CN106573072A - 降低血清胆固醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗患有对调节枯氏细胞功能的药剂有反应的疾病、病症或病状，包括与胆固醇体内平衡相关的病症的受试者的方法，包括与其相关的施用方法和给药方案。还提供了用IL‑10药剂治疗患有肝脏疾病、病症或病状，包括非酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪肝病的受试者的方法。

Description

降低血清胆固醇的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2014年6月2日提交的美国临时申请序列号62/006,651的优先权权益，该申请以全文引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明涉及通过施用能调节脂蛋白体内平衡的药剂来治疗或预防高胆固醇血症以及一系列不同的相关疾病、病症和病状的方法。
引言
高胆固醇血症是高脂血症和高脂蛋白血症的一种常见形式，即血液中存在高水平的胆固醇。胆固醇是在血浆中的脂蛋白内转运，所述脂蛋白根据其密度分类为：VLDL(极低密度脂蛋白)、IDL(中密度脂蛋白)、LDL(低密度脂蛋白)和HDL(高密度脂蛋白)。VLDL、IDL和LDL，特别是LDL的水平升高与心血管病症(包括动脉粥样硬化和心脏病)的风险增加相关。相反，认为HDL水平较高将发挥保护作用。在患有不受饮食限制控制的高胆固醇血症的受试者中，通常授权进行药物干预。
已经将先天免疫系统活性增加与肥胖相关性异常血脂症和胰岛素抗性以及II型糖尿病的发病相关联。骨髓衍生单核细胞巨噬细胞在先天免疫系统中起着关键作用。它们响应于感染、组织损伤或其他创伤而被募集至组织，而且特别富集在频繁暴露于外源性和内源性毒素的组织，诸如肝脏中。最近的研究表明，巨噬细胞参与肝脏代谢和胰岛素敏感性的饮食诱导变化，而且表明它们在II型糖尿病和肥胖中起着一定作用(Huang等,Diabetes59:347-57(2010))。因此，调节肝脏巨噬细胞体内平衡可以提供治疗和预防代谢异常的另一种方法。
虽然一般通过减少胆固醇产生或吸收来发挥其活性的常规脂质降低剂在治疗大部分患者群体时是有效的，但替代药剂，尤其是通过不同的作用机制起作用的药剂将提供有价值的治疗选择，既可以作为单一疗法又可以作为现存药物方案的补充。
发明概要
本公开设想了使用本文中所描述的IL-10、经过修饰(例如聚乙二醇化)的IL-10和相关药剂以及其组合物来治疗和/或预防多种疾病、病症和病状和/或其症状的方法。诸多具体实施方案涉及受试者的异常高水平的胆固醇和/或高胆固醇血症表现的治疗和/或预防。其他具体实施方案涉及调节枯氏细胞(例如，通过增加活性和/或增加数目)以实现对受试者的异常高水平的胆固醇和/或高胆固醇血症表现的治疗和/或预防。
高胆固醇血症本身一般是无症状的。然而，血清胆固醇的慢性升高促成动脉中形成动脉粥样硬化斑块。相对较小的斑块可能破裂并且引起凝块形成并阻塞血流。相比之下，较大的斑块可能导致所涉及的动脉的动脉狭窄或阻塞。冠状动脉的突然阻塞会导致心肌梗塞，而供应大脑的动脉的阻塞可能导致中风。
狭窄或阻塞逐渐发展导致供给组织和器官的血液供应量逐步减少，从而往往导致其活性受到损伤。组织缺血可以表现为一种或多种症状。举例来说，脑部短暂局部缺血(短暂性局部缺血发作)可能表现为视力短暂丧失、眩晕或平衡受损、失语症、轻瘫和感觉异常。供给心脏的血液供应量不足可能表现为胸痛；眼睛局部缺血可能表现为一只眼短暂视力丧失；而供给腿部的血液供应量不足可能表现为小腿疼痛。
高胆固醇血症可以根据特征性表现而被分类成各种类型。举例来说，IIa型高脂蛋白血症可能与睑黄斑瘤(眼睑周围的皮肤下面的淡黄色斑块)、老年环(角膜外周的白色或灰色变色)和肌腱(通常手指)的黄瘤(淡黄色富含胆固醇的物质的沉积)相关。相反，III型高脂血症可能与手掌、膝盖和肘部的黄瘤相关。
根据脂质假说，血液中的异常胆固醇水平(一般是较高浓度的LDL颗粒和较低浓度的功能性HDL颗粒)与由于动脉中粥样斑块发展(动脉粥样硬化)增进而引起的心血管疾病强相关。因为已经将高循环LDL浓度与粥样斑块形成相关联，因此LDL通常被称为“坏胆固醇”；相反，高浓度HDL可以从细胞中除去胆固醇，从而减少粥样斑块形成，且因此HDL通常被称为“好胆固醇”。然而，最近的证据表明，总胆固醇是心血管异常的最相关指标。
迄今为止，对系统胆固醇水平的治疗控制主要集中在抑制膳食胆固醇的吸收和抑制内源性肝细胞胆固醇合成。举例来说，依泽替米贝(ZETIA)抑制小肠中的膳食吸收，而且它已经在喂食高脂饮食的基因缺乏小鼠品系APOE-/-和LDLR-/-小鼠中表现出能显著降低血清胆固醇(Davis,H.R.,Jr.等,Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001.21(12):2032-38)。再举例来说，他汀类胆固醇降低治疗剂通过主要在肝细胞中具有活性的甲羟戊酸途径通过抑制HMG-CoA介导的胆固醇合成来起作用。
通过其他作用机制起作用的用于治疗高胆固醇血症的治疗形态已经被开发出来或在后期开发中。这些形态包括：PCSK9抑制剂，其增强LDL受体再循环至细胞表面，以便增加从血液中除去LDL颗粒的速率；米泊美生(KYNAMERO)，这是一种用于治疗家族性高胆固醇血症(FH)的反义寡核苷酸，其通过与apoB-100杂交且因此限制可以形成的LDL-C的量来起作用；以及洛美他派(JUXTAPID)，也用于治疗FH，它通过抑制肝脏中的微粒体甘油三酯转移蛋白来预防VLDL的形成和分泌。如同其他胆固醇降低剂，这些形态与限制其在某些患者群体中的功效的不利作用相关联(例如，米泊美生和洛美他派已经与由胆固醇在肝脏中积聚而导致的脂肪肝疾病相关联)。
如本文中进一步讨论，巨噬细胞通过吸收LDL胆固醇以及胆固醇的Ac-LDL和Ox-LDL形式而在胆固醇体内平衡中起重大作用。虽然枯氏细胞(KC)仅占总计100亿至300亿个肝细胞的大约10％至15％，但KC在胆固醇分解代谢方面的效率比肝细胞高18倍。因此，调节KC功能和/或增加KC数目代表了治疗和预防高胆固醇血症以及相关疾病、病症和病状的一种新颖手段。本公开的诸多实施方案包括向受试者施用能调节枯氏细胞(例如通过增加活性和/或增加数目)的药剂(例如小分子、多肽或抗体)来实现对受试者的异常高水平的胆固醇和/或高胆固醇血症表现的治疗和/或预防。在诸多具体实施方案中，调节枯氏细胞功能被用于治疗和/或预防家族性高胆固醇血症(FH)。在某些实施方案中，所述药剂是IL-10药剂(例如PEG-IL-10)。
如下文进一步讨论，人IL-10是同二聚体，并且每一个单体包含178个氨基酸，其中前18个包含信号肽。本公开的诸多具体实施方案包括缺少信号肽的成熟人IL-10多肽(参见例如美国专利号6,217,857)，或成熟人PEG-IL-10。在其他具体实施方案中，所述IL-10药剂是成熟人IL-10的变体。所述变体可以表现出比成熟人IL-10的活性小、与其相当或比其大的活性；在某些实施方案中，所述活性与成熟人IL-10的活性相当或比其大。
术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“药剂”等意在被广义地理解，并且包括例如人和非人IL-10相关多肽，包括同系物、变体(包括突变蛋白)和其片段，以及具有例如前导序列(例如，信号肽)的IL-10多肽，和前述各项的经修饰形式。在其他具体实施方案中，术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“药剂”是激动剂。诸多具体实施方案涉及聚乙二醇化IL-10，其在本文中也称为“PEG-IL-10”。
本公开设想了诸多方法，其中所述IL-10药剂包括至少一种修饰以形成经过修饰的IL-10药剂，其中所述修饰不改变所述IL-10药剂的氨基酸序列。本公开的某些实施方案设想了此类修饰以便增强一种或多种性质(例如药代动力学参数、功效等)。在其他实施方案中，对IL-10的修饰不会对免疫原性造成治疗相关的不利影响，并且在再其他实施方案中，经过修饰的IL-10的免疫原性比未经修饰的IL-10弱。在一些实施方案中，所述经过修饰的IL-10药剂是PEG-IL-10药剂。在其他实施方案中，所述PEG-IL-10药剂可以包括与IL-10的至少一个亚单元的至少一个氨基酸残基共价附接的至少一个PEG分子，或包括单聚乙二醇化IL-10与二聚乙二醇化IL-10的混合物。所述PEG-IL-10药剂的PEG组分可以具有大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa或大于约50kDa的分子质量。在一些实施方案中，所述分子质量是约5kDa至约10kDa、约5kDa至约15kDa、约5kDa至约20kDa、约10kDa至约15kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。
下文详细讨论了其他经过修饰的IL-10药剂。在一些实施方案中，所述经过修饰的IL-10药剂包括至少一个Fc融合分子、至少一个血清白蛋白(例如HSA或BSA)、HSA融合分子或白蛋白缀合物。在其他实施方案中，所述经过修饰的IL-10药剂被糖基化，被羟乙基淀粉化，或包括至少一个白蛋白结合域。一些经过修饰的IL-10药剂可以包括多于一种类型的修饰。在诸多具体实施方案中，所述修饰具有位点特异性，并且在再其他实施方案中，它包括接头。
本公开还设想了编码上述的核酸分子。某些实施方案预见了基因疗法连同本文中的教授内容一起使用。对于基因疗法用途和方法来说，可以用编码如本文中所阐述的IL-10相关多肽的核酸在体内转化受试者的细胞。替代地，可以用转基因或多核苷酸在体外转化细胞，然后移植至所述受试者的组织中，以便实现治疗。另外，可以用编码IL-10相关多肽的转基因或多核苷酸来转化分离的原代细胞或确立细胞株，然后任选地移植至受试者的组织中。
如实验部分中所描绘，发现PEG-rMuIL-10在受到侵袭性攻击的喂食高脂饮食的LDLR-/-小鼠中以吞噬细胞依赖性方式使生理血浆胆固醇水平降低达70％。这个发现在小鼠与人之间一致，说明了IL-10对KC清道夫受体调节的调控与胆固醇吸收增强之间的关系。此外，吞噬细胞在总血浆胆固醇的正常内源性调控中发挥一致而且强大的作用。
在诸多具体实施方案中，本公开描绘了一种鉴定能在KC中诱导STAT3磷酸化的药剂的方法，所述方法包括：a)使候选药剂与KC接触；b)测定所述KC中的STAT3磷酸化水平；以及c)比较b)中的STAT3磷酸化水平与由参考标准物诱导的STAT3磷酸化水平，其中所述KC中的STAT3磷酸化水平与所述参考标准物中的STAT3磷酸化水平相比更高鉴定所述候选药剂为能诱导磷酸化的药剂。
在一些实施方案中，将体外模型用于鉴定能在KC中诱导STAT3磷酸化的药剂。在其他实施方案中，所述KC来自于肝脏的窦状隙。
在本公开的其他实施方案中，所述候选药剂包括小分子、多肽或抗体。
本公开还设想了诸多实施方案，其中所述参考标准物是白介素、干扰素、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)、制瘤素M(OSM)或瘦素。在诸多具体实施方案中，所述白介素是IL-5、IL-6或IL-10。
本公开还包括评估能诱导磷酸化的药剂是否降低血清胆固醇水平和甘油三酯水平中的至少一项的方法。在一些方法中，此类评估是利用生物化学测定法、体外测定法、离体测定法或体内模型来进行。
本公开还设想了鉴定能降低受试者的血清胆固醇的药剂的方法，其包括：a)向所述受试者施用候选药剂，其中所述候选药剂在KC中诱导STAT3磷酸化；b)测定所述受试者的血清胆固醇水平；以及c)比较b)中的所述血清胆固醇水平与向所述受试者施用参考标准物(例如，他汀类)之后测得的血清胆固醇水平，其中已知所述参考标准物能降低血清胆固醇；其中降低血清胆固醇的程度超过所述参考标准物或与所述参考标准物相当的候选药剂鉴定为能降低所述受试者的血清胆固醇的药剂。在本公开的一些实施方案中，所述候选药剂包括小分子、多肽或抗体。本公开的其他实施方案还包括评估所述能降低所述受试者的血清胆固醇的药剂是否诱导肝细胞增殖。
设想了诸多实施方案，其中所述受试者是人。人的血清胆固醇水平可以是200至239mg/dL或至少240mg/dL。设想了其他实施方案，其中所述动物模型是小鼠模型(例如LDLR-/-小鼠模型)。
本公开还设想了降低有需要的受试者的血清胆固醇的方法，其包括施用治疗有效量的能调节KC体内平衡的药剂。所述KC体内平衡可以包括增加KC从血清中除去脂蛋白的能力，和/或它可以包括增加从血清中除去脂蛋白的KC的数目。
前一段中提到的药剂可以是使用上述方法之一鉴定的任何药剂。在诸多具体实施方案中，所述药剂是IL-10药剂。这些药剂可以经肠胃外(例如皮下)、口服或者通过本文中所描述的或技术人员已知的任何其他手段施用至受试者。
本文中设想了组合疗法，以便投与治疗可接受量的至少一种其他胆固醇降低剂。
本公开设想了治疗或预防受试者(例如人类)的高胆固醇血症或高胆固醇血症相关疾病、病症或病状的方法，其包括向所述受试者施用(例如，经由肠胃外(例如SC)或口服施用)治疗有效量的使用本文中所描述的任何方法鉴定的药剂。高胆固醇血症相关疾病、病症或病状可以是心血管病症(例如动脉粥样硬化)、血栓形成或血栓性病状、炎性病症(例如血管炎)或纤维化病症。设想了诸多具体实施方案，其中纤维化病症是肝脏相关性的，诸如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或硬化。
在诸多具体实施方案中，方法可能还包括施用治疗可接受量的至少一种其他治疗剂或预防剂，诸如胆固醇体内平衡剂(例如，他汀类、胆汁酸树脂、依泽替米贝、纤维酸、烟酸或PCSK9抑制剂)、抗肥胖剂或消炎剂。本文中设想了其他药剂以用于组合疗法中，并且这些药剂对本领域普通技术人员是已知的。
本发明设想了包含药学有效量的一种或多种上述药剂和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。一般来说，此类组合物适合用于人施用。这些药物组合物可以包含一种或多种其他预防剂或治疗剂，其实例描述于本文中。
在某些实施方案中，无菌容器(例如小瓶或注射器)可以含有这些药物组合物。所述无菌容器可以容纳在试剂盒中，所述试剂盒还可以含有一种或多种其他预防剂或治疗剂、复溶用构件、使用指导等。
本公开还设想了治疗或预防受试者(例如人)的肝脏疾病、病症或病状的方法，其包括向所述受试者施用(例如经肠胃外，包括皮下)治疗有效量的能调节KC体内平衡的IL-10药剂，其中所述肝脏疾病、病症或病状是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
本公开的其他实施方案设想了治疗或预防受试者(例如人)的肝脏疾病、病症或病状的方法，其包括向所述受试者施用(例如经肠胃外，包括皮下)治疗有效量的能调节KC体内平衡的IL-10药剂，其中所述量足以实现1pg/mL至10.0ng/mL的平均IL-10血清谷浓度；并且其中所述肝脏疾病、病症或病状是NASH或NAFLD。
在再其他实施方案中，本公开设想了治疗或预防受试者(例如人)的肝脏疾病、病症或病状的方法，其包括向所述受试者施用(例如经肠胃外，包括皮下)治疗有效量的能调节KC体内平衡的细胞因子(例如IL-10药剂)，其中所述量足以在一段时间内维持平均细胞因子(例如IL-10)血清谷浓度；其中所述平均细胞因子(例如IL-10)血清谷浓度是1.0pg/mL至10.0ng/mL；其中在至少95％的所述时间段内维持所述平均细胞因子(例如IL-10)血清谷浓度；并且其中所述肝脏疾病、病症或病状是NASH或NAFLD。如本文中所使用，术语“细胞因子”意在具有其在本领域中的一般含义。
在某些方法中，所述平均细胞因子(例如IL-10)血清谷浓度在以下范围内：0.1ng/mL至10ng/mL、0.1ng/mL至5.5ng/mL、0.5ng/mL至10ng/mL、0.5ng/mL至5.5ng/mL、0.75ng/mL至10.0ng/mL、0.75ng/mL至5.5ng/mL、0.9ng/mL至10.0ng/mL、0.9ng/mL至5.5ng/mL、0.9ng/mL至5.1ng/mL、0.9ng/mL至5.0ng/mL、0.9ng/mL至4.5ng/mL、0.9ng/mL至4.0ng/mL、0.9ng/mL至3.5ng/mL、0.9ng/mL至3.0ng/mL、1.0ng/mL至5.1ng/mL、1.0ng/mL至5.0ng/mL、1.0ng/mL至4.5ng/mL、1.0ng/mL至4.0ng/mL、1.0ng/mL至3.5ng/mL或1.0ng/mL至3.0ng/mL。本公开设想了诸多方法，其中将所述细胞因子(例如IL-10药剂)以每日至少两次、每日至少一次、每48小时至少一次、每72小时至少一次、每周至少一次、每2周至少一次、每个月至少一次、每2个月至少一次或每3个月至少一次或以更低频率施用给所述受试者。在本文中所描述的方法的一些实施方案中，在至少90％的所述时间段内、在至少95％的所述时间段内、在至少97％的所述时间段内、在至少99％的所述时间段内或在100％的所述时间段内维持所述平均IL-10血清谷浓度。
本公开设想了诸多实施方案，其中所述IL-10药剂是成熟人IL-10或成熟人IL-10的变体。在诸多具体实施方案中，所述变体表现出了与成熟人IL-10的活性相当的活性。
在一些实施方案中，所述疾病、病症或病状是NASH，并且在其他实施方案中，它是NAFLD。
在一些实施方案中，调节枯氏细胞体内平衡包括增加KC从血清中除去脂蛋白的能力，并且在其他实施方案中包括增加KC的数目以便从血清中除去脂蛋白。
本文中设想了诸多实施方案，其中所述细胞因子(例如IL-10药剂)降低肝脏胆固醇和/或甘油三酯、降低或逆转门静脉周胶原蛋白沉积或增加肝细胞的数目。
一些实施方案还包括施用所述细胞因子(例如IL-10药剂)与至少一种其他预防剂或治疗剂。在本公开的某些实施方案中，所述预防剂或治疗剂是胆固醇体内平衡剂。在一些实施方案中，所述胆固醇体内平衡剂包括他汀类、胆汁酸树脂、依泽替米贝、纤维酸、烟酸或PCSK9抑制剂。所述胆固醇体内平衡剂通常能直接或间接地改善心血管病症。在诸多具体实施方案中，预防剂或治疗剂是可用于预防或治疗动脉粥样硬化的药剂。在其他实施方案中，所述预防剂或治疗剂是抗糖尿病剂或抗肥胖剂，而在其他实施方案中，它是免疫剂或消炎剂。下文阐述了其他示例性预防剂和治疗剂。
本文中描述了本公开的其他实施方案，而技术人员在查阅本公开之后将能预见再其他实施方案。
附图简述
图1A至图1L示出了PEG-rMuIL-10对喂食正常和高脂饮食的野生型和LDLR-/-小鼠的血浆胆固醇水平的调控作用。
图1M至图1N示出了PEG-rHuIL-10对肿瘤学患者的血浆胆固醇水平的影响。
图2A至图2L示出了PEG-rMuIL-10对与肝功能和胆固醇调控相关的基因的表达的影响。
图3A至图3H示出了PEG-rMuIL-10对经过治疗和未经治疗的肝脏组织中的清道夫受体和枯氏细胞数目的影响。
图4A至图4G示出了为了确定与髓系相关的细胞是否负责通过PEG-rMuIL-10来控制血浆胆固醇而进行的评价的结果。
图5A至图5D示出了为了确定肝脏中哪些细胞会响应PEG-rHuIL-10而进行的评价的结果。
图6A至图6F示出了PEG-rHuIL-10增加了单核细胞中的乙酰化LDL(Ac-LDL)和氧化LDL(Ox-LDL)的吸收和枯氏细胞中的LDL更新。
图7A至图7C示出了PEG-rMuIL-10和依泽替米贝对胆固醇降低的相加作用。
图8A至图8I示出了在引入PEG-rMuIL-10的情况下观察到枯氏细胞在减少脂质、胆固醇和甘油三酯积聚方面起了一定作用。
图9A至图9I示出了用PEG-rMuIL-10治疗具有所指出的背景的动物造成了肝细胞增殖。
发明详述
在进一步描述本公开之前，应当理解，本公开不局限于本文中所阐述的具体实施方案，而且还应当理解，本文中所使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而不希望具有限制性。
当提供值的范围时，应当理解，在该范围的上限与下限之间的每个居中值(至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定)以及该所陈述范围内的任何其他所陈述或居中值都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内，并且也包括在本发明内，服从于所陈述范围内的任何特别排除的限值。当所陈述范围包括所述限值中的一个或两个时，排除那些所包括的限值中的一个或两个的范围也包括在本发明中。除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
必须指出，如本文中和所附权利要求中所使用，除非上下文另外明确指定，否则单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数指示物。还要指出的是，可以撰写权利要求来排除任何可选要素。这样，该陈述意在用作结合对权利要求要素的叙述来使用诸如“仅仅”、“仅”等此类排他性术语或使用“否定”限制的前置基础。
本文所讨论的出版物仅仅针对它们在本申请提交日期之前的公开内容而提供。另外，所提供的公布日期可能与实际公布日期不同，这可能需要独立地进行确认。
概述
本公开设想了本文中所描述的药剂和其组合物用于治疗和/或预防各种代谢相关疾病(例如，高胆固醇血症)、病症和病状和/或其症状的用途。
本公开还设想了IL-10药剂(例如，IL-10多肽)和其他细胞因子用于治疗或预防肝脏疾病、病症或病状的用途，其包括施用能调节枯氏细胞体内平衡的IL-10药剂(或其他细胞因子药剂)。在诸多具体实施方案中，所述肝脏疾病、病症或病状是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
在本公开的某些方面，此类治疗或预防是通过利用特定的给药参数来实现。本公开是基于以下发现：存在能实现血清胆固醇的治疗相关降低的最佳平均IL-10(或其他细胞因子)血清谷浓度范围和最佳给药范围。
在本公开的一些实施方案中，以足以实现高于约1ng/mL但低于约10ng/mL的血清谷浓度的量向患有可利用IL-10药剂(或其他细胞因子药剂)治疗的疾病或病症或者处于患有所述疾病或病症的风险下的受试者施用所述IL-10药剂，而在其他实施方案中，所述血清谷浓度高于约2ng/mL但低于约10ng/mL。
在IL-10药剂(例如，PEG-IL-10药剂)的上下文中描述了本文中所阐述的一些实施方案和描述。应当理解，鉴于使用情形，当适当时，对IL-10药剂的叙述可能还更广泛地指细胞因子药剂。
应该指出，结合本公开的多肽和核酸分子对“人”的任何提及并不意味着对获得所述多肽或核酸的方式或来源具有限制性，而是仅参考一下序列，因为其可能对应于天然存在的人多肽或核酸分子的序列。除了人多肽和编码它们的核酸分子以外，本公开还设想了IL-10相关多肽和来自于其他物种的相应核酸分子(以及，在某些情况下，细胞因子多肽和相应核酸分子)。
定义
除非另外指出，否则以下术语意在具有以下所示的含义。在本说明书的其他部分定义了其他术语。
术语“患者”或“受试者”可互换用于指人或非人动物(例如，哺乳动物)。
术语“施用(administration)”、“施用(administer)”等在其应用于例如受试者、细胞、组织、器官或生物体液时是指例如IL-10或PEG-IL-10)、核酸(例如，编码天然人IL-10的核酸)、包含前述各物的药物组合物或诊断剂与所述受试者、细胞、组织、器官或生物体液的接触。在细胞的情形下，施用包括试剂与细胞的接触(例如，体外或离体)以及试剂与体液的接触，其中所述体液与所述细胞接触。
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等是指在疾病、病症或病状或其症状已经被诊断、观察到等后开始以便暂时地或永久地消除、减轻、抑制、缓解或改善折磨受试者的疾病、病症或病状的至少一个潜在诱因，或与折磨受试者的疾病、病症或病状相关的至少一种症状的作用过程(诸如施用IL-10或包含IL-10的药物组合物)。因此，治疗包括抑制(例如，阻滞疾病、病症或病状或与其相关的临床症状的发展或进一步发展)活动性疾病。所述术语还可以用于其他情形下，诸如其中IL-10或PEG-IL-10接触例如体液相或胶体相中的IL-10受体的情形。
如本文中所用的术语“需要治疗”是指由医生或其他照料者作出的受试者需要或将受益于治疗的判断。该判断是基于医生或照料者的专业知识领域中的多种因素而作出。
术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”等是指一般在易患特定疾病、病症或病状的受试者的情形下以暂时地或永久地预防、遏制、抑制或降低受试者发展疾病、病症、病状等的风险(如通过例如不存在临床症状所确定)或延迟其发作的方式(例如，在疾病、病症、病状或其症状发作之前)开始的作用过程(诸如施用IL-10或包含IL-10的药物组合物)。在某些情况下，所述术语还指减缓疾病、病症或病状的进展或抑制其向有害或在其他方面不合需要的状态进展。
如本文中所用，术语“需要预防”是指由医生或其他照料者作出的受试者需要或将受益于预防护理的判断。该判断是基于医生或照料者的专业知识领域中的多种因素而作出。
