MX2013000314A

MX2013000314A - Polipeptidos.

Info

Publication number: MX2013000314A
Application number: MX2013000314A
Authority: MX
Inventors: Caroline Ekblad; Lars Abrahmsen
Original assignee: Affibody Ab
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2011-07-08
Publication date: 2013-01-29
Also published as: US9211344B2; JP5827994B2; CA2804002C; ES2676403T3; CA2804002A1; RU2577964C2; EP2933262A1; KR20130034043A; JP6486810B2; HK1209761A1; CN103003296A; DK2590993T3; CN110437320A; US20160108095A1; NZ604805A; EP2933262B1; CN110437320B; PL2933262T3; JP2016053047A; JP2013534421A

Abstract

La presente divulgación se refiere a un tipo de polipéptidos genomanipulados que tienen afinidad de unión con albúmina. También se refiere a nuevos métodos y usos que aprovechan la unión de estos y otros compuestos a la albúmina en diferentes contextos, algunos de los cuales son importantes para el tratamiento o diagnóstico de enfermedades en mamíferos, incluidos los humanos.

Description

POLIPÉPTIDOS Campo técnico La presente divulgación se refiere a un tipo de polipéptidos genomanipulados que tienen afinidad de unión con albúmina. También se refiere a nuevos métodos y usos que aprovechan la unión de estos y otros compuestos a la albúmina en diferentes contextos, algunos de los cuales son importantes para el tratamiento de enfermedades en mamíferos, incluidos los humanos.

Antecedentes Seroalbúmina La seroalbúmina es la proteina más abundante en el suero mamífero (40 g/1; aproximadamente 0,7 mM en humanos) y una de sus funciones es unir moléculas tales como lípidos y bilirrubina (Peters, Advances in Protein Chemistry 37:161, 1985) . La seroalbúmina no tiene función enzimática ni inmunológica . Adicionalmente, la seroalbúmina humana (HSA, por sus siglas en inglés) es un portador natural que participa en el transporte y entrega endógenos de numerosas moléculas naturales y también terapéuticas (Sellers y Koch-Weser, Albumin Structure, Function and Uses, eds Rosenoer et al, Pergamon, Oxford, p 159, 1977) . La semivida de la seroalbúmina es directamente proporcional al tamaño del animal, donde, por ejemplo, la seroalbúmina humana tiene una semivida de 19 días y la seroalbúmina de conejo tiene una semivida de aproximadamente 5 días (McCurdy et al, J Lab Clin Med 143:115, 2004). La HSA está ampliamente distribuida en todo el cuerpo, en particular en los compartimientos intersticiales y sanguíneos, donde participa principalmente en el mantenimiento de la osmolaridad. Estructuralmente, las albúminas son proteínas monocatenarias que comprenden tres dominios homólogos y en total 584 o 585 aminoácidos (Dugaiczyk et al, Proc Nati Acad Sci USA 79:71, 1982). Las albúminas contienen 17 puentes disulfuro y un único tiol reactivo, cisteína en la posición 34, pero carecen de restos de carbohidrato enlazados a N y enlazados a 0 (Peters, 1985, supra; Nicholson et al, Br J Anaesth 85:599, 2000).

La fusión o asociación con HSA resulta en el aumento de la semivida in vivo de las proteínas Se han divulgado varias estrategias para acoplar covalentemente proteínas directamente a seroalbúminas o a un péptido o proteína que permitirá la asociación in vivo con seroalbúminas. Se han descrito ejemplos del abordaje mencionado anteriormente, por ejemplo, en la publicación O91/01743, en la publicación WOOl/45746 y en Dennis et al (J Biol Chem 277:35035-43, 2002). El primer documento describe, entre otros, el uso de péptidos o proteínas de unión a albúmina derivados de la proteína G estreptococica (SpG) para aumentar la semivida de otras proteínas. La idea es fusionar el péptido/proteína de unión a albúmina derivado de bacterias con un péptido/proteína de interés terapéutico, que ha exhibido una rápida eliminación de la sangre. La proteína de fusión generada de esta forma se une a la seroalbúmina in vivo y se beneficia de su semivida más prolongada, lo cual aumenta la semivida neta del péptido/proteína de interés terapéutico fusionado. La publicación WO01/45746 y Dennis et al se refieren al mismo concepto, pero aquí los autores utilizan péptidos relativamente cortos para unir a la seroalbúmina. Los péptidos se seleccionaron de una biblioteca de péptidos de expresión en fago. En Dennis et al, se mencionan trabajos anteriores en los que se descubrió la mejora de una respuesta inmunitaria a una fusión recombinante del dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptococica a un receptor de complemento humano tipo 1. La solicitud de patente de los Estados Unidos publicada como US200 /0001827 (Dennis) también divulga el uso de constructos que comprenden ligandos peptídicos, nuevamente identificados mediante tecnología de expresión en fago, que se unen a la seroalbúmina y están conjugados para obtener compuestos bioactivos dirigidos a tumores.

Dominios de unión a albúmina de proteínas receptoras bacterianas La proteina G estreptocócica (SpG) es un receptor bifuncional presente en la superficie de ciertas cepas de estreptococos y es capaz de unirse a IgG y a seroalbúmina (Bjórck et al, Mol Immunol 24:1113, 1987). La estructura es altamente repetitiva con varios dominios estructuralmente y funcionalmente diferentes (Guss et al, EMBO J 5:1567, 1986), más precisamente tres dominios de unión a Ig y tres dominios de unión a seroalbúmina (Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987) . Se ha determinado la estructura de uno de los tres dominios de unión a seroalbúmina en SpG y muestra un pliegue de haz de tres hélices (Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996, Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-20, 2002). Un motivo de 46 aminoácidos se definió como ABD (siglas en inglés para dominio de unión a albúmina) y posteriormente también se ha designado como G148-GA3 (GA por unión a albúmina relacionada con la proteina G) . Por ejemplo, en el documento WO09/016043 se divulgan variantes del motivo ABD de 46 aminoácidos.

También se han identificado otros dominios de unión a albúmina bacterianos distintos de los de la proteina G, algunos de los cuales son estructuralmente similares a los de la proteina G. Son ejemplos de proteínas que contienen dichos dominios de unión a albúmina las proteínas PAB, PPL, MAG y ZAG (Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 2006). Se han llevado a cabo estudios de la estructura y función de dichos dominios de unión a albúmina y han sido divulgados por Johansson y colaboradores (Johansson et al, J Mol Biol 266:859-865, 1997). Adicionalmente, Rozak et al han divulgado la creación de variantes artificiales de G148-GA3, que fueron seleccionadas y estudiadas en relación con la especificidad y estabilidad de diferentes especies (Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 2006), mientras que Jonsson et al desarrollaron variantes artificiales de GÍ48-GA3 con una afinidad muy mejorada por la seroalbúmina humana (Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008) . En algunas variantes se alcanzó una afinidad más alta a costa de una estabilidad térmica reducida .

Además de las proteínas que contienen tres hélices descritas anteriormente, también existen otras proteínas bacterianas no relacionadas que se unen a la albúmina.

ABD e inmunización Recientemente se identificaron experimentalmente algunos epítopos de células T y B dentro de la región de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica de la cepa 148 (G148) (Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003) . Los autores de este estudio estaban interesados en utilizar los epítopos de célula T de G148 en vacunas, es decir, para utilizar la propiedad inmunoestimuladora inherente de la región de unión a albúmina. Goetsch et al adicionalmente descubrieron un epitopo de célula B, es decir, una región unida a anticuerpos después de la inmunización, en la secuencia de G148.

En composiciones farmacéuticas para administración humana no se desea ninguna respuesta inmunitaria. Por consiguiente, el dominio de unión a albúmina de G148 es como tal inapropiado para su uso en dichas composiciones debido a sus propiedades inmunoestimuladoras mencionadas anteriormente .

Descripción Las desventajas y carencias de la técnica anterior se superan o mejoran, en un primer aspecto, mediante un polipéptido de unión a albúmina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de i) LAX3AKX6X7ANXi0 ELDX14YGVS DF YKRLIX26KAKT VEGVEALKX39X40 ILX43X44LP en donde independientemente entre si X3 se selecciona de E, S, Q y C; ?d se selecciona de E, S y C; X se selecciona de A y S; Xxo se selecciona de A, S y R; X14 se selecciona de A, S, C y K; X26 se selecciona de D y E; X39 se- selecciona de D y E; X40 se selecciona de A y E; X43 se selecciona de A y K; X44 se selecciona de A, S y E; L en la posición 45 está presente o ausente; y P en la posición 46 está presente o ausente; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia definida en i) .

El tipo definido anteriormente de polipéptidos relacionados con la secuencia que tienen una afinidad de unión con la albúmina deriva de una secuencia de polipéptidos original común que se pliega en un dominio de haz de tres hélices alfa. Más específicamente, los polipéptidos tales como se describieron anteriormente derivan de una construcción de modelo en base a una estructura de un complejo entre seroalbúmina y el dominio de unión a albúmina G148-GA3 (Lejon efc al, J Biol Chem 279:42924-8, 2004), así como de análisis de las propiedades de unión y estructurales de diversas variantes mutacionales de las secuencia de polipéptidos original común. La secuencia de aminoácidos definida anteriormente i) comprende sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de polipéptidos original que resultan en un tipo de polipéptidos que se espera que se plieguen en un dominio de haz de tres hélices casi idéntico. Aunque la secuencia de polipéptidos original ya comprende una superficie de unión para interacción con albúmina, dicha superficie de unión se modifica mediante algunas de las sustituciones de acuerdo con la definición anterior. Las sustituciones de acuerdo con la definición anterior proporcionan una capacidad de unión a albúmina mejorada en comparación con la secuencia de polipéptidos original .

Los polipéptidos de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto de la divulgación exhiben un conjunto de características que, por ejemplo, los hacen adecuados para su uso como pareja de fusión o conjugación con moléculas terapéuticas para administración humana. Los polipéptidos de unión a albúmina de acuerdo con la presente divulgación demuestran, por ejemplo, en comparación con polipéptidos de unión a albúmina relacionados, tales como el dominio de unión a albúmina G148-GA3 y los polipéptidos de unión a albúmina divulgados en WO09/016043, al menos cinco de las seis características siguientes: • Los polipéptidos exhiben una superficie diferente comparada, por ejemplo, con G148-GA3 y otros dominios de unión a albúmina derivados de bacterias. La diferencia puede disminuir o eliminar cualquier riesgo de reacción de anticuerpos en un sujeto, tal como un humano, que previamente ha sido expuesto a dichas proteínas bacterianas.

• Los polipéptidos comprenden menos epítopos de células T potenciales que, por ejemplo, G148-GA3 y otras variantes mutacionales relacionadas pero diferentes de la secuencia de polipéptidos original común y, por lo tanto, exhiben inmunogenicidad baja cuando se administran a un sujeto, tal como un humano.

• Los polipéptidos exhiben una reactividad más baja con anticuerpos en circulación cuando se administran a un sujeto, tal como un humano. Por consiguiente, mediante las sustituciones de aminoácidos en la superficie de los polipéptidos expuestos a los anticuerpos en circulación, es decir, en la superficie de los polipéptidos que no participan en la interacción de unión con la albúmina, la reactividad cruzada a los anticuerpos se reduce en comparación, por ejemplo, con la reactividad cruzada provocada por G148-GA3 tal como se mide en un equipo de prueba de suero humano.

• Los polipéptidos tienen una capacidad de unión a albúmina alta, en términos de una afinidad de unión más alta, tal como se define mediante un valor KD, y en términos de una tasa de disociación más lenta, tal como se define mediante un valor k0ff, que, por ejemplo, los polipéptidos de unión a albúmina de origen natural conocidos, tales como los dominios de unión a albúmina derivados de proteínas bacterianas. • Los polipéptidos comprenden menos residuos de aminoácidos que se asocian con problemas de estabilidad de los polipéptidos que, por ejemplo, los polipéptidos de unión a albúmina de origen natural conocidos, tales como los dominios de unión a albúmina derivados de proteínas bacterianas. Por consiguiente, los polipéptidos no comprenden, por ejemplo, metioninas ni triptófanos propensos a la oxidación y solo una asparagina.

• Los polipéptidos tienen una estabilidad estructural más alta, tal como se define mediante un punto de fusión por encima de 55°C, que los polipéptidos de unión a albúmina anteriores, tales como los divulgados en WO09/016043.

En una realización, los polipéptidos de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto exhiben las seis características indicadas anteriormente. En otra realización, el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto exhibe, cuando se une a la albúmina, un perfil más hidrófilo que, por ejemplo, los polipéptidos de unión a albúmina anteriores, tales como los divulgados en O09/016043. La superficie del polipéptido de unión a albúmina que se expone al ambiente cuando el polipéptido interactúa con la albúmina comprende menos residuos de aminoácidos que confieren hidrofobicidad superficial.

Tal como será evidente para un experto, la función de cualquier polipéptido, tal como la capacidad de unión a albúmina de los polipéptidos de acuerdo con el primer aspecto, depende de la estructura terciaria del polipéptido. Sin embargo, es posible hacer cambios en la secuencia de aminoácidos en un polipéptido -helicoidal sin afectar la estructura del mismo (Taverna y Goldstein, J Mol Biol 315 (3) : 79-84, 2002; He et al, Proc Nati Acad Sci USA 105 (38) : 14412-17, 2008). Por consiguiente, las variantes modificadas de i), que son tales que la secuencia resultante es al menos 95% idéntica a la secuencia que pertenece al tipo definido en i), también están abarcadas en el primer aspecto. Por ejemplo, es posible que un residuo de aminoácido que pertenece a un determinado grupo funcional de residuos de aminoácidos (por ejemplo, hidrófobo, hidrófilo, polar, etc.) pueda intercambiarse por otro residuo de aminoácido del mismo grupo funcional.

La expresión "% idéntico" o "% de identidad", tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se calcula de la siguiente forma. La secuencia de consulta se alinea con la secuencia objetivo utilizando el algoritmo CLUSTAL W (Thompson, J.D., Higgins, D.G. y Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). Se lleva a cabo una comparación con la ventana correspondiente a la más corta de las secuencias alineadas. En algunos casos, la más corta de las secuencias alineadas puede ser la secuencia objetivo, tal como el polipéptido de unión a albúmina divulgado en la presente. En otros casos, la secuencia de consulta puede ser la más corta de las secuencias alineadas. La secuencia de consulta, por ejemplo, puede consistir en al menos 10 residuos de aminoácidos, tales como al menos 20 residuos de aminoácidos, tales como al menos 30 residuos de aminoácidos, tales como al menos 40 residuos de aminoácidos, por ejemplo, 45 residuos de aminoácidos. Los residuos de aminoácidos en dicha posición se comparan y el porcentaje de posiciones en la secuencia de consulta que tienen correspondencias idénticas en la secuencia objetivo se indican como el % de identidad.

En una realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto, Xe es E.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X3 es S.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X3 es E.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X7 es A.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X14 es S.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, Xi4 es C.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X10 es A.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, Xio es S.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X26 es D.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo .con este aspecto, X26 es E.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X39 es D.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X39 es E.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X 0 es A.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X43 es A.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X44 es A.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, X44 es S.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, el residuo L en la posición 45 está presente.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, el residuo P en la posición 46 está presente.

En otra realización del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto, el residuo P en la posición 46 está ausente.

En otra realización, el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto depende de la condición de que X7 no es L, E ni D.

El polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto puede prepararse para conjugación con una pareja de conjugación adecuada mediante el reemplazo de los residuos de aminoácidos expuestos en la superficie, por ejemplo, por una cisteina o una lisina. Estos reemplazos pueden introducirse en la hélice del extremo N terminal, es decir, la hélice uno del polipéptido, que es la hélice que está más alejada de la seroalbúmina cuando el polipéptido de unión a albúmina se une a la seroalbúmina. Por consiguiente, un residuo de lisina en la posición X1 de la secuencia definida en i) puede usarse para posibilitar la conjugación dirigida. Adicionalmente, esto puede ser ventajoso cuando la molécula se produce mediante síntesis química de péptidos, ya que puede utilizarse la protección ortogonal del grupo épsilon-amino de dicha lisina. Además, se puede introducir un residuo de cisteina en la secuencia de aminoácidos para posibilitar la conjugación dirigida. Por ejemplo, se puede introducir un residuo de cisteina en cualquiera de las posiciones X3, y/o X1 de acuerdo con ' la definición anterior.

El acoplamiento de una pareja de conjugación a la épsilon-amina de una lisina o al grupo tiol de una cisteina representa dos alternativas químicamente diferentes para obtener una conjugación dirigida utilizando un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos i) . Como comprenderá el experto, existen otras alternativas químicas para preparar una secuencia de aminoácidos para conjugación y como tales también están dentro del alcance de la presente divulgación. Un ejemplo de dicha química es la química similar a clic que se posibilita por la introducción de una tirosina tal como lo presentaron Ban et al (J Am Chem Soc 132: 1523-5, 2009) .

Las expresiones "de unión a albúmina" y "afinidad de unión con albúmina", tal como se usan en la presente memoria descriptiva, se refieren a una propiedad de un polipéptido que puede evaluarse, por ejemplo, mediante el uso de tecnología de resonancia de plasmones superficiales, tal como en un instrumento Biacore. Por ejemplo, tal como se describe en los ejemplos más adelante, la afinidad de unión a albúmina puede evaluarse en un experimento en el que la albúmina o un fragmento de la misma se inmoviliza sobre un chip sensor del instrumento y la muestra que contiene el polipéptido que va a evaluarse se pasa sobre el chip. Alternativamente, el polipéptido que va a evaluarse se inmoviliza sobre un chip sensor del instrumento y una muestra que contiene albúmina o un fragmento de la misma se pasa sobre el chip. En este sentido, la albúmina puede ser una seroalbúmina de un mamífero, tal como seroalbúmina humana. El experto a continuación puede interpretar los resultados obtenidos en dichos experimentos para establecer al menos una medición cualitativa de la afinidad de unión del polipéptido con la albúmina. Si se desea una medición cuantitativa, por ejemplo para determinar un valor KD para la interacción, también se pueden utilizar métodos de resonancia de plasmones superficiales. Los valores de unión pueden definirse, por ejemplo, en un instrumento Biacore2000 (GE Healthcare) . La albúmina se inmoviliza adecuadamente sobre un chip sensor de medición y se preparan las muestras del polipéptido cuya afinidad se va a determinar mediante dilución en serie e inyección. A continuación se pueden calcular los valores KD a partir de los resultados utilizando, por ejemplo, el modelo de unión 1:1 Langmuir del programa informático BIAevaluation 4.1 proporcionado por el fabricante del instrumento (GE Healthcare) .

