JP2016526014A - インターロイキン−１０組成物及びその使用 - Google Patents

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Abstract

インターロイキン−１０ムテイン及び他のインターロイキン−１０関連分子、並びに、インターロイキン−１０ムテイン及び他のインターロイキン−１０関連分子を同定する方法が記載される。上記物質の改変もまた本明細書に記載され、該改変によって、ムテイン、または、他分子の特性（例えば、半減期）が、ヒトインターロイキン−１０以上に強化される。特定のインターロイキン−１０ムテイン及び関連分子は、ヒトインターロイキン−１０と同等な免疫原性、及び／またはヒトインターロイキン−１０と少なくとも同等な生物活性を有する。医薬組成物及び使用方法も、また、本明細書に記載される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１３年４月２４日出願の米国特許仮出願第６１／８１５,６５７号の優先権利益を主張し、その特許内容全体を参照により本明細書に援用する。
本発明は、とりわけ、インターロイキン−１０ムテイン及び他のインターロイキン−１０関連分子、前述したものの改変、及びその関連する使用に関する。
サイトカインインターロイキン１０（ＩＬ−１０）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の作用を介して複数の免疫応答を調節する多面発現性サイトカインである。ＩＬ−１０は、活性化単球及び活性化マクロファージにおいて、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦの発現を阻害することにより免疫応答を抑制することができ、そしてそれは、また、ＮＫ細胞によりＩＦＮ−γの産生を抑制する。ＩＬ−１０は、主にマクロファージで発現されるが、発現は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、肥満細胞、および単球において検出されている。免疫応答を抑制することに加えて、ＩＬ−１０は、ＩＬ−２及びＩＬ−４で処理された胸腺細胞を刺激し、Ｂ細胞の生存率を高め、及びＭＨＣクラスＩＩの発現を刺激することを含めた免疫刺激特性を示す。
その多面的な活動の結果として、ＩＬ−１０は、炎症状態、免疫関連障害、線維性障害及び癌を含む、疾患、障害及び状態の広い範囲に関連している。多くのこのような疾患、障害及び状態に対するＩＬ−１０の臨床及び前臨床の評価は、その治療の可能性を固めている。その上、ＰＥＧ化ＩＬ−１０は、ある治療設定において、非ＰＥＧ化ＩＬ−１０より有効であることが示されている。
ＩＬ−１０関連の疾患、障害及び状態の有病率及び重症度を考慮して、新規なＩＬ−１０剤及びその改変物は、ＩＬ−１０関連の疾患、障害及び状態の治療及び予防に莫大な価値があるであろう。
本開示は、ＩＬ−１０組成物及びその使用に関する。用語「ＩＬ−１０」、「ＩＬ−１０ポリペプチド（単数または複数）」、「ＩＬ−１０−剤（単数または複数）」、「ＩＬ−１０分子（単数または複数）」などは、幅広く解釈されることを意図し、そして、例えば、ヒト及び非ヒトＩＬ−１０関連の、同族体、変異体（ムテインを含む）及びそのフラグメントを含むポリペプチド、並びに、例えば、リーダ配列（例えば、シグナルペプチド）を有するＩＬ−１０ポリペプチドを含む。特定の実施形態は、前述の改変に関する。特定の実施形態において、単数及び複数の改変は、そのペプチドの改変されていないバージョンと比較して、ペプチドの少なくとも１つの特性またはたの特徴（例えば、効率）を向上させる。本開示の更なる実施形態は、特定のアミノ酸残基、または本明細書に記載される方法に従って改変することができるＩＬ−１０のドメインを同定するための方法、及び他の技術に関係する。本明細書に記載のペプチドを、使用し（例えば、障害、または、その症状の治療または予防に）、同定し、及び／または、生成する方法も、また、本開示の態様である。他の態様は、例えば、ペプチドを含む医薬組成物を含む。
ヒトＩＬ−１０（及び、他種からのＩＬ−１０）は、ホモ二量体として存在する。野生型ヒトＩＬ−１０の各々の単量体は、１７８個のアミノ酸を含み、初めの１８個は、シグナルペプチドを含む。以下詳細に記載されるように、成熟ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）の各１６０個のアミノ酸単量体もヘリックス間接合として本明細書で参照する短いループにより連結された６個のヘリックス（Ａ−Ｆ）を含む。明確にするため、ヘリックス間接合は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基（一般には、１０未満の残基）を含むことができる。
アミノ酸残基、及びＩＬ−１０ヘリックスの領域、ヘリックス間接合、及び、変異させることができる、または、できない、改変させることができる、及び／または、できないキンク（後述）は、以下に議論する。一例として、アミノ酸残基、及びＩＬ−１０の三次元のコア内に埋もれた、または受容体結合に関与している領域は、一般的には、改変のための候補ではない。
本開示は、少なくとも１つのアミノ酸残基にＰＥＧまたは他の部分との結合を容易にする置換を含むペプチドを意図する。そのようなペプチドの例は、以下に詳細に記載される。
本開示の特定の実施形態では、変異体ＩＬ−１０または改変されたＩＬ−１０ペプチドは、対応する非改変ＩＬ−１０ペプチドよりも免疫原性が低い（即ち、免疫応答への刺激が少ない）。他の実施形態において、改変されたＩＬ−１０ペプチドは、対応する非改変ＩＬ−１０ペプチドよりも（即ち、免疫原性は治療に関連する方法では変更されない）、免疫原性で中性である。方法は、本明細書に記載のＩＬ−１０ペプチドの免疫原性を評価するために、本明細書に記載されている。さらに別の実施形態では、改変されたペプチドは、少なくとも１つの特性（例えば、溶解性、バイオアベイラビリティ、血清半減期、及び循環時間を含む物理的特性）の改良を有する。このような特性は、さらに、以下に記載される。
本開示は、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドを意図し、ここに、ペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または付加を含み、そして、前記の単数または複数の置換、単数または複数の欠失、または単数または複数の添加は、例えば、免疫原性に悪影響を与えない。本発明は、また、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または、少なくとも９９％の配列同一性を有するペプチドを意図し、ここに、ペプチドは、ａ）配列番号２のペプチドよりも免疫原性が大きくなく；及び／または、ｂ）配列番号２のペプチドの生物活性に少なくとも等しい生物活性を有し：及び／または、ｃ）配列番号２のペプチドに比べて改良されている少なくとも１つの特性（例えば、溶解性、バイオアベイラビリティ、血清半減期、及び循環時間などの物理的特性）を有する。異なった方法（例えば、ＩＬ−１０の正確な濃度を定量する異なった方法、及び／または、ＩＬ−１０を産生する異なった方法）の活用は、タンパク質濃度の計算の差異に起因した明白な活性、または実際の活性のいずれかにおいて、この標準試料より多かれ、少なかれ活性であるＩＬ−１０を発生させるかもしれないことは、当業者には明らかであろう。スキルと経験を天秤にかけて、当業者は、ＩＬ−１０分子対ｈＩＬ−１０の相対的な生物活性を決定する上で、これらの違いを考慮することができるようになる。幾つかの実施形態において、このようなペプチドの各単量体は、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２５、少なくとも１４０、少なくとも１４５、少なくとも１５０、少なくとも１５１、少なくとも１５２、少なくとも１５３、少なくとも１５４、少なくとも１５５、少なくとも１５６、少なくとも１５７、少なくとも１５８、または少なくとも１５９個のアミノ酸残基を有する。
幾つかの実施形態において、上述のペプチドの単数または複数のアミノ酸残基の付加、単数または複数の欠失、または単数または複数の置換は、ペプチドの分子内ジスルフィド結合、またはペプチドの２つの単量体サブユニット間の非共有結合の相互作用を破壊しない。しかし、そのような単数または複数の付加、単数または複数の欠失、または単数または複数の置換は、おそらく１つまたはそれ以上の単量体間の、非共有結合（例えば、水素結合）を、破断させるかもしれないが、このような破断は、治療に関連するタンパク質機能に及ぼす影響を持つべきではないことは指摘すべきであろう。本開示の教示に基づき、アミノ酸置換は、保存置換であってもよく、及び／または、アミノ酸置換は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基１２、６２、１０８及び１１４における置換ではない。
特定の実施形態において、本開示は、配列番号２の生物活性に少なくとも等しい生物活性を有するペプチドを意図する。生物活性は、ケモカイン放出アッセイ、ＴＮＦα阻害アッセイ、または、ＭＣ／９細胞増殖アッセイを含む、当該分野で公知の任意の方法により決定することができる。そのようなアッセイのための典型的な手順は、本明細書中に記載されている。同様に、ペプチドの免疫原性は、Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープの少なくとも１つをスクリーニングすることによる予測を含む、当業者に公知の任意の方法により、予測または決定することができる。１つの態様において、免疫原性は、インシリコシステム、及び／または、生体外アッセイシステムにより予測される。
本開示は、また、配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドを意図し、ここに、ペプチドは、表面露出アミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、及び置換は、免疫原性、及び／または、他の性質または特徴に悪影響を与えない。ある実施形態において、これらのペプチドは、また、受容体結合に関与する任意のアミノ酸残基の置換を含まない。しかし、耐え得るＩＬ−１０受容体結合領域の内、またはそれに近接する１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、及び／または、付加は、本開示により意図されることは理解すべきであろう。
更なる実施形態において、前項に記載されたペプチドは、ａ）プレヘリックスＡ；ｂ）ヘリックスＡ；ｃ）Ａ／Ｂヘリックス間接合；ｄ）ヘリックスＢ；ｅ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合；ｆ）ヘリックスＣ；ｇ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合；ｈ）ヘリックスＤ；ｉ）Ｄ／Ｅヘリックス間接合；ｊ）ヘリックスＥ；ｋ）Ｅ／Ｆヘリックス間接合；ｌ）ヘリックスＦ；及びｍ）ポストヘリックスＦを含み、ここに、そのようなペプチドは、更に、ｉ）アミノ酸残基１２（Ｃ）、１５（Ｆ）または１６（Ｐ）以外のプレヘリックスＡの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または、ｉｉ）アミノ酸残基１９〜２４（ＬＰＮＭＬＲ（配列番号３３））、２６〜３０ （ＬＲＤＡＦ（配列番号３４））、３３〜３９、１７（ＶＫＴＦＦＱＭ（配列番号３５））、または４１（Ｄ）以外のヘリックスＡの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または、ｉｉｉ）アミノ酸残基５２（Ｌ）、５３（Ｌ）、または５６（Ｆ）以外のヘリックスＢの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または、ｉｖ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合のアミノ酸残基の置換；または、ｖ）アミノ酸残基６２（Ｃ）、６４（Ａ）、６５（Ｌ）、６８（Ｍ）、６９（Ｉ）、７１〜７３（ＦＹＬ）、７６（Ｖ）、７７（Ｍ）、または８０（Ａ）以外のヘリックスＣの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換； または、ｖｉ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または、ｖｉｉ）アミノ酸残基８７（Ｉ）、９１（Ｖ）、９４（Ｌ）、９８（Ｌ）、１０１（Ｌ）、１０５（Ｌ）、または１０８（Ｃ）以外のヘリックスＤの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または、ｖｉｉｉ） アミノ酸残基１１１（Ｆ）、１１２（Ｌ）、または１１４（Ｃ）以外のＤ／Ｅヘリックス間接合の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または、ｉｘ）アミノ酸残基１２０（Ａ）、１２１（Ｖ）、１２４（Ｖ）、１２７（Ａ）、１２８ （Ｆ）、または１３１（Ｌ）以外のヘリックスＥの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または、ｘ）Ｅ／Ｆヘリックス間接合のアミノ酸残基の置換；または、ｘｉ）アミノ酸残基１３６〜１５６（ＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭ（配列番号３６））、１５８（Ｉ）、または１５９（Ｒ）以外のヘリックスＦの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または、ｘｉｉ）ポストヘリックスＦのアミノ酸残基の置換；の内少なくとも１つ含む。これらの領域の境界は図３Ｃで示されている。アミノ酸残基５９のチロシンは、改変（例えば、ＰＥＧ化）の候補である。
幾つかの実施形態において、前項に記載のペプチドのアミノ酸残基の単数若しくは複数の付加、単数若しくは複数の欠失、または、単数若しくは複数の置換は、分子内ジスルフィド結合、またはペプチドの２つの単量体サブユニット間の非共有結合の相互作用を破壊しない。しかし、そのような、単数若しくは複数の付加、単数若しくは複数の欠失、または単数若しくは複数の置換は、おそらく、１つまたはそれ以上の単量体内の非共有結合（例えば、水素結合）を破壊するかもしれないが、そのような破壊は、タンパク質機能に及ぼす治療に関連する影響を有さないはずだということは指摘すべきであろう。他の実施形態において、アミノ酸置換は、保存置換であってもよく、及び／または、アミノ酸置換は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基１２、６２、１０８及び１１４の置換ではない。これらのペプチドの生物活性及び免疫原性は、本明細書で記載する教示に基づき評価され得る。
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載したペプチドの単数若しくは複数の改変を意図し、ここに、単数若しくは複数の改変は、ペプチドのアミノ酸配列を変更しないが（即ち、アミノ酸の置換、付加、または欠失は、ＩＬ−１０の一次アミノ酸配列内に導入されない）、また、単数若しくは複数の改変は、未改変バージョンのペプチドと比較して、ペプチドの少なくとも１つの特性または他の特徴（例えば、薬物動態パラメータまたは効能）を改良若しくは強化する。
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０ペプチドの改変は、治療的に関連する免疫原性のレベルに有害な影響を引き起こさず、更に、他の実施形態において、改変したＩＬ−１０は、非改変ＩＬ−１０よりも免疫原性が低くなる。
本開示は、有益となり得るいかなる改変の導入も意図される。それ故、特定の実施形態において、改変は、ペプチドの少なくとも１つの物理的特性（例えば、溶解性、バイオアベイラビリティ、血清半減期、及び循環時間）を改良する。他の改変は、受容体切断をブロックし、単数若しくは複数のＩＬ−１０受容体に対する親和性を増大させる手段を導入すること（すなわち、ＩＬ−１０分子が長期間、単数若しくは複数の受容体とドッキングするようにオフレートを改変する）を含む。
いくつかの実施形態では、改変はＰＥＧ化であり、改変されたペプチドは、ＰＥＧ−ＩＬ−１０である。ＰＥＧ化ペプチドは、共有結合的にＩＬ−１０の少なくとも１つの単量体の少なくとも１つのアミノ酸残基に結合した少なくとも１つのＰＥＧ分子を含んでもよい。ＰＥＧ分子は、リンカーを介してＩＬ−１０に結合させることができる。リンカーは、以下に詳細に記載する。このようなＰＥＧ化ペプチドは、モノＰＥＧ化、及びジＰＥＧ化ＩＬ−１０の混合物を含んでもよい。「モノＰＥＧ化」または、「ジＰＥＧ化」またはその等価物にたいする本明細書の参照は、モノＰＥＧ化、または、ジＰＥＧ化ＩＬ−１０より幅広く解釈されることを意味する。説明するために、各ＩＬ１０単量体上の２つまたはそれ以上の異なる部位が、１つより多くの変異を導入して改変し、その後、各々を改変する；チロシン５９は、１つまたそれ以上の改変された変異体と組み合わせてＰＥＧ化されてもよく；または、チロシン５９は、Ｎ終端のＰＥＧ化と組み合わせてＰＥＧ化されてもよい。典型的なＰＥＧ化条件は本明細書に記載される。ＰＥＧ成分はペプチドにより許容されるいかなるＰＥＧであってもよい。１例として、改変ペプチドのＰＥＧ成分は、幾つかの実施形態において、５ｋＤａ〜２０ｋＤの分子量を有し；他の実施形態において、２０ｋＤａより大きい分子量を有し；または、尚、他の実施形態において、少なくとも３０ｋＤより大きい分子量を有する。他の分子量値を有するＰＥＧも、本明細書に記載される。
本開示は、非改変ペプチドの特性改良（例えば、マスキング）を含む、望ましい特性を付与するペプチドに対する任意の改変を意図する。いくつかの実施形態では、改変されたペプチドは、Ｆｃ融合分子；血清アルブミン（例えば、ＨＳＡまたはＢＳＡ）、それはＨＳＡ融合分子またはアルブミン複合体の形態であってもよく；またはアルブミン結合ドメインを含む。改変ペプチドは、グリコシル化またはＨｅｓ化されてもよい。前述の詳細な記述は、本開示内の他の個所で説明される。
特定の実施形態では、改変は、部位特異的である。更なる実施形態では、改変はリンカーを含む。いくつかの改変されたＩＬ−１０分子は、１タイプより多くの改変を含んでもよい。本明細書に記載の、改変のタイプとＩＬ−１０ペプチドへのそのような改変を導入する方法は限定されず、当業者は、その他のそのような改変及び方法を想定することができる。
本明細書に記載のペプチドは、組換えにより産生してもよい。本開示は、ペプチドをコード化する核酸分子を意図し、ここに、核酸分子は、生体外で、細胞内で、または生体内で、ペプチドをコード化する核酸分子の発現を与える発現制御エレメントに操作可能に連結できる。ベクター（例えば、ウイルスベクター）は、そのような核酸分子を含んでもよい。更なる実施形態では、形質転換された細胞、または本明細書に記載のペプチドを発現する宿主細胞を伴う。
本開示は、また、本明細書中の教示と併せて遺伝子治療の使用を意図する。遺伝子治療の使用及び方法のために、被験者の細胞は、生体内で本明細書に記載のＩＬ−１０関連ポリペプチドをコード化する核酸で形質転換することができる。或いは、細胞は、導入遺伝子またはポリヌクレオチドで生体外で形質転換し、その後、治療を達成するために、被験者の組織内に移植することができる。更に、初代細胞分離株、または確立された細胞株は、ＩＬ−１０関連ポリペプチドをコード化する導入遺伝子またはポリヌクレオチドで形質転換することができ、その後、場合により、被験者の組織内に移植できる。
本発明のペプチドは、抗体に（特異的にまたは非特異的に）結合する単数若しくは複数のエピトープを含んでもよい。特定の実施形態は、活性化抗体、例えば、これらの受容体を介してＩＬ−１０活性を模擬化する抗ＩＬ−１０Ｒ１／Ｒ２複合抗体を含む。
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよく、例えば、ヒトまたはヒト化であってもよい。実施形態は、分離ポリペプチドに、または単一ポリペプチドに存在する軽鎖変動領域及び重鎖変動領域を含む抗体、または、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の同位体である重鎖定常領域を含む抗体を含む。抗体は、例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖを、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、またはＦａｂ′抗体、または、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体（多量体化することができる）であってもよい。
更なる実施形態において、本開示の抗体は、約１０７Ｍ−１〜約１０１２Ｍ−１の親和性を有するペプチドに結合する。抗体は、脂質部分、脂肪酸部分、多糖部分、及び炭水化物部分から選択される、共有結合で結合した部分を含んでもよい。実施形態は、また、抗体が親和性ドメインを含み、固体支持体上に固定化してもよく、共有結合した、または検出可能に標識化した、非ペプチドポリマー（例えば、ポリ（エチレン）グリコールポリマー）を含むことを意図している。
本開示は、本明細書に記載のペプチドまたは抗体、及び薬学的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含む医薬組成物を包含する。いくつかの実施形態では、賦形剤は、等張性の注射液である。医薬組成物は、被験者（例えば、ヒト）への投与に適切であり得る、そして、１つまたはそれ以上の追加の予防剤または治療薬を含んでもよい。ある実施形態において、医薬組成物は、滅菌容器に含まれる（例えば、単回または複数回使用のバイアルまたは注射器）。キットは、単数若しくは複数の滅菌容器を含んでもよく、そしてキットは、また、少なくとも１つの追加の予防剤または治療薬または薬理学的治療で使用することができる任意の他の薬剤を含む１つまたはそれ以上の追加の滅菌容器を含むことができる。そのような態様の例は、本明細書に記載される。
本開示の更なる実施形態は、本明細書に記載のペプチドの治療上有効量を投与することを含む、被験者（例えば、ヒト）の疾患、障害、または状態を治療し、予防する方法を含む。更なる実施形態は、本明細書に記載の抗体の治療上有効量を投与することを含む、被験者（例えば、ヒト）の疾患、障害、または状態を治療し、予防する方法を含む。本開示の様々な実施形態において、疾患、障害または状態は、癌または癌関連の疾患（例えば、固形腫瘍または血液障害）を含む増殖性疾患；肝硬変、ＮＡＳＨ及びＮＡＦＬＤなどの線維性疾患；炎症性腸疾患、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、及びアルツハイマー病を含む免疫性または炎症性疾患；凝固亢進の状態を含む血栓症または血栓性状態または疾患；線維性疾患；ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、及びサイトメガロウイルスを含むが、それに限定されないウイルス性疾患；アテローム性動脈硬化症または他の心血管関連疾患を含む心血管障害であり、ここに、被験者は、コレステロール及び／または他の異常な代謝関連パラメータ（例えば、異常な血糖値、インスリンレベル、または脂質レベル）を上昇させているかもしれない。
疾患、障害または状態を治療し、または予防する方法にいおいて、本明細書に記載のペプチド（または抗体）の治療上有効量を投与することは、非経口（例えば、皮下に）注入を含むペプチド（または抗体）のための任意の適切な経路によるものであってもよい。１つまたはそれ以上の追加の予防剤または治療薬は、ペプチド（または抗体）と共に（例えば、前に、同時に、またはそれに続けて）投与されてもいいか、及び／または、それは、ペプチド（または抗体）と分離して、または組み合せて投与してもよい。
ヒトＩＬ−１０単量体のタンパク質結晶構造のリボン表現（平面図）である。６個のヘリックスは、Ａ〜Ｆと標識されている。 ヒトＩＬ−１０単量体のタンパク質結晶構造のリボン表現（側面図）である。６個のヘリックスは、Ａ〜Ｆと標識されている。 ヒトＩＬ−１０ホモ二量体のタンパク質結晶構造のリボン表現（平面図）である。１つの単量体は灰色であり、他は黒である。６個のヘリックスは、Ａ〜Ｆと標識されている。 ヒトＩＬ−１０ホモ二量体のタンパク質結晶構造のリボン表現（側面図）である。１つの単量体は灰色であり、他は黒である。 完全な１７８個のアミノ酸のヒトＩＬ−１０配列（配列番号１）を表す。１８個のアミノ酸のシグナルペプチドに下線を付している。 １６０個のアミノ酸成熟ヒトＩＬ−１０配列（配列番号２）を表す。 ヘリックスＡ〜Ｆに対応する領域、ループのそれぞれに対応する領域、及びキンクの領域／位置を示す成熟ヒトＩＬ−１０アミノ酸配列を示す。 ２つのヒトＩＬ−１０Ｒ１／α受容体（黒）に結合されたヒトＩＬ−１０ホモ二量体（灰色）のタンパク質結晶構造のリボン表現（平面図）である。 ２つのヒトＩＬ−１０Ｒ１／α受容体（黒）に結合したヒトＩＬ−１０ホモ二量体（灰色）のタンパク質結晶構造のリボン表現（側面図）である。 成熟ヒトＩＬ−１０アミノ酸配列のアミノ酸残基は、ＰＥＧ化のための候補であることを図示する。
本開示をさらに説明する前に、本開示が本明細書に記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、限定することを意図するものではないことを理解すべきである。
値の範囲が提供される場合、上限と下限の間で明記した任意の値、または介在値で、文脈が明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までその各々の値に含まれることは、本発明に包含されると理解されるであろう。小さい範囲の上限及び下限は、独立して、小さい範囲に含まれてもよく、そして、また、本発明内に包含し、記載した範囲で、いずれか具体的に排除した限界に従う。指示した範囲が、１つまたは両方の限界を含む場合、いずれか一方または両方に含まれる限界を除外する範囲も、また、本発明に含まれる。特に指示のない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により、共通して理解される同一の意味を有する。
本明細書、及び添付の特許請求範囲で使用される、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に指示のない限り、複数の参照も含むことを指摘しなければならない。さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように起草されてもよいことに留意されたい。このように、この文章は、特許請求範囲の要素の列挙、または「負」の限界の使用に関連して、「単に」、「のみ」などの用語使用が、排除的用語使用の先行詞として提供されることを意図する。
本明細書で論じる刊行物は、本出願の出願日前の開示のためにのみ提供されている。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日と異なるかもしれず、それは、独立して確認する必要があり得る。
総説
本開示は、変異体ＩＬ−１０分子（例えば、ムテイン）及び他のＩＬ−１０関連分子、並びに、その同定及びその使用を意図する。本明細書に記載されるように、ＩＬ−１０分子は、例えば、天然のヒトＩＬ−１０の、半減期の延長などの特性を増強するように改変することができる。特定のＩＬ−１０分子は、ヒトＩＬ−１０に対して比較可能な免疫原性、及び／または、ヒトＩＬ−１０に対して少なくとも比較可能な生物活性、及び／または、少なくとも１つの特性（例えば、溶解性、バイオアベイラビリティ、血清半減期、及び循環時間などの物理的特性）の改良を有する。
従って、例えば、ｈＩＬ−１０と同等の免疫原性を有するが、ｈＩＬ−１０よりも実質的に低い生物活性を有するＩＬ−１０分子は、本明細書に包含される。当業者は、そのような分子が治療のために実行可能な、例えば、非常に長い半減期であってもよいことを認識するであろう。本明細書で記載したＩＬ−１０分子、及びその組成物（例えば、医薬組成物）は、例えば、炎症性、及び、免疫関連疾患、線維性疾患、癌及び癌関連障害、及び心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）を含む様々な疾患、障害及び状態、及び／または、その症状を治療し、及び／または、予防するために使用してもよい。
本開示のポリペプチド及び核酸分子に関連した「ヒト」へのいかなる参照も、ポリペプチドまたは核酸が得られる方法、または源に関して限定されるものではなく、むしろ、それは、天然に存在するヒトポリペプチドまたは核酸分子の配列に対応することができるように配列を参照するのみであることを指摘すべきであろう。ヒトポリペプチド及びそれらをコード化する核酸分子に加えて、本開示は、ＩＬ−１０関連ポリペプチド、及び他の種由来の対応する核酸分子を意図する。
定義
特に指示のない限り、以下の用語は、以下に示す意味を有することを意図する。他の用語は、明細書を通して他の場所で定義される。
用語「患者」または「被験者」は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）を指すために互換的に使用される。
用語「投与」、「投与する」などは、それらが、例えば、被験者、細胞、組織、器官、または生物学的流体に適用されるとき、例えば、ＩＬ−１０またはＰＥＧ−ＩＬ−１０、核酸（例えば、天然ヒトＩＬ−１０をコード化する核酸）、前述を含む医薬組成物または診断薬と、被験者、細胞、組織、器官または生物学的流体との接触を意味する。細胞の文脈上では、投与は、試薬の細胞への接触（例えば、生体外、または生体内での）並びに、流体が細胞と接触しているところでは、試薬の流体への接触を含む。
用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、疾患、障害、または状態、若しくはその症状が診断され、観察された後、一時的に、または、恒久的に、被験者が病む疾患、障害、または状態、若しくはその症状に関連する少なくとも１つの症候を除去し、低減し、抑制し、または改善するために、始まる行動（ＩＬ−１０またはＩＬ−１０を含む医薬組成物の投与など）のコースを意味する。したがって、治療は、活性疾患を予防すること（例えば、疾患、障害または状態、若しくはそれに関連する臨床症候の発症、または更なる発症を阻止する）を含む。用語は、また、ＩＬ−１０またはＰＥＧ−ＩＬ−１０が、例えば、流体相またはコロイド相におけるＩＬ−１０受容体に接触するそのような状況など他の文脈で使用することもできる。
本明細書で使用する「治療を必要とする」という用語は、被験者が必要としているか、または治療から恩恵を受けるかを、医師または他の介護者が下す判断を指す。この判断は、医師か、介護者の専門知識の領域にある様々な要因に基づいて行われる。
用語「予防する」、「予防すること」、「予防」などは、一般的に、特定の疾患、障害、または状態を有することを事前に把握された被験者の文脈で、一時的、または、恒久的のいずれかで、疾患、障害、状態などを発症させる被験者のリスクを予防し、抑制し、または低減し、またはその開始を遅延する（例えば、臨床症状の非存在を決定することにより）ための（例えば、疾患、障害、状態またはその症候の開始に先立つ）方法で開始する行動（ＩＬ−１０またはＩＬ−１０を含む医薬組成物を投与することなど）のコースを意味する。ある例においては、この用語は、また、疾患、障害または状態の進行を遅らせるか、有害またはそうでなければ望ましくない状態へのその進行を阻害することを意味する。
本明細書で使用する「予防を必要とする」という用語は、被験者が必要としているか、予防ケアの恩恵を受けるであろうと、医師または他の介護者が下す判断を指す。この判断は、医師か、介護者の専門知識の領域にある様々な要因に基づいて行われる。
語句「治療有効量」は、単独で、または医薬組成物の一部として、また、単回用量または一連の用量の一部としてのいずれかで、被験者に投与した場合に、疾患、障害または状態の任意の症状、態様、または特徴に、任意の検出可能な積極的効果を有することができる量で、被験体に薬剤を投与することを意味する。治療上有効な量は、関連する生理学的効果を測定することにより確認することができ、そしてそれは、投与計画及び被験者の状態の診断分析などと連結して調整することができる。一例として、投与後に産生される炎症性サイトカインの量の測定は、治療上有効量が使用されたかどうかを示すことができる。
「変化をもたらすのに十分な量」という語句は、特定の療法の投与前（例えば、ベースラインレベル）と投与後に測定された指標のレベルとの間の検出可能な差異があることを意味する。指標としては、客観パラメータ（例えば、ＩＬ−１０の血清濃度）または主観的なパラメーター（例えば、被験者の幸福感覚）のいずれかが挙げられる。
用語「小分子」は、約１０ｋＤａ未満、２ｋＤａの約未満、または約１ｋＤａ未満の分子量を有する化学化合物を指す。小分子としては、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射性原子を含む分子、合成分子が挙げられるが、それに限定されない。治療的に、小分子は、細胞に対してより透過性があり、劣化の影響を受けにくく、大きな分子より免疫応答を誘発する可能性が低いことがあり得る。
用語「リガンド」は、例えば、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる、ペプチド、ポリペプチド、膜会合若しくは膜結合分子、またはその複合体を意味する。「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えば、サイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、ムテイン、及び抗体に由来する結合組成物、並びに、例えば、サイトカインのペプチド模倣物及び抗体のペプチド模倣物を包含する。この用語は、また、その生物学的特性、例えば、シグナル伝達または接着に特異的に影響を与えることなく、受容体に結合することができる、アゴニストでもアンタゴニストでもない物質を包含する。また、この用語は、膜結合リガンドの可溶性バージョンに、例えば、化学的または組換え法により、変更された膜結合リガンドを含む。リガンドまたは受容体は、完全に細胞内であってもよく、即ち、それは、細胞質ゾル、核に存在し、またはいくつかの他の細胞内区画に存在してもよい。リガンド及び受容体の複合体は、「リガンド−受容体複合体」と呼ばれる。
用語「阻害体」及び「アンタゴニスト」または「活性体」及び「アゴニスト」は、例えば、リガンド、受容体、補因子、遺伝子、細胞、組織または器官の活性化のために、例えば、それぞれ、阻害または活性化する分子を意味する。阻害体は、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、または細胞を、減少させ、ブロックし、防止し、活性化を遅延させ、不活性化させ、感度を下げ、または、下方に調節する分子である。活性体は、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、または細胞を、増加させ、活性化させ、助長し、活性化を強化し、感度を上げ、または上方に調節する分子である。阻害剤は、また、構成的活性を低下させ、ブロックし、またはを不活性化する分子として定義することができる。「アゴニスト」は、標的活性化の上昇を発生させ、または、促進するために、標的と相互作用する分子である。「アンタゴニスト」は、アゴニストの単数または複数の作用に対向する分子である。アンタゴニストは、アゴニストの作用を、防止し、減少させ、阻害し、または中和し、そして、アンタゴニストは、また、例えば、識別されたアゴニストがない場合でも、標的受容体の構成的活性を妨害、阻止、または低下させることができる。
用語「調節する」、「調節」などは、ＩＬ−１０分子（または、それらをコード化する核酸分子）の機能または活性を、直接的に、または、間接的に、上昇させ、または低下させるため；またはＩＬ−１０分子のそれと匹敵する効果を産生するために分子の能力を強化するための、分子（例えば、活性体または阻害体）の能力を意味する。用語「モジュレーター」は、上記の活動に影響を与えることができる分子を広く参照することを意味する。一例として、例えば、遺伝子、受容体、リガンド、または細胞のモジュレータは、遺伝子、受容体、リガンド、または細胞の活性を変化させる分子であり、ここで活性は、その調節特性を活性化させ、抑制し、または変化させることが可能である。モジュレーターは、単独で作用し得るか、または、それは、補因子、例えば、タンパク質、金属イオン、または小分子を使用することができる。用語「モジュレーター」は、ＩＬ―１０と同じ作用機序を介して動作する物質（即ち、それと類似の手法でＩＬ−１０と同一のシグナル伝達経路を調節する物質）を含み、そしてＩＬ−１０のそれと匹敵する（またはより大きい）生物学的応答を誘発することができる。
モジュレーターの例としては、小分子化合物及び他の生物有機分子が含まれる。分子化合物（例えば、コンビナトリアルライブラリー）の多数のライブラリーが市販されており、調節因子を同定するための出発点として役立つことができる。当業者は、１つまたは複数のアッセイ（例えば、生化学的または細胞を基礎とするアッセイ）を開発することができ、ここで、そのような化合物ライブラリーは、望ましい特性を有する１つまたはそれ以上の化合物を同定するためにスクリーニングすることができる。その後、医薬化学品の当業者は、例えば、その類似体及び誘導体を合成し、並びに、評価することにより、そのような１つまたはそれ以上の化合物を最適化することができる。合成及び／または分子モデリングの研究は、また、活性体の同定に利用することができる。
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体に対する分子の結合；触媒的活性；遺伝子の発現または細胞のシグナル伝達、分化または成熟を刺激する能力；抗原活性；他分子の活性の調節などを表すか、意味する。この用語は、また、細胞間相互作用（例えば、接着）を調節し、または維持することにおける活性度、または細胞（例えば、細胞膜）構造の維持における活性度を意味する。「活性度」は、また、特定の活性度、例えば、［触媒活性度］／［ｍｇ：タンパク質］、または、［免疫学的活性度］／［ｍｇ：タンパク質］、生物学的区画における濃度などを意味することができる。用語「増殖活性」は、例えば、正常な細胞分裂、並びに、癌、腫瘍、異形成、細胞の形質転換、転移、及び血管形成を促進し、そのために必要な、または特異的に関連する活性を包含する。
