualquier síntoma, aspecto o característica de una enfermedad, trastorno o afección cuando se administra al sujeto. La cantidad terapéuticamente eficaz se puede determinar mediante la medición de los efectos fisiológicos pertinentes y se puede ajustar con respecto al régimen de dosificación y al análisis diagnóstico de la afección del sujeto, y similares. Como ejemplo, la medición de la cantidad de citocinas inflamatorias producidas tras la administración puede ser indicativa de si se ha utilizado una cantidad terapéuticamente eficaz.
La expresión "en una cantidad suficiente para efectuar un cambio" significa que hay una diferencia detectable entre un nivel de un indicador medido antes (por ejemplo, un nivel inicial) y después de la administración de una terapia particular. Los indicadores incluyen cualquier parámetro objetivo (por ejemplo, concentración en suero de IL-10) o parámetro subjetivo (por ejemplo, la sensación de bienestar de un sujeto).
La expresión "moléculas pequeñas" se refiere a compuestos químicos que tienen un peso molecular que es inferior a aproximadamente 10 kDa, inferior a aproximadamente 2 kDa o inferior a aproximadamente 1 kDa. Las moléculas pequeñas incluyen, pero sin limitación, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas, moléculas orgánicas que contienen un componente inorgánico, moléculas que comprenden un átomo radioactivo y moléculas sintéticas. Desde el punto de vista terapéutico, una molécula pequeña puede ser más permeable en las células, menos susceptible a la degradación y tener menos probabilidad de inducir una respuesta inmunitaria que las moléculas grandes.
El término "ligando" se refiere a, por ejemplo, un péptido, polipéptido, una molécula asociada a la membrana o unida a la membrana, o un complejo de los mismos, que puede actuar como agonista o antagonista de un receptor. "Ligando" abarca ligandos naturales y sintéticos, por ejemplo, citocinas, variantes de citocinas, análogos, muteínas y composiciones de unión procedentes de anticuerpos. "Ligando" también abarca moléculas pequeñas, por ejemplo, miméticos peptídicos de citocinas y miméticos peptídicos de anticuerpos. La expresión también abarca un agente que no es ni agonista ni antagonista, pero que puede unirse a un receptor sin influir significativamente en sus propiedades biológicas, por ejemplo, la señalización o la adhesión. Además, el término incluye un ligando unido a la membrana que se ha modificado, por ejemplo, mediante métodos químicos o recombinantes, a una versión soluble del ligando unido a la membrana. Un ligando o receptor puede ser completamente intracelular, es decir, puede residir en el citosol, el núcleo o algún otro compartimento intracelular. El complejo de ligando y receptor se denomina "complejo ligandoreceptor".
Los términos "inhibidores" y "antagonistas", o "activadores" y "agonistas", se refieren a moléculas inhibidoras o activadoras, respectivamente, por ejemplo, para la activación de, por ejemplo, un ligando, receptor, cofactor, gen, célula, tejido u órgano. Los inhibidores son moléculas que disminuyen, bloquean, evitan, retrasan la activación, inactivan, desensibilizan o reducen, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor o célula. Los activadores son moléculas que aumentan, activan, facilitan, potencian la activación, sensibilizan o incrementan, por ejemplo, un gen, proteína, ligando, receptor o célula. Un inhibidor también puede definirse como una molécula que reduce, bloquea o inactiva una actividad constitutiva. Un "agonista" es una molécula que interactúa con una diana para provocar o estimular un aumento en la activación de la diana. Un "antagonista" es una molécula que se opone a la acción (o acciones) de un agonista. Un antagonista impide, reduce, inhibe o neutraliza la actividad de un agonista, y un antagonista también puede impedir, inhibir o reducir la actividad constitutiva de una diana, por ejemplo, un receptor diana, incluso cuando no hay un agonista identificado.
Los términos "modular", "modulación" y similares se refieren a la capacidad de una molécula (por ejemplo, un activador o un inhibidor) para aumentar o disminuir la función o actividad de un agente IL-10 (o las moléculas de ácido nucleico que las codifican), ya sea directa o indirectamente; o para mejorar la capacidad de una molécula para producir un efecto comparable al de un agente IL-10. El término "modulador" pretende referirse en términos generales a moléculas que pueden efectuar las actividades descritas anteriormente. Como ejemplo, un modulador de, por ejemplo, un gen, un receptor, un ligando o una célula, es una molécula que altera una actividad del gen, receptor, ligando o célula, donde la actividad se puede activar, inhibir o alterar en sus propiedades reguladoras. Un modulador puede actuar solo, o puede usar un cofactor, por ejemplo, una proteína, ion metálico o molécula pequeña. El término "modulador" incluye agentes que operan a través del mismo mecanismo de acción que la IL-10 (es decir, agentes que modulan la misma ruta de señalización que la IL-10 de manera análoga) y son capaces de provocar una respuesta biológica comparable a (o superior a) la de la IL-10.
Los ejemplos de moduladores incluyen compuestos de molécula pequeña y otras moléculas bioorgánicas. Están disponibles en el mercado numerosas bibliotecas de compuestos de molécula pequeña (por ejemplo, bibliotecas combinatorias) y pueden servir como punto de partida para la identificación de un modulador. El experto en la materia puede desarrollar uno o más ensayos (por ejemplo, ensayos bioquímicos o basados en células) en los que tales bibliotecas de compuestos pueden cribarse para identificar uno o más compuestos que tengan las propiedades deseadas; después de eso, el farmacoquímico experto es capaz de optimizar uno o más de tales compuestos mediante, por ejemplo, la síntesis y evaluación de análogos y derivados de los mismos. Además, pueden utilizarse estudios de modelado sintético y/o molecular en la identificación de un activador.
La "actividad" de una molécula puede describir o referirse a la unión de la molécula con un ligando o con un receptor; a la actividad catalítica; a la capacidad de estimular la expresión génica o la señalización, diferenciación o maduración celular; a la actividad antigénica; a la modulación de actividades de otras moléculas; y similares. El término también puede referirse a la actividad en la modulación o el mantenimiento de las interacciones de célula a célula (por ejemplo, adhesión) o a la actividad en el mantenimiento de una estructura de una célula (por ejemplo, una membrana celular). "Actividad" también puede significar actividad específica, por ejemplo, [actividad catalítica]/[mg de proteína] o [actividad inmunitaria]/[mg de proteína], concentración en un compartimento biológico o similar. El término "actividad proliferativa" abarca una actividad que estimula, que es necesaria para o que está específicamente asociada con, por ejemplo, la división celular normal, así como con cáncer, tumores, displasia, transformación celular, metástasis y angiogénesis.
Como se utiliza en el presente documento, "comparable", "actividad comparable", "actividad comparable a", "efecto comparable", "efecto comparable a" y similares son expresiones relativas que pueden verse desde un punto de vista cuantitativo y/o cualitativo. El significado de las expresiones depende con frecuencia del contexto en el que se utilizan. Como ejemplo, puede considerarse que dos agentes que activan un receptor tienen un efecto comparable desde una perspectiva cualitativa, pero se puede considerar que los dos agentes carecen de un efecto comparable desde una perspectiva cuantitativa si un agente solo puede lograr el 20 % de la actividad del otro agente según lo determinado en un ensayo aceptado en la materia (por ejemplo, un ensayo de respuesta a la dosis) o en un modelo animal aceptado en la materia. Cuando se compara un resultado con otro resultado (por ejemplo, un resultado con un patrón de referencia), "comparable" significa con frecuencia que un resultado se desvía de un patrón de referencia en menos del 35 %, en menos del 30 %, en menos del 25 %, en menos del 20 %, en menos del 15 %, en menos del 10 %, en menos del 7 %, en menos del 5 %, en menos del 4 %, en menos del 3 %, en menos del 2 % o en menos del 1 %. En realizaciones particulares, un resultado es comparable a un patrón de referencia si se desvía en menos del 15 %, en menos del 10 % o en menos del 5 % del patrón de referencia. Como ejemplo, pero sin limitación, la actividad o efecto puede referirse a la eficacia, estabilidad, solubilidad o inmunogenia.
El término "respuesta", por ejemplo, de una célula, tejido, órgano u organismo, abarca un cambio en el comportamiento bioquímico o fisiológico, por ejemplo, concentración, densidad, adhesión o migración dentro de un compartimento biológico, tasa de expresión génica o estado de diferenciación, donde el cambio se correlaciona con la activación, estimulación o tratamiento, o con mecanismos internos tales como la programación genética. En determinados contextos, los términos "activación", "estimulación" y similares se refieren a la activación celular regulada por mecanismos internos, así como por factores externos o ambientales; mientras que las expresiones "inhibición", "disminución" y similares se refieren a los efectos opuestos.
Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados genéticamente y no codificados genéticamente, aminoácidos modificados o derivatizados químicamente o bioquímicamente y polipéptidos que tienen estructuras principales polipeptídicas modificadas. Los términos incluyen proteínas de fusión, que incluyen, pero sin limitación, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga; proteínas de fusión con secuencias líder heterólogas y homólogas; proteínas de fusión con o sin restos de metionina en el extremo N; proteínas de fusión con proteínas marcadas de manera inmunológica; y similares.
Se apreciará que a lo largo de la presente divulgación se hace referencia a los aminoácidos de acuerdo con los códigos de una sola letra o de tres letras. Para comodidad del lector, los códigos de aminoácidos de una y tres letras se proporcionan a continuación:
G Glicina Gly P Prolina Pro
A Alanina Ala V Valina Val
L Leucina Leu I Isoleucina Ile
M Metionina Met C Cisteína Cys
F Fenilalanina Phe Y Tirosina Tyr
W Triptófano Trp H Histidina His
K Lisina Lys R Arginina Arg
Q Glutamina Gln N Asparagina Asn
E Ácido glutámico Glu D Ácido aspártico Asp
S Serina Ser T Treonina Thr
Como se utiliza en el presente documento, el término "variante" abarca variantes de origen natural y variantes de origen no natural. Las variantes de origen natural incluyen homólogos (polipéptidos y ácidos nucleicos que difieren en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, de una especie a otra) y variantes alélicas (polipéptidos y ácidos nucleicos que difieren en la secuencia de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, de un individuo a otro dentro de una especie). Las variantes de origen no natural incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que comprenden un cambio en la secuencia de aminoácidos o de nucleótidos, respectivamente, en que el cambio en la secuencia se introduce artificialmente (por ejemplo, muteínas); por ejemplo, el cambio se genera en el laboratorio mediante la intervención humana ("por la mano de hombre"). Por tanto, en el presente documento, una "muteína" se refiere ampliamente a proteínas recombinantes mutadas que normalmente llevan sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples y que con frecuencia proceden de genes clonados que se han sometido a mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio, o de genes completamente sintéticos.
Las expresiones "ADN", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "polinucleótido" y similares se usan indistintamente en el presente documento para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen ácidos nucleicos lineales y circulares, ARN mensajero (ARNm), ADN complementario (ADNc), polinucleótidos recombinantes, vectores, sondas, cebadores y similares.
Como se usa en el presente documento en el contexto de la estructura de un polipéptido, "extremo N" (o "extremo amino") y "extremo C" (o "extremo carboxilo") se refieren a los finales extremos amino y carboxilo del polipéptido, respectivamente, mientras que los términos "aminoterminal" y "carboxiterminal" se refieren a posiciones relativas en la secuencia de aminoácidos del polipéptido hacia el extremo N y el extremo C, respectivamente, y puede incluir los restos en el extremo N y extremo C, respectivamente. "Inmediatamente aminoterminal" o "inmediatamente carboxiterminal" se refiere a una posición de un primer resto de aminoácido con respecto a un segundo resto de aminoácido donde el primer y segundo restos de aminoácidos están unidos covalentemente para proporcionar una secuencia de aminoácidos contigua.
"Procedente de", en el contexto de una secuencia de aminoácidos o una secuencia de polinucleótidos (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos "procedente de" un polipéptido IL-10), significa que el polipéptido o ácido nucleico tiene una secuencia que se basa en la de un polipéptido o ácido nucleico de referencia (por ejemplo, un polipéptido IL-10 de origen natural o un ácido nucleico que codifica IL-10), y no pretende limitar la fuente o el método en el que se elabora la proteína o el ácido nucleico. Como ejemplo, la expresión "procedente de" incluye homólogos y variantes de secuencias de ADN o de aminoácidos de referencia.
En el contexto de un polipéptido, el término "aislado" se refiere a un polipéptido de interés que, si se produce de manera natural, se encuentra en un entorno diferente de aquel en el que puede producirse de manera natural. "Aislado" pretende incluir polipéptidos que están dentro de muestras que están sustancialmente enriquecidas para el polipéptido de interés y/o en las que el polipéptido de interés está purificado parcial o sustancialmente. Cuando el polipéptido no se produce de forma natural, "aislado" indica que el polipéptido se ha separado de un entorno en el que se produjo por medios sintéticos o recombinantes.
"Enriquecido" significa que una muestra se manipula de forma no natural (por ejemplo, por un científico) para que un polipéptido de interés esté presente en a) una concentración mayor (por ejemplo, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 64 veces mayor o más) que la concentración del polipéptido en la muestra de inicio, tal como una muestra biológica (por ejemplo, una muestra en la que el polipéptido se encuentra de forma natural o en la que está presente después de la administración), o (b) una concentración mayor que la del entorno en el que se produjo el polipéptido (por ejemplo, como en una célula bacteriana).
"Sustancialmente puro" indica que un componente (por ejemplo, in polipéptido) constituye más de aproximadamente un 50 % del contenido total de la composición, y normalmente más de aproximadamente un 60 % del contenido total de polipéptidos. De manera más habitual, "sustancialmente puro/a" se refiere a composiciones en las que al menos un 75 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o más de la composición total es el componente de interés. En algunos casos, el polipéptido constituirá más de aproximadamente un 90 %, o más de aproximadamente un 95 % del contenido total de la composición.
Las expresiones "se une específicamente" o "se une selectivamente", cuando hace referencia a un ligando/receptor, anticuerpo/antígeno u otro par de unión, indica una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por tanto, en las condiciones designadas, un ligando específico se une con un receptor en particular y no se une en una cantidad significativa con otras proteínas presentes en la muestra. El anticuerpo, o composición de unión procedente del sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, del método contemplado, se une a su antígeno, o una variante o muteína del mismo, con una afinidad que es al menos dos veces mayor, al menos diez veces mayor, al menos 20 veces mayor o al menos 100 veces mayor que la afinidad con cualquier otro anticuerpo o composición de unión procedente del mismo. En una realización particular, el anticuerpo tendrá una afinidad que es mayor que aproximadamente 109 litros/mol, según se determina mediante, por ejemplo, análisis de Scatchard (Munsen, et al. 1980 Analyt. Biochem. 107:220-239).
IL-10 y PEG-IL-10
La citocina antinflamatoria IL-10, también conocida como factor inhibidor de la síntesis de citocinas (CSIF, del inglés cytokine synthesis inhibitory factor) humanas, se clasifica como una citocina de tipo (clase) 2, un conjunto de citocinas que incluye la IL-19, IL-20, IL-22, lL-24 (Mda-7) e IL-26, interferón (IFN)-a, -p, -y, -8, -£, -k, -O y -t) y moléculas similares al interferón (limitina, IL-28A, IL-28B e IL-29).
La IL-10 es una citocina con efectos pleiotrópicos en la inmunorregulación y la inflamación. La producen los mastocitos, lo que contrarresta el efecto inflamatorio que estas células tienen en el sitio de una reacción alérgica. Si bien es capaz de inhibir la síntesis de citocinas proinflamatorias tales como el IFN-y, IL-2, IL-3, TNFa y GM-CSF, la IL-10 también estimula determinados linfocitos T y mastocitos y estimula la maduración de los linfocitos B, la proliferación y la producción de anticuerpos. La IL-10 puede bloquear la actividad de NF-kB y está implicada en la regulación de la ruta de señalización JAK-STAT. También induce la actividad citotóxica de los linfocitos T CD8+ y la producción de anticuerpos de los linfocitos B, y suprime la actividad de los macrófagos y la inflamación promotora de tumores. La regulación de los linfocitos T CD8+ depende de la dosis, en donde dosis más elevadas inducen respuestas citotóxicas más fuertes.
La IL-10 humana es un homodímero con una masa molecular de 37 kDa, en donde cada monómero de 18,5 kDa comprende 178 aminoácidos, de los cuales los primeros 18 comprenden un péptido señal y dos pares de restos de cisteína que forman dos enlaces disulfuro intramoleculares. El dímero IL-10 se vuelve biológicamente inactivo tras la interrupción de las interacciones no covalentes entre las dos subunidades monoméricas.
La presente divulgación contempla la IL-10 humana y la IL-10 murina, que presentan un 80 % de homología, y el uso de las mismas. Además, el alcance de la presente divulgación incluye ortólogos de IL-10 y formas modificadas de los mismos, de otras especies de mamíferos, incluida la rata (registro NP_036986.2; GI 148747382); vaca (registro NP_776513.1; GI 41386772); oveja (registro NP_001009327.1; GI 57164347); perro (registro ABY86619.1; GI 166244598); y conejo (registro AAC23839.1; GI 3242896).
Como se ha hecho alusión anteriormente, los términos "IL-10", "polipéptido(s) IL-10", "agente(s) IL-10" y similares están destinados a ser interpretados de manera amplia e incluyen, por ejemplo, polipéptidos relacionados con la IL-10 humana y no humana, incluidos homólogos, variantes (incluidas muteínas) y fragmentos de los mismos, así como polipéptidos IL-10 que tengan, por ejemplo, una secuencia líder (por ejemplo, el péptido señal), y versiones modificadas de lo anterior. En otras realizaciones particulares, IL-10, el uno o más polipéptidos IL-10 y el uno o más agentes IL-10 son agonistas.
El receptor de IL-10, un receptor de citocinas de tipo II, consiste en subunidades a y p, que también se conocen como R1 y R2, respectivamente. La activación del receptor requiere la unión tanto a a como a p. Un homodímero de un polipéptido IL-10 se une a a y el otro homodímero del mismo polipéptido IL-10 se une a p.
La utilidad de la IL-10 humana recombinante está frecuentemente limitada por su semivida en suero relativamente corta, que puede deberse a, por ejemplo, el aclaramiento renal, la degradación proteolítica y la monomerización en el torrente sanguíneo. Como resultado, se han explorado varios enfoques para mejorar el perfil farmacocinético de la IL-10 sin alterar su estructura dimérica y, por tanto, afectar negativamente a su actividad. La pegilación de IL-10 da como resultado una mejora de determinados parámetros farmacocinéticos (por ejemplo, la semivida en suero) y/o una mejora de la actividad. Por ejemplo, realizaciones particulares de la presente divulgación implican métodos para optimizar el tratamiento de trastornos proliferativos (por ejemplo, cáncer) con PEG-IL-10.
Como se ha indicado anteriormente, la presente divulgación también contempla el uso de la terapia génica junto con las enseñanzas del presente documento. La terapia génica se lleva a cabo mediante la administración de material genético, generalmente empaquetado en un vector, a células endógenas dentro de un sujeto para introducir nuevos genes, para introducir copias adicionales de genes preexistentes, para alterar el funcionamiento de genes existentes o para reparar genes existentes pero que no funcionan. Una vez dentro de las células, el ácido nucleico se expresa mediante la maquinaria celular, dando como resultado la producción de la proteína de interés. En el contexto de la presente divulgación, la terapia génica se utiliza como agente terapéutico para administrar ácido nucleico que codifica un agente IL-10 para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, trastorno o afección descrita en el presente documento.
Como se ha hecho alusión anteriormente, para usos y métodos de terapia génica, una célula en un sujeto se puede transformar con un ácido nucleico que codifica un polipéptido relacionado con la IL-10 como se establece en el presente documento in vivo. De manera alternativa, una célula se puede transformar in vitro con un transgén o polinucleótido, y después trasplantarse en un tejido del sujeto para realizar el tratamiento. Además, un aislado celular primario o una estirpe celular establecida se puede transformar con un transgén o polinucleótido que codifica un polipéptido relacionado con la IL-10 y después, opcionalmente, trasplantarse en un tejido de un sujeto.
Como se utiliza en el presente documento, los términos "IL-10 pegilada" y PEG-IL-10" se refieren a una molécula de IL-10 que tiene una o más moléculas de polietilenglicol unidas covalentemente a al menos un resto de aminoácido de la proteína IL-10, generalmente a través de un enlazador, tal que la unión sea estable. Los términos "IL-10 monopegilada" y "mono-PEG-IL-10" indican que una molécula de polietilenglicol está unida covalentemente a un solo resto de aminoácido en una subunidad del dímero de IL-10, generalmente a través de un enlazador. En determinadas realizaciones, el agente PEG-IL-10 utilizado en la presente divulgación es un agente mono-PEG-IL-10 en el que de una a nueve moléculas de PEG se unen covalentemente a través de un enlazador al grupo a-amino del resto de aminoácido en el extremo N de una subunidad del dímero de IL-10. La monopegilación en una subunidad de IL-10 generalmente da como resultado una mezcla no homogénea de compuestos no pegilados, IL-10 monopegilada y dipegilada debido a la mezcla de subunidades. Además, permitir que una reacción de pegilación continúe hasta su finalización generalmente dará como resultado una IL-10 no específica y multipegilada, lo que reduce su bioactividad. Por tanto, las realizaciones particulares de la presente divulgación comprenden la administración de una mezcla de IL-10 mono y dipegilada producida por los métodos descritos en el presente documento (por ejemplo, en la sección experimental).
En realizaciones particulares, el peso molecular promedio de la fracción de PEG está entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa. Aunque el método o sitio de unión del PEG a IL-10 no es crucial, en determinadas realizaciones, la pegilación no altera, o solo altera mínimamente, la actividad del agente IL-10. En determinadas realizaciones, el aumento de la semivida es mayor que cualquier disminución de la actividad biológica. La actividad biológica de PEG-IL-10 normalmente se mide mediante la evaluación de los niveles de citocinas inflamatorias (por ejemplo, TNF-a o IFN-y) en el suero de sujetos expuestos a un antígeno bacteriano (lipopolisacárido (LPS)) y tratados con PEG-IL-10, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7.052.686.
Las variantes de IL-10 se pueden preparar con varios objetivos en mente, incluido aumentar la semivida en suero, reducir una respuesta inmunitaria contra la IL-10, facilitar la purificación o preparación, disminuir la conversión de IL-10 en sus subunidades monoméricas, mejorar la eficacia terapéutica y disminuir la intensidad o la aparición de efectos secundarios durante el uso terapéutico. Las variantes de la secuencia de aminoácidos suelen ser variantes predeterminadas que no se encuentran en la naturaleza, aunque algunas pueden ser variantes postraduccionales, por ejemplo, variantes glucosiladas. Se puede utilizar cualquier variante de IL-10 siempre que conserve un nivel adecuado de la actividad de la IL-10. En el contexto tumoral, la actividad adecuada de IL-10 incluye, por ejemplo, la infiltración de linfocitos T CD8+ en sitios tumorales, la expresión de citocinas inflamatorias tales como IFN-y, IL-4, IL-6, IL-10 y RANK-L, a partir de estas células infiltrantes y niveles elevados de IFN-y en muestras biológicas.
La expresión "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a las sustituciones que conservan la actividad de la proteína cuando se reemplaza un(os) aminoácido(s) en la proteína con un aminoácido con una cadena lateral de acidez, basicidad, carga, polaridad o tamaño de la cadena lateral similares. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos generalmente implican la sustitución de restos de aminoácidos dentro de los siguientes grupos: 1) L, I, M, V, F; 2) R, K; 3) F, Y, H, W, R; 4) G, A, T, S; 5) Q, N; y 6) D, E. La pauta para sustituciones, inserciones o eliminaciones pueden basarse en alineaciones de secuencias de aminoácidos de diferentes proteínas variantes o proteínas de diferentes especies. Por tanto, además de cualquier polipéptido IL-10 de origen natural, la presente divulgación contempla que tenga 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, generalmente no más de 20, 10 o 5 sustituciones de aminoácidos, donde la sustitución suele ser una sustitución conservadora de aminoácidos.
La presente divulgación también contempla fragmentos activos (por ejemplo, subsecuencias) de IL-10 madura que contienen restos de aminoácidos contiguos procedentes de la IL-10 madura. La longitud de los restos de aminoácidos contiguos de una subsecuencia peptídica o polipeptídica varía dependiendo de la secuencia específica de aminoácidos naturales de la que procede la subsecuencia. En general, los péptidos y polipéptidos pueden ser de aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos, de aproximadamente 40 aminoácidos a aproximadamente 60 aminoácidos, de aproximadamente 60 aminoácidos a aproximadamente 80 aminoácidos, de aproximadamente 80 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos, de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 120 aminoácidos, de aproximadamente 120 aminoácidos a aproximadamente 140 aminoácidos, de aproximadamente 140 aminoácidos a aproximadamente 150 aminoácidos, de aproximadamente 150 aminoácidos a aproximadamente 155 aminoácidos, de aproximadamente 155 aminoácidos hasta el péptido o polipéptido de longitud completa.
De manera adicional, los polipéptidos IL-10 pueden tener una identidad de secuencia definida en comparación con una secuencia de referencia en una longitud definida de aminoácidos contiguos (por ejemplo, una "ventana de comparación"). Los métodos de alineación de secuencias para la comparación se conocen bien en la materia. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Madison, Wis.) o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 suplemento)).
Como ejemplo, un polipéptido IL-10 adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 %, de identidad de secuencia de aminoácidos respecto de una serie contigua de aproximadamente 20 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos, de aproximadamente 40 aminoácidos a aproximadamente 60 aminoácidos, de aproximadamente 60 aminoácidos a aproximadamente 80 aminoácidos, de aproximadamente 80 aminoácidos a aproximadamente 100 aminoácidos, de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 120 aminoácidos, de aproximadamente 120 aminoácidos a aproximadamente 140 aminoácidos, de aproximadamente 140 aminoácidos a aproximadamente 150 aminoácidos, de aproximadamente 150 aminoácidos a aproximadamente 155 aminoácidos, de aproximadamente 155 aminoácidos hasta el péptido o polipéptido de longitud completa.