短语“治疗有效量”是指将药剂单独或作为药物组合物的一部分而且呈单次剂量形式或作为一系列剂量的一部分，以当施用给受试者时能够对疾病、病症或病状的任何症状、方面或特征具有任何可检测的积极作用的量施用给受试者。治疗有效量可以通过测量相关生理效应来确定，并且可以结合给药方案和对受试者病状的诊断分析等加以调节。举例来说，测量施用后产生的炎性细胞因子的量可以指示是否已经使用了治疗有效量。
短语“以足以实现改变的量”意味着在施用特定疗法之前(例如，基线水平)和之后测得的指标水平之间存在可检测的差异。指标包括任何客观参数(例如，IL-10的血清浓度)或主观参数(例如，受试者的健康幸福感)。
术语“小分子”是指具有小于约10kDa、小于约2kDa或小于约1kDa的分子量的化学化合物。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、包含放射性原子的分子以及合成分子。在治疗上，小分子可能更易渗透细胞，不太容易降解，并且与大分子相比不太可能引发免疫应答。
术语“配体”是指例如可以充当受体激动剂或拮抗剂的肽、多肽、膜缔合或膜结合分子或其复合物。“配体”涵盖天然和合成配体，例如，细胞因子、细胞因子变体、类似物、突变蛋白和来源于抗体的结合组合物。“配体”还涵盖小分子，例如，细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。该术语还涵盖既不是激动剂也不是拮抗剂，但可以结合受体而不显著影响其生物学性质(例如信号传导或粘附)的药剂。此外，该术语包括已经例如通过化学或重组方法变成膜结合配体的可溶性形式的膜结合配体。配体或受体可以完全在细胞内，即，其可能驻留在细胞质、细胞核或某些其他细胞内区室中。配体和受体的复合物被称为“配体-受体复合物”。
术语“抑制剂”和“诘抗剂”或“活化剂”和“激动剂”是指是分别例如用于活化例如配体、受体、辅因子、基因、细胞、组织或器官的的抑制或活化分子。抑制剂是能减少、阻断、防止、延迟活化、灭活、脱敏或下调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。活化剂是增加、活化、促进、增强活化、敏化或上调例如基因、蛋白质、配体、受体或细胞的分子。抑制剂还可以定义为降低、阻断或灭活组成活性的分子。“激动剂”是与靶标相互作用以引起或促进靶标活化增加的分子。“拮抗剂”是与激动剂的作用相反的分子。拮抗剂防止、降低、抑制或中和激动剂的活性，并且拮抗剂还可以防止、抑制或降低靶标例如靶受体的组成活性，即使在不存在已鉴定的激动剂的情况下。
术语“调节(modulate)”、“调节(modulation)”等是指分子(例如，活化剂或抑制剂)直接或间接地增强或减弱药剂(例如IL-10药剂)(或编码它们的核酸分子)的功能或活性的能力；或增强分子产生与药剂(例如IL-10药剂)的作用相当作用的能力。术语“调节剂”意在广义上指能够实现上述活性的分子。举例来说，例如，基因、受体、配体或细胞的调节剂是能改变所述基因、受体、配体或细胞的活性的分子，其中可以用其调控性质来活化、抑制或改变活性。调节剂可以单独作用，或其可以使用辅因子，例如，蛋白质、金属离子或小分子。术语“调节剂”包括通过与药剂(例如IL-10药剂)(即，用与其类似的方式调节与药剂(例如IL-10药剂)相同的信号传导途径的药剂)相同的作用机制操作并且能够引发与药剂(例如IL-10药剂)的生物应答相当(或更大)的生物应答的药剂。
调节剂的实例包括小分子化合物和其他生物有机分子。小分子化合物的众多文库(例如，组合文库)可商购，并且可以充当起点以用于鉴定调节剂。技术人员能够开发出一种或多种测定法(例如，生物化学测定法或基于细胞的测定法)，其中可以筛选此类化合物文库以便鉴定一种或多种具有所需性质的化合物；此后，熟练药物化学家能够通过例如合成并评价其类似物和衍生物来优化此类一种或多种化合物。合成和/或分子建模研究也可用于活化剂的鉴定。
分子的“活性”可能描述或是指所述分子与配体或与受体的结合；催化活性；刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力；抗原活性；调节其他分子的活性等。该术语还可能是指在调节或维持细胞与细胞相互作用(例如，粘附)方面的活性，或在维持细胞结构(例如，细胞膜)方面的活性。“活性”还可能意指比活性，例如，[催化活性]/[mg蛋白质]，或[免疫学活性]/[mg蛋白质]，生物区室中的浓度等。术语“增殖活性”涵盖促进例如正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育不良、细胞转化、转移和血管生成，对于正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育不良、细胞转化、转移和血管生成来说是必需的，或与正常细胞分裂以及癌症、肿瘤、发育不良、细胞转化、转移和血管生成特别相关的活性。
如本文中所用，“相当的”、“相当的活性”、“与……相当的活性”、“相当的效果”、“与……相当的效果”等是可以定量和/或定性考虑的相关术语。所述术语的含义往往取决于使用它们的情形。举例来说，都能激活受体的两种药剂从定性角度可以看作具有相当的效果，但如在本领域接受的测定法(例如，剂量-应答测定法)或本领域接受的动物模型中所测定，如果一种药剂仅能够达到另一种药剂的活性的20％，则这两种药剂从定量角度可以视为缺乏相当的效果。当将一个结果与另一个结果(例如，一个结果与参考标准)相比较时，“相当的”往往意指一个结果与参考标准偏差小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于7％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在诸多具体实施方案中，如果一个结果与参考标准偏差小于15％、小于10％或小于5％，则其与参考标准相当。举例来说但不具限制性，所述活性或效果可以指功效、稳定性、溶解性或免疫原性。
术语例如细胞、组织、器官或生物体的“应答”涵盖生物化学或生理学行为，例如浓度、密度、粘附或生物区室内迁移、基因表达速率或分化状态的变化，其中所述变化与活化、刺激或治疗或与诸如基因编程之类的内部机制相关。在某些情况下，术语“激活”、“刺激”等是指如受内部机制以及受外部或环境因素调控的细胞活化；然而术语“抑制”、“下调”等是指相反的作用。
本文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指具有任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括基因编码和非基因编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生化的氨基酸和具有经过修饰的多肽主干的多肽。所述术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源和同源前导序列的融合蛋白；具有或不具有N末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；具有免疫学标签化蛋白质的融合蛋白；等等。
应当理解，贯穿本公开，根据单字母或三字母代码提及氨基酸。为了方便读者，以下提供了单字母和三字母氨基酸代码：
如本文中所用，术语“变体”涵盖天然存在的变体和非天然存在的变体。天然存在的变体包括同系物(在一个物种与另一个物种间分别在氨基酸或核苷酸序列方面有所不同的多肽和核酸)和等位基因变体(在一个物种内的一个个体与另一个个体间分别在氨基酸或核苷酸序列方面有所不同的多肽和核酸)。非天然存在的变体包括分别在氨基酸或核苷酸序列中包含变化的多肽和核酸，其中序列中的所述变化是人工引入的(例如，突变蛋白)；例如，在实验室中通过人干预(“人手动”)来产生所述变化。因此，在本文中，“突变蛋白”广泛地指已突变的重组蛋白质，其通常携带单个或多个氨基酸取代，并且往往来源于已经历定点或随机诱变的克隆基因，或来源于完全合成的基因。
术语“DNA”、“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换用于指具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物的聚合形式。多核苷酸的非限制性实例包括线性和环状核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等等。
如本文中在多肽结构的情形下所使用，“N端(N-terminus)”(或“氨基端”)和“C端(C-terminus)”(或“羧基端”)分别是指多肽的最氨基端和最羧基端，而术语“N末端(N-terminal)”和“C末端(C-terminal)”分别是指多肽氨基酸序列中相对于N端和C端的相对位置，并且分别可以包括所述N端和C端处的残基。“紧邻N末端”或“紧邻C末端”是指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置，其中所述第一氨基酸残基与第二氨基酸残基共价结合以提供连续氨基酸序列。
“来源于”在氨基酸序列或核苷酸序列的情形下(例如，“来源于”IL-10多肽的氨基酸序列)意在指出多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸(例如，天然存在的IL-10多肽或IL-10编码核酸)序列的序列，并且不意在限制产生蛋白质或核酸的来源或方法。举例来说，术语“来源于”包括参考氨基酸或DNA序列的同系物或变体。
在多肽的情形下，术语“分离的”是指目标多肽如果天然存在则存在于与其可能天然存在的环境不同的环境中。“分离的”意在包括基本上针对目标多肽进行富集和/或其中目标多肽被部分或基本上纯化的样品内的多肽。当多肽并非天然存在时，“分离的”表示已经将所述多肽与通过合成或重组手段产生其的环境分离。
“富集”意指样品被非天然操纵(例如，由科学家)，使得目标多肽以a)比诸如生物样品之类的起始样品(例如，所述多肽天然存在于其中或在施用后存在于其中的样品)中的多肽浓度高的浓度(例如，高出至少3倍、高出至少4倍、高出至少8倍、高出至少64倍或更多倍)，或b)比产生所述多肽的环境(例如，如在细菌细胞中)更高的浓度存在。
“基本上纯”表示组分(例如，多肽)构成组合物总含量的超过约50％，且典型地总多肽含量的超过约60％。更典型地，“基本上纯”是指总组成中中至少75％、至少85％、至少90％或更多是目标组分的组合物。在一些情况下，所述多肽将构成组合物总含量的超过约90％或超过约95％。
术语“特异性地结合”或“选择性地结合”当指配体/受体、抗体/抗原或其他结合对时表示决定着蛋白质在蛋白质异质群体和其他生物制品中的存在的结合反应。因此，在指定条件下，规定的配体结合特定受体并且不会大量结合样品中所存在的其他蛋白质。所设想的方法的抗体或来源于抗体的抗原结合位点的结合组合物以比与任何其他抗体或来源于其的结合组合物的亲和力高出至少2倍、高出至少10倍、高出至少20倍或高出至少100倍的亲和力结合其抗原或其变体或突变蛋白。在一个具体实施方案中，如通过例如Scatchard分析(Munsen等,1980Analyt.Biochem.107:220-239)所测定，所述抗体将具有大于约109L/mol的亲和力。
IL-10和PEG-IL-10
抗炎性细胞因子IL-10，也称为人细胞因子合成抑制因子(CSIF)，被分类为2型(类)细胞因子，即包括IL-19、IL-20、IL-22、IL-24(Mda-7)和IL-26、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-δ、IFN-ε、IFN-κ、IFN-Ω和IFN-τ)以及干扰素样分子(限制素、IL-28A、IL-28B和IL-29)的一组细胞因子。
IL-10是在免疫调控和炎症中具有多效性作用的细胞因子。虽然主要表达在巨噬细胞中，但在已活化的T细胞、B细胞、肥大细胞和单核细胞中也已经检测到了IL-10表达。它是由肥大细胞产生，抵消这些细胞在过敏反应位点所具有的炎性作用。尽管IL-10主要响应于toll样受体激动剂而限制促炎性细胞因子的产生和分泌，但是它还对某些T细胞和肥大细胞具有刺激性并且刺激B细胞成熟、增殖和抗体生产。IL-10可以阻断NF-κB活性，并且参与JAK-STAT信号传导途径的调控。它还诱导CD8+T细胞的细胞毒性活性和B细胞的抗体产生，并且它抑制巨噬细胞活性和肿瘤炎性反应。CD8+T细胞的调控具有剂量依赖性，其中剂量越高，诱导的细胞毒性应答越强。
由于其多效性活性，IL-10已经与多种疾病、病症和病状有关联，包括炎性病状、免疫相关病症、纤维化病症、代谢病症(包括胆固醇调控)和癌症。IL-10用于众多此类疾病、病症和病状的临床和临床前评估已经巩固了其治疗潜力。
人IL-10是具有37kDa分子质量的同二聚体，其中每一个18.5kDa单体包括178个氨基酸，其中前18个构成信号肽。每一个单体包括四个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基形成两个分子内二硫键。IL-10二聚体在破坏两个单体亚单元之间的非共价相互作用后变为无生物活性的。获自IL-10的公开晶体结构的数据表明，功能二聚体表现出了与IFN-γ的一定相似性(Zdanov等,(1995)Structure(Lond)3:591-601)。本文中的描述一般是指同二聚体；然而，所讨论的某些方面也可能适用于单体，如将根据上下文显而易见。
本公开的各种实施方案设想了表现出80％同源性的人IL-10(NP_000563)和鼠IL-10(NP_034678)以及其用途。另外，本公开的范围包括来自其他哺乳动物物种的IL-10直系同源物和其经修饰形式，包括大鼠(登录号NP_036986.2；GI 148747382)；牛(登录号NP_776513.1；GI 41386772)；绵羊(登录号NP_001009327.1；GI 57164347)；狗(登录号ABY86619.1；GI 166244598)；和兔(登录号AAC23839.1；GI 3242896)。
如上文所提到，术语“IL-10”、“IL-10多肽”、“IL-10分子”、“IL-10药剂”等意在被广义地理解，并且包括例如人和非人IL-10相关多肽，包括其同系物、变体(包括突变蛋白)和其片段，以及具有例如前导序列(例如，信号肽)的IL-10多肽，以及前述各物的经修饰形式。在其他具体实施方案中，IL-10、IL-10多肽和IL-10药剂是激动剂。
IL-10受体是II型细胞因子受体，由α和β亚单元(分别还被称为Rl和R2)组成。受体活化需要结合α和β。IL-10多肽的一种同二聚体结合α，而同一IL-10多肽的另一种同二聚体结合β。
重组人IL-10的实用性往往因其可能由于例如肾清除率、血流中的蛋白水解降解和单体化所导致的相对较短的血清半衰期而受限制。因此，已经开发了各种方法来改善IL-10的药代动力学概况而不破坏其二聚体结构并且因此不利地影响其活性。IL-10的聚乙二醇化改善了某些药代动力学参数(例如，血清半衰期)和/或增强了活性。
如本文中所用，术语“聚乙二醇化IL-10”和“PEG-IL-10”是指具有与IL-10蛋白质的至少一个氨基酸残基共价附接(一般通过接头，以使得附接稳定)的一个或多个聚乙二醇分子的IL-10分子。术语“单聚乙二醇化IL-10”和“单-PEG-IL-10”表示一个聚乙二醇分子与IL-10二聚体的一个亚单元上的单个氨基酸残基共价附接(一般通过接头)。如本文中所使用，术语“二聚乙二醇化IL-10”和“二-PEG-IL-10”表示至少一个聚乙二醇分子与IL-10二聚体的每一个亚单元上的单个残基附接，一般通过接头。
在某些实施方案中，本公开中所使用的PEG-IL-10是单-PEG-IL-10，其中1至9个PEG分子通过接头与IL-10二聚体的一个亚单元的N端的氨基酸残基的α氨基共价附接。一个IL-10亚单元上的单聚乙二醇化一般会由于亚单元改组而产生非聚乙二醇化、单聚乙二醇化和二聚乙二醇化IL-10的非均质混合物。此外，允许聚乙二醇化反应进行至完成一般将产生非特异性多聚乙二醇化IL-10，因此降低其生物活性。因此，本公开的诸多具体实施方案包括施用由本文中所描述的方法产生的单聚乙二醇化和二聚乙二醇化IL-10的混合物。
在一些实施方案中，可以使用N末端聚乙二醇化化学反应策略，从而在限定的时间段(例如，少于18小时)内以大约99％特异性使N端聚乙二醇化。允许化学反应继续直至超出该时间段将会导致赖氨酸侧链聚乙二醇化增加。实验部分中描述了若干种聚乙二醇化方法。
在诸多具体实施方案中，PEG部分的平均分子量在约5kDa与约50kDa之间。虽然PEG与IL-10附接的方法或位点并不重要，但在某些实施方案中，聚乙二醇化不会改变或仅最低限度地改变IL-10药剂的活性。在某些实施方案中，半衰期的增加超过生物学活性的任何降低。典型地通过评估利用细菌抗原(脂多糖(LPS))攻击并且利用PEG-IL-10治疗的受试者的血清中的炎性细胞因子(例如，TNF-α或IFN-γ)的水平来测量PEG-IL-10的生物学活性，如在美国专利号7,052,686中所描述。
可以在考虑各种目标(包括增加血清半衰期、降低对IL-10的免疫应答、促进纯化或制备、减少IL-10向其单体亚单元转化、提高治疗功效和在治疗使用期间减轻副作用的严重性或发生率)的情况下来制备IL-10变体(未经过例如聚乙二醇化或HAS缀合修饰)。氨基酸序列变体通常是自然界中未发现的预定变体，但有一些可以是翻译后变体，例如糖基化变体。可以使用IL-10的任何变体，条件是其保留合适水平的IL-10活性。如同野生型IL-10，可以如本文中所描述来修饰这些IL-10变体(通过例如聚乙二醇化或Fc融合)。
短语“保守氨基酸取代”是指通过用具有类似酸性、碱性、电荷、极性或侧链尺寸的侧链的氨基酸置换蛋白质中的氨基酸来保留所述蛋白质的活性的取代。保守氨基酸取代一般必需进行以下诸组内的氨基酸残基的取代：1)L、I、M、V、F；2)R、K；3)F、Y、H、W、R；4)G、A、T、S；5)Q、N；和6)D、E。关于取代、插入或缺失的指导可以基于对不同变体蛋白质或来自不同物种的蛋白质的氨基酸序列的比对。因此，除了任何天然存在的IL-10多肽以外，本公开设想了具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，通常不超过20、10或5个氨基酸取代，其中所述取代通常是保守氨基酸取代。
本公开还设想了含有来源于成熟IL-10的连续氨基酸残基的成熟IL-10的活性片段(例如，子序列)。取决于所述子序列所来源的特定天然存在的氨基酸序列，肽或多肽子序列的连续氨基酸残基的长度可以变化。一般来说，肽和多肽可以是约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸酸直至全长肽或多肽。
另外，与参考序列相比，IL-10多肽可以在确定长度的连续氨基酸(例如，“比较窗口”)上具有确定的序列同一性。用于比较的序列比对方法在本领域中是众所周知的。可以例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性搜索法、通过这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Madison，Wis.)或通过手工比对和目测观察(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编,1995年增刊)进行最佳序列比对以用于比较。
作为一个实例，合适的IL-10多肽可以包含与约20个氨基酸至约40个氨基酸、约40个氨基酸至约60个氨基酸、约60个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约120个氨基酸、约120个氨基酸至约140个氨基酸、约140个氨基酸至约150个氨基酸、约150个氨基酸至约155个氨基酸、约155个氨基酸直至全长肽或多肽的连续延伸段具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
如以下进一步讨论，IL-10多肽可以从非天然来源(例如，除其天然存在的环境以外的环境)分离，而且还可以重组产生(例如，在经过基因修饰的宿主细胞中，诸如细菌、酵母、毕赤酵母、昆虫细胞等中)，其中用包含编码所述多肽的核苷酸序列的核酸来修饰所述经过基因修饰的宿主细胞。还可合成产生IL-10多肽(例如，通过无细胞化学合成)。
本公开设想了编码IL-10药剂的核酸分子，包括其天然存在的和非天然存在的同种型、等位基因变体和剪接变体。本公开还涵盖了与天然存在的DNA序列相差一个或多个碱基，但由于遗传密码的简并性而仍然翻译成对应于IL-10多肽的氨基酸序列的核酸序列。
如先前所指出，本公开还设想了基因疗法连同本文中的教授内容一起使用。基因疗法是通过向受试者体内的内源性细胞递送通常包装在载体中的遗传物质，以便引入新颖基因、引入预先存在的基因的额外拷贝、削弱现存基因的功能或修复现存但无功能的基因来实现。一旦在细胞内部后，所述核酸被细胞器表达，从而产生目标蛋白质。在本公开的上下文中，使用基因疗法作为疗法来递送能编码IL-10药剂的核酸，以用于治疗或预防本文中所描述的疾病、病症或病状。
如以上所提到，对于基因疗法用途和方法来说，可以用编码如本文中所阐述的IL-10相关多肽的核酸在体内转化受试者的细胞。替代地，可以用转基因或多核苷酸在体外转化细胞，然后移植至受试者的组织中以便实现治疗。另外，可以用编码IL-10相关多肽的转基因或多核苷酸来转化分离的原代细胞或确立细胞株，然后任选地移植至受试者的组织中。
胆固醇体内平衡
生理学：胆固醇在一系列生理学过程中起着不可或缺的作用，包括细胞膜结构以及类固醇激素、胆汁酸和维生素D的生物合成。胆固醇合成需要复杂的37步方法，所述方法始于以酶HGM-CoA还原酶将3-羟基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)还原成甲羟戊酸。这是胆固醇合成中受到调控、具有速率限制性并且不可逆的步骤，而且是他汀类药物(HMG-CoA还原酶竞争性抑制剂)的作用位点。
肝脏是胆固醇的主要调控者。它不但是大部分循环LDL的前体VLDL的形成位点，它还是绝大多数受体介导的LDL清除发生的位置。
肝脏起初清除从小肠吸收的所有胆固醇。吸收过量胆固醇可能增加肝脏中存储的胆固醇的量，从而导致VLDL分泌(且因此LDL形成)增加和肝脏LDL受体活性下调。平均来说，进入肠中的所有胆固醇中有约一半被吸收。分段吸收速率在个体间差异极大，这可以至少部分地解释为何一些患者对他汀类和其他类别的脂质降低药物不良或完全不应答。参见例如Turley,SD,(2004)Clin.Cardiol.6增刊3:III16-21。肝脏还通过将胆固醇以非酯化形式排泄(通过胆汁)至消化道中而使它再循环。
血脂检查：总胆固醇定义为LDL、HDL和VLDL的总和。一般来说，总血胆固醇水平<200mg/dL被视为正常值，水平在200-239mg/dL之间被视为边界线高值，而水平>240mg/dL被视为高值。
自从1988起，国家胆固醇教育计划(NCEP)已经颁发了确定LDL为胆固醇疗法的主要靶标的指导方针。成人治疗第III版(ATP-III)中所阐述的现行指导方针设定了LDL<100mg/dL(2.6mmol/L)的目标。LDL增高与动脉粥样硬化疾病相关，从而带来冠心病(CHD)相关事件(包括临床CHD、有症状性颈动脉疾病、周边动脉疾病和腹主动脉瘤)的高风险。下文详细描述了与胆固醇水平升高相关的疾病、病症和病状以及其治疗和/或预防。
有相当多的证据表明低水平的高密度胆固醇(HDL-C或仅HDL)是发展动脉粥样硬化和CHD的促成因素。低HDL是早熟性冠状动脉病患者的最常见脂质病症之一。高甘油三酯血症患者通常具有较低的HDL胆固醇。某些药物，包括β-阻断剂、黄体酮和睾丸激素，也能降低HDL水平。
在普通男性中，HDL胆固醇水平在40至50mg/dL的范围内，而在普通女性中，其在50至60mg/dL的范围内。研究已经表明，与最低动脉粥样硬化事件风险相关的HDL中值在男性中是62mg/dL，而在女性中是81mg/dL。关于脂质降低疗法的ATP-III指导方针确定HDL水平低于40mg/dL为主要阳性风险因素且LDL水平≥60mg/dL为阴性风险因素(即，保护性)。总胆固醇与HDL的比率小于5:1被视为是理想的。
甘油三酯在血流中主要由极低密度脂蛋白(VLDL)输送。富甘油三酯颗粒存在相当大的异质性。来源于膳食脂肪乳糜粒的富甘油三酯颗粒本身与CHD不相关，但当非常高(>1,000mg/dL)时可能导致胰脏炎、静脉和动脉血栓、急性心脏病发作和中风。然而，这些乳糜粒颗粒的尺寸被脂蛋白脂肪酶逐渐减小，从而形成导致动脉粥样化的中密度脂蛋白(IDL)。类似地，来自于肝脏的VLDL的尺寸被脂蛋白脂肪酶减小，从而产生导致动脉粥样化的IDL。VLDL预示着冠状动脉病和CHD事件进展，且因此，已经越来越多地被认为是高甘油三酯血症CHD的风险因素。
高甘油三酯水平或是由遗传诱因引起，或是后天性的。就遗传诱因来说，约1/500的人对高血浆甘油三酯具有继承倾向。后天性高甘油三酯最常见与过度酒精摄入、外源雌激素或雌激素激动剂、不良控制的糖尿病、β-阻断剂、皮质类固醇和尿毒症相关。甘油三酯水平超过1,000mg/dL反映了高甘油三酯的后天性诱因叠加遗传诱因。后天性高甘油三酯的不太常见的诱因包括肾衰竭、肾病综合征、蛋白尿、甲状腺功能减退、许多肝脏疾病、青铜色糖尿病、甲状旁腺机能亢进和糖原贮积病。