本明細書で使用する場合、「匹敵する」、「同等の活性」、「匹敵する活性」、「同等の効果」、「匹敵する効果」などは、定量的、及び／または、定性的に表示できる相対的な用語である。用語の意味は、それらが使用される文脈にしばしば依存する。例を用いて、両方が受容体を活性化する二つの物質は、定性的な観点から同等の効果を持つと見なすことができるが、しかし、１つの物質が当該分野で認められたアッセイ（例えば、用量応答アッセイ）、または当該分野で認められた動物モデルにおいて決定される他の物質の活性の２０％しか達成することができなければ、２つの薬剤は、定量的観点から同等の効果を欠いていると見なすことができる。その１つの結果を別の結果（例えば、参照標準に対する１つの結果）と比較すると、「匹敵する」は、（常にではないが）、しばしば、１つの結果が、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満。または１％未満参照標準から外れていることを意味する。特定の実施形態において、それが参照標準の１５％未満、または１０％未満、または５％未満外れている場合、１つの結果は、参照標準に匹敵する。例として、しかし限定するものではないが、活性または効果は、有効性、安定性、溶解性、または免疫原性を指す場合もある。先に示したように、当業者は、別の方法を使用することが、ｈＩＬ−１０の参照標準より−タンパク質濃度の計算における差異に起因する見かけ上の活性、または現実の活性のいずれかで−多かれ少なかれ活性になっているＩＬ−１０をもたらし得ることを認識する。当業者は、ＩＬ−１０分子対ｈＩＬ−１０の相対的な生物活性を決定する上で、これらの違いを考慮にすることができるようになる。
細胞、組織、器官、または、生物の「応答」という用語は、例えば、生化学的または生理学的挙動、例えば、濃度、密度、接着、または、生物学的区画内での移動、遺伝子発現の速度、または分化の状態の変化を包含し、ここで、変化は、活性化、刺激、若しくは、処置、またはそのような遺伝的プログラミングなどの内部機構と相関している。ある文脈における、用語「活性化」、「刺激」などは、内部機構により、並びに、外部または環境要因により調節される細胞活性化を意味し、一方、用語「阻害」、「下方調整」などは、逆の効果を意味する。
用語、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に用い、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、ここで、それは、遺伝的にコード化された、及び、非遺伝的にコード化されたアミノ酸、化学的、または、生化学的に改変、または、誘導されたアミノ酸、及び改変されたポリペプチド骨格を有するポリペプチドを含む。この用語は、異種のアミノ酸配列を有する融合タンパク質；Ｎ終端にメチオニン残基を有する、または、有しない異種及び同質のリーダー配列を有する融合タンパク質；免疫原性のタグを付けたタンパク質などを含む融合タンパク質が挙げられるが、それに限定されない。
本明細書で使用する場合、用語「変異体」及び「相同体」は、それぞれ、参照アミノ酸または核酸配列に類似したアミノ酸またはＤＮＡ配列を表すために、相互交換可能に使用される。この用語は、天然に存在する変異体及び天然に存在しない変異体を包含する。天然に存在する変異体は、（１つの種から他の種へアミノ酸またはヌクレオチド配列がそれぞれ異なるポリペプチド及び核酸）の相同体、及び（１個体から種内の別の個体へ、それぞれアミノ酸またはヌクレオチド配列が異なるポリペプチド及び核酸）の対立遺伝子変異体を含む。このように、変異体及び相同体は、自然に発生するＤＮＡ配列、及び、それによりコード化されるタンパク質及びそのアイソフォーム、並びに、タンパク質または遺伝子のスプライスバリアントを包含する。この用語は、また、天然に存在するＤＮＡ配列からの１つまたはそれ以上の塩基が変化するが、それでも遺伝コードの縮重に基づき天然に存在するタンパク質に対応するアミノ酸配列に翻訳する核酸配列を包含する。非天然に存在する変異体及び相同体は、アミノ酸またはヌクレオチド配列の変化をそれぞれ含むポリペプチド及び核酸を含み、ここで配列の変化は、人工的に導入され（例えば、ムテイン）、変化はヒトの介入（「人の手」）により実験室内で発生する。従って、非天然の変異体及び相同体は、１つまたはそれ以上の保存置換、及び／または、タグ、及び／または、複合体により、天然に存在する配列とは異なるものを意味する。
本明細書で使用される用語「ムテイン」は、突然変異した組換えタンパク質を広く意味する。これらのタンパク質は、通常、単一または複数のアミノ酸置換を運び、部位指向的に、または、ランダム突然変異誘発的に、または、完全な合成遺伝子から実施されるクローン化された遺伝子に、しばしば、由来する。特に指示のない限り、「ＩＬ−１０の突然変異体」などの用語の使用は、ＩＬ−１０ムテインを意味する。
用語「ＤＮＡ」、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」などは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドポリマーの形態を意味ために、明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドの非限定の例としては、直鎖状及び環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマーなどが挙げられる。
なお、本開示全体を通して、１文字または３文字のコードに応じたアミノ酸の参照がなされることを理解するであろう。読者の便宜のために、１文字及び３文字のアミノ酸コードを以下に提供する。
Ｇ グリシン Ｇｌｙ Ｐ プロリン Ｐｒｏ
Ａ アラニン Ａｌａ Ｖ バリン Ｖａｌ
Ｌ ロイシン Ｌｅｕ Ｉ イソロイシン Ｉｌｅ
Ｍ メチオニン Ｍｅｔ Ｃ システイン Ｃｙｓ
Ｆ フェニルアラニン Ｐｈｅ Ｙ チロシン Ｔｙｒ
Ｗ トリプトファン Ｔｒｐ Ｈ ヒスチジン Ｈｉｓ
Ｋ リシン Ｌｙｓ Ｒ アルギニン Ａｒｇ
Ｑ グルタミン Ｇｌｎ Ｎ アスパラギン Ａｓｎ
Ｅ グルタミン酸 Ｇｌｕ Ｄ アスパラギン酸 Ａｓｐ
Ｓ セリン Ｓｅｒ Ｔ トレオニン Ｔｈｒ
天然のヒトＩＬ−１０またはＩＬ−１０ムテインの参照で本明細書中で使用される通り、用語「改変された」、「改変」などは、ヒトＩＬ−１０またはＩＬ−１０ムテインの望ましい特性を向上させる１つまたはそれ以上の変化を指す。このような望ましい性質は、例えば、検出アッセイでの使用のために、循環半減期を延長すること；安定性を上昇させること；クリアランスを低下させること；免疫原性またはアレルゲン性を変化させること；及び特定の抗体の育成を可能にすること（例えば、新規なエピトープの導入により）を含む。以下に詳細に議論する通り、実施され得るヒトＩＬ−１０またはＩＬ−１０ムテインは、ＰＥＧ化（１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）またはその誘導体との共有結合）；グリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）、ポリシアリル化及びＨＥＳ化；アルブミン融合；例えば、共役脂肪酸鎖を介在したアルブミン結合（アシル化）；Ｆｃ−融合；及びＰＥＧ擬態との融合を含むが、それに限定されない。いくつかの実施形態では、リンカーは、このような改変に使用され、以下に記載される。
ポリペプチド構造の文脈で本明細書で使用するとき、「Ｎ終端」（または「アミノ終端」）及び「Ｃ終端」（または「カルボキシル終端」）は、ポリペプチドの最末端のアミノ、及び、カルボキシル端部をそれぞれ意味し、一方、用語「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」は、それぞれＮ終端及びＣ終端に向かう、ポリペプチドのアミノ酸配列内の相対的な位置を意味し、Ｎ−終端及びＣ−終端での残基をそれぞれ含めることができる。「すぐＮ末端」または「すぐＣ末端」は、連続したアミノ酸配列を提供するために、第一及び第二のアミノ酸残基が共有結合した、第二のアミノ酸残基に対する第一のアミノ酸残基の位置を指す。
アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列（例えば、ＩＬ−１０ポリペプチド「由来の」アミノ酸配列）の文脈において「由来する」は、ポリペプチドまたは核酸は、対照ポリペプチドまたは核酸（例えば、天然に産生するＩＬ−１０ポリペプチド、またはＩＬ−１０をコード化する核酸）の配列に基礎を置く配列を有することを示すことを意味し、タンパク質または核酸が作られた源または方法を限定することを意味しない。一例として、「由来する」という用語は、対照アミノ酸配列または対照ＤＮＡ配列の相同体または変異体を含む。
ポリペプチドの文脈において、「単離された」という用語は、天然に存在する場合、それが天然に存在し得るとは異なる環境にある目的のポリペプチドを指す。「単離された」は、対象のポリペプチドのために実質的に濃縮された、及び／または、対象のポリペプチドを、部分的または実質的に精製したサンプル内にあるポリペプチドを含むことを意味する。ポリペプチドは、天然に存在しない場合、「単離された」は、ポリペプチドが、それが合成または組換え手段のいずれかにより作製された環境から分離されたことを示す。
「濃縮された」は、対象のポリペプチドが、ａ）生物学的サンプル（例えば、ポリペプチドが天然に発生する、または投与後それが存在するサンプル）などの出発サンプルのポリペプチド濃度より大きい濃度（例えば、少なくとも３倍より大きく、少なくとも４倍より大きく、少なくとも８倍より大きく、少なくとも６４倍より大きく、またはそれ以上に）で、または、ｂ）ポリペプチドが作られる環境（例えば、細菌セル）より高濃度で存在するように、サンプルは非天然的に（例えば、科学者により）操作されたことを意味する。
「実質的に純粋な」は、構成成分（例えば、ポリペプチド）が、組成物の総含有量の約５０％より大きく、及び、一般的には、全ポリペプチド含有量の約６０％より大きく占めることを示している。より一般的には、「実質的に純粋な」は、組成物全体の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％以上が対象の構成成分である組成物を意味する。いくつかの場合において、ポリペプチドは、組成物の総含有量の約９０％より大きく、または約９５％よりも大きく占めるようになる。
用語「特異的に結合する」または「選択的に結合する」が、リガンド／受容体、抗体／抗原、または他の結合対を意味する場合、タンパク質の異質集団及び他の生物学的製剤においてタンパク質の存在を決定する結合反応を示す。従って、指定された条件の下で、特定のリガンドは、特定の受容体に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に有意な量では結合しない。意図された方法による、抗体、または抗体の抗原結合部位に由来する結合組成物は、その抗原、または変異体、またはムテインに、他の抗体、またはそれから誘導される結合組成物の有する親和性より、少なくとも２倍大きく、少なくとも１０倍大きく、少なくとも２０倍大きく、または少なくとも１００倍大きい親和性を有して結合する。特定の実施形態において、抗体は、例えば、スキャッチャード分析によって決定されるように、約１０９Ｌ／ｍｏｌよりも大きい親和性を有するであろう（Ｍｕｎｓｅｎ， ｅｔ ａｌ． １９８０ Ａｎａｌｙｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０７：２２０−２３９）。
ＩＬ−１０及びＰＥＧ−ＩＬ−１０
また、ヒトのサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）として知られている抗炎症性サイトカインＩＬ−１０は、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２、ＩＬ−２４（Ｍｄａ−７）、及びＩＬ−２６、インターフェロン（ＩＦＮ−α、−β、−γ、−δ、−ε、−κ、−Ω、及び−τ）、及びインターフェロン様分子（リミチン、ＩＬ−２８Ａ、ＩＬ−２８Ｂ、及びＩＬ−２９）を含む、タイプ（クラス）−２サイトカイン、１セットのサイトカインとして分類されている。
ＩＬ−１０は、免疫調節と炎症において多面的な効果を有するサイトカインである。それは、アレルギー反応の部位に存在する炎症性効果を抑える肥満細胞により産生される。それは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＴＮＦα及びＧＭ−ＣＳＦなどの炎症誘発性サイトカインの合成を阻止できるが、ＩＬ−１０は、また、特定のＴ細胞及び肥満細胞に対して刺激的であり、そしてＢ細胞の成熟、増殖、及び抗体産生を刺激する。ＩＬ−１０は、ＮＦ−κＢ活性をブロックすることができ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の調節に関与している。それは、また、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性及びＢ細胞の抗体産生を誘導し、それはマクロファージ活性及び腫瘍促進炎症を抑制する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の調節は、より高い用量がより強い細胞傷害性応答を誘導しており、用量依存的である。
ヒトＩＬ−１０は、３７ｋＤａの分子量を有するホモ二量体であり、ここに、それぞれ１８．５ｋＤａの単量体は、１７８個のアミノ酸を含み、その内初めの１８個は、シグナルペプチドを含み、及び２対のシステイン残基は、２つの分子内ジスルフィド結合を形成する。成熟ｈＩＬ−１０の各単量体は、１６０個のアミノ酸残基を含む。ＩＬ−１０二量体は、２つの単量体サブユニット間の非共有結合相互作用の破壊時に生物学的に不活性となる。図３Ａは、完全な１７８個のアミノ酸のヒトＩＬ−１０配列（１８個のアミノ酸シグナルペプチドは下線が引かれている）を図示し、図３Ｂは、１６０個のアミノ酸成熟ヒトＩＬ−１０配列を図示する。
本開示は、８０％の相同性を示すヒトＩＬ−１０及びマウスＩＬ−１０、及びその使用を意図する。更に、本開示の範囲は、ラット（アクセッションＮＰ＿０３６９８６．２；ＧＩ１４８７４７３８２）、ウシ（アクセッションＮＰ＿７７６５１３．１；ＧＩ４１３８６７７２）、ヒツジ（アクセッションＮＰ＿００１００９３２７．１；ＧＩ５７１６４３４７）、イヌ（アクセッションＡＢＹ８６６１９．１；ＧＩ１６６２４４５９８）、ウサギ（アクセッションＡＡＣ２３８３９．１；ＧＩ３２４２８９６）を含む、他の哺乳動物種から、そのＩＬ−１０相同分子種及びその改変形態を含む。
ＩＬ−１０受容体、ＩＩ型サイトカイン受容体は、また、それぞれＲ１とＲ２と呼ばれるα及びβサブユニットからなる。受容体の活性化は、α及びβの両方に結合することが必要である。ＩＬ−１０ポリペプチドの１つのホモ二量体は、αに結合し、同じＩＬ−１０ポリペプチドの他のホモ二量体は、βに結合する。
組換えヒトＩＬ−１０の有用性は、しばしば、血流における、例えば、腎クリアランス、タンパク質分解、受容体媒介取り込み及び単量体化に起因し得る相対的に短い血清半減期によって制限される。その結果、様々なアプローチによって、その二量体構造を破壊し、その結果、その活性に悪影響を与えることがないように、ＩＬ−１０の薬物動態プロファイルを改善されている。ＩＬ−１０のＰＥＧ化は、ある薬物動態パラメータ（例えば、血清半減期）の改善、及び／または、活性の強化をもたらす。例えば、本開示の特定の実施形態は、ＰＥＧ化ＩＬ−１０ムテインで増殖性疾患（例えば、癌）の治療を最適化する方法を含む。
先に示したように、本開示は、また、本明細書中の教示と併せて、遺伝子治療の使用を意図する。遺伝子治療は、新規遺伝子を導入するために、既存の遺伝子の追加のコピーを導入するために、既存の遺伝子の機能を損なうために、または、存在するが、非機能である遺伝子を修復するために、被験者内の内因性細胞に、通常、ベクター内に包装された遺伝物質を送達することにより達成される。細胞内で一度、核酸は細胞機構により発現し、目的のタンパク質の産生をもたらす。本発明の文脈において、遺伝子治療は、本明細書に記載の疾患、障害または状態の治療または予防において使用するためのＩＬ−１０剤をコード化する核酸を送達するための治療薬として使用される。
上記で言及したように、遺伝子治療の使用及び方法のために、被験者の細胞は、生体内で本明細書に記載のＩＬ−１０関連ポリペプチドをコード化する核酸で形質転換することができる。あるいは、細胞は、導入遺伝子またはポリヌクレオチドで生体外で形質転換し、その後、治療を達成するために、被験者の組織に移植することができる。更に、初代細胞分離株、または確立された細胞株は、導入遺伝子、または、ＩＬ−１０関連ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドで形質転換し、その後、場合により被験者の組織に移植することができる。
本明細書で使用する場合、用語「ＰＥＧ化ＩＬ−１０」及び「ＰＥＧ−ＩＬ−１０」は、一般的に、結合が安定するように、リンカーを介してＩＬ−１０タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合で結合する１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール分子を有するＩＬ−１０分子を指す。用語「モノＰＥＧ化−ＩＬ−１０」及び「モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０」は、１つのポリエチレングリコール分子が、一般的に、リンカーを介して、ＩＬ−１０二量体のサブユニット上の単一アミノ酸残基に共有結合で結合されていることを示す。ある実施形態では、本開示で使用されるＰＥＧ−ＩＬ−１０は、１〜９個のＰＥＧ分子が、ＩＬ−１０二量体の１つのサブユニットのＮ−終端でアミノ酸残基のα−アミノ基にリンカーを介して共有結合で結合されるモノＰＥＧ−ＩＬ−１０である。リンカーは、下記で更に記載する。
１つのＩＬ−１０サブユニット上でのモノＰＥＧ化は、一般的に、サブユニットのシャッフリングに起因して、非ＰＥＧ化、モノＰＥＧ化及びジＰＥＧ化ＩＬ−１０の不均質な混合物をもたらす。また、ＰＥＧ化反応が完全に進行することを可能にすることは、一般的に、非特異的及びマルチＰＥＧ化ＩＬ−１０をもたらし、その結果、その生物活性を低下させることになる。従って、本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の方法により産生したモノ及びジＰＥＧ化ＩＬ−１０の混合物の投与を含む。先に示したように、本明細書中で、「モノＰＥＧ化」または「ジＰＥＧ化」、またはその同等物への言及は、単にモノＰＥＧ化、ジＰＥＧ化ＩＬ−１０よりも広く解釈されることを意味する。従って、それぞれのＩＬ−１０単量体上の２つまたはそれ以上の異なる部位は、１つ以上の変異を導入し、その後、それらの各々を改変することにより、改変されるかもしれない。更なる例として、チロシン５９は、１つまたはそれ以上の改変された変異体と組み合わせてＰＥＧ化されるかもしれないか、またはチロシン５９は、Ｎ終端のＰＥＧ化と組み合わせてＰＥＧ化される可能性がある。典型的なＰＥＧ化の条件は、例えば、実験の項に記載されている。
特定の実施形態では、ＰＥＧ部分の平均分子量は、約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの間である。例えば、ＰＥＧ部分は、約５ｋＤａより大きく、約１０ｋＤａより大きく、約１５ｋＤａより大きく、約２０ｋＤａより大きく、約３０ｋＤａより大きく、約４０ｋＤａより大きく、または約５０ｋＤａよりも大きい分子量を有してもよい。いくつかの実施形態では、分子量は、約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、約１０ｋＤａ〜約２５ｋＤａ、または約１０ｋＤａ〜約３０ｋＤａである。本開示は、特異的な方法の使用、または、ＩＬ−１０へのＰＥＧの結合部位の使用を必要としないが、ＰＥＧ化がＩＬ−１０分子の活性を変更せず、または最小限変更することは、しばしば有利となる。ある実施形態では、半減期の上昇の影響は、生物活性の低下の影響よりも大きい。ＰＥＧ−ＩＬ−１０の生物学的活性は、一般的には、Ｕ.Ｓ.７,０５２,６８６に記載されているように、細菌抗原（リポ多糖類（ＬＰＳ））でチャレンジし、ＰＥＧ−ＩＬ−１０で処理した被験者の血清中の炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γ）のレベルを評価することにより測定する。
ＩＬ−１０変異体は、血清半減期の上昇；ＩＬ−１０に対する免疫応答の低下；精製または調製の支援；ＩＬ−１０のその単量体サブユニット内への転換の減少；治療効果の改善；及び治療使用中の副作用の重症度または発生の低減化を含む、様々な目的を念頭に置き調製できる。いくつかは、翻訳後変異体、例えば、グリコシル化変異体であり得るが、アミノ酸配列変異体は、通常、天然に見出されない変異体を事前決定している。ＩＬ−１０のいずれかの変異体は、それがＩＬ−１０活性の適切なレベルを維持するならば、使用できる。腫瘍に関連して、適切なＩＬ−１０活性は、例えば、腫瘍部位へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤、それらの浸潤細胞から、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＲＡＮＫ−Ｌなどの炎症性サイトカインの発現、及び生物学的サンプル中のＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γの上昇レベルを含む。
用語「保存的アミノ酸置換」は、類似の酸性度、塩基性度、電荷、極性を有する側鎖、または、類似の側鎖サイズを有するアミノ酸で、タンパク質の単数若しくは複数のアミノ酸を置換することにより、タンパク質の活性を保存する置換を参照する。保存的アミノ酸置換は、一般に、以下のグループ内のアミノ酸残基の置換を伴う：１）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ；２）Ｒ、Ｋ；３）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ；４）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ；５）Ｑ、Ｎ；及び６）Ｄ、Ｅ。置換、挿入、または欠失のための指針は、異なる変異体タンパク質、または、異なる種からのタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づくことができる。従って、任意の天然に存在するＩＬ−１０ポリペプチドに加えて、本発明は、置換が、通常、保存的アミノ酸置換である場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個、通常、せいぜい２０、１０または５個のアミノ酸置換を有することを意図する。場合により、１つまたはそれ以上の非天然アミノ酸は、部位特異的結合を促進する手段として、ＩＬ−１０に導入してもよいことに留意すべきである。
本開示は、また、成熟ＩＬ−１０に由来する連続したアミノ酸残基を含む成熟ＩＬ−１０の活性フラグメント（例えば、部分配列）を意図する。ペプチドまたはポリペプチドの部分配列の連続したアミノ酸残基の長さは、部分配列が由来する特定の天然に存在するアミノ酸配列に依存して変化する。一般的に、ペプチドまたはポリペプチドは、約２０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約４０アミノ酸〜約６０アミノ酸、約６０アミノ酸〜約８０アミノ酸、約８０アミノ酸〜約１００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸〜約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸〜約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１５５アミノ酸、約１５５アミノ酸〜ペプチドまたはポリペプチド全長であってもよい。
更に、ＩＬ−１０ポリペプチドは、連続したアミノ酸（例えば、「比較ウィンドウ」）の定義された長さにわたって参照配列と比較して、定義された配列同一性を有することができる。比較のための配列のアラインメントの方法は当該分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ （１９８１）に記載のローカル相同性アルゴリズムにより；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０）に記載の相同性アラインメントアルゴリズムにより；Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８）に記載の類似法の探索により；これらのアルゴリズム（ＧＡＰ， ＢＥＳＴＦＩＴ， ＦＡＳＴＡ， ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）のコンピュータでの実行により；または、手動アラインメント及び目視検査により実施できる（参照：例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ））。
例として、適切なＩＬ−１０ポリペプチドは、約２０アミノ酸〜約４０アミノ酸、約４０アミノ酸〜約６０アミノ酸、約６０アミノ酸〜約８０アミノ酸、約８０アミノ酸〜約１００アミノ酸、約１００アミノ酸〜約１２０アミノ酸、約１２０アミノ酸〜約１４０アミノ酸、約１４０アミノ酸〜約１５０アミノ酸、約１５０アミノ酸〜約１５５アミノ酸、約１５５アミノ酸〜ペプチドまたはポリペプチドの全長までの連続したストレッチに対する、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
更に以下で議論するように、ＩＬ−１０ポリペプチドは、天然源から単離することができる（例えば、その天然に存在する環境以外の環境）、また、組換えで作ることもでき（例えば、細菌、酵母、ピチア、昆虫細胞など遺伝的に改変された宿主細胞中で）、ここで、遺伝的に改変された宿主細胞は、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む核酸で改変される。ＩＬ−１０ポリペプチドは、また、合成的に（例えば、細胞なしの化学合成により）産生してもよい。
その天然に存在する、及び、非天然のアイソフォーム、対立遺伝子変異体及びスプライス変異体を含む、ＩＬ−１０分子をコード化する核酸分子は、本開示により意図される。本開示は、また、天然に存在するＤＮＡ配列からの１つまたはそれ以上の塩基を変化させるが、それでも遺伝コードの縮重のために、ＩＬ−１０ポリペプチドに対応するアミノ酸配列に翻訳された核酸配列を包含する。
望ましい特徴を有する改変されたＩＬ−１０分子の同定
本発明は、突然変異誘発を介したタンパク質機能の操作、及び、ＩＬ−１０に対する他の改変を部分的に示している。いくつかの実施形態において、本発明は、ＩＬ−１０分子の改変を意図し、ここに、１つまたはそれ以上の有利な特性が、ＩＬ−１０に加えられ（１つまたは複数の特徴が未改変のＩＬ−１０に存在しない場合）、及び／または、強化される（最適量以下であるにも関わらず、単数または複数の特徴が未改変のＩＬ−１０に存在する場合）。さらに以下で論じるように、そのような分子は、例えば、ヒトＩＬ−１０における一連の点突然変異の発生を含む、合理的な薬物設計アプローチを介して同定し、合成できる。この一連の点突然変異は、一連のメンバーの特性（例えば、有効性）の性質及び程度を決定するために評価することができる。
いくつかの実施形態では、点変異は、例えば、改変されたＩＬ−１０ペプチドの合成を容易にするために使用され、ここに、ペプチドは、共有結合、または非共有結合の改変（例えば、ＰＥＧ化、Ｆｃ融合、及びＨＳＡ融合）を含む。次に、改変されたペプチドの系統的評価は、ＩＬ−１０の一次アミノ酸配列の位置を定義するために実施でき、この位置で改変は、ａ）タンパク質の生物活性を保持している；ｂ）特定のタンパク質の機能を増強している（例えば、ＩＬ−１０−ＩＬ−１０受容体の結合相互作用期間の伸長）；ｃ）他方を維持しながら、一方のＩＬ−１０の機能の強調を抑えている；または、ｄ）ａ）〜ｃ）の幾つかを組み合せを実行している間、影響を与えることができる。
本明細書で意図する合理的薬物設計アプローチの１つの目標は、他の属性の追加、または、強化を可能にする間、生物活性に有害な影響を有することなく改変できるＩＬ−１０のこれらのアミノ酸残基及び領域の同定である。これらの合理的薬物設計アプローチの別の目的は、ＩＬ−１０のアミノ酸残基及び他方を維持し、強化させつつある間、改変が、特定のＩＬ−１０の機能の強化を選択的に抑えるために使用できる領域を定義することである。従って、ある実施形態では、ＩＬ−１０分子（例えば、ムテイン）または改変されたＩＬ−１０分子は、１つまたはそれ以上の異なった役割の強調を抑える間、ＩＬ−１０の１つまたはそれ以上の役割を強調し、他方に影響を与えない間（例えば、ＩＬ−１０活性の正常レベルを維持し）、１つまたはそれ以上のＩＬ−１０の役割を強調し；または、他方に影響を与えない間、１つまたはそれ以上のＩＬ−１０の役割の強調を抑える。
特定の実施形態において、本明細書に記載の単数若しくは複数の改変は、そのペプチドの未改変バージョンに比べてペプチドの少なくとも１つの特性、または、他の特徴（例えば、有効性）を改良する。本開示の更なる実施形態は、特定のアミノ酸残基、または本明細書に記載される方法に従って改変することができるＩＬ−１０ドメインを同定するための方法及び他の技術に関係する。本明細書に記載のペプチドを（例えば、疾患またはその症状の治療または予防において）使用する、同定する、及び／または、産生する方法もまた、本開示の態様である。他の態様は、例えば、ペプチドを含む医薬組成物が含まれる。
特定のＩＬ−１０の機能的ドメインの同定及びＩＬ−１０複合体の特定のタイプの生成について説明したが、文献は、本明細書に記載のＩＬ−１０分子の種類およびそれを同定する方法のいずれかの記述を欠く。従って、Ｇｅｓｓｅｒ， Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９４：１４６２０−２５）は、特定のＩＬ−１０様の活性を保持することが見出された２つのノナペプチドの同定を記述し、一方は、ＩＬ−１０のＣ末端部分に位置し、他方は、Ｎ末端に近接している。Ｇｅｓｓｅｒらは、ＩＬ−１０変異体、または、改変されたＩＬ−１０変異体のいずれもを記載していない。更にその上、ポリペプチドを非ポリペプチド部分との結合に対してより感受性を持たせるように適合するために（米国公開特許第２００３／０１８６３８６号）、非ポリペプチド部分のための結合基を有するアミノ酸残基が、導入されるか、または除去されるＩＬ−１０ポリペプチドは、本明細書に記載のＩＬ−１０分子と方法論とで大きく異なる。
特定の実施形態において、本開示は、例えば、ヒトＩＬ−１０での点突然変異の一連の発現の発生、及び、哺乳動物または細菌系におけるそれらの突然変異したＩＬ−１０タンパク質（例えば、ムテイン）の発現を意図する。本開示は、本明細書に記載の変異体ＩＬ−１０分子と互換性のある任意の発現系の使用を意図する。他の実施形態では、候補タンパク質発現系が、細菌（例えば、大腸菌、コリネバクテリウム、Ｐ．フルオレセンス、及び枯草菌）、酵母（例えば、出芽酵母）由来のもの、及びバキュロウイルス感染昆虫細胞を含むが、哺乳動物のタンパク質発現系は、特定の実施形態において意図される。細胞ベースまたは無細胞発現系を使用することができる。ほとんどの組換えサイトカインは、細菌封入体中で産生され、その後精製し、再折り畳みした。
細菌細胞は、しばしば、一般的には、タンパク質の再折り畳みを含む方法を、サイトカインを発現するために使用される。しかし、最初に突然変異したタンパク質が発現されるかどうかを決定するために、哺乳動物発現系を使用することが有利であり得る。哺乳動物細胞は、変異したタンパク質を発現することができる場合には、タンパク質の折り畳みは、おそらく、突然変異により破壊されなかった。変異体分子を折り畳むことと変異分子を分泌する哺乳動物細胞系の能力と、さらなる評価のための候補としてのその分子の生存能力との間に密接な相関関係が頻繁にある。逆に、初期発現が細菌中で行われ、変異したタンパク質が正しく再折り畳みされていない場合、突然変異が破壊されたか、または、タンパク質再折り畳み手順が最適下限であったかどうか、それは明らかではない。
発現系（例えば、哺乳動物細胞ラインベースの発現系）でタンパク質の折り畳み、及び、分泌を有意に破壊しない突然変異体ＩＬ−１０分子は、更なる評価のための候補であり得る。例えば、このような変異体ＩＬ−１０分子は、生体内または生体外で、ＴＮＦα阻害アッセイ、及び、本明細書に記載のＭＣ／９細胞増殖アッセイを含む、１つまたはそれ以上の中に生物活性の分析を可能にするために十分に精製され得る。更なる例として、そのような変異体ＩＬ−１０分子は、ＩＬ−１０／ＩＬ１０Ｒ１またはＩＬ−１０／ＩＬ１０Ｒ１／ＩＬ１０Ｒ２の親和性測定を提供する生体外アッセイで評価することができる。また、生体内モデルにおいて（例えば、生体内でのマウス内毒素血症モデル）が記載されており、本明細書に記載のＩＬ−１０分子の評価に使用できる（参照：例えば、Ｈｏｗａｒｄ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１２０５−０８）。
特定の実施形態において、変異体ＩＬ−１０ポリペプチド分子（例えば、ムテイン）は、例えば、ＰＥＧ化により改変される。これらの改変されたＩＬ−１０分子は、その後、タンパク質機能への影響を決定するために評価することができる。良好な特性（例えば、正常またはタンパク質機能に影響を与えない）を示す改変されたＩＬ−１０分子は、更なる改変（例えば、より大きなまたは分枝状のＰＥＧ）、及び評価（例えば、溶解性）のための候補であり得る。
さらに、本開示は、本明細書記載の生体外、生体内、またはインシリコ免疫原性アッセイなどの免疫原性を決定するための１つまたはそれ以上のアッセイを用いて、変異体ＩＬ−１０ペプチド及び改変型ＩＬ−１０ペプチドの評価を意図する。特に良好な特性（例えば、インシリコで決定されるような免疫原性を増加させることなく、増強された効力）を示す改変されたＩＬ−１０分子は、生体内での免疫原性の分析、及び／または、生体内での設定における追加の分析を含む、更なる評価のための候補であり得る。特定の実施形態では、これらの改変されたＩＬ−１０分子は、対応する非改変ＩＬ−１０分子よりも免疫原性が大きくない。
また、ＩＬ−１０フラグメント；ＩＬ−１０単量体を基礎とするポリペプチド；異種タンパク質と複合化されたＩＬ−１０単量体を含む分子；及び核酸レベルで１つまたはそれ以上の治療薬に融合したＩＬ−１０を含むＩＬ−１０融合タンパク質（例えば、抗炎症性生物薬）を含む、他のＩＬ−１０分子は、本明細書に包含される。そのような分子は、本明細書に記載のアプローチを用いて、または、当業者に公知の他のアプローチを用いて改変できる。
本開示の合理的薬物設計アプローチは、ＩＬ−１０の公開された結晶構造から得られたデータ（Ｚｄａｎｏｖ，Ａ．ｅｔ ａｌ，（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ）３：５９１−６０１ 及び Ｗａｌｔｅｒ， Ｍ． ａｎｄ Ｎａｇａｂｈｕｓｈａｎ，Ｔ．，（１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （３８）：１２１１８−２５）；その溶解受容体を備えたｈＩＬ−１０結晶構造のモデル（Ｚｄａｎｏｖ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．（１０）：１９５５−６２）；及びＩＬ−１０／ＩＬ−１０Ｒ１複合体の結晶構造（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１）：３５−４６）を含む、多数の源からの結晶学的データを利用することができる。それ自身不十分で、そして不完全であるにもかかわらず、そのような情報源に記載された情報及びデータは、修正することができるＩＬ−１０のアミノ酸残基及びドメインの同定に使用される構成成分を表すことができる。そのような情報及びデータを活用した結果、変異体ＩＬ−１０分子（例えば、ムテイン）及び改変された変異体ＩＬ−１０分子（及び、いくつかの実施形態では、改変されたネイティブｈＩＬ−１０）は、本明細書で記載された利点、及び／または、望ましい特徴を有するとみなされた。
成熟ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）の各１６０アミノ酸単量体は、短いループにより連結された６個のヘリックスを含み、それは、また、ヘリックス間接合として本明細書に参照される。図１Ａ及び１Ｂは、６つのヘリックスがＡ〜Ｆと標識した、ｈＩＬ−１０単量体のタンパク質結晶構造のリボン表現（上面図及び側面図）を図示する。図２Ａ及び２Ｂは、ｈＩＬ−１０ホモ二量体のタンパク質結晶構造のリボン表現（上面図及び側面図）を図示し、各単量体の６ヘリックスは、図２Ａに、Ａ〜Ｆと標識した。図３Ｃは、ヘリックスＡ〜Ｆに対応する領域、及びヘリックス間接合（ループ）のそれぞれに対応する領域を示す成熟ｈＩＬ−１０のアミノ酸配列を図示する。図３Ｃは、また、ヘリックスＡ、Ｃ及びＦが、いくつかのアミノ酸のストレッチを含有する（ｈＩＬ−１０の三次元構造内の領域、ここでは、配列は、例えば、厳しい曲げを有する）キンクを保持していることを示す。各々のヘリックス、ヘリックス間接合及びキンクを定義するアミノ酸残基は、文献に受け入れられるが、当業者はどの残基が各ドメインとヘリックス間接合の正確な境界を形成するかに関して異なる知見を有するかもしれないこと、及びそのような差異が本明細書に記載の教示に影響を与えないことを理解するであろう。