Tal como se analiza adicionalmente a continuación, los polipéptidos IL-10 pueden aislarse de una fuente natural (por ejemplo, un entorno distinto del entorno natural) y también pueden prepararse de forma recombinante (por ejemplo, en una célula hospedadora modificada genéticamente, tal como una bacteria, levadura, Pichia, células de insecto y similares), donde la célula hospedadora genéticamente modificada se modifica con un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Los polipéptidos IL-10 también se pueden producir de manera sintética (por ejemplo, mediante síntesis química sin células).
La presente divulgación contempla moléculas de ácido nucleico que codifican los agentes IL-10, incluidas sus isoformas de origen natural y no natural, variantes alélicas y variantes de corte y empalme. La presente divulgación abarca también secuencias de ácidos nucleicos que varían en una o más bases con respecto a una secuencia de ADN natural pero que aún se traducen en una secuencia de aminoácidos que corresponde a un polipéptido IL-10 debido a la degeneración del código genético.
Concentración en suero de IL-10
Los niveles en plasma sanguíneo de IL-10 en los métodos descritos en el presente documento se pueden caracterizar de varias maneras, que incluyen: (1) una concentración mínima media en suero de IL-10 por encima de algún nivel especificado o en un intervalo de niveles; (2) una concentración mínima media en suero de IL-10 por encima de algún nivel especificado durante algún tiempo; (3) un nivel de concentración en suero de IL-10 en estado estacionario por encima o por debajo de algún nivel especificado o en un intervalo de niveles; o (4) una Cmáx del perfil de concentración por encima o por debajo de algún nivel especificado o en algún intervalo de niveles. Como se expone en el presente documento, se ha encontrado que las concentraciones mínimas medias en suero de IL-10 son de particular importancia para la eficacia en determinadas indicaciones.
Niveles en suero de PEG-hIL-10 para tratar pacientes con, por ejemplo, tumores sólidos.
La sección experimental describe las evaluaciones de la eficacia terapéutica de mIL-10 y PEG-mIL-10 en el carcinoma epidermoide PDV6 y el carcinoma de colon CT-26, en donde los parámetros de dosificación de mIL-10 y mPEG-IL-10 (cantidad y frecuencia de administración) son suficientes para lograr una concentración mínima media en suero de IL-10 de 1 a 2 ng/ml. Como se describe en la sección experimental, El tratamiento con PEG-IL-10 dio como resultado una respuesta completa, mientras que el tratamiento con IL-10 demostró una función antitumoral pero no una respuesta completa.
Sin embargo, evaluaciones adicionales, descritas en detalle en la sección experimental, indicaron que las concentraciones en suero más elevadas son útiles en el entorno oncológico. En particular, una evaluación del efecto de PEG-hIL-10 en pacientes con tumores sólidos (por ejemplo, tumores de ovario, tumores renales, tumores colónicos o tumores pancreáticos) indicó que es ventajoso alcanzar concentraciones en suero de PEG-hIL-10 superiores a las inicialmente contempladas (y descritas a continuación) con el fin de lograr la máxima eficacia.
Por tanto, la presente divulgación contempla realizaciones dirigidas al tratamiento o prevención de enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con el cáncer, en donde la terapia se optimiza logrando una concentración mínima media en suero de IL-10 de al menos 10,0 ng/ml. Como se divulga en el presente documento, los perfiles de concentración que se pueden producir incluyen: una concentración mínima media en suero de IL-10 superior a aproximadamente 6,5 ng/ml, superior a aproximadamente 7,0 ng/ml, superior a aproximadamente 7,5 ng/ml, superior a aproximadamente 8,0 ng/ml, superior a aproximadamente 8,5 ng/ml, superior a aproximadamente 9,0 ng/ml, superior a aproximadamente 9,5 ng/ml. En algunas realizaciones, los perfiles de concentración que se pueden producir incluyen: una concentración mínima media en suero de IL-10 superior a 10,0 ng/ml, superior a 10,5 ng/ml, superior a 11.0 ng/ml, superior a 11,5 ng/ml, superior a 12,0 ng/ml, superior a 12,5 ng/ml, superior a 13,0 ng/ml, superior a 13.5 ng/ml, superior a 14,0 ng/ml, superior a 14,5 ng/ml, superior a 15,0 ng/ml, superior a 15,5 ng/ml, superior a 16.0 ng/ml, superior a 16,5 ng/ml, superior a 17,0 ng/ml, superior a 17,5 ng/ml, superior a 18,0 ng/ml, superior a 18.5 ng/ml, superior a 19,0 ng/ml, superior a 19,5 ng/ml, superior a 20,0 ng/ml, superior a 20,5 ng/ml, superior a 21.0 ng/ml, superior a 21,5 ng/ml, superior a 22,0 ng/ml, superior a 22,5 ng/ml, superior a 23,0 ng/ml o superior a 24.0 ng/ml.
Las realizaciones particulares divulgadas en el presente documento comprenden una concentración mínima media en suero de IL-10 en un intervalo de aproximadamente 6,0 ng/ml a aproximadamente 20,0 ng/ml, de aproximadamente 7.0 ng/ml a aproximadamente 19,0 ng/ml, de aproximadamente 8,0 ng/ml a aproximadamente 18,0 ng/ml, de aproximadamente 9,0 ng/ml a aproximadamente 17,0 ng/ml. Las realizaciones particulares de la presente divulgación comprenden una concentración mínima media en suero de IL-10 en un intervalo de 10,0 ng/ml a 22,0 ng/ml, de 10.0 ng/ml a 21,0 ng/ml, de 10,0 ng/ml a 20,0 ng/ml, de 10,0 ng/ml a 19,0 ng/ml, de 10,0 ng/ml a 18,0 ng/ml, de 10.0 ng/ml a 17,0 ng/ml, de 10,0 ng/ml a 16,0 ng/ml, de 10,0 ng/ml a 15,0 ng/ml, de 10,0 ng/ml a 12,5 ng/ml, de 12.5 ng/ml a 22,0 ng/ml, de 12,5 ng/ml a 20,0 ng/ml, de 12,5 ng/ml a 17,5 ng/ml, de 12,5 ng/ml a 15,0 ng/ml, de 15.0 ng/ml a 22,0 ng/ml, de 15,0 ng/ml a 20,0 ng/ml, de 15,0 ng/ml a 18,0 ng/ml, de 15,0 ng/ml a 17,0 ng/ml, de 17.5 ng/ml a 22,0 ng/ml, de 17,5 ng/ml a 20,0 ng/ml, de 18,0 ng/ml a 22,0 ng/ml, de 18,0 ng/ml a 21,0 ng/ml, de 18.0 ng/ml a 20,0 ng/ml, de 6,0 ng/ml a 18,0 ng/ml, de 6,0 ng/ml a 16,0 ng/ml, de 6,0 ng/ml a 14,0 ng/ml, de 6,0 ng/ml a 12,0 ng/ml, de 6,0 ng/ml a 10,0 ng//ml, de 8,0 ng/ml a 22,0 ng/ml, de 8,0 ng/ml a 20,0 ng/ml, de 8,0 ng/ml a 18.0 ng/ml, de 8,0 ng/ml a 16,0 ng/ml, de 8,0 ng/ml a 14,0 ng/ml, de 10,0 ng/ml a 22,0 ng/ml, de 10,0 ng/ml a 20.0 ng/ml, de 10,0 ng/ml a 18,0 ng/ml, de 10,0 ng/ml a 16,0 ng/ml, de 0,0 ng/ml a 14,0 ng/ml, de 12,0 ng/ml a 22.0 ng/ml, de 12,0 ng/ml a 20,0 ng/ml, de 12,0 ng/ml a 18,0 ng/ml, de 12,0 ng/ml a 16,0 ng/ml o de 12,0 ng/ml a 14.0 ng/ml.
La evaluación adicional de pacientes con otras enfermedades, trastornos o afecciones puede identificar poblaciones de pacientes que también pueden beneficiarse de dichas concentraciones elevadas en suero. Sin embargo, incluso en dichas poblaciones de pacientes, también se puede observar una utilidad clínicamente relevante a concentraciones más bajas.
Niveles en suero de PEG-hIL-10 útiles para tratar determinadas poblaciones de pacientes.
En algunas realizaciones divulgadas en el presente documento, los perfiles de concentración de niveles plasmáticos en sangre que se pueden producir incluyen: una concentración mínima media en suero de IL-10 superior a aproximadamente 0,1 ng/ml, superior a aproximadamente 0,15 ng/ml, superior a aproximadamente 0,2 ng/ml, superior a aproximadamente 0,25 ng/ml, superior a aproximadamente 0,3 ng/ml, superior a aproximadamente 0,35 ng/ml, superior a aproximadamente 0,4 ng/ml, superior a aproximadamente 0,45 ng/ml, superior a aproximadamente
0,5 ng/ml, superior a aproximadamente 0,55 ng/ml, superior a aproximadamente 0,6 ng/ml, superior a aproximadamente 0,65 ng/ml, superior a aproximadamente 0,7 ng/ml, superior a aproximadamente 0,75 ng/ml, superior a aproximadamente 0,8 ng/ml, superior a aproximadamente 0,85 ng/ml, superior a aproximadamente
0,9 ng/ml, superior a aproximadamente 0,95 ng/ml, superior a aproximadamente 1,0 ng/ml, superior a aproximadamente 1,1 ng/ml, superior a aproximadamente 1,2 ng/ml, superior a aproximadamente 1,3 ng/ml, superior a aproximadamente 1,4 ng/ml, superior a aproximadamente 1,5 ng/ml, superior a aproximadamente 1,6 ng/ml, superior a aproximadamente 1,7 ng/ml, superior a aproximadamente 1,8 ng/ml, superior a aproximadamente
1.9 ng/ml, superior a aproximadamente 2,0 ng/ml, superior a aproximadamente 2,1 ng/ml, superior a aproximadamente 2,2 ng/ml, superior a aproximadamente 2,3 ng/ml, superior a aproximadamente 2,4 ng/ml, superior a aproximadamente 2,5 ng/ml, superior a aproximadamente 2,75 ng/ml o superior a aproximadamente 3,0 ng/ml.
Las realizaciones particulares divulgadas en el presente documento comprenden una concentración mínima media en suero de IL-10 en un intervalo de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 1,0 ng/ml, de aproximadamente
0,1 ng/ml a aproximadamente 0,9 ng/ml, de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 0,8 ng/ml, de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 0,7 ng/ml, de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente
0,6 ng/ml, de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 0,5 ng/ml, de aproximadamente 0,2 ng/ml a aproximadamente 1,0 ng/ml, de aproximadamente 0,2 ng/ml a aproximadamente 0,9 ng/ml, de aproximadamente
0,2 ng/ml a aproximadamente 0,8 ng/ml, de aproximadamente 0,2 ng/ml a aproximadamente 0,7 ng/ml, de aproximadamente 0,2 ng/ml a aproximadamente 0,6 ng/ml, de aproximadamente 0,2 ng/ml a aproximadamente
0,5 ng/ml, de aproximadamente 0,3 ng/ml a aproximadamente 1,0 ng/ml, de aproximadamente 0,3 ng/ml a aproximadamente 0,9 ng/ml, de aproximadamente 0,3 ng/ml a aproximadamente 0,8 ng/ml, de aproximadamente
0,3 ng/ml a aproximadamente 0,7 ng/ml, de aproximadamente 0,3 ng/ml a aproximadamente 0,6 ng/ml, de aproximadamente 0,3 ng/ml a aproximadamente 0,5 ng/ml, de aproximadamente 0,3 ng/ml a aproximadamente
0,4 ng/ml, de aproximadamente 0,4 ng/ml a aproximadamente 1,0 ng/ml, de aproximadamente 0,4 ng/ml a aproximadamente 0,9 ng/ml, de aproximadamente 0,4 ng/ml a aproximadamente 0,8 ng/ml, de aproximadamente
0,4 ng/ml a aproximadamente 0,7 ng/ml, de aproximadamente 0,4 ng/ml a aproximadamente 0,6 ng/ml, de aproximadamente 0,4 ng/ml a aproximadamente 0,5 ng/ml, de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente
1.0 ng/ml, de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 0,9 ng/ml, de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 0,8 ng/ml, de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 0,7 ng/ml, de aproximadamente
0,5 ng/ml a aproximadamente 0,6 ng/ml, de aproximadamente 0,7 ng/ml a aproximadamente 2,3 ng/ml, de aproximadamente 0,8 ng/ml a aproximadamente 2,2 ng/ml, de aproximadamente 0,9 ng/ml a aproximadamente
2.1 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 2,1 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 2,0 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 1,9 ng/ml, de aproximadamente
1.0 ng/ml a aproximadamente 1,8 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 1,7 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente 1,6 ng/ml, de aproximadamente 1,0 ng/ml a aproximadamente
1,5 ng/ml, de aproximadamente 1,9 ng/ml a aproximadamente 2,5 ng/ml, de aproximadamente 1,9 ng/ml a aproximadamente 2,5 ng/ml, de aproximadamente 1,9 ng/ml a aproximadamente 2,4 ng/ml, de aproximadamente
1.9 ng/ml a aproximadamente 2,3 ng/ml, de aproximadamente 1,9 ng/ml a aproximadamente 2,2 ng/ml o de aproximadamente 1,9 ng/ml a aproximadamente 2,1 ng/ml.
En realizaciones particulares divulgadas en el presente documento dirigidas al tratamiento o prevención de enfermedades, trastornos o afecciones antinflamatorias, la terapia se optimiza logrando una concentración mínima media en suero de IL-10 de 0,1 ng/ml a 1,0 ng/ml, de 0,1 ng/ml a 0,9 ng/ml, de 0,1 ng/ml a 0,8 ng/ml, de 0,1 ng/ml a
0,7 ng/ml, de 0,1 ng/ml a 0,6 ng/ml, de 0,1 ng/ml a 0,5 ng/ml, de 0,2 ng/ml a 1,0 ng/ml, de 0,2 ng/ml a 0,9 ng/ml, de
0,2 ng/ml a 0,8 ng/ml, de 0,2 ng/ml a 0,7 ng/ml, de 0,2 ng/ml a 0,6 ng/ml, de 0,2 ng/ml a 0,5 ng/ml, de 0,3 ng/ml 1.0 ng/ml, de 0,3 ng/ml a 0,9 ng/ml, de 0,3 ng/ml a 0,8 ng/ml, de 0,3 ng/ml a 0,7 ng/ml, de 0,3 ng/ml a 0,6 ng/ml, de
0,3 ng/ml a 0,5 ng/ml, de 0,3 ng/ml a 0,4 ng/ml, de 0,4 ng/ml a 1,0 ng/ml, de 0,4 ng/ml a 0,9 ng/ml, de 0,4 ng/ml 0,8 ng/ml, de 0,4 ng/ml a 0,7 ng/ml, de 0,4 ng/ml a 0,6 ng/ml, de 0,4 ng/ml a 0,5 ng/ml, de 0,5 ng/ml a 1,0 ng/ml, de
0,5 ng/ml a 0,9 ng/ml, de 0,5 ng/ml a 0,8 ng/ml, de 0,5 ng/ml a 0,7 ng/ml o de 0,5 ng/ml a 0,6 ng/ml.
La sección experimental y las figuras 4 a 7 proporcionan ejemplos de regímenes de dosificación que se pueden utilizar para lograr las concentraciones mínimas en suero de IL-10 deseadas. Con referencia a la figura 4, la administración subcutánea (s.c.) diaria de 20 pg/kg de PEG-hIL-10 dio como resultado exposiciones que excedieron la CE50 de
~6 ng/ml (se consideró que las exposiciones iguales o superiores a la CE50 eran ventajosas) y que estaban sistemáticamente por encima de una concentración mínima en suero de IL-10 de 10 ng/ml, mientras que la administración s.c. diaria de 10 pg/kg de PEG-hIL-10 dio como resultado con frecuencia exposiciones iguales o superiores a la CE50 y que estaban sistemáticamente por encima de una concentración mínima en suero de IL-10 de
5 ng/ml. Se lograron concentraciones mínimas en suero de IL-10 similares en pacientes que tenían tipos de cáncer particulares a los que se dosificó por vía s.c. diariamente 10 pg/kg y 20 pg/kg de PEG-hIL-10 (Figuras 5a y 5B).
Se puede evaluar el efecto del tratamiento con IL-10 en la hepatitis C. Se puede utilizar un modelo de ratón con un sistema inmunitario funcional que es susceptible a la infección por el virus de la hepatitis C (véase Dorner, M. (09 de junio de 2011) Nature 474:208-211) para evaluar los efectos farmacocinéticos y farmacodinámicos de la mIL-10 y de la PEG-mIL-10. Con las enseñanzas establecidas en el presente documento y la base de conocimientos del experto, se puede evaluar el efecto de la mIL-10 y de la PEG-mIL-10 administradas para lograr una concentración mínima media en suero de IL-10 deseada.
Aunque no es frecuente a dosis terapéuticas en la mayoría de las poblaciones de pacientes, la administración de dosis más elevadas de IL-10 ha provocado efectos indeseables (por ejemplo, cefalea, anemia y efectos sobre el hígado) en un número limitado de sujetos. Afortunadamente, dichos efectos indeseables no son frecuentes cuando se mantiene una concentración media en suero de IL-10 de 0,1 a 2,0 ng/ml durante la duración del tratamiento. Además, incluso a concentraciones medias en suero más elevadas (por ejemplo, de 10,0 a 20,0 ng/ml), dichos efectos indeseables generalmente no son frecuentes, son manejables y/o son aceptables en vista de la intensidad del trastorno que se está tratando. No obstante, otra realización de la presente divulgación proporciona un método para controlar a un sujeto que recibe terapia con IL-10 para predecir y, por lo tanto, evitar potencialmente, los efectos indeseables, comprendiendo el método: (1) medir la concentración máxima de IL-10 del sujeto; (2) medir la concentración mínima de IL-10 del sujeto; (3) calcular una fluctuación máxima-mínima; y, (4) utilizar la fluctuación máxima-mínima calculada para predecir posibles efectos indeseables en el sujeto. Una fluctuación máxima-mínima más pequeña indica una menor probabilidad de que el sujeto experimente efectos indeseables relacionados con la IL-10. En determinadas realizaciones, se determinan fluctuaciones máximas-mínimas particulares para el tratamiento de enfermedades, trastornos y condiciones particulares que utilizan parámetros de dosificación particulares, y esas fluctuaciones se utilizan como patrones de referencia.
Además de los parámetros relacionados con la dosificación de la IL-10 descritos anteriormente, las consideraciones sobre el volumen de distribución también son relevantes. Para la mayoría de los fármacos, las concentraciones del fármaco en plasma disminuyen de forma multiexponencial. Inmediatamente después de la administración intravenosa, el fármaco se distribuye rápidamente a lo largo de un espacio inicial (definido mínimamente como el volumen plasmático) y, a continuación, se produce una distribución más lenta y equilibrada a los espacios extravasculares (por ejemplo, determinados tejidos). La administración intravenosa de IL-10 está asociada con este modelo cinético de dos compartimentos (véase Rachmawati, H. et al. (2004) Pharm. Res. 21(11):2072-78). También se ha estudiado la farmacocinética de la hIL-10 recombinante subcutánea (Radwanski, E. et al. (1998) Pharm. Res. 15(12):1895-1901). Además, se han introducido modificaciones de la IL-10 en un intento de dirigir la citocina a tipos de células específicos (véase Rachmawati, H. (mayo de 2007) Drug Met. Dist. 35(5):814-21).
Como se describe más adelante, la eficacia antitumoral de la IL-10 y de la PEG-IL-10 observada en ratones se debe a la inducción de enzimas citotóxicas en los linfocitos T CD8+, lo que provoca la destrucción de las células tumorales. Muchos compuestos antineoplásicos, que incluyen, pero sin limitación, agentes inductores de la apoptosis, se administran en ciclos. Con frecuencia, se administra una dosis única o una serie de dosis que se acercan a la dosis máxima tolerada (DMT), que incluye una aplicación única o de una serie de dosis elevadas que se acerquen a la dosis máxima tolerada (DMT), seguido de un cese de la dosificación (un "descanso farmacológico") para permitir la recuperación de la fisiología normal del paciente. Como ejemplo, esta estrategia de dosificación se aplica a las terapias con anticuerpos quimioterapéuticos citotóxicos, tales como anti-VEGF (AVASTIN) y a reactivos biológicos de vida corta, tales como PROLEUKIN (IL-2).
Se realizaron estudios en ratones para generar datos útiles en la comprensión de los parámetros farmacocinéticos de la terapia con IL-10 y en la optimización de los regímenes de tratamiento de tumores en seres humanos. Como se describe en la sección experimental, aunque los ratones que recibieron la misma cantidad de fármaco en el transcurso de una semana administrado en una o varias dosis tuvieron exposiciones generales similares, los ratones que recibieron dosis diarias presentaron la mayor reducción en el tamaño del tumor (Tabla 15). Además, los regímenes de tratamiento que dieron lugar al mantenimiento de concentraciones mínimas en suero superiores a aproximadamente 1 ng/ml (por ejemplo, de 1,1 a 2,1 ng/ml) presentaron la mayor reducción en el tamaño y peso del tumor (Tabla 16).
La presente divulgación contempla la administración de cualquier dosis que dé como resultado el mantenimiento de las concentraciones mínimas en suero superiores a aproximadamente 10,0 ng/ml. Por ejemplo, cuando el sujeto es un ser humano, puede administrarse hIL-10 no pegilada a una dosis superior a 15 pg/kg/día, superior a 18 pg/kg/día, superior a 20 pg/kg/día, superior a 21 pg/kg/día, superior a 22 pg/kg/día, superior a 23 pg/kg/día, superior a 24 pg/kg/día o superior a 25 pg/kg/día. Cuando el sujeto es un ser humano, la PEG-hIL-10 que comprende un PEG relativamente pequeño (por ejemplo, mono-di PEG-hIL10 de 5 kDa) puede administrarse a una dosis superior a 2,0 pg/kg/día, superior a 2,3 pg/kg/día, superior a 2,5 pg/kg/día, superior a 2,6 pg/kg/día, superior a 2,7 pg/kg/día, superior a 2,8 pg/kg/día, superior a 2,9 pg/kg/día, superior a 3,0 pg/kg/día, superior a 3,1 pg/kg/día, superior a 3,2 pg/kg/día, superior a 3,3 pg/kg/día, superior a 3,4 pg/kg/día o superior a 3,5 pg/kg/día.
El papel de los linfocitos T CD8+ en la función de la IL-10
El CD8 (grupo de diferenciación 8) es una glucoproteína transmembrana que sirve como correceptor para el receptor de linfocitos T (TCR, del inglés T cell receptor). El correceptor CD8 se expresa predominantemente en la superficie de los linfocitos T citotóxicos (CTL, del inglés cytotoxic T lymphocytes), pero también se encuentra en otros tipos de células, incluidos los linfocitos citolíticos naturales (NK). Al igual que el TCR, CD8 se une a una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, del inglés majorhistocompatibility complex), pero es específico para la proteína MHC de clase I.
La función de CD8 necesita la formación de un dímero que comprenda un par de cadenas de CD8. Hay dos isoformas de CD8, a y p, y la forma más común de CD8 comprende una cadena CD8-a y una CD8-p, ambas son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. CD8-a interactúa con la molécula MHC de clase I y esta interacción mantiene al receptor de linfocitos T del linfocito T citotóxico y a la célula diana estrechamente unidos durante la activación específica del antígeno. Los linfocitos T citotóxicos con la proteína de superficie CD8 se denominan "linfocitos T CD8+". Los linfocitos T CD8+ (CTL y células NK) reconocen antígenos (generalmente péptidos o proteínas de la superficie celular resultantes de la infección por patógenos intracelulares) de células diana infectadas específicas, y si esos antígenos difieren del perfil antigénico normal del sujeto ("autoinmunitario"), los linfocitos T CD8+ se activan e inducen la apoptosis de las células diana.
Existen varios escenarios en donde difieren los perfiles de antígenos. Por ejemplo, cuando un patógeno (por ejemplo, un virus) invade una célula, la célula produce antígenos de superficie celular "no propios", y los linfocitos T c D8+ inician una respuesta inmunitaria en un intento de erradicar las células infectadas. Ocurre otro escenario en donde algunas de las proteínas de una célula se modifican debido a mutaciones a nivel de ácido nucleico y/o de aminoácido. Las células cancerosas generalmente portan muchas mutaciones y los linfocitos T CD8+ las reconocen como "diferentes". La presencia de linfocitos T CD8+ en el cáncer humano se correlaciona con una supervivencia más prolongada.
En los dos escenarios antes mencionados, los linfocitos T CD8+ activados producen IFNy, perforina y grancima B. El IFNy es importante para aumentar más la "presentación" de antígenos en las células diana, que se produce en la proteína m Hc de clase I. La perforina y la grancima B median en la destrucción de la célula diana (por ejemplo, virus y cáncer).
La perforina, una proteína citolítica que se encuentra en los gránulos de los CTL y en células NK, se inserta en la membrana plasmática de una célula diana tras la desgranulación. La perforina tiene similitudes estructurales y funcionales para complementar el componente 9 (C9) y, al igual que el C9, la perforina crea túbulos transmembrana y es capaz de lisar de forma no específica una variedad de células diana. La perforina es una molécula efectora clave para la citólisis mediada por linfocitos T y células NK.
Como se ha hecho alusión anteriormente, la grancima B es una serina proteasa expresada por los linfocitos T citotóxicos (CTL) y los linfocitos citolíticos naturales (NK). Los CTL y las células NK reconocen poblaciones específicas de células diana infectadas e inducen la apoptosis de las células que portan en su superficie "antígenos no propios", generalmente péptidos o proteínas resultantes de la infección por patógenos intracelulares. La grancima B es fundamental para la rápida inducción de la apoptosis de las células diana mediante los CTL en la respuesta inmunitaria mediada por células.