En una realización, el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto se une a la albúmina de forma que el valor koff de la interacción es a lo sumo 5 x 10~5 s_1, tal como a lo sumo 5 x 10"6 s"1.

Tal como se describió anteriormente, los polipéptidos de unión a albúmina, tales como se definieron mediante la secuencia de aminoácidos i) derivan de una secuencia de polipéptidos original común que se pliega en un dominio de haz de tres hélices alfa. En una realización, el dominio de tres hélices de esta secuencia de polipéptidos original forma parte de la proteina G de la cepa G148 de Streptococcus, específicamente el dominio GA3.

En otra realización, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de unión a albúmina se selecciona de cualquiera de SEQ ID NO: 1-144 y SEQ ID NO: 164-203, tal como seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO: 1-144. Más específicamente, la secuencia de aminoácidos se selecciona de SEQ ID NO: 4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42, SEQ ID NO:49-50, SEQ ID NO:164-170 y SEQ ID NO: 192-203. Por consiguiente, la secuencia de aminoácidos puede seleccionarse de SEQ ID NO: 4-5, SEQ ID NO: 7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO.16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42 y SEQ ID NO:49-50.

En una realización, el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto además comprende uno o más residuos de aminoácidos adicionales posicionados en el extremo N y/o C terminal de la secuencia definida en i) . Estos residuos de aminoácidos adicionales pueden tener un rol en la mejora de la unión a la albúmina por parte del polipéptido y en la mejora de la estabilidad conformacional del dominio de unión a albúmina plegado, pero pueden servir a otros fines de igual forma, relacionados, por ejemplo, con uno o más de producción, purificación, estabilización in vivo o in vitro, acoplamiento, etiquetado o detección del polipéptido, asi como cualquier combinación de los mismos. Dichos residuos de aminoácidos adicionales pueden comprender uno o más residuos de aminoácidos para producir un acoplamiento químico, por ejemplo, a una resina cromatográfica para obtener una matriz de afinidad o a un resto quelante para formar un complejo con un radiometal.

Por consiguiente, los aminoácidos que directamente preceden o están a continuación de la hélice alfa en el extremo N o C terminal de la secuencia de aminoácidos i) en una realización pueden afectar la estabilidad conformacional . Un ejemplo de un residuo de aminoácido que puede contribuir a mejorar la estabilidad conformacional es un residuo de serina posicionado en el extremo N terminal de la secuencia de aminoácidos i) tal como se definió anteriormente. El residuo de serina del extremo N terminal en algunos casos puede formar una caja de cubierta S-X-X-E canónica, que implica la unión de hidrógeno entre el oxigeno gamma de la cadena lateral de serina y el NH del esqueleto del polipéptido del residuo de ácido glutámico. Esta cubierta en el extremo N terminal puede contribuir con la estabilización de la primera hélice alfa del dominio de tres hélices que constituye el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto de la divulgación.

Por consiguiente, en una realización, los aminoácidos adicionales comprenden al menos un residuo de serina en el extremo N terminal del polipéptido. En otras palabras, la secuencia de aminoácidos está precedida por uno o más residuos de serina. En otra realización del polipéptido de unión a albúmina, los aminoácidos adicionales comprenden un residuo de glicina en el extremo N terminal del polipéptido. Se comprenderá que la secuencia de aminoácidos i) puede estar precedida por uno, dos, tres, cuatro o cualquier cantidad adecuada de residuos de aminoácidos. Por consiguiente, la secuencia de aminoácidos puede estar precedida por un único residuo de serina, un único residuo de glicina o una combinación de los dos, tal como una combinación glicina-serina (GS) o una combinación glicina-serina-serina (GSS) . Se indican ejemplos de polipéptidos de unión a albúmina que comprenden residuos de aminoácidos adicionales en el extremo N terminal en SEQ ID NO: 145-163, tales como en SEQ ID NO: 145-148 y SEQ ID NO: 162-163. En otra realización, los residuos de aminoácidos adicionales comprenden un ácido glutámico en el extremo N terminal del polipéptido tal como se define mediante la secuencia i) .

De forma similar, la cubierta del extremo C terminal puede aprovecharse para mejorar la estabilidad de la tercera hélice alfa del dominio de tres hélices que constituye el polipéptido de unión a albúmina. Un residuo de prolina, cuando está presente en el extremo C terminal de la secuencia de aminoácidos definida en i) , puede funcionar al menos parcialmente como un residuo de cubierta. En tal caso, un residuo de lisina a continuación del residuo de prolina en el extremo C terminal puede contribuir a estabilizar adicionalmente la tercera hélice del polipéptido de unión a albúmina, mediante unión de hidrógeno entre el grupo épsilon amino del residuo de lisina y los grupos carbonilo de los aminoácidos ubicados dos y tres residuos antes de la lisina en el esqueleto del polipéptido, por ejemplo, cuando L45 y P46 están presentes, los grupos carbonilo de los residuos de leucina y alanina de la secuencia de aminoácidos definida en i) . Por consiguiente, en una realización, los aminoácidos adicionales comprenden un residuo de lisina en el extremo C terminal del polipéptido.

Tal como se trató anteriormente, los aminoácidos adicionales pueden estar relacionados con la producción del polipéptido de unión a albúmina. En particular, cuando se produce un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con una realización en el que P46 está presente mediante síntesis química de péptidos, uno o más residuos de aminoácidos opcionales a continuación de la prolina en el extremo C terminal pueden proporcionar ventajas. Dichos residuos de aminoácidos adicionales, por ejemplo, pueden evitar la formación de sustancias indeseadas, tales como dicetopiperazina en la etapa de dipéptido de la síntesis. Un ejemplo de dicho residuo de aminoácido es glicina. Por consiguiente, en una realización, los aminoácidos adicionales comprenden un residuo de glicina en el extremo C terminal del polipéptido, directamente a continuación del residuo de prolina o a continuación de un residuo de lisina y/o glicina adicional tal como se indicó anteriormente. Alternativamente, la producción de polipéptidos puede beneficiarse de la amidación del residuo de prolina en el extremo C terminal de la secuencia de aminoácidos i), cuando está presente. En este caso, la prolina del extremo C terminal comprende un grupo amina adicional en el carbono carboxílico. En una realización de los polipéptidos descritos en la presente, específicamente aquellos finalizados en su extremo C terminal con prolina u otro aminoácido conocido por racemizarse durante la síntesis de péptidos, la adición mencionada anteriormente de una glicina en el extremo C terminal o la amidación de la prolina, cuando está presente, también puede contrarrestar problemas potenciales con la racemización del residuo de aminoácidos del extremo C terminal. Si se pretende que el polipéptido, amidado de esta forma, se produzca por medios recombinantes, en lugar utilizar síntesis química, la amidación del aminoácido del extremo C terminal puede llevarse a cabo mediante varios métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, a través del uso de enzima PAM de amidación .

Se indican ejemplos de polipéptidos de unión a albúmina que comprenden residuos de aminoácidos adicionales en el extremo C terminal en SEQ ID NO: 145-152, tales como en SEQ ID NO: 148-150. El experto conoce los métodos para lograr la modificación del extremo C terminal, tales como mediante diferentes tipos de matrices prefabricadas para síntesis de péptidos .

En otra realización, los residuos de aminoácidos adicionales comprenden un residuo de cisteína en el extremo N y/o C terminal del polipéptido. Dicho residuo de cisteína puede preceder directamente y/o estar a continuación de la secuencia de aminoácidos definida en i) o puede preceder y/o estar a continuación de cualquier otro residuo de aminoácido adicional tal como se describió anteriormente. Se indican ejemplos de polipéptidos de unión a albúmina que comprenden un residuo de cisteína en el extremo N y/o C terminal de la cadena polipeptídica en SEQ ID NO: 149-150 (extremo C terminal) y SEQ ID NO: 151-152 (extremo N terminal) . Mediante la adición de un residuo de cisteina en la cadena polipeptidica, se puede obtener un grupo tiol para conjugación dirigida del polipéptido de unión a albúmina. Alternativamente, se puede introducir un residuo de selenocisteina en el extremo C terminal de la cadena polipeptidica, de forma similar que para la introducción de un residuo de cisteina para facilitar la conjugación especifica de sitio (Cheng et al, Nat Prot 1:2, 2006) .

En una realización, el polipéptido de unión a albúmina comprende no más de dos residuos de cisteina. En otra realización, el polipéptido de unión a albúmina comprende no más de un residuo de cisteina.

En otra realización, los residuos de aminoácidos adicionales del polipéptido de unión a albúmina comprenden un "rótulo" para purificación o detección del polipéptido, tal como una etiqueta de, hexahistidilo (??ßß) o un rótulo "myc" ("c-Myc" ) o un rótulo "FLAG" para interacción con anticuerpos específicos para el rótulo y/o para usar en la purificación. El experto conoce otras alternativas.

En otra realización adicional, el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con este aspecto se une a seroalbúmina humana. En otras realizaciones, el polipéptido de unión a albúmina se une a albúmina de otras especies distintas a la especie humana, tal como albúmina de ratón, rata, perro y monos cangrejeros.

Los "residuos de aminoácidos adicionales" descritos anteriormente también pueden constituir uno o más dominios polipeptidicos con cualquier función deseada, tal como la misma función de unión que el primer dominio de unión a albúmina u otra función de unión, o una función terapéutica o una función enzimática o una función fluorescente o mezclas de las mismas.

Por consiguiente, en otro aspecto relacionado, se proporciona una proteina o conjugado de fusión que comprende i) un primer resto que consiste en un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto descrito en la presente; y ii) un segundo resto que consiste en un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada.

Un proteina o conjugado de fusión que comprende un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto de la divulgación y un segundo resto pueden aumentar la semivida in vitro y/o in vivo del segundo resto, en comparación con la semivida in vivo del segundo resto per se. En consecuencia, cuando una proteina o conjugado de fusión de acuerdo con este aspecto se administra a un sujeto, tal como un sujeto humano, la exposición in vivo al segundo resto puede aumentar, lo cual puede conducir a una potencia mejorada de la actividad biológica del segundo resto, en comparación con la potencia de la exposición in vivo al segundo resto cuando se administra solo.

La actividad biológica deseada puede ser, por ejemplo, una actividad terapéutica, una actividad de unión o una actividad enzimática. Cuando la actividad biológica deseada es una actividad terapéutica, el segundo resto que exhibe esta actividad puede ser un polipéptido terapéuticamente activo. Las biomoléculas son ejemplo no taxativos de polipéptidos terapéuticamente activos, tales como moléculas seleccionadas del grupo que consiste en enzimas, hormonas, factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas y linfocinas endógenas humanas y proteínas biológicamente activas no humanas, tales como proteínas seleccionadas del grupo que consiste en toxinas bacterianas (por ejemplo, exotoxina de pseudomonas y superantígenos estafilocócicos y estreptocócicos) , enzimas (por ejemplo, RNasa y beta-lactamasa) y proteínas de activación (por ejemplo, estreptocinasa) . Se seleccionan ejemplos no taxativos de biomoléculas terapéuticamente activas que pueden ser útiles en una fusión o conjugado con el polipéptido de unión a albúmina del grupo que consiste en IL-2, GLP-1, BNP (péptido Alb-beta-natriurético) , IL-l-RA (antagonista del receptor de interleucina-1 ) , KGF (factor de crecimiento de los queratinocitos ) , Stemgen®, hormona de crecimiento (GH) , G-CSF, CTLA-4, miostatina, Factor VII, Factor VIII y Factor IX.

Los vasos sanguíneos con defecto rezumante del tejido tumoral hacen que su vasculatura (barrera endotelial) sea permeable a macromoléculas, mientras que en vasos sanguíneos de tejidos sanos solo pueden pasar pequeñas moléculas a través de la barrera endotelial. De la misma forma, la permeabilidad de la barrera sangre-articulación para la albúmina en articulaciones inflamadas de pacientes que padecen artritis reumatoide aumenta considerablemente. Por consiguiente, es probable que las proteínas o conjugados de fusión de acuerdo con este aspecto permeen los vasos sanguíneos en el tejido tumoral y la barrera sangre-articulación en articulaciones inflamadas.

Cuando dicha actividad biológica deseada del segundo resto es una actividad de unión, dicho segundo resto puede ser un polipéptido de unión capaz de una interacción selectiva con una molécula objetivo. Dicho polipéptido de unión puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en anticuerpos y fragmentos y dominios de los mismos conservando sustancialmente la actividad de unión del anticuerpo; microcuerpos, maxicuerpos, avímeros y otras proteínas pequeñas unidas por disulfuro; y proteínas de unión derivadas de un andamiaje seleccionado del grupo que consiste en proteíña A estafilocócica y dominios de la misma, otros dominios de tres hélices, lipocalinas, dominios de repetición de anquirina, dominios de unión a celulosa, ? cristalinas, proteína verde fluorescente, antígeno 4 asociado a linfocito T citotóxico humano, inhibidores de proteasa tales como dominios Kunitz, dominios PDZ, dominios SH3, aptámeros peptídicos, nucleasa estafilocócica, tendamistatos , dominio de fibronectina tipo III, transferrina, dedos de zinc y conotoxinas .

En algunas realizaciones, la molécula objetivo para la unión de dicho polipéptido de unión objetivo puede seleccionarse del grupo que consiste en péptido ß amiloide (?ß) de la enfermedad de Alzheimer; otros péptidos amiloides asociados con enfermedades; toxinas, tales como toxinas bacterianas y venenos de serpiente; factores de coagulación sanguínea, tales como el factor de von Willebrand; interleucinas, tales como IL-13; miostatina; factores proinflamatorios, tales como TNF-a, receptor de TNF- , IL-1, IL-8 e il-23; factores de complemento, tales como C3 y C5; mediadores de hipersensibilidad, tales como histamina e IgE; antígenos relacionados con tumores, tales como CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD52, CD70, c et, HERI, HER2, HER3, HER4, CAIX (anhidrasa carbónica IX), CEA, receptor de IL-2, MUC1, PSMA, TAG-72; y otras moléculas biológicas tales como G-CSF, GM-CSF, hormona de crecimiento (GH) , insulina y somatostatina .

Como comprenderá un experto, el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto puede ser útil en una proteina de fusión o como pareja de conjugación con cualquier otro resto. Por lo tanto, las listas anteriores de polipéptidos terapéuticamente activos, polipéptidos de unión y moléculas objetivo no deben interpretarse como limitantes en ningún sentido.

En una realización de una proteina o conjugado de fusión de acuerdo con la presente divulgación, el segundo resto se conjuga con el polipéptido de unión a albúmina a través de un residuo de lisina o cisteina agregado al extremo N o C terminal del polipéptido de unión a albúmina o a través de un residuo de lisina o cisteina en una posición dentro del polipéptido de unión a albúmina, tal como en la posición seleccionada de X3, Xe y X14. Si el sitio de conjugación es uno dentro de la secuencia de aminoácidos i) del polipéptido de unión a albúmina, tal como una cisteina en la posición X14, no es necesario agregar aminoácidos adicionales al polipéptido de unión a albúmina a efectos de posibilitar la conjugación con el segundo resto. Un sitio de conjugación dentro de la cadena polipeptidica tal como se definió en i) puede proteger adicionalmente el polipéptido contra anticuerpos de reacción cruzada, en particular la porción del polipéptido cercana al sitio de conjugación. Sin ánimo de ceñirse a ninguna teoría, cuando el conjugado a través del polipéptido de unión a albúmina se une a la seroalbúmina in vivo, es decir, ubicado en el punto de unión de la seroalbúmina, es probable que el segundo resto, conjugado en una posición dentro de, por ejemplo, la hélice uno del dominio de tres hélices que constituye el polipéptido de unión a albúmina, apunte hacia afuera de la seroalbúmina a la cual está unido el polipéptido de unión a albúmina. Adicionalmente, un sitio de conjugación dentro del polipéptido de unión a albúmina puede afectar la presentación de la porción de los péptidos derivados de otra forma de esta porción del polipéptido a células T debido a, por ejemplo, efectos en el procesamiento en la célula de presentación de antigeno, ajuste deteriorado de péptidos potenciales en el surco de unión peptidica de la molécula MCH tipo II y superficie peptidica remodelada disponible para el receptor de célula T (debido a la protrusión de la porción conjugada) . Por consiguiente, se espera que la inmunogenicidad de la porción conjugada cerca del sitio de conjugación se reduzca adicionalmente después de la conjugación.

Debido a la alta afinidad entre el polipéptido de unión a albúmina de la presente divulgación y la seroalbúmina, un conjugado o proteina de fusión que comprende dicho polipéptido de unión a albúmina podría considerarse un complejo indirecto con seroalbúmina. Por consiguiente, un conjugado o una proteína de fusión de acuerdo con la presente divulgación, proporciona una alternativa al método usado frecuentemente para aprovechar conjugados o fusiones directas con seroalbúmina . Dichos conjugados directos con seroalbúmina son frecuentemente no homogéneos, independientemente del método usado para el acoplamiento. Cuando una molécula especifica se acopla a la seroalbúmina a través de un grupo amino de un residuo de lisina, se puede dirigir a cualquiera de una gran cantidad de Usinas sobre la superficie de la molécula de seroalbúmina, lo cual proporciona un sitio de conjugación aleatorio y un producto aleatorio. Aunque el acoplamiento de tiol a través de la única cisteina no apareada en la seroalbúmina humana (en la posición 34, Peters, 1985, supra) parece ofrecer un método alternativo para obtener un conjugado directo, dicha metodología generalmente no conduce a un producto homogéneo. Solo 20-60% de las moléculas en la seroalbúmina (humana) disponible en el mercado exhibe un grupo tiol libre, mientras que el resto están bloqueadas por compuestos de tiol tales como cisterna, homocisteína o glutatión. En cambio, la conjugación con el dominio de tres hélices del polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con la presente divulgación puede llevarse a cabo específicamente para un sitio. Esto puede lograrse, tal como se trató anteriormente, acoplándolo a una o más cisteínas, a una selenocisteína o a una lisina designada (protegida ortogonalmente durante la síntesis) .