既に指摘した通り、ＩＬ−１０受容体は、また、それぞれ、Ｒ１及びＲ２と呼ばれる、α及びβサブユニットを含む。ＩＬ−１０受容体結合の機構が完全に解明されていないが、ＩＬ−１０のシグナル伝達が、ＩＬ−１０Ｒ１及びＩＬ−１０Ｒ２の両方からの寄与を必要とすることが示されている。これは、クラスタリングイベントのいくつかの種類と組み合わせて、ＩＬ−１０Ｒ１及びＩＬ−１０Ｒ２の両方を組み合せて、またはＩＬ−１０Ｒ１及びＩＬ−１０Ｒ２の両方を備えた単一の複合体を形成する１つのＩＬ−１０ホモ二量体により、独立して結合し、１つのＩＬ−１０ホモ二量体を介在して発生し得る。図４Ａ及び４Ｂは、２つのヒトＩＬ１０Ｒ１／α受容体（黒）に結合するヒトＩＬ１０ホモ二量体（灰色）のタンパク質結晶構造リボン表示（上面図と側面図）を図示する。
改変（例えば、ＰＥＧ化）のための望ましくない候補であり得るアミノ酸残基は、改変にアクセスできない疎水性コアの残基；ＩＬ１０Ｒ１／２受容体と接触する残基；ＩＬ１０Ｒ１／２−ＩＬ−１０−結合界面に最近接する残基；及び、ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を含み、それは、システインを元にしたＰＥＧ化化学で一般的に非反応性となる（ジスルフィド結合のシステインＰＥＧ化は、定義されたＰＥＧ化条件を用いて達成できるが）。これとは対照的に、潜在的な改変（例えば、ＰＥＧ化）のための良好な候補であり得るアミノ酸残基は、タンパク質−タンパク質間の相互作用に関与しない表面露出残基、ヘリックス間接合を形成する残基、またはヘリックスＡの前の残基（下記で「プレヘリックスＡ」と定義する）またはヘリックスＦに続く残基（下記で「ポストヘリックスＦ」と定義する）を含む。アミノ酸残基５９におけるチロシンは、改変のための１つの候補（例えば、ＰＥＧ化）である。キンクを形成するアミノ酸残基の改変は、許容される置換基のより限定されたセットを有してもよい。
本明細書の他の箇所に記載されているように、化学物質は、現在のポリペプチドのＮ終端、リシン残基、システイン残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、及びＣ−終端のＰＥＧ化のために存在する。上記で指示した通り、本開示は、順番に、ＰＥＧ化できる非天然アミノ酸残基を導入することを意図する。しかし、幾つかのこれらのアミノ酸残基のみ（例えば、チロシン残基（及び（Ｎ終端））、常に、部位特異的にＰＥＧ化することができる。他のアミノ酸（例えば、グルタミン酸およびセリン残基）のＰＥＧ化が有用であり、あまりにも多くの位置異性体をもたらすが、他のアミノ酸のＰＥＧ化は、複雑な条件の下でのみ部位特異的に実施できる。
本明細書に記載した教示に基づき、突然変異誘発及び部位特異的な化学物質の組み合わせを介して、アミノ酸残基の改変は、疎水性コア内に埋め込まれ得る５８残基に対して；ジスルフィド結合に関与し得る４残基に対して；及びＩＬ−１０Ｒ１／αに接触し得る２７残基（その内７残基は、また、疎水性コアドメイン内に埋め込まれると予測されるが）に対して、実現可能であるとは予測されない。更に、これらの残基の改変は、また、実行可能ではないだろうと予測しているが、１０残基は、推定されるＩＬ−１０及びＩＬ−１０Ｒ１／α結合界面に最近接しているが、直接、ＩＬ−１０Ｒ１／αと相互作用しないことがあり得る。本開示は、このような改変は、本明細書に包含される場合には、これらの残基の１つまたはそれ以上の改変が許容し得ると認識している。逆に、本明細書に記載された教示に基づき、突然変異誘発及び部位特異的な化学物質の組み合わせを介して、アミノ酸残基の改変は、７８の表面露出残基に対して実現可能であるが、ＩＬ−１０Ｒ１／α結合またはジスルフィド結合に一体的に関与していないことを予測する。
各ヘリックス及びヘリックス間接合部に対応するアミノ酸残基は、ヘリックスＡの前、（「プレヘリックスＡ」）及びヘリックスＦの後（「ポストヘリックスＦ」）；プレヘリックスＡ＝１〜１７；ヘリックスＡ＝１８〜４１；Ａ／Ｂヘリックス間接合＝４２〜４８；ヘリックスＢ＝４９〜５８；Ｂ／Ｃヘリックス間接合＝５９；ヘリックスＣ＝６０〜８２；Ｃ／Ｄヘリックス間接合＝８３〜８６；ヘリックスＤ＝８７〜１０８；Ｄ／Ｅヘリックス間接合＝１０９〜１１７；ヘリックスＥ＝１１８〜１３１；Ｅ／Ｆヘリックス間接合＝１３２；ヘリックスＦ＝１３３〜１５９；及びポストヘリックスＦ＝１６０に発生する残基として、下記に記載される。本開示の教示に基づいて、特定の実施形態では、ペプチドは、そのような置換を収容することができるとして、本明細書に同定されるアミノ酸残基及び領域において、ペプチドは、１６０個のアミノ酸ＩＬ−１０単量体において少なくとも１つの置換を含む。これらのペプチドは、本明細書に記載のように改変してもよい。
従って、本開示のペプチドは、ａ）プレヘリックスＡ；ｂ）ヘリックスＡ；ｃ）Ａ／Ｂヘリックス間接合；ｄ）ヘリックスＢ；ｅ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合；ｆ）ヘリックスＣ；ｇ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合；ｈ）ヘリックスＤ；ｉ）Ｄ／Ｅヘリックス間接合；ｊ）ヘリックスＥ；ｋ）Ｅ／Ｆヘリックス間接合；ｌ）ヘリックスＦ；及び ｍ）ポストヘリックスＦを含んでもよい。ここに、そのようなペプチドは、更に、少なくとも１つの、ｉ）アミノ酸残基１２（Ｃ）、１５（Ｆ）若しくは１６（Ｐ）以外のプレヘリックスＡの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｉｉ）アミノ酸残基１９〜２４（ＬＰＮＭＬＲ（配列番号３３））、２６〜３０（ＬＲＤＡＦ（配列番号３４））、３３〜３９（ＶＫＴＦＦＱＭ（配列番号３５））、若しくは４１（Ｄ）以外のヘリックスＡの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｉｉｉ）アミノ酸残基５２（Ｌ）、５３（Ｌ）、若しくは５６（Ｆ）以外のヘリックスＢの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｉｖ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合のアミノ酸残基の置換；またはｖ）アミノ酸残基６２（Ｃ）、６４（Ａ）、６５（Ｌ）、６８（Ｍ）、６９（Ｉ）、７１−７３（ＦＹＬ）、７６（Ｖ）、７７（Ｍ）、若しくは８０（Ａ）以外のヘリックスＣの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｖｉ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合のアミノ酸残基の置換；またはｖｉｉ）アミノ酸残基８７（Ｉ）、９１（Ｖ）、９４（Ｌ）、９８（Ｌ）、１０１（Ｌ）、１０５（Ｌ）、若しくは１０８（Ｃ）以外のヘリックスＤの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｖｉｉｉ）アミノ酸残基１１１（Ｆ）、１１２（Ｌ）、若しくは１１４（Ｃ）以外のＤ／Ｅヘリックス間接合の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｉｘ）アミノ酸残基１２０（Ａ）、１２１（Ｖ）、１２４（Ｖ）、１２７（Ａ）、１２８（Ｆ）、若しくは１３１（Ｌ）以外のヘリックスＥの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｘ）Ｅ／Ｆヘリックス間接合のアミノ酸残基の置換；またはｘｉ）アミノ酸残基１３６〜１５６（ＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭ（（配列番号３６））、１５８（Ｉ）または１５９（Ｒ）以外のヘリックスＦの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；またはｘｉｉ）ポストヘリックスＦのアミノ酸の置換を含む。これらのペプチドは本明細書に記載の通りに改変してもよい。
実験の項で詳細に記載する通り、及び図５で示す通り、成熟ヒトＩＬ−１０ポリペプチドの７８残基は、ホモ二量体において表面露出である可能性があり、そして受容体結合に関与する可能性が少なく、そして、これらの７８残基は、ＰＥＧのアンカーとして提供する、アミノ酸の置換により、おそらく、変異を許容する可能性がある部位を表す。これらの７８個の可能な位置のうち、いくつかの変異体は以下の様々な理由のための特定の位置で除去される：ヒトＩＬ−１０がすでにその位置でのチロシンを含むため、残基５９（Ｙ）は、チロシンに変異することはできない；残基１０（Ｎ）、６０（Ｌ）に対して、について、Ｎ−グリコシル化部位を導入する１０６（Ｒ）残基は、システイン結合に干渉し、そして、おそらくタンパク質の生物活性を破壊する；残基１１６（Ｎ）は、すでに、Ｎ−Ｘ−Ｓ Ｎ−グリコシル化モチーフを含むため、Ｎ−Ｘ−Ｔモチーフのみを導入することができる；残基１６０（Ｎ）に対して、Ｎ−グルコシル化モチーフが３つのアミノ酸長（Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔ）であるので、Ｎ−グルコシル化部位は、タンパク質の最後の残基に導入できない。３個のアミノ酸に及ぶＮ−グリコシル化部位のためのモチーフ（Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔ、Ｘ≠Ｐ）基づき、記載される７８残基の外側に、頻繁に、変異を導入する必要があるが、これらの変異は、Ｎ−グリコシル化が、ヒトＩＬ−１０上のこれらの７８の位置で発生するように設計され、従ってＮ−グリコシル化変異が、まだこれらの７８位置を検査する手段として機能していることに留意すべきである。
変異体（例えば、システイン、チロシン、Ｎ−Ｘ−Ｓ及びＮ−Ｘ−Ｔ；図５参照）は、本明細書に記載の方法を用いて発生し、そして、生物学的活性を決定するために、ＭＣ／９アッセイで評価した。生物学的活性を有するこれらの変異体のうち、７６変異体は、ＰＥＧ部分のためのアンカー部位として提供される潜在的な候補であると同定された。
本開示のいくつかの実施形態は、以下の領域の少なくとも１つに、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むペプチドを意図している：１〜１１、４９〜５１、５７〜６１、８１〜８６、８８〜９０、１０２〜１０４、１１５〜１１９、または１３２〜１３４。他の実施形態では、ペプチドは、少なくとも以下の位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：１〜１１、１３、１４、１７、１８、２５、３１、３２、４０、４９〜５１、５４、５５、５７〜６１、６３、６６、６７、７０、７４、７５、７８、７９、８１〜８６、８８〜９０、９２、９３、９６、９７、９９、１００、１０２〜１０４、１０６、１０７、１０９、１１０、１１３、１１５〜１１９、１２２、１２３、１２５、１２６、１２９、１３０、１３２〜１３４、１５７、または１６０。
ＩＬ−１０の改変された形態の免疫原性の検討事項
免疫原性、被験者における体液性（Ｂ細胞）及び／または細胞媒介性（Ｔ細胞）の免疫応答を誘発する抗原の能力は、「望ましい」または「望ましくない」として分類することができる。望ましい免疫原性は、一般的に、ワクチン注射により、誘発される病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）に対して取り付けられた対象者の免疫応答を意味する。この文脈において、免疫応答は有利である。逆に、望ましくない免疫原性は、一般的に、治療用タンパク質（例えば、ＩＬ−１０）のような抗原に対して取付けられた被験者の免疫応答を意味する；免疫応答は、例えば、治療用タンパク質の有効性に、または、その薬物動態パラメータに悪影響を与え、および／または、他の副作用に寄与する抗薬物抗体（ＡＤＡ）をもたらすことができる。この文脈において、この免疫応答は不利益である。
タンパク質治療薬の被験者の免疫反応に影響を与える、被験者固有及び産生物固有の多くの要因がある。被験者固有の要因は、下記の免疫学的状況や被験者の能力を含む：前感作性／アレルギの履歴；投与の方式；投与の用量及び頻度；被験者の遺伝状態；及び内因性タンパク質に対する免疫寛容の被験者の状態。免疫原性に影響を与える製品固有の要因は、製品の起源（外因性または内因性）；製品の主な分子構造／翻訳後改変、三次及び四次構造など；製品の凝集体の存在；抱合／改変（例えば、グリコシル化及びＰＥＧ化）；アジュバント活性を有する不純物；製品の免疫調節作用；及び製剤を含む。
自家またはヒト様ポリペプチドの治療薬は、いくつかの適用分野では、驚くべきことに、免疫原性、及び他で驚くほど非免疫原性であることが証明される。特別のＩＬ−１０ムテイン、及び他の改変型ＩＬ−１０（例えば、ＰＥＧ化ＩＬ−１０及びＩＬ及びＩＬ−１０ドメイン）は、体液性及び細胞媒介性免疫応答の範囲を誘発する可能性がある。
本明細書で更に議論されるように、Ｔ細胞エピトープ、及び／または、Ｂ細胞エピトープの除去または改変は、免疫原性を低下することができる。実際、ある文脈において、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基と「マスキング剤」（例えば、ＰＥＧ）との結合、及び／または、アミノ酸残基自身への変化（例えば、置換による）は、そうでなければ高度に免疫原性タンパク質の免疫原性を劇的に低下させる。
Ｔ細胞エピトープ：更に下記で議論するように、複合体二次及び三次タンパク質構造にしばしば依存する三次元のＢ細胞エピトープとは対照的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープは、一般的には、約１１〜約２０アミノ酸残基長の線状ペプチド配列である。臨床免疫原性データが存在するタンパク質の領域の比較分析は、対応するタンパク質の免疫原性を有するＴ細胞エピトープの存在と効力の間の強力な関係を示す。
シリコスクリーニングにおいて、ツールは、しばしば包括的なＴ細胞エピトープ評価の最初のステップとして使用される。ペプチドに対するヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘導は、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを必要とする。このようなペプチド結合データの分析は、治療用タンパク質の開発プロセスに利用することができる。一例として、Ａｎｔｉｔｏｐｅ社（ケンブリッジ、英国）は、３４ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子へのペプチドの結合をモデル化する、インシリコ分子モデリング技術（ｉＴｏｐｅ（商標））で独自技術を有する。個々のアミノ酸残基のペプチド結合に対する寄与は、各対立遺伝子に対して決定することができ、これらのデータは、Ｔ細胞エピトープが結合を破壊するように突然変異している「脱免疫化」配列の変異体のデザインで使用することができる。
また、「免疫インフォマティクス」アルゴリズム及びＴ細胞エピトープを同定するための他の技術は、高リスクと低リスクのカテゴリにタンパク質治療をトリアージするために使用することができる。説明するために、タンパク質配列は、ほとんどのヒトの遺伝的背景を「覆う」各々の８つの共通クラスＩＩのＨＬＡ対立遺伝子に対する結合の可能性を、その後、評価する、９量体ペプチドフレームを重複して解析することができる。タンパク質内の高スコアリングフレームの密度を算出することにより、タンパク質の全体的な「免疫原性スコア」を推定することができる。また、稠密に詰め込まれた、高スコアリングフレームまたは潜在的な免疫原性の「クラスター」のサブ領域は、識別することができ、クラスタのスコアを計算し、編集できる。免疫原性の他の決定と一緒に、タンパク質の「免疫原性スコア」は、そのタンパク質が免疫応答を誘発する可能性を決定するために、その後、使用することができる。
治療用タンパク質の免疫原性を低下させる付加的な手段は、用いてもよい。技術（例えば、Ａｎｔｉｔｏｐｅ社の独自ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）ヒトエキソビボＴ細胞アッセイシステム）は、タンパク質、ペプチド、製剤などのヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞応答を決定することができる。そのような技術の使用から産生されたデータは、出発タンパク質の配列内ヘルパーＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープをマッピングするために使用することができ、Ｔ細胞エピトープは、１つまたはそれ以上の下記の件より、タンパク質より除去することができる：ヒトＭＨＣクラスＩＩへの結合を低減し／排除するするために突然変異を設計すること；ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ複合体の認識を破壊するために、Ｔ細胞受容体接触残基を標的化すること；望ましいタンパク質の活性を維持するために重要なアミノ酸残基の標的化及び置換を導くために、構造及び相同性分析を行うこと；及び効力に基づく除去のためのＴ細胞エピトープの優先順位付けをおこなうこと。
Ｂ細胞エピトープ：Ｔ細胞エピトープの正確な予測因子が存在するが、Ｂ細胞エピトープの現在の予測は、本質的に困難である。
Ｂ細胞エピトープは、２つのカテゴリーのいずれかに配置することができる。 第一のカテゴリーにおいて、エピトープは、タンパク質の特定領域の一次アミノ酸配列によって定義され、そしてエピトープの構成要素は、タンパク質上に順に配置される。これらの線形Ｂ細胞エピトープは、一般に、約５〜約２０アミノ酸残基長の範囲である。第二のカテゴリーでは、エピトープは、タンパク質の立体配座構造によって定義され、エピトープの構成要素は、天然タンパク質の折り畳まれた二次または三次構造で、互いに接近するタンパク質の別々の部分に位置している。ほとんどのＢ細胞エピトープは、タンパク質の立体配座構造に基づくので、Ｂ細胞エピトープは、（それらの一次アミノ酸配列によって決定される）Ｔ細胞エピトープよりも識別することが困難である。
以前に使用される配列に基づくＢ細胞エピトープの予測因子の例としては、下記に記述された技術を含む。Ｓａｈａ Ｓ， ａｎｄ Ｒａｇｈａｖａ ＧＰ （“ＡＢＣＰｒｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”）（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ （２００６） ６５：４０−４８）；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ （２００７） ３３：４２３−２８）；Ｅｌ−Ｍａｎｚａｌａｗｙ Ｙ， ｅｔ ａｌ．（“ＢＣＰｒｅｄ” ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ（２００８）２１：２４３−５５）；Ｓｗｅｒｅｄｏｓｋｉ ＭＪ，ａｎｄ Ｂａｌｄｉ Ｐ （“ＣＯＢＥｐｒｏ” ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ（２００９） ２２：１１３−２０）；Ｗｅｅ ＬＪ， ｅｔ ａｌ．（”ＢａｙｅｓＢ” ｔｅｈｎｏｌｏｇｙ）（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ （２０１０） １１：Ｓ２１）； 及び、Ａｎｓａｒｉ ＨＲ，ａｎｄ Ｒａｇｈａｖａ ＧＰ（“ＣＢＴＯＰＥ” ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （Ｉｍｍｕｎｏｍｅ Ｒｅｓ（２０１０）６：６）。
サポートベクターマシンツール（「ＢＥＳＴ」）を用いて、Ｂ細胞エピトープを予測することは、有望な新しいＢ細胞エピトープの技術である（Ｇａｏ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（６）： ｅ４０１０４． ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４０１０４）。ＢＥＳＴの方法は、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）により、２０量体のスライドから産生した、選択されたスコアの平均に基づく新しいアーキテクチャを使用して、短い配列フラグメントのみから予測する多くの従来の方法とは対照的に、抗原配列からエピトープを予測する。ＳＶＭの予測因子は、結合鎖から得られた情報、配列保存、公知の（トレーニング）エピトープの類似性を組み合わせることによって産生された入力の包括的かつカスタムデザインのセットを利用し、二次構造及び相対的溶媒接近性を予測する。更に、いくつかの事業者は、Ｂ細胞エピトープを評価するために独自の技術を利用する（例えば、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ’ｓ Ｂ−ｃｅｌｌ ＥＬＩＳｐｏｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ Ｌｔｄ．； Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）。
免疫原性を評価する目的のために、一般的に、常にではないが、抗原特異的Ｂ細胞応答を駆動する潜在的Ｔ細胞エピトープに集中することが有用である。
ＩＬ−１０産生の方法
本発明のポリペプチドは、非組換え（例えば、化学合成）及び組換え法を含む任意の適切な方法により、製造することができる。
化学合成
ポリペプチドが化学合成される場合、合成は、液相または固相を介して進行できる。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、非天然アミノ酸、及び／または、ペプチド／タンパク質骨格改変の組み込みを可能にする。例えば、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、及び、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）などのＳＰＰＳの様々な形態は、本開示のポリペプチドを合成するために利用可能である。化学合成の詳細は、当該分野で公知である（例えば、Ｇａｎｅｓａｎ Ａ．（２００６） Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ６：３−１０； 及びＣａｍａｒｅｒｏ Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８）。
固相ペプチド合成は、下記に記載の通りに実施できる。α機能（Ｎα）、及び、任意の反応性側鎖は、酸不安定または塩基に不安定な基によって保護される。保護基は、アミド結合を連結するための条件下で安定であるが、形成したペプチド鎖を損なうことなく容易に切断することができる。α−アミノ官能基に適した保護基としては、下記のものが挙げられるが、それに限定されない：Ｂｏｃ；ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）；ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル；ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル；ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｍｏｃ）；α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル；ｏ−ニトロフェニルスルフェニル；２−シアノ−ｔ−ブトキシ−カルボニル；Ｆｍｏｃ；１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）など。
適切な側鎖保護基は、下記のものが挙げられるが、それに限定されない：アセチル；アリル（Ａｌｌ）；アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）；ベンジル（Ｂｚｌ）；ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）；ｔ−ブチルオキシカルボニル （Ｂｏｃ）；ベンジルオキシメチル（Ｂｏｍ）；ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル；ｔ−ブチル（ｔＢｕ）；ｔ−ブチルジメチルシリル；２−クロロベンジル；２−クロロベンジルオキシカルボニル；２，６−ジクロロベンジル；シクロヘキシル；シクロペンチル；１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキサ−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）；イソプロピル；４−メトキシ−２，３，６−トリメトキシベンジルスルホニル（Ｍｔｒ）；２，３，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）；ピバロイル；テトラヒドロピラン−２−イル；トシル（Ｔｏｓ）；２，４，６−トリメトキシベンジル；トリメチルシリル；及びトリチル（Ｔｒｔ）。
固相合成において、Ｃ末端アミノ酸は、適切な支持体物質に結合されている。適切な担体物質は、合成工程の段階的縮合及び切断反応のための試薬、及び反応条件に対して不活性で、使用される反応媒体に溶解しないものである。商業的に入手可能な支持物質の例としは、反応基で改変され得るスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー、及び／または、ポリエチレングリコール；クロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー；ヒドロキシメチル化、または、アミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー；などが挙げられる。ペプチド酸の調製が望ましいとき、ポリスチレン（１％）−ジビニルベンゼン；または、４−ベンジルアルコールで誘導されるＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）（Ｗａｎｇ−アンカー）；または２−クロロトリチルクロリドが使用できる。ペプチドアミドの場合、ポリスチレン（１％）−ジビニルベンゼン、または、５−（４′−アミノメチル）−３′，５′−ジメトキシフェノキシ）吉草酸（ＰＡＬ−アンカ−）、または、ｐ−（２，４−ジメトキシフェニルアミノメチル）−フェノキシ基（Ｒｉｎｋアミドアンカー）で誘導されるＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）が使用できる。
ポリマー支持体への結合は、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルミアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドン、または、類似の溶媒で、室温または昇温下（例えば、４０℃〜６０℃の間）で、例えば、２〜７２時間の反応時間で、活性剤の付加により、支持物質で、Ｃ末端のＦｍｏｃ保護アミノ酸を反応させることにより達成できる。
Ｎα保護アミノ酸（Ｆｍｏｃアミノ酸など）のＰＡＬ、Ｗａｎｇ、または、Ｒｉｎｋアンカーへのカップリングは、例えば、Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）；Ｎ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）；または他のカルボジイミド；２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート（ＴＢＴＵ）；または、他のウロニウム塩；Ｏ−アシル−尿素；ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、または他のホスフェート塩；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；他のＮ−ヒドロキシイミドまたはオキシム；などのカップリング剤の助けを借りて、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、または、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールの存在下、または非存在下で、例えば、ＨＯＢｔを加えて、ＴＢＴＵの助けを借りて、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、トリエチルアミン、または、Ｎ−メチルモルホリンなどの塩基の添加のあり、または無しで；例えば、ジイソプロピルエチルアミンで、反応時間２〜７２時間で；（例えば、アミノ酸及びカップリング剤の１．５倍から３倍過剰で、例えば、２倍過剰で、３時間；約１０℃〜５０℃の温度で、例えば、２５℃の温度で、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、またはジクロロメタン、例えば、ジメチルホルムアミドなどの溶媒中で）実施できる。
カップリング剤の代わりに、活性エステル（例えば、ペンタフルオロフェニル、ｐ−ニトロフェニルなど）、Ｎα−Ｆｍｏｃ−アミノ酸の対称酸無水物、その酸クロリド、または酸フルオリドを上記の条件下で使用することも可能である。
Ｎα保護されたアミノ酸（例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸）は、ＤＩＥＡを添加したジクロロメタン中の２−クロロトリチル樹脂に、１０〜１２０分の反応時間で、例えば、２０分間で、この溶媒及びこの塩基の使用を限定せずに、カップリングできる。
保護されたアミノ酸の連続的なカップリングは、ペプチド合成の従来の方法に従い、一般的に、自動ペプチドシンセサイザーで実施できる。例えば、ジメチルホルムアミド中、ピペリジン（１０％〜５０％）で、５〜２０分；例えば、２×２分で、ＤＭＦ中５０％ピペリジンで；及び、１×１５分で、ＤＭＦ中２０％ピペリジンでの処理で固相上に結合させたアミノ酸のＮα−のＦｍｏｃ保護基の切断の後、次の保護アミノ酸は、１０倍過剰で、例えば３〜１０倍過剰で、ジクロロメタン、ＤＭＦまたは２つの混合物などの不活性、非水性、極性溶媒中で、約１０℃〜５０℃、例えば、２５℃の温度で、前述のアミノ酸に結合される。初めに、Ｎα−Ｆｍｏｃアミノ酸をＰＡＬ、ＷａｎｇまたはＲｉｎｋアンカーにカップリングするための前述した試薬は、カップリング試薬として好適である。アクティブな保護アミノ酸のエステル、またはクロリドまたはフルオリドまたはその対称無水物は、また、代替として使用することができる。
固相合成の最後に、ペプチドは、支持体から切断され、同時に側鎖保護基を切断する。切断は、トリフルオロ酢酸または他の強酸性の媒体をジメチルスルフィド、エチルメチルスルフィド、チオアニソール、チオクレゾール、ｍ−クレゾール、アニソール、エタンジチオール、フェノール、または水などの５％〜２０％（体積比）のスキャベンジャを加えて；例えば、１５％（体積比）のジメチルスルフィド／エタンジチオール／ｍ−クレゾール＝１：１：１で、０．５〜３時間で、例えば、２時間で実施することができる。完全に保護された側鎖を有するペプチドは、氷酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン＝２：２：６で、２−クロロトリチルアンカーを切断することにより得られる。保護されたペプチドは、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製することができる。ペプチドがＷａｎｇアンカーを介して固相に連結している場合、及びＣ末端アルキルアミド化を有するペプチドを得ることが意図されている場合、切断は、アルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンによるアミノ分解により実施できる。アミノ分解は、約１２〜２４時間（例えば、約１８時間）の反応時間で、約−１０℃〜５０℃の温度（例えば、約２５℃）で実施する。加えて、ペプチドを、例えば、メタノールで再エステル化することにより、支持体から切断することができる。
得られた酸性溶液は、ペプチドを沈殿させ、その結果、エーテル中に残るスカベンジャーと切断された保護基を分離するために、３〜２０倍量の冷エーテル、または、ｎ−ヘキサン、例えば、１０倍量のジエチルエーテルで混合する。更なる精製は、氷酢酸からペプチドを数回再沈殿させることによって行うことができる。得られた沈殿物は、水またはｔｅｒｔ−ブタノール、または、２つの溶媒の混合物、例えば、ｔｅｒｔ−ブタノール／水＝１：１の混合物及び凍結乾燥物に取り込んだ。
得られたペプチドは酢酸形態中で弱塩基性樹脂のイオン交換を含む、下記の様々なクロマトグラフィーの方法で精製することができた：非誘導体化ポリスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー（例えば、アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ）の上の疎水性吸着クロマトグラフィー；シリカゲル上での吸着クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー：例えば、カルボキシメチルセルロース；分配クロマトグラフィー；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５上で；向流分配クロマトグラフィー；または、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、例えば、オクチルまたはオクタデシルシリルシリカ（ＯＤＳ）相上の逆相ＨＰＬＣ。
組み換え産生物
ヒト及びマウスＩＬ−１０の調製を説明する方法は、例えば、Ｕ.Ｓ.５,２３１,０１２に見出すことができ、それは組換え及び他の合成技術を含む、ＩＬ−１０活性を有するタンパク質を産生するための方法を教示する。ＩＬ−１０は、ウイルス起源のものであり得る。Ｅｐｓｔａｉｎ Ｂａｒｒウイルス（ＢＣＲＦ１タンパク質）からクローニング及びウイルス性ＩＬ−１０の発現がＭｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１２３０に開示されている。ＩＬ−１０は、本明細書に記載のものなど、当該分野で公知の標準的技術を用いて多数の方法で得られる。組み換えヒトＩＬ−１０も、また、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ， Ｎ．Ｊ．から商業的に入手可能である。
部位特異的突然変異（また、部位特異的突然変異誘発及びオリゴヌクレオチド指定突然変異と参照されるが）は、改良した、望ましい特性を有する、本開示の合理的に設計されたタンパク質（例えば、特定のＩＬ−１０ムテイン及びそのドメインを含むＩＬ−１０の他の改変されたバージョン）を産生するために、ＤＮＡに特異的突然変異を産生するために、使用できる。部位特異的突然変異誘発のための技術は、当該分野で周知である。初期の部位特異的変異法（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ’ｓ ｍｅｔｈｏｄ； ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ； ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発；及び、ＳＰＲＩＮＰを含む、全プラスミド突然変異生成）は、Ｄｅｌｉｔｔｏのｐｅｒｆｅｔｔｏを含む様々な生体内方法のような、形質転換「ポップインポップアウト」；ＰＣＲ及び１つのリサイクル可能なマーカーを有する直接遺伝子欠失及び部位特異的突然変異；長い相同性ドメインを用いた、ＰＣＲ及び１つのリサイクル可能なマーカーを有する直接遺伝子欠失及び部位特異的突然変異；及び合成オリゴヌクレオチドを有する生体内部位指向性の突然変異誘発；より正確で効率的な方法により置き換えられる（参照：Ｓｔｏｒｉｃｉ Ｆ． ａｎｄ Ｒｅｓｎｉｃｋ ＭＡ，（２００６） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４０９：３２９−４５）（参照、例えば：Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），２ｎｄＥｄ．ＩＳＢＮ ９７８−０８９６０３９１００）。また、部位特異的突然変異誘発を行うためのツールが市販されている（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。
ポリペプチドが組換え技術を用いて産生される場合、ポリペプチドは、それぞれ、任意の適切な構築物、及び細菌（例えば、大腸菌）などの原核細胞または真核細胞であり得る任意の適切な宿主細胞、または酵母宿主細胞を用いて、細胞内タンパク質または分泌タンパク質として産生できる。宿主細胞として使用することができる真核細胞の他の例としては、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び／または、植物細胞が含まれる。哺乳動物宿主細胞が使用される場合、それらは、ヒトの細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞）；マウス細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３；Ｌ細胞、及びＣ１２７細胞）；霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１）；及びハムスタ細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含んでもよい。
ポリペプチドの発現に適した様々な宿主−ベクター系は、当該分野で公知の標準的な手順に従って使用することができる。参照：例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； 及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｄｓ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ。宿主細胞への遺伝物質の導入方法としては、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、接合、リン酸カルシウム法などを含む。導入されたポリペプチドをコード化する核酸の安定な発現を提供するように転送する方法が選択できる。ポリペプチドをコード化する核酸は、エピソームの遺伝要素（例えば、プラスミド）として提供することができ、またはゲノム統合することができる。対象のポリペプチドの産生に使用するのに適した種々の適切なベクターが市販されている。