La IL-10 juega diversos papeles en la activación de los linfocitos T CD8+. Por ejemplo, la IL-10 induce las moléculas efectoras (IFNy, perforina y grancima B) en los linfocitos T CD8+ de memoria, células que se han generado durante una infección o vacunación previa. Dichos linfocitos T CD8+ de memoria son las células responsables de proporcionar protección a largo plazo a un sujeto contra un virus. Aunque la generación y amplificación de linfocitos T CD8+ de memoria puede darse cuando la IL-10 no está presente (Vicari, A. y Trinchieri, G. (2004) Inmuno. Rev. 202:223-236), el hecho de que la IL-10 active directamente dichas células proporciona un enfoque terapéutico único y alternativo. Aunque la infección vírica crónica se ha relacionado con los linfocitos T CD8+ (Virgin, H. et al. (2009) Cell 138, pág.
30), no se ha descrito el tratamiento de sujetos (por ejemplo, ratones) con IL-10 no pegilada o IL-10 pegilada.
En vista de lo anterior, una realización de la presente divulgación se basa en el nexo entre los linfocitos T CD8+ y tanto el cáncer como infecciones víricas. Por tanto, determinados métodos de tratamiento y/o prevención de enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con el cáncer también deben ser aplicables en el tratamiento de enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con virus anteriormente mencionadas.
A diferencia de otras citocinas, la IL-10 puede considerarse tanto un potente factor inmunoestimulador como inmunosupresor. El papel de los linfocitos T CD8+ en la inflamación crónica no se ha dilucidado por completo. Sin embargo, dado que la implicación del IFNy en el cáncer y los trastornos relacionados con virus está mediada, al menos en parte, por los linfocitos T CD8+, y dado que la vía IL-10-linfocitos T implicada en el control de los trastornos relacionados con la inflamación (a través de la disminución de las citocinas inflamatorias) también implica al IFNy, los linfocitos T CD8+ también pueden desempeñar un papel clave en la inflamación. Por tanto, la IL-10 puede resultar un agente terapéutico importante en el grupo actual de agentes antinflamatorios.
Métodos de producción de IL-10
Un polipéptido de la presente divulgación se puede producir mediante cualquier método adecuado, incluidos métodos no recombinantes (por ejemplo, síntesis química) y recombinantes.
A. Síntesis química
Cuando se sintetiza químicamente un polipéptido, la síntesis puede realizarse en fase líquida o en fase sólida. La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS, del inglés Solid-phase peptide synthesis) permite la incorporación de aminoácidos no naturales y/o la modificación de la cadena principal de péptidos/proteínas. Diversas formas de SPPS, tales como 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) y t-butiloxicarbonilo (Boc), están disponibles para sintetizar polipéptidos de la presente divulgación. Los detalles de las síntesis químicas se conocen en la materia (por ejemplo, Ganesan A. (2006) Mini Rev. Med. Chem. 6:3-10; y Camarero J. A. et al., (2005) Protein Pept Lett. 12:723-8).
La síntesis de péptidos en fase sólida se puede realizar como se describe en el presente documento a continuación. Las funciones alfa (Na) y cualquier cadena lateral reactiva están protegidas con grupos lábiles a ácidos o lábiles a bases. Los grupos protectores son estables en las condiciones de unión de los enlaces amida, pero se pueden escindir fácilmente sin alterar la cadena peptídica que se ha formado. Los grupos protectores adecuados para la función aamino incluyen, pero sin limitación, los siguientes: Boc, benciloxicarbonilo (Z), O-clorbenciloxicarbonilo, bifenilisopropiloxicarbonilo, terc-amiloxicarbonilo (Amoc), a, a-dimetil-3,5-dimetoxi-benciloxicarbonilo, o-nitrosulfenilo, 2-ciano-t-butoxi-carbonilo, Fmoc, 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo (Dde) y similares.
Los grupos protectores de cadena lateral adecuados incluyen, pero sin limitación: acetilo, alilo (All), aliloxicarbonilo (Alloc), bencilo (Bzl), benciloxicarbonilo (Z), t-butiloxicarbonilo (Boc), benciloximetilo (Bom), o-bromobenciloxicarbonilo, t-butilo (tBu), t-butildimetilsililo, 2-clorobencilo, 2-clorobenciloxicarbonilo, 2,6-diclorobencilo, ciclohexilo, ciclopentilo, 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo (Dde), isopropilo, 4-metoxi-2,3-6-trimetilbencilsulfonilo (Mtr), 2,3,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc), pivalilo, tetrahidropiran-2-ilo, tosilo (Tos), 2,4,6-trimetoxibencilo, trimetilsililo y tritilo (Trt).
En la síntesis en fase sólida, el aminoácido carboxiterminal se acopla a un material de soporte adecuado. Los materiales de soporte adecuados son aquellos que son inertes frente a los reactivos y las condiciones de reacción para las reacciones de condensación y escisión por etapas del proceso de síntesis y que no se disuelven en los medios de reacción que se van a utilizar. Los ejemplos de materiales de soporte comercialmente disponibles incluyen copolímeros de estireno/divinilbenceno que se han modificado con grupos reactivos y/o polietilenglicol; copolímeros de estireno/divinilbenceno clorometilados; copolímeros de estireno/divinilbenceno hidroximetilados o aminometilados; y similares. Cuando se desea la preparación del ácido peptídico, se puede utilizar poliestireno (1 %)-divinilbenceno o TentaGel® derivatizado con 4-benciloxibencil-alcohol (anclaje Wang) o cloruro de 2-clorotritilo. En el caso del péptido con amida, se puede utilizar poliestireno (1 %) divinilbenceno o TentaGel® derivatizado con el grupo ácido 5-(4'-aminometil)-3',5'-dimetoxifenoxi)valérico (anclaje PAL) o p-(2,4-dimetoxifenil-aminometil)-fenoxi S (anclaje de amida Rink).
El enlace con el soporte polimérico puede lograrse haciendo reaccionar el aminoácido carboxiterminal protegido con Fmoc con el material de soporte mediante la adición de un reactivo de activación en etanol, acetonitrilo, N,N-dimetilformamida (DMF), diclorometano, tetrahidrofurano, N-metilpirrolidona o disolventes similares a temperatura ambiente o a temperaturas elevadas (por ejemplo, entre 40 °C y 60 °C) y con tiempos de reacción de, por ejemplo, de 2 a 72 horas.
El acoplamiento del aminoácido protegido con Na (por ejemplo, el aminoácido Fmoc) al anclaje PAL, Wang o Rink puede, por ejemplo, llevarse a cabo con la ayuda de reactivos de acoplamiento tales como N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) u otras carbodiimidas, tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (TBTU) u otras sales de uronio, O-acil-ureas, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-tris-pirrolidino-fosfonio (PyBOP) u otras sales de fosfonio, N-hidroxisuccinimidas, otras N-hidroxiimidas u oximas en presencia o ausencia de 1-hidroxibenzotriazol o 1-hidroxi-7-azabenzotriazol, por ejemplo, con la ayuda de TBTU con adición de HOBt, con o sin la adición de una base tal como, por ejemplo, diisopropiletilamina (DIEA), trietilamina o N-metilmorfolina, por ejemplo, diisopropiletilamina con tiempos de reacción de 2 a 72 horas (por ejemplo, 3 horas en un exceso de 1,5 a 3 veces del aminoácido y los reactivos de acoplamiento, por ejemplo, en un exceso de 2 veces y a temperaturas entre aproximadamente 10 °C y 50 °C, por ejemplo, 25 °C, en un disolvente tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidona o diclorometano, por ejemplo, dimetilformamida).
En lugar de los reactivos de acoplamiento, también es posible utilizar los ésteres activos (por ejemplo, pentafluorofenilo, p-nitrofenilo o similares), el anhídrido simétrico del Na-Fmoc-aminoácido, su cloruro de ácido o fluoruro de ácido, en las condiciones descritas anteriormente.
El aminoácido protegido con Na (por ejemplo, el aminoácido con Fmoc) puede acoplarse a la resina de 2-clorotritilo en diclorometano con la adición de DIEA y con tiempos de reacción de 10 a 120 minutos, por ejemplo, de 20 minutos, pero no se limita al uso de este disolvente y esta base.
El acoplamiento sucesivo de los aminoácidos protegidos puede realizarse según métodos convencionales en síntesis de péptidos, normalmente en un sintetizador de péptidos automatizado. Después de la escisión del grupo protector Na-Fmoc del aminoácido acoplado en la fase sólida por tratamiento con, por ejemplo, piperidina (10 % a 50 %) en dimetilformamida durante 5 a 2o minutos, por ejemplo, 2 * 2 minutos con piperidina al 50 % en DMF y 1 * 15 minutos con piperidina al 20 % en DMF, el siguiente aminoácido protegido en un exceso de 3 a 10 veces, por ejemplo, en un exceso de 10 veces, se acopla al aminoácido anterior en un disolvente inerte, no acuoso y polar tal como diclorometano, DMF o mezclas de los dos y a temperaturas entre aproximadamente 10 °C y 50 °C, por ejemplo, a 25 °C. Los reactivos mencionados anteriormente para acoplar el primer aminoácido Na-Fmoc al anclaje PAL, Wang o Rink son adecuados como reactivos de acoplamiento. También se pueden usar como alternativa ésteres activos del aminoácido protegido, o cloruros o fluoruros o anhídridos simétricos de los mismos.
Al final de la síntesis en fase sólida, el péptido se escinde del material de soporte al mismo tiempo que se escinden los grupos protectores de la cadena lateral. La escisión se puede llevar a cabo con ácido trifluoroacético o con otro medio fuertemente ácido con la adición del 5 % al 20 % v/v de depuradores tales como dimetilsulfuro, etilmetilsulfuro, tioanisol, tiocresol, m-cresol, etanoditiol anisólico, fenol o agua, por ejemplo, 15 % v/v de dimetilsulfuro/etanoditiol/mcresol 1:1:1, dentro de 0,5 a 3 horas, por ejemplo, 2 horas. Los péptidos con cadenas laterales totalmente protegidas se obtienen escindiendo el anclaje de 2-clorotritilo con ácido acético glacial/trifluoroetanol/diclorometano 2:2:6. El péptido protegido se puede purificar por cromatografía en gel de sílice. Si el péptido se une a la fase sólida a través del anclaje Wang y si se pretende obtener un péptido con una alquilamidación carboxiterminal, la escisión puede realizarse por aminolisis con una alquilamina o fluoroalquilamina. La aminolisis se realiza a temperaturas entre aproximadamente -10 °C y 50 °C (por ejemplo, aproximadamente 25 °C), y a tiempos de reacción entre aproximadamente 12 y 24 horas (por ejemplo, aproximadamente 18 horas). Además, el péptido se puede escindir del soporte por reesterificación, por ejemplo, con metanol.
La solución ácida que se obtiene se puede mezclar con una cantidad de 3 a 20 veces mayor de éter o n-hexano fríos, por ejemplo, un exceso de 10 veces de éter dietílico, para precipitar el péptido y, por lo tanto, separar los depuradores y los grupos protectores escindidos que quedan en el éter. Se puede realizar una purificación adicional volviendo a precipitar el péptido varias veces en ácido acético glacial. El precipitado obtenido se puede recoger en agua o terc-butanol o mezclas de los dos disolventes, por ejemplo, una mezcla 1:1 de terc-butanol/agua, y liofilizar.
El péptido obtenido se puede purificar por varios métodos cromatográficos, incluyendo el intercambio iónico sobre una resina débilmente básica en forma de acetato; cromatografía de adsorción hidrófoba sobre copolímeros de poliestireno/divinilbenceno no derivatizados (por ejemplo, Amberlite® XAD); cromatografía de adsorción sobre gel de sílice; cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, sobre carmelosa; cromatografía de distribución, por ejemplo, en Sephadex® G-25; cromatografía de distribución en contracorriente; o cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC), por ejemplo, HPLC de fase inversa en fases de octilo u octadecilsililsílice (ODS).
B. Producción recombinante
Los métodos que describen la preparación de IL-10 humana y de ratón se pueden encontrar en, por ejemplo, la patente de EE, UU. n.° 5.231.012, que enseña métodos para la producción de proteínas que tienen actividad de IL-10, incluyendo técnicas recombinantes y otras técnicas sintéticas. IL-10 puede ser de origen vírico, y la clonación y expresión de una IL-10 vírica del virus Epstein Barr (proteína BCRF1) se divulga en Moore et al., (1990) Science 248:1230. La IL-10 se puede obtener de varias maneras utilizando técnicas convencionales conocidas en la materia, tal como las descritas en el presente documento. La IL-10 humana recombinante también está disponible comercialmente, por ejemplo, de PeproTech, Inc., Rocky Hill, N.J.
Cuando se produce un polipéptido usando técnicas recombinantes, el polipéptido puede producirse como una proteína intracelular o como una proteína secretada, usando cualquier construcción adecuada y cualquier célula hospedadora adecuada, que puede ser una célula procariota o eucariota, como una célula hospedadora bacteriana (por ejemplo, E. coli) o una de levadura, respectivamente. Otros ejemplos de células eucariotas que pueden utilizarse como células hospedadoras incluyen células de insectos, células de mamífero y/o células vegetales. Cuando se utilizan células hospedadoras de mamífero, pueden incluir células humanas (por ejemplo, células HeLa, 293, H9 y Jurkat); células de ratón (por ejemplo, NIH3T3, células L y células C127); células de primates (por ejemplo, Cos 1, Cos 7 y CV1); y células de hámster (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO)).
Se puede emplear una variedad de sistemas hospedador-vector adecuados para la expresión de un polipéptido de acuerdo con los procedimientos convencionales conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989 Current Protocols in Molecular Biology Cold Spring Harbor Press, Nueva York; y Ausubel et al. 1995 Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Wiley and Sons. Los métodos para la introducción de material genético en las células hospedadoras incluyen, por ejemplo, transformación, electroporación, conjugación, métodos con fosfato de calcio y similares. El método de transferencia puede seleccionarse para proporcionar expresión estable del ácido nucleico que codifica el polipéptido introducido. El ácido nucleico que codifica el polipéptido se puede proporcionar como un elemento episómico heredable (por ejemplo, un plásmido) o se puede integrar genómicamente. Están disponibles comercialmente una variedad de vectores apropiados para su uso en la producción de un polipéptido de interés.
Los vectores pueden proporcionar el mantenimiento extracromosómico en una célula hospedadora o pueden proporcionar la integración en el genoma de la célula hospedadora. El vector de expresión proporciona secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción y puede proporcionar una expresión inducible o constitutiva cuando la región codificante está unida operativamente al control de la transcripción de la región de inicio de la transcripción y a una región de terminación de la transcripción y la traducción. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción pueden incluir, pero sin limitación, secuencias promotoras, sitios de unión a ribosomas, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción, y secuencias potenciadoras o activadoras. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles y pueden ser un promotor constitutivo fuerte (por ejemplo, T7).
Generalmente, las construcciones de expresión tienen sitios de restricción convenientes ubicados cerca de la secuencia promotora para posibilitar la inserción de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de interés. Puede estar presente un marcador seleccionable operativo en el hospedador de expresión para facilitar la selección de células que contienen el vector. Además, la construcción de expresión puede incluir elementos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresión puede tener uno o dos sistemas de replicación, lo que permite que se mantenga en organismos, por ejemplo, en células de mamífero o de insecto para expresión y en un hospedador procariota para clonación y amplificación. Además, la construcción de expresión puede contener un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células hospedadoras transformadas. Los genes de selección se conocen bien en la materia y variarán según la célula hospedadora que se vaya a utilizar.
El aislamiento y la purificación de una proteína se pueden lograr según métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, una proteína puede aislarse de un lisado de células modificadas genéticamente para expresar la proteína de forma constitutiva y/o por inducción, o de una mezcla de reacción sintética mediante purificación por inmunoafinidad, que generalmente implica poner en contacto la muestra con un anticuerpo antiproteínico, lavar para eliminar el material unido de manera inespecífica y eluir la proteína unida de manera específica. La proteína aislada puede purificarse adicionalmente mediante diálisis y otros métodos empleados normalmente en la purificación de proteínas. En una realización, la proteína se puede aislar usando métodos de cromatografía de quelatos metálicos. Las proteínas pueden contener modificaciones para facilitar el aislamiento.
Los polipéptidos se pueden preparar en forma sustancialmente pura o aislada (por ejemplo, exentos de otros polipéptidos). Los polipéptidos pueden estar presentes en una composición que está enriquecida para el polipéptido con respecto a otros componentes que pueden estar presentes (por ejemplo, otros polipéptidos u otros componentes de la célula hospedadora). Por ejemplo, el polipéptido purificado se puede proporcionar de tal manera que el polipéptido esté presente en una composición que está sustancialmente exenta de otras proteínas expresadas, por ejemplo, menos de aproximadamente un 90 %, menos de aproximadamente un 60 %, menos de aproximadamente un 50 %, menos de aproximadamente un 40 %, menos de aproximadamente un 30 %, menos de aproximadamente un 20 %, menos de aproximadamente un 10 %, menos de aproximadamente un 5 % o menos de aproximadamente un 1 %.
Se puede generar un polipéptido IL-10 usando técnicas recombinantes para manipular diferentes ácidos nucleicos relacionados con IL-10 conocidos en la materia para proporcionar construcciones capaces de codificar el polipéptido IL-10. Se apreciará que, cuando se proporciona una secuencia de aminoácidos particular, el experto en la materia reconocerá una variedad de moléculas de ácido nucleico diferentes que codifican dicha secuencia de aminoácidos en vista de sus antecedentes y experiencia en, por ejemplo, biología molecular.
Sustituciones de enlaces amida
En algunos casos, la IL-10 incluye uno o más enlaces distintos de los enlaces peptídicos, por ejemplo, al menos dos aminoácidos adyacentes se unen a través de un enlace que no es un enlace amida. Por ejemplo, para reducir o eliminar la proteólisis no deseada u otros medios de degradación, y/o aumentar la estabilidad en suero, y/o restringir o aumentar la flexibilidad conformacional, se pueden sustituir uno o más enlaces amida dentro de la cadena principal de IL-10.
En otro ejemplo, se pueden reemplazar uno o más enlaces amida (-CO-NH-) en la IL-10 con un enlace que es un isóstero de un enlace amida, tal como -CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-(c/s y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- o -CH2SO-. También se pueden reemplazar uno o más enlaces amida en IL-10 por, por ejemplo, un enlace pseudopeptídico isóstero reducido. Véase Couder et al. (1993) Int. J. Peptide Protein Res. 41:181-184. Dichos reemplazos y cómo efectuarlos son conocidos por los expertos en la materia.
Sustituciones de aminoácidos
Se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos en un polipéptido IL-10. Los siguientes son ejemplos no limitantes:
a) sustitución de aminoácidos hidrófobos sustituidos con alquilo, incluyendo alanina, leucina, isoleucina, valina, norleucina, ácido (S)-2-aminobutírico, (S)-ciclohexilalanina u otros alfa-aminoácidos simples sustituidos por una cadena lateral alifática de carbonos C1-C10 que incluyen sustituciones de alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal, cíclica y ramificada;
b) sustitución de aminoácidos hidrófobos aromáticos sustituidos, incluyendo fenilalanina, triptófano, tirosina, sulfotirosina, bifenilalananina, 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, 2-benzotienilalanina, 3-benzotienilalanina, histidina, incluidas las formas amino, alquilamino, dialquilamino, aza, halogenadas (fluoro, cloro, bromo o yodo) o alcoxi (de C1-C4) sustituidas de los aminoácidos aromáticos mencionados anteriormente, cuyos ejemplos ilustrativos son: 2, 3 o 4-aminofenilalanina, 2, 3 o 4-clorofenilalanina, 2, 3 o 4-metilfenilalanina, 2, 3 o 4-metoxifenilalanina, 5-amino, 5-cloro, 5-metil o 5-metoxitriptófano, 2', 3' o 4'-amino-, 2', 3' o 4'-cloro-, 2, 3 o 4-bifenilalanina, 2', 3' o 4-metil-, 2, 3 o 4-bifenilalanina y 2 o 3-piridilalanina;
c) sustitución de aminoácidos que contienen cadenas laterales básicas, incluyendo arginina, lisina, histidina, ornitina, ácido 2,3-diaminopropiónico, homoarginina, incluyendo derivados de alquilo, alquenilo o sustituidos con arilo (de C1-C10 ramificados, lineales o cíclicos) de los aminoácidos anteriores, si el sustituyente está en los heteroátomos (como el nitrógeno alfa, o el nitrógeno o nitrógenos distales, o en el carbono alfa, en la posición pro-R por ejemplo. Los compuestos que sirven como ejemplos ilustrativos incluyen: N-e-isopropil-lisina, 3-(4-tetrahidropiridil)-glicina, 3-(4-tetrahidropiridil)-alanina, N,N-y, Y'-dietil-homoarginina. También se incluyen compuestos tales como a-metil-arginina, ácido a-metil-2,3-diaminopropiónico, a-metil-histidina, a-metil-ornitina donde el grupo alquilo ocupa la posición pro-R del carbono a. También se incluyen las amidas formadas a partir de ácidos alquílicos, aromáticos, heteroaromáticos (donde el grupo heteroaromático tiene uno o más átomos de nitrógeno, oxígeno o azufre solos o en combinación), carboxílicos o cualquiera de los muchos derivados activados conocidos como cloruros de ácido, ésteres activos, azolidas activas y derivados relacionados, y lisina, ornitina o ácido 2,3-diaminopropiónico;
d) sustitución de aminoácidos ácidos, incluyendo ácido aspártico, ácido glutámico, ácido homoglutámico, tirosina, alquilo, arilo, arilalquilo y heteroarilsulfonamidas del ácido 2,4-diaminopriopionico, ornitina o lisina y aminoácidos de alquilo sustituidos con tetrazol;
e) sustitución de restos de amida de la cadena lateral, incluida la asparagina, glutamina y derivados sustituidos con alquilo o aromáticos de asparagina o glutamina; y
f) sustitución de aminoácidos que contienen hidroxilo, incluyendo serina, treonina, homoserina, ácido 2,3-diaminopropiónico y derivados sustituidos con alquilo o aromáticos de serina o treonina.
En algunos casos, la IL-10 comprende uno o más L-aminoácidos de origen natural no codificados genéticamente, L-aminoácidos sintéticos o D-enantiómeros de un aminoácido. Por ejemplo, la IL-10 puede comprender solamente D-aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido IL-10 puede comprender uno o más de los siguientes restos: hidroxiprolina, p-alanina, ácido o-aminobenzoico, ácido m-aminobenzoico, ácido p-aminobenzoico, ácido m-aminometilbenzoico, ácido 2,3-diaminopropiónico, ácido a-aminoisobutírico, N-metilglicina (sarcosina), ornitina, citrulina, t-butilalanina, tbutilglicina, N-metilisoleucina, fenilglicina, ciclohexilalanina, norleucina, naftilalanina, piridilalanina, 3-benzotienil alanina, 4-clorofenilalanina, 2-fluorofenilalanina, 3-fluorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, p-2-tienilalanina, sulfóxido de metionina, homoarginina, N-acetil lisina, ácido 2,4-diaminobutírico, roaminofenilalanina, N-metilvalina, homocisteína, homoserina, ácido £-aminohexanoico, ácido waminohexanoico, ácido w-aminoheptanoico, ácido w-aminooctanoico, ácido w-aminodecanoico, ácido waminotetradecanoico, ciclohexilalanina, ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a,p-diaminopropiónico, ácido 8-aminovalérico y ácido 2,3-diaminobutírico.
Modificaciones adicionales
Se puede introducir un resto de cisteína o un análogo de cisteína en un polipéptido IL-10 para permitir el enlace con otro péptido a través de un enlace disulfuro o para proporcionar la ciclación del polipéptido IL-10. Los métodos para introducir una cisteína o un análogo de cisteína son conocidos en la materia; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 8.067.532.
Un polipéptido IL-10 se puede ciclar. Se pueden introducir una o más cisteínas o análogos de cisteína en un polipéptido IL-10, donde la cisteína o el análogo de cisteína introducido puede formar un enlace disulfuro con una segunda cisteína o análogo de cisteína introducido. Otros medios de ciclación incluyen la introducción de un enlazador de oxima o un enlazador de lantionina; véase, por ejemplo, la patente de EE. Uu . n.° 8.044.175. Se puede utilizar y/o introducir cualquier combinación de aminoácidos (o fracciones no aminoacídicas) que puedan formar un enlace ciclante. Se puede generar un enlace ciclante con cualquier combinación de aminoácidos (o con un aminoácido y -(CH2)n-CO- o -(CH2)n-C6H4-CO-) con grupos funcionales que permiten la introducción de un puente. Algunos ejemplos son los disulfuros, miméticos de disulfuro tales como el puente -(CH2)n-carba, puentes tioacetales, tioéter (cistationina o lantionina) y puentes que contienen ésteres y éteres. En estos ejemplos, n puede ser cualquier número entero, pero con frecuencia es menos de diez.
Otras modificaciones incluyen, por ejemplo, una sustitución N-alquilo (o arilo) (^[CONR]), o entrecruzamiento de la cadena principal para construir lactamas y otras estructuras cíclicas. Otros derivados incluyen derivados de hidroximetilo carboxiterminal, derivados o-modificados (por ejemplo, hidroximetilbenciléter carboxiterminal), derivados modificados en el extremo N que incluyen amidas sustituidas tales como alquilamidas e hidrazidas.
En algunos casos, uno o más L-aminoácidos en un polipéptido IL-10 se reemplazan con uno o más D-aminoácidos.
En algunos casos, un polipéptido IL-10 es un análogo retroinverso (véase, por ejemplo, Sela y Zisman (1997) FASEB J. 11:449). Los análogos retroinversos de péptidos son isómeros de polipéptidos lineales en los que la dirección de la secuencia de aminoácidos está invertida (retro) y la quiralidad, D- o L-, de uno o más aminoácidos en el mismo está invertida (inverso), por ejemplo, utilizando D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos. [Véase, por ejemplo, Jameson et al. (1994) Nature 368:744; y Brady et al. (1994) Nature 368:692].