De acuerdo con este aspecto de la presente divulgación, el segundo resto que tiene una actividad biológica deseada puede conjugarse con el dominio de tres hélices del polipéptido de unión a albúmina o producirse como una proteina de fusión con el mismo. Un ejemplo no taxativo de un conjugado de acuerdo con la presente divulgación se proporciona a continuación. El péptido similar a glucagón 1 (GLP-1), o un derivado del mismo, es un pequeño polipéptido que puede estar presente de forma apropiada como un segundo resto en un conjugado con el polipéptido de unión a albúmina. La conjugación de GLP-1 con el polipéptido de unión a albúmina puede llevarse a cabo en cualquiera de las posiciones de la secuencia polipeptidica tal como se describió anteriormente. El conjugado puede producirse como tal en un proceso no biológico y se espera que exhiba una potencia considerablemente mejorada en comparación con la potencia de GLP-1 per se. La conjugación puede emplearse con polipéptidos o proteínas pequeños, tales como GLP-1 o con polipéptidos o proteínas más grandes. Un conjugado de acuerdo con la presente divulgación típicamente puede comprender un resto espaciador no aminoácido, tal como polietilenglicol (PEG) .

Otros polipéptidos o proteínas pueden combinarse con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de unión a albúmina en forma de una proteína de fusión. Dicha proteína de fusión puede comprender adicionalmente uno o más residuos de aminoácidos espaciadores entre el primer y segundo resto.

Tal como se describió anteriormente, el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto se une a la seroalbúmina de varias especies, incluidos ratón, rata, perro y monos cangrejeros. Por consiguiente, una proteina de fusión o conjugado de acuerdo con la presente divulgación puede contribuir a mejorar el efecto biológico de un segundo resto, no solo en un sujeto humano, sino también en modelos animales. Se han producido varias proteínas endógenas como fusiones directas con seroalbúmina humana, ejemplos de dichas proteínas incluyen G-CSF, GH, interferones , CD4, IL-2, insulina, glucagón, GLP-1, fragmentos Fab de anticuerpo e inhibidores de proteasea como proteínas derivadas del dominio Kunitz. Dichas fusiones directas sin embargo pueden no evaluarse completamente en modelos animales. Esto se debe al hecho de que la seroalbúmina humana no interactúa adecuadamente con el receptor Fe neonatal endógeno (FcRn), por ejemplo, en los modelos animales usados comúnmente de ratón y rata y que esta interacción es un factor importante que contribuye con el largo tiempo de circulación de la seroalbúmina. Tal como se describió anteriormente, un conjugado o una proteína de fusión de acuerdo con la presente divulgación, en presencia de seroalbúmina, puede combinarse con albúmina y funcionar como una fusión indirecta con albúmina. Esto hace que un conjugado o a una proteina de fusión que comprende un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto sea útil en especies de modelo preclínico, siempre que el segundo resto sea biológicamente activo en las especies seleccionadas.

En una realización, se proporciona una proteina de fusión o conjugado que comprende un resto adicional que consiste en un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada adicional, que puede ser igual o diferente a la del segundo resto. Un ejemplo especifico de dicha proteina de fusión o conjugado comprende un polipéptido terapéuticamente activo tal como se definió anteriormente como segundo resto y un polipéptido de unión tal como se definió anteriormente como resto adicional.

Con respecto a la descripción anterior de las proteínas de fusión o conjugados que incorporan un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto, cabe destacar que la designación de primer, segundo y resto adicional se hace a efectos de hacer una clara distinción entre el polipéptido de unión a albúmina o polipéptidos de acuerdo con la presente divulgación por un lado y los restos que exhiben otra función por otro. No se pretende que estas designaciones se refieran al orden real de los diferentes dominios en la cadena polipeptídica de la proteína de fusión o conjugado. Por consiguiente, por ejemplo, dicho primer resto puede, sin limitación, aparecer en el extremo N terminal, en el medio o en el extremo C terminal de la proteina de fusión o con ugado.

En un aspecto relacionado, se proporciona un polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado tal como se define en la presente divulgación, que comprende además una molécula orgánica, tal como un agente citotóxico. Se seleccionan ejemplos no taxativos de agentes citotóxicos que pueden fusionarse o conjugarse con un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto o combinarse con una proteina de fusión o conjugado de acuerdo con el segundo aspecto, de caliqueamicina, auristatina, doxorrubicina, maitansinoide, taxol, ecteinascidina, geldanamicina, metotrexato y sus derivados y combinaciones de los mismos. Anteriormente se hicieron intentos de tratar varios trastornos con conjugados de albúmina directos. Dichos conjugados de albúmina directos se utilizaron, por ejemplo, con doxorrubicina en cáncer (Kratz et al, J Med Chem 45: 5523-33, 2002) y metotrexato en la artritis reumatoide (Wunder et al, J Immunol 170:4793-4801, 2003). Se entenderá que el polipéptido de unión a albúmina, ya sea solo o como un resto en una proteina de fusión o conjugado, por su alta capacidad de unión a albúmina proporciona medios indirectos para construir complejos de albúmina y, por consiguiente, puede proporcionar un método de tratamiento alternativo con respecto a los intentos mencionados anteriormente.

Los aspectos anteriores además abarcan polipéptidos en los que el polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto o el polipéptido de unión a albúmina comprendido en una proteina de fusión o conjugado de acuerdo con el segundo aspecto, se proporcionó con un grupo etiqueta, tal como una etiqueta seleccionada del grupo que consiste en tintes fluorescentes y metales, tintes cromofóricos , compuesto quimioluminescentes y proteínas bioluminescentes , enzimas, radionúclidos y partículas, por ejemplo, a efectos de detectar el polipéptido. En particular, la divulgación abarca un polipéptido radioetiquetado que consiste en un radioquelado de un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado tales como se describen en la presente y un radionúclido, tal como un metal radioactivo.

En realizaciones donde el polipéptido de unión a albúmina etiquetado comprende un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con el primer aspecto de la divulgación y una etiqueta, el polipéptido etiquetado puede, por ejemplo, utilizarse para etiquetar la seroalbúmina indirectamente. Debido a la fuerte asociación entre el polipéptido etiquetado y la seroalbúmina, el polipéptido etiquetado puede utilizarse, por ejemplo, para estudiar la permeabilidad vascular y la acumulación sanguínea.

En otras realizaciones, el polipéptido de unión a albúmina etiquetado está presente como un resto en una proteina de fusión o conjugado que comprende también un segundo resto que tiene una actividad biológica deseada. La etiqueta, en algunos casos, puede estar acoplada solo al polipéptido de unión a albúmina y, en algunos casos, al polipéptido de unión a albúmina y al segundo resto del conjugado o proteina de fusión. Cuando se hace referencia a un polipéptido etiquetado, deberá entenderse como una referencia a todos los aspectos de polipéptidos tales como se describen en la presente, incluidas proteínas de fusión y conjugados que comprenden un polipéptido de unión a albúmina y un segundo y opcionalmente restos adicionales. Por consiguiente, un polipéptido etiquetado puede contener solo el polipéptido de unión a albúmina y, por ejemplo, un radionúclido terapéutico, que puede quelarse o acoplarse covalentemente al polipéptido de unión a albúmina o puede contener el polipéptido de unión a albúmina, un radionúclido terapéutico y un segundo resto tal como una molécula pequeña que tiene una actividad biológica deseada tal como eficacia terapéutica .

En realizaciones donde el polipéptido de unión a albúmina, la proteína de fusión o conjugado se radioetiqueta, dicho polipéptido radioetiquetado puede comprender un radionúclido. La mayoría de los radionúclidos tienen origen metálico y los metales típicamente son incapaces de formar enlaces covalentes estables con elementes presentes en proteínas y péptidos. Por este motivo, el etiquetado de proteínas y péptidos con metales radioactivos se lleva a cabo con el uso de quelantes, es decir, ligandos multidentados , que forman compuestos no covalentes, denominados quelatos, con los iones metálicos. En una realización del polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado, la incorporación de un radionúclido se posibilita a través del suministro de un ambiente quelante, a través del cual el radionúclido puede coordinarse, quelarse o formar un complejo con el polipéptido.

Un ejemplo de un quelante es el quelante de tipo poliaminopolicarboxilato . Se pueden distinguir dos tipos de dichos quelantes de poliaminopolicarboxilato: quelantes macrocíclicos y acíclicos. En una realización, el polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado comprende un ambiente quelante proporcionado por un quelante de poliaminopolicarboxilato conjugado con el polipéptido de unión a albúmina a través de un grupo tiol de un residuo de cisteína o un grupo épsilon-amina de un residuo de lisina.

Los quelantes macrocíclicos más comúnmente usados para radioisótopos de indio, galio, itrio, bismuto, radioactinidas y radiolantanidas son diferentes derivados de DOTA (ácido 1, 4, 7, 10-tetraazaciclododecano-l, 4, 7, 10-tetraacético) . En una realización, el ambiente quelante del polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado es proporcionado por DOTA o un derivado del mismo. Más específicamente, un grupo de polipéptidos quelantes abarcados en la presente divulgación se produce haciendo reaccionar el derivado de DOTA 10-maleimidoetilacetamida de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1 , 4,7-tris-acético (maleimidomonoamida-DOTA) con, por ejemplo, un grupo tiol del polipéptido de unión a albúmina, por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo 5.

La alta inactividad cinética, es decir, la tasa de disociación lenta entre el metal y DOTA, favorece la conexión estable de un radionúclido . Sin embargo, se necesitan temperaturas elevadas para el etiquetado debido a una tasa de asociación lenta. Por este motivo, los derivados de DOTA se usan ampliamente para etiquetar péptidos cortos, tales como el polipéptido de unión a albúmina de la presente divulgación, que exhiben una funcionalidad de unión tras incubarse a temperaturas necesarias para la reacción de etiquetado .

Los quelantes de poliaminopolicarboxilato acíclicos más comúnmente usados son diferentes derivados de DTPA (ácido dietilenotriaminapentaacético) . Por lo tanto, los polipéptidos que tienen un ambiente quelante proporcionado por ácido dietilenotriaminapentaacético o derivados del mismo también se abarcan en la presente divulgación.

Se descubrió que variantes semirrígidas con esqueleto modificado de DTPA proporcionan una estabilidad adecuada para el etiquetado con 90Y de, por ejemplo, Zevalin®. Aunque los quelantes acíclicos son menos inertes y, en consecuencia, menos estables que los macrocíclicos, su etiquetado es suficientemente rápido incluso a temperatura ambiente. Por este motivo, se podrían usar para etiquetar proteínas de fusión o conjugados de acuerdo con la presente divulgación. Se han publicado protocolos detallados para acoplar quelantes de poliaminopolicarboxilato con proteínas y péptidos objetivos por Cooper et al (Nat Prot 1: 314-7, 2006) y por Sosabowski y Mather (Nat Prot 1:972-6, 2006).

Un polipéptido de unión a albúmina, una proteína de fusión o conjugado de acuerdo con los aspectos descritos en la presente acoplado a un quelante de poliaminopolicarboxilato puede usarse para proporcionar un polipéptido radioetiquetado que consiste en un radioquelato del polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado acoplado al quelante y un radionúclido adecuado para la obtención de imágenes médicas, seleccionándose el radionúclido del grupo que consiste en 61Cu, 64Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 110mIn, inIn, 44Sc y 86Y o con un radionúclido adecuada para terapia, seleccionándose el radionúclido del grupo que consis„jt-e ^ e ^„n 225A,,c^,, 212DBij, 213,B-,i·, 67^C, ,u,, 1 S6HU ^o, 177TL,u,, 212 nPb, 149 nP„m, Sm, Th y Y, en donde el radionuclido forma un complejo con el polipéptido de unión a albúmina a través de un quelante .

En realizaciones del mismo, el polipéptido también puede radioetiquetarse con radioisótopos no metálicos usando el denominado etiquetado indirecto. Por consiguiente, para el etiquetado con, por ejemplo, 18F, 76Br, diferentes isótopos de yodo y 211At, se utilizan "moléculas conectoras" intermediarias para el etiquetado. Dicha molécula conectora debe contener dos restos funcionales: uno que proporciona un radioetiquetado rápido y eficaz y otro que permite un acoplamiento rápido y eficaz con las proteínas, por ejemplo, con los grupos amina o preferiblemente con el grupo tiol de una única cisteína, tal como en la posición X14 del polipéptido de unión a albúmina. Por ejemplo, un grupo malemida hace reacción con los grupos tiol para formar un enlace tioéter estable. La "molécula conectora" primero puede hacerse reaccionar con la radioetiqueta y posteriormente con el grupo tiol o selenotiol de la proteína.

En otro aspecto, se proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a albúmina o una proteína de fusión tal como se describe en la presente. También se abarca un método para producir un polipéptido de unión a albúmina o una proteína de fusión tal como se describió anteriormente que comprende expresar el polinucleótido, un vector de expresión que comprende el polinucleótido y una célula huésped que comprende el vector de expresión.

El polipéptido de unión a albúmina de la presente divulgación puede producirse alternativamente mediante síntesis de péptidos no biológica utilizando aminoácidos y/o derivados de aminoácidos que tienen cadenas laterales reactivas protegidas, comprendiendo la síntesis de péptido no biológica acoplamiento progresivo de los aminoácidos y/o los derivados de aminoácidos para formar un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto que tiene cadenas laterales reactivas protegidas, eliminación de los grupos protectores de las cadenas laterales reactivas del polipéptido y plegado del polipéptido en solución acuosa.

Por consiguiente, se usan aminoácidos normales (por ejemplo, glicina, alanina, fenilalanina, isoleucina, leucina y valina) y derivados de aminoácidos preprotegidos para construir secuencialmente una secúencia polipeptídica, en solución o sobre un soporte sólido en un disolvente orgánico. Un ejemplo específico de síntesis de péptidos sobre un soporte sólido se describe en el Ejemplo 5. Cuando se construye una secuencia polipeptídica completa, se eliminan los grupos protectores y se deja plegar el polipéptido en una solución acuosa. Cada polipéptido de acuerdo con la presente divulgación se pliega de forma reversible en un dominio de haz de tres hélices sin factores agregados y, por lo tanto, se pliega espontáneamente.

El conjugado de acuerdo con el segundo aspecto puede producirse mediante un método que comprende producir un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente, tal como mediante síntesis de péptidos no biológica y conjugar el polipéptido de unión a albúmina producido con un segundo y/o un resto adicional tal como se definió en relación con el segundo aspecto .

En una realización de una proteína de fusión o conjugado, adicionalmente se proporciona una proteína de fusión o conjugado tal como se definió en la presente para uso en terapia, por ejemplo, para su uso como medicamento. Dicha proteína de fusión o conjugado puede exhibir una semivida in vivo que es más larga que la semivida in vivo del polipéptido que tiene una actividad biológica deseada per se. La proteína de fusión o conjugado adicionalmente puede no provocar o provocar una respuesta inmune reducida tras la administración a un mamífero, tal como un humano, en comparación con la respuesta inmune provocada tras la administración al mamífero del polipéptido que tiene una actividad biológica deseada per se. Alternativamente, esto proporciona un método para disminuir la inmunogenicidad de un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada a través de la fusión o conjugación de dicho polipéptido con un polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado de acuerdo con aspectos divulgados en la presente. Adicionalmente, esto- puede posibilitar la mejora de la actividad biológica de un segundo resto.

En otra realización, se proporciona una proteina de fusión o conjugado de acuerdo con la presente divulgación, para uso en diagnóstico, por ejemplo, para su uso como agente de diagnóstico.

La presente divulgación también se refiere a diferentes aspectos del uso del polipéptido de unión a albúmina descrito anteriormente, asi como varios métodos de tratamiento, diagnóstico y detección en los que el polipéptido es útil debido a su capacidad de unión y otras características. Cuando se hace referencia al "polipéptido de unión a albúmina" en la siguiente descripción de estos usos y métodos, se pretende que esta expresión abarque el polipéptido de unión a albúmina solo y también todas las moléculas en base a este polipéptido descrito anteriormente que, por ejemplo, incorporan el polipéptido de unión a albúmina como un resto en una proteína de fusión o conjugado, y/o se conjugan con una etiqueta, un quelante, un agente terapéutico y/o de diagnóstico y/o se proporcionan con residuos de aminoácidos adicionales como un rótulo o para otros fines. Tal como se explicó anteriormente, dichas proteínas de fusión, derivados, etc. forman parte de la presente divulgación.

Otro conjunto de aspectos se refiere al suministro de nuevos medios para aumentar la solubilidad de solución acuosa de un compuesto poco soluble, a través de la conjugación del mismo con un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado. El complejo resultante de compuesto poco soluble y un polipéptido de unión a albúmina, solo o incorporado como un resto en una proteína de fusión o conjugado, es capaz de asociarse con la albúmina in vivo o in vitro, dicha asociación aumenta la solubilidad en solución acuosa. Por consiguiente, en una realización de este aspecto adicional, se proporciona una composición que comprende un compuesto que per se tiene una solubilidad en agua de no más de 100 g/ml; acoplado con un polipéptido de unión a albúmina, una proteína de fusión o conjugado tal como se describe en la presente, en donde el compuesto y el polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado se acoplan covalentemente.

En una realización, el compuesto per se tiene una solubilidad de no más de 10 g/ml. En otra realización, dicha solubilidad no es mayor que 1 g/ml.

