CN104710518A - 新白蛋白结合组合物、方法及应用 - Google Patents
新白蛋白结合组合物、方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104710518A CN104710518A CN201510071238.8A CN201510071238A CN104710518A CN 104710518 A CN104710518 A CN 104710518A CN 201510071238 A CN201510071238 A CN 201510071238A CN 104710518 A CN104710518 A CN 104710518A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- albumin bound
- seq
- polypeptide
- albumin
- bound polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 title claims abstract description 248
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 title claims abstract description 248
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 48
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 255
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 231
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 229
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 41
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 67
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 63
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 60
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 47
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 46
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 36
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 34
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 14
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 14
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 13
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 claims description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 13
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 13
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 12
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 12
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 241000194015 Streptococcus sp. G148 Species 0.000 claims description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- -1 tendamistats Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 6
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 6
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 5
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 5
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 101710153593 Albumin A Proteins 0.000 claims description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 4
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 4
- 102000008102 Ankyrins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010049777 Ankyrins Proteins 0.000 claims description 3
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 claims description 3
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 claims description 3
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 claims description 3
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 claims description 3
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 claims description 3
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 claims description 3
- 108010059724 Micrococcal Nuclease Proteins 0.000 claims description 3
- 241000191992 Peptostreptococcus Species 0.000 claims description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 108050003126 conotoxin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 3
- 101100067974 Arabidopsis thaliana POP2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024217 CAMPATH-1 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 2
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 2
- 241001617393 Finegoldia Species 0.000 claims description 2
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000910338 Homo sapiens Carbonic anhydrase 9 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 claims description 2
- 101100118549 Homo sapiens EGFR gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 2
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101100123851 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) HER1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 230000002052 anaphylactic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 2
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 claims description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 claims description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 claims description 2
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 claims description 2
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 claims description 2
- 102100025101 GATA-type zinc finger protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- 101710198884 GATA-type zinc finger protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 26
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 23
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 19
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 17
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 17
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 10
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 9
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 8
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 7
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 7
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 7
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 108700011201 Streptococcus IgG Fc-binding Proteins 0.000 description 6
- 231100000481 chemical toxicant Toxicity 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 5
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 5
- 229960000641 zorubicin Drugs 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 4
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 4
