JP6440618B2 - Her3結合ポリペプチド - Google Patents
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Description
i)EKYX4AYX7EIW X11LPNLTX17X18QX20 AAFIGX26LX28D
(式中、互いに独立して、
X4は、A、E、L、M、N、Q、R、S、およびTから選択され;
X7は、FおよびYから選択され;
X11は、EおよびQから選択され;
X17は、K、N、R、およびVから選択され;
X18は、F、M、N、R、T、Y、およびWから選択され;
X20は、AおよびKから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、EおよびQから選択される);および
ii)i)で定義された配列と少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる前記HER3結合ポリペプチドが提供される。
X4は、A、E、M、N、Q、S、およびTから選択され;
X7は、FおよびYから選択され;
X11は、Qであり;
X17は、KおよびRから選択され;
X18は、M、Y、およびWから選択され;
X20は、Kであり;
X26は、Kであり;
X28は、Qである、上記で定義されたようなHER3結合ポリペプチドを提供する。
I)X11は、Qであり;
II)X17X18は、KW、KY、KM、およびRYから選択され;
III)X20は、Kであり;
IV)X28は、Qである。
iii)K−[BM]−DPSQS XaXbLLXc EAKKL NDXdQ;
(式中、
[BM]は、上記で定義されるHER3結合モチーフであり;
Xaは、AおよびSから選択され;
Xbは、NおよびEから選択され;
Xcは、A、S、およびCから選択され;
Xdは、AおよびSから選択される);および
iv)iii)で定義された配列のいずれか1つと少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含んでいてもよい。
v)YAK−[BM]−DPSQS SELLXc EAKKL NDSQA P;
(式中[BM]は、上記で定義されたようなHER3結合モチーフであり、Xcは、SおよびCから選択される);および
vi)v)で定義された配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、上記で定義されたようなHER3結合ポリペプチドも提供される。
vii)FNK−[BM]−DPSQS ANLLXc EAKKL NDAQA P;
(式中[BM]は、上記で定義されたようなHER3結合モチーフであり、Xcは、AおよびCから選択される);および
viii)上記のvii)で定義された配列のいずれか1つと少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むHER3結合ポリペプチドが提供される。
ADNNFNK−[BM]−DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK−[BM]−DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE−[BM]−DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;および
AEAKYAK−[BM]−DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
(式中[BM]は、上記で定義されたようなHER3結合モチーフである)
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの一部を形成してもよい。
ix)AEAKYAK−[BM]−DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;(式中[BM]は、上記で定義されたようなHER3結合モチーフである)、および
x)ix)で定義された配列と少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む。
)と比較して少なくとも4分の1以下である。他の実施形態において、本明細書で定義されるHER3結合ポリペプチドは、前記解離速度(koff)が、配列番号107を含むHER3結合ポリペプチドの解離速度と比較して少なくとも8分の1以下であり、例えば少なくとも12分の1以下であり、例えば少なくとも15分の1以下であるHER3結合ポリペプチドである。より具体的な実施形態において、前記解離速度(koff)は、配列番号107を含むHER3結合ポリペプチドの解離速度と比較して少なくとも20分の1以下である。
対象または対象から単離したサンプルを、本明細書で説明されているようなHER3結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物と接触させる工程、および
前記対象中で、または前記サンプルに結合したHER3結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の量に相当する値を得る工程
を含む前記方法が提供される。
哺乳動物の対象の体に、本明細書で説明されているような放射標識したポリペプチド、融合ポリペプチドまたはコンジュゲートを投与する工程であり、ここで放射性核種はイメージングに好適なものである、工程;および