ベクターは、宿主細胞内の染色体外維持のために提供することができ、または宿主細胞ゲノムへの組み込みを提供することができる。発現ベクターは、転写及び翻訳調節配列を提供し、そして誘導的または構成的発現を提供することができ、ここに、コード化領域は、転写開始領域、転写及び翻訳終結領域の転写制御の元で作動可能に連結される。一般的に、転写及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、並びに、エンハンサーまたはアクチベーター配列を含むが、それに限定されない。プロモーターは、構成的または誘導的のいずれかであり得て、強力な構成的プロモーター（例えば、Ｔ７）であり得る。
発現構築物は、一般的に、対象のタンパク質をコード化する核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近傍に位置する便利な制限部位を有する。発現宿主において作動する選択マーカーは、ベクターを含む細胞の選択を容易にするために存在してもよい。また、発現構築物は、追加の要素を含んでもよい。例えば、発現ベクターは、１つまたは２つの複製システムを有していてもよく、その結果、それを、発現のために生物内で、例えば、哺乳動物または昆虫細胞で、並びに、クローニング及び増幅のために原核生物宿主中で、維持されることを可能にする。更に、発現構築物は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択的マーカー遺伝子を含んでもよい。選択遺伝子は当該分野で公知であり、使用する宿主細胞により変化する。
タンパク質の単離及び精製は、当該分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、タンパク質は、構成的に、及び／または、誘導時にタンパク質を発現するように、遺伝的に改変された細胞の溶解物から、または、免疫親和性の精製により、合成反応混合物から、単離することができ、それは、一般に、サンプルを抗タンパク質抗体と接触させ、非特異的に結合した物質を除去するために洗浄し、そして特異的に結合したタンパク質を溶出させることを含む。単離されたタンパク質は、さらに、通常は透析、及び、タンパク質精製に用いられるその他の方法によっても精製することができる。一実施形態では、タンパク質は、金属キレートクロマトグラフィー法を用いて単離することができる。タンパク質は、単離を容易にするための改変を含んでもよい。
ポリペプチドは、実質的に純粋な、または、単離された形態（例えば、他のポリペプチドがない）で調製することができる。ポリペプチドは、存在し得る他の構成要素（例えば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）に関連するポリペプチドに対して濃縮された組成物中に存在することができる。例えば、精製されたポリペプチドは、ポリペプチドが実質的に他の発現タンパク質を含まない、例えば：約９０％未満；約６０％未満；約５０％未満；約４０％未満；約３０％未満；約２０％未満；約１０％未満；約５％未満；または約１％未満で、組成物中に存在するように提供されてもよい。
ＩＬ−１０ポリペプチドをコード化することができる構築物を提供するために、当該分野において公知の異なったＩＬ−１０関連の核酸を操作する組換え技術を用いて、ＩＬ−１０ポリペプチドを生成できる。特定のアミノ酸配列が提供される場合、当業者は、例えば、分子生物学に対する背景及び経験を考慮して、このようなアミノ酸配列をコード化する多様な異なる核酸分子を認識することは理解されるであろう。
アミド結合置換
幾つかの場合、ＩＬ−１０は、ペプチド結合以外の１つ以上の結合を含む。例えば、少なくとも二つの隣接するアミノ酸は、アミド結合以外の結合を介して連結される。例えば、望ましくないタンパク質分解、または、分解の他の手段を減少し、排除するため、及び／または、血清安定性を上昇させるために、及び／または、骨格内の立体配座の柔軟性を制限または増加させるために、ＩＬ−１０の主鎖内の１つまたはそれ以上のアミド結合を置換できる。
別の例において、ＩＬ−１０内の１つまたはそれ以上のアミド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−または−ＣＨ２ＳＯ−などのアミド結合のアイソスターである結合で置換することができる。ＩＬ−１０の内の１つまたはそれ以上のアミド結合は、また、例えば、還元したアイソスター擬ペプチド結合によって置換することができる。参照：Ｃｏｕｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４１：１８１−１８４。そのような代替方法、及びそれを達成する方法は、当業者に知られている。
アミノ酸置換
１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＩＬ−１０ポリペプチド内で行われる。下記は、非限定の例である：
ａ）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、（Ｓ）−２−アミノ酪酸、（Ｓ）−シクロヘキシルアラニンを含むアルキル置換の疎水性アミノ酸の置換；または、分枝された、環状の、及び、直鎖の、アルキル、アルケニルまたはアルキニル置換を含むＣ１〜Ｃ１０炭素からの脂肪族側鎖により置換された他の単純α−アミノ酸置換；
ｂ）フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、スルホチロシン、ビフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−ベンゾチエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジンを含み；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）、または上記でリストアップした芳香族アミノ酸のアルコキシ置換型（Ｃ１〜Ｃ４）を含む、芳香族置換された疎水性アミノ酸の置換；その内の典型的例としては、２−、３−、または、４−アミノフェニルアラニン、２−、３−、または、４−クロロフェニルアラニン、２−、３−、または４−メチルフェニルアラニン、２−、３−、または、４−メトキシフェニルアラニン、５−アミノ−、５−クロロ−、５−メチル−、または、５−メトキシトリプトファン、２′−、３′−、または４′−アミノ−、２′−、３′−、または４′−クロロ−、２−、３−、または４−ビフェニルアラニン、２′−、３′−、または４′−メチル−、２−、３−、または４−ビフェニルアラニン，及び、２−、または、３−ピリジルアラニンがある；
ｃ）アルキル、アルケニル、またはアリール置換（Ｃ１〜Ｃ１０の分枝、直鎖状、または環状）した上記のアミノ酸誘導体を含む、アルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニンを含む塩基性側鎖を含有するアミノ酸の置換；置換基が、ヘテロ原子上に（α窒素、または、遠位置にある単数若しくは複数の窒素）、または、例えば、ｐｒｏ−Ｒ位置にあるα炭素上にあるかどうかである。典型的な例として提供される化合物としては、Ｎ−ε−イソプロピル−リシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−グリシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−アラニン、Ｎ，Ｎ−γ，γ′−ジエチル−ホモアルギニンが挙げられる。α−メチルアルギニン、α−メチル−２，３−ジミアノプロピオン酸、α−メチルヒスチジン、α−メチルオルニチンの様な化合物も、また、含まれ、ここに、アルキル基はα−炭素のｐｒｏ−Ｒを占める。アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ここで、ヘテロ芳香族基は、１つ若しくはそれ以上の窒素、酸素または硫黄原子を有する）、カルボン酸、または、酸クロリド、活性エステル、活性アゾリド及び関連誘導体及びリシン、オルニチン、または、２，３−ジアミノプロピオン酸などの多くのいずれか公知の活性化誘導体も、また、含まれる；
ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、２，４−ジアミノプロピオン酸のアルキル、アリール、アリールアルキル、及びヘテロアリールスルホンアミド、オルニチン、または、リシン、及び、テトラゾール−置換アルキルアミノ酸を含む酸性アミノ酸の置換；
ｅ）アスパラギン、グルタミン、及びアスパラギン若しくはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む側鎖アミド残基の置換；及び
ｆ）セリン、トレオニン、ホモセリン、２，３−ジアミノプロピオン酸、及びセリン若しくはトレオニンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む、ヒドロキシル含有アミノ酸の置換。
幾つかの例において、ＩＬ−１０は、１つまたはそれ以上の天然に発生する非遺伝的にコード化されたＬ−アミノ酸、合成したＬ−アミノ酸、または、アミノ酸のＤエナンチオマーを含む。幾つかの実施形態では、ＩＬ−１０は、Ｄ−アミノ酸のみを含む。例えば、ＩＬ−１０ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の下記の残基を含むことができる：ヒドロキシプロリン、β−アラニン、ｏ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、ｍ−アミノメチル安息香酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、オルニチン、シトルリン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ノルロイシン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−フルオロフェニルアラニン、３−フルオロフェニルアラニン、４−フルオロフェニルアラニン、ペニシラミン、１，２，３、４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、β−２−チエニルアラニン、メチオニンスルホキシド、ホモアルギニン、Ｎ−アセチルリシン、２，４−ジアミノ酪酸、ρ−アミノフェニルアラニン、Ｎ−メチルバリン、ホモシステイン、ホモセリン、ε−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘキサン酸、ω−アミノヘプタン酸、ω−アミノオクタン酸、ω−アミノデカン酸、ω−アミノテトラデカン酸、シクロヘキシルアラニン、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、δ−アミノ吉草酸、２，３−ジアミノ酪酸。
追加の改変
システイン残基またはシステイン類似体は、ジスルフィド結合を介して他のペプチドとの結合を可能にするか、またはＩＬ−１０ポリペプチドの環化を可能にするために、ＩＬ−１０ポリペプチドに導入することができる。システインまたはシステイン類似体を導入する方法は、当該分野で公知である（参照：例えば、Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８,０６７,５３２）。
ＩＬ−１０ポリペプチドは、環化することができる。１つ若しくはそれ以上のシステインまたはシステイン類似体は、ＩＬ−１０ポリペプチドに導入することができ、ここで、導入されたシステインまたはシステイン類似体は、二番目に導入されたシステインまたはシステイン類似体とジスルフィド結合を形成することができる。環化の他の手段としては、オキシムリンカーまたはランチオニンリンカーの導入が含まれる。例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８,０４４,１７５を参照のこと。環化結合を形成することができるアミノ酸（または非アミノ酸部分）の任意の組み合わせが使用され、及び／または、導入することができる。環化結合は、アミノ酸（または、アミノ酸と、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−、または、−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ−）と、ブリッジの導入を可能にする官能基との任意の組み合わせを用いて生成することができる。いくつかの例は、−（ＣＨ２）ｎ−炭素ブリッジ、チオアセタール、チオエーテルブリッジ（シスタチオニンまたはランチオニン）、及び、エステル及びエーテルを含むブリッジなどの、ジスルフィド、ジスルフィド模倣物である。これらの例において、ｎは任意の整数であるが、しばしば１０未満であり得る。
他の改変には、例えば、Ｎ−アルキル（またはアリール）置換（Ψ［ＣＯＮＲ］）、または、ラクタム及び他の環状構造を構築するための骨格架橋が挙げられる。他の誘導体は、Ｃ末端ヒドロキシメチル誘導体、ｏ−改変誘導体（例えば、Ｃ−末端ヒドロキシメチルベンジルエーテル）誘導体；アルキルアミド及びヒドラジドなどの置換アミドを含むＮ−末端改変誘導体を含む。
幾つかの例において、ＩＬ−１０ポリペプチド中の１つまたはそれ以上のＬ−アミノ酸は、１つまたはそれ以上のＤ−アミノ酸で置換される。
いくつかの例において、ＩＬ−１０ポリペプチドは、レトロインベルソ類似体である（参照：例えば、Ｓｅｌａ ａｎｄ Ｚｉｓｍａｎ （１９９７） ＦＡＳＥＢ Ｊ． １１：４４９）。レトロインベルソペプチド類似体は、例えば、Ｌ−アミノ酸よりむしろＤ−アミノ酸を用いて、アミノ酸配列の方向が逆転し（レトロ体）、その中に１つまたはそれ以上のアミノ酸のキラリティ、Ｄ体若しくはＬ体が反転した（インベルソ）線状ポリペプチドの異性体である［参照：例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８：７４４； 及びＢｒａｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３６８：６９２］。
ＩＬ−１０ポリペプチドは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜、または小胞膜を横断することを支援する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または有機、若しくは、無機分子を意味する「タンパク質導入ドメイン」（ＰＴＤ）を含むことができる。別の分子に結合したＰＴＤは、細胞外空間から細胞内空間へ、またはオルガネラ内の細胞質ゾルへ行くために、膜を横断する分子を支援する。幾つかの実施形態においては、ＰＴＤは、共有結合でＩＬ−１０ポリペプチドのアミノ末端に連結されるが、一方、他の実施形態においては、ＰＴＤは、共有結合的にＩＬ−１０ポリペプチドのカルボキシル末端に連結される。典型的なタンパク質伝達ドメインとしては、最小のウンデカペプチドタンパク質導入ドメインを含むがそれに限定されるものではない（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号３を含むＨＩＶ−１ ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）；細胞に直接入力するのに十分なアルギニン残基の数を含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０アルギニン）；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９（６）：４８９−９６）；ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質導入ドメイン；（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２−１７３７）；切断されたヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８−１２５６）；ポリリシン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３−１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号４）；トランスポータン：ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号５）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号６）；及び、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号７）を含む。典型的なＰＴＤは、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号８）；ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号９）；３残基〜５０残基のアルギニンホモポリマーを含むが、それに限定されない。典型的なＰＴＤドメインアミノ酸配列は、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１０）；ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１１）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１２）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１３）；及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１４）のいずれかを含むがそれに限定されない。
ＩＬ−１０ポリペプチドのＣ末端でアミノ酸のカルボキシル基ＣＯＲ３は、遊離形態（Ｒ３＝ＯＨ）で、または、生理学的に耐性のある、例えば、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などアルカリまたはアルカリ土類塩の形態などで存在することができる。カルボキシル基は、また、例えば、メタノール、分枝状または非分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキルアルコール、例えば、エチルアルコールまたはｔｅｒｔ−ブタノールなどの第一級、第二級または第三級アルコールでエステル化することができる。カルボキシル基は、また、アンモニア、分枝状または非分枝状のＣ１〜Ｃ６アルキルアミン、またはＣ１〜Ｃ６ジアルキルアミン、例えば、メチルアミンまたはジメチルアミンなどの第一級または第二級アミンでアミド化できる。
ＩＬ−１０ポリペプチドのＮ末端でのアミノ酸ＮＲ１Ｒ２のアミノ基は、遊離型（Ｒ１＝Ｈ及びＲ２＝Ｈ）、または、例えば、クロリドまたは酢酸塩のような生理学的に耐性のある塩の形態で存在することができる。Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝アセチル、トリフルオロアセチル、またはアダマンチルのような酸でアセチル化できる。アミノ基は、また、上記で提供されるものなど、ペプチド化学で従来より使用されているアミノ保護基で保護された形態で存在し得る（例えば、Ｆｍｏｃ、ベンジルオキシ−カルボニル（Ｚ）、Ｂｏｃ、及びＡｌｌｏｃ）。アミノ基は、Ｎ−アルキル化でき、ここで、Ｒ１、及び／または、Ｒ２＝Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、または、Ｃ７〜Ｃ９アラルキルである。アルキル残基は、直鎖状、分枝状または環状であり得る（例えば、それぞれ、エチル、イソプロピル及びシクロヘキシル）。
ＩＬ−１０機能を強化し、及び／または、擬態するための特定の改変
本明細書に開示された治療法（例えば、ＩＬ−１０ムテイン）、及び／または、それらが投与される方法における１つまたはそれ以上の物理的特性を向上させることは、しばしば有益であり、時には必須である。物理的特性の改善は、例えば、免疫原性を調節；水溶解性の増加、バイオアベイラビリティ、血清半減期、及び／または、治療半減期、及び／または、生物学的活性の調節を含む。ある改変は、また、例えば、検出アッセイ（例えば、エピトープタグ）で使用するための抗体を産生するのに、及びタンパク質精製を容易にするために提供するのに有用であり得る。そのような改変は、一般的に、治療法の生物活性に悪影響を与えることなく、及び／または、その免疫原性を増大させることなく付与される必要がある。
ＩＬ−１０のＰＥＧ化は、本開示により意図される特定の一改変であり、一方、他の改変は、以下の項目を含むがそれに限定されない：グリコシル化（Ｎ−及びＯ−連結）；ポリシリル化；血清アルブミンを含むアルブミン融合分子（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、シアノ血清アルブミン；またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））；例えば、共役脂肪酸鎖（アシル化）を通して結合するアルブミン；及び、Ｆｃ融合タンパク質。更に、ＰＥＧ擬態は、本明細書で意図する他の改変を表す。
ＰＥＧ化：タンパク質治療薬の臨床効果は、多くの場合、プロテアーゼ分解する短い血漿半減期及び感受性により制限される。非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの多様な、いずれかのポリペプチド配列と結合し、または、連結することを含む、様々な治療用タンパク質の研究は、そのような困難性が様々な改変により克服され得ることが示されている。これは、頻繁に、タンパク質及び非タンパク質ポリマー、例えば、ＰＥＧの両方に共有結合で結合された連結部分により行われる。そのようなＰＥＧで結合した生体分子は、良好な物理的及び熱的安定性、酵素分解の感受性に対する保護、増大した溶解性、長い生体内での循環半減期及び低下したクリアランス、低下した免疫原性及び抗原性、及び低下した毒性を含む、臨床的に有用な特性を有することが示される。
薬物動態パラメータに及ぼすＰＥＧ化の有益な効果に加えて、ＰＥＧ化自体が活性を高めることができる。例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、非ＰＥＧ化ＩＬ−１０よりも特定の癌に対してより有効であることが示される。（参照：例えば、ＥＰ２０６６３６Ａ２）。
ポリペプチド配列への結合に適したＰＥＧは、一般的に、室温で水に可溶性であり、及び一般式、Ｒ（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、ここに、Ｒは、水素、または、アルキルまたはアルカノール基などの保護基であり、ｎは、１〜１０００の整数である。Ｒが保護基である場合、それは、一般的に、１〜８個の炭素を有する。ポリペプチド配列に結合したＰＥＧは、直鎖状または分枝状であり得る。分枝状ＰＥＧ誘導体、「スターＰＥＧ」、及び、マルチアームのＰＥＧは、本開示により意図される。本開示で使用されるＰＥＧの分子量（分子量）は、いずれかの特定の範囲に限定されるものではない。他の実施形態は、４ｋＤａ〜１０ｋＤａの間の分子量を有するが、ある実施形態は、５ｋＤａ〜２０ｋＤａの間の分子量を有する。追加の分子量を有するＰＥＧを記載する更なる実施形態は、本明細書の他の箇所に記載される。
本開示は、また、複合体の組成物を意図し、ここに、ＰＥＧは、異なるｎ値を有し、その結果、様々な異なったＰＥＧは、特定の比率で存在する。例えば、いくつかの組成物は、複合体の混合物を含み、ここで、ｎ＝１、２、３及び４である。幾つかの組成物では、複合体のパーセントは、ｎ＝１の場合、１８〜２５％、ｎ＝２の場合、５０〜６６％、ｎ＝３の場合、１２〜１６％、ｎ＝４の場合、高々５％である。そのような組成物は、当該技術分野で既知の反応条件及び精製方法により産生できる。典型的な反応条件は、本明細書を通じて記載されている。カチオン交換クロマトグラフィーは、複合体を分離するために使用され、次に、例えば、結合した望ましい数のＰＥＧを有する複合体を含む画分が同定されて、未改変タンパク質、及び、結合した別の数のＰＥＧを有する複合体を除去するために精製される。
ＰＥＧ化は、最も頻繁に、ポリペプチドのＮ終端、リシン残基の側鎖上のε−アミノ基、及びヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基で起こる。ほとんどの組換えポリペプチドは、単一のα、及び、多数のεアミノ、及びイミダゾール基を有しているので、多くの位置異性体はリンカーの化学的性質に応じて生成できる。当該分野で公知の一般的なＰＥＧ化戦略は、本明細書で適用することができる。ＰＥＧは、ポリペプチド配列の１つまたはそれ以上の遊離アミノ基またはカルボキシル基及びポリエチレングリコールの間の結合を仲介する末端反応性基（「スペーサー」）を介して、本開示のポリペプチドに結合することができる。遊離アミノ基に結合し得るスペーサーを有するＰＥＧは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドポリエチレングリコールを含み、それは、Ｎ−スクシンイミドを有するポリエチレングリコールのコハク酸エステルを活性化することにより調製し得る。遊離アミノ基に結合し得る他の活性化ポリエチレングリコールは、２，４−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンであり、これは、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル及びシアヌルクロリドを反応させることにより調製し得る。遊離のカルボキシル基に結合する活性化ポリエチレングリコールは、ポリオキシエチレンジアミンを含む。
スペーサーを有するＰＥＧに対する、本開示のポリペプチド配列のうちの１つまたはそれ以上の結合は、様々な従来の方法により実施し得る。例えば、結合反応は、ｐＨ５〜１０の溶媒中、４℃〜室温の温度、３０分〜２０時間の間、タンパク質対試薬のモル比が４：１〜３０：１で実施できる。反応条件は、望ましい程度の置換を産生するように、反応を誘導することを選択できる。一般的に、低温で、低ｐＨ（例えば、ｐＨ＝５）、及び短い反応時間は、結合したＰＥＧの数を減少させる傾向にあり、一方、例えば、高温で、中性から高ｐＨ（ｐＨ≧７）、及びより長い反応時間は、結合したＰＥＧの数を増加させる傾向にある。当該分野で公知の種々の手段は、反応を停止するために使用できる。幾つかの実施形態において、反応は、反応混合物を酸性化し、例えば、−２０℃で凍結することにより停止する。種々の分子のＰＥＧ化は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ，Ｎｏ．５，２５２，７１４；５，６４３，５７５；５，９１９，４５５；５，９３２，４６２；及び５，９８５，２６３に記載されている。ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．７，０５２，６８６に記載されている。使用が意図される特定の反応条件は、本明細書の実験の項に記載されている。
上記で示したように、ＰＥＧ化は、最も頻繁に、Ｎ−終端、リシン残基の側鎖、及びヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基で起こる。そのようなＰＥＧ化の有用性は、例えば、反応条件の最適化及び精製プロセスの改良による精製で強化される。最近の残基に特異的な化学は、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、セリン、トレオニン、及びチロシン、並びに、カルボキシ末端のＰＥＧ化を可能にする。このいくつかのアミノ酸残基は、具体的には、ＰＥＧ化できるが、他のものは、より無差別的であるか、またはある条件下での部位特異的ＰＥＧ化のみをもたらす。
更なるアミノ酸残基のＰＥＧ化を可能にする現在のアプローチは、橋かけＰＥＧ化（ジスルフィド橋かけ）、酵素的ＰＥＧ化（グルタミン及びＣ終端）及びグリコＰＥＧ化（Ｏ−、及び、Ｎ−グリコシル化、または、糖タンパク質のグリカン部位）、及びヘテロ二官能性のＰＥＧ化を含む。更なるアプローチは、非天然アミノ酸、Ｃ末端ＰＥＧ化のための融合タンパク質、トランスグルタミナーゼ媒介ＰＥＧ化、ソルターゼＡ介在のＰＥＧ化、並びに、分離可能な、及び、非共有結合ＰＥＧ化を含むタンパク質のＰＥＧ化に描かれる。 更に、遺伝子工学的手法を用いた特定のＰＥＧ化の組み合わせのアプローチは、ポリエチレングリカンポリマーを、例えば、独立した反応性基を有する天然、または、非天然アミノ酸を有するポリペプチドの特定アミノ酸残基の置換のために、タンパク質表面のいかなる位置にも本質的に連結することを可能にする。参照：一般的には、例えば、Ｐａｓｕｔ，Ｇ． ａｎｄ Ｖｅｒｏｎｅｓｅ， Ｆ．Ｍ．，（２０１２） Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １６１：４６１−７２； Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１２） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．６４：１１６−２７； Ｊｅｖｓｅｖａｒ， Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｊ． ５：１１３−２８； 及び Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｙ．（２０１１） Ｃｈｅｍ． Ｃｅｎｔｒａｌ Ｊ．５：２５。
ＰＥＧ化分子の治療的価値は十分に検証される。以前の及び／または現在の医薬産生物は、オモンティス（アフィマックス／Ｔａｋｅｄａ）；ペグロチケース（サビエント）；ギムジア（ネクタール／ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ）；マクゲン（Ｐｒｉｚｅｒ）；ノイラスタ（Ａｍｇｅｎ）；ソマベルト（Ｐｒｉｚｅｒ）；ペガシス（Ｒｏｃｈｅ）；ドキシル（Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）；及び、ペギントリン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）を含む。
本開示は、また、ＰＥＧ模倣体の使用を意図する。ＰＥＧの属性（例えば、強化された血清半減期）を保持した組換えＰＥＧ模倣物は、いくつかの追加の有利な特性を付与しながら、開発されている。例を用いて、ＰＥＧと同様の拡張型立体配座を形成することができる（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＴｈｒを含む）単純なポリペプチド鎖は、既に組換えで産生され、目的のペプチドまたはタンパク質薬剤に融合させることができる（例えば、Ａｍｕｎｉｘ’ ＸＴＥＮ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）。これは、製造プロセス中に追加の接合工程を不要にする。その上、確立された分子生物学的技術は、免疫原性及び製造特性の最適化を可能にするポリペプチド鎖の側鎖の組成を制御することを可能にする。
グリコシル化：本開示の目的では、「グリコシル化」は、広く、タンパク質、脂質または他の有機分子にグリカンを付加する酵素的プロセスを参照することを意味する。本開示に関連して、用語「グリコシル化」の使用は、一般的に、１つまたはそれ以上の炭水化物部分を付加する、または、欠失する（内在するグリコシル化部位を除去することによって、または化学的、及び／または、酵素的手段によりグリコシル化を欠失させることにより）ことを意味することが意図されており、及び／または、天然配列中に存在しても、しなくてもよい１つまたはそれ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この語句は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化の質的変化を含んでいる。
グリコシル化は、劇的に、ＩＬ−１０などのポリペプチドの物理的性質（例えば、溶解性）に影響を及ぼすことができ、また、タンパク質安定性、分泌、及び細胞内局在化において重要であり得る。グリコシル化ポリペプチドは、また、強化された安定性を示すことができるか、半減期のような１つ以上の薬物動態特性を改良することができる。更に、溶解度の改良は、例えば、非グリコシル化ポリペプチドを含む製剤よりも、医薬品投与に、より適した製剤の生成を可能にすることができる。
適切なグリコシル化は、生物学的活性に必須であり得る。実際には、タンパク質をグリコシル化するための細胞プロセスを欠いている細菌で発現した場合（例えば、大腸菌）、真核生物からのいくつかの遺伝子は、グリコシル化の欠如により、活動がほとんどない、あるいは全くなくても、回収されるタンパク質をもたらす。
グリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を改変することによって達成できる。 ポリペプチドの改変は、例えば、１つまたはそれ以上のセリンまたはトレオニン残基（Ｏ−結合されたグリコシル化部位）、またはアスパラギン残基（Ｎ−結合されたグリコシル化部位）により、付加または置換により作成し得る。各タイプに見られるＮ−結合型及びＯ−結合型オリゴ糖及び糖残基の構造は異なってもよい。両方に、一般的に、見出される糖の一種は、Ｎ−アセチルノイラミン酸である（以下シアル酸と称される）。シアル酸は、その負電荷により、通常は、Ｎ−結合型及びＯ−結合型の両方のオリゴ糖の末端残基であり、糖タンパク質に酸性性質を付与できる。本開示の特定の実施形態は、Ｎ−グリコシル化変異体の生成および使用を含む。
本発明のポリペプチド配列は、望ましいアミノ酸に翻訳されるコドンが産生されるように、予め選択された塩基で、特に、ポリペプチドをコード化する核酸を変異させることにより、核酸レベルでの変化を介して、場合により、変更することができる。ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的または酵素的結合による。炭水化物の除去は、化学的または酵素的に達成し、またはグリコシル化されたアミノ酸残基をコード化するコドンの置換により達成できる。化学的脱グリコシル化技術は公知であり、ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、多様なｅｎｄｏ−及びｅｘｏ−グリコシダーゼの使用により達成することができる。
ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）−欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、組換え糖タンパク質の産生のために一般的に使用される宿主細胞である。これらの細胞は、酵素、β−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼを発現しないので、従って、シアル酸をα−２，６−結合で、これらの細胞中で産生された糖タンパク質のＮ−結合型オリゴ糖に付加しない。
ポリシアリル化：本開示は、また、ポリペプチドの安定性、及び、生体内薬物動態を改良するために、ポリシアリル化、ポリペプチドの自然に産生する生分解性のα−（２→８）−結合のポリシアル酸（「ＰＳＡ」）の結合を意図する。ＰＳＡは、高度に親水性であり、その血清半減期を増加させる、血液中の高い見かけの分子量を与える生分解性で、非毒性の天然ポリマーである。また、ペプチド及びタンパク質治療薬の範囲のポリシアル化は、著しく低下したタンパク質分解、生体内活性の保持、並びに、免疫原性及び抗原性の低下につながる（参照：例えば、Ｇ． Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ （２００５） ３００（１−２）：１２５−３０）。部位固有のポリシアル化のために、他の複合体（例えば、ＰＥＧ）による改変と同様に、様々な技術が利用できる。（参照：例えば、Ｔ．Ｌｉｎｄｈｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１１） ＰＮＡＳ １０８（１８）７３９７−７４０２）。
アルブミン融合：追加の適切な成分及び結合のための分子は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのアルブミンを含む。
約２０日の血清半減期を有する成熟ＨＳＡ、５８５アミノ酸のポリペプチド（約６７ｋＤａ）は、コロイド浸透血圧、血液ｐＨ、及びトランスポート、及び、多数の内因性及び外因性リガンドの分布を維持するために主要な責任がある。タンパク質は、構造的に相同性の３つのドメイン（ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩ）を有し、α−ヘリックス立体配座がほぼ完全であり、かつ１７ジスルフィド橋かけにより高度に安定化される。アルブミンの３つの主要な薬物結合領域は、サブドメインＩＢ、ＩＩＡ及びＩＩＩＡ内の３つのドメインのそれぞれに配置されている。
アルブミンの合成は、短命で、一次産品のプレプロアルブミンを産生する肝臓で行われる。従って、ＨＳＡの全長は、６個のアミノ酸のプロドメイン（ＲＧＶＦＲＲ；配列番号１６）が続く、１８個のアミノ酸（ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ；配列番号１５）のシグナルペプチドを有する。この２４個のアミノ酸残基は、プレプロドメインと参照される。ＨＳＡは発現し、プレプロドメインとしての、その内因性シグナルペプチドを用いて分泌することができる。あるいは、ＨＳＡは発現し、成熟構造に融合したＩｇＫシグナルペプチドを用いて分泌することができる。プレプロアルブミンは、安定な、６０９アミノ酸前駆体ポリペプチドであるプロアルブミンを産生するために、そのアミノ終端に小胞体の内腔で、急速に同時翻訳的に切断される。プロアルブミンは、その後、それがフリン依存アミノ末端切断によって５８５アミノ酸の成熟アルブミンに転換されるゴルジ装置を通過する。