根据美国心脏学会，低于150mg/dL的甘油三酯水平是正常值；150至199mg/dL的水平是边界线高值；200至499mg/dL的水平是高值；而≥500mg/dL的水平是极高值。一般来说，在150与200mg/dL之间的甘油三酯水平不需要进行药物治疗。
测试：若干种一般方法和系统已经被用于评估受试者的脂质概况。现在存在或后续开发的任何方法或系统都可以结合本公开的教授内容使用。
一般利用比色测定系统的空腹胆固醇测试是测量总血清胆固醇的传统手段。此类测试需要在12小时禁食后抽血以测定脂蛋白概况。通常，仅测量总胆固醇、HDL和甘油三酯；出于成本原因，一般不测量VLDL，而是估计为甘油三酯的五分之一，并且使用使用弗里德瓦尔德公式来估计LDL。虽然此类测试便宜而且广泛可得(例如Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；BioVision,Inc.，Milpitas，CA)，但其需要空腹而且不像其他测试那样敏感，因为LDL是估计的而不是准确测定的。
当评价高胆固醇血症时，它往往可用于测量所有脂蛋白亚级分(VLDL、IDL、LDL和HDL)。因为具体治疗目标是降低LDL(同时维持或增加HDL)，故直接测量LDL水平的胆固醇测试更准确，而且其尤其可用于具有升高的甘油三酯的那些患者。尽管可商购(例如BeckmanCoulter,Inc.；Brea，CA)，但这些直接测量测试的使用有时会由于其成本而受到限制。
枯氏细胞在胆固醇体内平衡中的作用
巨噬细胞通常以功能和位置进行分类；血液单核细胞、肝脏枯氏细胞(肝脏特异性巨噬细胞)、固定组织巨噬细胞和各种树突细胞是其中最流行的巨噬细胞类型。
枯氏细胞(KC)，即构成体内所存在的组织巨噬细胞的80-90％的大固定巨噬细胞，驻留在肝窦状隙的内腔内，并且对进入肝脏的血液携带物质表现出吞噬活性。KC在肝脏结构的生理维护方面起主要作用，并且密切参与肝脏对感染(例如HCV)、毒素(例如酒精和药物)、局部缺血、切除术和其他应力(例如创伤)的应答。
在活化(例如被细菌内毒素)后，KC释放出能调控KC自身的表型以及邻近细胞(诸如肝细胞、星形细胞、内皮细胞和通过肝脏的其他免疫细胞)的表型的多种因子，包括细胞因子、前列腺素类、氧化氮和反应性氧物质。巨噬细胞清道夫受体被表达在KC中，并且此类清道夫受体不仅参与灭菌过程，而且参与脂质代谢。证据表明KC代表了一个具有独特的分化机制、代谢功能和对炎性药剂的应答能力的独特细胞群体。
STAT3。转录因子STAT3(信号转导因子和转录活化因子3)是STAT蛋白质家族的一个成员。响应于细胞因子和生长因子，STAT家族成员被受体相关激酶磷酸化；此后，它们形成同二聚体或异二聚体，所述二聚体移位至细胞核，在其中充当转录活化因此。STAT3在许多细胞过程，包括细胞生长和细胞凋亡中起关键作用。它对于在多种自体免疫疾病中起作用的TH17辅助T细胞的分化是必不可少的。此外，STAT3牵涉脂质代谢的调控。(参见Kinoshita等,Kobe J.Med.Sci.,第54卷,第4期,第E200-E208页,2008)。
STAT3磷酸化响应于多种细胞因子和生长因子而发生，包括某些白介素(例如IL-5、IL-6和IL-10)、白血病抑制因子(LIF)、表皮生长因子(EGF)、某些干扰素、肝细胞生长因子(HGF)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)、细胞因子制瘤素M(OSM)和激素瘦素。IL-6降低小鼠和人类的血清胆固醇，人LIF降低高胆固醇血症兔的血清胆固醇，而OSM降低高胆固醇血症仓鼠的血清胆固醇；相信这种胆固醇降低是通过LDL受体上调而实现。
本公开部分基于以下发现：可以调节(例如增强)KC从血清中除去脂蛋白的能力以便实现理想的代谢效果(例如胆固醇降低)。在诸多具体方面，本公开描绘了鉴定能诱导KC中的STAT3磷酸化，从而增强其从血清中除去脂蛋白的能力的药剂的方法。如本文中所指出，尽管不需要理解KC参与胆固醇降低的潜在作用机制以便实践本公开，但相信能诱导KC中的STAT3磷酸化的药剂能增强KC从血清中清除脂蛋白的能力。在这种情形下，短语“能诱导STAT3磷酸化的药剂”意在泛指直接或间接地、完全或部分地导致磷酸化STAT3增加的任何分子(例如小分子、多肽和抗体)。在诸多具体实施方案中，此类药剂是驱动STAT3磷酸化的因子(例如IL-10、IL-6、LIF和制瘤素M)。
清道夫受体。清道夫受体通过广泛配体特异性和多种受体分子参与除去体内的许多外来物质和废物。它们构成了一组能识别并吸收带负电大分子以及已经通过氧化(oxLDL)或乙酰化(acLDL)而被修饰的LDL的受体。
清道夫受体一般根据其结构特征分类成三个类别—A类、B类和C类。A类清道夫受体(1型清道夫受体(SR-A1)和2型清道夫受体(SR-A2))是优先结合经过修饰的LDL(例如oxLDL和acLDL)而且具有配位体结合必需的胶原蛋白样结构域的三聚体。A类成员包括MSR1(也称为SCARA1)、MARCO(也称为SCARA2)、SCARA3、COLEC12(也称为SCARA4)和SCARA5。
B类清道夫受体被鉴定为已氧化的LDL受体，而且其成员包括CD36和BI类清道夫受体(SR-BI)。B类清道夫受体通常被称为SCARB1(其还与HDL相互作用)；SCARB2；和SCARB3(也称为CD36)，其牵涉凋亡细胞的吞噬和长链脂肪酸的代谢。C类清道夫受体包括可以结合氧化LDL的其他受体，包括CD68、粘蛋白和凝集素样氧化LDL受体1(LOX-1)。
如本文中所描述，清道夫受体对经修饰LDL的吸收过程之后是细胞内降解和/或流出至HLD颗粒上。已经证明IL-10参与吸收和流出过程，并且还可能促进降解过程。
本文中(参见实验部分)尤其针对MSR1、MARCO、SCARB1、SCARB2和CD36评估了清道夫受体功能。当评价IL-10(PEG-rMuIL-10)对与肝功能和胆固醇调控相关的基因的表达的作用时，仅改变两个主要基因群组，其中一组是清道夫受体(参见实施例2和图2)。如图2E至图2H中所表明，在维持正常食物饮食的野生型和LDLR-/-小鼠以及维持高脂食物饮食的野生型和LDLR-/-小鼠中，A型清道夫受体Msr1和Marco被诱导2至7倍。另外，因为清道夫受体主要表达在巨噬细胞型细胞上，所以评价了最常表达在肝组织驻留巨噬细胞上的两种细胞表面蛋白F4/80和CD14的基因表达差异，并且在不同的基因背景和膳食条件下适度诱导这些基因(参见图2E至图2H)。图3A至图3D表明了PEG-rMuIL-10对Msr1的影响(参见实施例3)。这些数据证实了清道夫受体在肝功能和胆固醇调控方面的作用。
PEG-IL-10和其他细胞因子对胆固醇体内平衡和KC功能的影响
IL-10在胆固醇体内平衡中的作用。PEG-IL-10降低血浆胆固醇的程度与受试者的总胆固醇水平有关。这在小鼠和人中都能观察到。如实施例1和图1中所指出，PEG-rMuIL-10仅降低高胆固醇血症小鼠的血浆胆固醇，而PEG-rMuIL-10仅降低具有升高血浆胆固醇水平的患者的血浆胆固醇。为了说明，具有边界线高(～200mg/dL)总胆固醇的癌症患者在每天皮下施用PEG-rHuIL-10后实现了大约40％胆固醇降低，而具有低(～100mg/dL)总胆固醇的患者不受影响。这些数据表明，PEG-IL-10在将从胆固醇降低受益最多的患者群体中更有效。
相信该应答是被IL-10Rα表达水平触发，因为高脂饮食诱导小鼠肝脏中的IL-10Rα上调(数据未示出)。
本公开设想了向将受益于胆固醇降低的受试者施用细胞因子(例如PEG-IL-10)，不考虑其总胆固醇水平。因此，举例来说，在一些实施方案中，将PEG-IL-10施用给具有以下总胆固醇水平的受试者：至少150mg/dL、至少160mg/dL、至少170mg/dL、至少180mg/dL、至少190mg/dL、至少200mg/dL、至少210mg/dL、至少220mg/dL、至少230mg/dL、至少240mg/dL、至少250mg/dL、至少260mg/dL、至少270mg/dL、至少280mg/dL、至少290mg/dL或至少300mg/dL。在其他实施方案中，将PEG-IL-10施用给具有以下总胆固醇水平的受试者：至少325mg/dL、至少350mg/dL、至少375mg/dL、至少400mg/dL、至少425mg/dL、至少450mg/dL、至少475mg/dL或至少500mg/dL。
在诸多具体实施方案中，本文中所公开的IL-10药剂(或其他细胞因子药剂)(例如PEG-IL-10)具有的抗高脂血症活性能够使VLDL水平、IDL水平、LDL水平或其组合降低例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在又其他实施方案中，本文中所公开的IL-10药剂(或其他细胞因子药剂)(例如PEG-IL-10)具有的抗高脂血症活性能够使VLDL水平、IDL水平、LDL水平或其组合降低一定范围，例如约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％或约80％至约100％；约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％或约70％至约90％；约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％或约60％至约80％；约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％或约50％至约70％。
在本公开的另一个实施方案中，本文中所公开的IL-10药剂(或其他细胞因子药剂)(例如PEG-IL-10)使HDL水平增高。在一些其他(通常更常见)实施方案中，HDL水平本身不增高；相反，LDL水平和HDL水平降低，但LDL水平降低程度超过HDL水平降低程度，使得最终LDL对HDL比率的变化与HDL脂质假说一致。在这些实施方案的一个方面，所述IL-10药剂(或其他细胞因子药剂)使HDL水平相对于LDL增高例如至少2％、至少3％、至少10％、至少12％、至少15％、至少17％、至少20％、至少22％、至少25％、至少27％、至少30％、至少32％、至少35％、至少37％、至少40％、至少42％、至少45％或至少47％。在这些实施方案的又其他方面，所述IL-10药剂使HDL水平相对于LDL增高一定范围，例如约2％至约100％；约10％至约50％、约15％至约50％、约20％至约50％、约25％至约50％、约30％至约50％、约35％至约50％或约40％至约50％；约2％至约45％、约10％至约45％、约15％至约45％、约20％至约45％、约25％至约45％、约30％至约45％或约35％至约45％；约2％至约40％、约10％至约40％、约15％至约40％、约20％至约40％、约25％至约40％或约30％至约40％；约2％至约35％、约10％至约35％、约15％至约35％、约20％至约35％或约25％至约35％。
IL-10在KC功能中的作用。如先前所提到，尽管不需要理解IL-10发挥其作用的潜在机制以便实践本公开，但IL-10通过活化肝脏驻留KC以活化骨髓免疫系统，从而显著降低具有高胆固醇的受试者的系统胆固醇水平。
如实验部分中所详述，使用鼠类替代物PEG-rMuIL-10来测定PEG-rHuIL-10对总血浆胆固醇的调控作用。图2A至图2D表明PEG-rMuIL-10减少了参与胆固醇合成的两个基因(Hmgcs1和Hmgcs2)。
向LDLR-/-小鼠施用PEG-rMuIL-10以与KC中的清道夫受体表达增加相称的方式降低了总血浆胆固醇，并且证明KC是响应于PEG-rMuIL-10与LDL清除增加的主要骨髓细胞类型。因为除去了所有吞噬细胞，其中大多数是髓系细胞，从而显著增加了血浆胆固醇，所以吞噬细胞群体在调控血浆胆固醇水平方面起重要作用。
用IL-10和其他细胞因子治疗NAFLD和NASH
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)被视为非酒精性脂肪肝病(NAFLD)范围的一部分，会导致肝脏中的炎症以及脂肪和纤维组织积聚。虽然NASH的确切诱因是未知的，但风险因素包括中心型肥胖、2型糖尿病、胰岛素抗性(IR)和异常血脂症；上述各项的组合通常被描述为代谢综合征。另外，已经某些药物与NASH相关联，包括他莫西芬、乙胺碘呋酮和类固醇(例如强的松和氢化可的松)。在美国，非酒精性脂肪肝病是慢性肝病的最常见诱因，并且NAFLD的估计发病率是20-30％，且NASH的估计发病率是3.5-5％。(参见例如Abrams,G.A.等,Hepatology,2004.40(2):475-83；Moreira,R.K.,Arch Pathol Lab Med,2007.131(11):1728-34)。
NASH往往呈现为无明显症状，从而使其诊断复杂化。肝功能测试一般开始诊断过程，其中NASH个体的AST(天冬氨酸转氨酶)和ALT(丙氨酸转氨酶)水平升高约90％。通常使用其他血液测试来排除其他肝病诱因，诸如肝炎。成像测试(例如超声、CT扫描或MRI)可以揭示肝脏中的脂肪积聚，但往往不能区分NASH与具有类似外观的其他肝病诱因。需要进行肝活组织检查以证实NASH。
受NASH困扰的个体的预后难以预测，但肝活组织检查中的特征可能是有帮助的。NASH的最严重并发症是当肝脏严重疤痕化时发生的硬化。已经报告了NASH个体中有8％至26％发展硬化，并且预测截至2020年，NASH将成为肝脏移植的主要适应症。
目前，NASH治疗主要集中在对与它相关的那些医学病状，包括高脂血症、糖尿病和肥胖进行药物和非药物管理。虽然不能治愈，但NASH本身的药物干预包括用维生素E、吡格列酮、二甲双胍、他汀类、ω-3脂肪酸和熊去氧胆酸(UDCA(熊二醇))进行治疗。所评估的目前批准用于不同的适应症的其他药剂包括洛沙坦和替米沙坦、艾塞那肽、GLP-1激动剂、DPPIV抑制剂和卡马西平。希望组合疗法能为疾病控制提供新机会。
在历史上，已经将枯氏细胞活化与肝病的引发和进展相关联(Kolios,G.等,WorldJ.Gastroenterol,2006.12(46):7413-20)。具体来说，相信枯氏细胞涉及酒精性肝病(ALD)(Eguchi,H.等,Hepatology,1991.13(4):751-57)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)(StienstraR.等,Hepatology,2010.51(2):511-22)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)(Tomita,K.等,Gut,2006.55(3):415-24)。一般来说，认为这些疾病与肝脏胆固醇和甘油三酯在枯氏细胞和肝细胞两者内的不当积聚有关。因此，相信在治疗诸如NASH之类的代谢病症时，缺失KC功能可能具有治疗相关性。(Neyrinck等,Biochem.Biophys.Res.Comm.,385:351-56(2009))。
本公开的教授内容径直与这种看法相反。尽管已经报告了KC活化对优化肝脏再生是必需的(Bilzer,M等,(2006),Liver Int,26:1175-86)，但先前不承认KC在胆固醇和甘油三酯调控方面起不可或缺的作用。本公开的诸多实施方案与以下新颖发现相关：KC功能的诸多方面需要大量吸收血清胆固醇且此后将其除去并且分解代谢。本文中所描述的对胶原蛋白沉积的改变与甘油三酯的去除有关，该去除然后导致促炎性刺激物的去除，从而允许门静脉周损伤和纤维化消退。
如实验部分中所描述，KC清除能力的IL-10(例如PEG-IL-10)活化与肝脏胆固醇和甘油三酯积聚减少相关，且本公开的某些实施方案设想使用PEG-IL-10来诱导所积聚的肝脏甘油三酯和胆固醇的去除。诱导所积聚的肝脏甘油三酯和胆固醇的去除又引起早期肝脏纤维化逆转，并且通过例如增加肝脏中的肝细胞数目而促进肝脏健康恢复。这些数据支持使用IL-10(例如PEG-IL-10)来治疗NAFLD和NASH。因此，本公开的诸多具体实施方案设想了IL-10(包括人和非人IL-10相关多肽，包括同系物、变体(包括突变蛋白)和其片段)在治疗和/或预防NAFLD和NASH中的用途。
另外，其他细胞因子可以实现KC功能缺失，并且可以在治疗诸如NAFLD和NASH之类的肝脏相关病症方面具有治疗相关性。如本文中所使用，术语“细胞因子”意在具有其在本领域中的一般含义。细胞因子参与细胞信号传导，即免疫系统的细胞通过释放和应答细胞因子来与彼此通信。细胞因子涵盖一系列不同的蛋白质，包括白介素、干扰素、趋化因子、淋巴因子和肿瘤坏死因子。它们是由广泛范围的细胞产生，包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、成纤维细胞和内皮细胞。
细胞因子调节基于体液的免疫应答与基于细胞的免疫应答之间的平衡，并且调控特定细胞群体的成熟、生长和应答能力。它们还在宿主对例如感染、免疫应答、炎症和创伤的应答中起着不可或缺的作用。虽然不容易进行确定性分类，但有时将细胞因子分类为白介素、淋巴因子、单核因子、干扰素、集落刺激因子和趋化因子。
在诸多具体实施方案中，本公开设想了细胞因子在治疗和/或预防肝脏相关病症，诸如NAFLD和NASH中的用途。本文中在其他部分描述了适用于一般来说细胞因子药剂且具体来说IL-10药剂的给药方案。
IL-10的产生方法
本公开的多肽可以通过任何合适的方法，包括非重组方法(例如，化学合成)和重组方法来产生。
A.化学合成
在化学合成多肽时，可以通过液相或固相进行合成。固相肽合成(SPPS)允许并入非天然氨基酸和/或肽/蛋白质主干修饰。各种形式的SPPS，诸如9-芴基甲氧羰基(Fmoc)和叔丁氧羰基(Boc)，可用于合成本公开的多肽。化学合成的细节在本领域中是已知的(例如，Ganesan A.(2006)Mini Rev.Med.Chem.6:3-10；和Camarero J.A.等,(2005)Protein PeptLett.12:723-8)。
可以如下文所描述来进行固相肽合成。利用酸不稳定性或碱不稳定性基团来保护α官能团(Να)和任何反应性侧链。保护基团在用于连接酰胺键的条件下是稳定的，但可以被容易地裂解而不损害已经形成的肽链。α氨基官能团的合适的保护基团包括但不限于以下基团：Boc、苄氧羰基(Z)、O-氯苄氧羰基、联苯异丙氧羰基、叔戊氧羰基(Amoc)、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基-苄氧基羰基、邻硝基硫基、2-氰基-叔丁氧基-羰基、Fmoc、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)等等。
合适的侧链保护基团包括但不限于：乙酰基、烯丙基(All)、烯丙氧基羰基(Alloc)、苄基(Bzl)、苄氧基羰基(Z)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧基甲基(Bom)、邻溴苄氧羰基、叔丁基(tBu)、叔丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苄基、2-氯苄氧羰基、2,6-二氯苄基、环己基、环戊基、1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基(Dde)、异丙基、4-甲氧基-2,3-6-三甲基苄基磺酰基(Mtr)、2,3,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)、新戊酰基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、2,4,6-三甲氧基苄基、三甲基甲硅烷基和三苯甲基(Trt)。
在固相合成中，使C末端氨基酸与合适的载体材料偶联。合适的载体材料是对于用于合成过程的逐步缩合和裂解反应的试剂和反应条件呈惰性且不溶解于欲使用的反应介质中的那些材料。可商购的载体材料的实例包括已经用反应性基团和/或聚乙二醇修饰的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；氯甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；羟甲基化或氨甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；等等。当期望制备肽酸时，可以使用以4-苄氧基苄基-醇(Wang锚)或2-氯三苯甲基氯衍生化的聚苯乙烯(1％)-二乙烯基苯或在肽酰胺的情况下，可以使用以5-(4'-氨基甲基)-3',5'-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL锚)或对-(2,4-二甲氧基苯基-氨基甲基)苯氧基基团(Rink酰胺锚)衍生化的聚苯乙烯(1％)二乙烯基苯或
通过在室温或升高温度(例如，在40℃与60℃之间)下且在例如2至72小时的反应时间下利用添加含活化试剂的乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮或类似溶剂来使C末端受到Fmoc保护的氨基酸与载体材料反应来实现与聚合物载体的键联。
受到Nα保护的氨基酸(例如，Fmoc氨基酸)与PAL、Wang或Rink锚的偶联可以例如在存在或不存在1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑的情况下，借助于诸如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)或其他碳二亚胺、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)或其他脲盐、O-酰基-脲、苯并三唑-1-基-三-吡咯烷基-磷六氟磷酸盐(PyBOP)或其他磷盐、N-羟基琥珀酰亚胺、其他N-羟基酰亚胺或肟类之类的偶联试剂，例如借助于TBTU加上HOBt，在添加或不添加诸如例如二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺或N-甲基吗啉之类的碱的情况下，例如，二异丙基乙胺，利用2至72小时的反应时间来进行(例如，3小时，以1.5至3倍过量的氨基酸和偶联试剂，例如，以2倍过量，且在约10℃与50℃之间的温度，例如25℃下，在诸如二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷之类的溶剂，例如，二甲基甲酰胺中)。
还有可能在以上所描述的条件下使用活性酯(例如，五氟苯基、对硝基苯基等等)、Nα-Fmoc-氨基酸的对称酸酐、其酰基氯或酰基氟来代替所述偶联试剂。
可以在添加DIEA且具有10至120分钟，例如20分钟的反应时间的情况下在二氯甲烷中使受到Nα保护的氨基酸(例如，Fmoc氨基酸)与2-氯三苯甲基树脂偶联，但不限于使用该溶剂和该碱。
在肽合成中，典型地在自动化肽合成仪中，根据常规方法对受保护的氨基酸进行连续偶联。在通过利用例如含哌啶(10％至50％)的二甲基甲酰胺处理5至20分钟，例如，利用含50％哌啶的DMF处理2×2分钟和利用含20％哌啶的DMF处理1×15分钟而使固相上的偶联氨基酸的Nα-Fmoc保护基团裂解之后，在诸如二氯甲烷、DMF或两者的混合物之类的惰性非水性极性溶剂中并且在约10℃与50℃之间的温度下，例如在25℃下，使下一个受保护氨基酸以3至10倍过量，例如以10倍过量与先前的氨基酸偶联。用于使第一Nα-Fmoc氨基酸与PAL、Wang或Rink锚偶联的先前提到的试剂适合用作偶联试剂。还可以使用受保护氨基酸的活性酯或其氯化物或氟化物或对称酸酐作为替代物。
在固相合成结束时，使肽从载体材料裂解，同时使侧链保护基团裂解。可以在添加5％-20％V/V的诸如二甲基硫醚、乙基甲基硫醚、茴香硫醚、硫代甲酚、间甲酚、茴香醚乙二硫醇、苯酚或水之类的清除剂，例如15％v/v二甲硫醚/乙二硫醇/间甲酚1:1:1的情况下，在0.5至3小时，例如2小时内，利用三氟乙酸或其他强酸介质进行裂解。通过用冰醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷2:2:6使2-氯三苯甲基锚裂解来获得具有完全受保护的侧链的肽。可以通过在硅胶上色谱来纯化受保护的肽。如果所述肽通过Wang锚与固相连接，并且如果意在获得具有C末端烷基酰胺化的肽，则可以通过利用烷基胺或氟代烷基胺的氨解来进行裂解。在约-10℃与50℃之间的温度(例如，约25℃)下进行氨解，并且反应时间在约12与24小时之间(例如，约18小时)。另外，可以通过再酯化，例如用甲醇使肽从载体裂解。
可以将所获得的酸性溶液与3至20倍量的冷乙醚或正己烷，例如，10倍过量的乙醚混合，以便使所述肽沉淀，并且因此分离出被保留在乙醚中的清除剂和已裂解的保护基团。可以通过使肽从冰醋酸中再沉淀若干次来进行进一步纯化。可以将所获得的沉淀物溶解在水或叔丁醇或这两种溶剂的混合物，例如叔丁醇/水的1:1混合物中，并且冷冻干燥。