放射標識したポリペプチドの投与から1〜72時間以内に、医療用イメージング装置を使用して対象の体の少なくとも一部の1つまたはそれ以上の画像を得る工程であり、前記画像は、体内の放射性核種の存在を示す工程
を含む前記イメージング方法が提供される。
新世代のHER3結合Z変異体の合理的な設計
この実施例では、以前の親和性成熟ライブラリー(Kronqvistら、2010、上記)から選択されたHER3結合ポリペプチドZ05416(配列番号106)およびZ05417(配列番号107)、加えてこの実施例で説明されるような蛍光活性化細胞分類法(FACS)で検討したZ05416のアラニンスキャニング分析からの結果に基づいて親和性成熟ライブラリーを構築した。
HER3およびHSAの標識付け:本明細書ではHER3−Fcと称される組換えヒトHER3/Fcキメラ(R&D Systems、カタログ番号348−RB−050)のビオチン化を、ビオチン−XXマイクロスケールタンパク質標識付けキット(Invitrogen、カタログ番号B30010)を供給元の推奨に従って使用して行った。アミノ酸分析を使用して標識されたタンパク質の濃度を決定した。本明細書ではHER3−ECDと称されるHER3(Sino Biological Inc.、カタログ番号10201−H08H)の細胞外ドメインを、NaHCO3(0.1M、pH8.5)中のビオチンカルボン酸、スクシンイミジルエステルと1.5時間コンジュゲートした。その後、グリシンを添加して反応を止め、続いてPD MiniTrap G−25カラム(GE Healthcare、カタログ番号28−9180−07)を製造元の推奨に従って使用して緩衝液をPBS(10mMのホスフェート、137mMのNaCl、2.68mMのKCl、pH7.4)に交換した。Alexa Fluor(登録商標)647スクシンイミジルエステル(Invitrogen、カタログ番号A20006)を供給元の推奨に従って使用して、ヒト血清アルブミン(HSA;Sigma、カタログ番号A−3782)を蛍光標識した。過量のフルオロフォアを全て除去するために、タンパク質緩衝液を、PBS(10mMのホスフェート、137mMのNaCl、2.68mMのKCl、pH7.4)または0.1%Pluronic(登録商標)F108NF界面活性剤(PBSP;BASF Corporation、カタログ番号30085231)が補充されたPBSに交換した。
HER3結合ポリペプチドのアラニンおよびバリン突然変異体のFACS分析:公知のHER3結合剤Z05416のヒトHER3−Fcの細胞外ドメインへの高親和性の結合部位を研究するために、アラニンスキャニング変異誘発を使用した。Z足場中13の元のランダム化した残基をそれぞれアラニンまたはバリンアミノ酸に置換し、それに続くブドウ球菌宿主への形質転換のために各コンストラクトをブドウ球菌ディスプレイベクターにサブクローニングした。13種の置き換えを示すブドウ球菌細胞をビオチン化HER3−Fcと共にインキュベートした。次に細胞を洗浄し、Z変異体分子と融合したアルブミン結合タンパク質(ABP)に結合させて表面発現レベルと抗原結合シグナルの標準化をモニターするために、ストレプトアビジン−Alexa488コンジュゲートおよびHSAと共にインキュベートした。洗浄後、HER3結合に対する各アラニンまたはバリンの置き換えの作用をフローサイトメトリーを使用して分析した。結果から、9、10、および17位でのアラニン置換は、HER3−Fcへの親和性を大幅に低下させたことが示されたことから、これらの位置は標的との結合に関与することを示す(図2)。さらに残基27位でのアラニンの置き換えは、標的に対してわずかに増加した親和性を示したことから、元の残基は標的との結合にそれほど大きい影響を及ぼさないことを示す。
ンパク質を発現したことが示された。したがってHER3結合ポリペプチドの新しい成熟ライブラリーがうまく構築された。
HER3結合Z変異体の選択、スクリーニング、および特徴付け
材料および方法
細胞の標識付けおよびFACSを使用したブドウ球菌のセルソーティング:実施例1で設計されたライブラリーSc:ZHER3LIB2(少なくとも10倍のライブラリーサイズ、すなわち6.7×108種より多くの変異体)のアリコートを10μg/mlクロラムフェニコールを含むTSB−YEに植え付け、37℃、150rpmで一晩増殖した。次の日、遠心分離(6000rpm、6分、4℃)によって細胞を回収し、PBSPで洗浄し、その後実施例1で説明したようにビオチン化したHER3−ECDを添加した。細胞を室温で穏やかに混合しながら結合の平衡に達するまでインキュベートした。氷冷PBSPで洗浄し、その後、フィコエリトリンとコンジュゲートさせた5μg/mlストレプトアビジン(SAPE;Invitrogen、カタログ番号S21388)および300nMのAlexa Fluor(登録商標)647コンジュゲートHSAと共に、氷上で30分、暗所でインキュベートした。細胞を再度一回洗浄し、最後に氷冷PBSPに再懸濁した。ライブラリーを標識し、MoFlo(登録商標)Astrios(Beckman Coulter)フローサイトメーターを使用して合計4回ソートした。ソート1および2については、5nMのビオチン化HER3−ECDでライブラリーを標識し、一方でソート3は、1nM(方策1)または5nM(方策2)のビオチン化HER3−ECDのいずれかによる2つの異なる標識付け方策を使用して行われた。方策2では、続いて細胞を5nMの非ビオチン化HER3−ECDと共に室温で1時間インキュベートし、その後SAPEおよびHSA−Alexa Fluor(登録商標)647で標識付けすることにより、さらにライブラリーに解離速度選択を行った。