Un polipéptido IL-10 puede incluir un "dominio de transducción de proteínas" (PTD, del inglés Protein Transduction Domain), que se refiere a un polipéptido, polinucleótido, hidrato de carbono, o molécula orgánica o inorgánica que facilita atravesar una bicapa lipídica, micela, membrana celular, membrana de orgánulos o membrana de vesículas. Un PTD unido a otra molécula facilita que la molécula atraviese una membrana, por ejemplo, pasar del espacio extracelular al espacio intracelular, o del citosol al interior de un orgánulo. En algunas realizaciones, un PTD está unido covalentemente al extremo amino de un polipéptido IL-10, mientras que, en otras realizaciones, un PTD está unido covalentemente al extremo carboxilo de un polipéptido IL-10. Los dominios de transducción de proteínas ilustrativos incluyen, pero sin limitación, un dominio de transducción de proteínas undecapeptídico mínimo (correspondiente a los restos 47-57 de TAT de VIH-1 que comprende YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 1); una secuencia de poliarginina que comprende varias argininas suficientes para dirigir la entrada en una célula (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 10-50 argininas); un dominio VP22 (Zender et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9(6):489-96); un dominio de transducción de proteínas de Drosophila Antennapedia (Noguchi et al. (2003) Diabetes 52(7): 1732-1737); un péptido de calcitonina humana truncado (Trehin et al. (2004) Pharm. Research 21:1248-1256); polilisina (Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008); RRQRRTSKLNMR (SEQ ID NO: 2); transportano GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 3); KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEQ ID NO: 4); y RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 5). Los PTD ilustrativos incluyen, pero sin limitación, YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1), RKKRRQRRR (s Eq ID NO: 6); un homopolímero de arginina de 3 restos de arginina a 50 restos de arginina; las secuencias de aminoácidos del dominio PTD ilustrativas incluyen, pero sin limitación, cualquiera de las siguientes:
YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1); RKKRRQRR (SEQ ID NO: 7); YARAAARQARA (SEQ ID NO: 8); THRLPRRRRRR (SEQ ID NO: 9); y GGRRARRRRRR (SEQ ID NO: 10).
El grupo carboxilo COR3 del aminoácido en el extremo carboxiterminal de un polipéptido IL-10 puede estar presente en forma libre (R3 = OH) o en forma de una sal alcalina o alcalinotérrea fisiológicamente tolerada, tal como, por ejemplo, una sal de sodio, potasio o calcio. El grupo carboxilo también se puede esterificar con alcoholes primarios, secundarios o terciarios tales como, por ejemplo, metanol, alcoholes alquílicos C1-C6 ramificados o no ramificados, por ejemplo, alcohol etílico o terc-butanol. El grupo carboxilo también se puede amidar con aminas primarias o secundarias tales como amoníaco, alquilaminas C1-C6 ramificadas o no ramificadas o dialquilaminas C1-C6, por ejemplo, metilamina o dimetilamina.
El grupo amino del aminoácido NR1R2 en el extremo aminoterminal de un polipéptido IL-10 puede estar presente en forma libre (R1 = H y R2 = H) o en forma de una sal fisiológicamente tolerada tal como, por ejemplo, un cloruro o acetato. El grupo amino también se puede acetilar con ácidos de manera que R1 = H y R2 = acetilo, trifluoroacetilo o adamantilo. El grupo amino puede estar presente en forma protegida por grupos protectores de amino utilizados convencionalmente en la química de péptidos, tales como los proporcionados anteriormente (por ejemplo, Fmoc, Benciloxi-carbonilo (Z), Boc y Alloc). El grupo amino puede estar N-alquilado en el que R1 y/o R2 = C1-C6 alquilo o C2-C8 alquenilo o C7-C9 aralquilo. Los restos alquilo pueden ser de cadena lineal, ramificados o cíclicos (por ejemplo, etilo, isopropilo y ciclohexilo, respectivamente).
Modificaciones particulares para mejorar y/o imitar la función de IL-10
Con frecuencia es beneficioso, y a veces imperativo, mejorar una o más propiedades físicas de las modalidades de tratamiento divulgadas en el presente documento (por ejemplo, IL-10) y/o la forma en que se administran. Las mejoras de las propiedades físicas incluyen, por ejemplo, inmunogenia moduladora; métodos para aumentar la solubilidad en agua, biodisponibilidad, semivida en suero y/o semivida terapéutica; y/o modular la actividad biológica. Determinadas modificaciones también pueden ser útiles para, por ejemplo, aumentar anticuerpos para su uso en ensayos de detección (por ejemplo, marcadores de epítopos) y para facilitar la purificación de proteínas. Dichas mejoras generalmente deben impartirse sin impactar negativamente en la bioactividad de la modalidad de tratamiento y/o aumentar su inmunogenia.
La pegilación de IL-10 es una modificación particular contemplada por la presente divulgación, mientras que otras modificaciones incluyen, pero sin limitación, glucosilación (ligada a N y O); polisialilación; moléculas de fusión de albúmina que comprenden seroalbúmina (por ejemplo, seroalbúmina humana (HSA), seroalbúmina de macaco cangrejero o seroalbúmina bovina (BSA)); unión de albúmina mediante, por ejemplo, una cadena de ácidos grasos conjugados (acilación); y proteínas de fusión Fc.
Pegilación: La eficacia clínica de los tratamientos con proteínas a menudo está limitada por la semivida en plasma corta y la susceptibilidad a la degradación con proteasas. Los estudios de varias proteínas terapéuticas (por ejemplo, filgrastim) han demostrado que dichas dificultades pueden superarse mediante diversas modificaciones, incluida la conjugación o unión de la secuencia polipeptídica a cualquiera de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos. Esto se realiza con frecuencia mediante una fracción de enlace unida covalentemente tanto a la proteína como al polímero no proteinacéo, por ejemplo, un PEG. Se ha demostrado que dichas biomoléculas conjugadas con PEG poseen propiedades clínicamente útiles, incluida una mejor estabilidad física y térmica, protección contra la susceptibilidad a la degradación enzimática, aumento de la solubilidad, semivida en circulación in vivo más extensa y disminución del aclaramiento, reducción de la inmunogenicidad y antigenicidad y reducción de la toxicidad.
Además de los efectos beneficiosos de la pegilación sobre los parámetros farmacocinéticos, la pegilación en sí misma puede mejorar la actividad. Por ejemplo, se ha demostrado que la PEG-IL-10 es más eficaz contra determinados tipos de cáncer que la IL-10 sin pegilar (véase, por ejemplo, el documento EP 206636A2).
Los PEG adecuados para la conjugación con una secuencia polipeptídica son generalmente solubles en agua a temperatura ambiente y tienen la fórmula general R(O-CH2-CH2)nO-R, donde R es hidrógeno o un grupo protector como un grupo alquilo o alcanol, y donde n es un número entero de 1 a 1000. Cuando R es un grupo protector, generalmente tiene de 1 a 8 carbonos. El PEG conjugado con la secuencia polipeptídica puede ser lineal o ramificado. La presente divulgación contempla derivados ramificados de PEG, "starPEG" y PEG de brazos múltiples. El peso molecular del PEG utilizado en la presente divulgación no se restringe a ningún intervalo en particular y los ejemplos se exponen en otra parte del presente documento; a modo de ejemplo, determinadas realizaciones tienen pesos moleculares entre 5 kDa y 20 kDa, mientras que otras realizaciones tienen pesos moleculares entre 4 kDa y 10 kDa.
La presente divulgación también contempla composiciones de conjugados en donde los PEG tienen diferentes valores de n y, por lo tanto, los diversos PEG diferentes están presentes en relaciones específicas. Por ejemplo, algunas composiciones comprenden una mezcla de conjugados donde n=1, 2, 3 y 4. En algunas composiciones, el porcentaje de conjugados donde n=1 es un 18-25 %, el porcentaje de conjugados donde n=2 es un 50-66 %, el porcentaje de conjugados donde n=3 es un 12-16 %, y el porcentaje de conjugados donde n=4 es hasta un 5 %. Dichas composiciones se pueden producir mediante condiciones de reacción y métodos de purificación conocidos en la materia. Las condiciones de reacción ilustrativas se describen a lo largo de la memoria descriptiva. Puede utilizarse cromatografía de intercambio catiónico para separar los conjugados y, a continuación, se identifica una fracción que contiene el conjugado que tiene, por ejemplo, el número deseado de PEG fijados, purificados exentos de secuencias de proteínas sin modificar y de conjugados que tienen otros números de PEG fijados.
La pegilación se produce con mayor frecuencia en el grupo alfa amino en el extremo N del polipéptido, en el grupo épsilon amino en la cadena lateral de los restos de lisina y en el grupo imidazol en la cadena lateral de los restos de histidina. Debido a que la mayoría de los polipéptidos recombinantes poseen un solo grupo alfa y varios grupos amino épsilon e imidazol, se pueden generar numerosos isómeros posicionales dependiendo de la química del enlazador. Las estrategias de pegilación generales conocidas en la materia se pueden aplicar en el presente documento. El PEG puede estar unido a un polipéptido de la presente divulgación a través de un grupo reactivo terminal (un "espaciador") que media un enlace entre los grupos amino o carboxilo libres de una o más de las secuencias polipeptídicas y el polietilenglicol. El PEG que tiene el espaciador que se puede unir al grupo amino libre incluye polietilenglicol de N-hidroxisuccinilimida que se puede preparar mediante la activación del éster de ácido succínico de polietilenglicol con N-hidroxisuccinilimida. Otro polietilenglicol activado que puede unirse a un grupo amino libre es el 2,4-bis(O-metoxipolietilenglicol)-6-cloro-s-triacina, que se puede preparar haciendo reaccionar polietilenglicol monometil éter con cloruro cianúrico. El polietilenglicol activado que se une al grupo carboxilo libre incluye polioxietilendiamina.
La conjugación de una o más de las secuencias polipeptídicas de la presente divulgación con PEG que tiene un espaciador puede realizarse mediante varios métodos convencionales. Por ejemplo, la reacción de conjugación se puede realizar en solución a un pH de 5 a 10, a una temperatura desde 4 °C a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 20 horas, utilizando una relación molar de reactivo a proteína de 4:1 a 30:1. Las condiciones de reacción se pueden seleccionar para dirigir la reacción hacia la producción predominante de un grado deseado de sustitución. En general, una temperatura baja, un pH bajo (por ejemplo, pH = 5) y un tiempo de reacción corto tienden a disminuir la cantidad de PEG fijados, mientras que la temperatura alta, un pH de neutro a alto (por ejemplo, pH>7) y un tiempo de reacción más largo tienden a aumentar el número de PEG fijados. Se pueden utilizar diversos medios conocidos en la materia para finalizar la reacción. En algunas realizaciones, la reacción se termina mediante la acidificación de la mezcla de reacción y la congelación a, por ejemplo, -20 °C. La pegilación de varias moléculas se analiza en, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5.252.714; 5.643.575; 5.919.455; 5.932.462; y 5.985.263. PEG-IL-10 se describe en, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.052.686. Las condiciones de reacción específicas contempladas para su uso en el presente documento se exponen en la sección experimental.
La presente divulgación también contempla el uso de miméticos de PEG. Se han creado miméticos del PEG recombinantes que conservan los atributos del PEG (por ejemplo, semivida en suero potenciada) al mismo tiempo que confieren varias propiedades ventajosas adicionales. Como ejemplo, se pueden producir de forma recombinante cadenas polipeptídicas simples (que comprenden, por ejemplo, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser y Thr) capaces de formar una conformación extendida similar al PEG ya fusionadas con el péptido o fármaco proteico de interés (por ejemplo, la tecnología XTEN de Amunix; Mountain View, CA). Esto evita la necesidad de una etapa de conjugación adicional durante el proceso de fabricación. Además, las técnicas establecidas de biología molecular permiten el control de la composición de la cadena lateral de las cadenas polipeptídicas, permitiendo la optimización de la inmunogenicidad y las propiedades de fabricación.
Glucosilación: Para los fines de la presente divulgación, "glucosNación" se refiere en términos generales al proceso enzimático que une polisacáridos a proteínas, lípidos u otras moléculas orgánicas. El uso del término "glucosilación" junto con la presente divulgación generalmente significa añadir o eliminar uno o más fracciones de hidratos de carbono (ya sea mediante la eliminación del sitio de glucosilación subyacente o mediante la eliminación de la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que pueden o no estar presentes en la secuencia natural. Además, la expresión incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas naturales que implican un cambio en la naturaleza y proporciones de las diversas fracciones de hidratos de carbono presentes.
La glucosilación puede afectar drásticamente a las propiedades físicas (por ejemplo, la solubilidad) de los polipéptidos tales como la IL-10 y también puede ser importante en la estabilidad, secreción y localización subcelular de las proteínas. Los polipéptidos glucosilados también pueden presentar una mayor estabilidad o pueden mejorar una o más propiedades farmacocinéticas, tal como la semivida. Además, las mejoras de solubilidad pueden, por ejemplo, permitir la generación de formulaciones más adecuadas para la administración farmacéutica que las formulaciones que comprenden el polipéptido no glucosilado.
La glucosilación adecuada puede ser esencial para la actividad biológica. De hecho, algunos genes de organismos eucariotas, cuando se expresan en bacterias (por ejemplo, E. coli) que carecen de procesos celulares para glucosilar proteínas, producen proteínas que se recuperan con poca o ninguna actividad en virtud de su falta de glucosilación.
La adición de sitios de glucosilación se puede lograr mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos. La alteración del polipéptido puede hacerse, por ejemplo, mediante adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina (para sitios de glucosilación ligados a O) o restos de asparagina (para sitios de glucosilación ligados a N). Las estructuras de los oligosacáridos ligados a N y ligados a O y los restos de azúcar que se encuentran en cada tipo pueden ser diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es el ácido N-acetilneuramínico (en lo sucesivo denominado en el presente documento, ácido siálico). El ácido siálico suele ser el resto terminal de los oligosacáridos ligados a N y ligados a O y, debido a su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas a la glucoproteína. Una realización particular de la presente divulgación comprende la generación y uso de variantes de N-glucosilación.
Las secuencias de polipéptidos de la presente divulgación pueden alterarse opcionalmente a través de cambios a nivel de ácido nucleico, particularmente mediante la mutación del ácido nucleico que codifica el polipéptido en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados. Otros medios para aumentar el número de fracciones de hidratos de carbono en el polipéptido son mediante el acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. La eliminación de hidratos de carbono puede realizarse química o enzimáticamente, o mediante la sustitución de codones que codifican restos de aminoácidos que están glucosilados. Se conocen técnicas de desglucosilación química, y se puede lograr la escisión enzimática de fracciones de hidratos de carbono en polipéptidos mediante el uso de una variedad de endo y exoglucosidasas.
Las células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) son una célula hospedadora comúnmente utilizada para la producción de glucoproteínas recombinantes. Estas células no expresan la enzima p-galactósido a-2,6-sialiltransferasa y, por tanto, no añaden ácido siálico en el enlace a-2,6 a los oligosacáridos unidos a N de las glucoproteínas producidas en estas células.
Polisialilación: La presente divulgación también contempla el uso de la polisialilación, la conjugación de polipéptidos con el ácido polisiálico ("PSA") a -(2^8) enlazado, biodegradable y de origen natural para mejorar la estabilidad de los polipéptidos y la farmacocinética in vivo. El PSA es un polímero natural, biodegradable y no tóxico que es altamente hidrófilo, lo que le confiere un elevado peso molecular aparente en la sangre que aumenta su semivida en suero. Además, la polisialilación de una gama de agentes terapéuticos peptídicos y proteínicos ha dado lugar a una proteólisis notablemente reducida, conservación de la actividad in vivo y reducción de la inmunogenicidad y antigenicidad (véase, por ejemplo, G. Gregoriadis et al., Int. J. Pharmaceutics 300(1-2): 125-30). Al igual que con las modificaciones con otros conjugados (por ejemplo, PEG), hay disponibles varias técnicas para la polisialilación específica de sitio (véase, por ejemplo, T. Lindhout et al., (2011) PNAS 108(18)7397-7402).
Fusión de albúmina: Los componentes y moléculas adecuados adicionales para la conjugación incluyen albúminas tales como seroalbúmina humana (HSA), seroalbúmina de macaco cangrejero o seroalbúmina bovina (BSA).
La HSA madura, un polipéptido de 585 aminoácidos (~67 kDa) que tiene una semivida en suero de ~20 días, es el principal responsable del mantenimiento de la presión arterial osmótica coloidal, el pH sanguíneo y el transporte y la distribución de numerosos ligandos endógenos y exógenos. La proteína tiene tres dominios estructuralmente homólogos (dominios I, II y III), está casi en su totalidad en la conformación alfa-helicoidal y está altamente estabilizada por 17 puentes disulfuro. Las tres regiones primarias de unión a fármacos de la albúmina están ubicadas en cada uno de los tres dominios dentro de los subdominios IB, IIA y IIIA.
La síntesis de albúmina tiene lugar en el hígado, que produce la preproalbúmina, producto primario de vida corta. Por tanto, la HSA de longitud completa tiene un péptido señal de 18 aminoácidos (MKWVTFISLLFLFSSAYS; SEQ ID NO: 11) seguido de un prodominio de 6 aminoácidos (RGVFRR; SEQ ID NO: 12); este péptido de 24 restos de aminoácidos puede denominarse dominio pre-pro. La HSA se puede expresar y secretar mediante su péptido señal endógeno como un preprodominio. De manera alternativa, la h Sa se puede expresar y secretar mediante un péptido señal de IgK fusionado con una construcción madura. La preproalbúmina se escinde rápidamente cotraduccionalmente en la luz del retículo endoplásmico en su extremo amino para producir el polipéptido precursor estable de 609 aminoácidos, la proalbúmina. A continuación, la proalbúmina pasa al aparato de Golgi, donde se convierte en albúmina madura de 585 aminoácidos mediante una escisión aminoterminal dependiente de furina.
Las secuencias de aminoácidos primarias, la estructura y la función de las albúminas están altamente conservadas en todas las especies, como lo son los procesos de síntesis y secreción de albúmina. Las proteínas de seroalbúmina comparables a la HSA se encuentran en, por ejemplo, macacos, vacas, perros, conejos y ratas. De las especies no humanas, la seroalbúmina bovina (BSA) es estructuralmente más similar a la HSA (véase, por ejemplo, Kosa et al., noviembre de 2007, J Pharm Sci. 96(11):3117-24). La presente divulgación contempla el uso de albúmina de especies no humanas, que incluyen, pero sin limitación, las expuestas anteriormente, en, por ejemplo, el proceso de desarrollo de fármacos.
De acuerdo con la presente divulgación, la albúmina se puede conjugar con una molécula de fármaco (por ejemplo, un polipéptido descrito en el presente documento) en el extremo carboxilo, el extremo amino, tanto el extremo carboxilo como amino, e internamente (véase, por ejemplo, los documentos USP 5.876.969 y USP 7.056.701).
En los conjugados de HSA y molécula de fármaco contemplados por la presente divulgación, se pueden utilizar varias formas de albúmina, tales como presecuencias de secreción de albúmina y variantes de las mismas, fragmentos y variantes de los mismos, y variantes de HSA. Dichas formas generalmente poseen una o más actividades de albúmina deseadas. En realizaciones adicionales, la presente divulgación comprende proteínas de fusión que comprenden una molécula de fármaco polipeptídica fusionada directa o indirectamente con la albúmina, un fragmento de albúmina y una variante de albúmina, etc., en donde la proteína de fusión tiene una mayor estabilidad en plasma que la molécula de fármaco sin fusionar y/o la proteína de fusión conserva la actividad terapéutica de la molécula de fármaco sin fusionar. En algunas realizaciones, la fusión indirecta se efectúa mediante un enlazador, tal como un enlazador peptídico o una versión modificada del mismo.
La escisión intracelular puede llevarse a cabo de manera enzimática mediante, por ejemplo, furina o caspasa. Las células expresan un bajo nivel de estas enzimas endógenas, que son capaces de escindir intracelularmente una parte de las moléculas de fusión; por lo tanto, algunos de los polipéptidos se secretan por la célula sin estar conjugados con la HSA, mientras que algunos de los polipéptidos se secretan en forma de moléculas de fusión que comprenden HSA. Las realizaciones de la presente divulgación contemplan el uso de diversas construcciones de fusión con furina. Por ejemplo, pueden diseñarse construcciones que comprendan la secuencia RGRR (SEQ ID NO: 13), RKRKKR (SEQ ID NO: 14), RKKR (SEQ ID NO: 15) o RRRKKR (SEQ ID NO: 16).
La presente divulgación también contempla la escisión extracelular (es decir, escisión ex vivo) mediante la cual las moléculas de fusión se secretan de la célula, se someten a purificación y, después, se escinden. Se entiende que la escisión puede disociar todo el complejo HSA-enlazador de la IL-10 madura, o menos que todo el complejo HSA-enlazador.
Como se ha hecho alusión anteriormente, la fusión de albúmina a uno o más polipéptidos de la presente divulgación puede, por ejemplo, lograrse mediante manipulación genética, tal que el ácido nucleico que codifica HSA, o un fragmento del mismo, se une al ácido nucleico que codifica una o más secuencias polipeptídicas. A partir de entonces, un hospedador adecuado puede transformarse o transfectarse con las secuencias de nucleótidos fusionadas en forma de, por ejemplo, un plásmido adecuado, para expresar un polipéptido de fusión. La expresión puede realizarse in vitro a partir de, por ejemplo, células procariotas o eucariotas, o in vivo a partir de, por ejemplo, un organismo transgénico. En algunas realizaciones de la presente divulgación, la expresión de la proteína de fusión se realiza en estirpes celulares de mamíferos, por ejemplo, estirpes celulares CHO. La transformación se utiliza ampliamente en el presente documento para referirse a la alteración genética de una célula resultante de la captación directa a través de la membrana celular, la incorporación y la expresión de material genético exógeno (ácido nucleico exógeno). La transformación ocurre de manera natural en algunas especies de bacterias, pero también puede realizarse por medios artificiales en otras células.
Además, la albúmina misma puede modificarse para extender su semivida circulante. La fusión de la albúmina modificada con IL-10 puede lograrse mediante las técnicas de manipulación genética descritas anteriormente o mediante conjugación química; la molécula de fusión resultante tiene una semivida que excede la de las fusiones con albúmina no modificada (véase el documento WO2011/051489).
Estrategias alternativas de unión a albúmina: Se han desarrollado varias estrategias de unión a albúmina como alternativas a la fusión directa, incluida la unión a albúmina a través de una cadena de ácidos grasos conjugados (acilación). Debido a que la seroalbúmina es una proteína de transporte de ácidos grasos, estos ligandos naturales con actividad de unión a albúmina se han utilizado para prolongar la semivida de productos terapéuticos de proteínas pequeñas. Por ejemplo, la insulina detemir (LEVEMIR), un producto aprobado para la diabetes, comprende una cadena de miristilo conjugada con una insulina modificada genéticamente, dando como resultado un análogo de insulina de acción prolongada.
La presente divulgación también contempla proteínas de fusión que comprenden una secuencia polipeptídica de dominio de unión a albúmina (ABD, del inglés albumin binding domain) y la secuencia de uno o más de los polipéptidos descritos en el presente documento. Cualquier secuencia polipeptídica de ABD descrita en la bibliografía puede ser un componente de las proteínas de fusión. Opcionalmente, los componentes de las proteínas de fusión se pueden unir covalentemente a través de un enlazador, tal como los enlazadores descritos en el presente documento. En algunas de las realizaciones de la presente divulgación, las proteínas de fusión comprenden la secuencia polipeptídica de ABD como una fracción aminoterminal y los polipéptidos descritos en el presente documento como una fracción carboxiterminal.
La presente divulgación también contempla proteínas de fusión que comprenden un fragmento de un polipéptido de unión a albúmina, cuyo fragmento conserva sustancialmente la unión a albúmina; o un multímero de polipéptidos de unión a albúmina o sus fragmentos que comprende al menos dos polipéptidos de unión a albúmina o sus fragmentos como unidades monoméricas. Para una discusión general del ABD y tecnologías relacionadas, véanse los documentos WO 2012/050923, WO 2012/050930, WO 2012/004384 y WO 2009/016043.
Conjugación con otras moléculas: Los componentes y moléculas adecuados adicionales para la conjugación incluyen, por ejemplo, tiroglobulina; toxoide tetánico; toxoide diftérico; poliaminoácidos tales como poli(D-lisina:ácido D-glutámico); polipéptidos VP6 de rotavirus; hemaglutinina del virus de la gripe, nucleoproteína del virus de la gripe; hemocianina de lapa californiana (KLH); y proteína central y antígeno de superficie del virus de la hepatitis B; o cualquier combinación de los anteriores.
Por tanto, la presente divulgación contempla la conjugación de uno o más componentes o moléculas adicionales en el extremo amino y/o carboxiterminal de una secuencia polipeptídica, tal como otro polipéptido (por ejemplo, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos heteróloga al polipéptido en cuestión) o una molécula transportadora. Por tanto, se puede proporcionar una secuencia polipeptídica ilustrativa como un conjugado con otro componente o molécula.
Una modificación del conjugado puede dar como resultado una secuencia polipeptídica que conserva la actividad con una función o actividad adicional o complementaria procedente de la segunda molécula. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica puede conjugarse con una molécula, por ejemplo, para facilitar la solubilidad, almacenamiento, in vivo o semivida o estabilidad, reducción de la inmunogenicidad, liberación retardada o controlada in vivo, etc. Otras funciones o actividades incluyen un conjugado que reduce la toxicidad en relación con una secuencia polipeptídica no conjugada, un conjugado que se dirige a un tipo de célula u órgano de manera más eficaz que una secuencia polipeptídica no conjugada, o un fármaco para contrarrestar aún más las causas o los efectos asociados con una enfermedad, trastorno o afección como se establece en el presente documento (por ejemplo, cáncer).