可以通过各种色谱方法来纯化所获得的肽，包括在呈乙酸盐形式的弱碱性树脂上进行离子交换；在非衍生化聚苯乙稀/二乙烯基苯共聚物(例如，XAD)上进行疏水性吸附色谱；在硅胶上进行吸附色谱；离子交换色谱，例如，在羧甲基纤维素上；分配色谱，例如，在G-25上；逆流分配色谱；或高压液相色谱(HPLC)，例如，在辛基或十八烷基甲硅烷基二氧化硅(ODS)相上进行反相HPLC。
B.重组产生
描述人和小鼠IL-10的制备的方法可见于例如美国专利号5,231,012中，该专利教授了用于产生具有IL-10活性的蛋白质的方法，包括重组和其他合成技术。IL-10可以具有病毒起源，而且Moore等,(1990)Science 248:1230中公开了来自于EB病毒的病毒IL-10(BCRF1蛋白)的克隆和表达。可以使用本领域中已知的标准技术，诸如本文中所描述的那些技术，以众多方式获得IL-10。重组人IL-10还可商购，例如，从PeproTech,Inc.(RockyHill，N.J.)。
在使用重组技术产生多肽时，可以使用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞(其可以是原核或真核细胞，分别诸如细菌(例如，大肠杆菌)或酵母宿主细胞)将多肽产生为细胞内蛋白质或分泌蛋白质。可以用作宿主细胞的真核细胞的其他实例包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。在使用哺乳动物宿主细胞时，它们可以包括人细胞(例如，HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如，NIH3T3、L细胞和C127细胞)；灵长类动物细胞(例如，Cos 1、Cos 7和CV1)；和仓鼠细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。
可以根据本领域中已知的标准程序，使用多种适合用于表达多肽的宿主-载体系统。参见例如Sambrook等,1989Current Protocols in Molecular Biology Cold SpringHarbor Press,New York；和Ausubel等,1995Current Protocols in Molecular Biology,Wiley and Sons编。用于将遗传物质引入宿主细胞的方法包括例如转化、电穿孔、缀合、磷酸钙方法等等。可以选择转移方法以便提供所引入的多肽编码核酸的稳定表达。所述多肽编码核酸可以呈可遗传附加元件(例如，质粒)的形式提供，或者可以被基因组整合。用于产生目标多肽的多种适当载体可商购。
载体可以提供宿主细胞中的染色体外维持或者可以提供整合至宿主细胞基因组中。表达载体提供转录和翻译调控序列，并且可以提供诱导型或组成型表达，其中在转录起始区以及转录和翻译终止区的转录控制下将编码区可操作地连接。一般来说，转录和翻译调控序列可以包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化子序列。启动子可以是组成型或诱导型的，并且可以是强组成型启动子(例如，T7)。
表达构建体一般具有位于启动子序列附近适宜限制性位点，以提供编码目标蛋白质的核酸序列的插入。表达宿主中可能存在可操作的选择标记物，以有利于选择含有载体的细胞。此外，表达构建体可以包括其他元件。举例来说，表达载体可以具有一个或两个复制系统，因此允许它被维持在生物体中，例如在哺乳动物或昆虫细胞中以供表达和在原核宿主中以供克隆和扩增。另外，表达构建体可以含有选择标记基因，以允许选择已转化的宿主细胞。可选择的基因在本领域中是众所周知的，并且将随所使用的宿主细胞而变化。
可以根据本领域中已知的方法来实现蛋白质的分离和纯化。举例来说，可以通过免疫亲和纯化从经过遗传修饰以组成型地和/或在诱导后表达蛋白质的细胞的溶解物，或者从合成反应混合物中分离蛋白质，所述免疫亲和纯化一般包括使样品与抗蛋白质抗体接触，洗涤以除去非特异性结合的材料，和洗脱特异性结合的蛋白质。可以通过透析和正常情况下用于蛋白质纯化的其他方法进一步纯化分离的蛋白。在一个实施方案中，可以使用金属螯合色谱法分离蛋白质。蛋白质可含有修饰，以促进分离。
可以制备呈基本上纯或已分离形式(例如，不含其他多肽)的多肽。多肽可以存在于相对于可能存在的其他组分(例如，其他多肽或其他宿主细胞组分)来说富含所述多肽的组合物中。举例来说，可以提供经过纯化的多肽，使得所述多肽存在于基本上不含其他表达蛋白质，例如少于约90％、少于约60％、少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％或少于约1％的组合物中。
可以使用本领域中已知的用于操纵不同的IL-10相关核酸以提供能够编码IL-10多肽的构建体的重组技术来产生IL-10多肽。应当了解，当提供特定氨基酸序列时，鉴于普通技术人员在例如分子生物学方面的背景和经验，她将能识别编码此类氨基酸序列的多种不同的核酸分子。
酰胺键取代
在一些情况下，IL-10包括除肽键以外的一个或多个键联，例如，至少两个相邻氨基酸经由除酰胺键以外的键联接合。举例来说，为了减少或消除不希望的蛋白水解或其他降解方式和/或增加血清稳定性和/或限制或增加构象灵活性，可以取代IL-10主干内的一个或多个酰胺键。
在另一个实例中，可以用呈酰胺键联的电子等排体形式的键联，诸如-CH2NH-、-CH2S-、-CH2CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-或-CH2SO-来置换IL-10中的一个或多个酰胺键(-CO-NH-)。还可以利用例如已还原的电子等排体假肽键来置换IL-10中的一个或多个酰胺键联。参见Couder等,(1993)Int.J.Peptide Protein Res.41:181-184。此类置换以及如何实现它们对于本领域中的普通技术人员来说是已知的。
氨基酸取代
可以在IL-10多肽中产生一个或多个氨基酸取代。以下是非限制性实例：
a)取代经过烷基取代的疏水性氨基酸，包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、正亮氨酸、(S)-2-氨基丁酸、(S)-环己基丙氨酸或被脂肪族侧链C1-C10碳取代(包括支链、环状和直链烷基、烯基或炔基取代)的其他简单α-氨基酸；
b)取代经过芳香族取代的疏水性氨基酸，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、硫代酪氨酸、联苯基丙氨酸、1-萘基丙氨酸、2-萘基丙氨酸、2-苯并噻吩基丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、组氨酸，包括以上列出的芳香族氨基酸的经氨基、烷基氨基、二烷基氨基、氮杂、卤代(氟、氯、溴或碘)或烷氧基(C1-C4)取代的形式，其说明性实例为：2-氨基苯丙氨酸、3-氨基苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸、2-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸或4-氯苯丙氨酸、2-甲基苯丙氨酸、3-甲基苯丙氨酸或4-甲基苯丙氨酸、2-甲氧基苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸或4-甲氧基苯丙氨酸、5-氨基色氨酸、5-氯色氨酸、5-甲基色氨酸或5-甲氧基色氨酸、2'-氨基丙氨酸、3'-氨基丙氨酸或4'-氨基丙氨酸、2'-氯丙氨酸、3'-氯丙氨酸或4'-氯丙氨酸、2-联苯基丙氨酸、3-联苯基丙氨酸或4-联苯基丙氨酸、2'-甲基丙氨酸、3'甲基丙氨酸或4'-甲基丙氨酸、2-联苯基丙氨酸、3-联苯基丙氨酸或4-联苯基丙氨酸以及2-吡啶基丙氨酸或3-吡啶基丙氨酸；
c)取代含有碱性侧链的氨基酸，包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、高精氨酸，包括前述氨基酸的经烷基、烯基或芳基取代的(C1-C10支链、线性或环状)衍生物，无论取代基是在杂原子(诸如α氮或者一个或多个远端氮)上还是在α碳上，例如在pro-R位置上。充当说明性实例的化合物包括：Ν-ε-异丙基-赖氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-甘氨酸、3-(4-四氢吡啶基)-丙氨酸、Ν,Ν-γ,γ'-二乙基-高精氨酸。还包括诸如α-甲基-精氨酸、α-甲基-2,3-二氨基丙酸、α-甲基-组氨酸、α-甲基-鸟氨酸之类的化合物，其中烷基占据α-碳的pro-R位置。还包括由烷基、芳香族、杂芳香族(其中杂芳香族基团具有一个或多个单独或组合的氮、氧或硫原子)、羧酸或许多众所周知的活化衍生物(诸如酰氯、活性酯、活性偶氮化物和相关衍生物)以及赖氨酸、鸟氨酸或2,3-二氨基丙酸中的任一种形成的酰胺；
d)取代酸性氨基酸，包括天冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、酪氨酸、2,4-二氨基丙酸、鸟氨酸或赖氨酸的烷基、芳基、芳烷基和杂芳基磺酰胺以及经四唑基取代的烷基氨基酸；
e)取代侧链酰胺残基，包括天冬酰胺、谷氨酰胺，以及天冬酰胺或谷氨酰胺的经烷基或芳香族取代的衍生物；以及
f)取代含羟基的氨基酸，包括丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸、2,3-二氨基丙酸以及丝氨酸或苏氨酸的经烷基或芳香族取代的衍生物。
在一些情况下，IL-10包含一个或多个天然存在的非基因编码的L-氨基酸、合成的L-氨基酸，或氨基酸的D-对映异构体。举例来说，IL-10可以仅包含D-氨基酸。举例来说，IL-10多肽可以包含以下残基中的一个或多个：羟基脯氨酸、β-丙氨酸、邻氨基苯甲酸、间氨基苯甲酸、对氨基苯甲酸、间氨基甲基苯甲酸、2,3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、鸟氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、萘基丙氨酸、吡啶基丙氨酸3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸、4-氟苯基丙氨酸、青霉胺、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸、β-2-噻吩基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2,4-二氨基丁酸、ρ-氨基苯丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、ε-氨基己酸、ω-氨基己酸、ω-氨基庚酸、ω-氨基辛酸、ω-氨基十二烷酸、ω-氨基十四烷酸、环己基丙氨酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、δ-氨基戊酸和2,3-二氨基丁酸。
其他修饰
可以将半胱氨酸残基或半胱氨酸类似物引入IL-10多肽中，以提供通过二硫键与另一个肽的键联，或提供IL-10多肽的环化。引入半胱氨酸或半胱氨酸类似物的方法在本领域中是已知的；参见例如美国专利号8,067,532。
IL-10多肽可以被环化。可以将一个或多个半胱氨酸或半胱氨酸类似物引入IL-10多肽中，其中所引入的半胱氨酸或半胱氨酸类似物可以与第二次引入的半胱氨酸或半胱氨酸类似物形成二硫键。其他环化手段包括引入肟接头或羊毛硫氨酸接头；参见例如美国专利号8,044,175。可以使用和/或引入可以形成环化键的氨基酸(或非氨基酸部分)的任何组合。可以利用具有允许引入桥的官能团的氨基酸的任何组合(或利用氨基酸和-(CH2)n-CO-或-(CH2)n-C6H4-CO-)来产生环化键。一些实例是二硫键、二硫键模拟物诸如-(CH2)n-卡巴桥、硫缩醛、硫醚桥(胱硫醚或羊毛硫氨酸)以及含有酯和醚的桥。在这些实例中，n可以是任何整数，但通常小于10。
其他修饰包括例如N-烷基(或芳基)取代(ψ[CONR])，或用于构建内酰胺和其他环状结构的主干交联。其他衍生物包括C末端羟甲基衍生物、邻位经修饰的衍生物(例如，C末端羟甲基苄基醚)、N末端经修饰的衍生物，包括经取代的酰胺，诸如烷基酰胺和酰肼。
在一些情况下，IL-10多肽中的一个或多个L-氨基酸被一个或多个D-氨基酸置换。
在一些情况下，IL-10多肽是逆反类似物(参见例如Sela和Zisman(1997)FASEBJ.11:449)。逆反肽类似物是其中氨基酸序列的方向被逆转(逆)并且其中一个或多个氨基酸的手性(D-或L-)被颠倒(反)，例如使用D-氨基酸而非L-氨基酸的线性多肽异构体。(参见例如Jameson等,(1994)Nature 368:744；和Brady等,(1994)Nature 368:692)。
IL-10多肽可以包括“蛋白转导结构域”(PTD)，其是指有助于穿过脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、多核苷酸、碳水化合物或者有机或无机分子。与另一个分子附接的PTD有助于所述分子穿过膜，例如从细胞外空间进入细胞内空间，或从细胞溶质进入细胞器内。在一些实施方案中，将PTD共价连接至IL-10多肽的氨基端，而在其他实施方案中，将PTD共价连接至IL-10多肽的羧基端。示例性蛋白转导结构域包括但不限于最小十一肽蛋白转导结构域(对应于包含YGRKKRRQRRR的HIV-1TAT残基47-57；SEQ ID NO://)；包含足以指导进入细胞中的许多精氨酸残基(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或10-50个精氨酸)的聚精氨酸序列；VP22结构域(Zender等,(2002)Cancer Gene Ther.9(6):489-96)；果蝇触角足蛋白转导结构域(Noguchi等,(2003)Diabetes 52(7):1732-1737)；截短人降钙素肽(Trehin等,(2004)Pharm.Research 21:1248-1256)；聚赖氨酸(Wender等,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:13003-13008)；RRQRRTSKLMKR(SEQ ID NO:/)；转运素GWTLNSAGYLLGKI NLKALAALAKKIL(SEQ ID NO:/)；KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALK CEA(SEQ ID NO:/)；和RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:/)。示例性PTD包括但不限于YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:/)、RKKRRQRRR(SEQ I D NO:/)；3个精氨酸残基至50个精氨酸残基的精氨酸均聚物；示例性PTD结构域氨基酸序列包括但不限于以下任一个：YGRKKRRQRRR(S EQ ID NO://)；RKKRRQRR(SEQ ID NO://)；YARAAARQARA(SEQ ID NO://)；THRLPRRRRRR(SEQ ID NO://)；和GGRRARRRRRR(SEQ ID N O://)。
在IL-10多肽C末端的氨基酸的羧基COR3可以呈游离形式(R3＝OH)或呈生理学上可耐受的碱或碱土金属盐(诸如例如钠盐、钾盐或钙盐)的形式存在。羧基还可以用伯醇、仲醇或叔醇，诸如例如甲醇、支链或无支链C1-C6烷基醇，例如，乙醇或叔丁醇进行酯化。羧基还可以用伯胺或仲胺，诸如氨、支链或无支链C1-C6烷基胺或C1-C6二烷基胺，例如甲胺或二甲胺进行酰胺化。
在IL-10多肽N端的氨基酸NR1R2的氨基可以呈游离形式(R1＝H且R2＝H)或呈生理学上可耐受的盐(诸如例如氯化物或乙酸盐)的形式存在。还可以用酸将氨基乙酰化，使得R1＝H且R2＝乙酰基、三氟乙酰基或金刚烷基。氨基可以呈受肽化学反应中通常使用的氨基保护基团(诸如以上所提供的那些，例如Fmoc、苄氧羰基(Z)、Boc和Alloc)保护的形式存在。可以对氨基进行N-烷基化，其中R1和/或R2＝C1-C6烷基或C2-C8烯基或C7-C9芳烷基。烷基残基可以是直链、支链或环状的(分别例如乙基、异丙基和环己基)。
旨在增强和/或模拟IL-10功能的特定修饰
通常有益且有时有必要改善本文中所公开的治疗形态(例如，IL-10)的多种物理性质之一和/或施用它们的方式。物理性质的改善包括例如调节免疫原性；增加水溶解度、生物可利用率、血清半衰期和/或治疗半衰期的方法；和/或调节生物学活性。某些修饰也可用于例如产生用于检测测定的抗体(例如，表位标签)和提供蛋白质纯化的容易性。一般必须在不会不利地影响治疗形态的生物活性和/或增加其免疫原性的情况下赋予此类改善。
IL-10的聚乙二醇化是由本公开所设想的一种特定修饰，而其他修饰包括但不限于糖基化(N-连接和O-连接)；聚唾液酸化；包含血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)、猕猴(cyno)血清白蛋白或牛血清白蛋白(BSA))的白蛋白融合分子；通过例如缀合的脂肪酸链(酰化)结合的白蛋白；和Fc-融合蛋白。
聚乙二醇化：蛋白质治疗剂的临床功效往往因短血浆半衰期和蛋白酶降解易感性而受限制。对各种治疗蛋白(例如，非格司亭)的研究已经表明，此类困难可以通过各种修饰来克服，所述修饰包括将多肽序列缀合或连接至多种非蛋白质聚合物中的任一种，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。这常常通过与蛋白质和非蛋白质聚合物(例如PEG)两者共价结合的连接部分来实现。已经证明此类PEG缀合的生物分子具有临床上有用的性质，包括更好的物理和热稳定性、针对酶促降解易感性的保护、增加的溶解度、更长的体内循环半衰期和降低的清除率、减弱的免疫原性和抗原性以及降低的毒性。
除了聚乙二醇化对药代动力学参数的有益作用以外，聚乙二醇化本身还可以增强活性。举例来说，已经证明PEG-IL-10比未聚乙二醇化的IL-10更有效地对抗某些癌症(参见例如EP 206636A2)。本公开的某些实施方案设想了使用能改善IL-10分子的药代动力学概况而不会导致麻烦的不利作用的相对较小PEG(例如5kDa)；此类PEG-IL-10对于长期使用尤其有效。
适合用于与多肽序列缀合的PEG在室温下一般可溶于水，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护基团，诸如烷基或烷醇基团，且其中n是1至1000的整数。当R是保护基团时，它一般具有1至8个碳。与多肽序列缀合的PEG可以是线性的或分枝的。本公开设想了分枝PEG衍生物、“星形PEG”和多臂PEG。本公开中所使用的PEG的分子量不局限于任何具体范围，并且本文中在其他部分阐述了诸多实例；举例来说，某些实施方案具有在5kDa与20kDa之间的分子量，而其他实施方案具有在4kDa与10kDa之间的分子量。
本公开还设想了缀合物的组合物，其中PEG具有不同的n值，且因此各种不同的PEG以特定的比率存在。举例来说，一些组合物包含n＝1、2、3和4的缀合物的混合物。在一些组合物中，n＝1的缀合物的百分比是18-25％，n＝2的缀合物的百分比是50-66％，n＝3的缀合物的百分比是12-16％，且n＝4的缀合物的百分比是至多5％。通过本领域中已知的反应条件和纯化方法来产生此类组合物。贯穿本说明书描述了示例性反应条件。可以使用阳离子交换色谱来分离缀合物，随后鉴定含有具有例如所期望数目的附接PEG的缀合物、经过纯化而不含未经修饰的蛋白质序列且不含具有其他数目的附接PEG的缀合物的级分。
聚乙二醇化最常发生在多肽N端的α氨基、赖氨酸残基侧链上的ε氨基和组氨酸残基侧链上的咪唑基处。由于大部分重组多肽具有单个α和许多ε氨基以及咪唑基团，因此，取决于接头化学性质，可以产生众多位置异构体。本文中可以应用本领域中已知的一般聚乙二醇化策略。PEG可以通过介导在一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间的键的末端反应性基团(“间隔基”)与本公开的多肽结合。具有可与游离氨基结合的间隔基的PEG包括可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化聚乙二醇琥珀酸酯而制得的N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇。可以与游离氨基结合的另一种已活化聚乙二醇是2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-均三嗪，其可以通过使聚乙二醇单甲醚与氰尿酰氯反应来制备。与游离羧基结合的已活化聚乙二醇包括聚氧化乙烯二胺。
本公开的一个或多个多肽序列与具有间隔基的PEG的缀合可以通过各种常规方法来进行。举例来说，缀合反应可以在4℃至室温的温度下，利用4:1至30:1的试剂与蛋白质摩尔比，在pH 5至10的溶液中进行30分钟至20小时。可以选择反应条件以便将反应导向主要产生所期望程度的取代。一般来说，低温、低pH值(例如，pH＝5)和短反应时间倾向于减少附接PEG的数目，而高温、中性至高pH值(例如，pH≥7)和较长反应时间倾向于增加附接PEG的数目。可以使用本领域中已知的各种手段来终止反应。在一些实施方案中，通过使反应混合物酸化并且在例如-20℃下冷冻来终止反应。在例如美国专利号5,252,714、5,643,575、5,919,455、5,932,462和5,985,263中讨论了各种分子的聚乙二醇化。在例如美国专利号7,052,686中描述了PEG-IL-10。实验部分中阐述了设想用于本文中的特定反应条件。
本公开还设想了PEG模拟物的用途。已经开发了保留PEG属性(例如，延长的血清半衰期)同时赋予若干种其他有利性质的重组PEG模拟物。举例来说，可以重组产生已经与目标肽或蛋白质药物融合(例如，Amunix公司的XTEN技术；Mountain View，CA)的能够形成与PEG类似的延伸构象的简单多肽链(包含例如Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr)。这就避免了制造过程中对额外缀合步骤的需要。此外，已确立的分子生物学技术使得能够控制多肽链的侧链组成，从而允许优化免疫原性和制造性质。
糖基化：出于本公开的目的，“糖基化”意在泛指将聚糖附接至蛋白质、脂质或其他有机分子的酶促过程。术语“糖基化”在结合本公开使用时一般意在意指添加或缺失一个或多个碳水化合物部分(或是通过除去潜在糖基化位点或是通过以化学和/或酶促手段使糖基化缺失)和/或添加天然序列中可能存在或可能不存在的一个或多个糖基化位点。另外，该短语包括天然蛋白质的糖基化的定性变化，包括所存在的各种碳水化合物部分的性质和比例的变化。
糖基化可以显著地影响多肽(诸如IL-10)的物理性质(例如，溶解度)，并且可能在蛋白质稳定性、分泌和亚细胞定位方面也非常重要。已糖基化的多肽还可能表现出增强的稳定性，或可能改善一种或多种药代动力学性质，诸如半衰期。另外，溶解度改善可以例如使得能够产生比包含非糖基化多肽的制剂更适合用于药物施用的制剂。
糖基化位点的添加可以通过改变氨基酸序列来实现。对多肽的改变可以例如通过添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(对于N-连接的糖基化位点)或用所述残基进行取代来进行。N-连接和O-连接的寡糖和每一种类型中发现的糖残基的结构可以是不同的。在两者上常发现的一种糖类型是N-乙酰神经氨酸(在下文中称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接的寡糖的末端残基，并且凭借其负电荷，可以赋予糖蛋白酸性性质。本公开的一个具体实施方案包括N-糖基化变体的产生和用途。
可以任选地通过核酸层级上的改变，特别是通过使编码多肽的核酸在预先选定的碱基处突变以便产生将翻译成所需氨基酸的密码子来改变本公开的多肽序列。
聚唾液酸化：本公开还设想了聚唾液酸化，即多肽与天然存在的可生物降解的α-(2→8)连接的聚唾液酸(“PSA”)缀合用于改善多肽的稳定性和体内药代动力学性质的用途。
白蛋白融合：用于缀合的其他合适的组分和分子包括白蛋白，诸如人血清白蛋白(HSA)、猕猴血清白蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。
根据本公开，可以使白蛋白在羧基端、氨基端、羧基端与氨基端两者以及内部与药物分子(例如，本文中所描述的多肽)缀合(参见例如USP 5,876,969和USP 7,056,701)。
在本公开所设想的HSA-药物分子缀合物中，可以使用各种形式的白蛋白，诸如白蛋白分泌前序列和其变体、其片段和变体以及HSA变体。此类形式一般具有一种或多种所需的白蛋白活性。在其他实施方案中，本公开涉及融合蛋白，其包含直接或间接地与白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等融合的多肽药物分子，其中所述融合蛋白具有比未融合的药物分子更高的血浆稳定性和/或所述融合蛋白保留未融合的药物分子的治疗活性。在一些实施方案中，通过诸如肽接头或其经修饰形式之类的接头来实现间接融合。