ソート4の前に、まず細胞を1nMのビオチン化HER3−ECDと共にインキュベートし;次いで細胞を洗浄し、その後1nMの非ビオチン化HER3−ECDを室温で4時間添加することにより、ソート3からの両方の方策に続いて解離速度選択を行った。各回のソーティングでは、およそ10倍のライブラリーサイズに相当する多数の細胞をフローサイトメーターで分析し、最大の比率の細胞表面発現へのHER3結合を示す上位の細胞画分(およそ0.1〜0.5%)を選出し、TSB−YEを含むエッペンドルフチューブにソートした。その後、ソートされた細胞をクロラムフェニコール(1μg/ml)が補充されたTSB−YEに植え付けて一晩増幅させ、引き続き次回のソーティングを行った。最後に、3回目および4回目のソーティング後に単離された細胞を、クロラムフェニコールを含有する寒天プレートに塗り広げた。
の平均蛍光強度(MFI)と細胞表面発現シグナルとの比率に基づき全てのサンプルをランク付けした。加えて、比較のためにZ変異体Z05417前駆体を分析した。
改善されたZ変異体を単離するためのフローサイトメトリーによるソーティング:成熟HER3結合Z変異体を単離するために、ブドウ球菌ライブラリーに4回のFACSを行った。選択プロセス全体を通して、ソーティングパラメーターおよびゲートを変化させることによって、さらに標的濃度を減少させるることに加えて後半のソーティング実行時に解離速度選択を取り入れることによっても、選択のストリンジェンシーを改変した。3回目のソーティングの前に、材料および方法の章で説明されているように異なる標識付け方策(方策1および方策2と称する)を使用した2つの異なるトラックに選択スキームを分けた。
選択されたHER3結合Z変異体の生産および特徴付け
この実施例において、実施例2で説明した細胞に対する親和性のランク付けから上位10種の候補(Z08694〜Z08703;配列番号71〜80;図1を参照)を再度クローニングし、大腸菌細胞抽出物からC末端にHis6−タグを有するZ変異体として精製し、安定性およびHER3への結合親和性に関してさらに特徴付けた。
Z変異体のクローニング、タンパク質発現、および精製:実施例2で選択された10種のHER3結合ポリペプチド(Z08694〜Z08703;配列番号71〜80)をコードするDNA配列を、NdeIおよびXhoI制限部位を導入するプライマーを使用してコロニーからPCRで増幅した。続いて、Z#####−LEHHHHHH様式でC末端にHis6−タグを有するZ変異体単量体をコードするためにNdeIおよびXhoIで制限処理した発現ベクターpET26b+(Novagen)に、Z変異体をクローニングした。Rosetta(DE3)大腸菌細胞にプラスミドをヒートショックによって形質転換した。TSB−YE中37℃で細胞を培養し、OD600がおよそ1に達したら、IPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)を最終濃度1mMまで添加することによりタンパク質発現を誘導した。25℃で一晩インキュベートした後、4000rpm、4℃で8分遠心分離することによって細胞を回収した。細胞ペレットを溶解緩衝液(7M塩化グアニジニウム、47mMのNa2HPO4、2.65mMのNaH2PO4、10mMのトリス−HCl、100mMのNaCl)中に再懸濁し、37℃で2時間、150rpmでインキュベートした。その後、16000rpmで20分、4℃で遠心分離することによって死細胞片を除去した。上清を単離し、変性条件下でHisPur(商標)コバルト樹脂(Thermo Scientific、カタログ番号89965)を使用したIMACによってZ変異体を精製した。3.5kDaカットオフのSlide−A−Lyzer透析カセット(Thermo Scientific)を使用した透析によって緩衝液をPBSに交換した。LC/MS(Agilent Technologies 6520ESI−Q−TOF)およびSDS−PAGEによって精製したZ変異体の分子量および純度を確認した。280nmでの吸光度測定によってタンパク質濃度を決定した。
タンパク質発現および精製:Z#####−His6様式の10種のZ変異体分子単量体(Z08694〜Z08703)から可溶性生成物が優れた生産レベルで生み出され、生産されたバッチの純度は、SDS−PAGE分析により95%を超えると概算された。LC/MS分析によって全ての純粋なZ変異体分子の正確な分子量を確認した。
Z変異体のHER3特異的結合を検討するインビトロでの細胞アッセイ
この実施例において、C末端にHis6−タグを有するZ変異体Z08698およびZ08699を99mTcで放射標識し、それらのインビトロにおける様々な異なる癌細胞株への細胞結合特性を分析した。
Z変異体の標識付け:他のZ変異体に関して上述したようにIsoLinkキット(Covidien)を使用して、実施例3で説明したようにして生産されたC末端にHis6−タグを有するZ変異体Z08698およびZ08699をHis6−タグのところで99mTcで標識した(Orlovaら、Journal of Nuclear Medicine 47:512〜519(2006))。簡単に言えば、滅菌0.9%NaClを用いてUltra−TechneKowジェネレーター(Covidien)から溶出させた99mTc−過テクネチウム酸溶液500μl(200〜320MBq)を、IsoLinkキットのIsoLinkカルボニル標識化剤に添加した。この混合物を100℃で20分インキュベートした。この混合物40μlをそれぞれのZ変異体を含有する溶液(50μg、PBS40μl中およそ6.8nmol)に移し、50℃でインキュベートした。インスタント薄層クロマトグラフィー(ITLC;Tec−コントロールクロマトグラフィーストリップ、Biodex Medical SystemsからのDARK GREEN、カタログ番号150−771を使用)およびPBSでの溶出によって、60分インキュベートした後の標識付けの収率を分析した。Cyclone(商標)ストレージ蛍光体系で薄層クロマトグラフィーストリップに沿った放射活性分布を測定し、OptiQuant(商標)画像分析ソフトウェア(PerkinElmer)を使用して分析した。予め平衡化したNAP−5脱塩カラム(GE Healthcare)を使用して標識されたZ分子を精製し、PBSで溶出させた。ITLCを使用して各調製物の純度を検討し、SDS−PAGEでクロス確認した。