Un polipéptido IL-10 también se puede conjugar con macromoléculas grandes de metabolización lenta, tales como proteínas; polisacáridos, tales como sefarosa, agarosa, celulosa o perlas de celulosa; aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico o polilisina; copolímeros de aminoácidos; partículas de virus inactivadas; toxinas bacterianas inactivadas tal como el toxoide de la difteria, tétanos, cólera o moléculas de leucotoxina; bacterias inactivadas; y células dendríticas. Dichas formas conjugadas, si se desea, se pueden utilizar para producir anticuerpos contra un polipéptido de la presente divulgación.
Los componentes y moléculas candidatos adicionales para la conjugación incluyen aquellos adecuados para el aislamiento o la purificación. Los ejemplos particulares no limitantes incluyen moléculas de unión, tal como biotina (par de unión específica biotina-avidina), un anticuerpo, un receptor, un ligando, una lectina o moléculas que comprenden un soporte sólido, que incluyen, por ejemplo, perlas de plástico o poliestireno, placas o perlas, perlas magnéticas, tiras reactivas y membranas.
Pueden utilizarse métodos de purificación como la cromatografía de intercambio catiónico para separar los conjugados por diferencia de carga, que separa de manera eficaz los conjugados en sus diversos pesos moleculares. Por ejemplo, la columna de intercambio catiónico se puede cargar y después lavar con acetato de sodio ~20 mM, pH ~4 y, a continuación, se eluye con un gradiente de NaCl lineal (0 M a 0,5 M) tamponado a un pH de aproximadamente 3 a 5,5, por ejemplo, a pH ~4,5. El contenido de las fracciones obtenidas por cromatografía de intercambio catiónico puede identificarse por peso molecular mediante métodos convencionales, por ejemplo, espectroscopia de masas, SDS-PAGE u otros métodos conocidos para separar entidades moleculares por peso molecular.
Moléculas de fusión Fc: En determinadas realizaciones, el extremo amino o carboxilo de una secuencia polipeptídica de la presente divulgación se puede fusionar con una región Fc de inmunoglobulina (por ejemplo, Fc humana) para formar un conjugado de fusión (o molécula de fusión). Se ha demostrado que los conjugados de fusión con Fc aumentan la semivida sistémica de los productos biofarmacéuticos y, por lo tanto, el producto biofarmacéutico puede precisar una administración menos frecuente. Fc se une al receptor de Fc neonatal (FcRn) en las células endoteliales que recubren los vasos sanguíneos y, al unirse, la molécula de fusión con Fc se protege de la degradación y se vuelve a liberar a la circulación, manteniendo la molécula en circulación durante más tiempo. Se cree que esta unión a Fc es el mecanismo por el cual la IgG endógena conserva su larga semivida plasmática. La tecnología de fusión con Fc más reciente une una sola copia de un producto biofarmacéutico a la región Fc de un anticuerpo para optimizar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del producto biofarmacéutico en comparación con los conjugados de fusión con Fc tradicionales. En el documento WO 2013/113008 se describen ejemplos de otras tecnologías relacionadas con Fc adecuadas para su uso con los polipéptidos divulgados en el presente documento.
Otras modificaciones: La presente divulgación contempla el uso de otras modificaciones, conocidas actualmente o creadas en el futuro, de IL-10 para mejorar una o más propiedades. Uno de dichos métodos para prolongar la semivida en circulación, aumentar la estabilidad, reducir el aclaramiento o alterar la inmunogenicidad o alergenicidad de un polipéptido de la presente divulgación implica la modificación de las secuencias polipeptídicas mediante hesilación, que utiliza derivados de hidroxietilalmidón unidos a otras moléculas para modificar las características de las secuencias polipeptídicas. Se describen varios aspectos de la hesilación en, por ejemplo, las solicitudes de patente de EE. UU. n.° 2007/0134197 y 2006/0258607).
La presente divulgación también contempla moléculas de fusión que comprenden SUMO como marcador de fusión (LifeSensors, Inc.; Malvern, PA). La fusión de un polipéptido descrito en el presente documento con SUMO puede transmitir varios efectos beneficiosos, incluida la mejora de la expresión, mejora de la solubilidad y/o asistencia en el desarrollo de métodos de purificación. Las proteasas SUMO reconocen la estructura terciaria de SUMO y escinden la proteína de fusión en el extremo C de SUMO, liberando así un polipéptido descrito en el presente documento con el aminoácido aminoterminal deseado.
Enlazadores: Los enlazadores y su uso se han descrito anteriormente. Cualquiera de los componentes y moléculas anteriores utilizados para modificar las secuencias polipeptídicas de la presente divulgación pueden conjugarse opcionalmente a través de un enlazador. Los enlazadores adecuados incluyen "enlazadores flexibles" que generalmente tienen una longitud suficiente para permitir algún movimiento entre las secuencias polipeptídicas modificadas y los componentes y moléculas unidos. Las moléculas enlazadoras tienen generalmente aproximadamente de 6 a 50 átomos de longitud. Las moléculas enlazadoras también pueden ser, por ejemplo, aril acetileno, oligómeros de etilenglicol que contienen de 2 a 10 unidades monoméricas, diaminas, diácidos, aminoácidos o combinaciones de los mismos. Los enlazadores adecuados pueden seleccionarse fácilmente y pueden tener cualquier longitud adecuada, tal como 1 aminoácido (por ejemplo, Gly), 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50 o más de 50 aminoácidos.
Los enlazadores flexibles ilustrativos incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (por ejemplo, (GS)n, GSGGSn (SEQ ID NO: 17), GGGSn (SEQ ID NO: 18), (GmSo)n, (GmSoGm)n, (GmSoGmSoGm)n (SEQ ID NO: 19), (GSGGSm)n (SEQ ID NO: 20), (GSGSmG)n (SEQ ID NO: 21) y (GGGSm)n (SEQ ID NO: 22) y combinaciones de los mismos, donde m, n y o se seleccionan cada uno independientemente de un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles. Los polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como un anclaje neutro entre los componentes. Los enlazadores flexibles ilustrativos incluyen, pero sin limitación, GGSG (SEQ ID NO: 23), GGSGG (SEQ ID NO: 24), GSGSG (SEQ ID NO: 19), GSGGG (SEQ ID NO: 25), GGGSG (SEQ ID NO: 26) y GSSSG (SEQ ID NO: 27).
Usos terapéuticos y profilácticos
La presente divulgación contempla el uso de los polipéptidos IL-10 descritos en el presente documento (por ejemplo, PEG-IL-10) en el tratamiento o la prevención de una amplia gama de enfermedades, trastornos y/o afecciones, y/o de los síntomas de los mismos. De hecho, las enseñanzas de la presente divulgación están destinadas a aplicarse a cualquier enfermedad, trastorno o afección para los cuales puede ser beneficioso lograr o mantener los parámetros de concentración mínima media en suero de IL-10 descritos anteriormente. Además, aunque las categorías generales de enfermedades, trastornos y condiciones particulares se establecen a continuación, algunas de las enfermedades, trastornos y afecciones pueden ser miembros de más de una categoría (por ejemplo, trastornos relacionados con el cáncer y la fibrosis), y otros pueden no ser miembros de ninguna de las categorías divulgadas.
Trastornos fibróticos y cáncer. De acuerdo con la presente divulgación, se puede utilizar IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) para el tratamiento o la prevención de una afección o trastorno proliferativo, incluido un cáncer (por ejemplo, cáncer de útero, de cuello uterino, de mama, próstata, testículos, del tracto gastrointestinal (por ejemplo, esófago, orofaringe, estómago, intestino delgado o grueso, colon o recto), riñón, de célula renal, vejiga, óseo, médula ósea, piel, de cabeza o cuello, piel, hígado, vesícula biliar, corazón, pulmón, páncreas, glándula salival, glándula suprarrenal, tiroides, de cerebro (por ejemplo, gliomas), de ganglios, de sistema nervioso central (SNC) y de sistema nervioso periférico (SNP), y cánceres del sistema hematopoyético y del sistema inmunitario (por ejemplo, bazo o timo). La presente divulgación también proporciona métodos para tratar o prevenir otras enfermedades, trastornos o afecciones relacionadas con el cáncer, que incluyen, por ejemplo, tumores inmunógenos, tumores no inmunógenos, tumores inactivos, cánceres inducidos por virus (por ejemplo, cánceres de células epiteliales, cánceres de células endoteliales, carcinomas de células escamosas y virus del papiloma), adenocarcinomas, linfomas, carcinomas, melanomas, leucemias, mielomas, sarcomas, teratocarcinomas, cánceres inducidos químicamente, metástasis y angiogénesis. La divulgación contempla la reducción de la tolerancia a una célula tumoral o antígeno de célula cancerosa, por ejemplo, mediante la modulación de la actividad de un linfocito T regulador y/o un linfocito T CD8+ (véase, por ejemplo, Ramirez-Montagut, et al. (2003) Oncogene 22:3180-3187; y Sawaya, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:1501-1509). En realizaciones particulares, el tumor o cáncer es cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de mama, melanoma, cáncer de pulmón, glioblastoma o leucemia. El uso de las expresiones enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con el cáncer se refieren en términos generales a las afecciones que están asociadas, directa o indirectamente, con el cáncer, e incluyen, por ejemplo, angiogénesis y afecciones precancerosas tales como displasia.
En el presente documento se divulgan métodos para tratar una afección proliferativa, cáncer, tumor o afección precancerosa con un polipéptido IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) y al menos un agente terapéutico o de diagnóstico adicional, ejemplos de los cuales se exponen en otra parte en el presente documento.
En el presente documento se divulgan métodos para tratar o prevenir enfermedades, trastornos y afecciones fibróticas. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "enfermedades, trastornos y afecciones fibróticas", y términos y expresiones similares (por ejemplo, "trastornos fibróticos"), deben interpretarse en sentido amplio de modo que incluya cualquier afección que pueda dar lugar a la formación de tejido fibrótico o tejido cicatricial (por ejemplo, fibrosis en uno o más tejidos). Como ejemplo, las lesiones (por ejemplo, heridas) que pueden dar lugar a tejido cicatricial incluyen heridas en la piel, ojo, pulmón, riñón, hígado, sistema nervioso central y sistema cardiovascular. La expresión también abarca la formación de tejido cicatricial como resultado de un ictus y la adhesión del tejido, por ejemplo, como resultado de una lesión o cirugía.
Como se utiliza en el presente documento, el término "fibrosis" se refiere a la formación de tejido fibroso como un proceso reparador o reactivo, y no como un constituyente normal de un órgano o tejido. La fibrosis se caracteriza por la acumulación de fibroblastos y el depósito de colágeno por encima de la deposición normal en cualquier tejido concreto.
Los trastornos fibróticos incluyen, pero sin limitación, fibrosis derivada de la cicatrización de heridas, esclerodermia sistémica y local, ateroesclerosis, reestenosis, inflamación y fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedad pulmonar intersticial, cirrosis hepática, fibrosis como resultado de una infección crónica por hepatitis B o C, enfermedad renal (por ejemplo, glomerulonefritis), enfermedad cardíaca resultante de tejido cicatricial, queloides y cicatrices hipertróficas, y enfermedades oculares como la degeneración macular y la retinopatía retiniana y vítrea. Otras enfermedades fibróticas incluyen fibrosis inducida por fármacos quimioterapéuticos, fibrosis inducida por radiación, y lesiones y quemaduras.
Los trastornos fibróticos a menudo están relacionados con el hígado y con frecuencia existe un nexo entre dichos trastornos y la acumulación inadecuada de colesterol y triglicéridos hepáticos dentro de los hepatocitos. Esta acumulación parece dar como resultado una respuesta proinflamatoria que conduce a fibrosis hepática y cirrosis. Los trastornos hepáticos que tienen un componente fibrótico incluyen la esteatosis hepática no alcohólica (NAFLD) y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH).
Enfermedades cardiovasculares. En el presente documento se divulga el uso de los polipéptidos IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) descritos en el presente documento para tratar y/o prevenir determinadas enfermedades, trastornos y afecciones cardiovasculares y/o relacionadas con el metabolismo, así como los trastornos asociados a los mismos.
Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "enfermedad cardiovascular", "enfermedad del corazón" y similares se refieren a cualquier enfermedad que afecta el sistema cardiovascular, principalmente una enfermedad cardíaca, una enfermedad vascular del cerebro y riñón, y una enfermedad arterial periférica. La enfermedad cardiovascular es una constelación de enfermedades que incluye la enfermedad cardíaca coronaria (es decir, enfermedad cardíaca isquémica o enfermedad de la arteria coronaria), ateroesclerosis, miocardiopatía, hipertensión, una cardiopatía hipertensiva, cardiopatía pulmonar, disritmias cardíacas, endocarditis, enfermedad cerebrovascular y enfermedad arterial periférica. La enfermedad cardiovascular es la principal causa de muerte en todo el mundo y, aunque generalmente afecta a los adultos mayores, los antecedentes de enfermedad cardiovascular, especialmente la ateroesclerosis, comienzan en los rimeros años de vida.
Las realizaciones particulares divulgadas en el presente documento están dirigidas al uso de polipéptidos IL-10 para tratar y/o prevenir la ateroesclerosis, una condición crónica en la que la pared de una arteria se engrosa hasta formar placas como resultado de la acumulación de materiales grasos como el colesterol y los triglicéridos. La ateroesclerosis implica con frecuencia una respuesta inflamatoria crónica en las paredes de las arterias, provocada en gran parte por la acumulación de macrófagos y promovida por lipoproteínas de baja densidad (LDL, del inglés low-density lipoproteins) sin la eliminación adecuada de grasas y colesterol de los macrófagos mediante lipoproteínas de alta densidad funcionales. Las lesiones ateroscleróticas que se expanden de manera crónica pueden provocar el cierre completo de la luz, que solo puede manifestarse cuando la estenosis de la luz es tan intenso que el suministro de sangre a los tejidos corriente abajo es insuficiente, lo que acaba en isquemia.
Los polipéptidos IL-10 pueden ser particularmente ventajosos en el tratamiento y/o prevención de trastornos relacionados con el colesterol, que pueden estar asociados con, por ejemplo, la enfermedad cardiovascular (por ejemplo, ateroesclerosis), la enfermedad cerebrovascular (por ejemplo, ictus) y la enfermedad vascular periférica. Como ejemplo, pero sin limitación, los polipéptidos IL-10 pueden utilizarse para reducir el nivel de colesterol en sangre de un sujeto. Para determinar si un sujeto tiene hipercolesterolemia, no existe una demarcación firme entre los niveles de colesterol normales y anormales, y la interpretación de los valores debe hacerse en relación con otras afecciones de salud y factores de riesgo. No obstante, las siguientes pautas se utilizan generalmente en los Estados Unidos: colesterol total <200 mg/dl es deseable, de 200 a 239 mg/dl está en el límite alto y >240 mg/dl es alto. Los niveles más altos de colesterol total aumentan el riesgo de enfermedad cardiovascular, y los niveles de colesterol de las LDL o no de las HDL son predictivos de futuras enfermedades coronarias. Cuando se evalúa la hipercolesterolemia, suele ser útil medir todas las subfracciones de lipoproteínas (VLDL, IDL, LDL y HDL). Un objetivo terapéutico particular es disminuir las LDL mientras se mantienen o aumentan las HDL.
T rombosis y condiciones trombóticas.
La trombosis, la formación de un trombo (coágulo de sangre) dentro de un vaso sanguíneo que provoca la obstrucción del flujo de sangre a través del sistema circulatorio, puede provocarse por anomalías en uno o más de los siguientes (tríada de Virchow): hipercoagulabilidad o aumento de la coagulación de la sangre, lesión de las células endoteliales o alteración del flujo sanguíneo (estasis, turbulencia).
En general, la trombosis se clasifica como venosa o arterial, cada una de las cuales puede presentarse por varios subtipos. La trombosis venosa incluye la trombosis venosa profunda (TVP), trombosis de la vena porta, trombosis de la vena renal, trombosis de la vena yugular, síndrome de Budd-Chiari, enfermedad de Paget-Schroetter y trombosis del seno venoso cerebral. La trombosis arterial incluye el ictus e infarto de miocardio.
Otras enfermedades, trastornos y afecciones se contemplan por la presente divulgación, incluida la trombosis auricular y la policitemia vera (también conocida como eritema, policitemia primaria y policitemia rubra vera), un trastorno sanguíneo mieloproliferativo en el que la médula ósea produce demasiados glóbulos rojos, glóbulos blancos y/o plaquetas.
Afecciones inmunitarias e inflamatorias. Como se utiliza en el presente documento, las expresiones tales como "enfermedad inmunitaria", "afección inmunitaria", "trastorno inmunitario", "enfermedad inflamatoria", "afección inflamatoria", "trastorno inflamatorio" y similares, pretenden abarcar ampliamente cualquier afección inmunitaria o inflamatoria (por ejemplo, inflamación patológica y enfermedades autoinmunitarias). Dichas afecciones con frecuencia están estrechamente relacionadas con otras enfermedades, trastornos y afecciones. Como ejemplo, una "afección inmunitaria" puede referirse a afecciones proliferativas, tales como cáncer, tumores y angiogénesis, incluyendo infecciones (agudas y crónicas), tumores y cánceres que resisten la erradicación por el sistema inmunitario.
Una lista no limitante de enfermedades, trastornos y afecciones inmunitarias e inflamatorias que pueden, por ejemplo, provocarse por citocinas inflamatorias, incluyen, artritis, insuficiencia renal, lupus, asma, psoriasis, colitis, pancreatitis, alergias, fibrosis, complicaciones quirúrgicas (por ejemplo, cuando las citocinas inflamatorias impiden la cicatrización), anemia y fibromialgia. Otras enfermedades y trastornos que pueden estar asociados con la inflamación crónica incluyen la enfermedad de Alzheimer, insuficiencia cardíaca congestiva, ictus, estenosis de la válvula aórtica, arteriesclerosis, osteoporosis, enfermedad de Parkinson, infecciones, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), dermatitis alérgica de contacto y otros eccemas, esclerosis sistémica, trasplante y esclerosis múltiple.
Algunas de las enfermedades, trastornos y condiciones anteriormente mencionadas para las cuales la IL-10 (por ejemplo, la PEG-IL-10) puede ser particularmente eficaz (debido a, por ejemplo, limitaciones de las terapias actuales) se describen con más detalle a continuación.
Los polipéptidos IL-10 divulgados en el presente documento pueden ser particularmente eficaces en el tratamiento y la prevención de enfermedades inflamatorias del intestino (EII). Las EII comprenden la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), ambas son enfermedades crónicas idiopáticas que pueden afectar cualquier parte del tracto gastrointestinal y están asociadas con muchos efectos adversos, y los pacientes con CU prolongada tienen un mayor riesgo de desarrollar cáncer de colon. Los tratamientos actuales de las EII están destinados a controlar los síntomas inflamatorios y, aunque determinados agentes (por ejemplo, corticoesteroides, aminosalicilatos y agentes inmunodepresores convencionales (por ejemplo, ciclosporina, azatioprina y metotrexato)) han tenido un éxito limitado, la terapia a largo plazo puede provocar daño hepático (por ejemplo, fibrosis o cirrosis) y supresión de la médula ósea, y los pacientes a menudo se vuelven resistentes a dichos tratamientos.
La psoriasis, una constelación de enfermedades cutáneas crónicas comunes inmunomediadas, afecta a más de 4,5 millones de personas en EE. UU., de las cuales se considera que 1,5 millones tienen una forma de la enfermedad de moderada a intensa. Además, más del 10 % de los pacientes con psoriasis desarrollan artritis psoriásica, que daña el hueso y el tejido conjuntivo alrededor de las articulaciones. Una mejor comprensión de la fisiología subyacente de la psoriasis ha dado como resultado la introducción de agentes que, por ejemplo, se dirigen a la actividad de los linfocitos T y las citocinas responsables de la naturaleza inflamatoria de la enfermedad. Dichos agentes incluyen los inhibidores de TNF-a (también utilizados en el tratamiento de la artritis reumatoide (AR)), incluyendo ENBREL (etanercept), REMICADE (infliximab) y HUMIRA (adalimumab)), e inhibidores de linfocitos T, tales como AMEVIVE (alefacept) y RAPTIVA (efalizumab). Aunque varios de estos agentes son eficaces hasta cierto punto en determinadas poblaciones de pacientes, ninguno ha demostrado poder tratar de forma eficaz a todos los pacientes.
La artritis reumatoide (AR), que generalmente se caracteriza por una inflamación crónica en el revestimiento membranoso (la membrana sinovial) de las articulaciones, afecta aproximadamente al 1 % de la población de EE. UU., o a 2,1 millones de personas en EE. UU. Una mayor comprensión del papel de las citocinas, incluidas la TNF-a e IL-1, en el proceso inflamatorio ha permitido el desarrollo y la introducción de una nueva clase de fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARD, del inglés disease-modifying antirheumatic drugs). Los agentes (algunos de los cuales se superponen con las modalidades de tratamiento para la AR) incluyen ENBREL (etanercept), REMICADE (infliximab), h Um IRA (adalimumab) y KINERET (anakinra). Aunque algunos de estos agentes alivian los síntomas, inhiben la progresión del daño estructural y mejoran la función física en poblaciones particulares de pacientes, todavía existe la necesidad de agentes alternativos con una eficacia mejorada, mecanismos de acción complementarios y menos efectos indeseables o menos intensos.
Sujetos que padecen esclerosis múltiple (EM), una enfermedad autoinmunitaria gravemente debilitante que comprende múltiples áreas de inflamación y cicatrización de la mielina en el cerebro y la médula espinal, pueden ser particularmente ayudados por los polipéptidos IL-10 descritos en el presente documento, ya que los tratamientos actuales solo alivian los síntomas o retrasan la progresión de la discapacidad.
De manera similar, los polipéptidos IL-10 pueden ser particularmente ventajosos para sujetos aquejados por trastornos neurodegenerativos, tales como la enfermedad de Alzheimer (EA), un trastorno cerebral que afecta gravemente los procesos de pensamiento, de memoria y del lenguaje de los pacientes, y la enfermedad de Parkinson (EP), un trastorno progresivo del SNC caracterizado por, por ejemplo, un movimiento anómalo, rigidez y temblor. Estos trastornos son progresivos y debilitantes, y no se dispone de agentes curativos.
Enfermedades víricas. Ha habido un mayor interés en el papel de la IL-10 en las enfermedades víricas. Se ha postulado que la IL-10 produce efectos estimulantes e inhibidores dependiendo de su actividad de unión al receptor.
Por ejemplo, se ha considerado el efecto de inhibir la función de IL-10 para aumentar la inmunidad antivírica y la eficacia de la vacuna (véase Wilson, E., (2011) Curr Top Microbiol Immunol. 350: 39-65). Además, se ha estudiado el papel de la IL-10 en la función del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Además de la inhibición de la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1), la IL-10 también puede promover la persistencia vírica mediante la inactivación de los mecanismos inmunitarios efectores (Naicker, D., etal., (2009) J Infect Dis. 200 (3):448-452). Otro estudio ha identificado un subconjunto de linfocitos B productores de IL-10 capaz de regular la inmunidad de los linfocitos T en la infección crónica por el virus de la hepatitis B (VHB).
Aunque los estudios antes mencionados indican que la inhibición de la IL-10 puede ser beneficiosa, infecciones víricas particulares que comprenden un componente de linfocitos T CD8+ pueden ser candidatas para tratamiento y/o prevención a través de la administración de IL-10. Esto está respaldado por el papel positivo que desempeña la IL-10 en determinados tipos de cáncer mediante la modulación de los linfocitos T reguladores y/o de los linfocitos T CD8+.
La presente divulgación contempla el uso de los polipéptidos IL-10 en el tratamiento y/o prevención de cualquier enfermedad, trastorno o afección vírica para el cual el tratamiento con IL-10 puede ser beneficioso. Ejemplos de enfermedades, trastornos y afecciones víricas que se contemplan incluyen hepatitis B, hepatitis C, VIH, virus del herpes y citomegalovirus (CMV).
Composiciones farmacéuticas
Los polipéptidos IL-10 divulgados en el presente documento pueden estar en forma de composiciones adecuadas para la administración a un sujeto. En general, dichas composiciones son "composiciones farmacéuticas" que comprenden IL-10 y uno o más diluyentes, transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables. En determinadas realizaciones, los polipéptidos IL-10 están presentes en una cantidad terapéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden usarse en los métodos de la presente divulgación; por lo tanto, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse ex vivo o in vivo a un sujeto para poner en práctica los métodos y usos terapéuticos y profilácticos descritos en el presente documento.
Las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento se pueden formular para que sean compatibles con el método o la vía de administración previstos; en el presente documento se exponen vías de administración de ejemplo. Además, las composiciones farmacéuticas pueden utilizarse en combinación con otros agentes o compuestos terapéuticamente activos como se describe en el presente documento para tratar o prevenir las enfermedades, trastornos y afecciones contempladas por la presente divulgación.
Las composiciones farmacéuticas normalmente comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido IL-10 contemplado por la presente divulgación y uno o más agentes de formulación farmacéutica y fisiológicamente aceptables. Los diluyentes, transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables adecuados incluyen, pero sin limitación, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico y bisulfato de sodio), conservantes (por ejemplo, alcohol bencílico, metil parabenos, etilo o n-propilo, p-hidroxibenzoato), agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes dispersantes, disolventes, relllenos, agentes de volumen, detergentes, tampones, vehículos, diluyentes y/o adyuvantes. Por ejemplo, un vehículo adecuado puede ser solución salina fisiológica o solución salina tamponada con citrato, posiblemente complementada con otros materiales comunes en composiciones farmacéuticas para la administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con seroalbúmina son vehículos ilustrativos adicionales. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una diversidad de tampones que pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas y las formas farmacéuticas contempladas en el presente documento. Los tampones típicos incluyen, pero sin limitación, ácidos débiles farmacéuticamente aceptables, bases débiles o mezclas de los mismos. Como ejemplo, los componentes tamponantes pueden ser materiales hidrosolubles tales como ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido acético, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido glutámico y sales de los mismos. Los agentes tamponantes aceptables incluyen, por ejemplo, un tampón Tris, ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), sal de sodio de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) y ácido N-tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS).
