ES2660912T3 - Nuevos polipéptidos - Google Patents

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Elin Gunneriusson
Malin Lindborg
Lars Abrahmsén
John LÖFBLOM
Torbjörn GRÄSLUND
Johan SEIJSING
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Abstract

El polipéptido de unión a FcRn, que comprende un motivo BM de unión a FcRn, motivo que consiste en la secuencia de aminoácidos EX2 X3 X4 AX6 X7 EIR WLPNLX16X17 X18 QR X21 AFIX25 X26LX28 X29 en donde, independientemente entre sí, X2 se selecciona entre A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X3 se selecciona entre A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X4 se selecciona entre A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X6 se selecciona entre A, E, F, G, H, I, K, Q, R, S y V; X7 se selecciona entre A, F, H, K, N, Q, R, S y V; X16 se selecciona entre N y T; X17 se selecciona entre F, W e Y; X18 se selecciona entre A, D, E y N; X21 se selecciona entre A, S, V y W; X25 se selecciona entre D, E, G, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; X26 se selecciona entre K y S; X28 se selecciona entre A, D, E, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W e Y; y X29 se selecciona entre D y R.

Description

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En una realización, X25 se selecciona entre D, G, H, K, L, N, R, V y W. En una realización, X25 se selecciona entre D, G, H, K, L, N, R y V. En una realización, X25 se selecciona entre H, L, R, V y W. En una realización, X25 se selecciona entre H, R, V y W. En una realización, X25 se selecciona entre H, R y V. En una realización, X25 se selecciona entre H, L y R. En una realización, X25 se selecciona entre H y R. En una realización, X25 se selecciona entre H y V. En una realización, X25 es H. En una realización, X26 es K. En una realización, X26 es S. En una realización, X28 se selecciona entre A, D, E, H, K, L, N, Q, R, S, T, W e Y. En una realización, X28 se selecciona entre A, D, E, K, L, N, Q, R, S, T, W e Y. En una realización, X28 se selecciona entre A, D, E, L, R, S, T, W e Y. En una realización, X28 se selecciona entre A, D, K, L, N, Q, R, S, T y W. En una realización, X28 se selecciona entre A, D y R. En una realización, X28 se selecciona entre A y R. En una realización, X28 se selecciona entre D y R. En una realización, X28 es A. En una realización, X28 es R. En una realización, X29 es D. En una realización, X29 es R. En una realización, X6X7 se selecciona entre AH y GH. En una realización, X6X7 es AH. En una realización, X6X7 es GH. En una realización, X17X18 se selecciona entre FD e YD. En una realización, X17X18 es FD. En una realización más específica que define una subclase del polipéptido de unión a FcRn, la secuencia cumple al
menos tres de las seis condiciones I-VI:
I. X6 se selecciona entre A, G, K y S, tal como en particular A;
II. X7es H;
III. X17 se selecciona entre F e Y, tal como en particular F;
IV.
X18 es D;
V.
X21 se selecciona entre V y W, tal como en particular V;
VI. X25 se selecciona entre H y R, tal como en particular H.
En algunos ejemplos de un polipéptido de unión a FcRn según el primer aspecto, dicha secuencia cumple al menos cuatro de las seis condiciones I-VI. Más específicamente, la secuencia puede cumplir al menos cinco de las seis condiciones I-VI, tales como las seis condiciones I-VI.
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v) K-[BM]-QPEQS XaXbLLXc EAKKL XdXeXfQ; donde [BM] es un motivo de unión a FcRn como se define en la presente memoria, con la condición de que X29 sea R; Xa se seleccione entre A y S; Xb se seleccione entre N y E; Xc se seleccione entre A, S y C; Xd se seleccione entre E, N y S; Xe se seleccione entre D, E y S; Xf se seleccione entre A y S; y vi) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 93 % de identidad con una secuencia definida por v). Como se ha descrito anteriormente, los polipéptidos que comprenden cambios menores en comparación con las
secuencias de aminoácidos anteriores que no afectan en gran medida a la estructura terciaria y a su función también
están dentro del alcance de la presente descripción. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la secuencia iv) o la
secuencia vi) tiene al menos un 95 %, por ejemplo, al menos un 97 % de identidad con una secuencia definida por
iii) y v), respectivamente.
En una realización, Xa en la secuencia iii) o v) es A. En una realización alternativa, Xa en la secuencia iii) o v) es S.
En una realización, Xb en la secuencia iii) o v) es N. En una realización alternativa, Xb en la secuencia iii) o v) es E.
En una realización, Xc en la secuencia iii) o v) es A. En una realización alternativa, Xc en la secuencia iii) o v) es S.
En aún otra realización alternativa, la secuencia Xc en iii) o v) es C. En una realización, Xd en la secuencia iii) o v) es E. En una realización, Xd en la secuencia iii) o v) es N. En una realización, Xd en la secuencia iii) o v) es S. En una realización, Xe en la secuencia iii) o v) es D. En una realización, Xe en la secuencia iii) o v) es E. En una realización, Xe en la secuencia iii) o v) es S. En una realización, XdXe en la secuencia iii) o v) se selecciona entre EE, ES, SE y SS. En una realización, XdXe en la secuencia iii) o v) es ES. En una realización, XdXe en la secuencia iii) o v) es SE. En una realización, Xf en la secuencia iii) o v) es A. En una realización alternativa, Xf en la secuencia iii) o v) es S. En una realización, en la secuencia iii) o v), Xa es A; Xb es N; Xc es A y Xf es A. En una realización, en la secuencia iii) o v), Xa es A; Xb es N; Xc es C y Xf es A. En una realización, en la secuencia iii) o v), Xa es S; Xb es E; Xc es S y Xf es S. En una realización, en la secuencia iii) o v), Xa es S; Xb es E; Xc es C y Xf es S. En una realización, en la secuencia iii) o v), Xa es A; Xb es N; Xc es A; XdXe es ND y Xf es A. En una realización, en la secuencia iii) o v), Xa es A; Xb es N; Xc es C; XdXe es ND y Xf es A. En una realización, en la secuencia iii) o v), Xa es S; Xb es E; Xc es S; XdXe es ND y Xf es S. En una realización, en la secuencia iii) o v), Xa es S; Xb es E; Xc es C; XdXe es ND y Xf es S. En una realización, en la secuencia iii) o v), Xa es A; Xb es N; Xc es A; XdXe es SE y Xf es A.
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VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK;
VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK; y
AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;
en donde [BM] es un motivo de unión a FcRn como se ha definido anteriormente.
En una realización, el polipéptido de unión a FcRn comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
xi) AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
en donde [BM] es un motivo de unión a FcRn como se ha definido anteriormente; y
xii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 94 % de identidad con la secuencia definida en xi).
En una realización, la secuencia xi) se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1060-1062.
En una realización, el polipéptido de unión a FcRn comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
xiii) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
en donde [BM] es un motivo de unión a FcRn como se ha definido anteriormente; y
xiv) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 94 % de identidad con la secuencia definida en xiii).
La secuencia xiii) en dicho polipéptido se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 707-1059. En una realización, la secuencia xiii) se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 707-721, SEQ ID NO: 723-846 y SEQ ID NO: 1059. En una realización, la secuencia xiii) se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 707-708 y SEQ ID NO: 723-846. En una realización, la secuencia xiii) se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 707-708, SEQ ID NO: 723-798, SEQ ID NO: 800-809, SEQ ID NO: 811-831 y SEQ ID NO: 833-846. En una realización, la secuencia xiii) se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 707-714, SEQ ID NO: 719, SEQ ID NO: 725-726, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 776, SEQ ID NO: 779, SEQ ID NO: 781-783 y SEQ ID NO: 1059. En otra realización, la secuencia xiii) se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 734, SEQ ID NO: 747, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 779 y SEQ ID NO: 781-783. En aún otra realización, la secuencia xiii) se selecciona entre la SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 729, SEQ ID NO: 750, SEQ ID NO: 771, SEQ ID NO: 781 y SEQ ID NO: 783. En una realización, la secuencia xiii) se selecciona entre la SEQ ID NO: 707, SEQ ID NO: 729 y SEQ ID NO: 781. En una realización, la secuencia xiii) es la SEQ ID NO: 707.
De nuevo, los polipéptidos que comprenden cambios menores en comparación con las secuencias de aminoácidos anteriores que no afectan en gran medida a la estructura terciaria y a su función también están dentro del alcance de la presente descripción. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el polipéptido de unión a FcRn como se ha definido anteriormente puede comprender una secuencia que es al menos un 96 %, tal como al menos un 98 % idéntica a una secuencia definida por xi) o xiii).
Los términos "unión de FcRn" y "afinidad de unión para FcRn" como se usan en esta especificación se refieren a una propiedad de un polipéptido que puede analizarse, por ejemplo, mediante el uso de tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) o ELISA.
Por ejemplo, como se describe en los ejemplos a continuación, la afinidad de unión de FcRn puede probarse en un experimento en el que FcRn, o un fragmento correctamente plegado del mismo, se inmoviliza en un chip sensor del instrumento, y se pasa la muestra que contiene el polipéptido a analizar sobre el chip. Como alternativa, el polipéptido a analizar se inmoviliza en un chip sensor del instrumento, y una muestra que contiene FcRn, o un fragmento correctamente plegado del mismo, se pasa sobre el chip. El experto en la materia puede entonces interpretar los resultados obtenidos por dichos experimentos para establecer al menos una medida cualitativa de la
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También se contemplan otras posibilidades para la creación de polipéptidos de fusión o conjugados. De este modo, un polipéptido de unión a FcRn según el primer aspecto de la invención puede acoplarse covalentemente a un segundo o a un resto o restos adicionales, que además de o en lugar de la unión a una diana exhiben otras funciones. Un ejemplo es una fusión entre uno o más polipéptidos de unión a FcRn y un polipéptido enzimáticamente activo que sirve como indicador o resto efector.
Con respecto a la descripción anterior de proteínas de fusión o conjugados que incorporan un polipéptido de unión a FcRn según la descripción, debe indicarse que la designación de primer resto, segundo resto y resto adicional se realiza por razones de claridad para distinguir entre polipéptidos o polipéptidos de unión a FcRn según la descripción, por una parte, y restos que exhiben otras funciones por otra. Estas designaciones no pretenden referirse al orden real de los diferentes dominios en la cadena polipeptídica de la proteína de fusión o conjugado. Así, por ejemplo, dicho primer resto puede aparecer sin restricciones en el extremo N-terminal, en el medio, o en el extremo C-terminal de la proteína de fusión o conjugado.