Z変異体の標識付け:IsoLinkキットを使用した放射標識により、99mTc(CO)3−Z08698−His6については43±6%、99mTc(CO)3−Z08699−His6については73±12%の収率が得られた。使い捨てのNAP−5カラムで精製した後、両方の標識されたコンジュゲートについて純度は97%より高かった。
HER3結合Z変異体のインビボでの生体内分布研究
この実施例は、マウスのHER3と交差反応することが実施例3で実証されたZ08698およびZ08699の放射標識したコンジュゲートを使用してマウスで行われたインビボでの研究を説明する。第一に、正常なマウスを使用して、生体内分布特性を研究し、さらに肺、肝臓、胃、小腸、および唾液腺などのHER3が通常発現される臓器における2種の放射標識したZ変異体分子のインビボでの蓄積の特異性を試験した。第二に、前立腺癌の異種移植片を有するヌードマウスで放射標識したZ08699の生体内分布および腫瘍標的化特性をさらに検討した。
実施例4で説明したようにして標識された99mTc(CO)3−Z08698−His6および99mTc(CO)3−Z08699−His6Z変異体を使用して生体内分布研究を行った。実験動物の保護に関する国内法令に従って、動物実験に関する地域倫理委員会によって承認された動物実験を計画し、実施した。
kBq)を静脈内注射した。標識されていないZ変異体分子でマウス1匹あたり1μg(0.13nmol)または10μg(1.3nmol)に希釈することによって注射したタンパク質用量を調整した。注射(pi)から4時間後、致死量の麻酔(体重1グラムあたりケタラール−ロンプン20μl;ケタラール(50mg/ml、Pfizer);ロンプン(20mg/ml、Bayer))の注射により4匹のマウスの群を屠殺し、続いてヘパリン(5000IE/ml、Leo Pharma)ですすいだシリンジで心臓穿刺と採血を行った。血液、肺、肝臓、脾臓、胃、小腸、腎臓、子宮、唾液腺、筋肉、および骨のサンプルを収集し、重さを量り、それらの放射活性を3インチのNaI(TI)検出器(1480WIZARD、Wallac Oy、Turku、Finland)を備えた自動式ガンマカウンターを使用して測定した。100〜160keVのエネルギー範囲でテクネチウム−99m放射活性を測定した。データをバックグラウンドに対して補正した。組織での取り込みを、1グラムあたりの注射された放射活性のパーセントとして(%IA/g)計算した。屠殺体中の放射活性を、全サンプルあたりの%IAとして計算した。何らかの有意差を決定するために(p<0.05)、GraphPadプリズム(バージョン4.00、ウィンドウ用GraphPadソフトウェア)を使用した対応のない両側t検定によって、生体内分布データを統計学的に検討した。
正常なマウスにおける生体内分布研究:雌NMRIマウスで、99mTc(CO)3−Z08698−His6および99mTc(CO)3−Z08699−His6の生体内分布を注射から4時間後に検討した。両方のコンジュゲートが、血液および骨や筋肉などの非HER3発現組織から迅速に排除された。HER3発現組織(肺、肝臓、胃、小腸、および唾液腺)において、より多くのタンパク質用量(10μg、1.3nmol)が注射されたとき、両方のコンジュゲートの取り込み(%IA/g)はより低かった。この結果から取り込みの飽和可能性が示され、これはHER3特異的な標的化の強い裏付けである。
アルブミン結合ドメインと融合した選択されたHER3結合Z変異体の生産
この実施例において、実施例2で説明した細胞に対する親和性のランク付けから2種のHER3結合Z変異体(Z08698およびZ08699)と、2種の参照Z変異体Z05416およびZ05417とを、アルブミン結合ドメインPP013(配列番号109)との融合体として再度クローニングし、大腸菌細胞抽出物から精製した。
Z変異体のサブクローニング:これは、実質的にWO2009/077175で説明される他のZ変異体に関して説明されている通りに行われた。Z変異体単量体をpAY01449ベクターから増幅した。標準的な分子生物学的技術を使用して、N末端および/またはC末端の融合を用いたZ変異体分子を構築するためのサブクローニング方策を適用した。様々なプライマー対を使用してPCRを行い、得られた遺伝子フラグメントを精製し、リガーゼ緩衝液中でハイブリダイズした。ハイブリダイズした遺伝子フラグメントをpAY03362ベクターにサブクローニングし、C末端PP013融合体を得た。HER3結合Z変異体を単量体としてサブクローニングし、発現ベクターによってコードされた正確なコンストラクトはMGSSLQ−[Z#####]−VDSS−[PP013]であった。