En algunas realizaciones, el compuesto puede ser un compuesto farmacéuticamente activo, por ejemplo, un agente citotóxico. Ejemplos no taxativos de agentes citotóxicos son los seleccionados de caliqueamicina, auristatina, doxorrubicina, maitansinoide, taxol, ecteinascidina, geldanamicina y sus derivados y combinaciones de los mismos. Alternativamente, el agente citotóxico puede ser una toxina química sintética producida mediante síntesis orgánica y no derivada de un compuesto de origen natural.

Además del compuesto poco soluble y el polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado, la composición de acuerdo con este aspecto de la divulgación puede, en algunos casos, comprender también un polipéptido de unión con afinidad con un objetivo clínicamente relevante. Este polipéptido de unión es diferente al polipéptido de unión a albúmina de forma adecuada y puede estar acoplado no covalentemente o covalentemente a los otros componentes de la composición de la invención. Como ejemplos no taxativos, el polipéptido de unión con una afinidad con un objetivo clínicamente relevante puede seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpos y fragmentos y dominios de los mismos conservando sustancialmente la actividad de unión del anticuerpo; microcuerpos, maxicuerpos, avímeros. y otras proteínas pequeñas unidas por disulfuro; y proteínas de unión derivadas de un andamiaje seleccionado del grupo que consiste en proteína A estafilocócica y dominios de la misma, otros dominios de tres hélices, lipocalinas, dominios de repetición de anquirina, dominios de unión a celulosa, ? cristalinas, proteína verde fluorescente, antígeno 4 asociado a linfocito T citotóxico humano, inhibidores de proteasa tales como dominios Kunitz, dominios PDZ, dominios SH3, aptámeros peptídicos, nucleasa estafilocócica, tendamistatos, dominio de fibronectina tipo III, transferrina, dedos de zinc y conotoxinas .

La composición de acuerdo con el aspecto anterior de la presente divulgación tiene una capacidad para asociarse con la albúmina in vivo o in vitro a través de la inclusión en la composición de un polipéptido de unión a albúmina, solo o presente en una proteína de fusión o conjugado. En ciertos casos, puede ser beneficioso formar un complejo de la composición con albúmina fuera de un organismo vivo, es decir, agregar albúmina exógena a la composición. Dicha composición puede liofilizarse, proporcionando una formulación que es adecuada para almacenamiento a temperatura ambiente. Por consiguiente, la presente divulgación también proporciona una composición tal como se definió anteriormente que además comprende albúmina, tal como seroalbúmina humana.

La presente divulgación también proporciona la composición de acuerdo con el aspecto anterior para su uso como medicamento, es decir, para uso en terapia, en casos donde el compuesto es un compuesto terapéuticamente activo. De forma adecuada, el suministro de un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado y opcionalmente albúmina no afecta nocivamente la eficacia terapéutica del compuesto activo, de forma que la composición de la invención será útil en los ambientes terapéuticos o profilácticos donde el compuesto se indica per se.

En otra realización, se proporciona la composición de acuerdo con el aspecto anterior para su uso como agente de diagnóstico, es decir, para uso en diagnóstico.

Un aspecto relacionado de la presente divulgación proporciona un método de preparación de una composición tal como se describió inmediatamente antes. El método comprende proporcionar un compuesto que . per se tiene una solubilidad en agua -de no más de 100 g/ml; y acoplar covalentemente el compuesto con un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado de acuerdo con aspectos tales como los descritos en la presente, formando así una composición que comprende un complejo covalente de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado.

En realizaciones de · la presente divulgación donde se incluye albúmina en la composición, el método puede comprender la etapa adicional de mezclar dicho complejo de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado con albúmina, formando asi una composición que comprende un complejo no covalente de i) el complejo covalente de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado y ii) albúmina. Las proporciones relativas de los dos componentes en este complejo no covalente puede ser, por ejemplo, 1:1, de forma que una unidad del complejo de compuesto poco soluble y polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado se asocia con una molécula de albúmina. En una realización, el método comprende adicionalmente liofilizar el complejo no covalente para obtener una composición liofilizada .

En otro aspecto estrechamente relacionado, la presente divulgación proporciona un método para aumentar la solubilidad acuosa de un compuesto, que comprende proporcionar un compuesto que per se tiene una solubilidad en agua de no más de 100 µg/ml; acoplar covalentemente el compuesto con un polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado de acuerdo con aspectos tales como los descritos en la presente, formando asi un complejo covalente de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado; y mezclar dicho complejo de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado con albúmina en condiciones que favorecen la asociación no covalente del polipéptido de unión a albúmina con la albúmina; por el cual la solubilidad en agua del compuesto en dicho complejo es mayor que la solubilidad en agua del compuesto per se.

En estos aspectos del método relacionados con la solubilidad de un compuesto poco soluble, las características opcionales de varios componentes se describen en relación con el aspecto de la composición inmediatamente precedente.

Aunque la invención se ha descrito en relación con varias realizaciones ejemplares, los expertos en la técnica entenderán que se pueden hacer varios cambios y se pueden sustituir equivalentes por elementos de los mismos sin apartarse del alcance de la invención. Adicionalmente, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptar una situación o molécula específica a los principios de la invención sin apartarse del alcance esencial de la misma. Por lo tanto, se pretende que la invención no sea limitada por ninguna realización específica contemplada para llevar a cabo esta invención, sino que dicha invención incluirá todas las realizaciones que entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Figuras La Figura 1 es un listado de las secuencias de aminoácidos de los ejemplos de los polipéptidos de unión a albúmina de la presente divulgación (SEQ ID NO: 1-152, SEQ ID NO:155-203), el dominio GA3 de la proteina G de la cepa de Streptococcus G148 extendido mediante un residuo de glicina en el extremo N terminal (SEQ ID NO: 153) y un polipéptido de unión a albúmina derivado de G148-GA3 tal como describieron anteriormente Jonsson et al (supra, SEQ ID NO:154).

La Figura 2 muestra el resultado del análisis de unión llevado a cabo en un instrumento Biacore para investigar la unión del polipéptido de unión a albúmina PEP07912 (SEQ ID NO: 157) a la seroalbúmina humana. Se inyectaron tres concentraciones diferentes de proteina purificada (40 nM, linea gris gruesa; 10 nM, linea negra; y 2,5 nM, linea gris) en una superficie con 955 UR de seroalbúmina humana inmovilizada .

Las Figuras 3A-C muestran el resultado del análisis de unión que se llevó a cabo mediante ELISA para investigar la unión de los polipéptidos de unión a albúmina PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07912 (SEQ ID N0.157), PEP07554 (SEQ ID NO: 156), PEP07914 (SEQ ID NO: 158), PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 159) y PEP07844 (SEQ ID NO: 161) con moléculas de IgG presentes en 126 sueros humanos normales individuales, donde A) muestra el valor de OD promedio, B) muestra el porcentaje de sueros negativos (definidos como OD < 0,15) y C) muestra el porcentaje de sueros positivos (definidos como OD > 1,0).

Las Figuras 4A-B son cromatogramas gue muestran análisis de polipéptidos de unión a albúmina producidos químicamente purificados PEP07834 (SEQ ID NO: 160), donde A) muestra la señal de absorbancia a 220 nm, con espacios en blanco restados y B) muestra la señal de absorbancia a 280 nm, con espacios en blanco restados. Se observaron dos picos en ambas longitudes de onda.

Las Figuras 5A-B son espectrogramas que muestran el análisis de espectrometría de masas de los dos picos identificados en las Figuras 4A) y B) . A) es el espectrograma del primer pico, es decir, el monómero de PEP07834 (SEQ ID NO: 160) y B) es el espectrograma del dimero de PEP07834.

Las Figuras 6A-C son diagramas que muestran una evaluación de la inmunogenicidad de los polipéptidos de unión a albúmina PEP07913 (SEQ ID NO: 153), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) y PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 159) en un ensayo de proliferación de células T CD3+ CD4+. A) muestra la cantidad de individuos que respondieron a los polipéptidos de unión a albúmina en comparación con la albúmina humana recombinante en una cohorte de 52 donantes caucásicos. B) muestra los índices de estimulación promedio (SI) para PEP07913, PEP07912, PEP07914 y PEP07968 en comparación con el testigo negativo que contiene albúmina humana recombinante. C) muestra la cantidad de individuos que respondieron con respecto a todas las proteínas en el estudio en comparación con el testigo de solución amortiguadora.

Las Figuras 7A-C muestran el resultado del análisis de unión que se llevó a cabo en un instrumento Biacore para investigar la unión de los polipéptidos de unión a albúmina A) PEP07986 (SEQ ID NO:163), B) PEP08296 (PEP08185 conjugado a DOTA, SEQ ID NO:148) y C) PEP06923 (SEQ ID NO: 154) a albúmina de diferentes especies. Los sensogramas que se muestran corresponden a proteína inyectada a una concentración de 40 nM en superficies inmovilizadas con albúmina de humano (1130 UR) , línea gris delgada; mono cangrejero 1046 UR) , línea gris gruesa; rata (831 UR) , línea gris claro gruesa; perro (1053 UR) , línea negra delgada; y ratón (858 UR) , línea negra gruesa.

La Figura 8 muestra el efecto inhibidor de ZX-PP013 (círculos abiertos) , ZY-PP013 (cuadrados abiertos) y Zneg-PP013 (triángulos cerrados) sobre la proliferación de células TF-1 inducida por citocina en presencia de un exceso molar de HSA de cinco veces.

La Figura 9 muestra las respuestas de unión máximas obtenidas mediante análisis en Biacore de PEP07986 (SEQ ID NO: 163) almacenado a 4, 25 o 40°C durante una semana, dos semanas, un mes y tres meses tal como se indicó, a una concentración de 2 mg/ml, inyectado en SH inmovilizado (704 UR) a una concentración de 10 nM. Las muestras no tratadas de tiempo = 0 se muestran como referencias.

La Figura 10 muestra el resultado del análisis de unión llevado a cabo en un instrumento Biacore para investigar la unión del polipéptido de unión a albúmina PEP07912 PEP08296 (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 148) a seroalbúmina humana antes y después del tratamiento térmico. Se inyectaron dos concentraciones de PEP08296 (0,8 nM, lineas grises; 4 nM, lineas negras) en una superficie con 724 UR de seroalbúmina humana inmovilizada. Las lineas continuas son antes de y las lineas sombreadas son después del tratamiento térmico durante 10 minutos a 90°C.

Las Figuras 11A-B muestran la superposición de dos espectros CD de PEP08296 (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 148 ) antes y después del tratamiento térmico durante 12 min a 90°C. A) Muestra incubada en PBS pH 7,2. B) Muestra incubada en PBS pH 4,0.

La Figura 12 muestra la imagen de proyección de intensidad máxima (MIP, por sus siglas en inglés) de la distribución en todo el cuerpo de 68Ga-PEP08296 en una rata sana, analizada durante 1,5 h de recolección de datos inmediatamente después de la inyección intravenosa (vena de la cola) . Rápidamente se obtienen los perfiles de radiactividad en circulación en los principales vasos (por ejemplo, la yugular (flecha larga) y la femoral (flecha corta) ) , el corazón (H) , hígado (L) , bazo (S) , riñon (K) y vej iga (B) .

La Figura 13 muestra un cromatograma de filtración en gel de PEP07986 (SEQ ID NO: 163) inyectado a una concentración de 42 mg/ml, línea continua negra. Se incluye un cromatograma de ovoalbúmina (Pm 43 kDa) inyectada a una concentración de 5 mg/ml, línea gris discontinua, para comparación, lo que confirma que el pico para PEP07986 no es un agregado, lo cual se hubiera esperado en el volumen vacío eluido en un punto de tiempo anterior que la ovoalbúmina.

A continuación la invención se ilustrará adicionalmente a través de la descripción no limitante de experimentos llevados a cabo de acuerdo con la misma. A menos que se indique lo contrario", se' usaron métodos de química y biología molecular convencionales en todo el documento.

E emplos Ejemplo 1: Clonación, expresión, purificación y caracterización de polipéptidos de unión a albúmina En este ejemplo se clonaron, purificaron y caracterizaron diez polipéptidos de unión a albúmina diferentes, PEP07913 (SEQ ID NO: 153), PEP07912 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 159), PEP06923 (SEQ ID NO: 154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07844 (SEQ ID NO:161), PEP07986 (SEQ ID NO:163) y PEP08296 (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 148), cuyas secuencias de aminoácidos se indican en la Figura 1 y en el listado de secuencias adjunto.

Materiales y métodos Clonación de variantes de polipéptido de unión a albúmina Se generaron mutaciones en G148-GA3 usando mutagénesis dirigida con los oligonucleotidos apropiados para obtener las variantes de polipéptido de unión a albúmina deseadas. Los fragmentos de gen se amplificaron mediante PCR con cebadores de adición de sitios de endonucleasa específicos así como una secuencia MGSS en el extremo N terminal precedente a las variantes de polipéptido de unión a albúmina. Los fragmentos se escindieron con Ndel y Notl, se purificaron y se ligaron a un vector de clonación, el plásmido pAY02556 (que contenía un origen de replicación de pBR322, un gen de resistencia a kanamicina y un promotor T7 para la expresión del gen de interés), restringido con las mismas enzimas. Las ligaduras se transformaron en células TOP10 de E. coli electrocompetentes . Las células transformadas se esparcieron sobre placas TBAB (30 g/1 de base de agar sangre triptosa) complementadas con 50 µg/ml de kanamicina, a continuación se incubaron a 37 °C durante toda la noche. Las colonias se sometieron a detección utilizando PCR y la secuenciación de los fragmentos amplificados se llevó a cabo utilizando el oligonucleótido biotinilado y un kit de secuenciación en ciclos BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems), que se usó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las reacciones de secuenciación se purificaron mediante unión a perlas revestidas con estreptavidina magnética utilizando un Magnatrix 8000 (NorDiag AB) y se analizaron en un analizador genético ABI PRISM® 3100 (PE Applied Biosystems) . Todas las variantes del polipéptido de unión a albúmina se subclonaron como monómeros y los constructos codificados mediante los vectores de expresión fueron GSS- [ PP### ] , donde PP### corresponde a los residuos de aminoácidos que constituyen la secuencia del polipéptido de unión a albúmina.

Adicionalmente, los fragmentos de genes de G148-GA3, PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13) y PP037 (SEQ ID NO: 37) se amplificaron mediante PCR con cebadores de adición de sitios de endonucleasa específicos así como una secuencia de hexahistidina, un sitio de proteasa TEV y un residuo de glicina antes de los residuos de aminoácidos que constituyen la secuencia del polipéptido de unión a albúmina. Los polipéptidos PEP07913 (SEQ ID NO: 153), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) y PEP07968 (SEQ ID NO:159) corresponden a los polipéptidos de unión a albúmina G148-GA3, PP007 (SEQ ID NO : 7 ) , PP013 (SEQ ID N0:13) y PP037 (SEQ ID NO: 37) con residuos de glicina agregados. Los fragmentos se escindieron con Xbal y Notl, se purificaron y se ligaron a un vector de clonación, el plásmido pAY02512 contenia un origen de replicación de pBR322, un gen de resistencia a kanamicina y un promotor T7 para la expresión del gen de interés. El sitio de clonación está precedido por una secuencia que codifica un péptido que contiene un rótulo de hexahistidina seguido por un sitio de escisión para la proteasa TEV) , restringido con las mismas enzimas. La ligación, transformación y verificación de secuencia se llevaron a cabo tal como se describió anteriormente. Las cuatro variantes de polipéptido de unión a albúmina G148-GA3, PP007, PP013 y PP037 se subclonaron como monómeros y los constructos codificados por los vectores de expresión fueron MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG- [PP###] .

El vector de expresión que codificaba MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG- [PPO 13] se modificó adicionalmente mediante mutagénesis dirigida utilizando oligonucleótidos, lo que resultó en la inserción de un residuo de serina antes de los residuos de aminoácidos que constituían la secuencia del polipéptido de unión a albúmina, para obtener el constructo MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS-[PP013] . Este constructo se modificó adicionalmente mediante 1) mutagénesis dirigida para reemplazar el residuo de serina en la posición 14 (dentro de PP013) por un residuo de cisteína, generando MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS- [ PP049] y 2) adición de un residuo de glicina en el extremo C terminal, generando MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS- [PP049] -G. La adición de la glicina en el extremo C terminal se llevó a cabo mediante amplificación PCR con cebadores que incluían nucleótidos que codificaban el residuo de glicina y sitios de endonucleasa específicos. -El fragmento se escindió con Xbal y Notl , se purificó y se ligó a un vector de clonación, el plásmido pAY02641 (que contenía un origen de replicación de pBR322, un gen de resistencia a kanamicina y un promotor T7 para la expresión del gen de interés) se restringió con las mismas enzimas. La ligación, transformación y verificación de secuencia se llevaron a cabo tal como se describió anteriormente .

Expresión proteica Las variantes de polipéptido de unión a albúmina se expresaron en BL21 (DE3) de E. coli con una extensión MGSS en el extremo N terminal o con un rótulo de HÍS6 en el extremo N terminal seguido por un sitio de reconocimiento de proteasa TEV y un residuo de glicina. Se utilizó una colonia de cada variante de polipéptido de unión a albúmina para inocular 4 mi de medio TSB+YE complementado con kanamicina hasta alcanzar una concentración de 50 ug/ml. Los cultivos se cultivaron a 37 °C durante aproximadamente 5 horas. Se usaron 3 mi de cada uno de los cultivos para inocular 800 mi de TSB+YE complementados con kanamicina hasta alcanzar una concentración de 50 µq/ l en biorreactores paralelos (Greta system, Belach Bioteknik AB) . Los cultivos se llevaron a cabo a 3 °C, con aireación a 800 ml/minuto y un perfil de agitación para mantener los niveles de oxigeno disuelto por encima de 30%, hasta alcanzar un OD600 de 2, posteriormente se agregó IPTG hasta alcanzar una concentración final de 0,5 mM. El cultivo se continuó durante cinco horas, posteriormente el cultivo se enfrió hasta alcanzar 10°C, se detuvo la aireación y se redujo la agitación hasta 300 rpm. El granulado celular se recogió mediante centrifugación (15600 x g, 4°C, 20 minutos) y se almacenó a -20°C hasta la purificación .