アルブミンの合成及び分泌のプロセスであるように、アルブミンの一次アミノ酸配列、構造、及び機能は、種間で高度に保存されている。ＨＳＡに匹敵するアルブミン血清タンパク質は、例えば、カニクイザル、ウシ、イヌ、ウサギ、及びラットで発見された。非ヒト種であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ＨＳＡに最も構造的に類似している（参照：例えば、Ｋｏｓａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｏｖ ２００７ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ． ９６（１１）：３１１７−２４）。本開示は、例えば、薬物開発プロセスにおいて、上記で記載したものを含む非ヒト種からのアルブミンの使用を意図するが、それらに限定されない。
本開示によると、アルブミンは、カルボキシル終端で、アミノ終端で、カルボキシル及びアミノ終端の両方で、及び内部で薬物分子（例えば、本明細書に記載のポリペプチド）に結合することができる（参照：例えば、ＵＳＰ５８７６９６９及びＵＳＰ７０５６７０１）。
本開示によって意図される、ＨＳＡ−薬物分子複合体において、アルブミン分泌プレ配列、及びその変異体、フラグメント及びその変異体、及びＨＳＡ変異体などのアルブミンの多様な形態が使用できる。このような形態は、一般的に、１つまたはそれ以上の望ましいアルブミン活性を有する。更なる実施形態において、本開示は、アルブミン、アルブミンフラグメント、アルブミン変異体等に、直接的に、または間接的に、融合するポリペプチドの薬物分子を含む融合タンパク質を含有し、ここに、融合タンパク質は、未融合タンパク質分子より高い血漿安定性を有し、及び／または、融合タンパク質は、未融合タンパク質分子の治療活性を保持する。幾つかの実施形態では、間接的な融合は、例えば、ペプチドリンカーまたはその改変版のリンカーによって行われる。
細胞内の切断は、例えば、フリンまたはカスパーゼによって、酵素的に行うことができる。細胞は、細胞内で融合分子の一部を切断することができるこれらの低レベルの内因性酵素を発現する。従って、ポリペプチドの一部は、ＨＳＡに結合化されることなく、細胞から分泌されるが、他のものは、ＨＳＡを含む融合分子の形態で分泌される。本開示の実施形態は、様々なフリン融合構築物の使用を意図する。例えば、構築物は、ＲＧＲＲ（配列番号１７）、ＲＫＲＫＫＲ（配列番号１８）、ＲＫＫＲ（配列番号１９）、またはＲＲＲＫＫＲ（配列番号２０）の配列を含むように設計することができる。
本開示は、また、細胞外切断を意図（生体外で切断）し、それにより、融合分子は、細胞から分泌し、精製を行い、その後、切断される。切除が、ＨＳＡリンカー複合体全体を、成熟ＩＬ−１０から解離してもよく、または、全ＨＳＡリンカー複合体の少ない部分を解離してもよいことが理解される。
上記に言及したように、本開示の１つまたはそれ以上のポリペプチドへのアルブミンへの融合は、例えば、ＨＳＡをコード化する核酸、またはそのフラグメントが、１つまたそれ以上のポリペプチド配列をコード化する核酸に連結されるように遺伝子操作で実施できる。その後、適当な宿主細胞は、形質転換することができ、または融合ポリペプチドを発現するように、例えば、適切なプラスミドの形態で遺伝子導入できる。発現は、例えば、原核細胞または真核細胞から生体外で行うことができ、または、例えば、遺伝子導入生物から、生体内で行なうことができる。本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質の発現は、哺乳動物細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞株において行われる。形質転換は、細胞膜、外因性の遺伝物質（外因性の核酸）の導入及び発現を介した直接取り込みに起因する細胞の遺伝的改変を指すために本明細書に広く使用される。形質転換は、いくつかの細菌において自然に発生するが、それはまた、他の細胞内では、人工的な手段によっても行うことができる。
さらにその上、アルブミン自体が、その循環半減期を延長するために改変できる。ＩＬ−１０への改変アルブミンの融合は、上記により、または、化学的結合により説明される遺伝子操作技術によって達成することができ、得られた融合分子は、非改変アルブミンとの融合を超える半減期を有する（参照：ＷＯ２０１１／０５１４８９）。
代替アルブミン結合の戦略：幾つかのアルブミン結合戦略は、結合脂肪酸鎖（アシル化）を介してアルブミン結合を含む直接融合の代替肢として開発された。血清アルブミンは、脂肪酸のための輸送タンパク質であるので、アルブミン結合活性を有するこれらの天然のリガンドは、小さなタンパク質治療薬の半減期を延長するために使用されてきた。例えば、インスリンデテミル（ＬＥＶＥＭＩＲ）、糖尿病のための承認された製品は、遺伝的に改変されたインスリンに結合したミリスチル鎖を含み、その結果、長時間作用型インスリン類似体をもたらした。
本開示は、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチド配列、及び、本明細書に記載のポリペプチドの１つまたはそれ以上の結合配列を含む融合タンパク質を意図する。文献に記載されたＡＢＤポリペプチド配列は、融合タンパク質の構成要素であり得る。融合タンパク質の構成要素は、場合により、本明細書に記載されるリンカーなどのリンカーを介して共有結合的に結合することができる。本開示のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてのＡＢＤポリペプチド配列、及び、Ｃ末端部分としての本明細書に記載のポリペプチドを含む。
本開示は、また、アルブミン結合ポリペプチドのフラグメントを含む融合タンパク質を意図し、ここで、フラグメントは、実質的に、アルブミン結合を保持し；または、単量体ユニットとしての、少なくとも２つのアルブミン結合ポリペプチド、または、そのフラグメントを含む、アルブミン結合の多量体、またはそのフラグメントを保持する。ＡＢＤ及び関連技術の一般的議論のために、ＷＯ２０１２／０５０９２３、ＷＯ２０１２／０５０９３０、ＷＯ２０１２／００４３８４、及び、ＷＯ２００９／０１６０４３を参照されたい。
他の分子との結合：追加の適切な成分と結合体化のための分子としては、例えば、サイログロブリン；破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；例えばポリアミノ酸（Ｄ−リシン：Ｄ−グルタミン酸）；ロタウイルスのＶＰ６ポリペプチド；インフルエンザウイルス血球凝集素；インフルエンザウィルス核タンパク質；キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）；及び、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質及び表面抗原、またはそのいずれかの組み合せを含む。
従って、本開示は、ポリペプチド配列のＮ−、及び／または、Ｃ終端で、そのような別のポリペプチド（例えば、対象ポリペプチドに対して異種のアミノ酸配列を有するポリペプチド）、または担体分子などの、１つまたはそれ以上の追加の成分または分子の結合を意図する。従って、典型的なポリペプチド配列は、他の成分または分子との複合体として提供できる。
結合の改変は、追加の、または、相補的な機能を有する活性、または第二の分子から誘導される活性を保持するポリペプチド配列をもたらし得る。例えば、ポリペプチド配列は、例えば、生体内、または、貯蔵寿命の半減期における溶解性、貯蔵性、または、安定性、免疫原性の低下、生体内での遅延または制御放出などを容易にするために、分子に結合することができる。他の機能または活性は、非複合化ポリペプチド配列に対する毒性を低下させる結合；非複合化ポリペプチド配列よりも効率的に細胞または器官のタイプを標的とする複合体；または本明細書に記載の疾患、障害、状態（例えば、癌）に関連する原因または結果を更に阻止するための薬物を含む。
ＩＬ−１０ポリペプチドは、また、タンパク質；セファロース、アガロース、セルロース、または、セルロースビーズなどの多糖類；ポリグルタミン酸またはポリリシンなどのポリマーアミノ酸；アミノ酸コポリマー；不活化ウイルス粒子；ジフテリア、破傷風、コレラ、または、ロイコトキシン分子からのトキソイド形態などの不活性化細菌毒素；不活性化された細菌；樹状細胞などのような、大きく、徐々に代謝される巨大分子に結合させることができる。そのような複合体の形態は、希望すれば、本開示のポリペプチドに対する抗体を産生するために使用することができる。
複合化のための成分及び分子の追加の候補は、単離または精製に適したものを含む。特定の非限定的な例としては、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対）などの結合分子、抗体、受容体、リガンド、レクチン、または、例えば、プラスチック、またはポリスチレンビーズ、プレート、磁気ビーズ、試験片及び膜を有する固体支持体を含む分子を含有する。
カチオン交換クロマトグラフィーなどの精製法は、効果的に、複合体を種々の分子量に分離する電荷差により複合体を分離するために使用できる。例えば、カチオン交換カラムは、装填し、次いで、ｐＨが約４の２０ｍＭ酢酸ナトリウムで洗浄した後、約３〜５．５のｐＨで、例えば、ｐＨ約４．５で、ＮａＣｌの直線勾配（０Ｍ〜０．５Ｍ）緩衝液で溶出した。カチオン交換クロマトグラフィーで得られた画分の含有量は、例えば、従来方法の、質量分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、分子量により分子実体を分離するための他の公知の方法を用いて分子量により同定することができる。
Ｆｃ−融合分子：特定の実施形態では、本開示のポリペプチド配列のアミノ終端またはカルボキシル終端は、融合複合体（または融合分子）を形成するため、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ヒトＦｃ）と融合することができる。Ｆｃ融合複合体は、バイオ医薬品の全身での半減期を伸長させることを示し、したがって、このバイオ医薬製品は、より少ない頻度での投与を必要とするかもしれない。
Ｆｃは、血管を整列する内皮細胞において、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、結合時、Ｆｃ融合分子を分解から保護し、より長い循環中に分子を保持する循環中に再放出される。このＦｃ結合は、内因性ＩｇＧがその長い血漿半減期を保持する機構であると考えられている。最近のＦｃ融合技術は、従来のＦｃ融合複合体と比較して、生物医薬品の薬物動態学、及び、薬物動態特性を最適化するために抗体のＦｃ領域に生物薬剤の単一コピーをリンクする。
他の改変：本開示は、１つまたはそれ以上の特性を改善するために、ＩＬ−１０の現在知られている、または将来開発する他の改変の使用を意図する。そのような方法の１つは、そのポリペプチド配列の特性を改変するために、他の分子に結合したヒドロキシエチルデンプン誘導体を活用するＨＥＳ化によるポリペプチド配列の改変を含む。ＨＥＳ化の様々な態様は、例えば、Ｕ．Ｓ．ＰａｔｅｎｔＡｐｐｌｎ．Ｎｏ．２００７／０１３４１９７及び２００６／０２５８６０７に記載されている。
本開示は、また、融合タグ（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ社；Ｍａｌｖｅｒｎ,ＰＡ）のような小さいユビキチン様改変体（ＳＵＭＯ）を含む融合分子を意図する。ＳＵＭＯと本明細書に記載のポリペプチドとの融合は、精製方法の開発における発現の強化、溶解性の改良、及び／または、支援を含むいくつかの有益な効果を、伝えることができる。ＳＵＭＯプロテアーゼは、ＳＵＭＯの三次構造を認識し、ＳＵＭＯのＣ終端で融合タンパク質を切断し、その結果、望ましいＮ末端アミノ酸と共に、本明細書に記載のポリペプチドを放出する。
本開示は、また、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（商標）（ＸＬ−プロテイン社（フライジング、ドイツ））の使用を意図する。この技術は、腎糸球体の細孔サイズを超えて、タンパク質の治療生物活性に悪影響を及ぼすことなく、目的のタンパク質の見かけの分子サイズを拡大させ、それにより、タンパク質の腎クリアランスを低下させる。
リンカー：リンカー及びその使用は上記で記載した。本開示のポリペプチド配列を改変するために使用される上述の構成成分及び分子のいずれかは、場合により、リンカーを介して結合することができる。適切なリンカーは、改変されたポリペプチド配列と連結された構成成分及び分子間のいくつかの運動を可能にするために、一般的に、十分な長さである「柔軟性リンカー」を含む。リンカー分子は、一般的に、約６〜５０原子長である。リンカー分子は、また、例えば、アリールアセチレン、２〜１０単量体単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはその組み合わせを含んでもよい。適切なリンカーは、１アミノ酸（例えば、グリシン）、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０、または５０より多くのアミノ酸など、容易に選択することができ、任意の適切な長さにすることができる。
典型的な柔軟性リンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号２１）、ＧＧＧＳｎ（配列番号２２）、（ＧｍＳｏ）ｎ、（ＧｍＳｏＧｍ）ｎ、（ＧｍＳｏＧｍＳｏＧｍ）ｎ（配列番号２３）、（ＧＳＧＧＳｍ）ｎ（配列番号２４）、（ＧＳＧＳｍＧ）ｎ（配列番号２５）及び（ＧＧＧＳｍ）ｎ（配列番号２６）、及びその組み合せを含み、ここに、ｍ及びｏは、それぞれ独立して、少なくとも１つの整数から選択される）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び他の柔軟性リンカーから選択される。グリシン及びグリシン−セリンポリマーが比較的構造化され、従って、構成成分間の中立テザーとして機能することができる。典型的な柔軟性リンカーとしては、ＧＧＳＧ（配列番号２７）、ＧＧＳＧＧ（配列番号２８）、ＧＳＧＳＧ （配列番号２９）、ＧＳＧＧＧ（配列番号３０）、ＧＧＧＳＧ（配列番号３１）、及びＧＳＳＳＧ（配列番号３２）を含むが、それに限定されない。
本開示のある実施形態において、ＰＥＧは、１つまたはそれ以上のＰＥＧ分子に共有結合で結合する活性化されたリンカーを介してＩＬ−１０に結合している。リンカーは、化学的に反応し、反応基のＯＮＡペプチドへの共有結合のために準備されている場合、リンカーは、「活性化」される。本開示は、それが１つまたはそれ以上のＰＥＧ分子を収納し、そして、適切な反応条件でアミノ酸残基と共有結合を形成することができる条件下での、任意の活性化リンカーの使用を意図する。特定の態様では、活性化リンカーは、他の結合部位上に高度に選択的にαアミノ基に結合する（例えば、リシンのε−アミノ基またはヒスチジンのイミノ基）。
幾つかの実施形態において、活性化ＰＥＧは、式：（ＰＥＧ）ｂ−Ｌ′で表され、ここで、ＰＥＧは、エーテル結合を形成するために、リンカーの炭素原子に共有結合し、ｂは、１〜９（すなわち、１〜９個のＰＥＧ分子がリンカーに結合できる）であり、そして、Ｌ′は、ＩＬ−１０へのＰＥＧの共有結合を提供するために、例えば、アミノ酸残基上のアミノ基またはイミノ基と反応することができる反応基（活性化部分）を含む。他の実施形態では、活性化リンカー（Ｌ′）は、Ｒが直鎖または分枝鎖のＣ１−１１のアルキル基である式ＲＣＨＯのアルデヒドを含み、ＩＬ−１０の活性化リンカーとの共有結合の後に、リンカーは、２〜１２個の炭素原子を含む。本開示は、プロピオンアルデヒドが典型的な活性化リンカーである、実施形態を意図する。ＰＥＧプロピオンアルデヒド（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯ）は、Ｕ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５,２５２,７１４に記載されており、市販されている（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）。他の活性化ＰＥＧリンカーは、例えば、 Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ｅｎｚｏｎ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）から、商業的に入手することができる。
いくつかの実施形態では、１つより多くのＰＥＧ分子をＩＬ−１０に共有結合することは望ましく、適切な活性化分枝リンカー（即ち、「多分枝」）が使用できる。２つまたはそれ以上のＰＥＧ分子をＩＬ−１０のアミノ酸残基上のアミノ基（例えば、Ｎ末端のαアミノ基）へ共有結合する任意の好適な分枝状のＰＥＧリンカーは使用できる。特定の実施形態では、本発明において使用される分枝状のリンカーは、２つまたは３つのＰＥＧ分子を含む。一例として、分枝状ＰＥＧリンカーは、上記で記載した通り、アミノ酸残基のアミノ基と反応する、加水分解的に安定であり、活性化された部分を含む直鎖状または分岐鎖状の脂肪族基（例えば、アルデヒド基）であり、分枝したリンカーの脂肪族基は、２〜１２個の炭素を含むことができる。いくつかの実施形態において、脂肪族基は、３個の炭素原子のそれぞれに最大３個のＰＥＧ分子を含む、ｔ−ブチル（すなわち、合計：９個のＰＥＧ分子）とｔ−ブチルの四番目の炭素上の反応性アルデヒド部分を含むことが可能である。
更なる典型的な分枝状ＰＥＧリンカーは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５,６４３,５７５、５,９１９,４５５、７,０５２,８６８、及び５,９３２,４６２に記載されている。当業者は、例えば、反応性アルデヒド部分の付加により、分枝状ＰＥＧリンカーへの改変を調製することができる。使用のためにリンカーを調製する方法も、また、当該分野で公知であり、例えば、上記でリストアップした米国特許に記載されている。
ＨＳＡ結合体で使用される典型的なリンカーは、当該分野で公知であり、［４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＨＳ）、及びＮ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）］などのヘテロ二官能性リンカーを含む。参照：Ｅｈｒｉｌｉｃｈ， ＧＫ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．（２０１３ Ｄｅｃ １８）； ２４（１２）：２０１５−２４。ＨＳＡリンカー及びその複合体の更なる例は、例えば、ＵＳ２０１２０００３２２１に記載されている。
治療的及び予防的使用
本開示は、疾患、障害及び／または状態及び／またはその症状の広い範囲の治療または予防における本明細書に記載のＩＬ−１０ポリペプチド（例えば、ＰＥＧ−ＩＬ−１０）の使用を意図する。特定の用途は、以下に詳細に記載されているが、本開示はそのように限定されないことを理解すべきである。更にその上、特定の疾患、障害及び状態の一般的なカテゴリーは、以下に記載されているが、疾患、障害及び状態のいくつかは、１つより多くのカテゴリ（例えば、癌及び線維症関連障害）のメンバーであってもよいし、他のものは開示されたカテゴリーのいずれかのメンバーではないかもしれない。
線維症関連障害及び癌：本開示によれば、ＩＬ−１０分子は、癌、例えば、子宮、子宮頸部、乳房、前立腺、精巣、消化管（例えば、食道、咽頭、胃、小規模または大規模な腸、結腸、または直腸）、腎臓、腎細胞、膀胱、骨、骨髄、皮膚、頭頸部、肝臓、胆嚢、心臓、肺、膵臓、唾液腺、副腎、甲状腺、脳（例えば、神経膠腫）、神経節、中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）、造血系の癌や免疫系（例えば、脾臓または胸腺）の癌を含む、増殖性の状態または疾患を治療または予防するために使用することができる。本開示は、また、例えば、免疫原性腫瘍、非免疫原性腫瘍、休眠腫瘍、ウイルス誘発性癌（例えば、上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮癌及びパピローマウイルス）、腺癌、リンパ腫、癌腫、黒色腫、白血病、骨髄腫、肉腫、奇形癌、化学的に誘導された癌、転移、及び血管形成を含む、他の癌関連の疾患、障害または状態を治療し、または予防する方法を提供する。本開示は、例えば、調節性Ｔ細胞、及び／または、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性を調節することにより、腫瘍細胞または癌細胞抗原に対する耐性を減少させることを意図する（参照：例えば、Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｍｏｎｔａｇｕｔ， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：３１８０−８７； 及び Ｓａｗａｙａ， ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ． Ｍｅｄ． ３４９：１５０１−０９）。特定の実施形態では、腫瘍または癌は、大腸癌、卵巣癌、乳癌、黒色腫、肺癌、神経膠芽腫、または白血病である。単数若しくは複数の用語、癌関連疾患、障害及び状態の使用は、癌に直接または間接的に関連し、例えば、血管新生、及び、異形成などの前癌性状態を含む、幅広い状態を参照する。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＩＬ−１０分子及び少なくとも１つの追加の治療薬または診断薬で、増殖状態、癌、腫瘍、または前癌状態を治療するための方法を提供する。その例は、本明細書の他の箇所に記載されている。
本開示はまた、線維性疾患、障害及び状態を治療し、または予防する方法を提供する。本明細書で使用する場合、用語「線維性疾患、障害及び状態」、並びに、類似の用語（例えば、「線維性障害」）、及び語句は、それが線維性組織または瘢痕組織の形成（例えば、１つまたはそれ以上の組織における線維症）をもたらすことができる任意の状態を含む様に、広く、解釈されるべきである。一例として、瘢痕組織を生じることがある外傷（例えば、創傷）は、皮膚、眼、肺、腎臓、肝臓、中枢神経系、及び心臓血管系の創傷を含む。この語句は、また、損傷または外科手術の結果として、例えば、脳卒中に起因する瘢痕組織形成、及び組織接着を包含する。
本明細書で用いられる用語「線維症」は、むしろ、器官または組織の正常な構成要素としてよりも、修復または反応過程としての線維組織の形成を指す。線維症は、任意の特定の組織における正常な沈着を超えた線維芽細胞蓄積及びコラーゲン沈着により特徴付けられる。
線維性疾患としては、創傷治癒、全身及び局所強皮症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺の炎症及び線維症、特発性肺線維症、間質性肺疾患、肝硬変、慢性Ｂ型またはＣ型肝炎感染症の結果としての線維症、腎疾患（例えば、糸球体腎炎）、瘢痕組織から発生する心臓病、ケロイドや肥厚性瘢痕、並びに、黄斑変性症、及び網膜硝子体や網膜症などの眼疾患から発生する線維症を含むが、それに限定されるものではない。追加の線維症は、化学療法薬剤誘発性の線維症、放射線誘発性線維症、及び怪我や火傷を含む。
線維性障害は、しばしば肝に関連し、そして肝細胞内のそのような疾患及び肝コレステロールの不適切な蓄積及びトリグリセリド間の結びつきが、しばしばある。この蓄積は、肝線維症及び肝硬変につながる炎症誘発性応答をもたらすように思われる。線維性成分を有する肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が挙げられる。ＮＡＦＬＤは、脂肪症（肝臓内の脂肪沈着）が存在する場合には、過度のアルコール使用に基づかないものが発生する。これは、インスリン抵抗性及びメタボリックシンドロームに関係している。ＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤの最も極端な形であり、原因不明の肝硬変の主な原因と考えられている。
循環器疾患：本開示は、また、特定の循環器疾患及び／または関連する代謝関連疾患、障害及び状態、並びに、それに関連する疾患を治療し、及び／または、予防するために本明細書に記載のＩＬ−１０分子の使用を意図する。
本明細書で使用する、用語「心血管疾患」、「心臓病」などは、心臓血管系、主に心疾患、脳及び腎臓の血管疾患、及び末梢動脈疾患に影響を与える疾患を意味する。心臓血管疾患は、冠動脈性心疾患（例えば、虚血性心疾患または冠状動脈疾患）、アテローム性動脈硬化症、心筋症、高血圧、高血圧性心疾患、肺性心、心律動異常、心内膜炎、脳血管疾患、及び末梢動脈疾患を含む疾患の一群である。心血管疾患は、世界中の死亡の主要な原因であり、それは、通常、高齢者に影響を与えるが、心血管疾患の先行条件、特にアテローム性動脈硬化症は、人生の早い段階で始まる。
本開示の特定の実施形態は、アテローム性動脈硬化症、慢性状態を、治療し、及び／または、予防するために、ＩＬ−１０ポリペプチドの使用に向けられ、ここに、動脈壁は、コレステロール及びトリグリセリドなどの脂肪物質の蓄積の結果として、プラークを形成するために厚くなる。アテローム性動脈硬化症は、しばしば、マクロファージの蓄積により主として引き起こされ、機能的な高密度リポタンパク質により、マクロファージから脂肪及びコレステロールを適切に除去されることなく、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）により促進する動脈壁における慢性炎症反応を含む。慢性的にアテローム性動脈硬化病変が拡大することは、内腔の完全な閉鎖を引き起こし、内腔狭窄は単数若しくは複数の下流組織への血液供給が不十分であるほど重症であるときにのみ現われ、その結果、虚血をもたらす。
ＩＬ−１０ポリペプチドは、例えば、心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、脳血管疾患（例えば、脳卒中）、及び末梢血管疾患に関連し得るコレステロール関連疾患の治療、及び／または、予防に特に有利である。例として、しかしそれには限定しないが、ＩＬ−１０ポリペプチドは、被験者の血中コレステロールレベルを低下させるために使用することができる。被験者が高コレステロール血症を有するかどうかを決定する際に、正常及び異常なコレステロールレベルとの間に堅固な境界がなく、値の解釈は、他の健康状態及びリスク因子と関連して行われる必要がある。それにもかかわらず、次のガイドラインは、米国で一般的に使用されている：総コレステロールが、＜２００ｍｇ／ｄＬが望ましく、２００〜２３９ｍｇ／ｄＬがボーダーラインで高く、≧２４０ｍｇ／ｄＬは高い。総コレステロールの高いレベルは、心血管疾患のリスクを増加させ、ＬＤＬまたは非ＨＤＬコレステロールの両レベルは、将来の冠動脈心疾患を予測する。高コレステロール血症を評価する場合、すべてのリポタンパク質サブフラクション（ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬ）を測定することは、しばしば有用である。特定の治療目標は、ＨＤＬを維持または増加させ、一方でＬＤＬを減少させることである。
血栓症及び血栓症状態：血栓症、血管内部の血栓（血の塊）の形成は、循環系を通る血流に閉塞が生じ、１つまたはそれ以上の凝固性亢進、血管内皮細胞の損傷、または、乱血流（うっ滞、乱流）（フィルヒョウの三要素）で示す異常により引き起こされることがあり得る。
血栓症は、一般的に、いくつかのサブタイプによって提示することができ、それぞれが静脈系または動脈系に分類される。静脈血栓症は、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、門脈血栓症、腎静脈血栓症、頚静脈血栓、バッド−キアリ症候群、パジェット−シュロッター病、脳静脈洞血栓症を含む。動脈血栓症には、脳卒中や心筋梗塞が含まれる。
他の疾患、障害及び状態は、心房血栓症及び真性多血症（また、紅斑、原発性赤血球増加症及び一次性赤血球増加症として知られている）、骨髄があまりにも多くの赤血球、白血球、及び／または、血小板を作る骨髄増殖性血液疾患を含む本開示で検討される。
免疫及び炎症状態：本明細書で使用される場合、「免疫疾患」、「免疫状態」、「免疫障害」、「炎症性疾患」、「炎症状態」、「炎症性障害」などの用語は、広く任意の免疫または炎症性に関連する状態（例えば、病理学的炎症及び自己免疫疾患）を包含することを意味する。そのような状態は、頻繁に、他の疾患、障害及び状態に、密接に絡み合っている。一例として、「免疫状態」は、免疫系による根絶に抵抗する感染症（急性及び慢性）、腫瘍、及び癌を含む、癌、腫瘍、及び血管形成などの増殖状態を参照できる。
例えば、炎症性サイトカインによって引き起こされ得る免疫及び炎症に関連する疾患、障害及び状態の非限定的リストは、関節炎、腎不全、狼瘡、喘息、乾癬、大腸炎、膵炎、アレルギー、線維症、外科的合併症（例えば、炎症性サイトカインが治癒を妨げる場合）、貧血、及び線維筋痛症を含む。慢性炎症と関連し得る他の疾患及び障害は、アルツハイマー病、うっ血性心不全、脳卒中、大動脈弁狭窄症、動脈硬化症、骨粗しょう症、パーキンソン病、感染症、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、アレルギー性接触皮膚炎及び他の湿疹、全身性硬化症、移植及び多発性硬化症を含む。
ＩＬ−１０分子が特に有効であり得る（例えば、現在の治療法が限界であるため）前述の疾患、障害、及び状態は、より詳細に下記に記載される。
本開示のＩＬ−１０ポリペプチドは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療及び予防に特に有効であり得る。ＩＢＤは、クローン病（ＣＤ）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を含み、その両者は、消化管の任意の部分に影響を与えることができる特発性慢性疾患であり、それは多くの悪影響に関連し、長期のＵＣを病む患者は、大腸癌を発症するリスクが高い。現在のＩＢＤの治療は、炎症症状を制御することを目的とし、一方で、特定の薬剤（例えば、コルチコステロイド、アミノサリチル酸及び標準免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、及びメトトレキサート））は、限られた成功をもたらし、長期的な治療は、肝臓障害（例えば、線維症または肝硬変）、及び骨髄抑制を引き起こす可能性があり、患者は、しばしばそのような治療に難治性となり得る。
乾癬、一般的な免疫媒介性の慢性皮膚疾患の集団は、米国では、４５０万人以上の人々に影響を与え、その内、１５０万人が中等度から重症度の疾患を有していると考えられる。その上、乾癬患者の１０％以上が乾癬性関節炎を発症し、それは、関節周囲の骨及び結合組織に損傷を与える。乾癬の根本的な生理学的理解の向上は、例えば、疾患の炎症性性質の原因となるＴリンパ球及びサイトカインの活性を標的とする薬剤の導入をもたらした。そのような薬剤は、エンブレル（エタネルセプト）、レミケード（インフリキシマブ）及びヒュミラ（アダリムマブ））などのＴＮＦ−α阻害剤（また、関節リウマチ（ＲＡ）の治療に使用される）、並びに、アメビブ（アレファセプト）、ラプチバ（エファリズマブ）などのＴ細胞阻害剤を含む。これらの薬剤のいくつかは、特定の患者集団である程度有効ではあるが、いずれもすべての患者を効果的に治療するためには示されていない。
一般的に、関節の膜ライニング（滑膜）の慢性炎症を特徴とするリウマチ性関節炎（ＲＡ）は、米国人口の約１％（約２１０万人）に影響を与えている。炎症過程におけるＴＮＦ−α及びＩＬ−１を含むサイトカインの役割の更なる理解は、新しいクラスの疾患改変性の抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の開発及び導入が可能になった。（ＲＡの治療法と重複するそのうちのいくつかの）薬剤としては、エンブレル（エタネルセプト）、レミケード（インフリキシマブ）、ヒュミラ（アダリムマブ）及びキネレット（アナキンラ）が挙げられる。これらの薬剤のいくつかは、症状を緩和し、構造的損傷の進行を阻害し、特定の患者集団における身体機能を改善するが、有効性の改善、作用の補完機構、及びより少ない／少ない重篤な有害作用を有する代替薬の必要性が依然として存在する。
多発性硬化症（ＭＳ）、脳及び脊髄におけるミエリンの炎症及び瘢痕化の多数の領域を含む、深刻な衰弱性の自己免疫疾患を病む被験者は、特に、現在の治療が、症状のみを軽減し、または障害の進行を遅らせるように、本明細書に記載のＩＬ−１０ポリペプチドによって助けられ得る。
同様に、ＩＬ−１０ポリペプチドは、アルツハイマー病（ＡＤ）、深刻に患者の思考、記憶、及び言語処理を損なう脳障害などの神経変性疾患：及び、パーキンソン病（ＰＤ）、例えば、異常な動き、硬直性、震えにより特徴付けられるＣＮＳの進行性疾患に罹患している被験者に対して特に有益であり得る。これらの障害は、進行性があり、衰弱し、何の治療薬も使用できない。
ウイルス性疾患：ウイルス性疾患におけるＩＬ−１０の役割への関心が高まっている。ＩＬ−１０がその受容体結合活性に応じて、刺激的及び抑制的の両方の効果を生成することを想定している。
抗ウイルス免疫及びワクチンの有効性を増加させるために、ＩＬ−１０の機能を阻害する効果が検討されている（参照：Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅ．，（２０１１） Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５０：３９−６５）。更に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）機能におけるＩＬ−１０の役割が研究されている。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）の複製の阻害に加えて、ＩＬ−１０は、また、エフェクター免疫機構の不活性化によりウイルス持続性を促進することができる（Ｎａｉｃｋｅｒ，Ｄ．， ｅｔ ａｌ．，（２００９） Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ２００（３）：４４８−４５２）。別の研究では、慢性Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症における、Ｔ細胞免疫を調節することができるＢ細胞のサブセットを産生するＩＬ−１０を同定した。密接した一時的相関が、ウイルス負荷におけるＩＬ−１０レベルと変動の間で観察され、そして生体外でのＩＬ−１０の遮断は、多官能性で、ウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を救出することが見出された（Ｄａｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｓｅｐｔ．１２，２０１２ １１０３１３９ （ｏｎ−ｌｉｎｅ））。
上記の研究は、ＩＬ−１０の阻害が有益であり得ることを示しているが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の成分を含む特定のウイルス感染は、ＩＬ−１０の投与による治療、及び／または、予防のための候補であり得る。これは、調節性Ｔ細胞、及び／または、ＣＤ８＋Ｔ細胞の調節により特定の癌におけるＩＬ−１０が果たす積極的な役割により支持される。ウイルスの文脈におけるＩＬ−１０治療の使用は、他の場所で議論される（参照：例えば、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｊｕｌｙ ２０１１ ｖｏｌ． ８５ ｎｏ．１４ ６８２２−６８３； 及び Ｌｏｅｂｂｅｒｍａｎｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１２） ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７（２）： ｅ３２３７１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３２３７１）。
本開示は、ＩＬ−１０による治療が有益であり得る任意のウイルス性疾患、障害または状態の治療、及び／または、予防において、ＩＬ−１０ポリペプチドの使用を意図している。意図されるウイルス性疾患、障害及び状態の例には、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が含まれる。
医薬組成物
本発明のＩＬ−１０ポリペプチドは、被験者への投与に適した組成物の形態であってもよい。一般に、そのような組成物は、ＩＬ−１０及び１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な、または、生理学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む「医薬組成物」である。ある実施形態において、ＩＬ−１０ポリペプチドは、治療上許容される量で存在する。医薬組成物は、本開示の方法で使用することができ、従って、例えば、本明細書に記載の治療及び予防の方法を実施するために、被験者に生体外で、または、生体内で投与することができる。
本開示の医薬組成物は、意図された方法または投与経路に適合するように処方でき、投与の典型的な経路は、本明細書に記載する。更に、医薬組成物は、本開示により意図される、疾患、障害及び状態を治療し、予防するために、他の治療上活性な薬剤、または、本明細書に記載の化合物と組み合わせて使用することができる。