En una realización, se proporciona un polipéptido de unión a FcRn, proteína de fusión o conjugado, que se une a FcRn de manera que la unión de IgG a FcRn se inhibe al menos parcialmente. Esta inhibición puede deberse a la unión del polipéptido de unión a FcRn, a la proteína de fusión o al conjugado a la misma, o a una región de FcRn al menos parcialmente superpuesta, como IgG. Como alternativa, el polipéptido de unión a FcRn, la proteína de fusión
o el conjugado se pueden unir a una región diferente de FcRn que, a IgG, pero estéricamente dificultan la unión de IgG a FcRn. Por lo tanto, la tasa de eliminación o aclaramiento de IgG del sistema circulatorio aumentaría debido al aumento de la degradación lisosómica de IgG, ya que el reciclaje de IgG mediado por FcRn podría no estar disponible total o parcialmente debido a la ocupación de sitios de unión a FcRn por el polipéptido de unión a FcRn según la presente descripción. En otras palabras, la administración de polipéptido de unión a FcRn, proteína de fusión o conjugado o composición según la presente descripción actuará para aumentar el catabolismo de anticuerpos IgG circulantes.
En una realización, el valor de KD de la interacción entre el polipéptido de unión a FcRn, la proteína de fusión o conjugado y FcRn es menor que la KD de la interacción entre IgG y FcRn. Esta relación puede ser verdadera tanto a pH 6,0 como a pH 7,4, o solo a pH 6,0.
Los aspectos anteriores también abarcan polipéptidos en los que el polipéptido de unión a FcRn según el primer aspecto, o el polipéptido de unión a FcRn como está comprendido en una proteína de fusión o conjugado según el segundo aspecto, comprende además un marcador, tal como un marcador seleccionado del grupo que consiste en colorantes fluorescentes y metales, colorantes cromóforos, compuestos quimioluminiscentes y proteínas, enzimas, radionúclidos y partículas bioluminiscentes. Dichos marcadores pueden usarse, por ejemplo, para la detección del polipéptido.
En otras realizaciones, el polipéptido de unión a FcRn marcado está presente como un resto en una proteína de fusión o conjugado que también comprende un segundo resto que tiene una actividad biológica deseada y/o que comprende una función de unión tal como se ha descrito anteriormente. El marcador en algunos casos puede estar acoplado solo al polipéptido de unión a FcRn, y en algunos casos al polipéptido de unión a FcRn y al segundo resto del conjugado o proteína de fusión. Además, también es posible que el marcador se pueda acoplar solamente a un segundo resto y no al resto de unión a FcRn. Por lo tanto, en otra realización más, se proporciona un polipéptido de unión a FcRn que comprende un segundo resto, en el que dicho marcador está acoplado solo al segundo resto.
Cuando se hace referencia a un polipéptido marcado, esto debe entenderse como una referencia a todos los aspectos de los polipéptidos como se describe en el presente documento, incluyendo proteínas de fusión y conjugados que comprenden un polipéptido de unión a FcRn y un segundo resto y opcionalmente más restos. Por lo tanto, un polipéptido marcado puede contener solo el polipéptido de unión a FcRn y, por ejemplo, un radionúclido terapéutico, que puede estar quelado o unido covalentemente al polipéptido de unión a FcRn, o contener el polipéptido de unión a FcRn, un radionúclido terapéutico y un segundo resto tal como una molécula pequeña que tiene una actividad biológica deseada, por ejemplo, que da como resultado una eficacia terapéutica.
En realizaciones en las que el polipéptido de unión a FcRn, la proteína de fusión o el conjugado están radiomarcados, dicho polipéptido radiomarcado puede comprender un radionúclido. La mayoría de los radionúclidos son de naturaleza metálica, se utilizan en forma iónica y normalmente son incapaces de formar enlaces covalentes estables con elementos presentes en proteínas y péptidos. Por esta razón, el marcaje de proteínas y péptidos con metales radiactivos se realiza con el uso de quelantes, es decir, ligandos multidentados, que forman compuestos no covalentes, llamados quelatos, con los iones metálicos. En una realización del polipéptido de unión a FcRn, proteína de fusión o conjugado, la incorporación de un radionúclido se habilita a través de la provisión de un entorno quelante, a través del cual el radionúclido se puede coordinar, quelar o formar un complejo con el polipéptido.
Un ejemplo de un quelante es el quelante de tipo poliaminopolicarboxilato. Se pueden distinguir dos clases de dichos quelantes de poliaminopolicarboxilato: quelantes acíclicos y macrocíclicos.
En una realización, el polipéptido de unión a FcRn, proteína de fusión o conjugado comprende un entorno quelante proporcionado por un quelante de poliaminopolicarboxilato conjugado con el polipéptido de unión a FcRn a través de
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un grupo tiol de un resto de cisteína o un grupo épsilon amina de un resto de lisina.
Los quelantes macrocíclicos usados más habitualmente para radioisótopos de indio, galio, itrio, bismuto, radioactínidos y radiolantánidos son derivados diferentes de DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10tetraacético). En una realización, DOTA o un derivado del mismo proporciona un entorno quelante del polipéptido de unión a FcRn, proteína de fusión o conjugado. Más específicamente, en una realización, los polipéptidos quelantes englobados por la presente descripción se obtienen haciendo reaccionar el derivado de DOTA ácido 1,4,7,10tetraazaciclododecano-1,4,7-tris-acético-10-maleimidoetilacetamida (maleimidomonoamida-DOTA) con dicho polipéptido.
Adicionalmente, el ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA) y sus derivados se pueden usar como quelantes. Por lo tanto, en una realización, se proporciona un polipéptido de unión a FcRn, proteína de fusión o conjugado, en el que el quelante de poliaminopolicarboxilato es ácido 1,4,7-triazaciclonon-1,4,7-triacético o un derivado del mismo.
Los quelantes de poliaminopolicarboxilato acíclicos más habitualmente utilizados son derivados diferentes de DTPA (ácido dietilentriaminopentaacético). Por lo tanto, los polipéptidos que tienen un entorno quelante proporcionado por ácido dietilentriaminopentaacético o sus derivados también están englobados por la presente descripción.
En una realización adicional, el polipéptido de unión a FcRn, producido recombinantemente a través de la expresión de un polinucleótido o sintéticamente, se conjuga con uno o más polímeros sintéticos, para, por ejemplo, aumentar su radio hidrodinámico. El polietilenglicol (PEG) se usa habitualmente para este fin, pero también se han usado otros polímeros en la técnica. Dicha "PEGilación" puede usarse para aumentar el tamaño del polipéptido de unión a FcRn de cualquiera de los tipos descritos en la presente memoria a un tamaño por encima del umbral para la excreción renal efectiva.
En una realización, un polímero sintético se conjuga con uno o más polipéptidos monoméricos de unión a FcRn sintetizados químicamente. También pueden conjugarse otras funcionalidades con el mismo polímero sintético. Si el polipéptido de unión a FcRn y otros componentes se sintetizan químicamente, ninguno de los componentes tendrá que elaborarse en un sistema biológico si esto no se desea.
En una realización preferida, uno o más polipéptidos de unión a FcRn fabricados sintética o biológicamente se conjugan con un polímero sintético, para alcanzar un tamaño que excede el tamaño asociado a una depuración renal eficiente y se usa para bloquear la unión de IgG a FcRn. Puede usarse una única cisteína en cada polipéptido de unión a FcRn para la conjugación específica de sitio, por ejemplo, una cisteína ubicada en el extremo C introducida para este fin. Con un polímero sintético ramificado, más de dos restos de unión a FcRn pueden conjugarse con el mismo polímero, para aumentar la avidez y, por lo tanto, la potencia de bloqueo.
En un tercer aspecto de la presente descripción, se proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido de unión a FcRn o una proteína de fusión como se describe en este documento. También está englobado por esta descripción un método para producir un polipéptido o proteína de fusión como se ha descrito anteriormente que comprende expresar un polinucleótido; un vector de expresión que comprende el polinucleótido; y una célula huésped que comprende el vector de expresión.
También se incluye un método para producir un polipéptido, que comprende cultivar dicha célula huésped en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido a partir de su vector de expresión, y aislar el polipéptido.
El polipéptido de unión a FcRn de la presente descripción puede producirse como alternativa mediante síntesis de péptidos no biológicos usando aminoácidos y/o derivados de aminoácidos que tienen cadenas laterales reactivas protegidas, la síntesis de péptidos no biológicos que comprende
-el acoplamiento gradual de los aminoácidos y/o los derivados de aminoácidos para formar un polipéptido según el primer aspecto que tiene cadenas laterales reactivas protegidas,
-la eliminación de los grupos protectores de las cadenas laterales reactivas del polipéptido, y
-el plegamiento del polipéptido en solución acuosa.
En un cuarto aspecto de la descripción, se proporciona una composición que comprende un polipéptido de unión a FcRn, proteína de fusión o conjugado como se describe en este documento y al menos un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización del mismo, dicha composición comprende además al menos un agente activo adicional, tal como al menos dos agentes activos adicionales, tales como al menos tres agentes activos adicionales. Los ejemplos no limitantes de agentes activos adicionales que pueden resultar útiles en dicha combinación son agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, agentes antimicrobianos y enzimas.
En una realización de este aspecto, dicha composición está adaptada para su administración por una ruta seleccionada del grupo que consiste en administración oral, administración intranasal, administración pulmonar, administración vaginal, administración rectal, inyección intravenosa, inyección intraperitoneal, inyección
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intramuscular, inyección subcutánea e inyección intradérmica.
Como se usa en el presente documento, el término "administración sistémica" se refiere a una ruta de administración tal que la sustancia de interés entre en el sistema circulatorio de modo que afecte a todo el cuerpo. El experto es consciente de que la administración sistémica puede tener lugar mediante administración enteral (absorción del fármaco a través del tracto gastrointestinal) o administración parenteral (generalmente inyección, infusión o implantación).
En una realización, dicha composición está adaptada para su administración sistémica o localmente. En ciertas realizaciones, se puede usar la administración sistémica de dicho compuesto. En otra realización, dicha composición está adaptada para su administración por una ruta local. Por ejemplo, la administración local puede ser tópica en una pomada, pasta, espuma o crema. En otra realización, dicha composición está adaptada para la administración a través de una capa endotelial o epitelial. En este caso, la composición puede transcitirse a través de dicha capa.
En una realización, la velocidad de captación de una composición que comprende una proteína de fusión o conjugado como se describe en este documento es mayor que la velocidad de captación de polipéptidos correspondientes a segundos o más restos per se. En una realización, la velocidad de captación es al menos 2 veces mayor, tal como al menos 5 veces mayor, tal como al menos 10 veces mayor, tal como al menos 25 veces mayor que la velocidad de captación del segundo o más restos per se.
Debe entenderse por la descripción anterior que la proteína de fusión o conjugado del polipéptido de unión a FcRn o la composición como se describe en la presente memoria puede ser útil como agente terapéutico y/o como medio para extender la semivida in vivo de un homólogo de fusión, y/o como medio para aumentar la tasa de eliminación de las dianas no deseables.
Por lo tanto, en un quinto aspecto de la presente descripción, se proporciona un polipéptido de unión a FcRn, proteína de fusión, conjugado o composición como se describe en el presente documento para su uso como medicamento.