Z変異体のサブクローニング:発現ベクターpAY03362でサブクローニングするためのZ変異体を選んだ。クローニングにより、アルブミン結合ドメインPP013と融合した4種の単量体、Z05416、Z05417、Z08698、およびZ08699のうち1種を含む4種の融合タンパク質を得た。
インビトロの増殖アッセイにおけるHER3結合Z変異体の阻害能力の評価
この実施例において、実施例6で説明されているようにC末端でPP013に融合したZ変異体Z08698およびZ08699を、MCF−7細胞を使用したインビトロアッセイでヘレグリンによって誘導された増殖を阻害するそれらの能力について試験した。
全て実施例6で説明したようにして生産された、C末端にアルブミン結合融合パートナーを有するZ変異体Z08698、Z08699、Z05416、およびZ05417を試験した。推奨通りに、完全培地(ピルビン酸ナトリウム(Lonza)、非必須アミノ酸(Lonza)、ペニシリン/ストレプトマイシン(Lonza)、および10%ウシ胎児血清(FCS)(Gibco)が補充されたL−グルタミン含有RPMI1640培地(Lonza))中で、細胞株MCF−7(ATCC HTB−22)を増殖させた。実験日に、細胞を補充なしのRPMI1640で2回洗浄し、アッセイ用培地(ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、ペニシリン/ストレプトマイシン、9μM組換えヒト血清アルブミン(rHSA、Novozymes)+2%透析済みFCS(Gibco)が補充されたL−グルタミン含有RPMI1640培地)に再懸濁した。Z変異体をアッセイ用培地中の200pMのHRG(NRG1−β1/HRG1−β1EGFドメイン、R&D Systems)と混合することによって、ヘレグリン(HRG)によって誘導された増殖をブロックするZ変異体の能力を分析した。固定濃度のHRG(200pM)を含む連続5倍希釈液で分子を滴定した。体積100μlの96ウェルの細胞培養プレートで滴定を行った。ウェル1つ(100μl)あたり1500個の細胞を添加し、プレートを37℃、5%CO2で5日間インキュベートした。インキュベート後、細胞計数キット−8(CCK−8、Fluka、Sigma Aldrich)を使用して各ウェル中の生細胞数の決定を行った。RPMI1640培地で2倍希釈したCCK−8細胞増殖試薬をウェルあたり19μl添加し、4時間後にマイクロプレートリーダー(Victor3、Perkin Elmer)を使用して450nmで吸光度を測定した。4パラメーターの用量作用曲線に対する非線形回帰によって細胞成長のデータを検討し、GraphPad Prism(ウィンドウ用バージョン5.01、GraphPad Software)を使用して半最大阻害濃度(IC50)を決定した。
HRGによって誘導された増殖アッセイにおける評価:図8に結果を示す。HRGによって誘導された増殖アッセイで、アルブミン結合ドメインと融合したZ変異体Z08698およびZ08699の半最大阻害濃度、IC50を決定した。各結合剤の連続希釈液を固定濃度のHRGと混合し、MCF−7細胞と共にrHSAの存在下で5日間インキュベートした。4パラメーターの用量作用曲線に対する非線形回帰によってIC50値を決定した。Z08698およびZ08699について得られたIC50値はそれぞれ0.4nMおよび0.6nMであり、これは、参照ポリペプチドZ05417と比較してインビトロでのブロック能力がそれぞれおよそ100倍および70倍に改善されたことを示す。
HER3リン酸化アッセイにおいてHER3結合Z変異体の阻害能力を検討するインビトロの細胞アッセイ
この実施例において、生産されたC末端のアルブミン結合ドメインを有するZ変異体Z08698およびZ08699を、HER3リン酸化を阻害するそれらの能力について試験した。
実施例6で説明されているようにしてC末端にPP013融合パートナーを有するZ変異体Z08698およびZ08699を生産し、試験した。推奨通りに完全培地で細胞株MCF−7を増殖させた。
HER3リン酸化アッセイ:図9に結果を示す。MCF−7細胞におけるHRGによって誘導されたHER3のリン酸化を阻害する能力を決定した。各結合剤の連続希釈液を固定濃度のHRGと混合し、MCF−7細胞と共にrHSAの存在下で10分間インキュベートした。400nMの濃度で、Z変異体Z08698およびZ08699は、HER3のリン酸化を89%阻害した。この作用はZ変異体の濃度に応じて減少し、40nMで、Z08698およびZ08699は、HER3リン酸化をそれぞれ67%および51%阻害した。4nMで作用はなくなった。これらの結果は、インビトロでのブロック能力が、リン酸化で検討した場合、参照ポリペプチドZ05417と比較しておよそ10倍改善されたことを示す。
HER3結合Z変異体二量体の阻害能力の評価
この実施例では、MCF−7細胞を使用したインビトロのアッセイにおいて、Z−PP013−Zの様式でアルブミン結合PP013と融合したZ08698を含むZ変異体二量体を、ヘレグリンによって誘導されたシグナル伝達を阻害するそれらの能力に関して試験した。Zとアルブミン結合部分との間にそれぞれGGGGSの1回または4回の反復を含む2種の異なるリンカーの長さ、すなわちZ08698−G4S−PP013−G4S−Z08698およびZ08698−(G4S)4−PP013−(G4S)4−Z08698を検討した。