医薬組成物は、一般的に、本開示で意図したＩＬ−１０ポリペプチド、及び、１つ若しくはそれ以上の薬学的及び生理学的に許容可能な製剤の治療上有効量を含む。適切な薬学的に許容可能な、または、生理学的に許容な希釈剤、担体または賦形剤は、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、及び、重硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、または、ｎ−プロピル）、乳化剤、懸濁剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、界面活性剤、緩衝剤、媒介物、希釈剤、及び／または、助剤を含むが、それに限定されない。例えば、適切な媒介物は、おそらく、非経口投与のための医薬組成物において一般的な他の物質で補填した生理食塩液またはクエン酸緩衝生理食塩水であってもよい。血清アルブミンと混合した中性緩衝食塩水または生理食塩水は、更なる典型的な媒介物である。血清アルブミンと混合した中性緩衝食塩水または生理食塩水は、更なる、典型的な媒介物である。当業者は、本明細書において意図される医薬組成物及び剤形で使用することができる様々な緩衝液を容易に理解するであろう。一般的な緩衝剤としては、薬学的に許容される弱酸、弱塩基、またはその混合物を含むが、それに限定されない。一例として、緩衝剤成分は、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びその塩などの水溶性物質であり得る。許容可能な緩衝剤としては、例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、及び、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）が挙げられる。
医薬組成物を配合した後、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水若しくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアルに保存することができる。そのような製剤は、いずれかのすぐに使用できる形で、使用前に凍結乾燥形態を必要とする再構成品で、使用前に希釈を必要とする液体形態で、または、他の許容可能な形態で保存できる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回使用の容器（例えば、単回使用バイアル、アンプル、注射器、または自動注射器（例えば、ＥｐｉＰｅｎ（登録商標）に類似した））中で提供されるが、一方、複数回使用容器（例えば、多数回使用バイアル）は、他の実施形態で提供される。インプラント（例えば、移植可能なポンプ）、並びに、カテーテルシステム、徐噴射ポンプ及びデバイスを含む、いかなる薬物送達デバイスも、ＩＬ−１０を送達するために使用してもよく、それら全ては当業者に公知である。一般的に、皮下または筋肉内に投与されるデポー注射は、また、所定の期間にわたって、本明細書に開示されるポリペプチドを放出するために利用することができる。デポー注射は、通常、固体ベース、または、油ベースのどちらかであり、一般的に、本明細書に記載の製剤成分の少なくとも１つを含む。当業者は、可能な製剤及びデポー注射の使用に精通している。
医薬組成物は、無菌の注射可能な水性の形態であってもよく、または
油性懸濁液であってもよい。
この懸濁液は、本明細書に記載の、適切な分散剤または湿潤剤、及び、懸濁剤を用いて、公知の技術に従って処方することができる。無菌の注射用製剤は、また、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。許容可能な、使用される希釈剤、溶媒及び分散媒は、水、リンガー溶液、等張性の塩化ナトリウム溶液、クレモホールＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ社製；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、または、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、並びに、その適切な混合物を含む。さらに、無菌の固定油は、従来、溶媒または懸濁媒体として使用されている。この目的のために、任意の無刺激性の固定油が合成モノ、または、ジグリセリドを含め、使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に用途を見出す。特別な注射用製剤の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン）を含めることにより達成することができる。
活性成分を含有する医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル、トローチ、ロゼンジ、水性若しくは油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルジョン、硬若しくは軟カプセル、またはシロップ、溶液、マイクロビーズまたはエリキシル剤などの経口使用に適した形態であってもよい。経口使用を意図した医薬組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、そして、そのような組成物は、薬学的に上品で口当たりのよい製剤を提供するために、例えば、甘味剤、香味剤、着色剤及び保存剤などの１つまたはそれ以上の薬剤を含有してもよい。錠剤、カプセルなどは、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤と混合した活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの希釈剤；例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸などの造粒剤及び崩壊剤；例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、及び、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの潤滑剤を含んでもよい。
経口投与のために適した錠剤、カプセルなどは、未被覆か、または胃腸管での崩壊および吸収を遅らせ、それにより持続作用を提供するために、公知の技術により被覆されてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いることができる。それらは、また、制御放出のために浸透性治療用錠剤を形成するための当技術分野で公知の技術により被覆されてもよい。追加の薬剤は、投与組成物の送達を制御するために、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、または、ラクチド／グリコリド共重合体、ポリラクチド／グリコリド共重合体、またはエチレンビニルアセテート共重合体などの生分解性、または、生体適合性のある粒子または高分子物質を含む。例えば、経口剤は、コアセルベーション技術により、または、界面重合により、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルまたはポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルのそれぞれの使用により、または、コロイド薬物送達システムにおいて調製したマイクロカプセル中に封入することができる。コロイド分散システムは、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む高分子複合体、ナノカプセル、微小球体、マイクロビーズ、および脂質ベースのシステムが含まれる。上記製剤の調製方法は当業者には明白であろう。
経口使用のための製剤は、硬質ゼラチンカプセルとして提供してもよく、ここに、活性成分は、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンまたは微結晶性セルロース、または軟質ゼラチンカプセルとして、不活性固体希釈剤と混合し、ここに、活性成分は、例えば、水、または、ピーナッツ油、液体パラフィン、またはオリーブ油などの油媒体と混合する。
水性懸濁剤は、その製造に適した賦形剤と混合した活性物質を含む。そのような賦形剤は、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムなどの懸濁剤；または、分散または湿潤剤、例えば、天然に存在するリン脂質（例えば、レシチン）；または、アルキレンオキシド及び脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）；または、長鎖脂肪族アルコール及びエチレンオキシドの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）；または、脂肪酸及びヘキシトール（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）から誘導される部分エステル及びエチレンオキシドとの縮合生成物；または、脂肪酸及びヘキシトール無水物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）から誘導される部分エステル及びエチレンオキシドとの縮合生成物であり得る。水性懸濁液は、また、１つまたはそれ以上の防腐剤を含有してもよい。
油性懸濁液は、例えば、ピーナツ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油などの植物油、または流動パラフィン油などの鉱物油中に活性成分を懸濁することによって処方化することができる。油性懸濁液は、例えば、蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含んでもよい。上記で記載した甘味剤、及び香味剤は、口当たりのよい経口製剤を提供するために添加されてもよい。
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤及び１つまたはそれ以上の保存剤と混合した活性成分を提供し得る。適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤は、本明細書中に例示されている。
本開示の医薬組成物は、また、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、例えば、オリーブ油若しくはラッカセイ油などの植物油、または、例えば、流動パラフィンなどの鉱物油、またはこれらの混合物であってもよい。好適な乳化剤は、例えば、アカシアゴムまたはトラガカントゴムなどの自然に発生するゴム；例えば、大豆、レシチン、及び、脂肪酸から誘導されるエステルまたは部分エステルなどの自然に発生するリン脂質；例えば、ソルビタンモノステアレートなどのヘキシトール酸無水物；及び、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなど、部分エステルのエチレンオキシドとの縮合生成物であってもよい。
製剤は、また、制御放出製剤のように身体からの急速な分解または除去に対して組成物を保護するインプラント、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグ及びマイクロカプセル化送達システムを含む、担体を含有することができる。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質は、単独で、または、ワックスと組み合わせて、使用することができる。
本開示は、直腸投与用の坐薬の形態で，ＩＬ−１０ポリペプチドの投与を意図する。坐薬は、常温では固体で、直腸温度で液体であり、したがって、薬物を放出するために直腸内で融解する、適切な非刺激性賦形剤と薬物を混合することにより、調製することができる。そのような物質としては、ココアバター及びポリエチレングリコールを含むが、それに限定されない。
本開示により、意図されるＩＬ−１０ポリペプチドは、現在知られている、または、将来開発される、任意の他の適切な医薬組成物の形態（例えば、経鼻または吸入用スプレー）であってもよい。
製剤中のポリペプチドまたはそのフラグメントの濃度は、（例えば、約０．１重量％未満から、または、通常、少なくとも約２重量％で、２０重量％〜５０重量％、またはそれ以上）幅広く変化することができ、そして、通常、流体容積、粘度、及び、例えば、選択された投与の特定のモードに従い、被験者ベースの因子を基礎に、初めに選択されるであろう。
投与経路
本開示は、任意の適切な方法でＩＬ−１０分子、及びその組成物を投与することを意図する。適切な投与経路は、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、皮下（例えば、注射またはインプラント）、腹腔内、大槽内、関節内、腹腔内、脳内（実質内）及び、脳室内）、口腔、鼻腔、膣、舌下、眼内、直腸、局所（例えば、経皮）、舌下及び吸入を含む。一般的に筋肉内または皮下投与されるデポー注射も、また、所定の期間にわたって、本明細書に開示されるＩＬ−１０分子を放出するために利用してもよい。
本開示の特定の実施形態は、非経口投与を意図し、更なる特定の実施形態では、非経口投与は皮下である。
併用療法
本開示は、１つまたはそれ以上の活性な治療薬（例えば、サイトカイン）、または、他の予防的または治療的方法（例えば、放射線）と組み合わせたＩＬ−１０分子の使用を意図する。そのような併用療法では、種々の活性薬剤は、しばしば、異なった作用、相補的な機構を有する。そのような併用療法は、薬剤の１つまたはそれ以上の用量の減少を可能にすることにより特に有利であり、１つまたはそれ以上の薬剤に関連する有害作用を低減するか、排除する。更にその上、そのような併用療法は、基礎疾患、障害、または状態に対して相乗的な治療効果または予防効果を有することができる。
本明細書で使用する、「組み合わせ」は、別々に投与することができ、例えば、分離した投与（例えば、キットで提供することができるような）のために別々に処方できる治療法、及び単一処方で一緒に投与できる治療法（即ち共処方）を意味する。
ある実施形態において、ＩＬ−１０ポリペプチド及び１つまたはそれ以上の活性な治療薬、または、他の予防若しくは治療法が、投与され、または、連続的に適用される。例えば、１つの薬剤が１つまたはそれ以上の他の薬剤の前に投与される。他の実施形態では、ＩＬ−１０ポリペプチド及び１つまたはそれ以上の活性な治療薬または他の予防または治療法が、同時に投与される。例えば、２つまたはそれ以上の薬剤は、ほぼ同時に投与されるか、２つまたはそれ以上の薬剤は、２つまたはそれ以上の別個の製剤中に存在するか、または単一の製剤中に組み合わせることができる（すなわち、共処方）。２つまたはそれ以上の薬剤が、順次または同時に投与されるかどうかに関わらず、それらは本開示の目的のために組み合わせて投与されることを想定する。
本発明のＩＬ−１０ポリペプチドは、適切な状況下で、任意の方法で、少なくとも１つの他の（アクティブな）薬剤と組み合わせて使用してもよい。一実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤、及び本開示の少なくとも１つのＩＬ−１０ポリペプチドを用いた治療は、ある期間にわたって維持される。別の実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤による治療が減らされるか、または中止される（例えば、被験者が安定している場合）が、一方、本発明のＩＬ−１０ポリペプチドを用いた治療は、一定の投与計画で維持される。更なる実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤による治療が、減らされるか、または中止される（例えば、対象が安定している場合）が、一方、本発明のＩＬ−１０ポリペプチドを用いた治療は、低下する（例えば、低用量、低投与頻度、または、より短い治療計画）。更に別の実施形態において、少なくとも１つの活性薬剤による治療が、低下するか、または中止され（例えば、被験者が安定している）、及び本発明のＩＬ−１０ポリペプチドを用いた治療は増加する（例えば、より高用量、より高頻度の投薬または長期治療計画）。更に、別の実施形態において、少なくとも１つの活性薬剤による治療が維持され、及び本開示のＩＬ−１０ポリペプチドを用いた治療は減らすかまたは中止される（例えば、より低用量、低投与頻度、または、より短い治療計画）。更に別の実施形態では、少なくとも１つの活性剤を用いた治療、及び本開示のＩＬ−１０ポリペプチドを用いた治療は、減らすかまたは中止される（例えば、低用量、低投与頻度、または、より短い治療計画）。
線維性疾患及び癌：本開示は、増殖性の状態；線維性疾患、障害または状態；癌、腫瘍、または前癌疾患、障害または状態を、ＩＬ−１０分子、及び、少なくとも１つの追加の治療薬または診断薬で治療し、及び／または、予防するための方法を提供する。
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル：ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチレンイミン；チオランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロノマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピュロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオンスタノール、メピチオステイン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトテイン、トリロステインなどの抗副腎抗体；フォリン酸などの葉酸補充液；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デホファミン；デメコルチン；ジアジコン；エルホルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピタモール；ニトラクリン；ペントスタチン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン； ポドフィン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；シゾフィラン；シピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２′，２′′−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金及び白金配位錯体；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；及び薬学的に許容可能な塩、酸または上記のいずれかの誘導体が挙げられるが、それに限定されない。
化学療法剤は、また、抗エストロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節し、または阻害するように作用する、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、４（５）−イミダゾールを阻害するアロマターゼ、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、オナプリストン、及びトレミフェンを含む、抗ホルモン剤；及び、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；及び薬学的に許容可能な塩、酸または上記のいずれかの誘導体を含有する。ある実施形態において、併用療法は、ホルモンまたは関連ホルモン剤の投与を含む。
ＩＬ−１０ポリペプチドと組み合わせて用いることができる追加の治療様式は、 ＩＬ−１２、ＩＮＦαまたは抗上皮成長因子受容体などのサイトカインまたはサイトカインアンタゴニスト、放射線療法、他の腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体及び毒素の複合体、Ｔ細胞アジュバント、骨髄移植、または、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞療法）を含む。ワクチン（例えば、可溶性タンパク質として、またはタンパク質をコードする核酸として）も、また、本明細書に提供される。
線維性疾患の治療のための併用療法において有用な治療薬は、当業者に公知である。一例として、例えば、インスリン抵抗性状態（例えば、２型糖尿病）及びメタボリックシンドロームの治療のために本明細書に記載されている薬剤（例えば、メトホルミン、チアゾリジンジオン、およびスタチン）は、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨを調節するのに役立ち、特にその症状を助けることができる。ビタミンＥは、また、一部の患者では、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨを制御するのに役立つことが示されている。
本開示は、薬学的に許容可能な塩、酸または上記のいずれかの誘導体を包含する。
循環器疾患：本開示は、特定の循環器疾患、及び／または、代謝関連疾患、障害、及び状態、並びに、それに関連する障害を、ＩＬ−１０分子、及び、少なくとも１つの追加の治療薬または診断薬で、治療し、及び／または、予防するための方法を提供する。
高コレステロール血症（及びアテローム性動脈硬化症など）の治療のための併用療法において有用な治療薬の例としては、コレステロールの酵素的合成を阻害するスタチン（例えば、クレストール、レスコール、リピトール、メバコール、プラバコール、及びゾコール）；コレステロールを隔離し、その吸収を防ぐ胆汁酸樹脂（例えばコレスチド、ＬＯ−コレスト、プレバライト、クエストラン、及びウエルコール）；コレステロール吸収をブロックするエゼチミブ（ゼチーア）；トリグリセリドを低減し、控えめに、ＨＤＬを増加させることができるフィブリン酸（例えば、トリコール）；控えめにＬＤＬコレステロール及びトリグリセリドを低減させるナイアシン（例えば、ナイアコール）；及び／または、上記の組み合せ（例えば、バイトリン（エゼチミブとシムバスタチン））が挙げられる。本明細書に記載のＩＬ−１０ポリペプチドと組み合わせて使用するための候補となり得る代替のコレステロール治療は、様々なサプリメントやハーブ（例えば、ニンニク、ポリコサノール、およびグッグル）が挙げられる。本開示は、上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体を包含する。
免疫及び炎症状態：本開示は、免疫、及び／または、炎症に関連する疾患、障害及び状態、並びに、それに関連する障害を、ＩＬ−１０分子及び少なくとも１つの追加の治療薬または診断薬で治療し、及び／または、予防するための方法を提供する。
併用療法において有用な治療薬の例としては、アスピリン、イブプロフェンなどの非ステロイド系の抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；及び他のプロピオン酸誘導体（アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロクス酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸、及びチオキサプロフェン）；及び酢酸誘導体（インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナック、クリダナク、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フイロフェナック、イブフェナック、イソキセパック、オキシピナック、スリンダク、チオピナク、トルメチン、ジドメタシン、及びゾメピラク）；フェナム酸誘導体（フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸及びトルフェナム酸）；ビフェニルカルボン酸誘導体（ジフルニサル及びフルフェニサル）、オキシカム（イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム及びテノキシカム）、サリチル酸（アセチルサリチル酸、スルファサラジン）、及びピラゾロン（アパゾン、ベンゾピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン）が挙げられるが、それに限定されない。他の組み合わせは、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤が含まれる。
組み合わせのための他の活性薬剤は、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、またはヒドロコルチゾンなどのステロイドが含まれる。１つまたはそれ以上のステロイドの有害な影響は、低減することができ、または、必要なステロイド用量を漸減することによって除去できるので、そのような組み合わせは特に有利であり得る。
例えば、関節リウマチを治療のために組み合わせて使用することができる活性剤の更なる例としては、単数若しくは複数のサイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤｓ）；他のヒトサトカインまたは成長因子の抗体またはアンタゴニスト、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ、またはＰＤＧＦが含まれる。
活性剤の特定の組合せは、自己免疫及び後続の炎症カスケードの異なる点で干渉するかも知れず、そして、キメラ、ヒト化またはヒトＴＮＦ抗体、レミケード、抗ＴＮＦ抗体フラグメント（例えば、ＣＤＰ８７０）、及び可溶性のｐ５５、または、ｐ７５のＴＮＦ受容体、その誘導体、ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（エンブレル）またはｐ５５ＴＮＦＲ１ｇＧ（レネルセプト）、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３）、また、ＴＮＦ−α転換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤などのＴＮＦアンタゴニストを含む。同様に、ＩＬ−１阻害剤が有効であり得る（例えば、インターロイキン１転換酵素阻害剤）。他の組合せとしては、インターロイキン１１、抗Ｐ７ｓ及びｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）が含まれる。本明細書に記載のＩＬ−１０ポリペプチドとの組み合わせで有用な薬剤の他の例としては、インターフェロンβ１ａ（アボネックス）；インターフェロンβ１ｂ（ベタセロン）；コパクソン；高圧酸素；静脈内免疫グロブリン；クラブリビン；及び他のヒトサイトカインまたは成長因子の抗体またはアンタゴニスト（例えば、ＣＤ４０リガンド及びＣＤ８０の抗体）が含まれる。
本開示は、上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体を包含する。
ウイルス疾患：本開示は、ウイルス性疾患、障害、及び状態、並びに、それに関連する障害を、ＩＬ−１０分子、及び、少なくとも１つの追加の治療薬または診断薬で、治療し、及び／または、予防するための方法を提供する（例えば、１つまたはそれ以上の抗ウイルス薬、及び／または、ウイルス治療に関連しない１つまたはそれ以上の薬剤）。
このような併用療法は、抗ウイルス剤、ウイルスの脱被覆の阻害剤（例えば、アマンタジン及びリマンチジン）；逆転写酵素阻害剤（例えば、アシクロビル、ジドブジン、ラミブジン）；インテグラーゼを標的とする薬剤；ウイルスＤＮＡへの転写因子の結合をブロックする薬剤；翻訳に影響を与える薬剤（例えば、アンチセンス分子）（例えば、ホミビルセン）；翻訳／リボザイム機能を調節する薬剤；プロテアーゼ阻害剤；ウイルス組み合せ調節剤（例えば、リファンピシン）；ウイルス粒子（例えば、ザナミビル及びオセルタミビル）の放出を防止する薬剤を含む、様々なウイルスのライフサイクルステージを標的とし、異なる作用機構を有する抗ウイルス剤が含まれるが、それに限定されない。特定のウイルス感染（例えば、ＨＩＶ）の治療、及び／または、予防は、しばしば、抗ウイルス剤のグループ（「カクテル」）を伴う。
ＩＬ−１０ポリペプチドと組み合わせて使用するために意図される他の抗ウイルス剤としては、アバカビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリゲン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビレルテット、シドフォビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エンドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、ファムシクロビル、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、様々なインターフェロン（例えば、ペグインターフェロンα−２ａ）、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、ラルテグラビル、リバビリン、リトナビル、ピラミジン、サキナビル、スタブジン、テラプレビル、テノホビル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、及びザルシタビンを含むが、それに限定されない。
本開示は、上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体を包含する。
投薬
本発明のＩＬ−１０ポリペプチドは、例えば、投与の目標（例えば、望ましい溶解の程度）、年齢、体重、性別、製剤が投与されている被験者の健康及び体調、投与経路、及び疾患、障害、またはその症状の性質に依存する量で被験者に投与できる。投与計画は、投与される単数若しくは複数の薬剤に関連する任意の副作用の存在、性質、及び程度を検討してもよい。効果的な投与量及び投与計画は、容易に、例えば、安全性、用量漸増試験、生体内研究（例えば、動物モデル）、及び当業者に公知の他の方法から決定することができる。
一般的に、投薬パラメータは、被験者に非可逆的に毒性であり得る量より少ない投与量（最大耐性用量（ＭＴＤ））、及び被験者に測定可能な効果を生み出すのに必要な量より少なくない投与量を指示する。そのような量は、投与経路及び他の因子を考慮して、例えば、ＡＤＭＥに関連する薬物動力学的、及び、薬物動態的パラメータにより決定される。
有効用量（ＥＤ）は、それを摂取した被験者のある部分での治療応答または望ましい効果を生み出す薬剤の用量または量である。薬剤の「５０％有効用量」またはＥＤ５０は、それが投与される個体群の５０％において治療的応答または望ましい効果を生じさせる薬剤の用量または量である。ＥＤ５０が、一般的に、薬剤効果の合理的な期待の尺度として使用されているが、それは、必ずしも、臨床医がすべての関連要因を考慮して適切と思われるかもしれない用量ではない。したがって、いくつかの状況において、有効量は、計算されたＥＤ５０より多く、他の状況では、有効量は、計算したＥＤ５０未満であり、さらに他の状況においては、有効量は、計算したＥＤ５０と同じである。
また、本開示のＩＬ−１０分子の有効投与量は、被験者への１つまたはそれ以上の用量を被験者に投与した場合、健常者に比べて、望ましい結果を生成する量であってもよい。例えば、特定の疾患を経験している被験者のため、有効用量は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、約８０％、少なくとも９０％、または９０％以上、その疾患の診断パラメータ、測定値、マーカー値などを改良するものであってもよく、ここで、１００％は、正常被験者により提示される疾患の診断パラメータ、測定値、マーカー値などで定義される。
本明細書に記載の疾患、障害または状態を治療するために必要なＩＬ−１０分子の量は、複合タンパク質のＩＬ−１０の活性に基づくが、それは当該分野公知のＩＬ−１０活性の分析により決定できる。一例として、腫瘍の文脈において、適切なＩＬ−１０活性は、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍部位への浸潤、これら浸潤細胞からの、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＲＡＮＫ−Ｌなどの炎症性サイトカインの発現、及び生物学的サンプル中のＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−γ濃度の増加を含む。
ＩＬ−１０分子の治療上有効量は、約０．０１〜約１００μｇタンパク質／ｋｇ体重／日、約０．１〜２０μｇタンパク質／ｋｇ体重／日、約０．５〜１０μｇタンパク質／ｋｇ体重／日、または、約１〜４μｇタンパク質／ｋｇ体重／日の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１０分子の治療上有効量は、約１〜１６μｇタンパク質／ｋｇ体重／日の範囲であり得る。本開示は、例えば、約５０〜８００μｇタンパク質／ｋｇ体重／日の送達を持続注入することによるＩＬ−１０分子の投与を意図する。注入速度は、例えば、副作用及び血液細胞数の評価に基づいて変えることができる。
経口剤の投与のために、組成物は、有効成分を１．０〜１０００ミリグラム、特に、１．０、３．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０、または１０００．０ミリグラムを含む、錠剤、カプセルなどの形態で提供することができる。
ある実施形態では、開示されたＩＬ−１０ポリペプチドの投与量は、「単位剤形」に含まれる。用語「単位剤形」は、物理的に別個の単位を指し、各単位は、十分望ましい成果を生成するために、単独で、または１つまたはそれ以上の追加の薬剤との組み合わせのいずれかで、本発明のＩＬ−１０ポリペプチドの所定量を含む。単位剤形のパラメータは、特定薬剤及び達成すべき効果に依存することが理解されるであろう。
キット
本発明は、また、ＩＬ−１０及びその医薬組成物を含むキットを意図する。以下に説明するように、キットは、一般的に、様々な構成要素を収納する物理的構造の形態であり、そして、例えば、本明細書に記載の方法を実行することに活用されている（例えば、コレステロールの恒常性を回復することに必要とする被験者へのＩＬ−１０分子の投与）。
キットは、（例えば、滅菌容器内で提供される）本明細書中に開示されるＩＬ−１０ポリペプチドの１つまたはそれ以上を含むことができ、被験者への投与に適した医薬組成物の形態であってもよい。ＩＬ−１０ポリペプチドは、例えば、使用のために準備した形態で、または、投与前に、再構成若しくは希釈を必要とする形態で提供することができる。ＩＬ−１０ポリペプチドが、ユーザにより再構成する必要がある形態であるとき、キットは、また、ＩＬ−１０ポリペプチドと一緒に、または、分離しして包装された、緩衝液、薬学的に許容可能な賦形剤などを含むことができる。併用療法が考慮される場合、キットは、別々に、いくつかの薬剤を含有してもよく、またはそれらが既にキットで組み合わせることができる。キットの各成分は、個別の容器内に封入することができ、種々の容器の全てが、単一の包装物内にあってもよい。本発明のキットは、その中に収容された成分を適切に維持する（例えば、冷蔵または冷凍）のに必要な条件のために設計されてもよい。
このキットは、その中の成分の識別情報、及びその使用の指示を含むラベルまたは包装の添付分書が収容されている場合がある（例えば、作用機構、薬物動態学、及び薬物力学、副作用、禁忌症などを含む、投与パラメータ、単数若しくは複数の活性成分の臨床薬理学）。ラベルまたは添付文書は、ロット番号と有効期限などの製造者情報を含めることができる。ラベルまたは包装の添付文書は、例えば、物理的構造物内にまとめて収納されても、ばらばらに収納されても、またはキットの構成部分（例えば、アンプル、チューブまたはバイアル）に貼付されてもよい。
ラベルまたは包装の添付文書は、更に、ディスクなどのコンピュータ読み取り可能な媒体（例えば、ハードディスク、カード、メモリディスク）；ＣＤ−、または、ＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３などの光学ディスク；磁気テープ；または、ＲＡＭ及びＲＯＭなどの電気記憶媒体；または、磁気／光学記憶媒体、フラッシュ媒体またはメモリ型カードや、これらのハイブリッドを含み、または、その中に導入される。いくつかの実施形態では、実際の指示書は、キット中に存在しないが、遠隔源から、例えば、インターネットを介して指示書を得るための手段が提供される。
以下の実施例は、本発明を作成し、使用する方法の完全な開示及び説明により、当業者に提供するように記載されるが、発明者がその発明とみなす範囲を限定する意図がなく、そして、下記の実験が実施され、及びそれが実施できる全ての実験であることを表す意図もない。現在形で書かれた典型的な記述は、必ずしも実施されたものとは限らず、むしろ、説明が、本明細書に記述されたデータなどを発生させるために実施できることと理解すべきであろう。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するために努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差があることを考慮すべきであろう。
特に指示のない限り、部は、重量部であり、分子量は、量平均分子量であり、温度は、摂氏（℃）であり、及び、圧力は、大気圧か、またはそれに近い圧力である。下記の標準的略号を使用する：ｂｐ＝単数若しくは複数の塩基対；ｋｂ＝単数若しくは複数のキロ塩基；ｐｌ＝単数若しくは複数のピコリットル；ｓ、または、ｓｅｃ＝単数若しくは複数の秒；ｍｉｎ＝単数若しくは複数の分；ｈ、または、ｈｒ＝単数若しくは複数の時間；ａａ＝単数若しくは複数のアミノ酸；ｋｂ＝単数若しくは複数のキロ塩基；ｎｔ＝単数若しくは複数のヌクレオチド；ｎｇ＝ナノグラム；μｇ＝マイクログラム；ｍｇ＝ミリグラム；ｇ＝グラム；ｋｇ＝キログラム；ｄｌまたはｄＬ ＝デシリットル；μｌ、または、μＬ＝マイクロリットル；ｍｌ、または、ｍＬ＝ミリリットル；ｌ、または、Ｌ＝リットル；ｎＭ＝ナノモル濃度；μＭ＝マイクロモル濃度；ｍＭ＝ミリモル濃度；Ｍ＝モル濃度；ｋＤａ＝キロダルトン；ｉ．ｍ．＝筋肉内（に）；ｉ．ｐ．＝腹腔内（に）；ｓ．ｃ．＝経皮的（に）；ＱＤ＝日毎；ＢＩＤ＝１日に２回；ＱＷ＝週毎；ＱＭ＝月毎；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー；ＢＷ＝体重；Ｕ＝ユニット；ｎｓ＝統計的に有意ではない；ＰＢＳ＝リン酸塩−生理食塩水緩衝液；ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応；ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＤＭＥＭ＝ダルベッコ変法イーグル培養液；ＧＣ＝ゲノムコピー；ＥＬＩＳＡ＝酵素結合免疫吸着アッセイ；ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸；ＰＭＡ＝ホルボールミリステートアセテート；ｒｈＩＬ−１０ ＝組み換えヒトＩＬ−１０；ＬＰＳ＝リポ多糖類。