如上文所提到，可以例如通过基因操纵来实现白蛋白与本公开的一种或多种多肽融合，以便将编码HSA的核酸或其片段接合至编码所述一种或多种多肽序列的核酸。
替代白蛋白结合策略：已经开发了若干种白蛋白-结合策略作为指导融合的替代方案，并且可以与本文所描述的IL-10药剂一起使用。举例来说，本公开设想了通过缀合的脂肪酸链(酰化)和包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和本文所描述的一种或多种多肽的序列的融合蛋白来进行白蛋白结合。
与其他分子缀合：用于缀合的其他合适的组分和分子包括例如甲状腺球蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；聚氨基酸，诸如聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸)；轮状病毒VP6多肽；流感病毒血凝素；流感病毒核蛋白；钥孔血蓝蛋白(KLH)；以及乙型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或前述各物的任合组合。
因此，本公开设想了一种或多种其他组分或分子在多肽序列N端和/或C端缀合，所述多肽序列为诸如另一种多肽(例如，具有与标的多肽异源的氨基酸序列的多肽)或载体分子。因此，示例性多肽序列可以呈与另一种组分或分子的缀合物的形式来提供。
还可以使IL-10多肽与大型缓慢代谢大分子缀合，所述大分子为诸如蛋白质；多糖，诸如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素或纤维素珠粒；聚合氨基酸，诸如聚谷氨酸或聚赖氨酸；氨基酸共聚物；已灭活的病毒颗粒；已灭活的细菌毒素，诸如来自白喉、破伤风、霍乱的类毒素或白细胞毒素分子；已灭活的细菌；和树突细胞。此类缀合形式在需要时可以用于产生能对抗本公开的多肽的抗体。
用于缀合的其他候选组分和分子包括适合用于分离或纯化的那些。具体非限制性实例包括结合分子，诸如生物素(生物素-亲和素特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素，或包含固体载体，包括例如塑料或聚苯乙烯珠粒、平板或珠粒、磁性珠粒、测试条和膜的分子。
Fc融合分子：在某些实施方案中，可以使本公开的多肽序列的氨基端或羧基端与免疫球蛋白Fc区(例如，人Fc)融合，以形成融合缀合物(或融合分子)。已经证明Fc融合缀合物增加生物药物的系统半衰期，且因此生物药物产品可以需要不太频繁的施用。
Fc结合作为血管内衬的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)，而且在结合后，所述Fc融合分子能免受降解，并且被重新释放至循环中，从而使所述分子在循环中保持更久。相信该Fc结合是内源性IgG借以保持其长血浆半衰期的机制。更近的Fc融合技术将单份生物药物连接至抗体的Fc区以便相较于常规Fc融合缀合物，使所述生物药物的药代动力学和药效学性质得到优化。
其他修饰：本发明设想了目前已知或将要开发的其他IL-10修饰用于改善一种或多种性质的用途。一种此类方法包括通过羟乙基淀粉化来修饰多肽序列，其利用与其他分子连接的羟乙基淀粉衍生物以便修饰所述多肽序列的特征。羟乙基淀粉化的各个方面描述于例如美国专利申请号2007/0134197和2006/0258607中。
本公开还设想了包含小泛素样修饰因子(SUMO)作为融合标签的融合分子(LifeSensors,Inc.；Malvern，PA)。本文中所描述的多肽与SUMO的融合可以输送若干种有益作用，包括增强表达、改善溶解度和/或辅助纯化方法的开发。SUMO蛋白酶识别SUMO的三级结构并且在SUMO的C端使融合蛋白裂解，因此释放本文中所描述的具有所需N末端胺基酸的多肽。
本公开还设想了PASylationTM(XL-Protein有限公司(弗莱辛市，德国))的用途。该技术扩大了目标蛋白质的表观分子大小，而不会：对蛋白质的治疗生物活性具有负面影响；超出肾小球的孔隙大小，从而降低蛋白质的肾清除率。
接头：上文已经描述了接头和其用途。可以任选地通过接头来缀合用于修饰本公开的多肽序列的任何前述组分和分子。合适的接头包括“柔性接头”，其一般具有足以允许经修饰的多肽序列与所连接的组分和分子之间存在一定移动的长度。接头分子一般是约6-50个原子长。接头分子还可以是例如芳基乙酰亚基、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可以容易地选择，并且可以具有任何合适的长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或超过50个氨基酸。
示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如，(GS)n、GSGGSn、GGGSn、(GmSo)n、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n、(GSGGSm)n、(GSGSmG)n和(GGGSm)n及其组合，其中m和和o各自独立地选自至少为1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物以及其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对未被结构化，且因此可以充当组分之间的中性系链。示例性柔性接头包括但不限于：GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG、GGGSG和GSSSG。
治疗和预防用途
本公开设想了本文中所描述的IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)治疗和/或预防与例如高胆固醇血症、异常脂质分布相关或由其引起的疾病、病症或病状和/或其症状以及与胆固醇体内平衡直接或间接相关的其他病症中的用途。尽管在下文中详细描述了具体用途，但应当理解，本公开不受此限制。另外，虽然在下文中讨论了与高胆固醇血症和异常脂质分布相关或由其引起的示例性疾病、病症和病状的具体类别，但应当理解，在一个或多个类别之间经常存在重叠(例如，某些心血管疾病可以具有炎性组分)。
心血管疾病。在诸多具体实施方案中，本公开设想了本文中所描述的IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)用于治疗和/或预防心血管疾病、病症和病状以及由高胆固醇血症和异常脂质分布引起的与其相关的病症的用途。
如本文中所使用，术语“心血管疾病”、“心脏疾病”等是指影响心血管系统的任何疾病，主要是心脏病、脑和肾血管疾病以及外周动脉疾病。心血管疾病是一系列疾病，其包括冠心病(例如，局部缺血性心脏疾病或冠状动脉疾病)、动脉粥样硬化、心肌病、高血压、高血压性心脏病、肺原性心脏病、心律失常、心内膜炎、脑血管疾病和外周动脉疾病。心血管疾病在世界范围内是死亡的首要原因，且尽管它通常影响老年人，但心血管疾病，尤其是动脉粥样硬化的前因始于生命早期。
本公开的诸多具体实施方案涉及本文中所描述的IL-10多肽用于治疗和/或预防动脉粥样硬化，即，因诸如胆固醇和甘油三酯之类的脂肪物质积聚导致形成斑块而使动脉壁增厚的一种慢性病状的用途。如本文中进一步讨论，动脉粥样硬化往往涉及动脉壁的慢性炎性反应，这在很大程度上由巨噬细胞积聚引起且在功能性HDL没有充分除去来自于巨噬细胞的脂肪和胆固醇的情况下由LDL促进。慢性扩张型动脉粥样硬化病变可能造成管腔完全封闭，这可能只有在管腔狭窄严重到致使对下游组织的血液供应不充足，从而导致局部缺血时才表现出来。
本公开特别设想了诸多实施方案，其中心血管疾病包括高脂血症(或高脂蛋白血症)，即，以血液中脂质和/或脂蛋白水平异常升高为特征的病状。高脂血症在由特定基因异常引起时可以被分类为家族性(或原发性)，当由另一种潜伏病症引起时被分类为后天性(或继发性)，或当原因不明时被分类为特发性。高脂血症还可以基于哪种类型的脂质和/或脂蛋白升高来进行分类。高脂血症的非限制性实例包括异常血脂症、高胆固醇血症、高甘油酯血症、高甘油二酯血症、高脂蛋白血症、高乳糜粒血症和混合型高脂血症。高脂蛋白血症包括例如Ia型高脂蛋白血症、Ib型高脂蛋白血症、Ic型高脂蛋白血症、IIa型高脂蛋白血症、IIb型高脂蛋白血症、III型高脂蛋白血症、IV型高脂蛋白血症和V型高脂蛋白血症。
在诸多具体实施方案中，本公开设想了家族性高胆固醇血症(FH)，即以血液中的极高LDL水平为特征的一种遗传性病症的治疗和/或预防。FH与早期心血管疾病相关，因为胆固醇在动脉壁中加速沉积会导致动脉粥样硬化。在某些患者群体中，总胆固醇水平在350-550mg/dL的范围内，而在其他患者群体中，它们在650-1000mg/dL的范围内。在患有FH的肥胖患者中，胆固醇水平可能显著更高。
通过控制血液中的脂质和/或脂蛋白水平来治疗心血管疾病的努力取得了有限的成功。举例来说，虽然施用他汀类降低了一些个体的心血管风险，但这些治疗化合物并不降低甘油三酯水平。在表现出不利高水平甘油三酯的处在心血管风险下的个体中，可以施用贝特类治疗剂的成员。然而，虽然降低了甘油三酯和LDL水平，但贝特类不影响HDL水平。此外，涉及他汀类和贝特类的组合治疗尽管有时有效，但往往导致肌病和横纹肌溶解风险显著增加，且因此只能在非常密切的医学监督下进行。鉴于以上例示的局限性，显然需要用于治疗心血管疾病，包括与高脂质和/或脂蛋白水平相关的那些疾病的的改进药剂。
血栓形成和血栓性病状。在其他实施方案中，本公开设想了本文中所描述的IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)用于治疗和/或预防血栓形成和血栓性疾病、病症和病状以及由高胆固醇血症和异常脂质分布引起的与其相关的病症的用途。血栓形成，即，血管内形成血栓从而导致通过循环系统的血液流动的阻塞，可能由以下一项或多项的异常而引起(魏克氏三联征)：高凝性或血液凝结增加、内皮细胞损伤或血流紊乱(淤滞、紊流)。
血栓形成一般被归类为静脉血栓形成或动脉血栓形成，其各自可以呈现若干种亚型。静脉血栓形成包括深静脉血栓形成(DVT)、门静脉血栓形成、肾静脉血栓形成、颈静脉血栓形成、布加氏综合征、佩-施二氏病和脑静脉窦血栓形成。动脉血栓形成包括中风和心肌梗塞。
炎性病症。当胆固醇和/或LDL被包埋在血管壁中时，可能触发免疫应答，这又会导致慢性炎症。响应于该炎症，血液单核细胞粘附至内皮、迀移至内皮下间隙中，并且向巨噬细胞分化。巨噬细胞又通过经由与LDL受体不同的清道夫受体进行吞噬来吞食胆固醇沉积物和经修饰的LDL。然而，由巨噬细胞介导的适应机制不足以处理病理学状态下所见的不受控制的胆固醇和/或LDL沉积。因此，所述载脂巨噬细胞转变为"泡沫细胞"，通常伴随炎症诱导分子的释放。胆固醇/LDL沉积和血管壁中的伴随泡沫细胞介导的促炎性反应导致动脉粥样硬化病变的发展。因此，载满脂质的巨噬细胞转化成“泡沫细胞”，往往伴随着炎症诱导分子的释放。血管壁中的胆固醇/LDL沉积和伴随的泡沫细胞介导的促炎性反应都导致发展动脉粥样硬化病变。因此，调节脂质或脂蛋白的水平的一个结果是减轻或消除慢性炎症。
本公开包括诸多实施方案，其中本文中所描述的IL-10药剂(例如，PEG-IL-10)被用于治疗和/或预防血管炎。血管炎是表征因白细胞迀移和所造成的损伤而导致的血管壁(包括淋巴管和血管，如静脉(静脉炎)、动脉(动脉炎)和毛细血管)炎症的一组多样化病症。炎症可以影响动脉和/或静脉，无论大小。它可以是局部的或广泛的，其中炎症区域分散在整个特定器官或组织中，或甚至影响体内的不止一个器官系统。血管炎包括但不限于伯格氏病(血栓闭塞性脉管炎)、脑血管炎(中枢神经系统血管炎)、丘-施二氏动脉炎、冷球蛋白血症、原发性冷球蛋白血症血管炎、巨细胞(颞)动脉炎、亨-舍二氏紫癜、过敏性血管炎(变应性血管炎)、川崎病、显微多动脉炎/多血管炎、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛(PMR)、类风湿性血管炎、高安氏动脉炎、血栓性静脉炎、韦格纳氏肉芽肿病；和结缔组织病症，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、复发性多软骨炎、白塞氏病或其他结缔组织病症的继发性血管炎；和病毒感染继发性血管炎。
其他实施方案涉及炎性心脏疾病，其是指以心肌和/或周围组织的炎症为特征的病状。实例包括但不限于心内膜炎、炎性心脏肥大和心肌炎。
纤维化病症：本公开还提供了治疗或预防纤维化疾病、病症和病状的方法。如本文中所使用，短语“纤维化疾病、病症和病状”以及类似术语(例如“纤维化病症”)和短语应当被广泛地理解，以使得它包括可能导致形成纤维化组织或疤痕组织的任何病状(例如一个或多个组织中的纤维化)。举例来说，可能产生疤痕组织的损伤(例如创伤)包括对皮肤、眼睛、肺、肾、肝、中枢神经系统和心血管系统的创伤。该短语还涵盖由中风和组织粘连，例如由于损伤或手术引起的疤痕组织形成。
如本文中所使用，术语“纤维化”是指作为修复性或反应性过程而不是作为器官或组织的正常组成部分的纤维组织形成。纤维化以任何特定组织中的成纤维细胞积聚和胶原蛋白沉积超过正常沉积为特征。
纤维化病症包括但不限于由创伤愈合引起的纤维化、系统和局部硬皮病、动脉粥样硬化、再狭窄、肺部炎症和纤维化、特发性肺纤维化、间质性肺病、肝硬化、由于慢性乙型或丙型肝炎病毒感染所致的纤维化、肾病(例如肾小球性肾炎)、由疤痕组织、瘢痕瘤和肥厚性瘢痕引起的心脏病以及眼病，诸如黄斑变性以及视网膜和玻璃体视网膜病。其他纤维化疾病包括化疗药物诱导的纤维化、辐射诱导的纤维化以及损伤和灼伤。
纤维化病症往往具有肝脏相关性，而且此类病症与肝细胞和枯氏细胞内的肝脏胆固醇和甘油三酯不当积聚之间往往存在一定关系。该积聚似乎引起促炎性反应，从而导致肝脏纤维化和硬化。具有纤维化组分的肝脏病症包括非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。当存在并非由于过度酒精使用导致的脂肪变性(肝脏中的脂肪沉积)时发生NAFLD。它与胰岛素抗性和代谢综合征有关。NASH是NAFLD的最极端形式，并且被认为是未知原因肝脏硬化的主要诱因。
药物组合物
本公开的IL-10多肽可以呈适于施用给受试者的组合物的形式。一般来说，此类组合物是包含IL-10和一种或多种药学上可接受或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的“药物组合物”。在某些实施方案中，IL-10多肽是以治疗可接受的量存在。药物组合物可以用于本公开的方法中；因此，举例来说，可以向受试者离体或体内施用所述药物组合物以实践本文中所描述的治疗和预防方法以及用途。
本公开的药物组合物可以经过配制以便与预期施用方法或途径相容；本文中阐述了示例性施用途径。此外，可以将所述药物组合物与本文中所描述的其他治疗活性剂或化合物组合使用，以便治疗或预防如本公开所设想的疾病、病症和病状。
药物组合物典型地包含治疗有效量的本公开所设想的IL-10多肽以及一种或多种药学上和生理学上可接受的配制剂。合适的药学上可接受或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包括但不限于抗氧化剂(例如，抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如，苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯)、乳化剂、悬浮剂、分散剂、溶剂、填充剂、增积剂、清洁剂、缓冲剂、媒介物、稀释剂和/或佐剂。举例来说，合适的媒介物可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水，可能补充有供肠胃外施用的药物组合物中常用的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其他示例性媒介物。本领域技术人员将能容易地认识可以用于本文中所设想的药物组合物和剂型中的多种缓冲剂。典型缓冲剂包括但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱或其混合物。作为一个实例，缓冲组分可以是水溶性物质，诸如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、醋酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸和其盐。可接受的缓冲剂包括例如Tris缓冲液、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)。
在已经配制药物组合物之后，可以将其作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或者脱水或冻干粉末贮存在无菌小瓶中。可以将此类制剂以即用形式、使用前需要复溶的冻干形式、使用前需要稀释的液体形式或其他可接受的形式贮存。在一些实施方案中，提供在单次使用容器(例如，单次使用小瓶、安瓿、注射器或自动注射器(类似于例如))中的所述药物组合物，而在其他实施方案中提供多次使用容器(例如，多次使用小瓶)。任何药物递送装置都可以被用于递送IL-10，包括植入物(例如，可植入式泵)和导管系统、缓慢注射泵和装置，所有这些对于技术人员都是众所周知的。还可以利用一般经皮下或肌内施用的储库注射在确定的时间段内释放本文中所公开的多肽。储库注射通常基于固体或油，并且一般包含本文中所阐述的制剂组分中的至少一种。本领域普通技术人员熟悉储库注射的可能配方和用途。
所述药物组合物可以呈无菌可注射水性或油性悬浮液的形式。该悬浮液可以根据已知的技术，使用本文中提到的那些合适的分散或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如如在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的稀释剂、溶剂和分散介质包括水、林格氏溶液、等渗氯化钠溶液、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)以及其合适的混合物。另外，通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。此外，诸如油酸之类的脂肪酸得以用于制备注射剂。可以通过包括能延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝或明胶)来实现特定可注射制剂的延长吸收。
含有活性成分的药物组合物可以呈适于口服使用的形式，例如作为片剂、胶囊剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、硬胶囊剂或软胶囊剂或糖浆剂、溶液剂、微珠或酏剂。在诸多具体实施方案中，与本文中所描述的IL-10药剂共同施用的药剂的活性成分呈适于口服使用的形式。意在用于口服使用的药物组合物可以根据本领域中已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且此类组合物可以含有一种或多种药剂，诸如例如甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便提供药学上美观而又可口的制剂。片剂、胶囊剂等含有活性成分与适于制造片剂的无毒药学上可接受的赋形剂的混合物。这些赋形剂可以是例如稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
适于口服施用的片剂、胶囊剂等可能未包衣，或通过已知技术进行包衣以便在胃肠道中延迟崩解和吸收，并且从而提供持续作用。举例来说，可以采用延时物质，诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们还可以利用本领域中已知的技术进行包衣，以形成受控释放型渗透性治疗片剂。其他药剂包括生物可降解或生物相容性颗粒或聚合物质，诸如聚酯、聚胺酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物，以便控制所施用的组合物的递送。举例来说，可以将口服剂包埋在通过凝聚技术或通过界面聚合、通过分别使用羟甲基纤维素或明胶微胶囊剂或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊制备的微胶囊中或胶体药物递送系统中。胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊剂、微球体、微珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用于制备上述制剂的方法对于本领域技术人员来说显而易见。
用于口服使用的制剂还可以作为硬明胶胶囊剂(其中将活性成分与惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙、高岭土或微晶纤维素混合)或作为软明胶胶囊剂(其中将活性成分与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合)来提供。
水性悬浮液含有活性物质与适合于其制造的赋形剂的混合物。此类赋形剂可以是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物(例如，对于十七碳环氧乙烷鲸蜡醇)，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)，或环氧乙烷与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂。
油性悬浮液可以通过使活性成分悬浮在植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中或在矿物油，诸如液体石蜡中来配制。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂(诸如以上所阐述的那些)和调味剂以提供可口的口服制剂。
适于通过添加水来制备水性悬浮液的可分散粉剂和颗粒剂提供了活性成分与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物。本文中例示了合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂。
本公开的药物组合物还可以呈水包油乳剂形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或矿物油，例如液体石蜡，或这些物质的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂和来源于脂肪酸的酯或偏酯；己糖醇酐，例如脱水山梨醇单油酸酯；和偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。
制剂还可以包括保护组合物免于从体内快速降解或消除的载体，诸如受控释放制剂，包括植入物、脂质体、水凝胶、前药和微胶囊化递送系统。举例来说，可以使用单独或与蜡组合的延时物质，诸如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
本公开设想了用于直肠施用的呈栓剂形式的IL-10多肽的施用。可以通过将药物与在常温下为固体但在直肠温度下为液体并且因此将在直肠中融化从而释放药物的合适的无刺激性赋形剂混合来制备栓剂。此类物质包括但不限于可可脂和聚乙二醇。
本公开所设想的IL-10多肽可以呈目前已知的或将来开发的任何其他合适的药物组合物的形式(例如，用于经鼻或吸入使用的喷雾剂)。
制剂中的多肽或其片段的浓度可以广泛地变化(例如，以重量计低于约0.1％，通常是约2％或至少约2％至多达20％至50％以上)并且通常将主要基于体液体积、粘度和基于受试者的因素，根据例如所选择的具体施用模式来选择。
施用途径
本公开设想了以任何适当的方式施用IL-10(例如IL-10多肽)和其组合物。合适的施用途径包括胃肠外(例如，肌内、静脉内、皮下(例如，注射或植入)、腹膜内、脑池内、关节内、腹膜内、脑内(实质内)和脑室内)、口服、经鼻、经阴道、舌下、眼内、经直肠、局部(例如，经皮)、舌下和吸入。还可以利用一般经皮下或肌内施用的储库注射以便在确定的时间段内释放本文中所公开的IL-10多肽。
本公开的诸多具体实施方案设想了肠胃外施用。在一些具体实施方案中，所述肠胃外施用是静脉内施用，而在其他具体实施方案中，所述肠胃外施用是皮下施用。
组合疗法
本公开设想了IL-10(例如，PEG-IL-10)与一种或多种活性治疗剂或其他预防或治疗形态(例如，辐射)组合使用。在此类组合疗法中，各种活性剂往往具有与IL-10不同的作用机制。此类组合疗法可以通过允许一种或多种药剂的剂量减少，从而减轻或消除与一种或多种药剂相关的不利作用而尤其有利；此外，此类组合疗法可能对潜伏疾病、病症或病状具有协同治疗或预防作用。