クローニングおよび生産:実質的に実施例6で説明した通りにして、さらにNdelおよびAscI制限部位を取り入れるプライマーを使用した標準的な分子生物学的技術を適用して、二量体Z変異体のサブクローニングを行った。HER3結合Z変異体をPP013と融合した二量体としてサブクローニングしたところ、発現ベクターによってコードされた正確なコンストラクトは、それぞれM−[Z08698]−GAP(GGGGS)TS−[PP013]−GT(GGGGS)PR−[Z08698]、およびM−[Z08698]−GAP(GGGGS)4TS−[PP013]−GT(GGGGS)4PR−[Z08698]であった。大腸菌でこのタンパク質変異体を発現させ、実質的に実施例6で説明した通りに、ただしアフィニティークロマトグラフィー工程の後、且つ最後のPBSへの緩衝液交換の前に分取逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)精製工程を追加することにより精製した。
Z08698−G4S−PP013−G4S−Z08698、Z08698−(G4S)4−PP013−(G4S)4−Z08698、およびZ08698−PP013について得られたIC50値は、それぞれ0.7nM、0.6nM、および1nMであった。したがって、ヘレグリンによって誘導されたシグナル伝達を阻害する能力は、Z−PP013−Z様式の二量体コンストラクトによって増加した。Zとアルブミン結合部分との間のリンカー長さの作用はそれほど重要ではなかった。Z08698−PP013変異体(1nM)のIC50値は、実施例7で説明される増殖アッセイで得られた結果と一致し、参照ポリペプチドZ05417−PP013より優れていることが示された。
99mTc(CO)3で標識したZ変異体を使用したマウスにおけるHER3を発現する異種移植片のイメージング
この実施例において、放射標識されたHER3特異的Z変異体をイメージングへ使用することについての実行可能性を調査した。N末端にHEHEHE−タグを有するZ08699を99mTc(CO)3で標識し、LS174T大腸癌の異種移植片を有するマウスに注射した。注射から4時間後に腫瘍をマイクロSPECT/CTで可視化した。
Z変異体のクローニング、生産、および標識付け:Z08699をコードするDNAを、NdeIおよびXhoI制限部位とN末端HEHEHE−タグのコドンとを取り入れるプライマーを使用したPCRで増幅した。実質的に実施例3で説明したようにして、ただしIMAC精製後に分取逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)精製工程を追加して、HEHEHE−Z08699のサブクローニングおよび生産を行った。ヒスチジル−グルタミル−ヒスチジル−グルタミル−ヒスチジル−グルタミル−(HEHEHE)−タグは、より好都合な生体内分布プロファイルを有し、特に肝臓での取り込みが少ないにもかかわらずIMAC精製が可能なことから、これをHis6タグの代わりに選択した(Tolmachevら、Bioconjug Chem 21:2013〜2022(2010))。IsoLinkキットを使用した99mTc(CO)3での標識付けを実施例4で説明したようにして行った。
図10に、腫瘍を有するマウス(LS174T大腸癌の異種移植片)に99mTc(CO)3−HEHEHE−Z08699を投与してから4時間後に獲得したマイクロSPECT画像を示す。腫瘍が明確に可視化された。腎臓および肝臓における放射活性の蓄積もみられる。
111Inで標識したZ変異体を使用したマウスにおけるHER3を発現する異種移植片のイメージング
この実施例において、放射標識したHER3特異的Z変異体をイメージングへ使用することについての実行可能性をさらに調査した。SPECTまたはPETイメージングに好適な多数の放射性核種と安定な複合体を形成するNOTAキレート剤を、特徴的なC末端システインを介してHEHEHE−Z08698およびHEHEHE−Z08699にコンジュゲートした。分子を111Inで標識し、BT474乳房癌腫の異種移植片を有するマウスに注射した。注射から4時間後、腫瘍をSPECTガンマカメライメージングで可視化した。
NOTAが結合したZ変異体のクローニングおよび生産:それぞれC末端にシステイン残基を有するHEHEHE−Z08698、およびHEHEHE−Z08699を、実質的に実施例3で説明したようにしてクローニングして発現させた。回収した細胞を1×PBS中に再懸濁し、フレンチプレスの使用によって破壊した。サンプルを最大70℃で熱処理し、10分インキュベートし、続いて氷上で10分冷却した。溶解産物を遠心分離によって(10分、30000g、4℃)透明化した。Z変異体の20mMシステインをDTTで、40℃で30分還元した。PD−10カラムで緩衝液を20mMの酢酸NH4、pH5.5に交換することにより過量のDTTを除去した。モル濃度が3倍過量のキレート剤であるマレイミド−NOTA(CheMatech、カタログ番号C101)を用いて、NOTAとのコンジュゲーションを行った。この混合物を40℃で40分インキュベートした。コンジュゲートしていないキレート剤からの精製をRP−HPLCで行った。各NOTAが結合したZ変異体の正確な分子量をHPLC−MSで確かめ、CD測定を行って保存された構造的な完全性を確認した。
各NOTAがコンジュゲートしたZ変異体の正確な分子量をHPLC−MSで確かめ、純度が95%を超えることが見出された。最大90℃に加熱した後でも、保存されたヘリックス構造、加えて可逆的なフォールディングがCD測定から確認された。111In−HEHEHE−Z08698−NOTAおよび111In−HEHEHE−Z08699−NOTAの放射性化学物質の収率はそれぞれ97%および96%であった。
インビボでのHER3結合Z変異体の投与による腫瘍成長の阻害