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 101100282617 Bovine herpesvirus 1.1 (strain Cooper) gC gene Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBTUMDXHSRTGRV-ALTNURHMSA-N zorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(\C)=N\NC(=O)C=1C=CC=CC=1)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 FBTUMDXHSRTGRV-ALTNURHMSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 description 2
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282566 Macaca arctoides Species 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000007478 blood agar base Substances 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011078 in-house production Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940125725 tranquilizer Drugs 0.000 description 2
- 239000003204 tranquilizing agent Substances 0.000 description 2
- 230000002936 tranquilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 2
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-(2,6-diethylphenyl)-n-(methoxymethyl)acetamide;2,6-dinitro-n,n-dipropyl-4-(trifluoromethyl)aniline Chemical compound CCC1=CC=CC(CC)=C1N(COC)C(=O)CCl.CCCN(CCC)C1=C([N+]([O-])=O)C=C(C(F)(F)F)C=C1[N+]([O-])=O CVOFKRWYWCSDMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000272173 Calidris Species 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100285402 Danio rerio eng1a gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N Geldanamycin Natural products C1C(C)CC(OC)C(O)C(C)C=C(C)C(OC(N)=O)C(OC)CCC=C(C)C(=O)NC2=CC(=O)C(OC)=C1C2=O JRZJKWGQFNTSRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101100438326 Salmonella phage Felix O1 (isolate Felix O1-VT1) gene 58 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 210000002457 barrier cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000007767 bonding agent Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000004656 cell transport Effects 0.000 description 1
- PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N chelidonic acid Natural products OC(=O)C1=CC(=O)C=C(C(O)=O)O1 PBAYDYUZOSNJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQFCCCIRTOLPEF-UHFFFAOYSA-N chembl1976978 Chemical compound CC1=CC=CC=C1N=NC1=C(O)C=CC2=CC=CC=C12 BQFCCCIRTOLPEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 102000006834 complement receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010047295 complement receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 206010013990 dysuria Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N geldanamycin Chemical compound N1C(=O)\C(C)=C/C=C\[C@@H](OC)[C@H](OC(N)=O)\C(C)=C/[C@@H](C)[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H](C)CC2=C(OC)C(=O)C=C1C2=O QTQAWLPCGQOSGP-GBTDJJJQSA-N 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002898 library design Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- NQCBIMOYRRMVNA-UHFFFAOYSA-N propane-1,2,3-triol;hydrochloride Chemical compound Cl.OCC(O)CO NQCBIMOYRRMVNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M sodium;1-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- PKVRCIRHQMSYJX-AIFWHQITSA-N trabectedin Chemical compound C([C@@]1(C(OC2)=O)NCCC3=C1C=C(C(=C3)O)OC)S[C@@H]1C3=C(OC(C)=O)C(C)=C4OCOC4=C3[C@H]2N2[C@@H](O)[C@H](CC=3C4=C(O)C(OC)=C(C)C=3)N(C)[C@H]4[C@@H]21 PKVRCIRHQMSYJX-AIFWHQITSA-N 0.000 description 1