物質及び方法
下記の一般的な物質及び方法は、以下の実施例において使用される。
分子生物学での標準的方法は、下記に記載されている：（参照：例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ （２００１） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．；及び、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｓ． １−４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．、そこには、細菌細胞のクローニング及びＤＮＡ突然変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳類細胞及び酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質及びタンパク質の発現（Ｖｏｌ．３）、及び生物情報学（Ｖｏｌ．４）について記載されている）。
科学文献には、免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化、並びに化学分析、化学改変、翻訳後改変、融合タンパク質の産生、及びタンパク質のグリコシル化を含むタンパク質精製のための方法が記載されている（参照：例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ， ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｓ．１−２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，ＮＹ）。
ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の産生、精製、及びフラグメント化が、下記に記載されている：（参照：例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）；リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的な技術は、利用可能である（参照：例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）；蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法は、利用可能である（参照：例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ， ＮＪ）；及び、診断試薬として、例えば、使用のための、核酸プライマー及びプローブ、ポリペプチド、及び抗体を含めた核酸を改変するのに適した蛍光試薬も、利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ．；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ．）。
免疫系の組織学の標準的な方法が記載されている：（参照：例えば、Ｌｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００２） Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。
免疫細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞）の欠失は、抗体媒介性の除去により行うことができる。例えば、２５０μｇのＣＤ４−またはＣＤ８−特異的抗体を毎週注射し、及び細胞欠失は、ＦＡＣＳ及びＩＨＣ分析を用いて確認できる。
例えば、抗原性フラグメント、リーダー配列、タンパク質の折り畳み、機能的ドメイン、グリコシル化部位、及び配列アラインメントを決定するためのソフトウェアのパッケージ及びデータベースは、利用可能である（参照：例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ （Ａｃｃｅｌｒｙｓ， Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；及び、ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，ＮＶ）。
免疫応答性のＢａｌｂ／Ｃ、または、Ｂ細胞−欠損Ｂａｌｂ／Ｃマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥから、入手し、そして標準的な手法に従い使用した（参照：例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６９（１１）：７０６７−７３ ａｎｄ Ｃｏｍｐｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５４（６）：６８１−８９）。本開示により意図される実験的な作業に適した他のマウス系統は、当業者に公知であり、一般的には、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂから、入手可能である。
特に指示のない限り、皮膚のＰＤＶ６扁平上皮癌は、本明細書に記載の実験に使用した（参照：例えば、Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４２：４６１−４６５）。ＥＰ２乳癌、ＣＴ２６結腸癌、及び４Ｔ１乳癌モデルなどの他の腫瘍学関連のモデル及び細胞株を使用することができ（参照：例えば、Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｎａｔｕｒｅ ４４２：４６１−４６５）、それは、当業者に公知である。非腫瘍−関連モデル及び細胞株（例えば、炎症のモデル）も、使用することができ、当業者に公知である。
血清ＩＬ−１０濃度レベル及び曝露レベルは、当該分野で使用される標準的な方法により決定することができる。例えば、血清暴露レベルのアッセイは、全血（約５０μＬ／マウス）をマウスの尾の切れ端から、平らな毛細管に収集し、遠心分離により血清及び血液細胞を分離し、そして標準的なＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄシステムズ社）と技術により、ＩＬ−１０曝露レベルを決定することにより実施できる。あるいは、または、更に、下記に記載するＥＬＩＳＡ手順（または類似の手順）は、ムテインまたは改変したムテインの生体内半減期を決定するための手段として、ヒトＩＬ−１０の血清レベルを測定するように適合させることができる。
ムテインの産生及び評価
ヒトＩＬ−１０発現ベクター、ｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ−ｈｕＩＬ１０の組み合せ：ヒトＩＬ−１０の哺乳動物発現ベクターは、プラチナＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃１１７０８〜０３９；製造業者の手順に従い）を使用し、ｐＣＭＶ６−ＸＬ５ヒト−ＩＬ１０（オリジーン＃ＳＣ３０００９９；遺伝子登録バンク＃ＮＭ０００５７．２）を、ＤＮＡテンプレートとして使用し、及び、プライマ５’−ｔａｔａＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＧＣ−３’（配列番号３４）、及び５’−ｔａｔａＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＴＴＴＣＧＴＡＴＣＴＴＣＡＴＴＧ−３’（配列番号３５）を用いて、ＰＣＲを介して完全なヒトＩＬ−１０のオープンリーディングフレームを増幅することにより構築した。得られたＰＣＲ反応物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社：＃２８１０６）を用いて精製した。精製したヒトＩＬ−１０のＰＣＲフラグメント、及び、哺乳動物発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ（Ｂ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃Ｖ９１０−２０）は、ｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ（Ｂ）の消化に加えられた子ウシ腸ホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）で、３７℃、１時間、ＡｐａＩ及びＮｈｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いて消化した。消化されたＤＮＡフラグメントは、１００Ｖで１時間、１％アガロースゲル（Ｌｏｎｚａ社：＃５４８０３）上で培養し、その後、切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社：＃２８７０６）を用いて精製した。ヒトＩＬ−１０のＰＣＲフラグメントは、Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ結合キット（Ｒｏｃｈｅ社：＃１１６３５３７９００１）を用いて、ｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ（Ｂ）ベクターに連結し、ワンショットのＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃Ｃ４０４００６）に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む寒天プレートにプレーティングし、３７℃で一晩増殖させた。翌日、細菌コロニーを個別に採取し、２００ＲＰＭで振盪培養器中でＬＢ＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む、３ｍＬの培養液に入れ、３７℃で８〜２０時間増殖させた。２つの各培養物（各２ｍＬ）は、その後、２ｍＬの試験管に分注し、細胞を１０分間、テーブルトップ遠心機で６０００ＲＰＭでペレット化し、培養液を吸引し、そしてＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社：＃２７１０６）を使用して、細菌から分離して精製した。適切な発現ベクターは、ＤＮＡ配列解析システム（ＭＣ Ｌａｂ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）を介して同定した。
ムテインの発現ベクターの形成：ヒトＩＬ１０ムテインの発現ベクターは、以前に記載したヒトＩＬ−１０の哺乳類発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ−ｈｕＩＬ１０を、ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＩＩ部位指向性の突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃２００５２４）を使用して変異させ、以下の分類により製造業者の手順に従い構築した：プライマーは常に推奨のＴｍを満たすとは限らなかった；ＰＣＲ反応は、６〜７分の伸長時間で１６〜１８ラウンド循環させた；４μＬのＤｐｎＩ−治療反応は、前述のようにワンショットＴＯＰ１０化学的コンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃Ｃ４０４００６）に形質転換させた。３つのミニプレップ培養物（各３ｍＬ）は、増殖し、精製し、そして前述のように配列検証した。システインが挿入されたムテインのために、４００ｍＬの培養物を増殖させ、精製した。簡単に言えば、１つの細菌コロニーを、４００ｍＬのＬＢ＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリン中に取り出し、そして、２Ｌのバッフル付き三角フラスコ中で、２００ＲＰＭで振盪培養器中、３７℃、１２〜２０時間成長させた。次いで、培養物を、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２５ＴのＪＡ−１０ローター内で、６０００ＲＰＭ、２０分間）でペレット化し、培養液を吸引し、そして、ＤＮＡをＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｅｇａ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ社：＃１２３８１）を用いて抽出し、その後、製造業者の手順に従った（最終ＤＮＡ濃度を増加させるために、ＤＮＡ沈殿法で行われる当業者に馴染みのタイプをごく僅か変更して）。
複数のアミノ酸の変化を必要とするムテインは、一度に１つの変異を挿入することにより組み立てた。Ｎ−グリコシル化モチーフ、Ｎ−Ｘ−Ｓ及びＮ−Ｘ−Ｔの導入は、時には、Ｘ≠Ｐ（プロリン）である３つの変異の導入を必要とした。表１は、ｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ−ｈｕＩＬ１０発現ベクター、並びに、すべてのムテインの発現ベクターを産生するために使用した、ＤＮＡテンプレート及びプライマーセットを詳細に説明する。ムテインに使用する番号付け規則は、最初の位置として開始コドンを割り当て、その結果、最初の１８残基（ＭＨＳＳＡＬＬＣＣＬＶＬＬＴＧＶＲＡ（配列番号３７））は、シグナルペプチドを含み、成熟タンパク質の第一の残基は、セリン１９である。
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形質移入の手順：全てのヒトＩＬ−１０発現ベクター（野生型及びムテイン）は、過渡的にＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃Ｒ７００−０７）に発現させた。細胞は、５０ｍＬのＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃１１９９５―０７３）＋１０％の特徴評価したウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社：＃ＳＨ３００７１．０３）＋１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃１５１４０−１２２）に、Ｔ１７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｏｎｅ／ＣｅｌｌＳｔａｒ社：＃６６０１７５）中、３７℃、５％ＣＯ２中で維持した。コンフルエンスに達すると、細胞を、１０ｍＬのＰＢＳ＋５ｍＭのＥＤＴＡで剥離し、細胞を、更に、１０ｍＬの成長培養液で採取し、遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ）を用いて、１０００ＲＰＭでペレット化し、培養液を吸引し、細胞を新鮮な培養液で再懸濁し、その後、４５ｍＬの成長培養液を含む、３つのＴ１７５フラスコの間に分割した。
全ての非システインのムテイン発現ベクターは、６ウェルプレート中で以下の通りに形質移入した： Ｈｅｋ２９３細胞は、コンフルエントのＴ１７５フラスコから収穫し、細胞を上記で記載した通りに採取し、その後、２０ｍＬの新鮮成長培養液中で再懸濁した。７００μＬの細胞懸濁液を、２ｍＬの新鮮培養液を含む６個のウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ社：＃３５３０４６）にそれぞれ加え、記載の通り、終夜成長させた。翌日、細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃１３８８７９５）を用いて、次の手順を使用して形質移入した：２５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭＩ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃３１９８５から０８８）は、２つのＥｐｐｉｎｄｏｒｆチューブに分注し、その後、１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００形質移入試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃１３８８７９５）を１つのアリコートに加え、４μｇのＤＮＡを他方に加えた。２つの溶液を、室温で５分間別々に培養し、その後、形質移入複合体は、二つの溶液を合わせ、更に３０分間室温で培養することにより形成した。完全な５００μＬの混合物を、その後、６ウェルプレートの１つのウェルに滴下し、そして４時間、培養器に戻した。その後、形質移入培養液を吸引し、ＤＭＥＭ＋ペニシリン／ストレプトマイシンで代替し、約３６時間増殖させた。馴化培養液を回収し、４℃で保存した。
以下の例外を除いて上記に記載の通りシステインムテインを形質移入した：４２〜４５ｍＬの増殖培養液を有する４個のＴ１７５フラスコは、形質移入の前に９５％コンフルエンスまで増殖させ、そして、形質移入複合体を、１７５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を、４．４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ Ｉに、及び７５〜１００μＬのＤＮＡを、第二の４．４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ Ｉに加えることにより形成した。形質移入複合体の吸引時に、５０ｍＬの培養液をそれぞれのフラスコに加えた。
空のｐＳｅｃＴａｇ２ｈｙｇｒｏ（Ｂ）発現ベクターを含むか、またはＤＮＡなしのいずれかのモック形質移入体は、システイン及び非システイン変異体の両方について記載した通りに調製した。
ヒトＩＬ−１０検出ＥＬＩＳＡ：９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ社：＃４４２４０４）を、１００μＬ／ウェルで、ＰＢＳ＋１μｇ／ｍＬの抗ヒトＩＬ−１０抗体９Ｄ７（Ａｒｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社；Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、４℃で、終夜コートし、ＤＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（Ｔｅｋｎｏｖａ社：＃Ｐ０２９７）で、６×２００μＬ洗浄し、２００μＬ／ウエルで、ＰＢＳ＋５％ＢＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社：＃２９６０）を用いて、２時間、室温で、ロッキングプラトフォーム上でブロックし、上記の通りに洗浄した。サンプルは、ＰＢＳ中のウエルＡ〜Ｈに、連続的に１：５で希釈し、そして１００μＬ／ウエルを、アッセイプレートに加えた。サンプルを、二重で、三重で用いた。陽性対照として、精製されたヒトＩＬ−１０（Ａｒｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を２μｇ／ｍＬの最終濃度に増殖培養液に添加し、一方、モック形質移入からの馴化培養液は、陰性対照として用い、両者連続して上記で記載の通りに希釈した。試料は、ロッキングプラットフォーム上で４℃で終夜培養し、次いで、上記で記載の通りに洗浄した。１００μＬ／ウェルのＰＢＳ＋抗ヒトＩＬ−１０抗体１２Ｇ８−ビオチン（Ａｒｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、各ウェルに加え、 ロッキングプラットフォーム上で、室温、１時間培養し、上記の通りに洗浄し、その後、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ＋ストレプタジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社：＃０１６−０３０−０８４、１：１０００に希釈）を加え、ロッキングプラットフォーム上で、室温で、更に１時間培養した。上記で記載の通りに、プレートを洗浄し、そして、１００μＬ／ウェルの１段階のＵｌｔｒａＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ社：＃３４０２９）を用いて、１〜５分間成長させ、その後、反応を、１００μＬ／ウェルの停止溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社：＃ＳＳ０４）で停止させた。プレートは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＭ２プレートリーダーを用い、４５０ｎｍで読み取った。
ＭＣ／９生物活性アッセイ： ＭＣ／９細胞（ＡＴＣＣ：＃ＣＲＬ−８３０６）は、ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）＋１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎ／Ｔｈｅｒｍｏ社）＋１Ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）＋５０μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｆｉｓｈｅｒ社：＃Ｏ３４４６Ｉ−１００）＋ＣｏｎＡ（ＢＤ社：＃３５４１１５）添加１ＸラットＴ−ＳＴＩＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。細胞は、０．４Ｅ６細胞／ｍＬの密度で、増殖培養液に懸濁し、そして細胞密度が１．５Ｅ６細胞／ｍＬ（通常は３〜４日後）に近づいたときに継代培養した。細胞の継代のために、細胞懸濁液の適当量を、１０００ＲＰＭでペレット化し、培養液を吸引、そして細胞を新たな増殖培養液に再懸濁した。新鮮なバイアルは、培養の約４週間後に解凍した。
アッセイで細胞を使用する前に、それらは、ラットＴ−ＳＴＩＭなしで、成長培養液中で３回洗浄し、細胞を１０００ＲＰＭでペレット化し、培養液を吸引し、その後、新しい培養液（Ｔ−ＳＴＩＭなし）でそれらを再懸濁した。システインムテインのために、精製したタンパク質は、ＭＣ／９アッセイで使用し、一方、一過性に形質移入された細胞からの馴化培養液は、非システイン変異体のために使用した。サンプルは、二重で、または、三重で使用した。
馴化培養液中のタンパク質：０．０５Ｅ６細胞／ｍＬの細胞懸濁液（Ｔ−ＳＴＩＭなし）を調製し、そして、５０μＬ／ウェル（約５０００細胞）を、不透明な９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ社：＃３９１７）で各ウェルに添加し、そして、試験サンプルを調製している間、培養器に戻した。一過性の形質移入からの馴化培養液を、Ｔ−ＳＴＩＭなしの成長培養液中で１：３に希釈し、そして、連続して、１２列を１：３で希釈し、１００μＬ／ウェルを細胞懸濁液に添加した。各プレートは、活動を評価するための相対参照として使用するために、野生型ＩＬ−１０を有する一過性の形質移入、並びに、モック形質移入からの馴化培養液を含む。細胞を、３７℃で、約４０時間、５％ＣＯ２で成長させ、２０分間、室温で、平衡化することを可能にし、その後、１００μＬ／ウェルのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社：＃Ｇ７５７１）を各ウェルに加えた。プレートを約３０分間４５０ｒｐｍで揺動し、１秒間の積算時間を用いて、３９５ｎｍで、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌプレートリーダーで読み取りを行なった。
精製したタンパク質：手順は、アッセイプレート中でＩＬ−１０タンパク質の最終濃度が、２００〜８００ｎｇ／ｍｌの間であることを除いて、馴化培養液と同様であった。
ＭＣ／９細胞の使用を含む多数のアッセイが、文献に記載されている。ＩＬ−１０のＭＣ／９細胞（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社：Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から、入手可能なマスト細胞の特徴を有するマウス細胞株）への投与が、用量依存的に細胞増殖の増加を引き起こした。典型的なアッセイは、標準的なアッセイ手順を説明する、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｓｎｉｐｅｓ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．（（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：５０７−１０）に記載され、ここで、ＭＣ／９細胞は、ＩＬ３＋ＩＬ１０及びＩＬ３＋ＩＬ４＋ＩＬ１０で補充される。提供者（例えば、Ｒ＆Ｄシステムズ社、ＵＳＡ；及びＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）は、ｒｈＩＬ１０のためにロット放出アッセイとしてのアッセイを使用する。当業者は、細胞が、ＩＬ−１０でのみ補充するように、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｓｎｉｐｅｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ，の標準的なアッセイ手順を変更することができるであろう。
野生型ヒトＩＬ−１０及びシステインムテインの精製：抗ヒトＩＬ−１０抗体９Ｄ７は、ＣＮＢｒ活性化セファロース４ファストフロー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社：＃７１−５０００−１５ ＡＦ、次いで、製造業者の手順に従い）に結合させ、ＰＢＳで平衡化させた。ガラスＥｃｏｎｏ−Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に含まれる馴化培養液１００ｍＬ当たり、５００μＬ〜１ｍＬの、９Ｄ７−セファロースを加え、そして、ロッキングプラットフォーム上で、室温で、１〜２時間培養した。培養液を、重力流を介してカラムに通して稼働させ、１ＸＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で洗浄し、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．９）で溶出し、そして１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）の１０体積％で中和した。タンパク質を濃縮し、そして緩衝液を、Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ；１００００ｋＤ分子量をカットオフ）を用いて、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に交換した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの分光光度計により測定した。システイン変異体のＳＥＣ分析：１１００シリーズのＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、 Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて、２０〜５０μｇのタンパク質を、ＴＳＫ３０００ｓｗカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｏｋｙｏ，ＪＰ）に注入し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化し、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で操作した。
ＰＥＧ化ＩＬ−１０の産生
本開示は、当業者に公知の任意の手段によるＰＥＧ化ＩＬ−１０の合成を意図する。モノＰＥＧ−ＩＬ−１０、及び、モノ／ジＰＥＧ−ＩＬ−１０の混合物を産生するためのいくつかの代替の合成スキームの下記の記述は、単なる例示であることを意味する。モノＰＥＧ−ＩＬ−１０、及び、モノ／ジＰＥＧ−ＩＬ−１０の混合物の両者は、多くの比較可能な特性を有するが、選択的にＰＥＧ化された、モノ−及びジ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０の混合物は、最終ＰＥＧ化産生物の収率を向上させる（参照：例えば、Ｕ.Ｓ. Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ.７０５２６８６、及び、ＵＳ Ｐａｔ. Ｐｕｂｌｎ. Ｎｏ.２０１１／０２５０１６３）。
本開示の実施に適したＰＥＧの製造と使用（及び、他の薬物送達技術）に自分のスキルを活用することに加えて、当業者は、また、ＰＥＧ関連技術（及び、他の薬物送達技術）の多くの商業的供給業者に精通している。一例として、ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ社（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）は、単官能性線状ＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、マルチアーム型ＰＥＳ、分枝ＰＥＧ、ヘテロ官能性ＰＥＧ、二股状のＰＥＧ、及び分離可能なＰＥＧを供給し、及び、Ｐａｒｃｈｅｍ社（Ｎｅｗ Ｒｏｃｈｅｌｌｅ、ＮＹ）は、ＰＥＧ製品やその他の特殊原料の世界的な販売代理店である。
典型的なＰＥＧ−ＩＬ−１０の合成スキームＮｏ．１：ＩＬ−１０は、ｐＨ７．０の１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌに対して透析することができる。その後、透析したＩＬ−１０は、透析緩衝液を用いて、４ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、３．２倍希釈してもよい。リンカー、ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋ（Ｄｅｌｍａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌａｂｓ社；Ｍａｙｗｏｏｄ、ＩＬ）を添加する前に、ｐＨ９．１で１００ｍＭの四ホウ酸ナトリウム１体積部を、ＩＬ−１０溶液のｐＨを８．６に上昇させために、９体積部の希釈したＩＬ−１０に加えることができる。ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋリンカーを透析緩衝液に溶解することができ、そして、リンカー溶液（１．８〜３．６モルのリンカー／ＩＬ−１０のモル）の適切な量を、ＰＥＧ化反応を開始するために、希釈したＩＬ−１０溶液に添加することができる。反応は、反応の速度を制御するために、５℃で実施できる。ＰＥＧ化反応の間に、反応溶液を穏やかに撹拌することができる。モノＰＥＧ−ＩＬ−１０の収率が、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により決定されるときに、４０％に近い場合、反応は、３０ｍＭの最終濃度まで、１Ｍグリシン溶液を添加することにより停止させる。反応溶液のｐＨは、ＨＣｌ溶液を用いて、徐々に、７．０に調整し、その後、反応溶液を、０．２ミクロンのフィルターを用いて濾過し、−８０℃で保存される。
典型的なＰＥＧ−ＩＬ−１０の合成スキームＮｏ．２：モノＰＥＧ−ＩＬ−１０は、リンカーとしてメトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（ＰＡＬＤ−ＰＥＧ）を用いて調製する（Ｉｎｈａｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， ＡＬ；ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ社（Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）からも、また、入手可能）。ＰＡＬＤ−ＰＥＧは、５ＫＤａ、１２ＫＤａ、または、２０ｋＤａの分子量を有することができる。ＩＬ−１０は、反応緩衝液のｐＨが６．３〜７．５の間であることを除いて、上記で記載の通りに透析し、希釈する。活性化ＰＡＬＤ−ＰＥＧリンカーは、反応緩衝液にモル比１：１で添加する。水性シアノ水素化ホウ素は、０．５〜０．７５ｍＭの最終濃度になるまで反応混合物に添加する。反応は、穏やかに撹拌しながら、１５〜２０時間、室温（１８〜２５℃）で実施する。反応は、１Ｍのグリシンでクエンチした。収率は、ＳＥ−ＨＰＬＣで分析する。モノ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、未反応のＩＬ−１０、ＰＥＧリンカー、及び、ジＰＥＧ−ＩＬ−１０から分離され、ＰＲ−ＨＰＬＣおよびバイオアッセイにより特徴付けられる（例えば、ＩＬ−１０の刺激−反応性細胞または細胞株）。
典型的なＰＥＧ−ＩＬ−１０の合成スキームＮｏ．３：ＩＬ−１０（例えば、齧歯類または霊長類）は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウムに対して、ｐＨ：５〜７．４の範囲で透析する。モル比１：１〜１：７の、５Ｋ−ＰＥＧ−プロピルアルデヒドを、０．７５〜３０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下、１〜１２ｍｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１０と反応させる。あるいは、反応は、ピコリンボランを用いて同様の手法で活性化できる。反応液は、３〜２４時間、５〜３０℃で培養する。
ＰＥＧ化反応のｐＨを、６．３に調整した。ＩＬ−１０のＰＥＧリンカーに対するモル比を１：３．５にするために、７．５ｍｇ／ｍＬのｈＩＬ−１０をＰＥＧと反応させた。シアノボロヒドリドの最終濃度は、約２５ｍＭである。反応は、１５℃、１２〜１５時間実施する。モノ−及びジ−ＰＥＧ−ＩＬ−１０は、終了時の反応生成物の最大濃度が約４５〜５０％である。反応は、グリシン若しくはリシン、あるいは、トリス緩衝液を用いてクエンチできる。ゲル濾過、アニオン、及び、カチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）など複数の精製方法を用いて、望ましいＰＥＧ化ＩＬ−１０分子を単離することができる。
典型的なＰＥＧ−ＩＬ−１０の合成スキームＮｏ．４：ＩＬ−１０は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０で、１００ｍＭのＮａＣｌに対して透析する。透析したＩＬ−１０は、透析緩衝液を用いて、約０．５〜１２ｍｇ／ｍｌの濃度になるように、３．２倍希釈される。リンカー、ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋ（Ｄｅｌｍａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｍａｙｗｏｏｄ，Ｉｌｌ）を添加する前に、ｐＨ９．１で、１００ｍＭのテトラホウ酸ナトリウム１体積部を、ＩＬ−１０溶液のｐＨを８．６に上昇させるために、希釈したＩＬ−１０の９体積部に加える。ＳＣ−ＰＥＧ−１２Ｋリンカーを、透析緩衝液に溶解し、リンカー溶液の適切な体積量（ＩＬ−１０のモル当たり１．８〜３．６モルのリンカー）を、ＰＥＧ化反応を開始するために、希釈したＩＬ−１０溶液に添加する。反応速度を制御するために、反応は５℃で行い、反応溶液を穏やかに攪拌する。モノＰＥＧ−ＩＬ−１０の収率が、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）により決定されるときに、４０％に近い場合、反応は、３０ｍＭの最終濃度まで１Ｍのグリシン溶液を添加することにより停止させる。反応溶液のｐＨを、ＨＣｌ溶液を用いて徐々に７．０に調整し、反応溶液を０．２ミクロンで濾過し、−８０℃で保存する。
ＩＬ−１０改変体の生物活性を決定するためのアッセイ
本開示は、本明細書に記載のＩＬ−１０分子の生物活性を決定するための当該分野で公知の任意のアッセイ及び方法の使用を意図する。本明細書に記載のアッセイは代表例であり、排他的ではない。
ＴＮＦα阻害アッセイ：Ｕ９３７細胞のＰＭＡ刺激（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（＃８５０１１４４０）から入手可能な、肺からのリンパ芽球のヒト細胞株；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が、細胞にＴＮＦαを分泌させ、そして、ヒトＩＬ−１０による、これらＴＮＦα分泌細胞のその後の処理は、ＴＮＦα分泌の低下を、用量依存的に引き起こす。