本明細書で開示されるようなHER3結合Z変異体がインビボで腫瘍成長を阻害することを示すために、異種移植されたマウスにZ変異体を投与して、腫瘍成長をモニターした。このようなHER3を発現する腫瘍モデルのうち有用なものは、ACHN異種移植片モデルである。
1.HER3結合モチーフ(BM)を含むHER3結合ポリペプチドであって、該モチーフは:
i)EKYX4AYX7EIW X11LPNLTX17X18QX20 AAFIGX26LX28D
(式中、互いに独立して、
X4は、A、E、L、M、N、Q、R、S、およびTから選択され;
X7は、FおよびYから選択され;
X11は、EおよびQから選択され;
X17は、K、N、R、およびVから選択され;
X18は、F、M、N、R、T、Y、およびWから選択され;
X20は、AおよびKから選択され;
X26は、KおよびSから選択され;
X28は、EおよびQから選択される);および
ii)i)で定義された配列と少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなる前記HER3結合ポリペプチド。
X4は、A、E、M、N、Q、S、およびTから選択され;
X7は、FおよびYから選択され;
X11は、Qであり;
X17は、KおよびRから選択され;
X18は、M、Y、およびWから選択され;
X20は、Kであり;
X26は、Kであり;
X28は、Qである
項目1に記載のHER3結合ポリペプチド。
I)X11は、Qであり;
II)X17X18は、KW、KY、KM、およびRYから選択され;
III)X20は、Kであり;
IV)X28は、Qである。
(式中、
[BM]は、項目1〜27のいずれか1項で定義されたHER3結合モチーフであり;
Xaは、AおよびSから選択され;
Xbは、NおよびEから選択され;
Xcは、A、S、およびCから選択され;
Xdは、AおよびSから選択される);
および
iv)iii)で定義された配列と少なくとも89%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、前記項目のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド。
(式中[BM]は、項目1〜27のいずれか1項で定義されたHER3結合モチーフであり、Xcは、SおよびCから選択される);および
vi)v)で定義された配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1〜32のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド。
(式中[BM]は、項目1〜27のいずれか1項で定義されたHER3結合モチーフであり、Xcは、AおよびCから選択される);および
viii)vii)で定義された配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1〜32のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド。
ADNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
ADNKFNK−[BM]−DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK;
ADAQQNNFNK−[BM]−DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
AQHDE−[BM]−DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK;
VDNKFNK−[BM]−DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK−[BM]−DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;および
AEAKYAK−[BM]−DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;
(式中[BM]は、項目1〜27のいずれか1項で定義されたHER3結合モチーフである)
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1〜31のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド。
(式中[BM]は、項目1〜27のいずれか1項で定義されたHER3結合モチーフである)、および
x)ix)で定義された配列と少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1〜51のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド。
b)所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第二の部分
を含む融合タンパク質またはコンジュゲート。
− 対象または対象から単離したサンプルを、項目1〜87のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは項目89〜91のいずれか1項に記載の組成物と接触させる工程、および
− 前記対象中で結合した、または前記サンプルに結合したHER3結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の量に相当する値を得る工程
を含む前記方法。