在诸多具体实施方案中，本公开提供了利用本文中所描述的IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)和至少一种其他治疗剂或诊断剂来治疗和/或预防与胆固醇体内平衡(直接或间接)相关的疾病、病症或病状(包括相关心血管疾病、血栓性和炎性病症)的方法。应该理解，组合疗法不限于治疗和/或预防上述疾病、病症或病状的药剂；例如，设想与IL-10多肽组合使用的药剂可以在治疗或预防其他代谢病症，诸如糖尿病或肥胖方面具有功效。本文中还设想了IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)与改进的饮食和/或锻炼方案组合使用。
如本文中所用，“组合”意在包括可以分开施用，例如分开配制以用于分开施用的疗法(例如，如可以提供于试剂盒中)以及可以在单一制剂中一起施用的疗法(即，“共制剂”)。
在某些实施方案中，相继施用或应用所述IL-10多肽，例如，其中施用一种药剂，随后施用一种或多种其他药剂。在其他实施方案中，同时施用所述IL-10多肽，例如，其中同时或大致同时施用两种或更多种药剂；所述两种或更多种药剂存在于两种或更多种个别制剂中或组合在单一制剂中(即，共制剂)。出于本公开的目的，无论所述两种或更多种药剂是相继施用还是同时施用，它们都被视为组合施用。
在许多情况下可以将本公开的IL-10多肽与至少一种活性剂以任何适当的方式组合使用。在一个实施方案中，在一段时间内维持利用所述至少一种活性剂和本公开的至少一种IL-10多肽(即，同二聚体)的治疗。在另一个实施方案中，减少或中断(例如，当受试者稳定时)利用所述至少一种活性剂的治疗，同时以恒定给药方案维持利用本公开的IL-10多肽的治疗。在另一个实施方案中，减少或中断(例如，当受试者稳定时)利用所述至少一种活性剂的治疗，同时减少(例如，较低剂量、较低给药频率或较短治疗方案)利用本公开的IL-10多肽的治疗。在又另一个实施方案中，减少或中断(例如，当受试者稳定时)利用所述至少一种活性剂的治疗，且增加(例如，较高剂量、更频繁给药或较长治疗方案)利用本公开的IL-10多肽的治疗。在又另一个实施方案中，维持利用所述至少一种活性剂的治疗，并且中断或减少(例如，较低剂量、较低给药频率或较短治疗方案)利用本公开的IL-10多肽的治疗。在又另一个实施方案，中断或减少(例如，较低剂量、较低给药频率或较短治疗方案)利用所述至少一种活性剂的治疗和利用本公开的IL-10多肽的治疗。
尽管下文阐述了适合与本文中所公开的IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)组合使用的特定药剂，但应当理解，本公开并不因此受限制。在下文中，在特定类别的示例性疾病、病症和病状中阐述了某些药剂；然而，应当理解，在一个或多个类别之间经常存在重叠(例如，某些药剂可以兼具心血管和消炎效果)。
胆固醇体内平衡剂。本公开的诸多具体实施方案涉及IL-10多肽与跟胆固醇体内平衡相关的药剂的组合。这些药剂中有许多靶向涉及胆固醇吸收、合成、运输、储存、分解代谢和排泄的不同途径，并且因此对于组合疗法来说是特别有用的候选物。
可用于组合疗法中以用于治疗高胆固醇血症(且因此通常用于例如动脉粥样硬化)的治疗剂的实例包括他汀类(例如，CRESTOR、LESCOL、LIPITOR、MEVACOR、PRAVACOL和ZOCOR)，其抑制胆固醇的酶促合成；胆汁酸树脂(例如，COLESTID、LO-CHOLEST、PREVALITE、QUESTRAN和WELCHOL)，其隔离胆固醇并阻止其吸收；依泽替米贝(ZETIA)，其阻断胆固醇吸收；纤维酸(例如，TRICOR)，其降低甘油三酯并且可以适度增加HDL；烟酸(例如，NIACOR)，其适度降低LDL胆固醇和甘油三酯；和/或上述各物的组合(例如，VYTORIN(依泽替米贝与辛伐他汀))。可作为与本文中所描述的IL-10多肽组合使用的候选物的替代胆固醇治疗包括各种补充剂和草药(例如，大蒜、甘蔗和穆库尔树)。下文进一步讨论了前述治疗剂中的若干个类别。
本公开的诸多具体实施方案包括IL-10药剂与贝特类的组合。贝特类，即，一类两亲性羧酸，可以用作抗高脂血症剂以降低例如甘油三酯和LDL的水平，并且增高HDL的水平。合适的贝特类的实例包括但不限于苯扎贝特、环丙贝特、氯贝特、吉非贝齐和非诺贝特。
本公开的其他具体实施方案包括IL-10药剂与HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类)的组合。HMG-CoA还原酶抑制剂可以通过抑制在肝脏中的胆固醇产生中起重要作用的酶HMG-CoA还原酶来降低LDL和/或胆固醇水平。为了补偿被降低的胆固醇可利用率，增加了肝LDL受体的合成，从而导致LDL颗粒从血液中的清除率增加。合适的他汀类的实例包括但不限于阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。本文中特别设想了IL-10多肽与他汀类的组合。
本公开的再其他具体实施方案包含IL-10药剂与烟酸的组合。烟酸可以通过选择性地抑制肝二酰基甘油酰基转移酶2、减少甘油三酯的合成以及通过受体HM74和HM74A或GPR109A减少VLDL分泌来降低LDL水平。烟酸的非限制性用途是作为抗高血脂症剂用于抑制脂肪组织中的脂肪分解。通过阻断脂肪分解，烟酸使血液中的游离脂肪酸减少，并且作为结果，减少肝脏的VLDL和胆固醇分泌。通过降低VLDL水平，烟酸还可以增高血液中的HDL水平。合适的烟酸的实例包括但不限于阿昔莫司、烟酸、烟酰胺和维生素B3。
本公开的其他具体实施方案包括IL-10药剂与胆汁酸螯合剂的组合。胆汁酸螯合剂(也称为树脂)结合胃肠道中的胆汁的某些组分，从而通过使它们螯合并且防止其从肠道再吸收来破坏胆汁酸的肠肝循环。胆汁酸螯合剂对降低LDL和胆固醇特别有效，并且还可以提高HDL水平。合适的胆汁酸螯合剂的实例包括但不限于考来稀胺、考来维仑和考来替泊。
本公开的其他具体实施方案包含IL-10药剂与胆固醇吸收抑制剂的组合。胆固醇吸收抑制剂减少胆固醇从肠中吸收；这导致细胞表面上的LDL-受体上调并且增加LDL胆固醇摄入这些细胞中，因此降低血浆中的LDL水平。合适的胆固醇吸收抑制剂的实例包括但不限于依泽替米贝、植物甾醇、甾醇和甾烷醇。本文中特别设想了IL-10多肽与依泽替米贝的组合。依泽替米贝选择性地阻断胆固醇吸收并且使血浆LDL水平降低平均18％。当依泽替米贝与较低剂量的他汀类共同施用时，LDL水平存在累加性降低，这与用最大剂量的单独他汀类实现的降低相等。他汀类剂量减少将引起更少的他汀类相关不利作用。
本公开的再其他具体实施方案包含IL-10药剂与脂肪吸收抑制剂的组合。脂肪吸收抑制剂减少从肠中吸收脂肪，从而减少热量摄入。在一个方面，脂肪吸收抑制剂抑制胰脂肪酶，一种在肠中分解甘油三酯的酶。合适的脂肪吸收抑制剂的实例包括但不限于奥利司他。
在再其他具体实施方案中，本公开设想了本文中所描述的PEG-IL-10药剂与PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型)调节剂的组合的用途。PCSK9在胆固醇体内平衡中起着重要调控作用。其是主要在肝、肠和肾中表达的丝氨酸蛋白酶。所编码的蛋白质被合成为在内质网中经历自催化分子内处理的可溶性酶原。
作为胆固醇体内平衡过程的一部分，当LDL胆固醇结合肝细胞表面上的LDL受体(LDLR)并且被此类细胞吸收时，其被从血液中除去。PCSK9通过结合LDLR和诱导受体降解，从而防止LDLR再循环至细胞表面以除去更多LDL胆固醇，最终导致其代谢减少来发挥作用。阻止PCSK9结合LDLR允许受体返回至细胞表面并且除去更多的胆固醇。
已经证明PCSK9功能抑制剂以可接受的不利作用概况引起比传统可商购药剂强得多的胆固醇降低。本公开设想了PEG-IL-10与对PCSK9具有直接或间接抑制作用的任何调节剂的用途。正在开发结合PCSK9并干扰其与LDLR相互作用的若干种单克隆抗体(例如，Amgen(AMG145)、Merck(1D05-IgG2)和Aventis/Regeneron(SAR236553/REGN727))。另外，正在开发能模拟LDLR中可结合PCSK9的EGFA结构域的肽，并且已经证明通过施用PCSK9反义寡核苷酸(ISIS Pharmaceuticals)引起的基因沉默能增加小鼠的LDLR表达并且降低循环总胆固醇水平。设想与本文中所描述的PEG-IL-10药剂一起用于组合疗法的其他PCSK9功能调节剂是通过RNA干扰(RNAi)起作用的那些(Alnylam Pharmaceuticals)和呈锁核酸(LNA，也称为不可及RNA)形式的那些(Santaris Pharma)。
本公开涵盖了药学上可接受的盐、酸或上述任一种的衍生物。
免疫和炎性病状。本公开提供了用IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)和至少一种具有免疫相关和/或炎性相关性质的其他药剂来治疗和/或预防免疫相关和/或炎性相关疾病、病症和病状以及与其相关的病症的方法。举例来说，可以将IL-10多肽与在具有炎性组分的心血管病症中具有功效的药剂一起施用。
用于组合疗法的治疗剂的实例包括但不限于非甾醇类消炎药(NSAID)。NSAID，即一大组的具有止痛、消炎和抗发热性质的治疗化合物，能通过阻断环加氧酶来减轻炎症。此类药剂的实例包括：布洛芬和其他丙酸衍生物(阿明洛芬、苯恶洛芬、布氯酸、卡洛芬、芬布芬、非诺洛芬、氟洛芬、氟比洛芬、吲哚洛芬、酮洛芬、咪洛芬、萘普生、奥沙普秦、吡洛芬、普拉洛芬、舒洛芬、噻洛芬酸和硫恶洛芬)；乙酸衍生物(吲哚美辛、阿西美辛、阿氯芬酸、环氯茚酸、双氯芬酸、芬氯酸、芬克洛酸、芬替酸、弗洛芬那、异丁芬酸、伊索克酸、奥品酸、舒林酸、硫平酸、托美丁、齐多美辛和佐美酸)；芬那酸衍生物(氟芬那酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟酸和托芬那酸)；联苯羧酸衍生物(二氟尼柳和氟苯柳)；昔康(伊索昔康、吡罗昔康、舒多昔康和替诺昔康)；水杨酸盐(乙酰水杨酸、柳氮磺吡啶)；和吡唑啉酮(阿扎丙宗、贝比派瑞(bezpiperylon)、非普拉宗、莫非布宗、羟布宗、保泰松)。
其他组合包括选择性环加氧酶-2(COX-2)抑制剂、选择性环加氧酶1(COX1)抑制剂和非选择性环加氧酶(COX)抑制剂。本公开的诸多具体实施方案设想了本文中所描述的IL-10多肽(例如，PEG-IL-10)与合适的选择性COX-2抑制剂(诸如塞来考昔、依托考昔、非罗考昔、罗美昔布、美洛昔康、帕瑞昔布、罗非昔布和伐地考昔)的组合。
用于组合的其他活性剂包括类固醇，诸如泼尼松龙、泼尼松、甲泼尼龙、倍他米松、地塞米松或氢化可的松。此类组合可能尤其有利，因为当与本发明IL-10多肽组合治疗患者时，可以通过减少所需的类固醇剂量来减轻或甚至消除类固醇的一种或多种副作用。
组合用于治疗例如类风湿性关节炎的活性剂的其他实例包括细胞因子抑制性消炎药(CSAID)；针对其他人细胞因子或生长因子(例如TNF、LT、IL-1β.、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF或PDGF)的抗体或拮抗剂。
活性剂的特定组合可以在自身免疫和后续炎性级联中的不同点处进行干扰，而且包括TNF拮抗剂，如嵌合TNF抗体、人源化TNF抗体或人TNF抗体、REMICADE、抗TNF抗体片段(例如，CDP870)和可溶性p55或p75TNF受体、其衍生物、p75TNFRIgG(ENBREL.)或p55TNFR1gG(LENERCEPT)、可溶性IL-13受体(sIL-13)以及还有TNFα转化酶(TACE)抑制剂；类似地，IL-1抑制剂(例如，白介素1转化酶抑制剂)可能有效。其他组合包括白介素11、抗P7s和p-选择素糖蛋白配体(PSGL)。可用于与本文中所描述的IL-10多肽组合的药剂的其他实例包括干扰素-β1a(AVONEX)；干扰素-β1b(BETASERON)；醋酸格拉替雷(copaxone)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉屈滨；和针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂(例如，针对CD40配体和CD80的抗体)。
本公开涵盖药学上可接受的盐、酸或以上任一种的衍生物。
抗糖尿病剂和抗肥胖剂。需要对胆固醇相关病症进行药物治疗的一些患者还在服用抗糖尿病剂和/或抗肥胖剂。本公开所设想的组合疗法利用许多抗糖尿病剂(和其类别)，包括：1)胰岛素、胰岛素模拟物和能刺激胰岛素分泌的药剂，包括磺酰脲类(例如，氯磺丙脲、妥拉磺脲、醋磺己脲、甲苯磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列吡嗪)和氯茴苯酸类(例如，瑞格列奈(PRANDIN)和那格列奈(STARLIX))；2)双胍类(例如，二甲双胍(GLUCOPHAGE))和通过促进葡萄糖利用、减少肝葡萄糖产生和/或减少肠道葡萄糖输出而起作用的其他药剂；3)α-葡糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖和米格列醇)和能减缓糖类消化和因此减缓从肠中吸收并且降低餐后高血糖症的其他药剂；4)能增强胰岛素作用(例如，通过胰岛素致敏)，因此促进外周组织中的葡萄糖利用的噻唑烷二酮类(例如，罗格列酮(AVANDIA)、曲格列酮(REZULIN)、吡格列酮(ACTOS)、格列吡嗪，巴格列酮、利格列酮、萘格列酮、曲格列酮、恩格列酮、环格列酮、阿格列酮、达格列酮；5)升糖素样肽，包括DPP-IV抑制剂(例如，维格列汀(GALVUS)和西他列汀(JANUVIA)和升糖素样肽-1(GLP-1)和GLP-1激动剂和类似物(例如，艾塞那肽(BYETTA))；和6)抗DPP-IV类似物(肠促胰岛素模拟物)、PPARγ激动剂、双重作用PPAR激动剂、泛作用PPAR激动剂、PTP1B抑制剂、SGLT抑制剂、胰岛素促分泌素、糖原合成酶激酶-3抑制剂、免疫调节剂、β-3肾上腺素能受体激动剂、11β-HSD1抑制剂和胰淀素类似物。在再其他实施方案中，将本文中所描述的IL-10药剂与一种或多种合适的核受体结合剂(例如，视黄酸受体(RAR)结合剂、视黄醇X受体(RXR)结合剂、肝X受体(LXR)结合剂和维生素D结合剂)组合使用。
此外，本公开设想了利用有助于体重减轻的药剂和方法，诸如能刺激代谢或减弱食欲的药剂以及有助于体重减轻的已改进饮食和/或锻炼方案的组合疗法。
本公开涵盖药学上可接受的盐、酸或以上任一种的衍生物。
给药
可以向受试者施用一定量的本公开的IL-10多肽，这取决于例如施用目标(例如，所期望的消退程度)；受试者的年龄、体重、性别以及健康和身体状况；施用途径；和疾病、病症、病状或其症状的性质。给药方案还可以考虑与所施用的药剂相关的任何不利作用的存在、性质和程度。还可以根据例如安全性和剂量递增试验、体内研究(例如，动物模型)和技术人员已知的其他方法容易地确定有效给药量和给药方案。
一般来说，给药参数决定了给药量小于可能对受试者产生不可逆的毒性的量(即，最大耐受剂量，“MTD”)，并且不小于对受试者产生可测量的效果所需的量。考虑施用途径和其他因素，由例如与ADME相关的药代动力学参数和药效学参数来确定此类量。
有效剂量(ED)是在一部分服用其的受试者中产生治疗反应或所期望的效果的药剂剂量或量。药剂的“中值有效剂量”或ED50是在50％的施用它的群体中产生治疗反应或所期望的效果的药剂剂量或量。虽然ED50通常用作药剂效果的合理预期量度，但其未必是临床医师通过考虑所有相关因素可能认为合适的剂量。因此，在一些情况下，有效量高于计算的ED50，在其他情况下，有效量低于计算的ED50，而在其他情况下，有效量与计算的ED50相同。
另外，本公开的IL-10多肽的有效剂量可以是当以一个或多个剂量施用给受试者时能相对于健康受试者产生所期望的结果的量。举例来说，对于经历特定病症的受试者来说，有效剂量可以是使该病症的诊断参数、量度、标记物等改善至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或超过90％的剂量，其中100％被定义为正常受试者所表现出的诊断参数、量度、标记物等。
当IL-10多肽是PEG-IL-10时，治疗本文中所描述的疾病、病症或病状所必需的PEG-IL-10的量是基于缀合蛋白的IL-10活性，如以上所指出，这可以通过本领域中已知的IL-10活性测定法来测定。举例来说，在肿瘤情况下，合适的IL-10活性包括例如向肿瘤位点中的CD8+T细胞浸润、来自这些浸润细胞的炎性细胞因子(诸如IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10和RANK-L)的表达以及生物样品中TNF-α或IFN-γ的水平增高。
如同需要药物，静脉内IL-10施用与双区室动力学模型相关(参见Rachmawati,H.等,(2004)Pharm.Res.21(11):2072-78)。血浆药物浓度以多指数方式衰减。静脉内施用之后，药物立即快速分布至整个初始空间(最低限度地定义为血浆容量)，然后缓慢平衡分布至血管外空间(例如，某些组织)。还已经研究了皮下重组hIL-10的药代动力学(Radwanski,E.等,(1998)Pharm.Res.15(12):1895-1901)。当评价适当的IL-10给药相关参数时，分布容量和其他药代动力学考虑因素是适当的。此外，可以证明IL-10药代动力学和给药原则杠杆对于使IL-10药剂靶向特定细胞类型的工作所取得的成就来说是无价的(参见例如Rachmawati,H.(May 2007)Drug Met.Dist.35(5):814-21)。
本公开设想了施用能产生所期望的治疗结果的任何剂量和给药方案。举例来说但不具限制性，当受试者是人时，可以按超过0.5μg/kg/天、超过1.0μg/kg/天、超过2.5μg/kg/天、超过5μg/kg/天、超过7.5μg/kg、超过10.0μg/kg、超过12.5μg/kg、超过15μg/kg/天、超过17.5μg/kg/天、超过20μg/kg/天、超过22.5μg/kg/天、超过25μg/kg/天、超过30μg/kg/天或超过35μg/kg/天的剂量来施用非聚乙二醇化hIL-10。另外，举例来说但不具限制性，当受试者是人时，可以按超过0.5μg/kg/天、超过0.75μg/kg/天、超过1.0μg/kg/天、超过1.25μg/kg/天、超过1.5μg/kg/天、超过1.75μg/kg/天、超过2.0μg/kg/天、超过2.25μg/kg/天、超过2.5μg/kg/天、超过2.75μg/kg/天、超过3.0μg/kg/天、超过3.25μg/kg/天、超过3.5μg/kg/天、超过3.75μg/kg/天、超过4.0μg/kg/天、超过4.25μg/kg/天、超过4.5μg/kg/天、超过4.75μg/kg/天或超过5.0μg/kg/天的剂量来施用包含相对较小的PEG(例如5kDa单PEG-hIL-10、二PEG-hIL-10)的聚乙二醇化hIL-10。
治疗有效量的PEG-IL-10可以在约0.01至约100μg蛋白质/kg体重/天、约0.1至20μg蛋白质/kg体重/天、约0.5至10μg蛋白质/kg体重/天或约1至4μg蛋白质/kg体重/天的范围内。在一些实施方案中，通过连续输注以递送约50至800μg蛋白质/kg体重/天来施用PEG-IL-10(例如，约1至16μg蛋白质/kg体重/天的PEG-IL-10)。可以基于例如对不利作用和血细胞计数的评估而改变输注速率。
对于口服药剂的施用来说，所述组合物可以呈含有1.0至1000毫克活性成分，特别是1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0和1000.0毫克的活性成分的片剂、胶囊剂等形式提供。
在某些实施方案中，将所公开的IL-10多肽(例如PEG-IL-10)的剂量包含在“单位剂型”中。短语“单位剂型”是指物理离散单元，每一个单元含有单独或在与一种或多种其他药剂组合时足以产生所期望的效果的预定量的本公开IL-10多肽。应当理解，单位剂型的参数将取决于具体药剂和要实现的效果。
试剂盒
本公开还设想了包含IL-10多肽(例如PEG-IL-10)和其药物组合物的试剂盒。所述试剂盒一般呈容纳各种组分的物理结构的形式，如以下所描述，并且可以用于例如实践以上所描述的方法(例如，向需要恢复胆固醇体内平衡的受试者施用IL-10多肽)。
试剂盒可以包括本文中所公开的一种或多种IL-10多肽(提供在例如无菌容器中)，其可以呈适于施用给受试者的药物组合物形式。IL-10多肽可以呈容易使用的形式或呈在施用前需要例如复溶或稀释的形式提供。当IL-10多肽呈需要由使用者复溶的形式时，所述试剂盒还可以包括与IL-10多肽一起或分开包装的缓冲剂、药学上可接受的赋形剂等。当设想组合疗法时，所述试剂盒可以分开地含有若干种药剂，或它们可能已经被组合在试剂盒中。可以将试剂盒的每一种组分封装在个别容器内，并且所有不同的容器都可以在单个包装内。本公开的试剂盒可以被设计用于适当地维持容纳在其中的组分所必需的条件(例如，冷藏或冷冻)。
试剂盒可以含有标签或包装插页，包括其中的组分的标识信息和其使用说明书(例如，给药参数、活性成分的临床药理学(包括作用机制、药代动力学和药效学)、不利作用、禁忌症等)。标签或插页可以包括制造商信息，诸如批次号和有效期。标签或包装插页可以被例如整合至容纳诸多组分的物理结构中，单独地包含在所述物理结构内，或贴附至试剂盒的组件(例如，安瓿、管或小瓶)。
标签或插页还可以另外包括或被并入计算机可读介质，诸如磁盘(例如，硬盘、卡、内存盘)、光盘(诸如CD-或DVD-ROM/RAM)、DVD、MP3、磁带或电存储介质(诸如RAM和ROM)或这些的混合形式(诸如磁性/光学存储介质)、FLASH介质或内存型卡中。在一些实施方案中，实际说明书不存在于试剂盒中，但提供了用于例如通过网络从远程来源，例如通过互联网获得说明书的手段。
实验
提出以下实施例以便给本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开内容和描述，而不意在限制诸位发明人所认为的其发明范围，它们也不意在表示以下实验已经进行而且是可以进行的全部实验。应当理解，以现在时书写的示例性描述未必已经进行，而是可能进行所述描述以生成本文中所描述的数据等。已经努力确保关于所用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应当考虑一些实验误差和偏差。
除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度以摄氏度(℃)计，并且压力等于或接近大气压。使用标准缩写，包括以下缩写：bp＝碱基对；kb＝千碱基；pl＝皮升；s或sec＝秒；min＝分钟；h或hr＝小时；aa＝氨基酸；kb＝千碱基；nt＝核苷酸；pg＝皮克；ng＝纳克；μg＝微克；mg＝毫克；g＝克；kg＝千克；dl或dL＝分升；μl或μL＝微升；ml或mL＝毫升；l或L＝升；μΜ＝微摩尔；mM＝毫摩尔；M＝摩尔；kDa＝千道尔顿；i.m.＝肌内；i.p.＝腹膜内；SC或SQ＝皮下；QD＝每日一次；BID＝每日两次；QW＝每周一次；QM＝每月一次；wt＝野生型；HPLC＝高效液相色谱；BW＝体重；U＝单位；ns＝不具统计学显著性；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；PCR＝聚合酶链式反应；NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺；Cl＝氯膦酸盐；HSA＝人血清白蛋白；MSA＝小鼠血清白蛋白；IHC＝免疫组织化学；DMEM＝达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基；GC＝基因组拷贝；EDTA＝乙二胺四乙酸；PCSK9＝前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型；CYP7A1＝细胞色素P450 7A1，胆固醇7α-羟化酶或胆固醇7-α-单加氧酶；ABCG1＝ATP结合盒亚家族G成员1；MSR1＝巨噬细胞清道夫受体1。
材料和方法
以下一般材料和方法可以用于指定情况下，或可以用于以下实施例中：
科学文献中描述了分子生物学中的标准方法(参见例如Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.；和Ausubel等(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第1-4卷,John Wiley and Sons,Inc.New York,N.Y.，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷))。
所述科学文献描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱、电泳、离心和结晶，以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白质的产生以及蛋白质的糖基化(参见例如Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science,第1-2卷,John Wileyand Sons,Inc.,NY)。