- 229960000977 trabectedin Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及一类具有白蛋白结合亲和性的工程化多肽。还涉及新的方法及应用，其在不同背景中采用这些及其它化合物与白蛋白的结合，其中一些具有治疗哺乳动物包括人类的疾病的显著性。
Description
本申请是申请号为“200880101168.4”，申请日为“2008年7月17日”，原发明名称为“新组合物、方法及应用”(2010年7月21日提交主动修改时将其修改为“新白蛋白结合组合物、方法及应用”)的申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及一类具有白蛋白结合亲和性的工程化多肽。还涉及新的方法及应用，其采用这些及其它化合物与白蛋白在不同环境下的结合，其中一些具有治疗哺乳动物包括人类的疾病的意义。
背景
血清白蛋白
血清白蛋白是哺乳动物血清中最丰富的蛋白质(40g/l；大约0.7mM于人类中)，其功能之一是结合诸如脂质和胆红素的分子(Peters T,Advancesin Protein Chemistry 37:161,1985)。血清白蛋白的半衰期与动物大小直接成比例，其中例如人血清白蛋白(HSA)半衰期是19天，兔血清白蛋白半衰期是大约5天(McCurdy TR et al,J Lab Clin Med 143:115,2004)。人血清白蛋白在体内广泛分布，特别是在肠道和血液区室内，其中其主要参与维持摩尔渗透压浓度。结构上，白蛋白是单链蛋白，包含3个同源结构域，总共584或585个氨基酸(Dugaiczyk L et al,Proc Natl Acad Sci USA79:71,1982)。白蛋白含有17个二硫桥和一个反应硫醇C34，但是缺少N-连接和O-连接碳水化合物部分(Peters,1985,supra；Nicholson JP et al,BrJ Anaesth 85:599,2000)。缺少糖基化简化了白蛋白的重组表达。白蛋白的这一性质与其三维结构是已知的的事实(He XM and Carter DC,Nature358:2091992)一起使其成为有吸引力的候选物而用于重组融合蛋白。这种融合蛋白通常组合治疗蛋白(其在给予该蛋白本身时会迅速从身体内清除)和血浆蛋白(其显示天然的慢清除)在一个多肽链中(Sheffield WP,CurrDrug Targets Cardiovacs Haematol Disord 1:1,2001)。这种融合蛋白可提供临床益处，注射频率降低，体内治疗蛋白水平更高。
与HSA的融合或缔合导致增加的蛋白质体内半衰期
血清白蛋白缺少任何酶学或免疫学功能，因此当与生物活性多肽偶联时应该不显示不希望的副作用。另外，HSA是天然载体，参与内源转运和输送各种天然和治疗分子(Sellers EM and Koch-Weser MD,AlbuminStructure,Function and Uses,eds Rosenoer VM et al,Pergamon,Oxford,p159,1977)。已报道几种策略以将蛋白质直接共价偶联至血清白蛋白或者偶联至允许体内缔合血清白蛋白的肽或蛋白质。后一途径的例子已在例如WO91/01743,WO01/45746及Dennis et al,J Biol Chem 277:35035-43(2002)中描述。第一个文件描述了衍生自链球菌蛋白G(SpG)的白蛋白结合肽或蛋白质的应用，用于增加其它蛋白质的半衰期。其中的观点是将细菌衍生的白蛋白结合肽/蛋白质与已显示在血液中快速清除的治疗感兴趣肽/蛋白质融合。由此产生的融合蛋白结合体内血清白蛋白并从其更长的半衰期获益，其增加了融合的治疗感兴趣肽/蛋白质的净半衰期。WO01/45746及Dennis et al涉及同一概念，但是作者利用相对短的肽结合血清白蛋白。所述肽选自噬菌体展示的肽文库。在Dennis et al中，早期工作被提及，其中发现了对链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域与人补体受体1型的重组融合体的免疫学应答的增强。US专利申请US2004/0001827(Dennis)也披露了使用包含肽配体的构建体，其也由肽展示技术鉴别，其结合血清白蛋白及缀合生物化学化合物用于肿瘤靶向。
与HSA缔合导致降低的免疫原性
除了对生物学活性蛋白质的体内半衰期的作用之外，还提示生物学活性蛋白质和白蛋白结合蛋白之间的融合体的与白蛋白的非共价缔合降低对生物学活性蛋白的免疫应答。因此，在WO2005/097202中，描述了用这一原理降低或消除对生物学活性蛋白的免疫应答。
细菌受体蛋白质的白蛋白结合结构域
链球菌蛋白G(SpG)是存在于一些链球菌菌株的表面上的双功能受体，能结合IgG和血清白蛋白(et al,MoI Immunol 24:1113,1987)。所述结构高度重复，具有几个结构和功能不同的结构域(Guss et al,EMBOJ 5:1567,1986)，更精确3个Ig结合基序和3个血清白蛋白结合结构域(Olsson et al,Eur J Biochem 168:319,1987)。3个血清白蛋白结合结构域之一的结构已确定，显示三螺旋束结构域(Kraulis et al,FEBS Lett 378:190,1996)。这一基序命名为ABD(白蛋白结合结构域)，大小为46个氨基酸残基。在文献中，其也被称为G148-GA3。