− 哺乳動物の対象の体に、項目85〜87のいずれか1項に記載の放射標識したポリペプチド、融合ポリペプチドまたはコンジュゲートを投与する工程であり、ここで放射性核種はイメージングに好適なものである、工程;および
− 放射標識したポリペプチドの投与から1〜72時間以内に、医療用イメージング装置を使用して対象の体の少なくとも一部の1つまたはそれ以上の画像を得る工程であり、前記画像は、体内の放射性核種の存在を示す工程
を含む前記イメージング方法。
− 前記発現ベクターからの前記ポリペプチドの発現が可能な条件下で項目110に記載の宿主細胞を培養すること、および
− 前記ポリペプチドを単離すること
を含む、項目1〜75のいずれか1項に記載のポリペプチドを生産する方法。
Claims (15)
- HER3結合モチーフ(BM)を含むHER3結合ポリペプチドであって、該モチーフは:
i)配列番号1〜35のいずれか一つ;および
ii)i)で定義された配列と少なくとも96%の同一性を有するアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列からなり、
ここで、前記HER3結合ポリペプチドとヒトHER3との相互作用のKD値は最大で1×10-9Mである、
前記HER3結合ポリペプチド。 - 前記HER3結合モチーフは、3ヘリックスバンドルタンパク質のドメインの一部を形成する、請求項1に記載のHER3結合ポリペプチド。
- ix)AEAKYAK−[BM]−DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK;(式中[BM]は、請求項1に記載のHER3結合モチーフである)、
および
x)ix)で定義された配列と少なくとも91%の同一性を有するアミノ酸配列、ここで、[BM]は請求項1において定義されたHER3結合モチーフである、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載のHER3結合ポリペプチド。 - 配列ix)は、配列番号71〜105から選択される、請求項3に記載のHER3結合ポリペプチド。
- 同じ実験条件を使用して測定した場合、前記HER3結合ポリペプチドとヒトHER3との相互作用の解離速度(koff)は、配列番号107のアミノ酸配列を含む比較用HER3結合ポリペプチドとヒトHER3との相互作用の解離速度(koff)と比較して少なくとも4分の1以下である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド。
- 前記HER3結合ポリペプチドとヒトHER3との相互作用のKD値は、最大で1×10-10Mである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド。
- a)請求項1〜6のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチドからなる第一の部分;および
b)所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第二の部分
を含む、融合タンパク質またはコンジュゲート。 - 前記所望の生物活性は、治療活性、結合活性、および酵素活性からなる群から選択される、請求項7に記載の融合タンパク質またはコンジュゲート。
- 標識をさらに含み、前記標識は、蛍光色素および金属、色素産生色素、化学発光化合物および生物発光タンパク質、酵素、放射性核種および粒子からなる群から選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲート。
- 請求項1〜9のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートと、少なくとも1種の薬学的に許容される添加剤またはキャリアーとを含む組成物。
- 医薬品、診断剤または予後予測剤として使用するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド、融合タンパク質もしくはコンジュゲートまたは請求項10に記載の組成物。
- HER3関連の状態の処置、診断または予後で使用するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは請求項10に記載の組成物。
- 前記HER3関連の状態は、乳癌、卵巣癌、および前立腺癌からなる群から選択される癌などの癌である、請求項12に記載の使用のためのHER3結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物。
- HER3を含有する疑いのあるサンプルを準備すること、前記サンプルを、請求項1〜9のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチド、融合タンパク質またはコンジュゲートまたは請求項10に記載の組成物と接触させること、およびHER3結合ポリペプチド、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組成物の結合を検出して、サンプル中のHER3の存在を示すことを含む、HER3の検出方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載のHER3結合ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
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