描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(例如，Harlow和Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)；可利用用于表征配体/受体相互作用的标准技术(参见例如Coligan等(2001)CurrentProtocols in Immunology,第4卷,John Wiley,Inc.,NY)；可利用用于流式细胞术，包括荧光激活细胞分选(FACS)的方法(参见例如Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,JohnWiley and Sons,Hoboken,NJ)；并且可利用适合于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体以用作例如诊断试剂的荧光试剂(Molecular Probes(2003)Catalogue,MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR.；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO.)。
可利用用于确定例如抗原片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库(参见例如GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.，SanDiego，CA)；和DeCypherTM(TimeLogic Corp.，Crystal Bay，NV))。
可以通过基于参考样品中的基因表达来计算样品中的基因表达变化的相对定量来确定经过校正的mRNA单元。
小鼠：LDLR-/-小鼠是获自The Jackson Lab(Bar Harbor，ME)。LDLR-/-小鼠具有200-400mg/dl的升高血清胆固醇水平，并且当喂食高脂膳食时，其胆固醇水平平均是～1,500mg/dL。小鼠的正常血清胆固醇是80-100mg/dl。
血清IL-10浓度：对于本文中所描述的实验来说，通过在MDS平台上针对mIL-10进行电化学发光测定法来测定血清样品中的测试物质浓度。使用LCB-33AEY(ARMO)抗MIL-10作为俘获抗体，并且使用生物素化抗MIL-10(R&D)作为检测抗体。用195,000pg-9pg的上限和下限来建立PEG-rMuIL-10标准曲线。在室温下将诸板培育2小时，并且在洗涤之后，在MSD2400平台上通过SulfoTag程序进行检测。
替代地，可以通过本领域中所使用的其他标准方法来测定血清IL-10浓度水平和暴露水平。举例来说，可以通过从小鼠尾部剪切口将全血(～50μl/小鼠)收集至扁平毛细管中，通过离心分离血清和血细胞，并且通过标准ELISA试剂盒和技术测定IL-10暴露水平来进行血清暴露水平测定。
血清和组织胆固醇定量：
方法第1号：在1:300稀释度下分析血清。用研杵(VWR)在200μL水中将小鼠肝脏碾碎。将二十五微升等分试样用于使用胆固醇/胆固醇基测定试剂盒(BioVision)根据制造商的说明书来提取胆固醇/胆固醇基酯，并且用Spectra Max 340PC(Molecular Devices)进行测量。使用DNeasy试剂盒(QIAGEN)从相等量的样品中提取基因组DNA，并且用NanoVuePlus(GE Healthcare)进行测量，以便校正胆固醇/胆固醇基测量值。
方法第2号：在Beckman Coulter AU系统上通过使用双试剂均质系统的LDL-胆固醇测试进行血清LDL-C或HDL-C定量。所述测定由两个不同的阶段组成。在第1阶段中，独特的清洁剂从非LDL脂蛋白或非HDL颗粒中溶解出胆固醇，取决于所期望的测定输出。该胆固醇被胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物和4-氨基安替比林(LDL-C)或DSBmT(HDL-C)消耗，从而产生无色最终产物。在第2阶段中，R2试剂中的第二清洁剂从剩余的脂蛋白中释放出胆固醇。该胆固醇与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和发色团系统反应，以产生蓝色复合物，可以在540/660nm下进行双色测量。所引起的吸光率增加与样品中的LDL-C或HDL-C浓度成正比。
qPCR分析：尸检时从小鼠中切出肝脏并且快速冷冻，以供随后分析。使用研杵(VWR)在含10μLβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)的缓冲液RLT(QIAGEN)中小鼠肝脏碾碎，之后使用RNeasy试剂盒(QIAGEN)，根据制造商的说明书来提取RNA。使用经过纯化的RNA作为模板，以用于使用RT2First Strand试剂盒(QIAGEN)的RT-PCR。将所得cDNA样品的一微升等分试样用于在ABI PRISM 7700序列检测系统或ABI ViiA 7实时PCR机器(LifeTechnologies)上对所指示的转录产物进行qPCR。将CT值相对于Gapdh和Gusb的平均CT值进行校正。
组织甘油三酯定量：用研杵(VWR)在200μL水中将小鼠肝脏碾碎。将二十五微升等分试样用于使用甘油三酯测定试剂盒(BioVision)根据制造商的说明书来提取甘油三酯，并且用Spectra Max 340 PC(Molecular Devices)进行测量。使用Pierce BCA蛋白质测定法(Thermo Scientific)根据制造商的说明书来测定蛋白质浓度，并且用Spectra Max 340PC进行测量。
免疫组织化学：
苦味酸天狼星红染色：在烘箱中在60℃下将载玻片加热45分钟，使用二甲苯和一系列乙醇进行脱蜡，并且在水中进行再水合；然后根据制造商的说明书在新鲜制备的苦味酸天狼星红溶液中保持60分钟，随后在酸化的水中进行两次洗涤。用Weigert的苏木精将细胞核染色8-10分钟，在三次更换的100％乙醇中进行脱水，清洁并且固定。
苏木精和伊红染色：在两次更换二甲苯(各10分钟)的情况下对载玻片进行脱蜡，通过绝对95％、70％乙醇进行脱水(各5分钟)，并且在水中再水合。然后将载玻片放在苏木精染色剂中持续4分钟，在水中冲洗，在1％酸性乙醇中分化30秒，并且在0.01％伊红Y中染色2秒，在95％乙醇中冲洗，用绝对乙醇脱水，并且在二甲苯中清洁15分钟，随后盖上盖玻片。
抗F4/80、抗Msr1、抗PCNA：用10％中性缓冲甲醛固定肝组织，并且将其包埋在石蜡中。将组织样本切成5μm厚切片，在二甲苯中对切片进行脱蜡，并且在梯度系列乙醇溶液(100％、95％、80％、70％、50％(3次更换，各5分钟))中进行水合。使载玻片上的组织经历热诱导的表位修复(10mmol/L柠檬酸钠缓冲液，98℃，20分钟)，然后用3％H2O2处理以淬灭内源性过氧化物酶。在室温下，在阻断溶液(5％中性山羊血清)中将切片孵育1小时。将所选择的一级抗体施用至载玻片，并且在4℃下在潮湿箱中孵育过夜。然后将二级生物素化抗体以1:250稀释度施用(Vector Lab，Burlingame，CA，USA)，随后与链霉亲和素过氧化物酶一起孵育。在每一个步骤之后用PBS将切片洗涤3次。用DAB底物对切片进行染色，并且用Mayer的苏木精复染2分钟。在三次更换100％乙醇中对载玻片进行脱水，清洁并且固定。
图像定量：为了PEG-rMuIL-10处理过的肝脏与媒介物处理过的肝脏相比较的分析，随机选择每组5-10只小鼠，并且用天狼星红(Polyscience Inc.)、TUNEL(Roche)、抗PCNA(Abcam)、苏木精(American MasterTech)、抗Msr1(Abcam)、抗F4/80(Abcam)或抗CD68(Serotech)进行染色。对于各肝脏，使用20倍物镜收集8-10张独立的图像。然后使用MetaMorph Imaging软件(Molecular Devices)，通过对代表性视野应用颜色阈值并且调整像素分布以便与阳性信号相对应来分析信号的平均面积。
体外吸收测定：通过Miltenyi磁珠正选择从Ficoll离心分离的外周血单核细胞中分离出单核细胞。在完全RPMI中在有或者没有PEG-rHuIL-10的情况下刺激细胞24小时。分析1×106个细胞在4小时内对20μL DiLDL、OxLDL或AcLDL(Alfa Aesar)的吸收。在cRPMI中利用50ng/mL M-CSF(BioLegend)使巨噬细胞从经过正选择的外周血单核细胞分化7天。将细胞以0.3-0.4×106个细胞/孔再接种在24孔板中，并且暴露于PEG-rHuIL-10，持续24小时。将细胞洗涤一次并且暴露于20μL DiLDL、OxLDL或AcLDL(Alfa Aesar)，在4小时之后测量吸收率。将人原代肝细胞(Triangle Research Labs)和枯氏细胞(Invitrogen)解冻并且以0.4×106个细胞/孔接种在24孔板中，并且分别在肝细胞培养基(无酚红RPMI、青霉素/链酶亲和素、细胞维持补充剂B(Invitrogen))和完全RPMI中孵育过夜。洗涤细胞并且将其暴露于PEG-rHuIL-10，持续24小时。此后，将细胞洗涤一次并且暴露于20μL DiLDL、OxLDL或AcLDL(Alfa Aesar)，在4小时之后测量吸收率。在1×PBS中将所有细胞洗涤一次，并且用110μL细胞溶解缓冲液(Sigma-Aldrich)使其溶解。将45μL细胞溶解物转移至透明底黑壁板(Greiner Bio-One)中，在575nm下读取荧光。
体内研究：在Aragen Biosciences(Morgan Hill，CA)根据由其研究动物管理与使用委员会(IACUC)批准的标准操作程序和确立的指导方针来进行小鼠研究。
高胆固醇血症模型：研究的生体内部分是在Aragen Biosciences进行。在给药之前使野生型和LDLR-/-C57BL/6小鼠(7-8周龄)维持正常食物或喂食西式饮食2或7周。每天经皮下给与聚乙二醇化重组小鼠IL-10(PEG-rMuIL-10)或媒介物(10mM HEPES、100mM NaClpH6.5、0.05％小鼠血清白蛋白)，持续2至3周；在整个给药期间使小鼠维持其相应饮食。对于氯膦酸盐耗竭研究来说，在PEG-rMuIL-10给药前一天开始，每3天对小鼠经静脉内给与氯膦酸盐脂质体(5mg/mL氯膦酸盐)或媒介物脂质体(第一剂量：0.2mL，后续剂量：0.1mL)。
聚乙二醇化：
将专利文献(例如US 2011/0250163)中所描述的单-/二-PEG-IL-10混合物用于临床前分析和临床分析中以及下文所阐述的实施例中。两种示例性合成方案如下：
示例性方案第1号。将IL-10(例如，啮齿类动物或灵长类动物)针对50mM磷酸钠、100mM氯化钠(pH值范围5-7.4)进行透析。在存在0.75-30mM氰基硼氢化钠的情况下使1:1-1:7摩尔比的5kDa PEG-丙醛与浓度为l-12mg/mL的IL-10反应。替代地，可以用类似方式以甲基吡啶硼烷活化所述反应。在5-30℃下将反应物孵育3-24小时。将聚乙二醇化反应的pH值调节至6.3，并且使7.5mg/mL hIL-10与PEG反应以产生1:3.5的IL-10与PEG接头比率。氰基硼氢化物的最终浓度是约25mM，并且使该反应在15℃下进行12-15小时。所述单PEG IL-10和二PEG IL-10是该反应的最主要产物，结束时各自的浓度是约50％。可以使用氨基酸(诸如甘氨酸或赖氨酸)或替代地Tris缓冲液来淬灭该反应。可以使用多种纯化方法，诸如凝胶过滤、阴离子和阳离子交换色谱以及尺寸排除HPLC(SE-HPLC)来分离所期望的聚乙二醇化IL-10分子。
示例性方案第2号。使IL-10针对10mM磷酸钠pH 7.0、100mM NaCl进行透析。使用透析缓冲液将经过透析的IL-10稀释3.2倍，从而达到约0.5至12mg/mL的浓度。在添加接头之前，将SC-PEG-12kDa(Delmar Scientific Laboratories，Maywood，Ill.)和一倍体积的100mM四硼酸钠pH 9.1加入9倍体积的经过稀释的IL-10中，以便将IL-10溶液的pH值升至8.6。将SC-PEG-12K接头溶解在透析缓冲液中，并且将适当体积的接头溶液(1.8至3.6摩尔接头/摩尔IL-10)加入经过稀释的IL-10溶液以引发聚乙二醇化反应。在5℃下进行该反应以便控制速率，并且轻轻搅拌反应溶液。如通过尺寸排除HPLC(SE-HPLC)所测定，当单-PEG-IL-10产率接近于40％时，通过添加1M甘氨酸溶液达到30mM的最终浓度来终止反应。使用HCl溶液将反应溶液的pH值缓慢调节至7.0，并且对反应物进行0.2微米过滤且储存在-80℃下。
在含有0.05％MSA的10mM HEPES pH 6.5、100mM NaCl中以0.75-1.0mg/mL配制PEG-IL-10。对照(安慰剂)＝无PEG-IL-10的同一配制基质。
实施例1
PEG-rMuIL-10降低血浆胆固醇水平
评价了PEG-rMuIL-10对喂食正常饮食和高脂饮食的野生型小鼠和LDLR-/-小鼠的血浆胆固醇水平的调控作用。
参考图1A至图1C，每天经皮下施用1.0、0.2和0.02mg/kg PEG-rMuIL-10或媒介物对照后，维持正常食物的野生型小鼠表现出总血浆胆固醇、LDL或HDL颗粒不减少。
然后测定PEG-rMuIL-10在LDLR-/-小鼠中的效果。当维持正常食物饮食的LDLR-/-小鼠和维持高脂食物饮食的野生型小鼠的总血浆胆固醇水平达到大约200mg/dL时，经皮下施用0.2mg/kg PEG-rMuIL-10、0.02mg/kg PEG-rMuIL-10或媒介物对照。接受了0.2mg/kgPEG-rMuIL-10的小鼠表现出胆固醇降低22％(图1D；LDLR-/-小鼠)和25％(图1G；野生型小鼠)。接受了0.2mg/kg PEG-rMuIL-10的小鼠表现出LDL-C降低30％(图1E；LDLR-/-小鼠)和15％(图1H；野生型小鼠)。接受了0.2mg/kg PEG-rMuIL-10的小鼠表现出HDL-C降低36％(图1F；LDLR-/-小鼠)和45％(图1I；野生型小鼠)。当胆固醇和LDL-C的初始水平较高时，每天经皮下接受0.02mg/kg PEG-rMuIL-10持续两周的维持高脂食物饮食的LDLR-/-小鼠表现出总血浆胆固醇水平降低接近50％、LDL-C水平降低60％，且HDL-C降低35％(分别见图1J至图1L)。图1A至图1L还指出了0.02mg/kg PEG-rMuIL-10对上述参数中的每一个的影响。最后，对维持高脂食物饮食的LDLR-/-小鼠进行更长时间给药导致总血浆胆固醇降低达70％(数据未示出)。总之，结果表明用PEG-rMuIL-10实现的血浆胆固醇降低程度取决于总胆固醇水平。
为了证实以上所阐述的发现，在用PEG-rHuIL-10治疗癌症(非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)和结肠直肠癌的混合型癌)的人患者(n＝4)中评价总血浆胆固醇。每天经皮下给患者施用2.5μg/kg或5μg/kg PEG-rHuIL-10。如图1M中所指出，在具有边界线高(约200mg/dL)总胆固醇的患者中，施用2.5μg/kg PEG-rHuIL-10实现的胆固醇降低程度最大；在这个患者群体中，总血浆胆固醇降低达40％，与先前讨论的小鼠数据一致。具有低(约100mg/dL)总胆固醇的患者不受PEG-rHuIL-10影响，而具有约140mg/dL初始血浆胆固醇浓度的患者实现了胆固醇降低至约100mg/dL。140mg/dL或更低的水平与心血管事件的无生命时间风险一致。使用5μg/kg PEG-rHuIL-10导致胆固醇以与施用2.5μg/kg PEG-rHuIL-10时的观察结果一致的方式降低，而且降低量也取决于患者的基线胆固醇水平(参见图1N)。
这些数据表明，PEG-IL-10在小鼠中调控血清胆固醇的机制与在人中的类似。
实施例2
PEG-rMuIL-10改变胆固醇合成和清道夫受体基因的肝脏表达
使用Qiagen脂蛋白信号传导和胆固醇代谢、纤维化以及先天性和适应性免疫应答检查，评估了PEG-rMuIL-10对与肝功能和胆固醇调控相关的基因的表达的影响。如图2A至图2L中所示，响应于PEG-rMuIL-10暴露，仅改变两组主要基因。
第一组调控基因涉及内源性胆固醇合成。每天经皮下给维持正常食物饮食的野生型小鼠(图2A)、维持正常食物饮食的LDLR-/-小鼠(图2B)、维持高脂食物饮食的野生型小鼠(图2C)和维持高脂食物饮食的LDLR-/-小鼠(图2D)施用0.2mg/kg PEG-rMuIL-10、0.02mg/kg PEG-rMuIL-10或媒介物对照。涉及内源性胆固醇合成的两个基因Hmgcs1和Hmgcs2在肝脏中适度但一致地降低(图2A至图2D)。这些数据与IL-10可以通过抑制甲羟戊酸途径来减少内源性胆固醇合成的报告一致。
第二组调控基因包括清道夫受体。如图2E至图2L中所表明，所有进一步比较都集中于媒介物对照组与施用0.2mg/kg PEG-rMuIL-10的小鼠群组之间的差异，因为施用0.02mg/kg PEG-rMuIL-10的小鼠群组对血浆胆固醇控制和基因调控都发挥有限的控制。每天经皮下给维持正常食物饮食的野生型小鼠(图2E)、维持正常食物饮食的LDLR-/-小鼠(图2F)、维持高脂食物饮食的野生型小鼠(图2G)和维持高脂食物饮食的LDLR-/-小鼠(图2H)施用0.2mg/kg PEG-rMuIL-10或媒介物对照。如图2E至图2H中所表明，A型清道夫受体Msr1和Marco被诱导2至7倍。为了展开清道夫受体分析，评价了已知能调控血清胆固醇的其他受体的表达差异。LDL受体表达不变(数据未示出)而且在LDLR-/-中不具相关性，并且CD36和PCSK9的表达也不变(参见图2E至图2H)。因为清道夫受体主要表达在巨噬细胞型细胞上，所以还评价了最经常表达在肝脏组织驻留巨噬细胞上的两种细胞表面蛋白F4/80和CD14的表达差异。在不同的基因背景和饮食条件下适度地诱导这些基因(参见图2E至图2H)。这些数据证实了清道夫受体在肝功能和胆固醇调控方面的作用。
如果PEG-rMuIL-10诱导脂蛋白吸收增加，则可能伴随流出相关基因的增加。因此，评估了流出介体ABCG1和ABCA1的水平。ABCG1被视为主要在肝脏中发挥功能，而ABCA1被视为主要在胃肠道中发挥功能。两种因子都充当用于将胆固醇从细胞内部移置到低脂质HDL颗粒上的胆固醇流出泵。每天经皮下给维持正常食物饮食的野生型小鼠(图2I)、维持正常食物饮食的LDLR-/-小鼠(图2J)、维持高脂食物饮食的野生型小鼠(图2K)和维持高脂食物饮食的LDLR-/-小鼠(图2L)施用0.2mg/kg PEG-rMuIL-10或媒介物对照。如图2I至图2L中所描绘，仅ABCG1表现出表达适度地但一致地增加的趋势。
实施例3
PEG-rMuIL-10改变清道夫受体的表达和枯氏细胞的存在
为了评估PEG-rMuIL-10是否增加清道夫受体和KC数目，通过IHC来分析经过处理和未经处理的肝脏组织在MSR1表达方面的差异。
每天经皮下给维持正常食物饮食的野生型小鼠(图3A)、维持正常食物饮食的LDLR-/-小鼠(图3B)、维持高脂食物饮食的野生型小鼠(图3C)和维持高脂食物饮食的LDLR-/-小鼠(图3D)施用0.2mg/kg PEG-rMuIL-10或媒介物对照。如图3A和图3B中所表明，给与PEG-rMuIL-10在维持正常饮食的野生型小鼠和LDLR-/-小鼠中引起可检测的MSR1稍微增加。然而，对照组织中的MSR1水平似乎随膳食脂肪摄入量增加而下降。相对于维持高脂食物的同一类型小鼠，维持正常食物的野生型小鼠和LDLR-/-小鼠中的可检测MSR1的水平较高。在使用IHC对Msr1的量进行定量的情况下证实了该结果(图3A至图3D)。另外，用PEG-rMuIL-10治疗似乎能校正LDLR-/-小鼠肝脏组织内的Msr1水平(数据未示出)。
参考图2A至图2L，清道夫受体最经常表达在巨噬细胞系细胞上，并且标识着F4/80和CD14的信息表达增加。因此，每天经皮下给维持正常食物饮食的野生型小鼠(图3E)、维持正常食物饮食的LDLR-/-小鼠(图3F)、维持高脂食物饮食的野生型小鼠(图3G)和维持高脂食物饮食的LDLR-/-小鼠(图3H)施用0.2mg/kg PEG-rMuIL-10或媒介物对照，以便通过IHC来评价F4/80的蛋白质表达水平(数据未示出)。在维持正常食物的野生型小鼠和LDLR-/-小鼠中，在F4/80阳性细胞的存在方面存在极小至无差异(图3E和图3F)。然而，在维持高脂食物的野生型和LDLR-/-中，F4/80阳性细胞存在可检测的增加(图3G和图3H)，表明PEG-rMuIL-10在膳食脂肪吸收增加的情况下增加了动物肝脏中的枯氏细胞数目。
另外，对IL-10Rα的表达分析表明，维持正常食物对比高脂食物的野生型小鼠和LDLR-/-小鼠之间的IL-10Rα信息存在大约2倍差异，表明胆固醇调控差异在一定程度上可能是由于相对IL-10受体水平所致(数据未示出)。
实施例4
体内吞噬细胞耗竭消除PEG-rMuIL-10的胆固醇降低作用
为了确定与髓系相关的细胞是否负责通过PEG-rMuIL-10来控制血浆胆固醇而进行了评价。
使用标准技术，通过在存在或不存在PEG-rMuIL-10的情况下给与动物氯膦酸盐(Cl)脂质体来除去吞噬细胞。在确保肝脏中的所有吞噬细胞都完全耗竭并且通过IHC来评价肝细胞健康(数据未示出)之后，在维持正常食物饮食的野生型小鼠(图4B)、维持正常食物饮食的LDLR-/-小鼠(图4C)、维持高脂食物饮食的野生型小鼠(图4D)和维持高脂食物饮食的LDLR-/-小鼠(图4A)中评估PEG-rMuIL-10对血浆胆固醇水平的调控。
如图4A至图4G中所表明，吞噬细胞耗竭消除了PEG-rMuIL-10对血浆胆固醇的调控。给与PEG-rMuIL-10的小鼠(1mg/kg)表现出胆固醇降低50％，而给与PEG-rMuIL-10和氯膦酸盐脂质体的小鼠存在25％增加(图4A)。出乎意料的是，只接受氯膦酸盐的小鼠表现出总血浆胆固醇增加45％。此后，在维持正常食物饮食的野生型小鼠和LDLR-/-小鼠(分别见图4B和图4C)和维持高脂食物饮食的野生型小鼠(图4D)中使吞噬细胞耗竭。令人惊讶的是，除去吞噬细胞一致地增加了血浆胆固醇，表明吞噬细胞一般牵涉血浆胆固醇的正常调控。
IHC评价表明，PEG-rMuIL-10在第7天对氯膦酸盐介导的肝脏枯氏细胞耗竭不发挥作用，但PEG-rMuIL-10在第14天已经开始促进肝脏枯氏细胞的再群体化(数据未示出)。如图4E中所表明，PEG-rMuIL-10的肝脏枯氏细胞再群体化作用与血浆胆固醇降低一致。
给与PEG-rMuIL-10似乎增强了单核细胞从骨髓进入系统循环中。如图4F和图4G中所表明，在暴露于氯膦酸盐之后，小鼠的外周单核细胞起初减少。然后，PEG-rMuIL-10发挥作用，从而促进该细胞群体恢复。这些数据表明，给与PEG-rMuIL-10可以缓慢恢复体内平衡，从而克服氯膦酸盐的作用并且增强肝脏中的枯氏细胞的再群体化，进而恢复其降低胆固醇的能力。
实施例5
PEG-rHuIL-10诱导人髓系中的清道夫受体表达
为了明确地确定肝脏中哪些细胞响应PEG-rHuIL-10，进行了体外实验，其中使人单核细胞(图5A)、人巨噬细胞(图5B)、人枯氏细胞(图5C)和人肝细胞(图5D)暴露于PEG-rHuIL-10。参考图5A至图5D，只有枯氏细胞和外周单核细胞表现出响应于PEG-rHuIL-10而上调清道夫受体表达。
这些数据表明，PEG-rHuIL-10能上调髓系细胞而不是肝细胞上的清道夫受体表达。值得注意的是，清道夫受体调控似乎在小鼠和人中类似，表明了IL-10在对骨髓区室的作用方面的生物学性质的保守性。
实施例6
PEG-rHuIL-10增加经修饰的LDL的单核细胞吸收和枯氏细胞的LDL吸收
为了确定清道夫受体表达增加是否与脂蛋白吸收增强相关，分离出外周人单核细胞(图6A、图6E和图6F)、人巨噬细胞(图6B)、人枯氏细胞(图6C)和人肝细胞(图6D)，并且暴露于PEG-rHuIL-10。
参考图6A至图6D，Y轴是已经被吸收的经标记胆固醇的量相对于相同经标记胆固醇的标准曲线稀释度的定量。X轴上的参数可以简要概括如下：使细胞暴露于PEG-IL-10，持续约24小时，然后洗涤并且暴露于以下条件，持续3至5小时：i)无试剂、无经标记的胆固醇，用于充当背景对照组；ii)无试剂、有经标记的胆固醇，用于充当背景对照组；或iii)PEG-IL-10与经标记的胆固醇。洗涤细胞，溶解，然后如以上所指出对总内在化经标记胆固醇进行定量。以类似的方式生成图6E和图6F中的数据。
如图6A中所表明，PEG-rHuIL-10增加了新分离的外周血单核细胞对乙酰化LDL(Ac-LDL；*，p<0.05)和氧化LDL(Ox-LDL；(***，p<0.001)而非对未修饰LDL(LDL)的吸收。图6E和图6F表现出了PEG-rHuIL-10和PEG-rHuIL-10加甘露糖对人单核细胞中的乙酰化LDL(图6E)和氧化LDL(图6F)的作用。甘露糖被用来阻断甘露糖受体。阻断甘露糖受体抑制了乙酰化LDL的吸收，但不抑制氧化LDL的吸收(分别见图6E和图6F)。这些数据表明，PEG-rHuIL-10通过上调典型和非典型清道夫受体而增强了LDL蛋白的清除。