Una vez que se ha formulado una composición farmacéutica, puede almacenarse en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para su uso, una forma liofilizada que precisa reconstitución antes del uso, una forma líquida que precisa dilución antes del uso u otra forma aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se proporciona en un recipiente de un solo uso (por ejemplo, un vial de un solo uso, ampolla, jeringuilla o autoinyector (similar a, por ejemplo, un EpiPen®)), mientras que en otras realizaciones se proporciona un recipiente de múltiples usos (por ejemplo, un vial de múltiples usos). Puede utilizarse cualquier aparato de administración de fármacos para administrar iL-10, incluyendo sistemas de implantes (por ejemplo, bombas implantables) y catéteres, bombas y dispositivos de inyección lenta, siendo todos ellos bien conocidos por los expertos en la materia. También pueden utilizarse inyecciones de absorción lenta, que generalmente se administran por vía subcutánea o por vía intramuscular, para liberar los polipéptidos divulgados en el presente documento durante un período de tiempo definido. Las inyecciones de absorción lenta son habitualmente a base de aceite o sólido y generalmente comprenden al menos uno de los componentes de formulación expuestos en el presente documento. Un experto en la materia está familiarizado con las posibles formulaciones y usos de las inyecciones de absorción lenta.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión oleosa o acuosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con la materia conocida utilizando los agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión mencionados en el presente documento. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, en forma de una solución en 1,3-butanodiol. Los diluyentes, disolventes y medios de dispersión aceptables que pueden emplearse incluyen agua, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS), etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. Además, normalmente se emplean aceites no volátiles estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin puede emplearse cualquier suave no volátil, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos, tales como el ácido oleico, encuentran uso en la preparación de inyectables. Se puede conseguir la absorción prolongada de formulaciones inyectables particulares incluyendo un agente que retrase la absorción (por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina).
Las composiciones farmacéuticas que contienen el principio activo pueden estar en forma adecuada para su uso oral, por ejemplo, como comprimidos, cápsulas, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes, soluciones, microperlas o elixires. Las composiciones farmacéuticas destinadas al uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la materia para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes tales como, por ejemplo, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes, para proporcionar preparaciones sabrosas y farmacéuticamente elegantes. Los comprimidos, cápsulas y similares contienen el principio activo mezclado con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes, tales como carbonato cálcico, carbonato de sodio, lactosa, fosfato cálcico o fosfato sódico; agentes de granulación y disgregantes, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o goma arábiga; y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
Los comprimidos, cápsulas y similares adecuados para la administración oral pueden estar sin recubrir o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas para retrasar la disgregación y absorción en el tracto gastrointestinal y, de ese modo, proporcionar una acción prolongada. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Además, pueden recubrirse mediante técnicas conocidas en la materia para formar comprimidos terapéuticos osmóticos para la liberación controlada. Los agentes adicionales incluyen partículas biodegradables o biocompatibles o una sustancia polimérica tal como poliésteres, ácidos de poliamina, hidrogel, polivinilpirrolidona, polianhídridos, ácido poliglicólico, etilen-vinilacetato, metilcelulosa, carmelosa, sulfato de protamina o copolímeros de lactida/glicolida, copolímeros de polilactida/glicolida o copolímeros de etilenvinilacetato, para controlar el suministro de una composición administrada. Por ejemplo, el agente oral puede quedar atrapado en microcápsulas preparadas mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, mediante el uso de hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina o microcápsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, o en un sistema coloidal de administración de fármacos. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, microperlas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Los métodos para la preparación de las formulaciones mencionadas anteriormente serán evidentes para los expertos en la materia.
Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar en forma de cápsulas de gelatina dura en donde el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio, caolín o celulosa microcristalina, o como cápsulas de gelatina blanda en donde el principio activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo, aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.
Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de las mismas. Dichos excipientes pueden ser agentes de suspensión, por ejemplo, carmelosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes, por ejemplo, un fosfátido natural (por ejemplo, lecitina) o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos (por ejemplo, estearato de polioxietileno), o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga (por ejemplo, para heptadecaetilenoxicetanol), o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales procedentes de ácidos grasos y un hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietilen sorbitol), o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales procedentes de ácidos grasos y anhídridos de hexitol (por ejemplo, monooleato de sorbitán polietilenado). Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes.
Pueden formularse suspensiones oleosas suspendiendo el principio activo en un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden añadir agentes edulcorantes tales como los indicados anteriormente y agentes saborizantes para proporcionar una preparación de sabor agradable.
Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el principio activo mezclado con un agente de dispersión o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes. En el presente documento se ejemplifican agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo, parafina líquida o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo, goma arábiga o goma de tragacanto; fosfátidos de origen natural, por ejemplo, soja, lecitina, y ésteres o ésteres parciales procedentes de ácidos grasos; anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán; y productos de condensación de ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de sorbitán polietilenado.
Las formulaciones también pueden incluir transportadores para proteger la composición frente a la degradación o eliminación rápida del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, liposomas, hidrogeles, profármacos y sistemas de administración microencapsulados. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerilo o estearato de glicerilo, solo o en combinación con una cera.
La presente divulgación contempla la administración de los polipéptidos IL-10 en forma de supositorios para administración rectal. Los supositorios pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a temperaturas normales pero líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se funda en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen, pero sin limitación, manteca de cacao y polietilenglicoles.
Los polipéptidos IL-10 contemplados por la presente divulgación pueden estar en forma de cualquier otra composición farmacéutica adecuada (por ejemplo, nebulizadores para su uso nasal o por inhalación) conocida actualmente o desarrollada en el futuro.
La concentración de un polipéptido o fragmento del mismo en una formulación puede variar ampliamente (por ejemplo, de menos de aproximadamente un 0,1 %, a o a al menos aproximadamente un 2 % hasta tanto como del 20 % al 50 % o más en peso) y normalmente se selecciona principalmente basándose en los volúmenes de líquido, viscosidades y en factores basados en el sujeto en conformidad con, por ejemplo, el modo particular de administración seleccionado.
Vías de administración
La presente divulgación contempla la administración de IL-10 y sus composiciones de la misma, de cualquier manera adecuada. Las vías de administración adecuadas incluyen parenteral (por ejemplo, intramuscular, intravenosa, subcutánea (por ejemplo, inyección o implante), intraperitoneal, intracisternal, intraarticular, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimatosa) e intracerebroventricular), oral, nasal, vaginal, sublingual, intraocular, rectal, tópica (por ejemplo, transdérmica), sublingual e inhalación. También pueden utilizarse inyecciones de absorción lenta, que generalmente se administran por vía subcutánea o por vía intramuscular, para liberar los polipéptidos IL-10 divulgados en el presente documento durante un período de tiempo definido.
Realizaciones particulares de la presente divulgación contemplan la administración parenteral, y en realizaciones particulares adicionales, la administración parenteral es subcutánea.
Terapia combinada
La presente divulgación contempla el uso de IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) en combinación con uno o más agentes terapéuticos activos (por ejemplo, citocinas) u otras modalidades profilácticas o terapéuticas (por ejemplo, radiación). En tal terapia combinada, los diversos agentes activos tienen con frecuencia distintos mecanismos de acción. Dicha terapia combinada puede ser especialmente ventajosa ya que permite una reducción de la dosis de uno o más de los agentes, reduciendo o eliminando de este modo los efectos indeseables asociados con uno o más de los agentes; asimismo, dicha terapia combinada puede tener un efecto terapéutico o profiláctico sinérgico sobre la enfermedad, trastorno o afección subyacente.
Como se utiliza en el presente documento, "combinación" pretende incluir terapias que se pueden administrar por separado, por ejemplo, formuladas por separado para administración separada (por ejemplo, como se puede proporcionar en un kit), y terapias que se pueden administrar juntas en una única formulación (es decir, una "coformulación").
En determinadas realizaciones, los polipéptidos IL-10 se administran o aplican de manera secuencial, por ejemplo, cuando un agente se administra antes que uno o más de otros agentes. En otras realizaciones, los polipéptidos IL-10 se administran de manera simultánea, por ejemplo, cuando se administran dos o más agentes al mismo tiempo o aproximadamente; los dos o más agentes pueden estar presentes en dos o más formulaciones separadas o combinados en una sola formulación (es decir, una coformulación). Independientemente de si los dos o más agentes se administran de forma secuencial o simultánea, para los fines de la presente divulgación se considera que se administran en combinación.
Los polipéptidos IL-10 de la presente divulgación pueden utilizarse en combinación con uno o más agentes (activos) de cualquier manera adecuada según las circunstancias. En una realización, el tratamiento con al menos un agente activo y al menos un polipéptido IL-10 de la presente divulgación se mantiene durante un período de tiempo. En otra realización, el tratamiento con al menos un agente activo se reduce o se interrumpe (por ejemplo, cuando el sujeto está estable), mientras que el tratamiento con el polipéptido IL-10 de la presente divulgación se mantiene en un régimen de dosificación constante. En una realización adicional, el tratamiento con al menos un agente activo se reduce o se interrumpe (por ejemplo, cuando el sujeto está estable), mientras que el tratamiento con el polipéptido IL-10 de la presente divulgación se reduce (por ejemplo, una dosis más baja, una dosificación menos frecuente o un régimen de tratamiento más corto). En otra realización más, el tratamiento con el al menos un agente activo se reduce o se interrumpe (por ejemplo, cuando el sujeto está estable) y el tratamiento con el polipéptido IL-10 de la presente divulgación se aumenta (por ejemplo, una dosis más alta, una dosificación más frecuente o un régimen de tratamiento más largo). En otra realización más, el tratamiento con el al menos un agente activo se mantiene y el tratamiento con el polipéptido IL-10 de la presente divulgación se reduce o interrumpe (por ejemplo, una dosis más baja, una dosificación menos frecuente o un régimen de tratamiento más corto). En otra realización más, el tratamiento con el al menos un agente activo y el tratamiento con el polipéptido IL-10 de la presente divulgación se reducen o interrumpen (por ejemplo, una dosis más baja, una dosificación menos frecuente o un régimen de tratamiento más corto).
Trastornos fibróticos y cáncer. La presente divulgación proporciona métodos para el tratamiento y/o la prevención de una afección proliferativa, cáncer, tumor o enfermedad, trastorno o afección precancerosa con un polipéptido IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) y al menos un agente terapéutico o de diagnóstico adicional.
Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen, pero sin limitación, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; alquilsulfonatos, tales como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas, incluida altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamima; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carcinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, cinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antisuprarrenales, tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diacicuona; elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbacina; razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triacicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbacina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (Ara-C); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel y doxetaxel; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; platino y complejos de coordinación de platino, tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbine; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT11; inhibidores de la topoisomerasa; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Los agentes quimioterapéuticos también incluyen agentes antihormonales que actúan regulando o inhibiendo la acción hormonal sobre tumores tales como los antiestrógenos, incluyendo, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, onapristona y toremifeno; y antiandrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. En determinadas realizaciones, la terapia combinada comprende la administración de una hormona o agente hormonal relacionado.
Las modalidades de tratamiento adicionales que se pueden utilizar en combinación con los polipéptidos IL-10 incluyen una citocina o un antagonista de citocina, tales como IL-12, INFa o antirreceptor de factor de crecimiento epidérmico, radioterapia, un anticuerpo monoclonal contra otro antígeno tumoral, un complejo de un anticuerpo monoclonal y una toxina, un adyuvante de linfocitos T, trasplante de médula ósea o células presentadoras de antígenos (por ejemplo, terapia con células dendríticas). Además, en el presente documento se proporcionan vacunas (por ejemplo, como una proteína soluble o como un ácido nucleico que codifica la proteína).
Enfermedades cardiovasculares. En el presente documento se divulgan métodos para tratar y/o prevenir determinadas enfermedades, trastornos y afecciones cardiovasculares y/o relacionadas con el metabolismo, así como los trastornos asociados a los mismos, con un polipéptido IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) y al menos un agente terapéutico o de diagnóstico adicional.
Los ejemplos de agentes terapéuticos útiles en la terapia combinada para el tratamiento de la hipercolesterolemia (y, por lo tanto, de la ateroesclerosis) incluyen estatinas (por ejemplo, CRESTOR, LESCOL, LIPITOR, MEVACo R, PRAVACOL y ZOCOR), que inhiben la síntesis enzimática del colesterol; resinas para ácidos biliares (por ejemplo, COLESTID, LO-CHOLEST, PREVALITE, QUESTRAN y WELCHOL), que secuestran el colesterol e impiden su absorción; ezetimiba (ZETIA), que bloquea la absorción del colesterol; ácido fíbrico (por ejemplo, TRICOR), que reduce los triglicéridos y puede aumentar moderadamente las HDL; niacina (por ejemplo, NIACOR), que reduce moderadamente el colesterol de las LDL y los triglicéridos; y/o una combinación de los mencionados anteriormente (por ejemplo, VYTORIN (ecetimiba con simvastatina). Los tratamientos alternativos para el colesterol que pueden ser candidatos para su uso en combinación con los polipéptidos IL-10 descritos en el presente documento incluyen diversos complementos y plantas medicinales (por ejemplo, ajo, policosanol y guggul). La presente divulgación abarca sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Afecciones inmunitarias e inflamatorias. En el presente documento se divulgan métodos para tratar y/o prevenir enfermedades, trastornos y afecciones inmunitarias y/o relacionadas con la inflamación, así como los trastornos asociados a los mismos, con un polipéptido IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) y al menos un agente terapéutico o de diagnóstico adicional.
Los ejemplos de agentes terapéuticos útiles en la terapia combinada incluyen, pero sin limitación, los siguientes: fármacos antinflamatorios no esteroideos (AINE) tales como la aspirina, el ibuprofeno y otros derivados del ácido propiónico (alminoprofeno, benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, indoprofeno, cetoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprocina, pirprofeno, pranoprofeno, suprofeno, ácido tiaprofénico y tioxaprofeno), derivados del ácido acético (indometacina, acemetacina, alclofenaco, clidanaco, diclofenaco, fenclofenaco, ácido fenclócico, fentiazaco, fuirofenaco, ibufenaco, isoxepac, oxpinaco, sulindaco, tiopinaco, tolmetina, cidometacina y zomepiraco), derivados del ácido fenámico (ácido flufenámico, ácido meclofenámico, ácido mefenámico, ácido niflúmico y ácido tolfenámico), derivados del ácido bifenilcarboxílico (diflunisal y flufenisal), oxicámicos (isoxicam, piroxicam, sudoxicam y tenoxican), salicilatos (ácido acetilsalicílico, sulfasalacina) y pirazolonas (apazona, benzpiperilona, feprazona, mofebutazona, oxifenbutazona, fenilbutazona). Otras combinaciones incluyen inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (COX-2).
Otros agentes activos para la combinación incluyen esteroides tales como prednisolona, prednisona, metilprednisolona, betametasona, dexametasona o hidrocortisona. Dicha combinación puede ser especialmente ventajosa, ya que uno o más efectos secundarios del esteroide se pueden reducir o incluso eliminar mediante la disminución progresiva de la dosis de esteroide necesaria cuando se tratan pacientes en combinación con los presentes polipéptidos IL-10.
Ejemplos adicionales de agentes activos para combinaciones para el tratamiento, por ejemplo, de la artritis reumatoide incluyen fármacos antinflamatorios supresores de citocinas (CSAID, del inglés cytokine suppressive anti-inflammatory drugs); anticuerpos para, o antagonistas de, otras citocinas o factores de crecimiento humanos, por ejemplo, TNF, LT, IL-ip, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF o PDGF.
Las combinaciones particulares de agentes activos pueden interferir en diferentes puntos de la cascada autoinmunitaria y la posterior cascada inflamatoria, e incluyen antagonistas del TNF como anticuerpos del TNF quiméricos, humanizados o humanos, REMICADE, fragmentos de anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, CDP870) y receptores de TNF p55 o p75 solubles, derivados de los mismos, p75TNFRIgG (ENBREL.) o p55TNFR1gG (LENERCEPT), receptor de IL-13 soluble (sIL-13) y también inhibidores de la enzima convertidora de TNFa (TACE, del inglés TNFa-converting enzyme); del mismo modo que también pueden ser eficaces los inhibidores de IL-1 (por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de interleucina-1). Otras combinaciones incluyen interleucina 11, anti-P7s y ligando de glucoproteína de p-selectina (PSGL, del inglés p-selectin glycoprotein ligand). Otros ejemplos de agentes útiles en combinación con los polipéptidos IL-10 descritos en el presente documento incluyen interferón-p1a (AVONEX); interferón-p1b (BETASERON); copaxone; oxígeno hiperbárico; inmunoglobulina intravenosa; clabribina; y anticuerpos contra o antagonistas de otras citocinas o factores de crecimiento humanos (por ejemplo, anticuerpos contra el ligando CD40 y CD80).
La presente divulgación abarca sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Enfermedades víricas. En el presente documento se divulgan métodos para tratar y/o prevenir enfermedades, trastornos y afecciones víricas, así como los trastornos asociados a los mismos, con un polipéptido IL-10 (por ejemplo, PEG-IL-10) y al menos un agente terapéutico o de diagnóstico adicional (por ejemplo, uno o más agentes antivíricos y/o uno o más agentes no víricos).
Dicha terapia combinada incluye agentes antivíricos dirigidos a diversas fases del ciclo de vida vírico y que tienen distintos mecanismos de acción, que incluyen, pero sin limitación, los siguientes: inhibidores de la eliminación de la cubierta vírica (por ejemplo, amantadina y rimantidina); inhibidores de la transcriptasa inversa (por ejemplo, aciclovir, zidovudina y lamivudina); agentes que se dirigen a la integrasa; agentes que bloquean la unión de factores de transcripción al ADN vírico; agentes (por ejemplo, moléculas antisentido) que afectan la traducción (por ejemplo, fomivirsen); agentes que modulan la función de la traducción/ribozima; inhibidores de proteasas; moduladores de ensamblaje vírico (por ejemplo, rifampicina); y agentes que impiden la liberación de partículas víricas (por ejemplo, zanamivir y oseltamivir). El tratamiento y/o la prevención de determinadas infecciones víricas (por ejemplo, VIH) implica con frecuencia un grupo ("cóctel") de agentes antivíricos.
Otros agentes antivíricos contemplados para su uso en combinación con los polipéptidos IL-10 incluyen, pero sin limitación, los siguientes: abacavir, adefovir, amantadina, amprenavir, ampligen, arbidol, atazanavir, atripla, boceprevirertet, cidofovir, combivir, darunavir, delavirdina, didanosina, docosanol, edoxudina, efavirenz, emtricitabina, enfuvirtida, entecavir, famciclovir, fosamprenavir, foscarnet, fosfonet, ganciclovir, ibacitabina, imunovir, idoxuridina, imiquimod, indinavir, inosina, diversos interferones (por ejemplo, peginterferón a-2a), lopinavir, lovirida, maraviroc, moroxidina, metisazona, nelfinavir, nevirapina, nexavir, penciclovir, peramivir, pleconarilo, podofilotoxina, raltegravir, ribavirina, ritonavir, piramidina, saquinavir, estavudina, telaprevir, tenofovir, tipranavir, trifluridina, trizivir, tromantadina, truvada, valaciclovir, valganciclovir, vicriviroc, vidarabina, viramidina y zalcitabina.
En el presente documento se divulgan sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Dosificación
Los polipéptidos IL-10 de la presente divulgación pueden administrarse a un sujeto en una cantidad que depende de, por ejemplo, el objetivo de la administración (por ejemplo, el grado de resolución deseado); la edad, peso, sexo, salud y estado físico del sujeto al que se va a administrar la formulación; la vía de administración; y la naturaleza de la enfermedad, trastorno, afección o síntomas de los mismos. El régimen de dosificación también puede tener en cuenta la existencia, naturaleza y alcance de cualquier efecto indeseable asociado con el agente (o agentes) que se administran. Las cantidades de dosificación y los regímenes de dosificación eficaces pueden determinarse fácilmente a partir de, por ejemplo, ensayos de seguridad y aumento de la dosis, estudios in vivo (por ejemplo, modelos animales) y otros métodos conocidos por el experto en la materia.
La presente divulgación contempla la administración de IL-10 para lograr determinadas concentraciones mínimas en suero y/o para mantener determinadas concentraciones mínimas medias en suero. Las metodologías específicas para IL-10 se describen en otra parte del presente documento y en esta sección a continuación.
En general, los parámetros de dosificación dictan que la cantidad de dosificación sea menor que una cantidad que podría ser irreversiblemente tóxica para el sujeto (es decir, la dosis máxima tolerada, "DMT") y no menos de una cantidad necesaria para producir un efecto mensurable en el sujeto. Dichas cantidades se determinan mediante, por ejemplo, los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos asociados con la ADME, teniendo en cuenta la vía de administración y otros factores.
Una dosis eficaz (DE) es la dosis o cantidad de un agente que produce una respuesta terapéutica o un efecto deseado en alguna fracción de los sujetos que lo toman. La "dosis media eficaz" o DE50 de un agente es la dosis o cantidad de un agente que produce una respuesta terapéutica o un efecto deseado en el 50 % de la población a la cual se le administra. Aunque la DE50 se utiliza comúnmente como una medida de expectativa razonable del efecto de un agente, no es necesariamente la dosis que un médico podría considerar apropiada teniendo en cuenta todos los factores pertinentes. Por tanto, en algunas situaciones, la cantidad eficaz es mayor que la DE50 calculada, en otras situaciones, la cantidad eficaz es menor que la DE50 calculada y, en aún otras situaciones, la cantidad eficaz es la misma que la DE50 calculada.
Además, una dosis eficaz del polipéptido IL-10 de la presente divulgación puede ser una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un sujeto, produce un resultado deseado con respecto a un sujeto sano. Por ejemplo, para un sujeto que padece un trastorno en particular, una dosis eficaz puede ser una que mejora un parámetro de diagnóstico, medida, marcador y similares del trastorno en al menos aproximadamente un 5 %, al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 % o más del 90 %, donde el 100 % se define como el parámetro de diagnóstico, medida, marcador y similares presentados por un sujeto normal.
La cantidad de PEG-IL-10 necesaria para tratar una enfermedad, trastorno o afección descritas en el presente documento se basa en la actividad de IL-10 de la proteína conjugada, que puede determinarse mediante ensayos de actividad de IL-10 conocidos en la materia. Como ejemplo, en el contexto tumoral, la actividad adecuada de IL-10 incluye, por ejemplo, la infiltración de linfocitos T c D8+ en sitios tumorales, la expresión de citocinas inflamatorias, tales como IFN-y, IL-4, IL-6, IL-10 y RANK-L, a partir de estas células infiltrantes y niveles elevados de IFN-y en muestras biológicas.
La cantidad terapéuticamente eficaz de un agente IL-10 puede variar entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 100 |jg de proteína/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0,1 a 20 |jg de proteína/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0,5 a 10 jg de proteína/kg de peso corporal/día, o de aproximadamente 1 a 4 jg de proteína/kg de peso corporal/día. En algunas realizaciones, un agente IL-10 se administra mediante infusión continua para administrar aproximadamente de 50 a 800 jg de proteína/kg de peso corporal/día (por ejemplo, aproximadamente de 1 a 16 jg de proteína/kg de peso corporal/día del agente IL-10). La tasa de infusión se puede variar según la evaluación de, por ejemplo, los efectos indeseables y recuentos de células sanguíneas.
Para la administración de un agente oral, las composiciones pueden proporcionarse en forma de comprimidos, cápsulas y similares que contengan de 1,0 a 1000 miligramos del principio activo, en particular 1,0, 3,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 50,0, 75,0, 100,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 400,0, 500,0, 600,0, 750,0, 800,0, 900,0 y 1000,0 miligramos del principio activo.
Los regímenes de dosificación particulares (por ejemplo, frecuencias de dosificación) para los polipéptidos IL-10 se describen en otra parte del presente documento.
En determinadas realizaciones, la dosificación del polipéptido IL-10 divulgado está contenida en una "forma farmacéutica unitaria". La expresión "forma farmacéutica unitaria" se refiere a unidades físicamente separadas, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un polipéptido IL-10 de la presente divulgación, ya sea solo o en combinación con uno o más agentes adicionales, suficiente para producir el efecto deseado. Se apreciará que los parámetros de una forma farmacéutica unitaria dependerán del agente particular y del efecto a conseguir.
Kits
En el presente documento se divulgan kits que comprenden IL-10 y composiciones farmacéuticas de la misma. En general, los kits están en forma de una estructura física que aloja diversos componentes, como se describe a continuación, y pueden utilizarse, por ejemplo, en la práctica de los métodos descritos anteriormente (por ejemplo, la administración de un polipéptido IL-10 a un sujeto que necesita restaurar la homeostasis del colesterol).
Un kit puede incluir uno o más de los polipéptidos IL-10 divulgados en el presente documento (proporcionados en, por ejemplo, un recipiente estéril), que pueden estar en forma de una composición farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. Los polipéptidos IL-10 se pueden proporcionar en una forma que esté lista para usar o en una forma que necesite, por ejemplo, reconstitución o dilución antes de la administración. Cuando los polipéptidos IL-10 están en una forma que necesita ser reconstituida por un usuario, el kit también puede incluir tampones, excipientes farmacéuticamente aceptables y similares, empaquetados con los polipéptidos IL-10 o por separado de ellos. Cuando se contempla una terapia combinada, el kit puede contener los distintos agentes por separado o ya pueden estar combinados en el kit. Cada componente del kit puede estar contenido dentro de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden estar dentro de un solo envase. Un kit de la presente divulgación puede diseñarse para las condiciones necesarias para mantener adecuadamente los componentes alojados en el mismo (por ejemplo, refrigeración o congelación).