En un sexto aspecto relacionado de la presente descripción, se proporciona un método de tratamiento de un sujeto que lo necesita, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente activa de un polipéptido de unión a FcRn, proteína de fusión, conjugado o composición como se describe en este documento.
En una realización de uno cualquiera de estos dos últimos aspectos, el medicamento o método está destinado al tratamiento en el que se explota la capacidad del polipéptido de unión a FcRn para bloquear al menos parcialmente la unión de IgG a FcRn, es decir, tratamiento en el que se desea aumentar el catabolismo de anticuerpos IgG. En una realización, una afección en la que puede estar indicado dicho tratamiento es una afección autoinmune. Como ejemplos no limitantes de las afecciones indicadas, se hace mención a la miastenia gravis, síndrome de Guillain-Barré, encefalitis límbica autoinmune, trastornos neuropsiquiátricos pediátricos autoinmunes asociados a infección por estreptococos (PANDAS), neuromiotonía (síndrome de Isaac), síndrome de Morvan, esclerosis múltiple, pénfigo vulgaris, foliáceo, penfigoide bulloso, epidermólisis bullosa adquirida, penfigoide gestacional, penfigoide de la membrana mucosa, liquen escleroso, síndrome antifosfolípido, policondritis eriapsante, anemia autoinmune, púrpura trombocítica idiopática, enfermedad autoinmune de Grave, miocardiopatía dilatada, vasculitis, síndrome de Goodpasture, nefropatía membranosa idiopática, artritis reumatoide y lupus eritematoso sistémico.
En otra realización, se proporciona un polipéptido de unión a FcRn, proteína de fusión, conjugado o composición como se describe en este documento para su uso en el bloqueo o la eliminación de una diana no deseable de la circulación. En una realización, dicha diana no deseable se selecciona del grupo que comprende alérgenos, amiloides, anticuerpos, autoantígenos, factores de coagulación sanguínea, hormonas, células tumorales, moléculas de fármaco, citoquinas, quimioquinas, mediadores de hipersensibilidad, factores proinflamatorios, toxinas tales como toxinas bacterianas y venenos de serpientes, contaminantes, metales y antioxidantes.
Aunque la invención se ha descrito con referencia a diversos aspectos ejemplares y realizaciones, los expertos en la técnica entenderán que pueden realizarse diversos cambios y sus elementos pueden sustituirse por equivalentes sin apartarse del alcance de la invención. Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptar una situación
o molécula particular a las enseñanzas de la invención sin apartarse del alcance esencial de la misma. Por lo tanto, se pretende que la invención no se limite a ninguna realización particular contemplada, sino que la invención incluirá todas las realizaciones que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es una lista de las secuencias de aminoácidos de ejemplos de motivos de unión a FcRn comprendidos en polipéptidos de unión a FcRn de la invención (SEQ ID NO: 1-353), ejemplos de polipéptidos de unión a FcRn de 49 unidades según la descripción (SEQ ID NO: 354-706), ejemplos de polipéptidos de unión a FcRn de 58 unidades según la descripción (SEQ ID NO: 707-1062) así como las secuencias de aminoácidos de la variante de polipéptido de unión a albúmina PP013 (SEQ ID NO: 1063), la variante Z de unión a Taq polimerasa Z03638 (SEQ ID NO: 1064), αFcRn humano (SEQ ID NO: 1065), αFcRn murino (SEQ ID NO: 1070), β2-microglobulina humana (SEQ ID NO: 1066), β2-microglobulina murina (SEQ ID NO: 1067), αFcRn humano (SEQ ID NO: 1068) cuando está en FcRn
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eGFP humano y αFcRn murino (SEQ ID NO: 1069) cuando está en FcRn-eGFP murino.
Las Figuras 2A-2E muestran la unión a FcRn humano a pH 6,0 y disociaciones a pH 6,0 y 7,4 para variantes Z marcadas con His6 y para IgG como se describe en el Ejemplo 3. Se muestra la superposición de sensogramas obtenidos de un instrumento Biacore que representa inyección a pH 6,0 seguido de la disociación a pH 6,0 (línea continua) y la inyección a pH 6,0 seguida de disociación a pH 7,4 (línea discontinua) para (A) Z07918 (SEQ ID NO: 707), (B) Z07960 (SEQ ID NO: 710), (C) Z10109 (SEQ ID NO: 709), (D) Z10193 (SEQ ID NO: 708) y (E) IgG.
La Figura 3 muestra gráficos de puntos de un análisis de citometría de flujo de la unión de la variante Z de unión a FcRn a células HeLa FcRn-eGFP humanas (panel superior) y de ratón (panel inferior), como se describe en el Ejemplo 4. Debido a la expresión heterogénea de FcRn-eGFP por células HeLa, las células se separaron según el nivel de expresión de FcRn-eGFP. Las células en la puerta H se consideran FcRn-eGFP negativas y las células en la puerta I se consideran positivas. La incubación con variantes Z marcadas con Alexa647 dio como resultado una población positiva tanto para Alexa647 como para eGFP, mientras que la incubación con tampón (control con tampón) no lo hizo. La figura muestra que las tres variantes Z07960 (SEQ ID NO: 710), Z07930 (SEQ ID NO: 712) y Z07918 (SEQ ID NO: 707) se unen a FcRn humano y FcRn de ratón. El eje y muestra la intensidad de Alexa647 y el eje × muestra la actividad de eGFP.
La Figura 4 muestra los valores medios de intensidad de fluorescencia (MFI) de Z07960 marcado con Alexa647 (SEQ ID NO: 710), Z07930 (SEQ ID NO: 712) y Z07918 (SEQ ID NO: 707), medido en el ensayo de unión celular descrito en el Ejemplo 4. El diagrama (A) muestra la MFI de células HeLa transducidas con FcRn-eGFP humano y el diagrama (B) muestra la MFI de células HeLa transducidas con FcRn-eGFP de ratón.
La Figura 5 muestra gráficas de puntos del análisis de citometría de flujo de IgG humana o de ratón Alexa647 que se une a células HeLa FcRn-eGFP humanas (panel superior) y de ratón (panel inferior), como se describe en el Ejemplo 5. Debido a la expresión heterogénea de FcRn-eGFP por las células HeLa, las células se separaron según la abundancia de FcRn-eGFP en la superficie celular. Las células en la puerta M se consideran FcRn-eGFP negativas y las células en la puerta N se consideran positivas. La unión de 100 nM de IgG-Alexa647 humano o de ratón a células HeLa transducidas con FcRn se muestra en el panel izquierdo (0 nM). La figura muestra que la unión de IgG se bloqueó con Z07918 marcado con His6 (SEQ ID NO: 707) de una manera dependiente de la dosis (1, 10, 100 y 1000 nM). El eje y muestra la intensidad de Alexa647 y el eje × muestra la actividad de eGFP.
La Figura 6 muestra los valores medios de intensidad de fluorescencia (MFI) resultantes de la unión de FcRn de IgG Alexa647 en presencia de diferentes concentraciones de Z07918 marcado con His6 (SEQ ID NO: 707) en (A) células HeLa transducidas con FcRn-eGFP humano y (B) células HeLa transducidas con FcRn-eGFP de ratón, como se describe en el Ejemplo 5. La figura muestra el bloqueo dependiente de la dosis de la unión de IgG-FcRn por la variante Z.
Las Figuras 7A-7C muestran la cinética de unión de tres variantes Z a FcRn humano a pH 6,0, como se describe en el Ejemplo 6, usando un instrumento Biacore. Se muestran los sensogramas para una serie de concentraciones de
(A) Z11948 (SEQ ID NO: 1060), (B) Z11946 (SEQ ID NO: 1061) y (C) Z11947 (SEQ ID NO: 1062), respectivamente, en fusión con el polipéptido de unión a albúmina PP013 (SEQ ID NO: 1063) y la molécula variante Z de control Z03638 (SEQ ID NO: 1064; no específica para FcRn). Las curvas de 640 nM (línea discontinua), 160 nM (línea de puntos) y 40 nM (línea gris sólida) se sometieron a análisis cinético usando el modelo de unión de Langmuir 1:1. Los parámetros cinéticos y las afinidades se calcularon a partir de las curvas ajustadas (líneas negras continuas) y se muestran en la Tabla 5.
La Figura 8 muestra los perfiles farmacocinéticos para tres variantes Z de unión a FcRn fusionadas al polipéptido de unión a albúmina PP013 obtenido como se describe en el Ejemplo 6. Las variantes Z Z11947 (SEQ ID NO: 1062, cuadrados vacíos), Z11946 (SEQ ID NO: 1061, triángulos vacíos) y Z11948 (SEQ ID NO: 1060, diamantes vacíos) mostraron una semivida prolongada en comparación con el control negativo PP013-Z03638 (círculos vacíos).
La Figura 9 muestra el bloqueo de IgG humana a FcRn humano mediante His6-Z07918 (SEQ ID NO: 707; círculos negros), IVIg (cuadrados grises) y SClg (triángulos grises), respectivamente, analizados como se describe en el Ejemplo 10.
La Figura 10 muestra que el bloqueo de las interacciones IgG-FcRn con variantes Z específicas de FcRn en ratones da como resultado niveles reducidos de IgG. Como se describe adicionalmente en el Ejemplo 11, los ratones se trataron con cinco inyecciones diarias de vehículo (+), la variante Z fusionada con ABD Z07918-PP013 (cuadrado vacío) y Z11948 (SEQ ID NO: 1060; círculo lleno). La concentración de IgG endógena se midió por ELISA. La concentración de IgG en ratones individuales a las 24, 72, 120 y 168 h se relacionó con el nivel a las 0 h y los resultados, por lo tanto, se presentan como porcentaje de IgG a las 0 h.
Ejemplos
Resumen
Los siguientes ejemplos describen el desarrollo de nuevas moléculas variantes Z dirigidas al receptor de Fc neonatal
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Producción de variantes Z para ELISA: Se produjeron variantes Z secuenciadas inoculando colonias individuales de las selecciones en 10 ml de medio TSB-YE suplementado con 100 μg/ml de ampicilina e IPTG 0,1 mM e incubando durante 24 horas a 37 °C. Las células se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en 2 ml de PBST (PBS suplementado con Tween-20 al 0,05 %), se congelaron a -80 °C y se descongelaron en un baño de agua para liberar la fracción periplásmica de las células. El procedimiento de congelación-descongelación se repitió siete veces y a continuación las células se sedimentaron por centrifugación. El sobrenadante del extracto periplásmico contenía las variantes Z como fusiones a ABD, expresadas como AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG (Grönwall et al., supra). Z##### se refiere a variantes individuales de 58 restos de aminoácidos Z.