Purificación de variante de polipéptido de unión a albúmina con rótulo de His6 y un sitio de proteasa TEV Se suspendieron granulados celulares congelados que alojaban polipéptidos rotulados con hexahistidina solubles PEP07913 (SEQ ID NO: 153), PEP07912 (SEQ ID NO: 156) , PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (SEQ ID NO:159), PEP07986 (SEQ ID NO:163) y PEP08185 (SEQ ID NO:148) en 35 mi de solución amortiguadora de unión (20 mM fosfato de sodio, NaCl 0,5 M, 20 mM de imidazol, pH 7,4) con una adición de 1000 U de Benzonase® (1.01654.001, Merck) y se destruyeron mediante ultrasonidos. Para cada uno de los polipéptidos, la suspensión sometida a ultrasonidos se clarificó mediante centrifugación (1 h, 37000 ? g, 4°C) y el sobrenadante se cargó en una columna His GraviTrap™ (11-0033-99, GE Healthcare) . La columna se lavó con 10 mi de solución amortiguadora de lavado (20 mM de fosfato de sodio, NaCl 0,5 M, 60 mM de imidazol, pH 7,4), antes de eluir el polipéptido con 3 mi de solución amortiguadora de elución (20 mM de fosfato de sodio, NaCl 0,5 M, imidazol 0,5 M, pH 7,4). La solución amortiguadora se cambió por una solución amortiguadora de escisión (50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 8) utilizando la columna de desalinización PD-10 (17-0851-01, GE Healthcare) . La cantidad de producto de polipéptido se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm antes de agregar DTT hasta alcanzar una concentración final de 5 mM. La proteasa TEV rotulada con His6 se agregó a la solución amortiguadora de escisión en una relación de masa de 1:10 con respecto al producto de polipéptido. La escisión se llevó a cabo durante la noche con mezcla lenta a 4°C. Se agregó imidazol a la mezcla de escisión hasta alcanzar una concentración de 20 mM, antes de cargar la mezcla en una columna His GraviTrap™ (11-0033-99, GE Healthcare) para eliminar los rótulos de His6 escindidos, la proteasa TEV rotulada con His6 y el producto sin escindir rotulado con His6.

Para cada variante, el flujo, que contenia la variante de polipéptido de unión a albúmina, se purificó adicionalmente mediante cromatografía de fase inversa (RPC, por sus siglas en inglés), de la siguiente forma. La fracción de flujo se cargó en una columna de RPC Resource 15 de 1 mi (GE Healthcare) , previamente equilibrada con solución amortiguadora ? de RPC (0,1% de TFA en agua) . Después del lavado de la columna con 10 volúmenes de columna (CV) de solución amortiguadora A de RPC, los polipéptidos unidos se eluyeron con un gradiente lineal de 0-50% de solución amortiguadora B de RPC (0,1% de TFA en acetonitrilo) durante 10 CV. La tasa de flujo era 2 ml/min y se monitoreó la absorbancia a 280 nm. Las fracciones que contenían la variante de polipéptido de unión a albúmina se identificaron mediante análisis mediante SDS-PAGE y se agruparon.

Las variantes de polipéptido de unión a albúmina purificadas mediante RPC se purificaron adicionalmente mediante filtración en gel sobre 120 mi de Superdex 75 (GE Healthcare) envasado en una columna XK16 (GE Healthcare) . La solución amortiguadora de pasada fue IxPBS y la tasa de flujo fue 2 ml/min. Las fracciones que contenían una variante de polipéptido de unión a albúmina pura se agruparon y concentraron hasta aproximadamente 1,3 mg/ml. Finalmente, el concentrado se purificó de trazas de endotoxinas restantes mediante el columnas de 1 mi de gel de remoción AffinityPak Detoxi-Gel Endotoxin (Pierce, No. de producto 20344), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Las variantes de polipéptido de unión a albúmina PEP07911 y PEP08185 se conjugaron con Mal-DOTA antes de la etapa de purificación mediante RPC, de la siguiente forma. La solución amortiguadora de la fracción de flujo de la etapa de purificación mediante IMAC-FT se cambió por NaAc 0,2 M, pH 5,5, utilizando una columna de desalinización PD-10 descartable (GE Healthcare) . Se agregó maleimido-mono-amida-DOTA (Macrocíclicos, cat . no. B-272) en un exceso molar de 5 veces y se incubó durante 60 minutos a 30°C con agitación continua. Los polipéptidos resultantes se denominaron PEP07968 y PEP08296, respectivamente.

Purificación de variantes de polipéptido de unión a albúmina sin rótulo de Hise Se suspendieron granulados celulares congelados que alojaban variantes de polipéptido de unión a albúmina solubles PEP06923 (SEQ ID NO: 154), PEP07271 (SEQ ID NO: 155), PEP07554 (SEQ ID NO:156) y PEP07844 (SEQ ID NO: 161) en 20 mM de Tris-HCl, pH 8 y se destruyeron mediante ultrasonidos. Para cada una de las variantes de polipéptido, la suspensión sometida a ultrasonidos se clarificó mediante centrifugación (30 min, 32000 ? g, 4°C) y el sobrenadante se cargó en una columna HSA-Sefarosa (11-0033-99, GE Healthcare) . Después del lavado con solución amortiguadora de TST (25 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 200 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 8,0) y posteriormente con 5 mM de NH4Ac, pH 5,5, la variante de polipéptido de unión a albúmina unida se eluyó con HAc 0,5 M, pH 3,2.

Las variantes de polipéptido de unión a albúmina se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de fase inversa (RPC) , de la siguiente forma. Para cada una de las variantes, el eluato de la etapa de purificación de afinidad con HSA se cargó en una columna de 1 mi Resource 15 RPC (GE Healthcare) , equilibrada previamente con solución amortiguadora A de RPC (0,1% de TFA en agua) . Después del lavado de la columna con 10 CV de solución amortiguadora A de RPC, los polipéptidos unidos se eluyeron con un gradiente lineal de 0-50% de solución amortiguadora B de RPC (0,1% de TFA en acetonitrilo) durante 10 CV. La tasa de flujo era 2 ml/min y se monitoreó la absorbancia a 280 nm. Las fracciones que contenían las variantes de polipéptido de unión a albúmina puras se identificaron mediante análisis mediante SDS-PAGE y se agruparon. Finalmente, la solución amortiguadora se cambió por lxPBS (2,68 mM de KC1, 137 mM de NaCl, 1,47 mM de KH2P04, 8,1 mM de Na2HP0 , pH 7,4) utilizando una columna de desalinización PD-10 descartable (GE Healthcare) .

Caracterización de variantes de polipéptido de unión a albúmina purificadas La concentración se evaluó midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando un espectrofotómetro NanoDrop®. Las proteínas se analizaron adicionalmente con SDS-PAGE y LC-MS.

Para el análisis de SDS-PAGE, se mezclaron aproximadamente 10 µq de cada variante de polipéptido de unión a albúmina con solución amortiguadora de muestra NuPAGE LDS ( Invitrogen) , se incubaron a 70°C durante 15 min y se cargaron sobre genes NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen). Los geles se pasaron con solución amortiguadora de pasada NuPAGE MES SDS (Invitrogen) por una celda de electroforesis XCell II SureLock (Novex) empleando el Sharp Prestained Standard (Invitrogen) como marcador de peso molecular y utilizando PhastGel BlueR (GE Healthcare) para la tinción.

Para verificar la identidad de las variantes de polipéptido de unión a albúmina, se llevaron a cabo análisis mediante LC/MS utilizando un sistema de LC/MSD Agilent 1100, equipado con API-ESI y un único analizador de masa cuádruple.

Se cargaron aproximadamente 10 ]iq de cada una de las variantes de polipéptido de unión a albúmina purificadas en un columna Zorbax 300SB-C8 Narrow-Bore (2,1 x 150 mm, 3,5 pm, Agilent Technologies) a una tasa de flujo de 0,5 ml/min. Los polipéptidos se eluyeron utilizando un gradiente lineal de 10-70% de solución B durante 15 min a 0,5 ml/min. La separación se llevó a cabo a 30°C. Se monitorearon la señal de iones y la absorbancia a 280 y 220 nm. Los pesos moleculares de las variantes de polipéptido de unión a albúmina se confirmaron mediante S .

Resul tados Los niveles de expresión de las variantes de polipéptido de unión a albúmina fueron 10-30 mg producto/g de granulado celular, tal como se estimó a partir de un análisis mediante SDS-PAGE.

En todas las variantes, la pureza, tal como se determinó mediante análisis mediante SDS-PAGE, superó el 95% y el análisis mediante LC/ S verificó los pesos moleculares correctos. Después de la purificación, se obtuvieron entre 1 y 8 mg de polipéptido puro de cada una de las diez variantes de polipéptido de unión a albúmina.

Ejemplo 2: Determinación de afinidad de los polipéptidos de unión a albúmina En este ejemplo se caracterizaron PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07844 (SEQ ID N0:161), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07914 (SEQ ID NO: 158) y PEP07968, (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 159), sintetizados o expresados y purificados en el Ejemplo 1, para determinar la afinidad con la seroalbúmina humana (HSA) utilizando un instrumento Biacore. PEP07913 corresponde a la secuencia de aminoácidos de G148-GA3 con la adición de un residuo de glicina en el extremo N terminal, mientras que PEP07271, PEP07844, PEP07912, PEP07914 y PEP07968 corresponden a los polipéptidos de unión a albúmina de PP001 (SEQ ID ??:1), PP043 (SEQ ID NO:43), PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13) y PP037 (SEQ ID NO:37) con diferentes adiciones de aminoácidos en el extremo N terminal.

Materiales y métodos Se llevó a cabo un análisis en biosensor en un instrumento Biacore2000 (GE Healthcare) con HSA (Albucult®, Novozymes) , inmovilizada mediante acoplamiento de amina sobre la capa de dextrano carboxilado de las superficies de chips CM-5 (grado de investigación; GE Healthcare) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La superficie 1 del chip se activó y se desactivó y se usó como célula de referencia (superficie en blanco) durante las inyecciones, mientras que la superficie 2 comprendía HSA inmovilizada a 731 unidades de resonancia (UR) y la superficie 4 comprendía HSA inmovilizada a 955 UR. Las variantes de polipéptido de unión a albúmina se diluyeron en solución amortiguadora de pasada HBS-EP (GE Healthcare) hasta alcanzar 2,5 nM, 10 nM y 40 n y se inyectaron a una tasa de flujo constante de 50 µ?/min durante 5 minutos, posteriormente se inyectó HBS-EP durante 60 minutos. Las superficies se regeneraron con una inyección de 25 µ? de HC1, 10 mM. Las mediciones de afinidad se llevaron a cabo en dos conjuntos; en el primer conjunto se inyectaron HBS-EP, PEP06923, PEP07271, PEP07912, PEP07913, PEP07914 y PEP07968 (superficie 2 del chip) y en el segundo conjunto se inyectaron HBS-EP, PEP06923, PEP07844, PEP07912 y PEP07914 (superficie 4 del chip) . PEP06923 se inyectó dos veces en cada pasada como testigo. Los resultados se analizaron con un programa informático BiaEvaluation (GE Healthcare) . Las curvas de la superficie en blanco se restaron de las curvas de las superficies de ligando.

Resul tados El instrumento Biacore 2000 tiene una limitación técnica que dificulta las mediciones de afinidad muy alta. Por consiguiente, el objetivo del estudio con Biacore no fue determinar los parámetros cinéticos exactos de la afinidad de las variantes del polipéptido de unión a albúmina con HSA. Sin embargo, los resultados proporcionan una estimación cuantitativa de las afinidades relativas de estos polipéptidos con la albúmina. Después de restar la superficie de referencia e inyectar la solución amortiguadora, las curvas se ajustaron a un modelo de unión 1:1 (Langmuir) utilizando un programa informático BIAevaluation con corrección de transferencia de masa y con RUmax como parámetro local. Las curvas se muestran en la Figura 2. Se estimaron los valores KD, ka (kon) y kd (k0ff) relativos y se presentan en las Tablas a continuación.

Tabla 1: Parámetros cinéticos (ka, kd y KD) de los polipéptidos de unión a albúmina con HSA, 1er conjunto Tabla 2: Parámetros cinéticos (ka, kd y D) de los polipéptidos de unión a albúmina con HSA, 2do conjunto Tal como se muestra en las Tablas 1 y 2, PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07844 ( SEQ ID NO:161), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 ( SEQ ID NO:158) y PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 159) parecen tener todos aproximadamente la misma afinidad con HSA, superando ampliamente la afinidad del G148-GA3 original (PEP07913; SEQ ID NO: 153). La afinidad con HSA de estos polipéptidos es ligeramente más baja en comparación con PEP06923 (SEQ ID NO:154), a pesar de la tasa de disociación similar.

Ejemplo 3: Determinación de la temperatura de fusión (Tm) de los polipéptidos de unión a albúmina En este ejemplo, se analizaron las variantes de polipéptido de unión a albúmina PEP07913 (SEQ ID NO: 153), PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:159), PEP07844 (SEQ ID NO:161) y PEP07986 (SEQ ID NO:163), expresadas y purificadas tal como se describe en el Ejemplo 1 y la variante del polipéptido de albúmina PEP07975 (PEP07834 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 160), producida tal como se describe en el Ejemplo 5, mediante Análisis por CD. PEP07913 corresponde a la secuencia de G148-GA3 que tiene un residuo de glicina en el extremo N terminal, PEP06923 es un derivado de alta afinidad genomanipulado descrito previamente por Jonsson et al, supra, mientras que PEP07271, PEP07554, PEP07912, PEP07914, PEP07968, PEP07844 y PEP07975 son ejemplos de polipéptidos de unión a albúmina de PP001 (SEQ ID ??:1), PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13), PP037 (SEQ ID NO: 37) y PP043 (SEQ ID NO: 3) que tienen diferentes adiciones de aminoácidos en el extremo N terminal de acuerdo con la presente divulgación.

Materiales y métodos Las variantes de polipéptido de unión a albúmina purificadas se diluyeron en lxPBS, hasta alcanzar concentraciones finales entre 0,4 y 0,5 mg/ml. Se llevó a cabo un análisis de dicroismo circular (CD) en un espectropolarimetro Jasco J-810 en una celda con una longitud del trayecto óptico de 1 mra. En las mediciones de temperatura variable, la absorbancia se midió a 221 nm de 20°C a 90°C, con un pendiente de temperatura de 5°C/min.

Resultados Las temperaturas de fusión (Tm) de las diferentes variantes de polipéptido de unión a albúmina se calcularon determinando el punto medio de la transición en la gráfica de CD con respecto a la temperatura. Los resultados se resumen en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3. Valores determinados de Tm de las variantes de polipéptido de unión a albúmina evaluadas El péptido está conjugado con maleimida-DOTA en la cisteína 21 El péptido está amidado en el extremo C terminal 3) La leucina (subrayado) es el residuo en la posición 1 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de unión a albúmina tal como se definió en el primer aspecto de la presente divulgación El polipéptido PEP07968 es idéntico a PEP07912, excepto que el primero tiene un residuo de cisteina en la posición 14 conjugado con maleimida DOTA y el último un residuo de serina. Por consiguiente, la modificación con DOTA no afecta la temperatura de fusión. Adicionalmente PEP07975 se conjuga con DOTA utilizando Ci4, y es idéntico a PEP07968 excepto por la amida del extremo C terminal (resultante de la síntesis de péptidos en el Ejemplo 5) y por tener una alanina en el extremo N terminal en lugar de una glicina. Además, la comparación de PEP07912 y PEP07554 muestra que una serina en el extremo N terminal proporciona una temperatura de fusión más alta que una glicina en la misma posición (5°C de diferencia en la Tm) . Por consiguiente, todas las variantes de polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con la presente divulgación exhiben una Tm por encima de 55 °C, excepto PEP07912 y las variantes conjugadas con DOTA. Tomando en cuenta la importancia de la porción en el extremo N terminal, todos los polipéptidos de unión a albúmina evaluados son superiores al derivado de la técnica anterior de Jonsson et al, es decir, PEP06923.

Ejemplo 4: Análisis de respuesta de suero Se analizó el porcentaje de suero humano que contiene IgG, capaz de unirse a un conjunto de polipéptidos de unión a albúmina tal como se divulgan en la presente mediante ELISA. En total se sometieron a detección 149 muestras de suero correspondientes a 127 individuos.

Materiales y métodos Se revistieron placas de ELISA (placas de área media de 96 pocilios, (Costar, cat . No. 3690)) con 50 µ?/pocillo de Albucult® (Novozymes) diluido hasta alcanzar 8 g/ml en solución amortiguadora de revestimiento (Sigma, cat. No. 3041). Las placas se revistieron durante toda la noche durante tres días a 4°C. El día del análisis, se lavaron las placas dos veces con agua corriente y se bloquearon durante 2 horas con 100 µ? de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) que contenia 0,05% de caseína (PBSC) . Las placas se vaciaron y se agregaron 50 µ?/pocillo de polipéptidos de unión a albúmina PEP07913 (SEQ ID NO: 153), PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 159) y PEP07844 (SEQ ID NO: 161), diluidos hasta alcanzar 2 µg/ml en PBSC de acuerdo con una distribución de placa prefabricada. Después de la incubación durante dos horas a temperatura ambiente (TA) , las placas se lavaron en PBSC cuatro veces usando una lavadora ELISA automática. Las 149 muestras de suero de 129 individuos se diluyeron 50 veces en PBSC mediante la adición de 24 µ? de suero en 1174 µ? de PBSC. Se agregaron 50 µ? de suero diluido por pocilio de acuerdo con la disposición de placa prefabricada. Cada muestra de suero se evaluó como un singlete. Se incluyeron testigos positivos y negativos en cada placa y para cada polipéptido de unión a albúmina. Se agregaron anticuerpos de unión a albúmina (50 µ?, 0,5 µ?/ml de solución de inmunoglobulina preparada en el laboratorio a partir de suero de primates inmunizados con PEP06923) como testigo positivo y se usaron 50 µ? de PBSC como testigo negativo. Las placas se incubaron durante una hora a TA y posteriormente se lavaron cuatro veces en PBSC utilizando una lavadora ELISA automática. La IgG unida se detectó con 50 µ?/pocillo de IgG antihumana (Southern Biotech, cat no 2040-05) diluida 10000 veces en PBSC. Después de lavar cuatro veces en PBSC utilizando una lavadora ELISA automática, se agregaron 50 µ?/pocillo de sustrato (Pierce cat. No. 34021). La reacción se detuvo después de 10-15 minutos mediante la adición de 50 µ? de H2SO4 a cada pocilio, antes de medir la absorbancia utilizando un lector de placa con múltiples pocilios (Victor3, Perkin Elmer) .