Un kit puede contener una etiqueta o un prospecto de envase que incluya información identificativa de los componentes del mismo e instrucciones para su uso (por ejemplo, los parámetros de dosificación, la farmacología clínica del principio(s) activo(s), incluyendo el mecanismo de acción, la farmacocinética y la farmacodinámica, los efectos indeseables, las contraindicaciones, etc.). Las etiquetas o prospectos incluyen información del fabricante, tal como números de lote y fechas de caducidad. La etiqueta o el prospecto puede estar, por ejemplo, integrado en la estructura física que aloja los componentes, contenidos por separado dentro de la estructura física o incluidos en un componente del kit (por ejemplo, una ampolla, tubo o vial).
Las etiquetas o prospectos incluyen adicionalmente, o se incorporan en, un medio legible por ordenador, tal como un disco (por ejemplo, disco duro, tarjeta, disco de memoria), disco óptico tal como CD o DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, cinta magnética o un medio de almacenamiento eléctrico, tal como una RAM y ROM o híbridos de estos tales como medios de almacenamiento magnéticos/ópticos, medios FLASH o tarjetas de memoria. En algunas realizaciones, las instrucciones propiamente dichas no están presentes en el kit, sino que se proporcionan medios para obtener las instrucciones de una fuente remota, por ejemplo, a través de internet.
SECCIÓN EXPERIMENTAL
Los siguientes ejemplos se han incluido para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de cómo hacer y utilizar la presente invención. Debe entenderse que las descripciones ilustrativas escritas en tiempo presente no necesariamente se realizaron, sino que las descripciones se pueden realizar para generar los datos y similares descritos en ellas. Se ha intentado garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales.
A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio ponderal, la temperatura está en grados Celsius (°C) y la presión es igual o cercana a la atmosférica. Se utilizan abreviaturas convencionales, que incluyen las siguientes: pb = par (o pares) de bases; kb = kilobase (o kilobases); pl = picolitro (o picolitros); s o sec = segundo (o segundos); min = minuto (minutos); h u hr = hora (u horas); aa = aminoácido (o aminoácidos); kb = kilobase (o kilobases); nt = nucleótido (o nucleótidos); ng = nanogramo; |jg = microgramo; mg = miligramo; g = gramo; kg = kilogramo; dl = decilitro; j l = microlitro; ml = mililitro; l o L = litro; jM = micromolar; mM = milimolar; M = molar; kDa = kilodalton; i.m. = (por vía) intramuscular; i.p. = (por vía) intraperitoneal; i.v. o IV = (por vía) intravenosa; s.c. o SC = (por vía) subcutánea; QD = diario; BID = dos veces al día; QW = semanal; QM = mensual; HPLC = cromatografía de líquidos de alto rendimiento; PC = peso corporal; U = unidad; ns = no estadísticamente significativo; PBS = solución salina tamponada con fosfato; PCR = reacción en cadena de la polimerasa; NHS = N-hidroxisuccinimida; DMEM = medio de Eagle modificado por Dulbecco; GC = copia del genoma; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético.
Materiales y métodos
Los siguientes materiales y métodos generales pueden utilizarse en los ejemplos siguientes:
Se describen los métodos convencionales en biología molecular (véase, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, 3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; y Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. Nueva York, N.Y., que describe la clonación en células bacterianas y la mutagénesis de ADN (vol. 1), la clonación en células de mamífero y levaduras (vol. 2), glucoconjugados y expresión de proteínas (vol. 3) y bioinformática (vol. 4)).
La bibliografía científica describe métodos para la purificación de proteínas, incluida la inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización, así como el análisis químico, modificación química, modificación postraduccional, producción de proteínas de fusión y glucosilación de proteínas (véase, por ejemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1-2, John Wiley and Sons, Inc., NY).
Se describen la producción, la purificación y la fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales (por ejemplo, Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY); están disponibles técnicas convencionales para caracterizar interacciones ligando/receptor (véase, por ejemplo, Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York); están disponibles métodos de citometría de flujo, que incluyen la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (véase, por ejemplo, Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ); y están disponibles reactivos fluorescentes adecuados para modificar ácidos nucleicos, incluidos cebadores y sondas de ácido nucleico, polipéptidos y anticuerpos, para su uso, por ejemplo, como reactivos de diagnóstico, (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO.).
Están descritos métodos convencionales de histología del sistema inmunitario (véase, por ejemplo, Louis et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nueva York, NY).
El agotamiento de las células inmunitarias (linfocitos T CD4+ y CD8+) puede efectuarse mediante la eliminación mediada por anticuerpos. Por ejemplo, se pueden inyectar semanalmente 250 |jg de anticuerpos específicos de CD4 o CD8 y se pueden verificar el agotamiento de células mediante análisis FACS e IHC.
Están disponibles paquetes de programas informáticos y bases de datos para determinar, por ejemplo, fragmentos antigénicos, secuencias líderes, plegamiento de proteínas, dominios funcionales, sitios de glucosilación y alineaciones de secuencias (véase, por ejemplo, GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); y DeCypher™ (TimeLogic Corp., Crystal Bay, NV).
Se obtuvieron ratones Balb/C inmunocompetentes o Balb/C deficientes en linfocitos B de The Jackson Lab., Bar Harbor, ME y se utilizaron de acuerdo con los procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Martin et al. (2001) Infect. Immun., 69(11):7067-73 y Compton et al. (2004) Comp. Medicina. 54(6):681-89). otras cepas de ratones adecuadas para el trabajo experimental contemplado por la presente divulgación son conocidas por el experto en la materia y generalmente están disponibles en The Jackson Lab.
A menos que se indique de otro modo, el carcinoma epidermoide PDV6 de la piel se utilizó en los experimentos descritos en el presente documento (véase, por ejemplo, Langowski et al. (2006) Nature 442:461-465). Se pueden utilizar otros modelos y estirpes celulares relacionados con la oncología, tales como los modelos de carcinoma mamario Ep2, carcinoma de colon CT26 y carcinoma de mama 4T1 (véase, por ejemplo, Langowski et al. (2006) Nature 442:461-465) que son conocidos por los expertos en la materia. También se pueden utilizar modelos y estirpes celulares no relacionados con la oncología (por ejemplo, modelos de inflamación) que son conocidos por los expertos en la materia.
Los niveles de concentración de IL-10 en suero y los niveles de exposición pueden determinarse mediante métodos convencionales utilizados en la materia. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de nivel de exposición en suero mediante la recogida de sangre completa (~50 jl/ratón) de cortes en la cola de los ratones en tubos capilares simples, la separación del suero y de las células sanguíneas mediante centrifugación y la determinación de los niveles de exposición de IL-10 mediante kits y técnicas ELISA convencionales. Más adelante se describen medios adicionales para determinar las concentraciones en suero de IL-10.
La presente divulgación contempla la síntesis de IL-10 pegilada por cualquier medio conocido por el experto en la materia (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7.052.686 y la publicación de patente de EE. UU. n.° 2011/0250163).
El material expuesto a continuación, hasta la tabla 15 inclusive y la descripción de la misma, se reproduce de la publicación de patente de EE. UU. n.° 2011/0091419 (un coinventor de la publicación de patente de EE. UU. n.° 2011/0091419 es también un inventor de la presente solicitud) y las enseñanzas contenidas en ella, y variaciones de las mismas, son ampliamente aplicables y se pueden utilizar y/o modificar en varios contextos diferentes. De manera similar, las enseñanzas de otras publicaciones en campos y/o áreas tecnológicas relacionadas (véase, por ejemplo, los documentos USP n.° 6.387.364 y 7.052.684, y la publicación PCT n.° WO 2006/075138), junto con el conocimiento general del experto, pueden formar la base para trabajos experimentales adicionales.
Modelos tumorales y análisis tumoral
Cualquier modelo tumoral aceptado en la materia, ensayo y similares se pueden utilizar para evaluar el efecto de la IL-10 y de la PEG-IL-10 en diversos tumores. Los modelos de tumores y los análisis de tumores que se describen a continuación son representativos de los que se pueden utilizar, y se usaron para generar y evaluar los datos expuestos en las tablas 1 a 15.
Las células tumorales de ratón singénicas se inyectan por vía subcutánea o intradérmica a 104, 105 o 106 células por inoculación tumoral. Se pueden utilizar modelos de carcinoma mamario Ep2, carcinoma de colon CT26, carcinoma epidermoide PDV6 de piel y carcinoma de mama 4T1 (véase, por ejemplo, Langowski et al. (2006) Nature 442:461-465). Se pueden utilizar ratones Balb/C inmunocompetentes o Balb/C deficientes en linfocitos B. Se puede administrar PEG-mIL-10 a los ratones inmunocompetentes, mientras que se puede utilizar el tratamiento con PEG-hIL-10 en los ratones deficientes en linfocito B. Se permite que los tumores alcancen un tamaño de 100 a 250 mm3 antes de iniciar el tratamiento. Se administra por vía subcutánea IL-10, PEG-mIL-10, PEG-hIL-10 o tampón de control en un sitio distante de la implantación del tumor. El crecimiento tumoral se monitoriza normalmente dos veces por semana usando calibradores electrónicos.
Los tejidos tumorales y los órganos linfáticos se recogen en varios puntos finales para medir la expresión de ARNm para una serie de marcadores inflamatorios y para realizar inmunohistoquímica para varios marcadores de células inflamatorias. Los tejidos se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 °C. El crecimiento del tumor primario generalmente se controla dos veces por semana con calibradores electrónicos. El volumen tumoral se puede calcular con la fórmula (ancho2 * longitud/2) donde la longitud es la dimensión más larga. Se permite que los tumores alcancen un tamaño de 90 a 250 mm3 antes de iniciar el tratamiento.
Administración de IL-10 y/o PEG-IL-10
Los modelos de tumores y los métodos de análisis de tumores descritos anteriormente se utilizaron para generar los datos expuestos a continuación. Sin embargo, como se ha hecho alusión anteriormente, estos mismos modelos y metodologías pueden utilizarse en otros escenarios experimentales.
Se administró IL-10 murina (mIL-10) o PEG-mIL-10 a los ratones inmunocompetentes, mientras que el tratamiento con PEG-hIL-10 se utilizó en los ratones deficientes en linfocitos B. Se administró por vía subcutánea IL-10 murina, PEG-mIL-10, PEG-hIL-10 o vehículo de control en un sitio distante de la implantación del tumor. La PEG-mIL-10 utilizada en estos estudios se preparó con el enlazador SC-PEG-12K. Las actividades biológicas de mIL-10 y PEG-mIL-10 se evaluaron mediante la aplicación de un bioensayo de proliferación a corto plazo que utiliza MC/9, una estirpe de mastocitos de ratón, que expresa receptores de mIL-10 endógenos (R1 y R2). Las células MC/9 proliferan en respuesta a la estimulación conjunta con mIL-4 y mIL-10 (las células MC/9 no proliferan solo con mIL-4 o mIL-10). La proliferación se midió por medios colorimétricos con Alamar Blue, un colorante indicador de crecimiento basado en la detección de actividad metabólica. La actividad biológica de PEG-mIL-10 o recombinante se evaluó mediante el valor CE50, o la concentración de proteína a la que se observa la mitad de la estimulación máxima en una curva de dosis-respuesta (Tabla 1).
____________________________________________ TABLA 1___________________________________________ Bioensayo de proliferación de MC/9 para la evaluación de la bioactividad de los reactivos mIL-10 y PEG-mIL10 utilizados en estos estudios
Proteína CE50 (ng/ml) en ensayo en MC/9
mIL-10 0,5711
PEG-mIL-10 4,039
Como se indica en la tabla 1, basándose en el bioensayo de MC/9, la actividad específica de la PEG-mIL-10 utilizada en los experimentos es aproximadamente 7 veces menor que la actividad de la mIL-10.
La PEG-mIL-10 también se puede administrar cada dos días a ratones que albergan tumores de cáncer de mama Ep2. El tratamiento fue eficaz para reducir el tamaño del tumor e inducir el rechazo del tumor.
__________________________________________ TABLA 2__________________________________________
La PEG mIL-10 reduce el tamaño del tumor (mm3) en el modelo de cáncer de mama Ep2 en ratones Balb/C.
Días después de la inoculación
11 15 18 21 25 27 33 Control 300 450 500 750 1300 1500 2700 PEG-IL-10 300 400 310 280 250 50 0
El tratamiento con PEG-mIL-10 también fue eficaz para reducir el tamaño del tumor en modelos tumorales de ratón inmunocompetentes singénicos PDV6, CT-26 y 4T1 (véanse las tablas 3, 4 y 5).
TABLA 3
Estudio 04-M52 338: La PEG mIL-10 a partir del día 36 después del implante reduce el tamaño del tumor PDV6
(mm3) en ratones C57B/6.
Días después de la inoculación
36 38 42 44 46 48 52 Control 200 255 290 380 395 420 485 PEG-mIL-10 210 265 200 190 155 110 55
T A B L A 4
La PEG mIL-10 a partir del día 7 después del implante reduce el tamaño del tumor con respecto al control con vehículo de los tumores CT26 (mm3) en ratones BALB/c.
Días después de la inoculación
10 15 17 20 22 24 Control con vehículo 155 424 791 1274 1737 2170 PEG-mIL-10 136 212 291 336 450 455
__________________________________ TABLA 5__________________________________
La IL-10 y la PEG mIL-10 reducen el tamaño del tumor (mm3) del carcinoma de mama 4T1 Días de tratamiento 20 24 29 33 Control 200 410 584 1000 PEG-mIL-10 200 320 560 350 IL-10 200 290 575 400
Estudios de valoración de la dosis
En los estudios de valoración de la dosis, se recogieron muestras de sangre de la vena de la cola de ratones representativos de cada grupo en momentos correspondientes a los niveles de dosis máxima y mínima esperados. El suero recogido se analizó para determinar las concentraciones de mIL-10 mediante la plataforma Meso Scale Discovery, que se basa en la tecnología de matriz múltiple, una combinación de detección de electroquimioluminiscencia y matrices con patrones. Se utilizó una prueba t de Student no pareada bilateral para comparar el volumen tumoral medio de los ratones tratados con mIL-10 o PEG-mIL-10 agrupados por concentración en suero de mIL-10 con el volumen tumoral medio de su grupo de control con vehículo correspondiente. Se utilizó una corrección de Welch cuando dos grupos tenían una varianza desigual (p <0,05 de la prueba t).
Las valoraciones de la dosis de PEG-mIL-10 y mIL-10 en ratones con carcinoma de mama 4T1 muestran que el control del tumor primario y las metástasis pulmonares son dosificables tanto con mIL-10 como con PEG-mIL-10. Tal como se expone en la tabla 6, a cualquier dosis dada, PEG-mIL-10 es más eficaz que mIL-10. El tratamiento dos veces al día se inició el día 17 después del implante, cuando el volumen tumoral medio alcanzó de 84 a 90 mm3. Los grupos de tratamiento consistieron en 14 ratones por grupo, mientras que los grupos de control tenían 8 ratones en cada grupo. Los tampones Tris y Hepes fueron los controles para mIL-10 y PEG mIL-10, respectivamente.
__________________________________________ TABLA 6__________________________________________ Estudio 06-M175-1103. La mIL-10 y la PEG-mIL-10 reducen el tamaño del tumor primario (mm3) del carcinoma de mama 4T1 en ratones BALB/c de forma dependiente de la dosis.
Días después del implante
17 21 24 27 30 34 38 42 Control con vehículo Tris 90 184 288 448 560 861 1126 1248 Control con vehículos Hepes 90 215 344 476 658 940 1261 1520 PEG-mIL-10 (0,5 mg/kg) 86 107 117 129 150 165 204 195 PEG-mIL-10 (0,1 mg/kg) 84 112 142 152 224 256 286 356 PEG-mIL-10 (0,01 mg/kg) 85 140 200 240 288 462 627 773 PEG-mIL-10 (0,001 mg/kg) 88 168 239 262 373 532 729 942 mIL-10 (1,0 mg/kg) 85 117 168 207 256 350 446 497 mIL-10 (0,1 mg/kg) 84 136 180 251 337 424 641 704 mIL-10 (0,01 mg/kg) 86 121 165 231 331 436 631 809
Las valoraciones de la dosis de PEG-mIL-10 y mIL-10 en ratones portadores de carcinoma epidermoide PDV6 muestran que el control del tumor primario se puede ajustar en dosis tanto con mIL-10 como con PEG-mIL-10, aunque a cualquier dosis dada, PEG-mIL-10 es más eficaz que mIL-10 (Tabla 7). El tratamiento con dosis elevadas de PEG-mIL-10 dio como resultado una regresión del tumor de casi el 100 % y la posterior resistencia a la reexposición (Tabla 8). El tratamiento dos veces al día se inició el día 23 después del implante, cuando los volúmenes tumorales medios eran de 107 a 109 mm3 y continuó hasta el día 55 para todos los grupos tratados con mIL10 y el grupo tratado con 0,01 mg/kg de PEG mIL-10. El tratamiento con 0,1 mg/kg de PEG-mIL-10 se detuvo el día 48 cuando se observó una regresión tumoral del 100 %, mientras que los grupos restantes se trataron hasta el día 51. Los grupos de tratamiento consistieron en 10 ratones por grupo, mientras que cada grupo de control con vehículo contenía 6 ratones. El tampón Tris y el tampón Hepes fueron el vehículo de control para mIL-10 y PEG mIL-10, respectivamente. El reimplante se realizó 85 días después del implante primario y 4 semanas después del último tratamiento con PEG-mIL 10. Había 10 ratones por grupo.
_____________________________________TABLA 7____________________________________
Estudio 06-M52-1106. La mIL-10 y la PEG-mIL-10 reducen el tamaño del tumor (mm3) del carcinoma epidermoide PDV6 en ratones C57Bl6lJ de forma dependiente de la dosis.
Días después del implante
23 27 30 33 36 40 43 47 51 55 Control con 111 179 232 318 412 493 635 848 958
vehículo Tris
Control con 107 210 293 433 541 653 712 761 986 vehículos
Hepes
PEG-mIL-10 108 99 55 31 17 11 3 1 1 1 (0,1 mg/kg)
PEG-mIL-10 107 131 92 97 95 114 119 123 183 228 (0,01 mg/kg)
PEG-mIL-10 109 191 191 241 327 455 535
(0,001 mg/kg)
mIL-10 107 129 144 143 124 87 51 36 52 75 (1,0 mg/kg)
mIL-10 107 85 85 88 117 121 130 143 182 217 (0,1 mg/kg)
Estudio 06-M52-1106. La mIL-10 y la PEG-mIL-10 reducen el tamaño del tumor (mm3) del carcinoma epidermoide PDV6 en ratones C57B16/J de forma dependiente de la dosis.
Días después del implante
23 27 30 33 36 40 43 47 51 55 mIL-10 107 120 150 146 196 244 262 263 249 250 (0,01 mg/kg)
_____________________________________________TABLA 8_________________________________________ Estudio 06-M52-1106. Los ratones C57B1/6J que han eliminado los tumores del carcinoma epidermoide PDV6 después de 3 semanas de tratamiento con PEG-mIL-10 son resistentes al reimplante en ausencia de tratamiento adicional.
Días después del implante % de ratones que 0 16 21 28 36 49 son positivos para tumores Control con 0 113 145 188 418 761 100 vehículo
PEG-mIL-10 0 0,3 0 7 16 47 10
(0,1 mg/kg)
Estudios de metástasis pulmonar
Las metástasis pulmonares en el modelo de carcinoma de mama 4T1 se cuantificaron de manera macroscópica después de la resección pulmonar (Tabla 9) o mediante la puesta en contacto con las colonias metastásicas pulmonares después del cultivo (Tabla 10) como se describe en Current Protocols in Immunology (Sección 20.2.4) John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; Harlow y Lane (1999). En resumen, los pulmones extraídos de un ratón con tumor 4T1 se trituraron y digirieron con un cóctel de colagenasa/elastasa seguido de cultivo en un ensayo de dilución limitante, en medio que contenía 6-tioguanina. Solo las células 4T1 son resistentes a la 6-tioguanina y pueden cuantificarse mediante el recuento del número de colonias después de 10 a 14 días de cultivo. El tratamiento dos veces al día se inició el día 17 después del implante, cuando el volumen tumoral medio alcanzó de 84 a 90 mm3. Los tampones Tris y Hepes fueron los controles para mIL-10 y PEG mIL-10, respectivamente. Las metástasis pulmonares se midieron como el número de colonias metastásicas cultivadas por pulmón.
_________________________________________ TABLA 9_________________________________________ Estudio 05-M52-496. El tratamiento de 2 semanas con mIL-10 y PEG-mIL-10 que comienza 19 días después del implante reduce la metástasis del carcinoma de mama 4T1 (medido como número de metástasis pulmonares por ratón)
Metástasis pulmonar 33 días después de la inoculación
Control con vehículo mIL-10 PEG-mIL-10 Ratón n.° 1 7 0 0
Ratón n.° 2 7 0 0
Ratón n.° 3 7 0 0
Ratón n.° 4 8 0 0
Ratón n.° 5 20 4 0
TABLA 10
Estudio 06-M175-1103. La mIL-10 y la PEG-mIL-10 reducen las metástasis pulmonares del carcinoma de mama 4T1 en ratones BALB/c de forma dependiente de la dosis.
Metástasis pulmonares 42 a 45 días después del implante Colonias por pulmón (* 103) Control Control
con con
vehículo vehículo
de de PEG- PEG- PEG-mIL- PEG-mIL-tampón tampón mIL-10 mIL-10 mIL-10 mIL-10 mIL-10 10 10 Ratón Tris Hepes 1,0 mg/kg 0,1 mg/kg 0,01 mg/kg 0,5 mg/kg 0,1 mg/kg 0,01 mg/kg 0,001 mg/kg
1 362 481 76 116 1064 7,1 89 0,43 366
2 2,12 533 20 5,6 150 1,0 0,7 234 212
3 152 264 28,1 8,1 67,4 0,4 0,01 377 0,6
4 0,4 218 1,2 137 18 1,5 223 315 586
5 1000 517 45,7 257 77 0,3 0,07 0,54 486
6 474 93 21,7 2,72 1,2 0,02 10,1 1,67 844
7 524 1000 4,4 364 285 0 7,6 68 6,5
8 1000 1026 128,6 772 9,7 0,002 1,85 27 265
9 13,3 348 878 0,3 0,01 139 338
10 51,2 204 45 0,03 0,01 177 824
11 9,4 49 56 0,01 2,68 597 263
12 0,1 635 17,1 240 0,01 7,4
13 5,1 19,7 1014 0,02 2,94 0,01
14 0,02 750 72,2 0,01 0,01 0,01
Mediana 418,0 499,0 16,7 170,5 69,8 0,17 1,28 47,5 338,0 Media 502,0 579,0 28,9 262,0 268,2 17,9 24,1 138,9 381,0
D.T. 519,0 467,0 36,5 276,9 397,1 64,0 61,8 183,7 284,0
La administración de PEG-mIL-10 o IL-10 a ratones portadores del carcinoma de mama 4T1 reduce la tasa de metástasis y aumenta la infiltración de linfocitos T CD8+ y la expresión de citocinas inmunoestimuladoras, medido mediante RT-PCR cuantitativa (Tablas 11 y 12). El número de linfocitos T CD8+ infiltrantes se contó a partir de secciones representativas de varios tumores teñidos mediante inmunohistoquímica para el marcador de superficie CD8 y se verificó mediante tinción con anticuerpos anti-CD3 y anti-TCRap.
TABLA 11
La IL-10 y la PEG mIL-10 inducen la infiltración de linfocitos T CD8+ en el carcinoma 4T1
control IL-10 PEG-IL-10
Número promedio de células CD8+/campo 6,4 25,8 39,2
La PEG-mIL-10 es más eficaz que la IL-10 en la inducción de citocinas inflamatorias. El ARN total de muestras de tumores homogeneizados se extrajo y se transcribió inversamente como se describió anteriormente (véase, por ejemplo, Homey, et al. (2000) J. Immunol. 164:3465-3470). El ADN complementario se analizó cuantitativamente para determinar la expresión de citocinas mediante el ensayo de PCR con 5'-nucleasa fluorógena (véase, por ejemplo, Holland, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280). Los productos de PCR específicos se midieron de manera continua mediante un sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) durante 40 ciclos.
Los valores se normalizaron a ubiquitina. Los datos transformados logarítmicamente se sometieron al análisis estadístico de Kruskal-Wallis (método de la mediana). El nivel de expresión (log transformado) corresponde a la cantidad de citocina inflamatoria expresada en la muestra del tumor, tal que cuanto mayor sea el nivel de expresión (log transformado), mayor es la cantidad de citocina inflamatoria expresada en la muestra tumoral.
TABLA 12
La PEG-mIL-10 administrada induce niveles sostenidos de citocinas inflamatorias en el carcinoma 4T1 24 h después de la administración de la dosis.
Citocina control IL-10 PEG-mIL-10 IFNy 36,04 68,51 98,96
IL-4 7,77 13,13 40,32
IL-6 43,64 50,59 111,98
IL-10 9,94 41,62 106,16 LIGANDO RANK 19,14 36,13 46,08
Agotamiento de las células inmunitarias
Los linfocitos T CD4+ y CD8+ se agotaron por eliminación mediada por anticuerpos. Para este fin, se inyectaron semanalmente 250 |jg de anticuerpos específicos para CD4 o CD8. Los agotamientos celulares se verificaron utilizando análisis fAc S e IHC.
El agotamiento de los linfocitos T CD4+ en ratones BALB/c deficientes en linfocitos B (C.129-Igh-6ím1Cgn) con anticuerpos CD4 inhibe la función de la PEG-hIL-10 en tumores (Tabla 13).
_________________________________________ TABLA 13_________________________________________ El tratamiento con la PEG-hIL-10 que comienza 8 días después del implante del tumor no logra reducir el tamaño del tumor (mm3) del carcinoma de colon CT-26 después del agotamiento de CD4 en ratones BALB/c deficientes en linfocitos B (C.129-Igh-6ím/Cgn).