Análisis de KD por ELISA de variantes Z: La unión de variantes Z a FcRn se analizó en ensayos ELISA. Se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos de media área con 2 μg/ml de un anticuerpo de cabra anti-ABD (producido internamente) diluido en tampón de revestimiento (carbonato de sodio 50 mM, pH 9,6) a 4 °C durante la noche. La solución de anticuerpo se separó y los pocillos se bloquearon con 100 μl de PBSC (PBS suplementado con caseína al 0,5 %) durante 1,5 h a TA. La solución de bloqueo se descartó y se añadieron 50 μl de solución periplásmica, diluida 1:4, a los pocillos y se incubaron durante 1,5 h a TA con agitación lenta. Las soluciones se vertieron y los pocillos se lavaron cuatro veces con tampón PCT al 0,05 %, a pH 6,0 (tampón citrato de fosfato Mcllvaines, pH 6,0, suplementado con Tween-20 al 0,05 %) o tampón PCT al 0,05 %, a pH 7,4 (tampón de fosfato citrato de Mcllvaines, pH 7,4, suplementado con el 0,05 % de Tween-20). La proteína diana, FcRn humana biotinilada, se añadió a los pocillos en una serie de concentración diluida 1:3 de 2 μg/ml (45 nM) a 0,3 ng/ml (6,9 pM) diluida en tampón PCC, pH 6,0 o pH 7,4. (Tampón fosfato citrato de Mcllvaines, pH 6,0 o pH 7,4, suplementado con caseína al 0,5 %), respectivamente. Las placas se incubaron durante 1,5 h a TA seguido de lavados como se ha descrito anteriormente. Se diluyó HRP conjugada con estreptavidina (Thermo Scientific, n.° cat. N100) 1:30.000 en tampón PCC, pH 6,0 o pH 7,4, respectivamente, y se añadió a los pocillos seguido de 45 min de incubación. Después del lavado como se ha descrito anteriormente, se añadieron 50 μl de sustrato ImmunoPure TMB (Thermo Scientific, n.° de cat. 34021) a los pocillos y las placas se trataron según las recomendaciones del fabricante. La absorbancia se midió a 450 nm utilizando un lector de placas de múltiples pocillos, Victor3 (Perkin Elmer). Se utilizó una variante Z que unía una proteína irrelevante como control negativo y se creó un blanco omitiendo el paso periplásmico. Se usó una variante Z que se unió a FcRn en un experimento previo (Z07918, SEQ ID NO: 707) como control positivo. Los valores medidos se analizaron utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, LaJolla, CA, EE. UU.) y regresión no lineal con el fin de determinar las afinidades (KD) de las interacciones.
Análisis de especificidad ELISA de variantes Z: En otro experimento ELISA, se probaron las especificidades de las variantes Z analizándolas frente a 2 μg/ml de proteínas biotiniladas humanas B2M, PSMA (producidas internamente) e IgG (policlonal, Pharmacia, Suecia) y frente a tampón PCC a pH 6,0 o pH 7,4, respectivamente. El ensayo se realizó a pH 6,0 y a pH 7,4, respectivamente, como se ha descrito anteriormente. Las proteínas biotiniladas o el tampón se añadieron a los pocillos en lugar de FcRn en la etapa de la proteína diana.
Resultados
Selección de presentación en fagos de variantes Z de unión a FcRn: Se obtuvieron clones individuales después de cuatro ciclos de selecciones de presentación en fago frente a FcRn humano biotinilado.
Secuenciación: La secuenciación se realizó en clones recogidos al azar de la ronda de selección cuatro. Cada variante Z recibió un número de identificación único ##### y las variantes individuales se conocen como Z#####. Las secuencias de aminoácidos de las variantes Z de 58 restos de aminoácidos de largo se enumeran en la Figura 1 como SEQ ID NO: 707-722 y SEQ ID NO: 1059.
Los motivos de unión de FcRn deducidos de estas variantes Z se enumeran en la Figura 1 como SEQ ID NO: 1-16 y SEQ ID NO: 353. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de 49 aminoácidos de longitud que se predijo que constituirían el paquete completo de tres hélices dentro de cada una de estas variantes Z se enumeran en la Figura 1 como SEQ ID NO: 354-369 y SEQ ID NO: 706.
Ensayos ELISA con variantes Z: Se produjeron dieciséis clones como proteínas de fusión ABD en E. coli. Las fracciones periplásmicas se usaron en un ELISA frente a una dilución en serie de FcRn humano. Los clones fueron: Z07909 (SEQ ID NO: 719), Z07918 (SEQ ID NO: 707), Z07930 (SEQ ID NO: 712), Z07960 (SEQ ID NO: 710), Z10109 (SEQ ID NO: 709), Z10111 (SEQ ID NO: 714), Z10127 (SEQ ID NO: 718), Z10129 (SEQ ID NO: 715), Z10140 (SEQ ID NO: 711), Z10141 (SEQ ID NO: 716), Z10145 (SEQ ID NO: 721), Z10152 (SEQ ID NO: 720), Z10156 (SEQ ID NO: 717), Z10161 (SEQ ID NO: 722), Z10183 (SEQ ID NO: 713) y Z10193 (SEQ ID NO: 708). Los valores de KD se determinaron para todas las variantes a pH 6,0 y para tres variantes a pH 7,4 (Tabla 1). Para trece variantes, no se obtuvieron datos para un análisis de KD a pH 7,4. Ninguna de las dieciséis variantes mostraba unión no específica cuando se analizaba contra B2M humana, IgG o PSMA.
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Tabla 1. Análisis de ELISA KD de variantes Z-ABD en fracciones periplásmicas de E. coli.
Variante Z SEQ ID NO: KD pH 6,0 (M) KD pH 7,4 (M)
Z07909 719 24,5 × 10-9 n.d. Z07918 707 2,0 × 10-9 10,9 × 10-9 Z07930 712 10,4 × 10-9 n.d. Z07960 710 6,0 × 10-9 n.d. Z10109 709 3,9 × 10-9 23,9 × 10-9 Z10111 714 11,4 × 10-9 n.d. Z10127 718 21,3 × 10-9 n.d. Z10129 715 17,6 × 10-9 n.d. Z10140 711 8,8 × 10-9 n.d. Z10141 716 21,2 × 10-9 n.d. Z10145 721 42,0 × 10-9 n.d. Z10152 720 24,6 × 10-9 n.d. Z10156 717 21,3 × 10-9 n.d. Z10161 722 163,0 × 10-9 n.d. Z10183 713 10,9 × 10-9 n.d. Z10193 708 2,3 × 10-9 25,9 × 10-9
n.d.= no determinable
Ejemplo 3
Producción y caracterización de variantes Z de unión a FcRn
En este ejemplo, se produjeron diecisiete variantes Z en E. coli, se purificaron y se analizaron frente a FcRn humano en Biacore. Un subconjunto de dichas variantes también se analizó frente a FcRn de ratón. Se realizó espectroscopía de dicroísmo circular (CD) para un subconjunto de variantes Z para la investigación de su estructura secundaria.
Materiales y métodos
Subclonación de variantes Z: El ADN de diecisiete variantes de unión a FcRn Z (SEQ ID NO: 707-722 y SEQ ID NO: 1059) se amplificó a partir del vector de biblioteca pAY02592. Se aplicó una estrategia de subclonación para la construcción de moléculas monoméricas de variantes Z con la etiqueta His6 N-terminal usando técnicas de biología molecular estándar (esencialmente como se describe en detalle en el documento WO2009/077175 para variantes Z que se unen a otra diana). Los fragmentos del gen Z se subclonaron en el vector de expresión pAY01448 dando como resultado la secuencia codificada MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD.
Además, la variante de unión a FcRn Z07918 (SEQ ID NO: 707), pero comenzando con los aminoácidos AE en lugar de VD y denominada Z11948 (SEQ ID NO: 1060), se clonó como construcciones homodiméricas con dos enlazadores diferentes entre las variantes Z y seguido por una etiqueta His6 C-terminal. Esto se realizó usando métodos de biología molecular convencionales que incluyen la amplificación de ADN, la restricción con enzimas de restricción adecuadas y la ligación del ADN. Los dos enlazadores se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific. Los fragmentos del gen Z se subclonaron en el vector de expresión (origen pET-26, Novagen) dando como resultado la secuencia codificada [Z#####]-GT-(G4S)-PR-[Z######]-LEHHHHHH y [Z#####]-GT-(G4S)3-[Z#####]-LEHHHHHH, respectivamente.
Cultivo y purificación: Células E. coli BL21 (DE3) (Novagen) se transformaron con plásmidos que contienen el fragmento del gen de cada variante Z de unión a FcRn respectiva y se cultivaron a 37 °C en 800 o 1000 ml de medio TSB-YE suplementado con 50 μg/ml de kanamicina. A una DO600 = 2, se añadió IPTG para inducir la expresión a una concentración final de 0,17 o 0,2 mM y el cultivo se incubó a 37 °C durante otras 5 h. Las células se cosecharon por centrifugación.
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Aproximadamente 2-5 g de cada sedimento celular se resuspendieron en 10-25 ml de tampón de unión (fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 20 mM, pH 7,4) suplementado con Benzonase® (Merck, n.° de cat. 1.01654.0001) a una concentración de 15 U/ml y lisozima (Sigma, n.° de catálogo L-7651) a una concentración de 0,5 mg/ml. Después de la rotura celular mediante tres ciclos de congelación-descongelación o sonicación, los restos celulares se eliminaron por centrifugación y cada sobrenadante se aplicó en una columna Suvi GraviTrap IMAC de 1 ml (GE Healthcare, n.° de catálogo 11-0033-99). Los contaminantes se eliminaron mediante lavado con tampón de lavado (fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 20 o 60 mM, pH 7,4) y las variantes Z de unión a FcRn se eluyeron posteriormente con tampón de elución 1 (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, imidazol 250 mM, pH 7,4) o tampón de elución 2 (ácido acético 0,1 M, cloruro de sodio 0,5 M, pH 4,5). Las variantes Z purificadas se intercambiaron en tampón a PBS usando columnas PD-10 (GE Healthcare), según el protocolo del fabricante. Las concentraciones de proteína se determinaron midiendo la absorbancia a 280 nm, usando un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000, y usando el coeficiente de extinción de la proteína respectiva. La pureza de las variantes Z de unión a FcRn se analizó mediante SDS-PAGE teñida con azul de Coomassie. La identidad de cada variante Z de unión a FcRn purificada se confirmó usando análisis LC/MS.
Análisis de CD: Las variantes Z marcadas con His6 purificadas se diluyeron a 0,5 mg/ml en PBS. Para cada variante Z diluida, se obtuvo un espectro de CD a 250-195 nm o 250-190 nm a 20 °C. Además, se realizó una medición de temperatura variable (VTM) para determinar la temperatura de fusión (Tm). En la VTM, la absorbancia se midió a 221 nm mientras que la temperatura se elevó de 20 a 90 °C, con una pendiente de temperatura de 5 °C/min. Se obtuvo un nuevo espectro de CD a 20 °C después del procedimiento de calentamiento para estudiar la capacidad de replegamiento de las variantes Z. Las mediciones de CD se realizaron en un espectropolarímetro Jasco J-810 (Jasco Scandinavia AB) usando una celda con una longitud de camino óptico de 1 mm.