Resul tados De los 149 sueros sometidos a detección para determinar la unión de IgG a los polipéptidos de unión a albúmina, 23 fueron negativos para los ocho polipéptidos (valor OD < 0,1), es decir, no exhibieron IgG unida a los polipéptidos. El análisis se llevó a cabo con los 126 sueros que fueron positivos para uno o más de los polipéptidos de unión a albúmina. Se calculó la absorbancia promedio (Figura 3A) y el porcentaje de sueros con valores OD < 0,15 (Figura 3B) o > 1,0 (Figura 3C) . El valor OD promedio más alto y el porcentaje de suero más alto con unión a IgG se obtuvieron con PEP07913 (SEQ ID NO: 153), PEP06923 (SEQ ID NO:154) y PEP07844 (SEQ ID NO: 161), mientras que se observó menos reactividad con respecto a PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 159), PEP07914 (SEQ ID NO: 158) y PEP07954 (SEQ ID NO: 156) .

Por consiguiente, los polipéptidos de unión a albúmina más reactivos fueron el G148-GA3 original (PEP07913, SEQ ID NO: 153) y el derivado con afinidad mejorada anteriormente (PEP06923, SEQ ID NO:154), que1 tenia la hélicé 1 conservada de G148-GA3. El tercero de los polipéptidos más reactivos (PEP07844, SEQ ID NO: 161) contiene la lisina original en la posición 14 en la hélice 1, Este residuo está previsto para la conjugación y, por lo tanto, no se expone en el contexto final. La variante del polipéptido de unión a albúmina idéntica, excepto por tener una alanina en la posición 14 (PEP07554, SEQ ID NO:156) es una de las menos reactivas.

Ejemplo 5: Síntesis química de un polipéptido de unión a albúmina conjugado con DOTA Materiales y métodos El polipéptido de unión a albúmina PEP07834 (SEQ ID NO: 160) se sintetizó mediante síntesis de péptido en fase sólida (SPPS, tal como la describieron Quibell, M. y Johnson, T., en Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach, .C. Chan, P.D. White Eds, Oxford University Press 2000, 115-135) en un reactor 433 A Peptide Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA) a una escala de 0,1 mmol, es decir, con un posible rendimiento teórico de 0,1 mmol de péptido, utilizando química Fmoc estándar. Se utilizó una resina de amida Fmoc ácida-lábil como soporte sólido en la síntesis (Rink Amide MBHA Resin LL (malla 100-200), cargando 0,39 mmol amida/g resina (Novabiochem) ) .

Se acoplaron 47 residuos de aminoácidos de acuerdo con la secuencia a continuación a la resina de amida mediante reacciones de acilación en el reactor durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) y mezcla. Las reacciones de acilación se llevaron a cabo con un exceso molecular de diez veces de aminoácidos protegidos con Fmoc en NMP (N-metilpirrolidona, Merck) , activados con 1 eq de hexafluorofosfato de 2- (lH-benzotriazol-l-il) -1, 1, 3, 3-tetrametilaminio (HBTU, IRIS Biotech) , 1 eq de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, IRIS Biotech) y 2 eq de diisopropiletilamina (DIEA, Applied Biosystems).

Adicionalmente, todas las cadenas laterales de aminoácidos reactivas se protegieron con grupos de protección de cadena lateral estándares (tere-butilo (tBu) para Asp, Glu, Ser, Thr y Tyr, terc-butiloxicarbonilo (Boc) para Lys, 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf) para Arg y tritilo (Trt) para Asn y Cys) antes de la activación y el acoplamiento. Para disminuir la cantidad de acoplamientos incompletos que conducen a péptidos truncados, una cantidad menor de residuos de aminoácidos seleccionados se sometieron a acoplamiento mediante acilación dos veces, sin desprotección de Fmoc tal como se describe más adelante entre el primer y el segundo acoplamiento. La secuencia de aminoácidos del polipéptido de unión a albúmina sintetizado PEP07834 fue ALASAKEAAN AELDCYGVSD FYKRLIDKAK TVEGVEALKD AILAALP-NH2 (SEQ ID NO: I6O-NH2) .

Los residuos de aminoácidos subrayados se acoplaron dos veces. Todos los grupos amino sin reaccionar restantes en los péptidos unidos a la resina se cubrieron con anhídrido acético (anhídrido acético 0,5 M (AlfaAesar) , DIEA 0,125 M, HOBt 0,015 M en NMP) durante 5 min. Luego de cada acoplamiento, se llevó a cabo la desprotección del grupo Fmoc en el extremo N terminal en los péptidos unidos a la resina mediante tratamiento con 20% de piperidina (Sigma-Aldrich) en NMP durante 10 min.

Después de finalizar la síntesis, los péptidos se escindieron del soporte sólido y simultáneamente se eliminaron por escisión los grupos protectores de cadenas laterales mediante tratamiento con TFA/EDT/H20/TIS (94:2,5:2,5:1) (TFA: ácido trifluoroacético (Apollo), EDT: 1, 2-etanoditiol (Aldrich) , TIS: triisopropilsilano (Aldrich) ) a TA durante 2 h con mezcla ocasional. Después del tratamiento con TFA, los péptidos se extrajeron tres veces utilizando 20% de acetonitrilo (Merck) en agua y terc-butil metil éter (Merck) . Las fases acuosas se combinaron, filtraron y liofilizaron .

Los péptidos brutos se analizaron y purificaron mediante RP-HPLC semipreparatoria (Reprosil GOLD C18 300, 250*10 mm, tamaño de partícula 5 µ?a) y un gradiente de 32-55% B (A: 0,1% de TFA-H20; B: 0,1% de TFA-CH3CN) durante 25 min a una tasa de flujo de 2,5 mi min-1, con posterior liofilización .

El rendimiento sintético se determinó mediante cálculo de las áreas integradas debajo de los picos de la señal de 220 nm del análisis bruto en RP-HPLC. El peso molecular correcto se verificó utilizando cromatografía líquida, ionización por electropulverizacion y espectrometría de masas (LC-ESI-MS) en un 6520 Accurate Mass Q-TOF LC/MS (Agilent Technologies). La pureza del producto se verificó utilizando RP-HPLC (Reprosil GOLD C18 300, 250*4,6 mm, tamaño de partícula 3 m) utilizando un gradiente de 35-55% B durante 25 min a una tasa de flujo de 1,0 mi min-1.

Conjugación con DOTA Se redujeron 3 mg de amida de PEP07834 (amida de SEQ ID NO: 160) con 20 mM de DTT a 40°C durante 30 minutos. Se eliminó el exceso de DTT mediante intercambio de solución amortiguadora en una columna PD-10 (GE Healthcare) en acetato de amonio 0,2 M , pH 5,5. El acoplamiento se llevó a cabo con un exceso molar de cinco veces de quelante, solución de maleimido-mono-amida-DOTA ( acrocyclics, Cat . No. B-272) en agua (1 mg/ml). La mezcla se incubó durante 1 hora a 30°C con agitación continua. La purificación de los quelantes no conjugados se llevó a cabo en una columna semipreparativa de RPC (Zorbax 300SB C18, 9,4x250 mm, 5 m) . El grado de acoplamiento del material purificado se analizó mediante HPLC-MS en una columna analítica Zorbax 300SB C8 150 x 2,1 mm, 3,5 µ?a. Solamente PEP07834 conjugado con maleimida-DOTA, denominado PEP07975, se detectó mediante el método.

Resul tados En base al perfil de elución del material bruto, se determinó que el rendimiento sintético del polipéptido de unión a albúmina PEP07834-amida (SEQ ID NO: 160-amida) fue 8%. El peso molecular encontrado fue 4952,9 Da, que está de acuerdo con el peso molecular teórico calculado en 4952,6 Da. En el análisis del producto purificado se descubrió que aproximadamente 10-15% de la proteína era un homodímero enlazado por disulfuro (Figura 4 y 5) . La actividad de unión del péptido conjugado a DOTA (PEP07975) se confirmó tal como se describe en el Ejemplo 2 (no se muestran los datos) y la temperatura de fusión de determinó tal como se describe en el Ejemplo 3.

Ejemplo 6: Evaluación de inmunogenicidad de polipéptidos de unión a albúmina Se sometieron a detección PEP07913 (SEQ ID NO: 153), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) y PEP07968 (PEP07911 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 159) para determinar su capacidad para inducir la proliferación de células T en células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) de 52 individuos humanos caucásicos (adquiridos de CRI-Labo Medische Analyse, Gent, Bélgica) . El PEP07913 corresponde a la secuencia de G148-GA3 que tiene un residuo de glicina en el extremo N terminal, mientras que PEP07912, PEP07914 y PEP07968 son ejemplos de los polipéptidos de unión a albúmina de PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID N0:13) y PP037 (SEQ ID NO:37) que tienen diferentes adiciones de aminoácidos en el extremo N terminal de acuerdo con la presente divulgación.

Materiales y métodos Se agregaron PBMC, preparadas de acuerdo con los métodos biológicos con células estándares, a un placa de fondo redondo de 96 pocilios (Falcon) tratada con cultivo tisular (CT) en una cantidad de 300000 PBMC/pocillo . Las células se estimularon mediante la adición de 100 µ?/pocillo de polipéptidos de unión a albúmina PEP07913, PEP07912, PEP07914 y PEP07968 en medio AI V (Invitrogen) que contenia adicionalmente 900 pg/ml (exceso molar de 3 veces) de albúmina humana recombinante (Albucult®, Novozymes) . Esto corresponde a una concentración final de polipéptido de unión a albúmina de 30 µg/ml. La estimulación se llevó a cabo en octuplicados, es decir, el mismo polipéptido de unión a albúmina se agregó a ocho pocilios en cantidades idénticas y en las mismas condiciones. En los pocilios de testigo positivo, las células se estimularon con 30 pg/ml de hemocianina de lapa californiana (KLH, Calbiochem) o 30 pg/ml de toxoide de tétano (TT, Statens Serum Institut) . En pocilios de testigo negativo, solo se agregó medio AIMV con o sin 900 pg/ml de albúmina.

La proliferación celular se evaluó después de siete días de cultivo usando un kit de ensayo de citometria de flujo Alexa Fluor 488 Click-iT EdU (Invitrogen) . Se agregó 1 µ?/pocillo de marcador de incorporación EdU el sexto día. El séptimo día, las células se lavaron, se disociaron de la placa, se lavaron nuevamente y se tiñeron durante 30 minutos con reactivo anti-CD3-PerCP (Becton Dickinson) y reactivo anti-CD4-Alexa647 (Becton Dickinson) . Luego del teñido, las células se lavaron, se fijaron (BD cellfix, BD biosciences) , se permeabilizaron (utilizando saponina) y se tiñeron para EdU mediante la adición del reactivo Click-iT de acuerdo con el protocolo del fabricante ( Invitrogen) . Después de finalizar el teñido, las células se lavaron nuevamente y se analizaron utilizando citometria de flujo ( FACSCantoII , BD Biosciences) . Para evaluar la cantidad de células proliferativas , se agregó una cantidad fija de fluoesferas (Invitrogen) en cada pocilio antes del análisis. Todos los procedimientos de teñido y lavados se llevaron a cabo directamente en la placa de 96 pocilios.

Los datos de FACSCantoII sin procesar se agruparon jerárquicamente para las células T CD3+ CD4+ y se registró la cantidad de células agrupadas asi como su intensidad de fluorescencia del marcador de incorporación EdU-Alexa Flour 488. Los valores promedio de la cantidad dé células proliferativas/octuplicados de pocilios tratados con proteina se compararon con los testigos positivo y negativo y se calcularon las relaciones resultantes, descritas como índices de estimulación (IE) . En base al IE y a la variación entre los replicados, se establecieron los valores umbrales de IE en 2,0 y 0,5 para estimulación e inhibición, respectivamente.

Resul tados Los polipéptidos de unión a albúmina PEP07913, PEP07912, PEP07914 y PEP07968 se evaluaron para determinar su potencial inmunógeno en presencia de un exceso de 3 veces de albúmina humana recombinante en una población humana objetivo utilizando un ensayo de proliferación de PBMC in vitro. En comparación con el testigo de albúmina, PEP07913 indujo la proliferación de las células T CD3+CD4+ en 6 de 52 donantes, PEP07912 en 5 de 52 donantes y PEP07914 y PEP07968 en 1 de 52 donantes (Figura 6A) .

El índice de estimulación promedio (IE) para los 52 donantes no fue considerablemente diferente para PEP07914 y PEP07968 en comparación con el testigo negativo que contenía albúmina humana recombinante (p = 0,79 y 0,48 respectivamente, Figura 6B) . El IE para PEP07913 fue considerablemente más alto (p = 0,002) mientras que el IE para PEP07912 fue más alto pero no de forma considerable (p=0, 03, Figura 6B) .

En comparación con la solución amortiguadora sola, la cantidad de individuos con repuesta fue 10 para PEP07912, 7 para PEP07912, 2 para PEP07914, 1 para PEP07968, 2 para la albúmina humana recombinante y 49 y 51 para los dos testigos positivos TT y KLH, respectivamente (Figura 6C) . Los polipéptidos de unión a albúmina se clasificaron de acuerdo con su inmunogenicidad en el siguiente orden: PEP07913 > PEP07912 > PEP07914 > PEP07968. PEP07914 y PEP07968 se definieron como no inmunógenos . Por consiguiente, los resultados anteriores demuestran que el potencial inmunógeno de los polipéptidos de unión a albúmina de la presente divulgación es bajo, en comparación con los testigos positivos .

Ejemplo 7: Afinidad de los polipéptidos de unión a albúmina con albúmina de diferentes especies En este ejemplo, PEP06923 (SEQ ID NO: 154), PEP07986 (SEQ ID NO: 163) y PEP08296, (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO:148), expresados y purificados tal como se describe en el Ejemplo 1, se caracterizaron por su afinidad con albúmina de humano (HSA) , mono cangrejero (CSA) , ' rata (RSA) , ratón (MSA) y perro (DSA) utilizando un instrumento Biacore.

Materiales y métodos El análisis con biosensor en un instrumento Biacore2000 (GE Healthcare) se 11evó a cabo con HSA (Albucult®, Novozymes), CSA (purificado in situ a partir de suero cangrejero), RSA (Sigma-Aldrich, Cat . No. A6272), MSA (Sigma-Aldrich, Cat. No. A3559) y DSA (MP Biomedicals, Cat. No. 55925) , inmovilizado mediante acoplamiento con amina sobre la capa de dextrano carboxilado de las superficies de chips CM-5 (grado de investigación; GE Healthcare) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

En el chip 1, la superficie 1 se activó y desactivó y se usó como célula de referencia (superficie en blanco) durante las inyección, mientras que la superficie 2 comprendía HSA inmovilizada en 1130 unidades de resonancia (UR) , la superficie 3 comprendía CSA inmovilizada en 1046 UR, la superficie 4 comprendía RSA inmovilizada en 831 UR. En el chip 2, la superficie 1 se usó como superficie en blanco, mientras que la superficie 3 comprendía MSA inmovilizada en 858 UR. En el chip 3, la superficie 1 se usó como superficie en blanco, mientras que la superficie 2 comprendía DSA inmovilizada en 1053 UR.

Para el análisis de afinidad para HSA, CSA y RSA (chip 1), las variantes de polipéptido de unión a albúmina purificadas se diluyeron en solución amortiguadora de pasada HBS-EP (GE Healthcare) hasta alcanzar 40 nM, 10 nM y 2,5 nM; para el análisis de afinidad para MSA (chip 2) las variantes de polipéptido de unión a albúmina se diluyeron hasta alcanzar 1280 nM, 640 nM, 160 nM y 40 nM y para el análisis de afinidad para DSA (chip 3) las variantes de polipéptido de unión a albúmina se diluyeron hasta alcanzar 1280 nM, 640 nM, 160 nM, 40 nM y 10 nM. Los polipéptidos de unión a albúmina se inyectaron a una tasa de flujo constante de 50 µ?/min durante 5 minutos, con posterior inyección de HBS-EP durante 60 minutos. Las superficies se regeneraron con una inyección de 25 µ? de HC1, 10 mM. Todas las muestras se pasaron en duplicados .

Los resultados se analizaron con un programa informático BIAevaluation (GE Healthcare) . Las curvas de la superficie en blanco se restaron de las curvas de las superficies de ligando .

Resultados El instrumento Biacore 2000 tiene una limitación técnica que dificulta las mediciones de afinidad muy alta. Por consiguiente, el objetivo del estudio con Biacore no fue determinar los parámetros cinéticos exactos de la afinidad de las variantes del polipéptido de unión a albúmina con HSA, CSA, RSA, MSA y DSA respectivamente. Sin embargo, los resultados proporcionan una estimación cuantitativa de las afinidades relativas de los polipéptidos adjuntos con la albúmina para estas especies diferentes. Después de restar la superficie de referencia e inyectar la solución amortiguadora, las curvas se ajustaron a un modelo de unión 1:1 (Langmuir) utilizando un programa informático BIAevaluation con corrección de transferencia de masa y con RUmax como parámetro local. Las curvas de unión representativas se muestran en la Figura 7.