相反，在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)分化的巨噬细胞响应于PEG-rHuIL-10对任何形式的LDL的吸收中没有检测到差异(图6B)。参考图6C，PEG-rHuIL-10增加了LDL(*，p<0.05)而非Ac-LDL或Ox-LDL的枯氏细胞吸收。这些数据支持枯氏细胞参与调控血浆LDL胆固醇。还评价了对未修饰、氧化和乙酰化LDL的肝细胞吸收的变化的存在。响应于PEG-rHuIL-10，观察到对未修饰、氧化和乙酰化LDL的肝细胞吸收没有变化(图6D)。尽管髓系细胞一般是吞噬性的，但这些数据表明，在单核细胞、巨噬细胞、枯氏细胞和肝细胞之间，响应于PEG-rHuIL-10的胆固醇吸收的性质是不同的。
当评估作为PEG-rHuIL-10对胆固醇吸收的影响的潜在抑制剂的针对MARCO和CD36的中和抗体时，没有观察到吸收方面的差异(数据未示出)。相反，聚葡萄糖抑制PEG-rHuIL-10增加单核细胞对Ac-LDL而非Ox-LDL的吸收(数据未示出)。这些数据表明，PEG-rHuIL-10对脂蛋白吸收的控制是通过已知的和可能未知的清道夫受体调控来发生。此外，与体内流出基因调控一致，枯氏细胞暴露于IL-10适度增加了胆固醇流出至HDL颗粒上(数据未示出)。
总的来说，这些数据表明，尽管PEG-rHuIL-10可以增强外周单核细胞对Ac-LDL和Ox-LDL的吸收，但肝脏内的枯氏细胞群体才是PEG-rHuIL-10介导的外周胆固醇控制的靶细胞群体。此外，这些数据暗示髓系在外周胆固醇控制之下，表明了单核细胞、巨噬细胞和枯氏细胞代表着肝脏内主动去除血浆胆固醇的未开发细胞储备。最后，这些数据表明，用PEG-rHuIL-10调节枯氏细胞上的清道夫受体以及用其他治疗化合物对髓系进行一般性调节可以代表一种降低血浆胆固醇的替代手段。
实施例7
PEG-rMuIL-10与依泽替米贝在胆固醇降低方面具有相加作用
为了评价先前实施例中所观察到的PEG-rMuIL-10介导的作用是否与利用标准护理治疗剂目前未靶向的细胞类型一致，将PEG-rMuIL-10与口服施用的他汀类或能阻断胆固醇吸收的口服治疗剂依泽替米贝组合。
如图7A中所示，当施用给维持高脂饮食的LDLR-/-小鼠时，PEG-rMuIL-10(1.0mg/kg，皮下，每天一次)和依泽替米贝(Ez)(10mg/kg，每天一次，通过口服管饲法)分别单独使血浆胆固醇降低58％和55％，并且在组合时达86％。在施用PEG-rMuIL-10和依泽替米贝的情况下观察到的血浆胆固醇浓度类似于在LDLR-/-小鼠中观察到的正常血浆胆固醇水平。
使用与产生图7A中的数据的方法相当的实验方法来生成与血浆LDL-C和血浆HDL-C相关的数据。如图7A和图7B中所表明，PEG-rMuIL-10与依泽替米贝组合导致LDL-C和HDL-C分别降低。虽然PEG-rMuIL-10与他汀类(辛伐他汀)组合也能降低LDL-C和HDL-C(数据未示出)，但口服施用他汀类在小鼠中有毒性，并且因此限制了他汀类所能实现的血浆降低的最高水平。PEG-rMuIL-10与依泽替米贝和他汀类两者的组合表明各药剂的作用机制是非冗余的。
实施例8
PEG-rMuIL-10减少脂质、胆固醇和甘油三酯的积聚
为了确定PEG-rMuIL-10介导的枯氏细胞活化对血浆胆固醇的清除效果而进行了评估。
如通过以油红O染色来评价肝脂质浓度(数据未示出)所确定，用PEG-rMuIL-10进行治疗减少了喂食高脂食物的LDLR-/-小鼠的肝脏脂质小滴(图8A)。另外，对胆固醇和甘油三酯的肝组织浓度进行定量。如图8B至图8E中所示，喂食高脂饮食的野生型小鼠和LDLR-/-小鼠的肝脏胆固醇浓度仅倾向于较低；接受正常饮食的小鼠没有表现出可感知的效应。图8E至图8I表明喂食高脂饮食的野生型小鼠以及喂食正常饮食和高脂饮食的LDLR-/-小鼠的肝脏甘油三酯浓度较低。总的来说，这些数据表明i)枯氏细胞借以除去血浆脂蛋白的清除系统攻击和ii)适度增强流出至HDL脂蛋白上(数据未示出)足以防止枯氏细胞和肝细胞内的不当甘油三酯和胆固醇积聚。
实施例9
PEG-rMuIL-10治疗导致肝细胞增殖
施用PEG-rMuIL-10导致LDLR-/-小鼠的门静脉周细胞数目增加(数据未示出)，反映了脂肪变性细胞明显减少与先前实施例中所观察到的肝脏甘油三酯降低一致。如图9A中所描绘，观察到肝脏重量增加与饮食(正常饮食对比高脂饮食)和品系无关(野生型对比LDLR-/-)，但与剂量有关(数据未示出)。对Ki67基因表达进行定量，以便确定观察结果是否能反映肝脏增殖。如图9B至图9E中所示，当用0.2mg/kg PEG-rMuIL-10(而不是0.02mg/kgPEG-rMuIL-10)治疗动物时，喂食正常饮食的野生型和LDLR-/-小鼠以及喂食高脂饮食的野生型和LDLR-/-小鼠的基因表达增加了超过2倍。
为了确定那些细胞在分裂，通过IHC针对增殖细胞核抗原(PCNA)对细胞进行染色，而且在喂食正常食物的野生型小鼠和喂食高脂食物的LDLR-/-小鼠中都观察到了PCNA阳性细胞增加(数据未示出)。如图9F至图9I中所表明，PEG-rMuIL-10给药导致所有小鼠背景的PCNA阳性细胞增加。PCNA阳性细胞似乎是肝细胞和通过门静脉管进入肝脏的细胞。
实施例10
PEG-rMuIL-10表现出抗纤维化作用
肝脏中的甘油三酯积聚被视为脂肪肝病的诱因，而且已经将长期积聚与发展NASH相关联(参见例如Liu,Q.等,Lipids Health Dis,2010.9:42)。脂肪肝疾病被认为能进展至硬化，这与已活化的肝脏星形细胞引起胶原蛋白沉积相关。IL-10抑制胶原蛋白从这些细胞分泌。因此，为了确定用PEG-rMuIL-10治疗正常和高脂血症野生型小鼠和LDLR-/-小鼠是否会引起肝脏胶原蛋白沉积变化而进行了评价。
对得自于喂食正常和高脂食物的野生型和LDLR-/-小鼠的代表性肝脏门静脉周区域的比较表明，喂食高脂饮食的LDLR-/-小鼠的具有门静脉周胶原蛋白沉积的变化最大(数据未示出)。这些数据表明，用PEG-rMuIL-10治疗可以抑制门静脉周胶原蛋白沉积，这与IL-10的已被报告的抗纤维化功能一致。进一步评价表明，可以通过PEG-rMuIL-10给药使响应来源于高血浆胆固醇的炎性刺激的门静脉周胶原蛋白沉积恢复至正常。与这些数据一致，PEG-rMuIL-10还降低这些动物的肝脏甘油三酯(数据未示出)。
总的来说，这些数据表明PEG-rMuIL-10可以通过诱导肝细胞增殖、降低肝脏甘油三酯浓度和重塑不当沉积的胶原蛋白来恢复肝脏健康。肝脏甘油三酯积聚和后续胶原蛋白沉积是NAFLD的标志，如果不加检查，则会发展成NASH。因为用PEG-rMuIL-10治疗能减少这些诱因性因素，所以PEG-IL-10代表了一种用于治疗NAFLD和NASH的可能治疗形态。
实施例11
PEG-rMuIL-10对肝功能的影响
研究了小鼠暴露于PEG-rMuIL-10与肝脏毒性之间的可能联系。如表1中所阐述，对肝功能血清标记物变化的评价表明，相对于正常鼠类对照组，PEG-rMuIL-10不显著改变肝脏血清功能标记物。
表1
因而，尽管高胆固醇血症小鼠暴露于PEG-rMuIL-10在肝脏生物学中引起了某些变化时，但那些变化不会诱导有毒的主要或次要作用。这些数据进一步支持PEG-rHuIL-10在控制高血浆胆固醇方面的潜在用途以及对NAFLD和NASH的伴随有益作用。
本文中描述了本发明的诸多具体实施方案，包括诸位本发明人已知的用于进行本发明的最佳模式。在阅读前述内容后，所公开的实施方案的变化形式对于本领域中的工作人员来说可能显而易见，并且预期本领域技术人员可以在适当时使用此类变化形式。因此，希望能以不同于本文中具体描述的方式来实施本发明，并且本发明在适用法律允许时包括对所附权利要求书中所叙述的所有标的物的所有修改和等效方案。此外，除非本文中另外指出或在其他方面与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖其所有可能的变化形式中的上述要素的任何组合。
本说明书中所引用的所有出版物、专利申请、登录号和其他参考文献以引用的方式并入本文中，就如同明确地和单独地指出每一个单独出版物或专利申请以引用的方式并入本文中一样。

Claims (103)

1.一种鉴定能在枯氏细胞中诱导STAT3磷酸化的药剂的方法，其包括：
a)使候选药剂与枯氏细胞接触，
b)测定所述枯氏细胞中的STAT3磷酸化水平，以及
c)比较b)中的STAT3磷酸化水平与由参考标准物诱导的STAT3磷酸化水平，
其中所述枯氏细胞中的STAT3磷酸化水平与所述参考标准物中的STAT3磷酸化水平相比更高鉴定所述候选药剂为能诱导磷酸化的药剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中使用体外测定法来鉴定能在枯氏细胞中诱导STAT3磷酸化的药剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中使用离体测定法来鉴定能在枯氏细胞中诱导STAT3磷酸化的药剂。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述枯氏细胞来自于肝脏的窦状隙。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述候选药剂包括小分子、多肽或抗体。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述参考标准物是白介素、干扰素、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)、制瘤素M(OSM)或瘦素。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述白介素是IL-5、IL-6或IL-10。
8.如权利要求1所述的方法，其还包括评估所述能诱导磷酸化的药剂是否降低血清胆固醇水平和甘油三酯水平中的至少一项。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述评估是利用生物化学测定法、体外测定法和离体测定法或体内模型来进行。
10.一种鉴定能降低受试者的血清胆固醇的药剂的方法，其包括：
a)向所述受试者施用候选药剂，其中所述候选药剂在枯氏细胞中诱导STAT3磷酸化，
b)测定所述受试者的血清胆固醇水平，以及
c)比较b)中的所述血清胆固醇水平与在向所述受试者施用参考标准物之后测得的血清胆固醇水平，其中已知所述参考标准物能降低血清胆固醇；
其中降低血清胆固醇的能力超过所述参考标准物或与所述参考标准物相当的候选药剂鉴定出能降低所述受试者的血清胆固醇的药剂。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述受试者是动物模型。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述动物模型是小鼠模型。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述小鼠模型是LDLR-/-小鼠模型。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述受试者是人类。
15.如权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述候选药剂包括小分子、多肽或抗体。
16.如权利要求10至14中任一项所述的方法，其中所述参考标准物是他汀类。
17.如权利要求11所述的方法，其中所述血清胆固醇水平是200至239mg/dL。
18.如权利要求11所述的方法，其中所述血清胆固醇水平是至少240mg/dL。
19.如权利要求10至18中任一项所述的方法，其还包括评估所述能降低所述受试者的血清胆固醇的药剂是否诱导肝细胞增殖。
20.一种降低有需要的受试者的血清胆固醇的方法，其包括施用治疗有效量的能调节枯氏细胞体内平衡的药剂。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述调节枯氏细胞体内平衡包括增强枯氏细胞从血清中除去脂蛋白的能力。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述调节枯氏细胞体内平衡包括增加枯氏细胞的数目以便从血清中除去脂蛋白。
23.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其中使用如权利要求1至9中任一项所述的方法来鉴定所述药剂。
24.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其中使用如权利要求10至19中任一项所述的方法来鉴定所述药剂。
25.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述药剂是IL-10药剂。
26.如权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述药剂是经肠胃外施用。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述肠胃外施用是经皮下施用。
28.如权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述药剂是口服施用。
29.如权利要求20至28中任一项所述的方法，其还包括施用治疗可接受量的至少一种其他胆固醇降低剂。
30.一种治疗或预防受试者的高胆固醇血症或者高胆固醇血症相关疾病、病症或病状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的使用如权利要求1至19中任一项所述的方法鉴定的药剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述高胆固醇血症相关疾病、病症或病状是心血管病症。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述心血管病症是动脉粥样硬化。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述高胆固醇血症相关疾病、病症或病状是血栓形成或血栓性病状。
34.如权利要求30所述的方法，其中所述高胆固醇血症相关疾病、病症或病状是炎性病症。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述炎性病症是血管炎。
36.如权利要求30所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是纤维化病症。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述纤维化病症是肝脏相关性的。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述肝脏相关性纤维化病症是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或肝硬化。
39.如权利要求30至38中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
40.如权利要求39至39中任一项所述的方法，其中所述药剂是经肠胃外施用。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述肠胃外施用是经皮下施用。
42.如权利要求30至39中任一项所述的方法，其中所述药剂是口服施用。
43.如权利要求30至39中任一项所述的方法，其还包括施用治疗可接受量的至少一种其他治疗剂或预防剂。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述第二治疗剂或预防剂是胆固醇体内平衡剂。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述胆固醇体内平衡剂包括他汀类、胆汁酸树脂、依泽替米贝、纤维酸、烟酸或PCSK9抑制剂。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述预防剂或治疗剂是抗糖尿病剂或抗肥胖剂。
47.如权利要求43所述的方法，其中所述预防剂或治疗剂是免疫剂或消炎剂。
48.一种药物组合物，其包含药学上有效量的如权利要求1至19中任一项所述的药剂和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
49.如权利要求48所述的药物组合物，其中所述组合物适合用于人施用。
50.如权利要求48或49所述的药物组合物，其还包括至少一种其他预防剂或治疗剂。
51.如权利要求50所述的药物组合物，其中所述预防剂或治疗剂是胆固醇体内平衡剂。
52.如权利要求51所述的药物组合物，其中所述胆固醇体内平衡剂包括他汀类、胆汁酸树脂、依泽替米贝、纤维酸、烟酸或PCSK9抑制剂。
53.如权利要求50所述的药物组合物，其中所述预防剂或治疗剂是抗糖尿病剂或抗肥胖剂。
54.如权利要求50所述的药物组合物，其中所述预防剂或治疗剂是免疫剂或消炎剂。
55.一种无菌容器，其包括如权利要求48至54中任一项所述的药物组合物。
56.如权利要求55所述的无菌容器，其中所述无菌容器是注射器。
57.一种试剂盒，其包括如权利要求55或56所述的无菌容器。
58.如权利要求57所述的试剂盒，其还包括第二无菌容器，所述第二无菌容器包括至少一种其他预防剂或治疗剂。
59.一种治疗或预防受试者的肝脏疾病、病症或病状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的能调节枯氏细胞体内平衡的IL-10药剂，
其中所述肝脏疾病、病症或病状是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。
60.一种治疗或预防受试者的肝脏疾病、病症或病状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的能调节枯氏细胞体内平衡的IL-10药剂，
其中所述量足以实现1pg/mL至10.0ng/mL的平均IL-10血清谷浓度；并且
其中所述肝脏疾病、病症或病状是NASH或NAFLD。
61.一种治疗或预防受试者的肝脏疾病、病症或病状的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的能调节枯氏细胞体内平衡的细胞因子，其中所述量足以在一段时间内维持平均细胞因子血清谷浓度；
其中所述平均细胞因子血清谷浓度是1.0pg/mL至10.0ng/mL；
其中在至少95％的所述时间段内维持所述平均细胞因子血清谷浓度；并且
其中所述肝脏疾病、病症或病状是NASH或NAFLD。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述平均细胞因子血清谷浓度在0.1ng/mL至10ng/mL的范围内。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述平均细胞因子血清谷浓度在0.1ng/mL至5.0ng/mL的范围内。
64.如权利要求61所述的方法，其中所述平均细胞因子血清谷浓度在1.0ng/mL至10ng/mL的范围内。
65.如权利要求61所述的方法，其中所述平均细胞因子血清谷浓度在1.0ng/mL至5.0ng/mL的范围内。
66.如权利要求61所述的方法，其中所述平均细胞因子血清谷浓度在0.9ng/mL至5.1ng/mL的范围内。
67.如权利要求61至66中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IL-10。
68.如权利要求61至67中任一项所述的方法，其中所述时间段是至少12小时。
69.如权利要求61至67中任一项所述的方法，其中所述时间段是至少24小时。
70.如权利要求61至67中任一项所述的方法，其中所述时间段是至少48小时。
71.如权利要求61至67中任一项所述的方法，其中所述时间段是至少72小时。
72.如权利要求61至67中任一项所述的方法，其中所述时间段是至少1周。
73.如权利要求61至67中任一项所述的方法，其中所述时间段是至少2周。
74.如权利要求61至67中任一项所述的方法，其中所述时间段是至少1个月。
75.如权利要求61至74中任一项所述的方法，其中在至少97％的所述时间段内维持所述平均细胞因子血清谷浓度。
76.如权利要求75所述的方法，其中在至少99％的所述时间段内维持所述平均细胞因子血清谷浓度。
77.如权利要求76所述的方法，其中在100％的所述时间段内维持所述平均细胞因子血清谷浓度。
78.如权利要求59、60和67至77中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂是成熟人类IL-10。
79.如权利要求59、60和67至77中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂是成熟人类IL-10的变体，并且其中所述变体展现出与成熟人类IL-10活性相当的活性。
80.如权利要求59至79中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是NASH。
81.如权利要求59至79中任一项所述的方法，其中所述疾病、病症或病状是NAFLD。
82.如权利要求59至81中任一项所述的方法，其中所述调节枯氏细胞体内平衡包括增强枯氏细胞从血清中除去脂蛋白的能力。
83.如权利要求59至81中任一项所述的方法，其中所述调节枯氏细胞体内平衡包括增加枯氏细胞的数目以便从血清中除去脂蛋白。
84.如权利要求59、60和67至83中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂降低胆固醇。
85.如权利要求59、60和67至83中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂降低甘油三酯。
86.如权利要求59、60和67至85中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂减少或逆转门静脉周胶原蛋白沉积。
87.如权利要求59、60和67至86中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂增加肝细胞数目。
88.如权利要求59、60和67至87中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂是经肠胃外施用。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述肠胃外施用是经皮下施用。
90.如权利要求59至89中任一项所述的方法，其还包括投与至少一种其他预防剂或治疗剂。
91.如权利要求59、60和67至90中任一项所述的方法，其中所述IL-10药剂包括至少一种修饰以形成经过修饰的IL-10药剂，其中所述修饰不改变所述IL-10药剂的氨基酸序列。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述经过修饰的IL-10药剂是PEG-IL-10药剂。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述PEG-IL-10药剂包括与IL-10的至少一个亚单元的至少一个氨基酸残基共价连接的至少一个PEG分子。
94.如权利要求91或92所述的方法，其中所述PEG-IL-10药剂包括单聚乙二醇化IL-10与二聚乙二醇化IL-10的混合物。
95.如权利要求92至94中任一项所述的方法，其中所述PEG-IL-10药剂的所述PEG组分具有约5kDa至约20kDa的分子质量。
96.如权利要求92至94中任一项所述的方法，其中所述PEG-IL-10药剂的所述PEG组分具有大于约20kDa的分子质量。
97.如权利要求92至94中任一项所述的方法，其中所述PEG-IL-10药剂的所述PEG组分具有至少约30kD的分子质量。
98.如权利要求91所述的方法，其中所述经过修饰的IL-10药剂是Fc融合分子。
99.如权利要求91所述的方法，其中所述经过修饰的IL-10药剂包括血清白蛋白或白蛋白结合域(ABD)。
100.如权利要求91所述的方法，其中所述经过修饰的IL-10药剂经过糖基化或羟乙基淀粉化。
101.如权利要求91至100中任一项所述的方法，其中所述修饰具有位点特异性。
102.如权利要求91至97和99至101中任一项所述的方法，其中所述修饰包括接头。
103.如权利要求59至102中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
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