Análisis de unión y cinético de Biacore: La interacción de las variantes Z marcadas con His6 que se unen a FcRn con FcRn humano se analizó en un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). El FcRn humano se inmovilizó en una célula de flujo sobre la capa de dextrano carboxilada de una superficie del chip CM5 (GE Healthcare). La inmovilización se realizó usando química de acoplamiento de amina según el protocolo del fabricante y utilizando HBS-EP (GE Healthcare) como tampón de carrera. Una superficie de la célula de flujo en el chip se activó y se desactivó para usarla como blanco durante las inyecciones de analito. En los dos experimentos de unión presentados a continuación, se usó tampón de fosfato citrato de Mcllvaines a pH 6,0 suplementado con Tween-20 al 0,005 % (PCT al 0,005 %) como tampón de carrera. En todos los experimentos, se usó una velocidad de flujo de 50 μl/min.
En un experimento, la disociación a pH 6,0 se comparó con la disociación a pH 7,4. Las variantes Z marcadas con His6 y una IgG1 monoclonal humana se diluyeron en tampón de carrera hasta una concentración final de 250 nM o 2,5 nM, respectivamente, y se inyectaron sobre el chip FcRn durante 1 minuto usando el procedimiento de coinyección. La segunda inyección del procedimiento de coinyección, que representa la fase de disociación de las interacciones, contenía tampón de carrera (pH 6,0) o PCT al 0,005 %, pH 7,4. Las variantes Z se dejaron disociar durante 1 minuto, excepto Z07918 y Z10193, que se dejaron disociar durante 4 minutos, antes de un equilibrio de la superficie durante 5 minutos en tampón de carrera. La IgG se dejó disociar durante 4 minutos antes del equilibrio. Las inyecciones de tampón se realizaron de manera similar; coinyección de tampón pH 6,0 seguido de pH 6,0 o coinyección de tampón pH 6,0 seguido de pH 7,4. Los resultados se analizaron en el software BiaEvaluation 4.1 (GE Healthcare). Las curvas de la superficie en blanco se restaron de las curvas de la superficie del ligando. Además, las curvas de las inyecciones de tampón se sustrajeron de las curvas las variantes Z y de las curvas de IgG para ajustar los efectos del tampón.
En otro experimento, se determinaron las constantes cinéticas aproximadas (kon y koff) y las afinidades (KD) para un subconjunto de variantes Z marcadas con His6. Se inyectaron tres concentraciones de las variantes Z durante 1 minuto seguido de disociación en tampón de carrera durante 1 minuto. Las superficies se equilibraron con tampón de carrera durante 7,5 minutos antes del inicio del siguiente ciclo. Las concentraciones inyectadas fueron 675 nM, 225 nM y 75 nM (Z10140, Z10156 y Z10183) o 225 nM, 75 nM y 25 nM (Z07918 y Z10193). Las constantes cinéticas se calcularon a partir de los sensogramas utilizando el modelo de Langmuir 1:1 del software BiaEvaluation 4.1 (GE Healthcare).
En un experimento separado, la afinidad de las interacciones de las variantes Z con hFcRn (SEQ ID NO: 1065) y mFcRn (SEQ ID NO: 1070), respectivamente, se midió tanto a pH 6,0 como a pH 7,4 en un instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare). hFcRn y mFcRn se produjeron esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 pero usando células 3T3 de ratón en lugar de células SKOV-3 humanas para la producción de mFcRn, y se inmovilizaron en células de flujo separadas en un chip CM5 en tampón de acetato a pH 4,65. El nivel de inmovilización fue de aproximadamente 1000 UR para ambos receptores. Se creó una célula de flujo de referencia mediante activación y desactivación. Se utilizó el 0,005 % de PCT a pH 6,0 o 7,4 como tampón de carrera y para la dilución de los analitos. Todos los análisis se realizaron a 25 °C. Las constantes de afinidad para las variantes Z marcadas con His6 Z07918 (SEQ ID NO: 707), Z07960 (SEQ ID NO: 710) y Z10193 (SEQ ID NO: 708) se determinaron inyectando una serie de diluciones de 1024 nM a 0,5 nM (pH 6,0) o de 10240 nM a 5 nM (pH 7,4). Las afinidades se obtuvieron utilizando el software GraphPad Prism 5, usando un modelo de saturación de unión de un sitio.
Ensayo de bloqueo de AlphaLISA: El potencial de las variantes Z para inhibir la unión de IgG a FcRn se analizó en
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un ensayo AlphaLISA con un lector multiplaca EnSpire 2300 (Perkin Elmer). Se inmovilizó IgG humana (Roactemra) en perlas aceptoras AlphaLISA (Perkin Elmer, n.° de catálogo 6772002) según las recomendaciones del fabricante. Se realizaron diluciones en serie escalonadas 1:3 de variantes Z marcadas con His hasta concentraciones finales de 250 nM a 38 pM en una placa de 384 pocillos (Perkin Elmer, n.° de cat. G6005350) y se incubaron durante 45 min con FcRn humano biotinilado 10 nM (Biorbyt, n.° de catálogo orb84388; biotinilado esencialmente como se describe en el Ejemplo 2) en tampón AlphaLISA (Perkin Elmer, n.° de catálogo AL000F) ajustado a pH 6,0 usando HCl. Se añadieron perlas de receptor revestidas con IgG hasta una concentración final de 10 μM y se incubaron durante 45 minutos. Finalmente, se añadieron perlas donadoras recubiertas con estreptavidina (Perkin Elmer, n.° de catálogo 6772002) a una concentración final de 40 μg/ml y se incubaron durante 30 minutos. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente en oscuridad. La placa se analizó en el instrumento EnSpire y los valores de CI50 se calcularon usando GraphPad Prism 5.
Resultados
Cultivo y purificación: Las diecisiete variantes Z de unión a FcRn (SEQ ID NO: 707-722 y SEQ ID NO: 1059), construidas con la etiqueta His6 N-terminal, se produjeron en E. coli. La cantidad de proteína purificada IMAC de aproximadamente 2-5 g de sedimentos bacterianos, determinada espectrofotométricamente midiendo la absorbancia a 280 nm, varió de aproximadamente 10 mg a 20 mg para las diferentes variantes Z de unión a FcRn. El análisis SDS-PAGE de cada preparación de proteína final mostró que estos contenían predominantemente la variante Z de unión a FcRn. La identidad correcta y el peso molecular de cada variante Z de unión a FcRn se confirmaron mediante análisis HPLC-MS.
Análisis de CD: Los espectros de CD determinados para seis variantes Z mostraron que cada una tenía una estructura α-helicoidal a 20 °C. Este resultado también se verificó en las mediciones de temperatura variables, en las que se determinaron las temperaturas de fusión (Tm) (Tabla 2). Se observó un plegamiento reversible para las seis variantes Z al superponer espectros medidos antes y después de calentar a 90 °C.
Tabla 2. Temperaturas de fusión para una selección de variantes Z.
Variante Z SEQ ID NO: Tm (°C)
Z07909
719 56
Z07918
707 49
Z07930
712 56
Z07960
710 58
Z10109
709 61
Z10193
708 59
Análisis de unión y cinético de Biacore: La unión de diecisiete variantes Z al FcRn humano y la disociación a diferentes pH se probaron en un instrumento Biacore inyectando secuencialmente cada una de las variantes Z a pH 6,0 y tampón a pH 6,0 o pH 7,4 sobre una superficie de chip que contiene FcRn. El nivel de inmovilización del ligando de la superficie fue de 1668 UR de FcRn humano. Las diecisiete variantes Z mostraron unión a FcRn a pH 6,0, y para todas las variantes, se observaron velocidades de liberación más rápidas a pH 7,4 en comparación con pH 6,0. El resultado para IgG fue similar, mostrando una tasa de eliminación más rápida a pH 7,4. Las variantes Z07918 y Z10193 mostraron las curvas de disociación más lentas. Los sensogramas para un subconjunto de variantes e IgG se muestran en la Figura 2 A-E.
Tabla 3. Constantes cinéticas de Biacore y afinidades para la unión de hFcRn a pH 6,0.
-1)
Variante Z SEQ ID NO: kon (M-1s koff (s-1) KD (M)
Z07918 707 1,4 × 106 0,022 1,6 × 10-8 Z10140 711 1,4 × 106 0,12 8,6 × 10-8
Z10156 717 7,6 × 105 0,28 3,7 × 10-7
Z10183 713 1,0 × 106 0,13 1,3 × 10-7
Z10193 708 1,5 × 106 0,033 2,2 × 10-8
Se determinaron las constantes cinéticas de cinco variantes Z que interactúan con FcRn a pH 6,0 (véase la Tabla 3). El nivel de inmovilización de la superficie fue de 2015 UR de FcRn humano. Para cada variante Z, las constantes cinéticas se calcularon usando un conjunto de curvas de tres concentraciones inyectadas.
Las constantes de afinidad (KD) también se determinaron para las variantes Z marcadas con His6 Z07918 (SEQ ID NO: 707), Z07960 (SEQ ID NO: 710) y Z10193 (SEQ ID NO: 708) que interactúan con FcRn humano y de ratón a pH 6,0 y pH 7,4 (Tabla 4). Para las tres variantes, los valores de KD fueron inferiores a pH 6,0 en comparación con pH 7,4.
Tabla 4. Afinidad de Biacore por hFcRn y mFcRn a pH 6,0 y pH 7,4.
Variante Z SEQ ID NO: KD (M) hFcRn KD (M) mFcRn
pH 6,0 pH 7,4 pH 6,0 pH 7,4 Z07918 707 1,2 × 10-8 >5 × 10-7 9,0 × 10-8 >5 × 10-7 Z07960 710 5,0 × 10-8 >1 × 10-6 3,5 × 10-7 >5 × 10-6 Z10193 708 1,4 × 10-8 >5 × 10-7 9,5 × 10-8 >5 × 10-7
Tabla 5: Valores calculados de CI50 del ensayo de bloqueo AlphaLISA
Variante Z
SEQ ID NO de la variante Z CI50 (M)
Z07909
719 4,6 × 10-8
Z07918
707 2,1 × 10-9
Z07930
712 4,2 × 10-8
Z07960
710 4,2 × 10-8
Z10109
709 5,7 × 10-8
Z10111
714 4,6 × 10-8
Z10140
711 5,6 × 10-8
Z10183
713 3,9 × 10-8
Z10193
708 1,2 × 10-8
Z13993
1059 1,3 × 10-7
Z11948-G4S-Z11948
1060 3,8 × 10-10
Z11948-(G4S)3-Z11948
1060 4,1 × 10-10
Ensayo de bloqueo de AlphaLISA: La capacidad de diecisiete variantes Z monoméricas marcadas con His6 (SEQ ID NO: 707-722 y SEQ ID NO: 059) y dos variantes diméricas, Z11948-G4S-Z11948 y Z11948-(G4S) 3-Z11948 para inhibir la unión de IgG a FcRn se probó en un ensayo de bloqueo AlphaLISA. Las diluciones en serie de las variantes
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20 Ejemplo 4
Unión de variantes Z de unión a FcRn a células HeLa transfectadas con FcRn/eGFP humanas o de ratón
En este ejemplo, se investigó la capacidad de unión de las variantes Z de unión a FcRn. Se describe la producción de células HeLa que expresan el transgén del gen FcRn-eGFP humano y murino y el uso de estas células para el análisis de citometría de flujo con variantes Z marcadas con Alexa647.