典型的なＴＮＦα阻害アッセイは、以下の手順を用いて実施してもよい。１０％のＦＢＳ／ＦＣＳ、及び抗生物質、プレート１×１０５、条件ごとに三連で９６ウェルの平底プレート（いずれかのプラズマ処理された組織培養プレート（例えば、Ｎｕｎｃ社；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ＵＳＡ）を使用してもよい。）中で、９０％生存したＵ９３７細胞を含むＲＭＰＩにＵ９３７細胞を培養した後、プレート細胞は、以下の条件を提供される：（すべての少なくとも三連で；半分を１０ｎＭのＰＭＡとの培養の後で、生存率のために使用されるので、「培養液単独」のために、ウェルの数が２倍になる）：５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳのみ；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋０．１ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１０；５ｎｇ／ ｍＬのＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０００ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋０．１ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ−のｒｈＩＬ−１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０；５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１００ｎｇ／ｍｌのＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０；及び５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ＋１０００ｎｇ／ｍＬのＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０。
各ウェルに１０ｎＭのＰＭＡを２００μＬ加えて、２４時間曝露し、細胞の約９０％が接着した後、５％ＣＯ２の培養器中、３７℃で培養する。３つの余分なウェルを再懸濁し、そして細胞が、生存率を評価するためにカウントされる（＞９０％の生存率があるべきである）。培養液を含む新鮮な非ＰＭＡで、穏やかで、しかし完全に、３Ｘ洗浄し、細胞がウェル内に残っていることを確認する。適切な濃度（２Ｘ：容積が１００％に希釈されるように）のｒｈＩＬ−１０またはＰＥＧ−ｒｈＩＬ−１０を含む培養液をウェル当たり１００μＬ加えて、３７℃、５％ＣＯ２培養器中、３０分間培養した。５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳの最終濃度を達成するために、１０ｎｇ／ｍＬのストックＬＰＳを各ウェル当たり、１００μＬ加え、そして、３７℃、５％ＣＯ２培養器中、１８〜２４時間培養する。上清液を除去し、製造業者の指示に従い、ＴＮＦαのＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡで重複して、各々馴化上清を実施する。
ＣＤ８＋Ｔ−細胞ＩＦＮγ分泌アッセイ：ＰＥＧ−ＩＬ−１０で、その後、抗ＣＤ３抗体で処理すると、活性化初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＦＮγを分泌する。下記の手順は、典型的なＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌アッセイを提供する。ヒト一次末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、任意の標準的な手順に従い単離することができる（参照：例えば、Ｆｕｓｓ ｅｔ ａｌ．（２００９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ ７．１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ， Ｉｎｃ．，ＮＹ）。２．５ｍＬのＰＢＭＣｓ（１０００万細胞／ｍＬの細胞密度で）が、ＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社；Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）；及びペニシリン／ストレプトマイシンカクテル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む、任意の標準的な組織培養で処理した６ウェルプレート（ＢＤ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）で、完全ＲＰＭＩによりウェル当たり培養することができる。ＰＥＧ化ヒトＩＬ−１０は、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度でウェルに添加することができる。阻害性／チェックポイント受容体の機能を遮断する抗体の１０μｇ／ｍＬの最終濃度は、また、ＰＥＧ化ＩＬ−１０と組み合わせて添加することができる。細胞を、６〜７日間、５％ＣＯ２を含む加湿した３７℃の培養器中で培養することができる。この培養の後、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社のＭＡＣＳ細胞分離技術を用いて製造業者の手順に従い単離することができる（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社； Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）。分離したＣＤ８＋Ｔ細胞は、その後、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む完全ＲＰＭＩで、任意の標準組織培養プレートを用いて４時間培養できる。４時間の培養の後、培養液を集め、市販のＥＬＩＳＡキットを用い、製造者のプロトコルに従い（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＩＦＮγのアッセイができる。
腫瘍モデル及び腫瘍分析
任意の当該分野で認められた腫瘍モデル、アッセイなどは、種々の腫瘍で、本明細書に記載のＩＬ−１０分子の効果を評価するために使用することができる。下記に記載された腫瘍モデル及び腫瘍分析は、活用できるものの代表である。
同系マウス腫瘍細胞は、腫瘍接種あたり、１０４、１０５または１０６細胞で、皮下注射するか、または、皮内注射する。ＥＰ２乳腺癌、ＣＴ２６結腸癌、皮膚のＰＤＶ６扁平上皮癌、及び４Ｔ１乳癌モデルを用いることができる（参照：例えば、Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４２：４６１−４６５）。免疫応答性のＢａｌｂ／ＣまたはＢ細胞欠損Ｂａｌｂ／Ｃマウスを使用することができる。ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０は、免疫正常マウスに投与することができる。一方、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０の治療は、Ｂ細胞欠損マウスで行なうことができる。腫瘍は、治療が始まる前に、１００〜２５０ｍｍ３の大きさに到達させることが可能である。ＩＬ−１０、ＰＥＧ−ｍＩＬ−１０、ＰＥＧ−ｈＩＬ−１０、または対照群の緩衝液を、腫瘍移植から離れた部位に皮下投与される。腫瘍増殖は、一般的には、電子カリパスを用いて毎週、二回監視される。
腫瘍組織及びリンパ器官は、多くの炎症マーカー用のｍＲＮＡの発現を測定するために、及びいくつかの炎症細胞マーカー用の免疫組織化学を行うために、様々なエンドポイントで入手できる。組織を液体窒素中でスナップ凍結し、−８０℃で保存する。原発腫瘍の成長は、一般的には、電子カリパスを用いて、週２回監視する。腫瘍体積は、長さが長い方の寸法である式（幅２×長さ／２）を用いて計算できる。腫瘍は、治療を開始する前に、９０〜２５０ｍｍ３の大きさに到達することを可能にする。
生物学的活性を示す識別変異体
本明細書に記載の方法を用いて、評価は、成熟ヒトＩＬ−１０タンパク質の１６０個のアミノ酸残基の内どの部分が、ＰＥＧ部分のためのアンカー部位の形成を助長する残基での置換に耐えられるかどうかを決定するために実施した。この評価を用いて同定された残基は、置換が生物活性を示す変異体（ムテイン）をもたらすかどうかを決定するために分析された。当業者は、生体外アッセイにおいて活性ではない全ての変異体は、生体内設定において活性を有するとも限らず、そして逆もまた真であることを認識するであろう。
評価結果を図５に要約する。図５の最初の２行は、ＩＬ−１０の領域ごとに境界線（即ち：ａ）プレヘリックスＡ：ｂ）ヘリックスＡ；ｃ）Ａ／Ｂヘリックス間接合；ｄ）ヘリックスＢ；ｅ）Ｂ／Ｃ ヘリックス間接合；ｆ）ヘリックスＣ；ｇ）Ｃ／Ｄ ヘリックス間接合；ｈ）ヘリックスＤ；ｉ）Ｄ／Ｅヘリックス間接合；ｊ）ヘリックスＥ；ｋ）Ｅ／Ｆヘリックス間接合；ｌ）ヘリックスＦ；及び、ｍ）各領域のアミノ酸残基）、並びに、ヘリックス内のキンク位置及び各キンクのアミノ酸残基を定義する。図５の次の４行は、それぞれの残基に導入された変異の種類に関連する：システイン、チロシン、Ｎ−Ｘ−Ｓ、及びＮ−Ｘ−Ｔ；Ｎ−Ｘ−Ｓ、及びＮ−Ｘ−Ｔは、Ｎ−グリコシル化モチーフである。
図５の影を参照して、下記に記載の「ｘ」（後記）を有するダークグレイボックスを例外として、ダークグレイボックスの残基は変異せず、または分析の一部でもない。本明細書の教示の適用を元に、そのような残基は、表面露出せず、または受容体結合に関与している。ライトグレイボックス内の残存する７８個の残基は、ホモ二量体上に表面露出する可能性が高く、受容体結合に干渉する可能性が少ない残基を表す。当業者は、１つ以上の残基が異なって分類できると結論付けることができることを理解すべきであろう（即ち、ダークグレイボックス内にある残基は、ライトグレイボックス内に置かれてもよい）。
変異体（例えば、システインまたはチロシン）は、本明細書に記載の方法を使用して生成され、生物学的活性を決定するために、ＭＣ／９アッセイで評価した。変異体が発現され、生物学的活性を示した場合、該当するボックスに「＋」を入れた（例えば、アミノ酸残基９６を参照して、チロシン変異体は、活性を示すが、一方システイン変異体は示さなかった）。評価の目的のために、任意の生物学的活性の測定は、「＋」記号を割り当てた。
図５中の特定のアミノ酸残基に関連付けられた列で、いくつかの箱（ライトグレイ）には、「＋」が含まれ、他のボックス（ダークグレイ）は、「ｘ」を含む。これらの例では（例えば、１０（Ｎ））、ダークグレイの「ｘ」のボックスは、さまざまな理由で変異させることができなかった。ヒトＩＬ−１０がすでにその位置にチロシンが含まれているため、残基５９（Ｙ）は、チロシンに変異することができなかった。１０（Ｎ）、６０（Ｌ）、１０６（Ｒ）の残基に、Ｎ−グリコシル化部位を導入することは、システイン結合に干渉し、タンパク質の生物活性をおそらく破壊するであろう。残基１１６（Ｎ）のために、タンパク質は、既に、Ｎ−Ｘ−ＳにＮ−グリコシル化モチーフが含まれているため、Ｎ−Ｘ−ＳにＮ−グリコシル化モチーフを導入することができなかった。残基１６０（Ｎ）のために、Ｎ−グリコシル化モチーフが、３個のアミノ酸長（Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔ）を含むため、Ｎ−グリコシル化サイトは、タンパク質の最終残基に導入できない。
ライトグレイボックス内の変異体「＋」（例えば、列４（Ｑ）のシステイン行）は、変異体が発現せず、またはＭＣ／９アッセイにおいて活性ではなかったことを示す。しかしながら、ヘテロ二量体の大きな度合いを形成するシステイン変異体だけの活性を試験することに留意すべきである。遊離のシステインは、それが遊離のシステインをペアリングしようとするように、タンパク質を多数の異なるアイソフォームまたは凝集体を形成することを可能にし、これらの凝集体は、それらが治療の候補である可能性がない場合であっても、細胞ベースのアッセイ系の一部の活性を示す可能性があり、それ故、これらは、評価されない。比較では、他の変異体は、凝集体を導入することがはるかに少ない傾向にあるため、従って、それらの生物活性について試験した。
前述の記載に基づき、７８個のアミノ酸残基は、最初の変異体の生成のための部位として検討できる。変異を導入するための７８個の可能性のある部位のうち、２つのサイトが試験した任意の変異体で活性タンパク質を生成しなかったので、７６個のアミノ酸が、それらをＰＥＧ部分を固定するための実行可能な候補とする特性を保持する。
上記で指示した通り、本開示は、ＰＥＧまたは他の部分のｉ）アミノ酸残基１２（Ｃ）、１５（Ｆ）、または１６（Ｐ）以外のプレヘリックスＡ；ｉｉ）アミノ酸残基１９〜２４（ＬＰＮＭＬＲ（配列番号３３））、２６〜３０（ＬＲＤＡＦ（配列番号３４））、３３〜３９；（ＶＫＴＦＦＱＭ（配列番号３５））、または、４１（Ｄ）以外のヘリックスＡ；ｉｉｉ）アミノ酸残基５２（Ｌ）、５３（Ｌ）、または５６（Ｆ）以外のヘリックスＢ；ｉｖ）Ｂ／Ｃへリックス間接合；ｖ）アミノ酸残基６２（Ｃ）、６４（Ａ）、６５（Ｌ）、６８（Ｍ）、６９ （Ｉ）、７１〜７３（ＦＹＬ）、７６（Ｖ）、７７（Ｍ）、または、８０（Ａ）以外のヘリックスＣ；ｖｉ）Ｃ／Ｄへリックス間接合；ｖｉｉ）アミノ酸残基８７（Ｉ）、９１（Ｖ）、９４（Ｌ）、９８（Ｌ）、１０１（Ｌ）、１０５（Ｌ）、または１０８（Ｃ）以外のヘリックスＤ；ｖｉｉｉ）アミノ酸残基１１１（Ｆ）、１１２（Ｌ）、または１１４（Ｃ）以外のＤ／Ｅヘリックス間接合；ｉｘ）アミノ酸残基１２０（Ａ）、１２１（Ｖ）、１２４（Ｖ）、１２７（Ａ）、１２８（Ｆ）または１３１（Ｌ）以外のヘリックスＥ；ｘ）Ｅ／Ｆへリックス間接合；ｘｉ）アミノ酸残基１３６〜１５６（ＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭ（配列番号３６））、１５８（Ｉ）、または１５９（Ｒ）以外のヘリックスＦ；または、ｘｉｉ）ポストヘリックスＦ；の少なくとも１つのアミノ酸残基への結合を促進する置換を含むペプチドを意図する。
本開示の幾つかの実施形態は、少なくとも１つの以下の領域における少なくとも１つのアミノ酸置換を含むペプチドを意図する：１〜１１、４９〜５１、５７〜６１、８１〜８６、８８〜９０、１０２〜１０４、１１５〜１１９、または１３２〜１３４。他の実施形態において、ペプチドは、以下の位置の少なくとも１つで少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：１〜１１、１３、１４、１７、１８、２５、３１、３２、４０、４９〜５１、５４、５５、５７〜６１、６３、６６、６７、７０、７４、７５、７８、７９、８１〜８６、８８〜９０、９２、９３、９６、９７、９９、１００、１０２〜１０４、１０６、１０７、１０９、１１０、１１３、１１５〜１１９、１２２、１２３、１２５、１２６、１２９、１３０、１３２〜１３４、１５７、または１６０。
発明を実施するために発明者に知られている最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態が本明細書に記載される。前述の記載を読んだとき、開示された実施形態の変更例は、当該分野で働く各人には明らかになり、当業者が、必要に応じて、このような変更例を採用できることが期待される。従って、本発明は、本明細書に具体的に記載した以外の方法で実施すること、及び、本発明は、適用法令により許容される通りに、添付の特許請求範囲に記載の主題のすべての修正及び均等物を含むことを意図する。更に、本明細書に示された、またはそうでなければ文脈によって明らかに矛盾しない限り、すべての可能な変更における上記要素の任意の組み合わせも、本発明に包含される。
全ての刊行物、特許出願、受託番号、及び本明細書で引用したその他の参考文献は、個々の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に、参照により導入したことを提示する通りに、参照により本明細書に導入したものとする。

Claims (120)

  1. ａ）プレヘリックスＡ；
    ｂ）ヘリックスＡ；
    ｃ）Ａ／Ｂヘリックス間接合；
    ｄ）ヘリックスＢ；
    ｅ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合；
    ｆ）ヘリックスＣ；
    ｇ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合；
    ｈ）ヘリックスＤ；
    ｉ）Ｄ／Ｅヘリックス間接合；
    ｊ）ヘリックスＥ；
    ｋ）Ｅ／Ｆヘリックス間接合；
    ｌ）ヘリックスＦ；及び、
    ｍ）ポストヘリックスＦ
    を含むペプチドであって、
    １つまたはそれ以上のａ）〜ｍ）に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換、付加、または、欠失を更に含むペプチド。
  2. ａ）プレヘリックスＡ；
    ｂ）ヘリックスＡ；
    ｃ）Ａ／Ｂヘリックス間接合；
    ｄ）ヘリックスＢ；
    ｅ）Ｂ／Ｃヘリックス間接合；
    ｆ）ヘリックスＣ；
    ｇ）Ｃ／Ｄヘリックス間接合；
    ｈ）ヘリックスＤ；
    ｉ）Ｄ／Ｅヘリックス間接合；
    ｊ）ヘリックスＥ；
    ｋ）Ｅ／Ｆヘリックス間接合；
    ｌ）ヘリックスＦ；及び、
    ｍ）ポストヘリックスＦ
    を含むペプチドであって、
    アミノ酸残基１２（Ｃ）、１５（Ｆ）、または１６（Ｐ）以外のプレヘリックスＡの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
    アミノ酸残基１９〜２４（ＬＰＮＭＬＲ）、２６〜３０（ＬＲＤＡＦ）、３３〜３９（ＶＫＴＦＦＱＭ）、または４１（Ｄ）以外のヘリックスＡの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
    アミノ酸残基５２（Ｌ）、５３（Ｌ）、または５６（Ｆ）以外のヘリックスＢの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
    Ｂ／Ｃヘリックス間接合のアミノ酸残基の置換；または
    アミノ酸残基６２（Ｃ）、６４（Ａ）、６５（Ｌ）、６８（Ｍ）、６９ （Ｉ）、７１〜７３（ＦＹＬ）、７６（Ｖ）、７７（Ｍ）、または８０（Ａ）以外のヘリックスＣの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
    Ｃ／Ｄヘリックス間接合の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
    アミノ酸残基８７（Ｉ）、９１（Ｖ）、９４（Ｌ）、９８（Ｌ）、１０１ （Ｌ）、１０５（Ｌ）、または１０８（Ｃ）以外のヘリックスＤの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
    アミノ酸残基１１１（Ｆ）、１１２（Ｌ）、または１１４（Ｃ）以外のＤ／Ｅヘリックス間接合の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
    アミノ酸残基１２０（Ａ）、１２１（Ｖ）、１２４（Ｖ）、１２７（Ａ）、１２８（Ｆ）、または１３１（Ｌ）以外のヘリックスＥの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
    Ｅ／Ｆヘリックス間接合のアミノ酸残基の置換；または
    アミノ酸残基１３６〜１５６（ＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭ）、１５８（Ｉ）、または１５９（Ｒ）以外のヘリックスＦの少なくとも１つのアミノ酸残基の置換；または
    ポストヘリックスＦのアミノ酸残基の置換；
    を含む少なくとも１つのアミノ酸置換を更に含む、請求項１に記載の前記ペプチド。
  3. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、ペプチドの２つの単量体サブユニット間の非共有結合相互作用を破壊しない、請求項２に記載の前記ペプチチド。
  4. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、保存置換である、請求項２に記載の前記ペプチチド。
  5. 前記ペプチドが、配列番号２の生物活性と少なくとも同等の生物活性を有し、 該生物活性が、生体外アッセイまたは生体内アッセイで決定される、請求項２に記載の前記ペプチチド。
  6. 生体外活性が、ＴＮＦα阻害アッセイ、ＭＣ／９細胞増殖アッセイ、またはＣＤ８＋Ｔ細胞ＩＦＮγ分泌アッセイの少なくとも１つである、請求項５に記載の前記ペプチチド。
  7. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が免疫原性に悪影響を与えない、請求項２に記載の前記ペプチド。
  8. 前記ペプチドの前記免疫原性が、少なくとも１つのＴ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープをスクリーニングすることにより予測される、請求項７に記載の前記ペプチド。
  9. 前記スクリーニングは、インシリコスクリーニングシステム、または、生体外アッセイシステムの少なくとも１つである、請求項８に記載の前記ペプチド。
  10. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、以下の領域：１〜１１、４９〜５１、５７〜６１、８１〜８６、８８〜９０、１０２〜１０４、１１５〜１１９、または、１３２〜１３４の少なくとも１つにある、請求項２に記載の前記ペプチド。
  11. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、以下の位置：１〜１１、１３、１４、１７、１８、２５、３１、３２、４０、４９〜５１、５４、５５、５７〜６１、６３、６６、６７、７０、７４、７５、７８、７９、８１〜８６、８８〜９０、９２、９３、９６、９７、９９、１００、１０２〜１０４、１０６、１０７、１０９、１１０、１１３、１１５〜１１９、１２２、１２３、１２５、１２６、１２９、１３０、１３２〜１３４、１５７、または１６０の少なくとも１つにある、請求項２に記載の前記ペプチド。
  12. 前記ペプチドが、受容体結合に関与するアミノ酸残基の置換を含まない、請求項２に記載の前記ペプチド。
  13. 前記ペプチドが、改変ペプチドを生成するために、少なくとも１つの改変を含み、
    該改変は、前記ペプチドのアミノ酸配列を変更せず、及び、
    該改変は、前記ペプチドの少なくとも１つの特性を向上させる、請求項２に記載の前記ペプチド。
  14. 前記改変ペプチドがＰＥＧ化されている、請求項１３に記載の前記ペプチド。
  15. 前記改変ペプチドが、ＩＬ−１０の少なくとも１つの単量体の少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合する少なくとも１つのＰＥＧ分子を含む、請求項１４に記載の前記ペプチド。
  16. 前記改変ペプチドが、モノＰＥＧ化及びジＰＥＧ化ＩＬ−１０の混合物を含む、請求項１５に記載の前記ペプチド。
  17. 前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が、５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１５に記載の前記ペプチド。
  18. 前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が、２０ｋＤａより大きい分子量を有する、請求項１５に記載の前記ペプチド。
  19. 前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が、少なくとも３０ｋＤの分子量を有する、請求項１５に記載の前記ペプチド。
  20. 前記改変ペプチドが、グリコシル化されている、請求項１３に記載の前記ペプチド。
  21. 前記改変ペプチドが、Ｆｃ融合分子、血清アルブミン、またはアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の前記ペプチド。
  22. 前記改変が部位特異的である、請求項１３に記載の前記ペプチド。
  23. 前記改変がリンカーを含む、請求項１３に記載の前記ペプチド。
  24. 前記改変が、前記ペプチドの少なくとも１つの物理的特性を向上させる、請求項１３に記載の前記ペプチド。
  25. 前記物理的特性が、溶解度、バイオアベイラビリティ、血清半減期、及び循環時間から成るグループから選択される、請求項２４に記載の前記ペプチド。
  26. 前記改変ペプチドが、成熟ヒトＩＬ−１０の活性と少なくとも同等の活性を有する、請求項１３に記載の前記ペプチド。
  27. 前記ペプチドが組み換え的に産生される、請求項２に記載の前記ペプチド。
  28. 配列番号２のアミノ酸配列を含むペプチドであって、
    表面露出型アミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、
    前記置換が、下記の効果：
    （ａ）前記ペプチドの少なくとも１つの物理的特性を向上させ；
    （ｂ）前記ペプチドの免疫原性に悪影響を与えず；または、
    （ｃ）前記ペプチドの生物活性に悪影響を与えない；
    の少なくとも１つを有するペプチド。
  29. 前記ペプチドが、受容体結合に関与するアミノ酸残基の置換を含まない、請求項２８に記載の前記ペプチド。
  30. 前記置換が、前記ペプチドの分子内ジスルフィド結合を破壊しない、請求項２８に記載の前記ペプチド。
  31. 前記置換が、前記ペプチドの２つの単量体サブユニットの間の非共有相互作用を破壊しない、請求項２８に記載の前記ペプチド。
  32. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が保存置換である、請求項２８に記載の前記ペプチド。
  33. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、アミノ酸残基１２、６２、１０８及び１１４の１つまたはそれ以上での置換ではない、請求項２８に記載の前記ペプチド。
  34. 配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列相同性を含むペプチドであって、
    下記の特徴：
    （ａ）配列番号２の前記ペプチドより免疫原性が大きくなく；
    （ｂ）配列番号２の前記ペプチドの生物活性と少なくとも同等の生物活性を有し；
    （ｃ）配列番号２の前記ペプチドの少なくとも１つの物理特性の向上を有する；
    の少なくとも１つを有するペプチド。
  35. 前記ペプチドが、少なくとも９５％のアミノ酸配列相同性を有する、請求項３４に記載の前記ペプチド。
  36. 前記ペプチドが、少なくとも９７％のアミノ酸配列相同性を有する、請求項３４に記載の前記ペプチド。
  37. 前記ペプチドが、少なくとも９８％のアミノ酸配列相同性を有する、請求項３４に記載の前記ペプチド。
  38. 前記ペプチドが、少なくとも９９％のアミノ酸配列相同性を有する、請求項３４に記載の前記ペプチド。
  39. 前記ペプチドの各単量体が少なくとも１２５個のアミノ酸残基を有する、請求項３４に記載の前記ペプチド。
  40. 前記ペプチドの各単量体が少なくとも１５０個のアミノ酸残基を有する、請求項３４に記載の前記ペプチド。
  41. 前記ペプチドの各単量体が少なくとも１５５個のアミノ酸残基を有する、請求項３４に記載の前記ペプチド。
  42. 前記ペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または、付加を含む、請求項３４に記載の前記ペプチド。
  43. 前記ペプチドが、受容体結合に関与するアミノ酸残基の置換を含まない、請求項４２に記載の前記ペプチド。
  44. 前記ペプチドが、表面露出型アミノ酸残基の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項４２に記載の前記ペプチド。
  45. 前記少なくとも１つの付加、欠失、または置換が、前記ペプチドの分子内ジスルフィド結合を破断しない、請求項４２に記載の前記ペプチド。
  46. 前記少なくとも１つの付加、欠失、または置換が、前記ペプチドの２つの単量体サブユニット間の非共有相互作用を破断しない、請求項４２に記載の前記ペプチド。
  47. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、保存置換である、請求項４２に記載の前記ペプチド。
  48. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、アミノ酸残基１２、６２、１０８、及び１１４の１つまたはそれ以上での置換ではない、請求項４２に記載の前記ペプチド。
  49. 物理特性が、溶解度、バイオアベイラビリティ、血清半減期及び循環時間から成るグループから選択される、請求項２８または３４に記載の前記ペプチド。
  50. 前記ペプチドが、配列番号２の生物活性と少なくとも同等な生物活性を有し、
    当該生物活性は、生体外アッセイまたは生体内アッセイにより決定される、請求項２８または３４に記載の前記ペプチド。
  51. 前記生体外活性が、ＴＮＦα阻害アッセイ、ＭＣ／９細胞増殖アッセイ、または、ＣＤ８＋Ｔ細胞ＩＦＮγ分泌アッセイの少なくとも１つである、請求項４８に記載の前記ペプチド。
  52. 前記ペプチドの免疫原性が、Ｔ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープの少なくとも１つをスクリーニングすることにより予測される、請求項２８または３４に記載の前記ペプチド。
  53. 前記スクリーニンングが、インシリコスクリーニングシステムまたは生体外アッセイシステムの少なくとも１つである、請求項５２に記載の前記ペプチド。
  54. 前記ペプチドが、改変ペプチドを産生するために少なくとも１つの改変を含み、
    当該改変が、前記改変ペプチドのアミノ酸配列を変更せず、及び
    前記改変ペプチドが、成熟ヒトＩＬ−１０の活性と少なくとも同等な活性を有する、請求項２８または３４に記載の前記ペプチド。
  55. 前記改変ペプチドがＰＥＧ化されている、請求項５４に記載の前記ペプチド。
  56. 前記改変ペプチドが、ＩＬ−１０の少なくとも１つの単量体の少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合される少なくとも１つのＰＥＧ分子を含む、請求項５５に記載の前記ペプチド。
  57. 前記改変ペプチドが、モノＰＥＧ化及びジＰＥＧ化ＩＬ−１０の混合物を含む、請求項５６に記載の前記ペプチド。
  58. 前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が、５ｋＤａ〜２０ｋＤａの分子量を有する、請求項５６に記載の前記ペプチド。
  59. 前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が、２０ｋＤａより大きい分子量を有する、請求項５６に記載の前記ペプチド。
  60. 前記改変ペプチドのＰＥＧ成分が、少なくとも３０ｋＤの分子量を有する、請求項５６に記載の前記ペプチド。
  61. 前記改変ペプチドが、グリコシル化されている、請求項５４に記載の前記ペプチド。
  62. 前記改変ペプチドが、Ｆｃ融合分子、血清アルブミン、またはアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の少なくとも１つを含む、請求項５４に記載の前記ペプチド。
  63. 前記改変が部位特異的である、請求項５４に記載の前記ペプチド。
  64. 前記改変がリンカーを含む、請求項５４に記載の前記ペプチド。
  65. 前記ペプチドが組み換え的に産生される、請求項２８または３４に記載の前記ペプチド。
  66. 請求項１、２６または３２に記載のペプチドをコード化する核酸分子。
  67. 前記核酸分子が、生体外、細胞内、または生体内のペプチドをコード化する核酸分子の発現を与える発現制御要素に操作可能に連結されている、請求項６６記載の前記核酸分子。
  68. 請求項６７に記載の前記核酸分子を含むベクター。
  69. 前記ベクターがウイルスベクターを含む、請求項６８記載の前記ベクター。
  70. 請求項２、２８または３４に記載のペプチドを発現させる、形質転換細胞または宿主細胞。
  71. 請求項２、２８または３４に記載のペプチド、及び、薬学的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
  72. 前記賦形剤が等張性注射液である、請求項７１に記載の前記医薬組成物。
  73. 前記医薬組成物がヒト投与に好適である、請求項７１に記載の前記医薬組成物。
  74. 少なくとも１つの追加の予防剤または治療薬を更に含む、請求項７１に記載の前記医薬組成物。
  75. 請求項７１記載の前記医薬組成物を含む、滅菌容器。
  76. 前記滅菌容器が注射器である、請求項７５に記載の前記滅菌容器。
  77. 請求項７５に記載の前記滅菌容器を含むキット。
  78. 少なくとも１つの追加の予防剤または治療薬を含む、第二の滅菌容器を更に含む、請求項７７に記載の前記キット。
  79. 請求項２、２８または３４に記載の前記ペプチドに特異的に結合する抗体。
  80. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項７９に記載の前記抗体。
  81. 前記抗体が、別々のポリペプチド中に存在する、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む、請求項７９に記載の前記抗体。
  82. 前記抗体が、単一のポリペプチド中に存在する、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む、請求項７９に記載の前記抗体。
  83. 前記抗体が重鎖定常領域を含み、
    前記重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のアイソタイプである、請求項７９に記載の前記抗体。
  84. 抗体が検出可能に標識化される、請求項７９に記載の前記抗体。
  85. 前記抗体が、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、またはＦａｂ′である、請求項７９に記載の前記抗体。
  86. 前記抗体が、ヒト抗体である、請求項７９に記載の前記抗体。
  87. 前記抗体が、約１０７Ｍ−１〜約１０１２Ｍ−１の親和性でペプチドと結合する、請求項７９に記載の前記抗体。
  88. 前記抗体が、脂質部分、脂肪酸部分、多糖類部分、及び炭水化物部分から選択される共有結合で連結した部分を含む、請求項７９に記載の前記抗体。
  89. 前記抗体が、親和性ドメインを含む、請求項７９に記載の前記抗体。
  90. 前記抗体が、固体支持体上に固定化される、請求項７９に記載の前記抗体。
  91. 前記抗体がヒト化抗体である、請求項７９に記載の前記抗体。
  92. 前記抗体が、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体である、請求項７９に記載の前記抗体。
  93. 前記ｓｃＦｖが多量体化されている、請求項９２に記載の前記抗体。
  94. 前記抗体が共有結合した非ペプチドポリマーを含む、請求項７９に記載の前記抗体。
  95. 前記ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）ポリマーである、請求項９４に記載の前記抗体。
  96. 請求項７９に記載の抗体、及び薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤を含む、医薬組成遺物。
  97. 前記賦形剤が、等張性の注射液である、請求項９６に記載の前記医薬組成物。
  98. 前記医薬組成物がヒト投与に好適である、請求項９６に記載の前記医薬組成物。
  99. 少なくとも１つの追加の予防剤または治療薬を更に含む、請求項９６に記載の前記医薬組成物。
  100. 請求項９６に記載の前記医薬組成物を含む、滅菌容器。
  101. 注射器である、請求項１００に記載の前記滅菌容器。
  102. 請求項１００に記載の前記滅菌容器を含むキット。
  103. 第二の治療薬を含む第二の滅菌容器を更に含む、請求項１０２に記載の前記キット。
  104. 治療上有効な量の請求項２、２８、または３４に記載のペプチドを被験者に投与することを含む、被験者の疾患、障害、または状態を治療し、または予防する方法。
  105. 前記疾患、障害、または状態が、増殖性障害である、請求項１０４に記載の前記方法。
  106. 前記増殖性障害が癌である、請求項１０５に記載の前記方法。
  107. 前記癌が固形腫瘍または血液障害である、請求項１０６に記載の方法。
  108. 前記疾患、障害、または状態は、免疫性または炎症性障害である、請求項１０４に記載の前記方法。
  109. 前記免疫性または炎症性障害が、炎症性腸疾患、乾癬、関節リウマチ、多発性硬化症、及びアルツハイマー病から成るグループから選択される、請求項１０８に記載の前記方法。
  110. 前記疾患、障害、または状態が、血栓症または血栓状態である、請求項１０４に記載の前記方法。
  111. 前記疾患、障害、または状態が、線維性疾患である、請求項１０４に記載の前記方法。
  112. 前記疾患、障害、または状態が、ウイルス性障害である、請求項１０４に記載の前記方法。
  113. 前記ウイルス障害が、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、及びサイトメガロウイルスから成るグループから選択される、請求項１１２に記載の前記方法。
  114. 前記疾患、障害、または状態は、心血管障害である、請求項１０４に記載の前記方法。
  115. 前記心血管障害が、アテローム性動脈硬化症である、請求項１１４に記載の前記方法。
  116. 前記被験者は、コレステロールが上昇している、請求項１１５に記載の前記方法。
  117. 前記被験者がヒトである、請求項１０４に記載の前記方法。
  118. 前記投与が非経口注射による、請求項１０４に記載の前記方法。
  119. 前記非経口注射が、皮下注射である、請求項１１８に記載の前記方法。
  120. 少なくとも１つの追加の予防剤、または治療薬を投与することを更に含む、請求項１０４記載の前記方法。
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