PEP07986 y PEP08296 (PEP08185 conjugado con DOTA) se unen con alta afinidad (KD en el rango de por debajo de picomolar a por debajo de nanomolar) con seroalbúmina humana asi como con albúmina de especies de modelo preclinico frecuentes como rata, mono cangrejero, ratón y perro. Las afinidades relativas con las diferentes especies pueden clasificarse como RSA > HSA/CSA > MSA/DSA, es decir, los valores KD clasificados como KD-RSA = D-HSA/KD-CSA < KD-MSA/KD-DSA-Las afinidades en términos de valores KD son iguales o ligeramente más bajas (pero en el mismo orden de magnitud) que la afinidad obtenida para PEP06923 (polipéptido que no pertenece a la invención) .

Ejemplo B: Actividad in vitro de variantes de proteina Z fusionadas a un polipéptido de unión a albúmina En este ejemplo se evaluaron polipéptidos que comprendían variantes de proteina Z específicas de citocina (derivado del dominio B de proteína A estafilocócica ) genéticamente fusionadas a la variante de polipéptido de unión a albúmina PP013 (SEQ ID NO: 13) para determinar su funcionalidad, siendo esta para bloquear la proliferación de células TF-1 inducida por citocina en presencia de seroalbúmina humana. La proliferación de células TF-1 depende de la presencia de cualquiera de los diferentes tipos de citocinas y la respuesta proliferativa puede inhibirse mediante reactivos de bloqueo tales como la variante de proteina Z especifica de citocina correspondiente. Se usó PP013 fusionado a una variante de proteina Z con especificidad para una proteina irrelevante como testigo negativo.

Materiales y métodos Clonación de proteínas de fusión Z - PP013 Los fragmentos de genes de variantes de proteina Z con especificidad para la citocina X o Y respectivamente o para una proteina irrelevante (testigo negativo) se amplificaron mediante PCR usando cebadores de adición de sitios de endonucleasa específicos PstI y Accl . Los fragmentos se escindieron con PstI y Accl, se purificaron y se ligaron a un vector de expresión, el plásmido pAY02512, restringido con las mismas enzimas. pAY02747 contiene un origen de replicación de pBR322, un gen de resistencia a kanamicina y un promotor T7 para la expresión del gen de interés. El sitio de clonación está precedido por una secuencia que codifica los aminoácidos MGSSLQ y sucedido por una secuencia que codifica VDSS-PP013, donde PP013 es el polipéptido de unión a albúmina divulgado con la SEQ ID NO: 13. La ligación, transformación y verificación de secuencia se llevaron a cabo tal como se describió anteriormente. Las proteínas codificadas fueron: 1) GSSLQ-ZX-VDSS-PP013 (denominada ZX-PP013) 2) MGSSLQ-ZY-VDSS-PP013 (denominada ZY-PP013) 3) MGSSLQ-Zneg-VDSS-PP013 (denominada Zneg-PP013) Expresión proteica ZX-PP013, ZY-PP013 y Zneg-PP013 se expresaron en células BL21 (DE3) de E. coli. Se utilizaron colonias de las transformaciones de cada variante de fusión para inocular los cultivos iniciales de 50 mi de medio TSB+YE complementado con kanamicina hasta alcanzar una concentración de 50 pg/ml. Los cultivos se cultivaron a 37 °C durante toda la noche con agitación, 100 rpm. A continuación se usaron los cultivos iniciales para inocular 900 mi de medio TSB+YE complementado con kanamicina hasta alcanzar una concentración de 50 pg/ml. Los cultivos se cultivaron durante aproximadamente 1,5 h hasta alcanzar un OD600 de >1,1, luego se agregó IPTG hasta una concentración final de 0,2 mM. El cultivo continuó durante cinco horas. Los granulados celulares se recogieron mediante centrifugación (15600 g, 4°C, 20 minutos) y se almacenaron a -20°C hasta la purificación.

Purificación de proteína Se volvieron a suspender granulados celulares congelados que alojaban las variantes de proteina de fusión solubles Zx-PP013, ZY-PP013 y Zneg-PP013 en 50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, pH 8 y se agregaron 1000 U de Benzonase® (Merck Cat . No. 1.01654.0001). Las células se destruyeron mediante ultrasonidos y para cada una de las variantes de proteina de fusión, la suspensión sometida a ultrasonidos se clarificó mediante centrifugación (15 min, 37000 g, 4°C). Se agregó solución amortiguadora TST 20x (20x [25 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 200 mM de NaCl, Tween 20 al 0,05%, pH 8,0]) a un volumen que resultó en 1 ? solución amortiguadora TST en la suspensión clarificada. Cada muestra de la variante de proteina de fusión se cargó en una columna de HSA-Sefarosa (GE Healthcare) . Después del lavado con solución amortiguadora TST y posteriormente con 5 mM de NH4Ac, pH 5,5, la variante de proteina de fusión unida se eluyó con HAc 0,5 M, pH 2,5.

Las variantes de proteina de fusión se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de fase inversa (RPC) , de la siguiente forma. Para cada una de las variantes, el eluato de la etapa de purificación de afinidad con HSA se cargó en una columna de 1 mi Resource 15 RPC (GE Healthcare) , equilibrada previamente con solución amortiguadora A de RPC (0,1% de TFA en agua) . Después del lavado de la columna con 10 CV de solución amortiguadora A de RPC y 5 CV de solución amortiguadora B de RPC (0,1% de TFA en acetonitrilo) , las proteína de fusión unidas se eluyeron con un gradiente lineal de 10-50% de solución amortiguadora B de RPC en 20 CV. La tasa de flujo era 2 ml/min y se monitoreó la absorbancia a 280 nm. Las fracciones que contenían las variantes de proteína de fusión puras se identificaron mediante análisis por SDS-PAGE y se agruparon. Finalmente, la solución amortiguadora se cambió por lxPBS (2,68 mM de KC1, 137 mM de NaCl, 1,47 mM de KH2P04, 8,1 mM de Na2HP04, pH 7,4) utilizando una columna de desalinización PD-10 descartable (GE Healthcare) . Para verificar la identidad de las variantes de proteína de fusión, se llevaron a cabo análisis mediante SDS-PAGE y LC/MS tal como se describe en el Ejemplo 1.

Ensayo celular in vitro de proteínas de fusión Z- PP013 La línea celular TF-1 (CLS Cat . No. 300434) se propagó tal como recomendó el proveedor en medio RPMI 1640 + 10% de suero de ternero fetal (Gibco) con la adición de 2 ng/ml de rhGM-CSF (Miltenyi) . El día del experimento, las células se lavaron en el medio RPMI 1640 + 10% de suero de ternero fetal para eliminar el GM-CSF.

Se analizó la capacidad de ZX-PP013 y ZY-PP013 para bloquear la proliferación inducida por citocina mezclando las moléculas ZX-PP013, ZY-PP013 y Zneg-PP013 con citocinas X y Y respectivamente y con un exceso molar de cinco veces de HSA (Albucult®, Novozymes) . Las moléculas se titularon en una serie de dilución de 2 veces con una concentración fija de citocina (4,9 pM) y un exceso molar de cinco veces de HSA. La titulación se llevó a cabo en placas de 96 pocilios en un volumen de 100 µ? . Se agregaron 25000 células por pocilio (100 µ?) y las placas se incubaron a 37°C, 5% de C02 durante tres días. Para medir la proliferación, se agregaron 19 µ? por pocilio de reactivo de proliferación celular CCK-8 (Sigma) diluido dos veces en medio RPMI 1640 + 10% de suero de ternero fetal. La reacción de color se monitoreó después de 4 horas utilizando un lector de placa de 96 pocilios (Victor3; PerkinElmer ) .

Resultados Tal como se muestra en la Figura 8, ZX-PP013 y ZY-PP013 inhibieron la proliferación inducida por citocina respectiva en presencia de HSA mientras que Zneg~PP013, el testigo negativo, no afectó la proliferación de TF-1. Por consiguiente, el experimento muestra que se conservó la función de las moléculas Z cuando se incorporó una proteina de fusión que contenia el polipéptido de unión a albúmina y también cuando las proteínas de fusión estaban unidas a la albúmina .

Ejemplo 9; Estabilidad prolongada de un polipéptido de unión a albúmina En este ejemplo, se investigó la estabilidad de PEP07986 (SEQ ID NO: 163), expresado y purificado tal como se describe en el Ejemplo 1, tras el almacenamiento a 4, 25 y 40°C por hasta tres meses. El estado del polipéptido después del almacenamiento se investigó midiendo su unión a HSA utilizando un ins Itrumento Biacore.

Materiales y métodos Se devolvió PEP07986 liofilizado en una solución amortiguadora de NaPi estéril (20 mM fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,2) a una concentración de 2 mg/ml. Se recogió una muestra de referencia (tiempo = 0) y se almacenó a -80°C. Se almacenaron alícuotas de 105 µ? en tubos eppendorf con tapa a rosca estériles sellados con parafilm a 4, 25 y 40°C. Después de una semana, dos semanas, un mes y tres meses, una muestra almacenada a cada temperatura se enfrió hasta alcanzar 4°C, se centrifugó durante 5 min a 13000 rpm y a continuación se almacenó a -80°C para luego proceder al análisis en Biosensor.

El análisis en Biosensor se llevó a cabo esencialmente como se describe en el Ejemplo 2 pero con HSA (Albucult®, Novozymes), inmovilizada en 704 unidades de resonancia (UR) y la variante de polipéptido de unión a albúmina se diluyó hasta alcanzar 10 nM y se inyectó a una tasa de flujo constante de 20 µ?/min durante 10 minutos, con posterior inyección de HBS-EP durante 10 minutos.

Resultados La unión a HSA de PEP07986 (SEQ ID NO: 163} se conservó después del almacenamiento a 4, 25 y 40 °C durante al menos tres meses. Las máximas respuestas de unión a HSA obtenidas para PEP07986 almacenado en las diversas condiciones se muestran en la Figura 9.

Ejemplo 10: Estabilidad de un polipéptido de unión a albúmina en condiciones extremas En este ejemplo se describe el análisis en biosensor y de dicroismo circular (CD) del polipéptido de unión a albúmina PEP08296 (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 148) después del tratamiento térmico (90°C) en solución amortiguadora de pH bajo (~4,0). Dado que dichas condiciones de reacción extremas deben usarse por ejemplo para el etiquetado con 68Ga de la proteínas modificadas con DOTA, la influencia del tratamiento a alta temperatura y pH bajo sobre la identidad estructural del polipéptido y su capacidad para unirse a HSA se investigó midiendo la temperatura de fusión (Tm) , la propiedades de repliegue y la unión a HSA.

Materiales y métodos Análisis en Biosensor de la estabilidad térmica Se llevó a cabo un análisis en biosensor en un instrumento Biacore2000 (GE Healthcare) con HSA (Albucult®, Novozymes), inmovilizada mediante acoplamiento de amina sobre la capa de dextrano carboxilado de las superficies de chips C -5 (grado de investigación; GE Healthcare) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La superficie 1 del chip se activó y se desactivó y se usó como célula de referencia (superficie en blanco) durante las inyecciones, mientras que la superficie 2 comprendía HSA inmovilizada en 724 unidades de resonancia (UR) . Se diluyó PEP08296 (50 µ?, 100 µ?) en un tubo Falcon de 15 mi con 450 µ? de acetato de sodio 0,2 M (NaAc) pH 5,5 hasta una concentración final de péptido de 0,2 mg/mL. Después de la adición de 1,5 mi de HCl 0,05 M (asemejándose a las condiciones y volumen utilizados para eluir un generador 68Ge/68Ga) la muestra se incubó durante 10 minutos a 90°C o TA (testigo) y luego se transfirió a TA. Se agregaron 6 mi de citrato de sodio 0,1 M para neutralizar el pH. El PEP08296 tratado térmicamente (0,8 y 4 nM) se inyectó a una tasa de flujo constante de 50 µ?/min durante 5 minutos, con posterior disociación en HBS-EP durante 15 minutos. Las superficies se regeneraron con una inyección de 25 µ? de HCl, 10 mM. Los resultados se analizaron con un programa informático BIAevaluation (GE Healthcare) . Las curvas de la superficie en blanco se restaron de las curvas de las superficies de ligando.

Determinación de la temperatura de fusión (Tm) El PEP08296 se disolvió en PBS hasta alcanzar una concentración final de 0,5 mg/ml. Se preparó PBS con un pH de aproximadamente 4,0 mediante adición de 9,5 µ? de HC1 100 mM a 100 µ? de PBS. El análisis de dicroísmo circular (CD) se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 3.

Análisis por CD de la estabilidad térmica Para investigar la reversibilidad estructural de PEP08296 después del tratamiento térmico se registraron dos espectros de CD entre 195 y 250 por muestra a 20°C. Después del primer espectro, se llevó a cabo un ciclo VTM con calentamiento hasta alcanzar 90 °C tal como se describió anteriormente y luego se recogió el segundo espectro de CD entre 195 y 250 nm a 20°C. Adicionalmente , se incubó el PEP08296 en solución amortiguadora de PBS a pH 4,0 o solución amortiguadora de PBS a pH 7,2 durante 12 minutos a 90 °C en una termomezcladora (500 rpm, intervalo de mezcla 10 s encendido, 30 s apagado) . Después de la incubación, las muestras se enfriaron sobre hielo y posteriormente se sometieron a centrifugación a 13000 rpm durante 1 minuto y se registró un espectro de CD entre 195 y 250 nm a 20°C.

Resultados Se utilizó el análisis en biosensor para investigar si el tratamiento térmico en combinación con el pH bajo, es decir, las condiciones habituales necesarias para el etiquetado con 68Ga de un polipéptido, afectaría la capacidad del PEP08296 para unirse a HSA. La Figura 10 muestra el resultado de este análisis de unión que se llevó a cabo con un instrumento Biacore 2000. Se inyectaron dos concentraciones diferentes de PEP08296, 0,8 nM y 4 nM en una superficie con 724 UR de seroalbúmina humana inmovilizada. El tratamiento térmico durante 10 min a 90°C, pH 4,0, redujo ligeramente la capacidad de unión de PEP08296 a HSA, lo cual indica un potencial cambio estructural de la molécula.

Se utilizó CD para investigar adicionalmente el potencial cambio estructural de la molécula. Espectros de CD similares antes y después del calentamiento probarían que una muestra es reversible estructuralmente . En el primer experimento, las muestras se calentaron con un gradiente de temperatura de 20°C a 90°C. Los espectros de CD antes y después del tratamiento térmico fueron similares en el experimento de determinación de Tm con el mínimo típico a 207 y 221 nm que indica una -helicidad, es decir, el calentamiento en corto tiempo hasta alcanzar 90°C en solución amortiguadora con pH 4 o pH 7,2 no tuvo efecto sobre la estructura de PEP08296.

Sin embargo, el pretratamiento de PEP08296 durante 12 minutos a 90 °C mostró una reducción ligera en el contenido de hélices alfa de PEP08296 al incubarlo a pH 4,0, pero ningún cambio en el contenido de hélices alfa al incubarlo a pH 7,2. En la Figura 11 se muestran las superposiciones típicas de dos espectros de CD antes y después del calentamiento.

Los resultados de la determinación de la temperatura de fusión (Tm) se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4. Tm de PEP08296 Ejemplo 11: Obtención de imágenes de acumulación sanguínea utilizando un polipéptido de unión a albúmina etiquetado con En los experimentos que componen este ejemplo se siguió la distribución en todo el cuerpo de PEP08296 (PEP08185 conjugado con DOTA, SEQ ID NO: 148) etiquetado con 68Ga en ratas mediante obtención dinámica de imágenes durante 1,5 horas. Debido a la fuerte asociación entre el polipéptido etiquetado y la seroalbúmina, el polipéptido etiquetado puede utilizarse, por ejemplo, para estudiar la acumulación sanguínea y la permeabilidad vascular.

Materiales y métodos Etiquetado de PEP08296 con 68Ga Se eluyó 68Ga como 68GaCl3 del generador de 68Ge/68Ga (Obninsk, Rusia) con HC1 0,1 M, se convirtió en 68GaCl4- con HC1 concentrado, se atrapó en una columna de intercambio aniónico (Chromafix-HC03) y posteriormente se eluyó con agua de 18 ?O, tal como se describió anteriormente (Velikyan et al (2008), Nucí Med Biol 35:529-536).

El etiquetado se llevó a cabo esencialmente como se describe en Tolmachev et al. (EJNMMI 37:1356-1367, 2010). El eluato de 68Ga concentrado (150-200 µ?) se agregó a PEP08296 (=100 ug en solución amortiguadora de acetato de sodio 0,2 M pH 5,5) y el pH se ajustó hasta alcanzar 3,5-4 utilizando acetato de sodio (1,25 M) o HC1 (0,1 M) . La mezcla de etiquetado se incubó a 90°C durante 15 min antes de enfriarse y la proteína etiquetada se aisló mediante purificación de exclusión por tamaño en una columna NAP-5 eluida con solución salina amortiguada fisiológicamente.

La pureza radioquímica y la identidad de la proteína etiquetada con 68Ga se evaluó mediante radio-HPLC utilizando detectores de UV (210 nm) y radiactividad en serie y una columna Superdex Peptide 10/300 GL (GE Healthcare) eluida con solución salina amortiguada fisiológicamente.