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Materiales y métodos
Clonación de vectores virales FcRn-eGFP y B2M: Los genes que codifican FcRn murino (mFcRn, Genbank BC003786.1, OpenBiosystems) y B2M murino (mB2M, Genbank BC085164.1, OpenBiosystems) se amplificaron de forma similar a los genes para FcRn humano y B2M humana como se describe en el Ejemplo 1. Los genes FcRn y B2M humanos y murinos se amplificaron de la siguiente manera: para hFcRn, se amplificó la secuencia que codifica los aminoácidos 1-365 (SEQ ID NO: 1068); para hB2M, se amplificó la secuencia que codifica los aminoácidos 21119 (SEQ ID NO: 1066); para mFcRn, se amplificó la secuencia que codifica los aminoácidos 1-369 (SEQ ID NO: 1069); y para mB2M, se amplificó la secuencia que codifica los aminoácidos 21-119 (SEQ ID NO: 1067). El vector pHR-cPPT-CMV-EGFP (Jakobsson et al. (2003) J Neurosci Res 73: 876-85) y los amplicones de PCR FcRn (humano y murino) se cortaron usando las enzimas de restricción BamHI (humano) o BclI (murino) y MluI (New England Biolabs, n.° de catálogo R0136M, R0160L y R0198L, respectivamente), y se ligaron usando ADN ligasa de T4 (New England Biolabs, n.° de catálogo M0202M). La mezcla de ligación se transformó químicamente en E. coli RRIΔM15 y se extendió sobre placas de ampicilina. Las colonias se recogieron y seleccionaron con pares de cebadores adecuados. La construcción que codifica el péptido señal original, FcRn humano y murino y eGFP en la cola citoplásmica se verificaron por secuenciación y se denominaron pHR-cPPT-CMV-hFcRn-eGFP y pHR-cPPT-CMV-mFcRn-eGFP, respectivamente.
Los amplicones B2M de PCR humanos y murinos se insertaron en el plásmido pDONOR221 (Invitrogen, n.° de cat. 12536-017) por recombinación usando el sistema Gateway (Invitrogen, n.° de catálogo 11789020, mezcla de enzima Gateway® BP Clonase® II) según las recomendaciones del fabricante. Después de la verificación de las secuencias correctas, se insertó B2M humana o murina en p2k7_gtc (Suter et al., supra) usando un sistema de clonación Gateway multisitio (Invitrogen, catálogo n.°11791020, mezcla de enzima Gateway® LR Clonase® II) junto con el promotor que contiene el plásmido pENTR-CMV (Tai y col., supra), dando como resultado los vectores 2k7neo-CMVhB2M y 2k7neo-CMV-mB2M, respectivamente.
Transducción lentiviral de células HeLa: Los pares de vectores 2k7neo-CMV-hB2M y pHR-cPPT-CMV-hFcRn-eGFP o 2k7neo-CMV-mB2M y pHR-cPPT-CMV-mFcRn-eGFP se cotransfectaron junto con la envoltura VSV-G y el plásmido de empaquetamiento gag/pol en células HEK293T usando transfección con cloruro de calcio (Zufferey et al., supra, Jakobsson et al. (2006), supra). Los sobrenadantes de cultivo HEK293T que contienen partículas lentivirales formadas con transgenes FcRn y B2M, respectivamente, se usaron para transducir secuencialmente células de adenocarcinoma HeLa Cervix (Cell Line Service) con un bajo número de pases. Las dos líneas celulares HeLa transducidas de forma estable se indican a continuación hFcRn-eGFP (transducidas con genes para FcRn-eGFP y hB2M humanas) y mFcRn-eGFP (transducidas con genes para FcRn-eGFP y mB2M de ratón).
Marcaje de Alexa647 de las variantes Z de unión a FcRn: Las tres variantes Z marcadas con His6 Z07918, Z07930 y Z07960 se marcaron con éster del ácido succinimidil carboxílico Alexa Fluor® 647 (Invitrogen, n.° de catálogo A20106). Antes del marcaje, el tampón se intercambió a tampón de carbonato 0,2 M, pH 8,3, usando unidades de filtro centrífugo Vivaspin500 (MWCO 10 kDa, Vivaproducts n.° de catálogo 512-2838) centrifugado a 10.000 g. El marcaje se realizó en el Vivaspin500 y se añadió 1 μl de colorante de succinimidil éster Alexa647 (40 μg/μl en DMSO correspondiente a 1,3 × de exceso molar) a 200 μg/25 μl de variante Z. Las mezclas se incubaron a temperatura ambiente en oscuridad durante 40 minutos en un mezclador giratorio. Las mezclas de reacción se pusieron posteriormente en hielo durante 3,5 horas y el colorante libre se eliminó mediante lavado con 15 × 100 μl de PBS en Vivaspin500.
Tinción de inmunofluorescencia de células HeLa transfectadas con FcRn-eGFP humanas y de ratón con variantes Z de unión a FcRn: Células HeLa hFcRn-eGFP y mFcRn-eGFP se recogieron por tripsinación y se lavaron dos veces en PBS a pH 6,0 antes del recuento. Se pipetearon 100.000 células por pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V (Nunc, n.° de catálogo 277143) y las células de la placa se sedimentaron posteriormente a 1700 rpm durante 4 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se eliminaron y las células se fijaron con 50 μl de formaldehído al 2 % (Sigma Aldrich, n.° de catálogo F8775) en PBS a pH 6,0 durante 10 min a temperatura ambiente. Después, las células se lavaron con 2 × 100 μl de PBS a pH 6,0, se saturaron con caseína (PBSC) y se resuspendieron en PBSC más saponina al 0,1 % (AppliChem, n.° de catálogo A4518.0100) que contenía 620 nM de variantes Z marcadas con His6 marcadas con Alexa647; Z07960, Z07930 y Z07918. Las células HeLa transducidas, incubadas con tampón solo, se usaron como control. Las células se incubaron durante 1 h a 8 °C en un agitador en oscuridad, se lavaron con 2 × 100 μl de PBSC y se resuspendieron en 180 μl de PBS a pH 6,0 más BSA al 1 % (fracción V, Merck, n.° de catálogo 1,12018). 0100). Se analizaron 10.000 células/pocillo en un citómetro de flujo Gallios (Beckman Coulter) y los datos se analizaron usando el software Kaluza (Beckman Coulter).
Resultados
El análisis de citometría de flujo se utilizó para determinar si las variantes Z de unión a FcRn podían unirse a FcRn humano y/o de ratón en células HeLa transducidas con FcRn/eGFP humanas o de ratón. El experimento se realizó a pH 6,0 con Alexa647 marcado con Z07960, Z07930 y Z07918 (SEQ ID NO: 710, 712 y 707, respectivamente). El análisis de puntos (eje y: Alexa647, eje x: eGFP) mostró que la población de células transducidas podría dividirse en población positiva y negativa de FcRn-eGFP (Figura 3, puerta H e I, respectivamente) que indica expresión heterogénea de proteína de fusión FcRn-FGF por células HeLa (Figura 3). En consecuencia, los valores medios de
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Estudio farmacocinético: Los perfiles farmacocinéticos de las construcciones Z mencionadas anteriormente fusionadas con PP013-Z03638 se compararon con el control negativo Z03638-PP013 en un estudio farmacocinético de ratón. En trabajos anteriores, por ejemplo, como se describe en la solicitud PCT WO2009/016043, se demuestra que las proteínas de fusión ABD tienen una semivida larga en el suero, causada por la unión de ABD a la albúmina sérica. Según los resultados previos, la semivida terminal de la molécula variante Z fusionada con ABD (Z03638-PP013) fue de aproximadamente 43 horas, que es comparable a la semivida de la albúmina de ratón (35 horas). Las semividas terminales de las construcciones que contienen la molécula variante Z de unión a FcRn además de ABD eran dos o tres veces más largas (Figura 8). Las semividas terminales calculadas fueron de 99 horas (Z11947), 69 horas (Z11946) y 58 horas (Z11948), lo que sugiere que la unión a FcRn de las variantes Z contribuyó a la semivida prolongada.
Ejemplo 7
Diseño y construcción de una biblioteca de maduración de variantes Z de unión a FcRn
En este ejemplo, se construyó una biblioteca madura. La biblioteca se usó para selecciones de variantes Z de unión a FcRn. Normalmente, se espera que las selecciones de bibliotecas maduras den como resultado, ligantes con afinidad incrementada (Orlova et al., (2006) Cancer Res 66 (8): 4339-48). En este estudio, se generaron enlazadores de cadena sencilla aleatorios usando síntesis de grupo dividido que permite la incorporación de codones definidos en posiciones deseadas en la síntesis.
Materiales y métodos
Diseño de la biblioteca: La biblioteca se basó en las dieciséis secuencias de las variantes Z de unión a FcRn humano en la Tabla 1 y se ha descrito adicionalmente en los Ejemplos 2-6. En la nueva biblioteca, 13 posiciones variables en el esqueleto de la molécula Z se polarizaron hacia ciertos restos de aminoácidos, según una estrategia basada principalmente en los motivos de unión de las variantes Z definidas en la SEQ ID NO: 707-722. Se generó un enlazador de ADN usando síntesis de grupo dividido que contenía la hélice 1 y 2 parcialmente aleatoria de 147 pb de la secuencia de aminoácidos: 5'-AA ATA AAT CTC GAG GTA GAT GCC AAA TAC GCC AAA GAA NNN NNN NNN GCG NNN NNN GAG ATC NNN NNN TTA CCT AAC TTA ACC NNN NNN CAA NNN NNN GCC TTC ATC NNN AAA TTA NNN GAT GAC CCA AGC CAG AGC TCA TTA TTT A-3' (SEQ ID NO: 1074; los codones aleatorios se ilustran como NNN) flanqueados por sitios de restricción XhoI y SacI, se ordenó a partir de DNA 2,0 (Menlo Park, CA, EE. UU.). Las distribuciones teóricas de los restos de aminoácidos en la nueva biblioteca, que incluyen ocho posiciones de aminoácidos variables (9, 10, 11, 13, 14, 24, 32 y 35) y cinco posiciones de aminoácidos constantes (17, 18, 25, 27 y 28) en el andamiaje de la molécula Z se dan en la Tabla 8. El tamaño de la biblioteca teórica resultante es de 5,3 × 108 variantes.
Tabla 7: Diseño de la biblioteca para la maduración.