除了来自链球菌的蛋白G之外的其它细菌白蛋白结合蛋白也已经鉴别，其含有类似于蛋白G的白蛋白结合三螺旋结构域的结构域。这种蛋白的例子是PAB,PPL,MAG和ZAG蛋白。这种白蛋白结合蛋白的结构和功能研究已经进行和报道，例如Johansson和同事(Johansson et al,J MoIBiol 266:859-865,1997；Johansson et al,J Biol Chem 277:8114-8120,2002)，其引入了命名“GA模块”(蛋白G相关白蛋白结合模块)，针对负责白蛋白结合的三螺旋蛋白质结构域。另外，Rozak et al报道了产生GA模块的人工变体，其被选择和研究不同物种特异性和稳定性(Rozak et al,Biochemistry 45:3263-3271,2006)。在本说明书中，使用Johansson et al和Rozak et al文章中建立的对来自不同细菌物种的GA模块的术语。
除了上述含有三螺旋的蛋白质之外，存在结合白蛋白的其它细菌蛋白质。例如，命名为“M蛋白”的链球菌蛋白质家族包含结合白蛋白的成员(参见Navarre&Schneewind,MMBR 63:174-229,1999中的表2)。非限制性例子是蛋白质M1/Emm1,M3/Emm3,M12/Emm12,EmmL55/Emm55,Emm49/EmmL49和H。
新生Fc受体(FcRn)介导的HSA的胞转
MHC 1类新生Fc受体(FcRn)介导白蛋白和IgG的细胞运输和再循环(Brambell et al,Nature 203:1352,1964；Chaudhury et al,J Exp Med197:315,2003)。FcRn也称为Brambell受体，在低内体pH特异结合白蛋白和IgG，因此通过转运至细胞表面并在中性pH释放而保护胞饮蛋白免于溶酶体降解。FcRn在pH5-6对白蛋白和IgG有良好亲和性，而在中性pH显示差的至无亲和性。以此方式，白蛋白和IgG的浓度和半衰期被调节。另外，FcRn负责主动转运白蛋白和IgG穿过细胞屏障，例如气道的表皮和覆盖肠道和胎盘的内皮。
如从背景描述不同段落证明的，提供选择具有对白蛋白的高亲和性的多肽是开发各种生物医学、生物技术和其它应用的关键因素，因此现有技术需要额外的这种多肽分子。
发明公开
本发明第一方面满足了对具有相当高的白蛋白亲和性的新多肽的需求，其是通过提供包含白蛋白结合基序的白蛋白结合多肽而满足，所述基序由如下氨基酸序列组成：
GVSDX5YKX8X9I X11X12AX14TVEGVX20ALX23X24X25I
其中各自独立地，
X5选自Y和F；
X8选自N,R和S；
X9选自V,I,L,M,F和Y；
X11选自N,S,E和D；
X12选自R,K和N；
X14选自K和R；
X20选自D,N,Q,E,H,S,R和K；
X23选自K,I和T；
X24选自A,S,T,G,H,L和D；和
X25选自H,E和D；
条件是所述氨基酸序列不是
GVSDYYKNLI NNAKTVEGVK ALIDEI；
所述白蛋白结合多肽结合白蛋白，从而相互作用的KD值最大为1x 10-9M。
本发明的序列相关的白蛋白结合多肽种类的上述定义是基于大量如下实验章节详细描述的鉴别和鉴定的白蛋白结合多肽的统计学分析。变体选自亲代多肽序列或“骨架”的随机变体的大集合，所述选择基于在例如噬菌体展示或其它选择实验中与白蛋白的相互作用。鉴别的白蛋白结合基序或“ABM”相应于亲代骨架的白蛋白结合区，所述区域组成三螺旋束蛋白结构域内的2个α螺旋。尽管亲代骨架中的2个ABM螺旋的原始氨基酸残基已经组成结合表面用于与白蛋白相互作用，该结合表面根据本发明通过取代修饰以提供另外的白蛋白结合能力。
本领域技术人员会认识到任何多肽的功能，例如本发明多肽的白蛋白结合能力，依赖于多肽的三级结构。因此可以对多肽的氨基酸序列进行小改变而不影响其功能。因此，本发明涵盖了ABM的修饰变体，它们使得白蛋白结合特征被保留。例如，可以将属于某一功能组的氨基酸残基(例如疏水性、亲水性、极性等)的氨基酸残基用来自相同功能组的另一个氨基酸交换。
在本发明这一方面的多肽的一个实施方案中，X5是Y。
在本发明这一方面的多肽的一个实施方案中，X8选自N和R，并且可以特别是R。
在本发明这一方面的多肽的一个实施方案中，X9是L。
在本发明这一方面的多肽的一个实施方案中，X11选自N和S，并且可以特别是N。
在本发明这一方面的多肽的一个实施方案中，X12选自R和K，例如X12是R或X12是K。
在本发明这一方面的多肽的一个实施方案中，X14是K。
在本发明这一方面的多肽的一个实施方案中，X20选自D,N,Q,E,H,S和R，并且可以特别是E。
在本发明这一方面的多肽的一个实施方案中，X23选自K和I，并且可以特别是K。
在本发明这一方面的多肽的一个实施方案中，X24选自A,S,T,G,H和L。
在本发明这一方面的多肽的一个更具体的实施方案中，X24是L。
在本发明这一方面的多肽的一个甚至更具体的实施方案中，X23X24是KL。
在本发明这一方面的多肽的另一个甚至更具体的实施方案中，X23X24是TL。
在本发明这一方面的多肽的一个实施方案中，X24选自A,S,T,G和H。
在本发明这一方面的多肽的一个更具体的实施方案中，X24选自A,S,T,G和H，以及X23是I。
在本发明这一方面的多肽的一个实施方案中，X25是H。
如以下实验章节详述，白蛋白结合变体的选择导致鉴别大量的各个白蛋白结合基序(ABM)序列。这些序列组成了本发明这一方面的白蛋白结合多肽的定义中的ABM序列的各个实施方案。各个白蛋白结合基序的序列如图1和SEQ ID NO:1-257所示。在本发明的白蛋白结合多肽的一些实施方案中，ABM由选自SEQ ID NO:1-257的氨基酸序列组成。在本发明这一方面的一个更具体的实施方案中，ABM序列选自SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240、SEQ IDNO:241、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244和SEQ IDNO:245。在本发明这一方面的更具体的实施方案中，ABM序列选自SEQID NO:3、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:239。
在本发明实施方案中，ABM可形成三螺旋束蛋白结构域的部分。例如，ABM可基本上组成或形成所述三螺旋束蛋白结构域内的具有互连环的两个α螺旋。
在本发明的特定实施方案中，这种三螺旋束蛋白结构域选自由细菌受体蛋白的三螺旋结构域组成的组。这种细菌受体蛋白的非限制性例子可以选自由来自链球菌、消化链球菌和Finegoldia的物种的白蛋白结合受体蛋白组成的组，例如选自由蛋白G、MAG、ZAG、PPL和PAB组成的组。在本发明的一个具体的实施方案中，ABM形成蛋白G例如来自链球菌菌株G148的蛋白G的部分。在这一实施方案的不同变体中，ABM形成其部分的三螺旋束蛋白结构域选自由来自链球菌菌株G148的蛋白G的结构域GA1、结构域GA2和结构域GA3组成的组，特别是结构域GA3。