Días después del implante 8 10 13 19 27 PBS 173 322 391 841 1979 PEG-hIL-10 184 276 251 602 1332
El agotamiento de los linfocitos T CD8+ inhibe completamente el efecto de la PEG mIL-10 sobre el crecimiento tumoral singénico (Tabla 14).
________________________________________ TABLA 14________________________________________
El tratamiento con PEG-hIL-10 que comienza 8 días después del implante del tumor no logra reducir el tamaño del tumor (mm3) del carcinoma de colon CT-26 después del agotamiento de CD8 en ratones BALB/c deficientes en linfocitos B.
Días después del implante 8 10 13 19 27 PBS 151 335 584 1434 2746 PEG-hIL-10 226 575 1047 2449 4799
Frecuencia de dosificación de IL-10 y concentración mínima en suero
Se diseñaron y realizaron estudios murinos para mejorar la comprensión de los parámetros farmacocinéticos de la terapia con IL-10 y generar datos en ratones útiles para optimizar los regímenes de tratamiento tumoral para la IL-10 humana recombinante (rhIL-10) en sujetos humanos.
Se inocularon a los ratones células tumorales PDV6 y se permitió que los tumores crecieran durante 2,5 semanas hasta alcanzar los 100 mm3. A continuación, se trataron grupos de ratones portadores del tumor (n = 10/grupo) con dosis semanales idénticas (0,7 mg/kg/semana), mediante la administración de mono-di PEGmIL-10 de 5 kDa como a) una inyección s.c. en bolo una vez a la semana, o b) varias inyecciones s.c. en dosis divididas a lo largo de la semana, incluida dos veces por semana (0,35 mg/kg), cada dos días (-0,25 mg/kg, tal que la dosis total semanal = 0,7 mg/kg), y diaria (0,1 mg/kg/día). Como todos los ratones recibieron la misma cantidad de fármaco en el transcurso de una semana, se observaron exposiciones generales similares (área bajo la curva, ABC). La exposición máxima fue más elevada en los animales que recibieron dosis una vez por semana, mientras que la exposición mínima al fármaco (mínima) fue más elevada en los ratones que recibieron dosis más pequeñas, dosis diarias. Sorprendentemente, tal como se indica en la tabla 15, los animales que recibieron dosis diarias presentaron la mayor eficacia antitumoral, lo que indica que la exposición mínima en suero era importante para la función antitumoral, mientras que la influencia de la máxima exposición en la función antitumoral no fue determinante.
TABLA 15
Figure imgf000044_0002
La concentración mínima en suero necesaria se exploró más a fondo en dos modelos tumorales: tumores PDV6 en ratones C57BL/6 y células de cáncer de colon CT26 en ratones Balb/C. Mediante el uso de procedimientos convencionales, se permitió que los tumores crecieran hasta 100 mm3 y, después, se inició el tratamiento con la administración de mono-di PEGmIL-10 de 5 kDa durante 4 semanas. A partir de entonces, las concentraciones mínimas en suero de IL-10 se midieron en ratones portadores de tumores que recibieron diferentes pautas de tratamiento. Las concentraciones mínimas en suero de IL-10 se correlacionaron luego con el tamaño del tumor resultante. Como se indica en la tabla 16, los ratones con una mínima en suero de IL-10 superior a 1 ng/ml tenían tumores sistemáticamente pequeños y rechazaron sus tumores.
TABLA 16
Figure imgf000044_0001
Para confirmar la concentración mínima clave en células humanas, se añadió hIL-10 a concentraciones crecientes a cultivos de monocitos de sangre periférica humana (PBMC, del inglés human peripheral blood monocyte cells). Los cultivos de PBMC se dejaron sin tratar o se estimularon con lipopolisacárido (l p S). Se sabe que la IL-10 inhibe la activación de las PBMC mediada por LPS. La actividad se midió como la secreción de la quimiocina MCP-1. Tanto los LPS como la IL-10 inducen la secreción de MCP-1, pero inhiben la actividad del otro en la inducción de la quimiocina. A concentraciones de 1 ng/ml y superiores, la IL-10 aumentó la secreción de MCP-1 en ausencia de LPS (Figura 2A). Por el contrario, en PBMC estimuladas con LPS, la adición de IL-10 a una concentración de 1 ng/ml inhibió significativamente la secreción de MCP-1 (Figura 2B). Esto confirmó la actividad biológica de la IL-10 tanto para la inducción como para la inhibición de los respectivos procesos biológicos.
Efecto de la IL-10 en las citocinas y el colesterol en sujetos humanos
Determinación de concentraciones en suero de IL-10 en sujetos humanos. Se administró a voluntarios humanos la cantidad deseada de rhIL-10 s.c. o i.v., y se extrajeron muestras de sangre completa en recipientes que contenían anticoagulante de heparina en el momento o momentos deseados después de la administración. Las concentraciones en suero de rhIL-10 o PEG-rhIL-10 se determinaron con un kit convencional de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de tipo sándwich. Por lo general, se determinó que el ensayo ELISA era selectivo, lineal y reproducible en el intervalo de concentración de 0,1 a 10 ng/ml, y el límite de cuantificación (LOO) fue de 0,1 ng/ml. Las muestras de suero también se analizaron mediante ELISA para determinar la presencia de anticuerpos que se unen a hIL-10. Además, la muestras de suero seleccionadas se analizaron con un bioensayo validado que comprende la estirpe de mastocitos de ratón MC9; esta estirpe celular prolifera en respuesta a la IL-10. El bioensayo se utilizó para determinar la bioactividad de rHuIL-10 y PEG-rHuIL-10 producidos por GMP y para determinar la actividad biológica de la IL-10 en el suero del paciente. Por lo general, las determinaciones mediante ELISA y bioensayo de la concentración y actividad de la IL-10 revelaron valores correspondientes.
Determinación de las concentraciones de TNFa e IL-1P en sujetos humanos. La IL-10 tiene una función antinflamatoria en pacientes que padecen enfermedades inflamatorias crónicas, y el TNFa y la IL-1p representan las citocinas inflamatorias clave liberadas en dichas enfermedades. Las concentraciones de TNFa e IL-1p se determinaron en muestras de sangre obtenidas de sujetos humanos. Por lo general, se recogieron de manera aséptica 3 ml de sangre venosa justo antes de la administración s.c. o i.v. (hora 0) de rhIL-10 y a las 0,5, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosis. Las muestras se sometieron a un ensayo de liberación de citocinas en sangre completa en presencia de LPS y un anticoagulante, y las concentraciones de TNFa e IL-1p se midieron con un ensayo ELISA. Los LPS estimularon la liberación de TNFa e IL-1p de las células sanguíneas.
En las muestras recogidas entre 0,5 y 12 horas después de que los individuos recibieron la dosis i.v. de rHuIL-10, se inhibió la liberación de TNFa e IL-1p. En muestras recogidas de individuos a los que se administró s.c. rHuIL-10, la liberación de TNFa e IL-1p se inhibió a partir de 0,5 horas hasta 24 horas. La concentración en suero de rHuIL-10 en esos sujetos humanos se determinó mediante ELISA. La inhibición de TNFa e IL-1p se correlacionó con la concentración en suero de rHuIL-10. La concentración en suero de rHuIL-10 aumentó después de la dosificación y permaneció elevada durante 48 horas. Sin embargo, la liberación de TNFa e IL-1p se inhibió sólo mientras la concentración de rHuIL-10 fue igual o superior a 0,2 ng/ml; la liberación de TNFa e IL-1p no se inhibió cuando la concentración fue inferior a 0,1 ng/ml. Después de 12 h después de la dosificación i.v. de rHuIL-10 y después de 24 h después de la dosificación s.c., la concentración en suero cayó por debajo de 0,2 ng/ml y se observó la liberación de TNFa e IL-1p. Estos datos indican que es necesario lograr una concentración mínima en suero de IL-10 igual o superior a 0,2 ng/ml para observar una función antinflamatoria en pacientes que padecen enfermedades inflamatorias crónicas.
Determinación de la modulación del INFv y del colesterol mediante la PEG-IL-10 en pacientes humanos con cáncer. La IL-10 induce el IFNy en linfocitos T CD8+, y la inducción del IFNy es esencial para el rechazo de tumores mediado por IL-10 en ratones. Los ratones deficientes en IFNy no pudieron rechazar sus tumores cuando se trataron con PEG-rmIL-10 a concentraciones que inducían la resolución del tumor en ratones de control (datos no mostrados). Por tanto, se midió el IFNy en el suero de pacientes tratados con PEG-rhIL-10.
Tras recibir formación sobre técnicas de administración adecuadas, los pacientes con cáncer se autoinyectaron PEG-rhIL-10 s.c. diariamente a varias dosis. Las concentraciones en suero de IL-10 se determinaron utilizando un ELISA de tipo sándwich como se describió anteriormente. El IFNy se midió utilizando un ensayo de perlas Luminex (Luminex Corp.; Austin, TX) en muestras de suero tomadas antes de la primera dosis o después de 28 días de dosificación.
Como se indica en la tabla 17, los pacientes que recibieron 1 pg/kg de PEG-IL-10 tenían niveles mínimos en suero entre ~0,4 y ~1,1 ng/ml de IL-10, mientras que los pacientes que recibieron dosis de 2,5 pg/kg de PEG-IL-10 tenían niveles mínimos en suero entre ~0,4 y ~2,6 ng/ml de IL-10.
El IFNy señala principalmente a través de la ruta Jak-Stat. La señalización de Jak-Stat implica el reclutamiento secuencial de receptores y la activación de miembros de la familia de cinasas Janus (Jaks: Jaks 1-3 y Tyk2) y las Stats (Stats 1-6, incluyendo Stat5a y Stat5b) para controlar la transcripción de genes diana a través de elementos de respuesta específicos. Como este mecanismo de señalización es una característica de muchos miembros de la superfamilia de receptores de citocinas, la señalización de Jak-Stat inducida por IFNy es el paradigma actual para la transducción de señales del receptor de citocinas de clase II. Como se indica en la tabla 17, los pacientes que tenían niveles mínimos en suero de 1 ng/ml o superiores mostraron una inducción del IFNy en el suero, mientras que los pacientes que tenían niveles mínimos en suero por debajo de 1 ng/ml no mostraron inducción de IFNy. Con referencia a la tabla 17, la inducción de IFNy se define como un valor superior a 1.
TABLA 17
Figure imgf000045_0002
Estos datos indican que es necesario lograr una concentración mínima en suero de IL-10 igual o superior a 1 ng/ml para observar un efecto terapéutico en el contexto del cáncer/tumor. Es importante destacar que, la concentración mínima en suero fue el factor determinante para la inducción del IFNy, no el nivel de dosis.
El colesterol se midió en muestras de suero extraídas de pacientes con cáncer antes de la administración de la PEG-rhIL-10 o después de una semana de dosificación s.c. diaria (1 pg/kg; 2,5 pg/kg; o 5 pg/kg; n = 3 a 4 pacientes/dosis). Con referencia a la tabla 18, los pacientes que recibieron 1 pg/kg lograron una concentración en suero promedio diaria de colesterol de 0,4 ng/ml y tuvieron una reducción del colesterol del 7,8 %; el paciente que recibió 2,5 pg/kg logró una concentración en suero promedio diaria de colesterol de 1 ng/ml y tuvo una reducción del colesterol del 19 %; y el paciente que recibió 5 pg/kg logró una concentración mínima en suero de colesterol promedio de 2 ng/ml y tuvo una reducción del colesterol del 38 %. Por tanto, cada uno de los regímenes de dosificación dio como resultado una reducción terapéuticamente adecuada en el colesterol en suero, lo que indica que las concentraciones mínimas en suero promedio de IL-10 de aproximadamente 0,2 ng/ml a 0,4 ng/ml fueron eficaces.
TABLA 18
Figure imgf000045_0001
Efecto de la PEG-hIL-10 en pacientes con tumores sólidos
Estudio de aumento de la dosis. Se evaluó el efecto de administrar diferentes cantidades de PEG-hIL-10 a pacientes que tenían tipos particulares de tumores sólidos. Como se establece en la figura 3, un total de 28 pacientes recibieron 1,2,5, 5, 10 o 20 |jg/kg de PEG-hIL-10 s.c. diariamente, y los tumores de 24 de esos pacientes se evaluaron mediante los criterios de respuesta inmunitaria (irRC), una metodología normalmente utilizada para determinar patrones de respuesta con agentes inmunoterapéuticos (véase, por ejemplo, Wolchok et al., Clin. Cancer Res. 15(23):7412-20 (1 de diciembre de 2009)). Los pacientes tenían tumores de ovario, tumores renales, tumores colónicos, tumores pancreáticos o melanoma.
En la figura 3 se establece la tasa de control de la enfermedad (TCE) según lo determinado usando irRC. En términos de oncología, la TCE se refiere a la proporción total de pacientes que demuestran una respuesta al tratamiento; la TCE es la suma de remisiones completas (RC) remisiones parciales (RP) enfermedad estable (EE). En este contexto, EE se definió como un aumento de la carga tumoral de <25 %, donde la carga tumoral se determinó utilizando la metodología irRC después de 7 semanas de tratamiento. Tal como se indica en la figura 3, a 10 jg/kg de PEG-hIL-10, la TCE fue del 40 % (2 de los 5 pacientes evaluables), y ambos pacientes tenían tumores de colon. A 20 jg/kg de PEG-hIL-10, la TCE fue del 80 % (4 de los 5 pacientes evaluables). De esos cuatro pacientes, uno tenía tumor colónico, uno tenía tumor pancreático, uno tenía melanoma y uno tenía tumor renal.
Aumento de las concentraciones en suero de PEG-hIL-10. Se evaluaron los parámetros farmacocinéticos asociados con la terapia con PEG-hIL-10 para optimizar los regímenes de dosificación del tratamiento del tumor. Utilizando metodologías similares a las descritas anteriormente, el valor CE50 se determinó en un ensayo basado en células utilizando PEG-hIL-10 y se comparó con los niveles en suero de IL-10 logrados en aquellos pacientes en el estudio de aumento de la dosis que recibieron 10 o 20 jg/kg de PEG-hIL-10. Tal como se indica en la figura 4, se determinó que la CE50 era ~6000 pg/ml (~6 ng/ml). A continuación, se determinaron las concentraciones en suero resultantes de la administración de 1, 2,5, 5, 10 o 20 jg/kg de PEG-hIL-10 s.c. diariamente para cada uno de los pacientes que participaron en el estudio de aumento de la dosis, y se calculó la concentración promedio en suero para aquellos pacientes que recibieron la misma dosis. Los datos se presentan en la figura 4. Con referencia a la figura 4, la administración de 20 jg/kg de PEG-hIL-10 dio como resultado exposiciones que excedieron la CE50, mientras que la administración de 10 jg/kg de PEG-hIL-10 con frecuencia dio como resultado exposiciones que estaban en o por encima de la CE50 (las exposiciones en o por encima de la CE50 se consideraron ventajosas).
En las figuras 5A y B se exponen los datos de la figura 4 determinados en cada paciente que recibió 10 jg/kg de PEG-hIL-10 (Figura 5A) y 20 jg/kg de PEG-hIL-10 (Figura 5B). Cada línea representa un paciente individual, donde CRC = cáncer colorrectal, RCC = carcinoma de células renales, Panc = cáncer de páncreas, MEL = melanoma y CRPC = cáncer de próstata resistente a la castración. La concentración en suero se midió en un ensayo de electroquimioluminiscencia (ECL) validado. De acuerdo con la figura 4, los pacientes que recibieron 20 jg/kg de PEG-hIL-10 alcanzaron de forma habitual exposiciones superiores a la CE50, mientras que los pacientes que recibieron 10 jg/kg de PEG-hIL-10 alcanzaron de forma habitual exposiciones cercanas a la c E50.
Efecto de la PEG-hIL-10 en el marcador tumoral CEA en pacientes con carcinoma colorrectal
El antígeno carcinoembrionario (CEA) se refiere a un conjunto de glucoproteínas ancladas en la superficie celular producidas en el tejido gastrointestinal durante el desarrollo fetal, pero presentes solo en niveles muy bajos en el suero de adultos sanos. Los niveles en suero del CEA aumentan en determinados tipos de cáncer (por ejemplo, CRC), y el CEA se puede utilizar como marcador tumoral durante los ensayos clínicos, prediciendo respuestas clínicas.
Se evaluó el efecto de administrar s.c. diariamente cantidades crecientes de PEG-hIL-10 a pacientes con CRC. La mayoría de los pacientes con CRC con dosis más bajas (por ejemplo, 1,2,5 o 5 jg/kg) experimentó un aumento lento del CEA durante el tratamiento, mientras que el paciente con CRC que recibió la dosis más elevada de PEG-hIL-10 (20 jg/kg) experimentó una fuerte caída en el CEA (datos no mostrados). En la figura 6 se representa el efecto estabilizador del CEA en dos pacientes que recibieron cantidades crecientes de PEG-hIL-10 durante el curso del tratamiento. Con referencia a la figura 6, un paciente comenzó la terapia con PEG-hIL-10 a 2,5 jg/kg y los niveles del CEA aumentaron de manera continua, incluso después de aumentar la dosis a 5 jg/kg después de ~130 días de tratamiento. Cuando posteriormente se aumentó la dosis a 10 jg/kg después de ~190 días de tratamiento, la concentración en suero del CEA se estabilizó, lo que sugiere que la PEG-hIL-10 se estaba administrando a una dosis suficiente para lograr una concentración en suero de la PEG-hIL-10 necesaria para el mantenimiento de la enfermedad estable. La terapia de un segundo paciente se inició con 5 jg/kg de PEG-hIL-10 s.c. diariamente. En este paciente, la medición de los niveles del CEA se inició alrededor del día 30. Con referencia a la figura 6, los niveles del CEA aumentaron de manera gradual y, después, se estabilizaron. El día ~100, la dosis de PEG-hIL-10 se aumentó a 10 jg/kg, después de lo cual los niveles del CEA disminuyeron de manera gradual, lo que indica la administración de una dosis suficiente para lograr una concentración en suero de PEG-hIL-10 necesaria para, al menos, mantener estable la enfermedad.
Efecto de la PEG-hIL-10 en la reducción del tamaño de la lesión tumoral metastásica
Se evaluó el efecto de la PEG-hIL-10 en las lesiones metastásicas en pacientes que tenían uno de tres tipos de tumores primarios (melanoma, RCC y CRC). Para cada paciente, el cambio porcentual en el tamaño de la lesión metastásica (volumen) se determinó durante el transcurso del tratamiento con PEG-hIL-10 (20 pg/kg de PEG-hIL-10 s.c. diaria) utilizando imágenes de tomografía computarizada (TC) (gráficos de la izquierda en cada una de las figuras 7A a C). Las concentraciones en suero de PEG-hIL-10 se midieron para cada paciente y se compararon con el valor CE50 determinado anteriormente (gráficos de la derecha en cada una de las figuras 7A a C).
En el paciente con melanoma, se midieron los tamaños de dos lesiones metastásicas pulmonares, dos lesiones metastásicas de ganglios linfáticos y cinco lesiones metastásicas hepáticas durante el curso de la terapia. Como se representa en el gráfico de la izquierda de la figura 7A, las lesiones hepáticas fueron las que más respondieron al tratamiento. El gráfico de la derecha de la figura 7A representa la concentración en suero de la IL-10 determinada en varios momentos después del inicio del tratamiento. En cada punto temporal en el que se midió, la concentración en suero fue superior a 10 ng/ml y superó el valor CE50 en cada uno de esos puntos temporales.
En el paciente con RCC, se midieron los tamaños de dos lesiones metastásicas pulmonares y una lesión metastásica esquelética en la semana 7 de tratamiento. Como se representa en el gráfico de la izquierda de la figura 7B, ambos tipos de lesiones respondieron al tratamiento, con una de las lesiones pulmonares disminuyendo un 24 % de tamaño. El gráfico de la derecha de la figura 7B representa las concentraciones en suero de la IL-10 determinadas en varios momentos después del inicio del tratamiento. En cada punto temporal en el que se midió, la concentración en suero fue superior a 10 ng/ml y superó el valor CE50 en cada uno de esos puntos temporales.
En el paciente con CRC, se midieron los tamaños de cuatro lesiones metastásicas pulmonares y dos lesiones metastásicas hepáticas en la semana 7 de tratamiento. Como se representa en el gráfico de la izquierda de la figura 7C, cada una de las lesiones pulmonares respondió al tratamiento, y una de las lesiones hepáticas permaneció estable en tamaño. El gráfico de la derecha de la figura 7C representa la concentración en suero de la PEG-hIL-10 determinada en varios momentos después del inicio del tratamiento. En cada punto temporal en el que se midió, la concentración en suero fue superior a 10 ng/ml y superó el valor CE50 en cada uno de esos puntos temporales.
Efecto de la PEG-hIL-10 en pacientes con melanoma y carcinoma de células renales
Se evaluó el efecto de administrar diferentes cantidades de PEG-hIL-10 a pacientes que tienen uno de dos tipos de tumores sólidos, melanoma o carcinoma de células renales. En la cohorte de dosificación para melanoma, se administró PEG-hIL-10 s.c. diariamente a un paciente por dosis (1, 5, 20 y 40 pg/kg) durante el número de semanas indicado en la tabla 19. En la cohorte de dosificación para carcinoma de células renales, se administró PEG-hIL-10 s.c. diariamente a dos pacientes a 2,5 pg/kg por dosis y a un paciente a 5, 10 y 20 pg/kg por dosis durante el número de semanas indicado en la tabla 19. Para la mayoría de los pacientes, la dosificación continuó más allá del número indicado de semanas.
La respuesta tumoral al tratamiento con PEG-hIL-10 se evaluó mediante exámenes de tomografía computarizada (TC) a intervalos definidos (por ejemplo, ~ cada 7 a 8 semanas), mientras que se realizó un seguimiento de intervalo más corto (por ejemplo, 4 semanas) si era necesario para los fines como la confirmación de la respuesta o la progresión. El cambio porcentual en la carga tumoral para cada paciente se evaluó mediante los criterios de respuesta inmunitaria (irRC), una metodología normalmente utilizada para determinar patrones de respuesta con agentes inmunoterapéuticos (véase, por ejemplo, Wolchok et al., Clin. Cancer Res. 15(23):7412-20 (1 de diciembre de 2009)). En la tabla 19, los porcentajes expuestos son la "mejor respuesta", que no incluye la progresión posterior; a modo de ejemplo, para el paciente con RCC que recibió 2,5 pg/kg de PEG-hIL-10 que dio como resultado una respuesta tumoral del 41 % a las 8 semanas, el paciente tuvo una respuesta del 49 % a las 14 semanas, una respuesta del 62 % a las 22 semanas y una respuesta del 85 % a las 28 semanas.
TABLA 19
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T al como lo indican los datos expuestos en la tabla 19, las dosis más elevadas tendieron hacia una tasa de respuesta más elevada para las cohortes de dosificación para melanoma y carcinoma de células renales. Estos hallazgos son coherentes con la necesidad de lograr concentraciones mínimas en suero de IL-10 más elevadas (por ejemplo, >10 ng/ml) para el tratamiento de diversos tumores.
En el presente documento se describen realizaciones particulares de la presente invención, incluido el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Al leer la descripción anterior, las variaciones de las realizaciones divulgadas pueden resultar evidentes para las personas que trabajan en la materia, y se espera que los expertos en la materia puedan emplear dichas variaciones según corresponda.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un agente PEG-IL-10 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente PEG-IL-10,
en donde el agente IL-10 es IL-10 humana madura o una variante de la IL-10 humana madura en donde la variante presenta una actividad comparable a la actividad de la IL-10 humana,
en donde la variante incluye variantes de origen natural, variantes de origen no natural y variantes postraduccionales,
en donde las variantes de origen natural incluyen homólogos de la IL-10 humana madura que difieren en aminoácidos de una especie a otra y variantes alélicas que difieren en aminoácidos de un individuo a otro dentro de una especie,
en donde las variantes que de origen no natural incluyen polipéptidos que comprenden cambios únicos o múltiples en aminoácidos donde el cambio o cambios en la secuencia se introducen de manera artificial,
en donde el agente PEG-IL-10 es un agente IL-10 que tiene una o más moléculas de PEG unidas covalentemente a al menos un resto de aminoácido del agente IL-10,
en donde la modificación del agente IL-10 mediante unión covalente al PEG no modifica la secuencia de aminoácidos del agente IL-10,
en donde la cantidad administrada al sujeto es suficiente para lograr una concentración mínima media de IL-10 en suero de al menos 10,0 ng/ml.
2. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente PEG-IL-10 comprende al menos una molécula de PEG unida covalentemente a al menos un resto de aminoácido de al menos una subunidad de la IL-10.
3. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el agente PEG-IL-10 comprende una mezcla de IL-10 monopegilada y dipegilada.
4. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el componente de PEG del agente PEG-IL-10 tiene una masa molecular de 5 kDa a 20 kDa.
5. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el componente de PEG del agente PEG-IL-10 tiene una masa molecular superior a 20 kDa.
6. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el componente de PEG del agente PEG-IL-10 tiene una masa molecular de al menos 30 kD.
7. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la unión covalente del PEG a al menos un resto de aminoácido de al menos una subunidad de la IL-10 comprende un enlazador.
8. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el agente IL-10 se administra al sujeto por vía subcutánea al menos una vez al día.
9. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el agente IL-10 se administra al sujeto por vía subcutánea al menos cada 72 horas.
10. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el agente IL-10 se administra al sujeto por vía subcutánea al menos una vez a la semana.
11. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además administrar al menos un agente profiláctico o terapéutico adicional.
12. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el agente profiláctico o terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo antirreceptor del factor de crecimiento epidérmico, un anticuerpo monoclonal contra el antígeno tumoral y una vacuna.
13. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el agente profiláctico o terapéutico adicional es uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en complejos de coordinación de platino, análogos de ácido fólico y análogos de purina.
14. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el análogo de ácido fólico es ácido folínico y el análogo de purina es 5-FU.
15. El agente PEG-IL-10 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el método da como resultado una mejora en los criterios de respuesta inmunitaria (irRC) en dicho sujeto.
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