Posición de aminoácido en la variante Z
Aleatorización (abreviaturas de aminoácidos) N.° de aminoácidos Proporción
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A,D,E,F,H,I,K,L,N,Q,R,S,T,V,W,Y 16 1/16
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A,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y 17 1/17
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A,D,E,F,H,I,K,L,N,Q,R,S,T,V,W,Y 16 1/16
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A,D,E,F,G,H,I,K,L,N,Q,R,S,T,V,W,Y 17 1/17
14
A,F,H (25 %),I,K,L,N,Q,R,S,T,V,W,Y 14 3/52, 13/52 (H)
17
R 1 1
18
W 1 1
24
F,Y 2 1/2
25
D 1 1
27
R 1 1
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V 1 1
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A,D,E,F,H,I,K,L,N,Q,R,S,T,V,W,Y 16 1/16
35
A,D,E,F,H,I,K,L,N,Q,R,S,T,V,W,Y 16 1/16
imagen17
esencialmente como se describe en el Ejemplo 2 usando biotina a un exceso 10 × molar. Las selecciones de presentación en fagos, usando la nueva biblioteca de moléculas variantes Z descrita en el Ejemplo 7, se realizaron en cuatro ciclos contra FcRn humano o FcRn murino esencialmente como en el Ejemplo 2 pero con las siguientes excepciones. Los tampones de selección fueron tampón PCTG al 0,1 %, pH 5,5 (tampón de fosfato citrato 5 McIlvaines, pH 5,5, suplementado con el 0,1 % de Tween-20 y del 0,1 % de gelatina) o tampón PCTG al 0,1 %, pH 7,4, (tampón de fosfato citrato McIlvaines, pH 7,4, suplementado con el 0,1 % de Tween-20 y el 0,1 % de gelatina), respectivamente. Antes de la selección, se añadió HSA a los tampones de selección hasta una concentración final de 1,5 μM. Todos los tubos y perlas usados en la selección se prebloquearon con cualquiera de los dos tampones de selección diferentes. Se realizó una etapa de preselección, mediante incubación de solución madre de fago con
10 perlas SA durante 45 min, en el ciclo 1. Para la captura de complejos diana-fago, se usaron 1 mg de perlas por 1,1 μg de FcRn humano biotinilado o 1,6 μg de FcRn murino biotinilado. Los lavados se realizaron con tampón PCT al 0,1 %, pH 5,5 o pH 7,4, excepto para las pistas 2-1-2-1 y 2-1-2-2, donde se usó PCT al 0,1 % suplementado con IgG 25 nM (Herceptin®) o IgG 10 nM, respectivamente, como se describe en la Tabla 7.
Las cinco pistas (1-5) en el ciclo 1 se dividieron en el segundo a cuarto ciclo, lo que resulta en siete pistas (1-1 a 5-1)
15 en el ciclo 2, once pistas (1-1-1 a 5-1-1) en el ciclo 3 y catorce pistas (1-1-1-1 a 5-1-1-1) en el ciclo 4. Las partículas del fago unido se eluyeron como se describe en el Ejemplo 2.
En la Tabla 8 se muestra una visión general de la estrategia de selección, que describe una mayor rigurosidad en ciclos posteriores, utilizando una concentración diana reducida y un número mayor de lavados.
Tabla 8. Descripción general de los datos de selección de maduración.
Ciclo
Pista de selección Solución madre de fagos de la bibliotecao pista de selección Especies diana Conc. diana (nM) pH de selección pH de lavado Número de lavados
1
1
Zlib006FcRn.I humana 100 7,4 7,4 2
1
2 Zlib006FcRn.I humana 100 7,4 5,5 2
1
3 Zlib006FcRn.I humana 25 5,5 5,5 4
1
4 Zlib006FcRn.I murina 100 7,4 7,4 2
1
5 Zlib006FcRn.I murina 100 5,5 5,5 2
2
1-1 1 humana 50 7,4 7,4 4
2
2-1 2 humana 50 7,4 5,5 4
2
2-2 2 humana 25 5,5 7,4 6
2
3-1 3 humana 5 5,5 7,4 4
2
3-2 3 humana 5 5,5 5,5 8
2
4-1 4 murina 50 7,4 5,5
2
2
5-1 5 murina 100 5,5 5,5
2
3
1-1-1 1-1 humana 10 7,4 7,4 8
3
1-1-2 1-1 humana 5 5,5 7,4 8
3
2-1-1 2-1 humana 10 7,4 5,5 8
3
2-1-2 2-1 humana 5 7,4 5,5 12
3
2-2-1 2-2 humana 10 7,4 5,5 12
3
2-2-2 2-2 humana 5 7,4 5,5 15
3
3-1-1 3-1 humana 1 5,5 7,4 8
3
3-2-1 3-2 humana 0,5 5,5 5,5 12
3
3-2-2 3-2 humana 0,25 5,5 5,5 16
3
4-1-1 4-1 murina 10 7,4 5,5 6
3
5-1-1 5-1 murina 5 5,5 5,5 8
4
1-1-1-1 1-1-1 humana 1 7,4 7,4 12
4
1-1-1-2 1-1-1 humana 0,25 7,4 7,4 15
4
1-1-2-1 1-1-2 humana 0,5 7,4 5,5 15
4
1-1-2-2 1-1-2 humana 0,1 5,5 7,4 15
4
2-1-1-1 2-1-1 humana 1 7,4 5,5 15
4
2-1-1-2 2-1-1 humana 0,5 7,4 5,5 15
4
2-1-2-1 2-1-2 humana 0,25 7,4 5,5 20 (+IgG)
4
2-1-2-2 2-1-2 humana 0,1 7,4 5,5 20 (+IgG)
4
2-2-1-1 2-2-1 y 2-2-2 humana 0,5 5,5 7,4 15
4
2-2-2-1 2-2-1 y 2-2-2 humana 0,5 7,4 5,5 20
4
3-1-1-1 3-1-1 humana 1 5,5 7,4 12
4
3-2-1-1 3-2-1 y 3-2-2 humana 0,5 5,5 5,5 16
4
4-1-1-1 4-1-1 murina 1 7,4 5,5 12
4
5-1-1-1 5-1-1 murina 0,5 5,5 5,5 15
Amplificación de partículas de fago: La amplificación de partículas de fago entre el ciclo de selección 1 y 2 se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 2, con las siguientes excepciones. E. coli ER2738 se usó para la amplificación de fagos y se usó el fago auxiliar M13K07 en un exceso de 5 veces. La amplificación de partículas de 5 fago entre los ciclos de selección 2 y 4 se realizó llevando a cabo la infección de bacterias en solución de la siguiente manera. Después de la infección de E. coli ER2738 en fase logarítmica con partículas de fago, se añadió TSB suplementado con glucosa al 2 %, 10 μg/ml de tetraciclina y 100 μg/ml de ampicilina, seguido de incubación con rotación durante 30 minutos a 37 °C. A continuación, las bacterias se infectaron con el fago auxiliar M13K07 en un exceso de 5 veces. Las bacterias infectadas se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en medio
10 TSB-YE suplementado con 100 μM de IPTG, 25 μg/ml de kanamicina y 100 μg/ml de ampicilina y se dejaron crecer durante la noche a 30 °C. Los cultivos crecidos durante la noche se sedimentaron en una centrífuga, y las partículas de fago en el sobrenadante se precipitaron dos veces con tampón de PEG/NaCl. Finalmente, las partículas del fago se volvieron a suspender en el tampón de selección antes de entrar en el siguiente ciclo de selección.
En el ciclo de selección final, las bacterias en fase logarítmica se infectaron con eluato y se diluyeron antes de
15 esparcirlas en placas TBAB (30 g/l de agar sangre de triptosa, Oxoid n.° de cat. CMO233B) suplementado con 0,2 g/l de ampicilina para formar colonias individuales para su uso en la selección de ELISA.
Secuenciación de ligantes potenciales: Se seleccionaron clones individuales de las diferentes pistas de selección para la secuenciación. Todos los clones corridos en la selección de ELISA se secuenciaron. La amplificación de los fragmentos del gen y el análisis de la secuencia de los fragmentos del gen se realizaron esencialmente como se
20 describe en el Ejemplo 2.
Selección de ELISA de variantes Z: Colonias individuales que contienen variantes Z (expresadas como proteínas de fusión ABD de variante Z como se describe en el Ejemplo 2) se seleccionaron aleatoriamente de los clones seleccionados de la biblioteca madura con FcRn y se cultivaron en cultivos de 1 ml esencialmente como se describe en el Ejemplo 2. La preparación de los sobrenadantes periplásmicos se realizó como en el Ejemplo 2 con ocho ciclos
25 de congelación-descongelación y las fracciones periplásmicas se usaron sin diluir en la selección de ELISA. Las selecciones de ELISA se realizaron tanto a pH 6,0 como a pH 7,4 esencialmente como se describe en el Ejemplo 2 usando FcRn humano biotinilado a una concentración de 2 nM en cada pocillo. La fracción periplásmica del ligante primario de FcRn Z10193 (SEQ ID NO: 708, analizado en los experimentos anteriores) se usó como control positivo. El periplasma que contiene el resto ABD solo se usó como control negativo.