PET en animales pequeños Se anestesió una rata (277 g) con isoflurano ( inicialmente 5%, luego 2% mezclado con 7:3 aire/02) , se controló mediante un vaporizador E-Z utilizando una mascarilla de suministro de oxígeno a alta concentración icroflex de Euthanex Corporation y se mantuvo sobre una almohadilla de calentamiento (37°C) mientras estaba dentro del sistema microPET Focusl20 (Siemens, CTI Concorde Microsystems) . Se dispensó 68Ga-PEP08296, 33 MBq, en una jeringa, diluido con solución salina hasta alcanzar 0,5 mi y se inyectó a través de la vena de la cola. Se obtuvieron datos de todo el cuerpo moviendo el lecho en un protocolo de movimiento constante del lecho durante 1,5 h. Los datos de procesaron con MicroPET Manager y se corrigieron los datos aleatorios, el tiempo muerto y la desintegración. Las imágenes se reconstruyeron con retroproyección filtrada 2D estándar utilizando un filtro de rampa y se evaluaron utilizando el programa informático Inveon Research Workplace (Siemens Medical Solutions) .

Resultados Los patrones de distribución básica (Figura 12) para PEP08296 fueron muy similares a los de la albúmina etiquetada con radioisótopos tales como 68Ga-DOTA, 64Cu-DOTA y nC (ver, por ejemplo, Hoffend et al (2005), Nucí Med Biol 32:287-292 y Lu et al (2008), " [ l-nC] Butanol and [Methyl-nC] Albumin for Blood Flow and Blood Pool Imaging", presentado en el Xlth Turku PET Symposium, 24-27 de mayo de 2008) . Brevemente, se observaron concentraciones altas de radiactividad en los principales vasos sanguíneos a través del barrido. Los órganos con grandes volúmenes de sangre (hígado, bazo y riñon) también estaban claramente definidos, así como la radiactividad en la acumulación sanguínea cardíaca. La radiactividad en la vejiga urinaria aumentó durante el período de observación, siendo consistente esta observación de la eliminación renal con observaciones previas con trazadores en base a albúmina etiquetados y con el metabolismo de la albúmina en sí.

El patrón de distribución general de radiactividad y el aclaramiento del plasma muy lento después de la inyección intravenosa de 68Ga-PEP08296 son consistentes con su unión esperada muy rápida y fuerte a la albúmina. Estos resultados, por lo tanto, respaldan las aplicaciones adicionales del radiotrazador como un agente para la obtención de imágenes de acumulación sanguínea in vivo para uso con estudios de tomografía por emisión de positrones de permeabilidad de tejido, durante el desarrollo de la enfermedad o durante la intervención terapéutica.

Ejemplo 12: Solubilidad de un polipéptido de unión a albúmina Se investigó la solubilidad de PEP07986 (SEQ ID NO: 163) en solución amortiguadora fisiológica mediante concentraciones consecutivas de la muestra utilizando ultrafiltración, con posterior medición de la concentración e investigación del estado de agregación. Las concentraciones determinadas mediante lecturas de absorbancia directa a 280 nm fueron consistentes con las concentraciones determinadas mediante filtración en gel, exhibiendo una solubilidad de más de 42 mg/ml sin agregados detectados.

Materiales y métodos Se disolvió el PEP07986 liofilizado en una solución amortiguadora de NaPi (20 mM fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,2) a una concentración de 3 mg/ml. Las unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra, corte de 3 kDa, (Millipore, Cat . No. UFC800324) se preenj uagaron con 2 mi de solución amortiguadora de NaPi mediante centrifugación a 4000 g durante 20 min en una centrífuga de rotor basculante (Multifuge, Heraeus) . Se aplicaron 1620 µ? de 3 mg/ml de ???07986· a una primera unidad de filtro centrífugo y se llevó a cabo la centrifugación a 4000 g, 20°C, durante 7 min. Se extrajo una muestra de 25 µ? (muestra 1 de UF) para someterla a análisis adicionales y el resto de la muestra se transfirió a una segunda unidad de filtro centrífugo. La centrifugación y la extracción de una muestra se repitieron tres veces con tiempos de rotación de 8, 9 y 20 min respectivamente (muestras 2, 3 y 4 de UF respectivamente) . Las lecturas de absorbancia se llevaron a cabo utilizando un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 y diluyendo las muestras 1-4 de UF en solución amortiguadora de NaPi 2, 4, 6 y 12 veces respectivamente. Las concentraciones se calcularon utilizando el coeficiente de extinción 1 Abs 280 = 1, 955 mg/ml. La filtración en gel se llevó a cabo en un sistema 1100 HPLC (Agilent Technologies) utilizando una columna Superdex75 10/300 GL (GE Healthcare) que se había equilibrado en solución amortiguadora de NaPi. Se aplicaron 10 µ? de cada muestra de UF a la columna; se utilizó la solución amortiguadora de NaPi como solución amortiguadora de pasada y la tasa de flujo fue 0,5 ml/min. También se recogió un cromatograma de la ovoalbúmina de peso molecular estándar (GE Healthcare), inyectada a una concentración de 5 mg/ml. Las concentraciones se determinaron integrando el área debajo de la curva.

Resultados Las concentraciones determinadas mediante lecturas de absorbancia directas a 280 nm y las concentraciones determinadas mediante filtración en gel se muestran en la Tabla 5. La solubilidad de PEP07986 (SEQ ID NO: 163) es de al menos 42 mg/ml en solución amortiguadora fisiológica (20 mM de fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,2) . No se detectaron agregados mediante la filtración en gel, tal como se muestra en la Figura 13.

Tabla 5. Concentraciones determinadas después de la concentración consecutiva de PEP07986 (SEQ ID NO: 163) Concentraciones (mg/ml) determinadas mediante Muestra Espectrofotómetro Filtración en gel UF2 12,1 12, 4 UF3 22,2 22, 1 UF4 42, 7 42,6 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de unión a albúmina que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de i) LAX3AKX6X7ANX10 EL DX14 YGVS DF YKRLIX26 AKT VEGVEAL X39X4o ILX43X44LP en donde independientemente entre si X3 se selecciona de E, S, Q y C; Xe se selecciona de E, S y C; X7 se selecciona de A y S; Xio se selecciona de A, S y R; ? Xl4 se selecciona de A, S, C y K; X26 se selecciona de D y E; X39 se selecciona de D y E; X40 se selecciona de A y E; X43 se selecciona de A y K; X44 se selecciona de A, S y E; L en la posición 45 está presente o ausente; y P en la posición 46 está presente o ausente; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia definida en i) .

2. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con la reivindicación 1, en donde Xe es E.

3. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde X3 es S .

4. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde X3 es E.

5. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde X7 es A.

6. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Xi4 es S .

7. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde Xi es C.

8. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde Xio es A.

9. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde Xio es S.

10. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 9, en donde X26 es D.

11. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 9, en donde : 26 es E.

12. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 11, en donde X39 es D.

13. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 11, en donde X39 es E.

14. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 13, en donde X40 es A.

15. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 14, en donde X43 es A.

16. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 15, en donde X44 es A.

17. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde 4 es S.

18. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde L en la posición 45 está presente.

19. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde P en posición 46 está presente.

20. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que se une a albúmina de forma que el valor k0ff de interacción es a lo sumo 5 x 10~5 s"1.

21. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con la reivindicación 20 que se une a albúmina de forma que el valor k0ff de interacción es a lo sumo 5 x 10"6 s"1.

22. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de cualquiera de SEQ ID NO: 1-144 y SEQ ID NO: 164-203.

23. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con la reivindicación 22, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de cualquiera de SEQ ID NO: 4-5, SEQ ID NO: 7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO.13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42, SEQ ID NO:49-50, SEQ ID NO:164-170 y SEQ ID NO:192-203.

24. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con la reivindicación 22, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de cualquiera de SEQ ID NO: 1-144.

25. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con la reivindicación 24, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de cualquiera de SEQ ID NO:4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42 y SEQ ID NO:49-50.

26. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además uno o más residuos de aminoácidos adicionales posicionados en el extremo N y/o C terminal de la secuencia definida en i) .

27. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con la reivindicación 26, en el que los aminoácidos adicionales comprenden al menos un residuo de serina en el extremo terminal del polipéptido.

28. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26-27, en el que los aminoácidos adicionales comprenden un residuo de glicina en el extremo N terminal del polipéptido.

29. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26-28, en el que los aminoácidos adicionales comprenden un residuo de cisteina en el extremo N terminal del polipéptido.

30. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26-29, en el que los aminoácidos adicionales comprenden un residuo de lisina en el extremo C terminal del polipéptido.

31. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26-30, en el que los aminoácidos adicionales comprenden un residuo de glicina en el extremo C terminal del polipéptido.

32. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26-31, en el que los aminoácidos adicionales comprenden un residuo de cisteina en el extremo C terminal del polipéptido.

33. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26-32, cuya secuencia de aminoácidos se selecciona de cualquiera de SEQ ID NO: 145-150 y SEQ ID NO:162-163.

3 . Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende no más de dos residuos de cisteina.

35. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con la reivindicación 34 que comprende no más de un residuo de cisteina .

36. Un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que se une a seroalbúmina humana.

37. Una proteina de fusión o conjugado que comprende i) un primer resto que consiste en un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes; y ii) un segundo resto que consiste en un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada.

38. Una proteina de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 37, en el que el segundo resto que tiene una actividad biológica deseada es un polipéptido terapéuticamente activo.

39. Una proteina de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 38, en el que el segundo resto que tiene una actividad biológica deseada se selecciona del grupo que consiste en enzimas, hormonas, factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas y linfocinas endógenos humanos.

40. Una proteina de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 39, en el que el segundo resto se selecciona del grupo que consiste en IL-2, GLP-1, BNP, IL-l-RA, KGF, Stemgen®, GH, G-CSF, CTLA-4, miostatina, Factor VII, Factor VIII y Factor IX.

41. Una proteina de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 38, en el que el segundo resto que tiene una actividad biológica deseada es una proteina biológicamente activa no humana, seleccionada del grupo que consiste en toxinas, enzimas y proteínas de activación bacterianas.

42. Una proteína de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 37, en el que el segundo resto que tiene una actividad biológica deseada es un polipéptido de unión capaz de una interacción selectiva con una molécula objetivo.

43. Una proteína de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 42, en el que el polipéptido de unión se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos y fragmentos y dominios de los mismos conservando sustancialmente la actividad de unión del anticuerpo; microcuerpos , maxicuerpos, avímeros y otras proteínas pequeñas unidas por disulfuro; y proteínas de unión derivadas de un andamiaje seleccionado del grupo que consiste en proteína A estafilocócica y dominios de la misma, otros dominios de tres hélices, lipocalinas, dominios de repetición de anquirina, dominios de unión a celulosa, ? cristalinas, proteína verde fluorescente, antígeno 4 asociado a linfocito T citotóxico humano, inhibidores de proteasa tales como dominios Kunitz, dominios PDZ, dominios SH3, aptámeros peptídicos, nucleasa estafilocócica, tendamistatos , dominio de fibronectina tipo III, transferrina, dedos de zinc y conotoxinas.

44. Una proteína de fusión o conjugado de. acuerdo con la reivindicación 43, en el que dicha molécula objetivo se selecciona del grupo que consiste en péptido ?ß de la enfermedad de Alzheimer; otros péptidos amiloides asociados con enfermedades; toxinas, tales como toxinas bacterianas y venenos de serpiente; factores de coagulación sanguínea, tales como el factor de von Willebrand; interleucinas, tales como IL-13; miostatina; factores proinflamatorios , tales como TNF-OÍ, receptor de TNF- , IL-1, IL-23 e IL-8; factores de complemento, tales como C3 y C5; mediadores de hipersensibilidad, tales como histamina e IgE; antígenos relacionados con tumores, tales como CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD52, CD70, cMet, HERI, HER2, HER3 , HER4 , CAIX, CEA, receptor de IL-2, MUC1, PSMA, TAG-72; y otras moléculas biológicas tales como G-CSF, GM-CSF, GH, insulina y somatostatina .

45. Una proteína de fusión o conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37-44, que comprende un resto adicional que consiste en un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada adicional que puede ser la misma o diferente a la del segundo resto.

46. Una proteína de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 45, en donde el segundo resto es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 38-41 y el resto adicional es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 42-44.

47. Un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37-46, en el que el segundo resto se conjuga con un polipéptido de unión a albúmina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-36 a través del grupo tiol de cualquier residuo de cisteina presente en la posición Xi4 del polipéptido.

48. Un polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además un agente citotóxico .

49. Un polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 48, en donde el agente citotóxico se selecciona de caliqueamicina, auristatina, doxorrubicina, maitansinoide, taxol, ecteinascidina, geldanamicina, metotrexato y sus derivados y combinaciones de los mismos.

50. Un polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además una etiqueta .

51. Un polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 50, en el que dicha etiqueta se selecciona del grupo que consiste en tintes y metales fluorescentes, tintes cromofóricos , compuestos quimioluminiscentes y proteínas, enzimas, radionúclidos y partículas bioluminiscentes.

52. Un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 51, que comprende un ambiente quelante proporcionado por un quelante de poliaminopolicarboxilato conjugado con el polipéptido de unión a albúmina a través de un grupo tiol de un residuo de cisteína o un grupo amina de un residuo de lisina.

53. Un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 52, en donde el quelante de poliaminopolicarboxilato es ácido 1 , , 7 , 10-tetraazaciclododecano-l , , 7 , 10-tetraacético o un derivado del mismo.

54. Un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 53, en donde el derivado del ácido 1 , 4 , 7 , 10-tetraazaciclododecano-1, 4, 7, 10-tetraacético es 10-maleimidoetilacetamida de ácido 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-l , 4,7-tris-acético.

55. Un polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 52, en donde el quelante de poliaminopolicarboxilato es ácido dietilenotriaminopentaacético o derivados del mismo.

56. Un polinucleotido que codifica un polipéptido de unión a albúmina o una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-46.

57. Un método para producir un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-45 que comprende expresar un polinucleotido de acuerdo con la reivindicación 56.

58. Un vector de expresión que comprende un polinucleotido de acuerdo con la reivindicación 56.

59. Una célula huésped que comprende un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 58.

60. Un método para producir un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-36 mediante síntesis de péptidos no biológica utilizando aminoácidos y/o derivados de aminoácidos que tienen cadenas laterales reactivas protegidas, comprendiendo la síntesis de péptido no biológica acoplamiento progresivo de los aminoácidos y/o los derivados de aminoácidos para formar un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-36 que tiene cadenas laterales reactivas protegidas, eliminación de los grupos protectores de las cadenas laterales reactivas del polipéptido y plegado del polipéptido en solución acuosa.

61. Un método para producir un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37-48 que comprende producir un polipéptido de unión a albúmina mediante el método de acuerdo con la reivindicación 60 y conjugar el polipéptido de unión a albúmina con un segundo resto y/o un resto adicional tales como se definen en cualquiera de las reivindicaciones 38-48.

62. Una proteína de fusión o conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37-55 para su uso como medicamento .

63. La proteina de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 62 que no provoca o provoca una respuesta inmune reducida tras la administración a un mamífero, tal como un humano, en comparación con la respuesta inmune provocada tras la administración al mamífero del polipéptido que tiene una actividad biológica deseada per se.

64. Una proteína de fusión o conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37-55 para uso en diagnóstico .

65. Una composición que comprende un compuesto que per se tiene una solubilidad en agua de no más de 100 pg/ml; acoplado con un polipéptido de unión a albúmina, una proteína de fusión o conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-47, en donde el compuesto y el polipéptido de unión a albúmina, proteína de fusión o conjugado se acoplan covalentemente .

66. Una composición de acuerdo con la reivindicación 65, en donde dicha solubilidad no es mayor que 10 g/ml.

67. Una composición de acuerdo con la reivindicación 66, en donde dicha solubilidad no es mayor que 1 µg/ml.

68. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 65-67, en donde dicho compuesto es un compuesto farmacéuticamente activo.

69. Una composición de acuerdo con la reivindicación 68, en donde dicho compuesto farmacéuticamente activo es un agente citotóxico.

70. Una composición de acuerdo con la reivindicación 69, en donde dicho agente citotóxico es tal como se define en la reivindicación 49.

71. Una composición de acuerdo con la reivindicación 69, en donde dicho agente citotóxico es una quimiotoxina sintética no derivada de un compuesto de origen natural.

72. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 65-71, que comprende además un polipéptido de unión que tiene una afinidad de unión con un objetivo clínicamente relevante.

73. Una composición de acuerdo con la reivindicación 72, en donde dicho polipéptido de unión es tal como se define en la reivindicación 43.

74. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 65-73 que comprende además seroalbúmina humana .

75. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 65-74 para su uso como medicamento.

76. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 65-74 para uso en diagnóstico.

77. Un método de preparación de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 65-76 que comprende a) proporcionar un compuesto que per se tiene una solubilidad en agua de no más de 100 \iq/ml; y b) acoplar covalentemente el compuesto con un polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-47, formando asi una composición que comprende un complejo covalente de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado.

78. Un método de acuerdo con la reivindicación 77, que comprende además c) mezclar dicho complejo de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado con albúmina, formando asi una composición que comprende un complejo no covalente de i) el complejo covalente de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado y ii) albúmina.

79. Un método de acuerdo con la reivindicación 78, que comprende además liofilizar dicha composición que comprende el complejo no covalente para obtener una composición liofilizada .

80. Un método para aumentar la solubilidad acuosa de un compuesto que comprende proporcionar un compuesto que per se tiene una solubilidad en agua de no más de 100 µg/ml; acoplar covalentemente el compuesto con un polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-47, formando asi un complejo covalente de compuesto y polipéptido de unión a albúmina; y mezclar dicho complejo de compuesto y polipéptido de unión a albúmina, proteina de fusión o conjugado con albúmina en condiciones que favorecen la asociación no covalente del polipéptido de unión a albúmina con seroalbúmina humana; por el cual la solubilidad en agua del compuesto en dicho complejo es mayor que la solubilidad en agua del compuesto per se.

81. Un método de acuerdo con la reivindicación 80, en donde dicha solubilidad es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 66-67.

82. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 80-81, en donde dicho compuesto es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 68-71.

83. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 80-82, en donde dicho complejo comprende además un polipéptido que tiene una afinidad de unión con un objetivo clínicamente relevante.

84. Un método de acuerdo con la reivindicación 83, en donde dicho polipéptido de unión es tal como se define en la reivindicación 43.