30 Análisis de la KD por ELISA de variantes Z de unión a FcRn: Una selección de ligantes de FcRn se sometió a un
imagen18
Z13587
732 1,4 × 10-9 6,9 × 10-9 Z13710 794 1,6 × 10-9 2,6 × 10-9
Z13588
733 1,0 × 10-9 2,3 × 10-9 Z13711 795 2,1 × 10-9 4,9 × 10-9
Z13592
734 9,5 × 10-10 1,8 × 10-9 Z13714 796 2,1 × 10-9 6,0 × 10-9
Z13594
735 1,3 × 10-9 6,3 × 10-9 Z13716 797 1,8 × 10-9 5,8 × 10-9
Z13596
736 1,5 × 10-9 3,6 × 10-9 Z13719 798 2,6 × 10-9 7,3 × 10-9
Z13597
737 1,4 × 10-9 6,0 × 10-9 Z13720 799 2,5 × 10-9 4,5 × 10-7
Z13598
738 1,1 × 10-9 1,7 × 10-9 Z13721 800 1,9 × 10-9 2,9 × 10-9
Z13600
739 1,4 × 10-9 4,0 × 10-9 Z13725 801 1,8 × 10-9 4,9 × 10-9
Z13604
740 1,3 × 10-9 4,1 × 10-9 Z13727 802 2,1 × 10-9 5,9 × 10-9
Z13605
741 1,3 × 10-9 3,8 × 10-9 Z13728 803 2,6 × 10-9 6,7 × 10-9
Z13609
742 1,3 × 10-9 2,7 × 10-9 Z13732 804 2,1 × 10-9 9,4 × 10-9
Z13611
743 1,3 × 10-9 2,5 × 10-9 Z13735 805 1,6 × 10-9 9,1 × 10-9
Z13612
744 1,2 × 10-9 8,6 × 10-9 Z13736 806 1,7 × 10-9 3,0 × 10-9
Z13613
745 1,2 × 10-9 4,3 × 10-9 Z13740 807 2,0 × 10-9 5,0 × 10-9
Z13615
746 1,2 × 10-9 3,1 × 10-9 Z13742 808 2,4 × 10-9 7,6 × 10-9
Z13616
747 9,6 × 10-10 1,7 × 10-9 Z13747 809 1,3 × 10-9 2,3 × 10-9
Z13617
748 1,2 × 10-9 1,9 × 10-9 Z13749 810 2,8 × 10-9 1,2 × 10-8
Z13620
749 1,4 × 10-9 3,3 × 10-9 Z13750 811 2,7 × 10-9 8,4 × 10-9
Z13621
750 8,6 × 10-10 1,4 × 10-9 Z13751 812 2,0 × 10-9 3,8 × 10-9
Z13622
751 1,1 × 10-9 2,1 × 10-9 Z13752 813 2,0 × 10-9 5,8 × 10-9
Z13624
752 1,3 × 10-9 3,4 × 10-9 Z13758 814 1,9 × 10-9 6,5 × 10-9
Z13625
753 1,3 × 10-9 2,8 × 10-9 Z13759 815 2,1 × 10-9 5,6 × 10-9
Z13626
754 1,2 × 10-9 2,7 × 10-9 Z13760 816 2,1 × 10-9 5,8 × 10-9
Z13627
755 1,2 × 10-9 2,9 × 10-9 Z13761 817 1,9 × 10-9 3,7 × 10-9
Z13628
756 1,3 × 10-9 5,5 × 10-9 Z13771 818 1,5 × 10-9 2,0 × 10-9
Z13629
757 1,2 × 10-9 8,5 × 10-9 Z13773 819 2,5 × 10-9 4,9 × 10-9
Z13633
758 1,5 × 10-9 6,2 × 10-9 Z13776 820 2,2 × 10-9 5,5 × 10-9
Z13634
759 1,1 × 10-9 2,3 × 10-9 Z13777 821 2,4 × 10-9 4,6 × 10-9
Z13635
760 1,0 × 10-9 1,7 × 10-9 Z13780 822 2,1 × 10-9 4,0 × 10-9
Z13637
761 1,3 × 10-9 4,8 × 10-9 Z13782 823 2,2 × 10-9 4,2 × 10-9
Z13638
762 1,2 × 10-9 2,9 × 10-9 Z13783 824 1,4 × 10-9 2,2 × 10-9
Z13639
763 1,3 × 10-9 3,0 × 10-9 Z13786 825 2,3 × 10-9 4,7 × 10-9
Z13640
764 1,1 × 10-9 1,9 × 10-9 Z13792 826 2,0 × 10-9 2,9 × 10-9
Z13641
765 1,1 × 10-9 1,8 × 10-9 Z13796 827 2,3 × 10-9 4,2 × 10-9
Z13644
766 1,3 × 10-9 2,8 × 10-9 Z13799 828 1,9 × 10-9 5,6 × 10-9
Z13645
767 1,2 × 10-9 2,5 × 10-9 Z13806 829 1,6 × 10-9 3,1 × 10-9
Z13648
768 1,6 × 10-9 3,3 × 10-9 Z13808 830 2,4 × 10-9 5,5 × 10-9
Z13651
769 1,2 × 10-9 2,7 × 10-9 Z13811 831 2,0 × 10-9 3,1 × 10-9
Z13652
770 1,4 × 10-9 2,9 × 10-9 Z13812 832 2,3 × 10-9 1,1 × 10-8
Z13654
771 9,5 × 10-10 2,9 × 10-9 Z13823 833 2,9 × 10-9 3,8 × 10-9
Z13655
772 1,1 × 10-9 2,4 × 10-9 Z13824 834 1,9 × 10-9 3,8 × 10-9
Z13656
773 1,1 × 10-9 3,7 × 10-9 Z13838 835 2,6 × 10-9 5,4 × 10-9
Z13657
774 2,1 × 10-9 3,9 × 10-9 Z13840 836 2,2 × 10-9 4,1 × 10-9
Z13659
775 2,2 × 10-9 3,1 × 10-9 Z13842 837 2,2 × 10-9 5,5 × 10-9
Z13663
776 9,3 × 10-10 1,5 × 10-9 Z13845 838 2,6 × 10-9 4,2 × 10-9
Z13664
777 2,4 × 10-9 4,2 × 10-9 Z13846 839 2,3 × 10-9 4,3 × 10-9
Z13667
778 1,2 × 10-9 2,3 × 10-9 Z13848 840 2,1 × 10-9 3,1 × 10-9
Z13669
779 9,2 × 10-10 1,7 × 10-9 Z13849 841 2,1 × 10-9 3,0 × 10-9
Z13672
780 2,5 × 10-9 5,6 × 10-9 Z13860 842 2,3 × 10-9 8,7 × 10-9
Z13674
781 9,2 × 10-10 1,3 × 10-9 Z13865 843 2,5 × 10-9 5,6 × 10-9
Z13675
782 9,6 × 10-10 2,2 × 10-9 Z13866 844 2,0 × 10-9 2,8 × 10-9
Z13676
783 9,4 × 10-10 3,1 × 10-9 Z13875 845 2,0 × 10-9 3,4 × 10-9
Z13678
784 2,0 × 10-9 3,3 × 10-9 Z13879 846 2,1 × 10-9 3,0 × 10-9
Ejemplo 9
Producción y caracterización de variantes Z a partir de una biblioteca madura
En este ejemplo, se produjeron doce variantes Z en E. coli, se purificaron y se analizaron para determinar la unión a 5 FcRn, así como para la inhibición de la unión de IgG a FcRn.
Materiales y métodos
Subclonación de variantes Z en vectores de expresión: El ADN de doce variantes Z de unión a FcRn (Z13577 (SEQ ID NO: 725), Z13578 (SEQ ID NO: 726), Z13583 (SEQ ID NO: 729), Z13592 (SEQ ID NO: 734), Z13616 (SEQ ID NO: 747), Z13621 (SEQ ID NO: 750), Z13654 (SEQ ID NO: 771), Z13663 (SEQ ID NO: 776), Z13669 (SEQ ID NO:
10 779), Z13674 (SEQ ID NO: 781), Z13675 (SEQ ID NO: 782) y Z13676 (SEQ ID NO: 783)) se amplificaron a partir del vector de biblioteca pAY02592. La subclonación se realizó como se describe en el Ejemplo 3. Los fragmentos del gen Z se subclonaron en el vector de expresión pAY01448 dando como resultado la secuencia codificada MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD.
Producción de variantes Z: El cultivo y la purificación de las variantes Z marcadas con His6 se realizaron 15 esencialmente como se describe en el Ejemplo 3.
Análisis de unión y cinético de Biacore: La interacción de FcRn que se une a las variantes Z marcadas con His6 con FcRn humano se analizó en un instrumento Biacore 2000 esencialmente como se describe en el Ejemplo 3. Se usó FcRn humano adquirido en Biorbyt (n.° de catálogo orb84388) como proteína diana. Los analitos se inyectaron durante 2 minutos a 30 μl/min. La fase de disociación fue de 4 minutos y el tiempo de equilibrio entre las inyecciones
20 de analito fue de 30 minutos.
En un experimento, las variantes Z se inyectaron a pH 6,0 seguido de disociación en tampones de pH 6,0 o pH 7,4, respectivamente, usando el procedimiento de coinyección. La concentración de las variantes Z fue de 100 nM.
En otro experimento, se determinaron las constantes cinéticas aproximadas (kon y koff) y las afinidades (KD) para un subconjunto de variantes Z. Las concentraciones inyectadas fueron 540 nM, 180 nM, 60 nM, 20 nM y 6,7 nM.
Ensayo de bloqueo de AlphaLISA: El potencial de las variantes Z para inhibir la unión de IgG a FcRn se analizó en el ensayo AlphaLISA descrito en el Ejemplo 3.
Resultados
Producción de variantes Z: Las doce variantes Z de unión a FcRn construidas con una etiqueta His6 N-terminal se
5 produjeron en E. coli. El análisis SDS-PAGE de cada preparación de proteína final mostró que estas contenían predominantemente la variante Z de unión a FcRn. La identidad correcta y el peso molecular de cada variante Z de unión a FcRn se confirmaron mediante análisis HPLC-MS.
Análisis de unión y cinético de Biacore: La unión de las doce variantes Z al FcRn humano y la disociación a diferentes pH se probaron en un instrumento Biacore inyectando secuencialmente cada una de las variantes Z a pH
10 6,0 y en tampón a pH 6,0 o pH 7,4 sobre un chip de superficie que contiene FcRn. El nivel de inmovilización del ligando de la superficie fue de 890 UR de FcRn humano. Las doce variantes Z mostraron unión a FcRn a pH 6,0, y para todas las variantes, se observaron velocidades de liberación más rápidas a pH 7,4 en comparación con pH 6,0.
Se determinaron las constantes cinéticas de las variantes Z Z13577 (SEQ ID NO: 725) y Z13621 (SEQ ID NO: 750) que interaccionan con FcRn a pH 6,0 (véase la Tabla 10). Las constantes cinéticas se calcularon usando grupos de
15 curvas de dos o cuatro concentraciones inyectadas de Z13577 y Z13621, respectivamente.
Tabla 10. Constantes cinéticas de Biacore y afinidades para la unión de FcRn a pH 6,0.
-1)
Variante Z SEQ ID NO: kon (M-1s koff (s-1) KD (M)
Z13577 725 3,0 × 105 4,0 × 10-3
13 × 10-9 Z13621 750 6,4 × 105 3,7 × 10-3 6 × 10-9
Análisis de bloqueo de AlphaLISA: La capacidad de doce variantes Z monoméricas marcada con His6 madura para inhibir la unión de IgG a FcRn se probó en un ensayo de bloqueo de AlphaLISA. Las diluciones en serie de la
20 variante Z se incubaron con FcRn humano biotinilado y se midió la capacidad de bloqueo de cada variante respectiva después de la adición de perlas aceptoras revestidas con IgG y, posteriormente, perlas donadoras recubiertas con estreptavidina. La inhibición podría medirse como una disminución en los recuentos de AlphaLISA para la variante Z positiva. Se demostró que las doce variantes Z probadas bloquean la unión de IgG a FcRn y los valores de CI50 calculados se muestran en la Tabla 11.
25 Tabla 11: Valores calculados de CI50 del ensayo de bloqueo de AlphaLISA
Variante Z
SEQ ID NO: CI50 (M)
Z13577
725 1,2 × 10-8
Z13578
726 1,2 × 10-8
Z13583
729 2,7 × 10-9
Z13592
734 6,4 × 10-9
Z13616
747 7,4 × 10-9
Z13621
750 3,2 × 10-9
Z13654
771 3,5 × 10-9
Z13663
776 1,1 × 10-8
Z13669
779 5,2 × 10-9
Z13674
781 2,5 × 10-9
Z13675
782 8,2 × 10-9
Z13676
783 3,9 × 10-9
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