在其它实施方案中，ABM形成来自金黄色葡萄球菌的细菌受体蛋白蛋白A的5个三螺旋结构域的一或多个的部分，即所述三螺旋束蛋白结构域选自由蛋白A结构域A、B、C、D和E组成的组。在其它相似实施方案中，ABM形成衍生自来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域B的蛋白Z的部分。
在本发明的实施方案中，其中ABM“形成三螺旋束蛋白结构域的部分”，是指ABM的序列“插入”或“移植”到天然发生的(或原始的)三螺旋束结构域的序列之中或之上，从而ABM置换原始结构域中相似的结构基序。例如，不希望受理论束缚，ABM被认为组成三螺旋束的三个螺旋中的两个，因此可以置换任何三螺旋束内的这种两个螺旋基序。如本领域技术人员理解，由两个ABM螺旋置换三螺旋束结构域的两个螺旋应该不影响多肽的基本结构而进行。即，本发明的这一实施方案的多肽的Cα骨架的整体折叠与其形成部分的三螺旋束蛋白结构域的整体折叠基本上相同，例如具有相同顺序的相同二级结构元件等。因此，如果本发明这一实施方案的多肽与原始结构域具有相同折叠，则本发明的ABM“形成”三螺旋束结构域的“部分”，提示基本结构性质被共享，所述性质例如产生相似的CD谱。技术人员了解相关的其它参数。
在本发明的一个实施方案中，白蛋白结合多肽是三螺旋束蛋白结构域，其包含上述白蛋白结合基序和构成三螺旋构型的其余部分的额外序列。因此，本发明提供了白蛋白结合多肽，其包含如下氨基酸序列：
LAEAKXaXbAXcXd ELXeKY-[ABM]-LAALP
其中
[ABM]是上述定义的白蛋白结合基序，
以及，各自独立地，
Xa选自V和E；
Xb选自L,E和D；
Xc选自N,L和I；
Xd选自R和K；及
Xe选自D和K。
在这个多肽的一个实施方案中，Xa是V。
在这个多肽的一个实施方案中，Xb是L。
在这个多肽的一个实施方案中，Xc是N。
在这个多肽的一个实施方案中，Xd是R。
在这个多肽的一个实施方案中，Xe是D。
同样，如以下实验章节详述，大量白蛋白结合变体的选择和测序导致鉴别各个白蛋白结合多肽序列。这些序列组成了本发明第一方面的上述实施方案的白蛋白结合多肽的各个实施方案。这些白蛋白结合多肽各自的序列在图1和SEQ ID NO:258-514中示出。本发明还涵盖具有与选自SEQ IDNO:258-514的序列具有85％或更大相同性的氨基酸序列的白蛋白结合多肽。在具体的实施方案中，白蛋白结合多肽的序列选自SEQ ID NO:259,SEQ ID NO:260,SEQ ID NO:266,SEQ ID NO:272,SEQ ID NO:282,SEQID NO:284,SEQ ID NO:303,SEQ ID NO:306,SEQ ID NO:310,SEQ IDNO:311,SEQ ID NO:312,SEQ ID NO:412,SEQ ID NO:496,SEQ IDNO:497,SEQ ID NO:498,SEQ ID NO:499,SEQ ID NO:500,SEQ IDNO:501和SEQ ID NO:502以及与其有85％或更大相同性的序列。在本发明这一方面的更具体的实施方案中，白蛋白结合多肽的序列选自SEQ IDNO:260,SEQ ID NO:310和SEQ ID NO:496以及与其有85％或更大相同性的序列。
如以上证明，除了氨基酸序列选自SEQ ID NO:258-514或其亚集的多肽之外，本发明还涵盖其变体。这种涵盖的变体的氨基酸序列与SEQ IDNO:258-514相比仅显示小差异。这种变体的一个定义见上述，及具有与选自SEQ ID NO:258-514的序列有至少85％相同性的氨基酸序列的白蛋白结合多肽。在一些实施方案中，本发明多肽可具有与选自SEQ IDNO:258-514的序列至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。比较可以在相应于被比较的序列的最短者的窗口进行，或者在相应于在被比较的序列的至少一种中的白蛋白结合基序的窗口进行。
术语“白蛋白结合”和“对白蛋白的结合亲和性”在本说明书中是指多肽的性质，其可以例如用表面等离子体共振技术如在Biacore仪器中被测试。例如如下述实施例所述，白蛋白结合亲和性可以在实验中测试，其中白蛋白或其片段固定化在仪器的传感器芯片上，含有被测多肽的样品通过芯片。或者，被测多肽固定化在仪器的传感器芯片上，含有白蛋白或其片段的样品通过芯片。白蛋白可以是来自哺乳动物的血清白蛋白，如人血清白蛋白。技术人员可以然后解释这种实验获得的结果以建立多肽对白蛋白的结合亲和性的至少一种定性测量。如果希望定性测量，例如确定相互作用的KD值，也可以使用表面等离子体共振方法。结合值可以例如在Biacore2000仪器(Biacore AB)中限定。白蛋白被适当地固定化在测量的传感器芯片上，待确定亲和性的多肽的样品用系列稀释制备并以随机顺序注射。然后可用例如由仪器厂商提供的BIAevaluation 4.1软件的1:1Langmuir结合模型从结果计算KD值(Biacore AB)。
根据本发明的第一方面的白蛋白结合多肽结合白蛋白，从而相互作用的KD值是最多1x 10-9M，即1nM。在一些实施方案中，相互作用的KD值是最多1x 10-10M,如最多1x 10-11M,例如最多1x 10-12M。
在本发明的一个实施方案中，白蛋白结合多肽结合的白蛋白是人血清白蛋白。
本发明也涵盖了上述白蛋白结合多肽，其进一步包含位于白蛋白结合基序的一侧或两侧的一或多个额外氨基酸。这些额外氨基酸残基可起增强多肽对白蛋白的结合的作用，但是可有其它目的，相关于例如生产、纯化、体内或体外稳定化、多肽的偶联或检测及其任意组合。这种额外的氨基酸残基可包含一或多个添加的氨基酸残基，用于化学偶联于例如层析树脂的目的，以获得亲和基质，或者偶联于螯合部分以与金属放射核素复合。一个例子是在多肽链的第一个或最后一个位置添加半胱氨酸残基，及在N或C端。这种额外的氨基酸残基也可以包含“标记(tag)”用于纯化或检测多肽，如六组氨酸(His6)标记或“myc”(“c-myc”)标记或“FLAG”标记用于与特异于该标记的抗体相互作用。技术人员了解其它替代方式。
上述“额外的氨基酸残基”也可组成具有任何希望功能的一或多个多肽结构域，如与第一个白蛋白结合结构域相同结合功能，或者另一种结合功能，或者治疗功能，或酶功能，或荧光功能，或其混合物。本发明的这种多肽中的连接的多肽“单位”可以用已知有机化学方法共价偶联而连接，或者在多肽的重组表达系统中表达为一或多个融合多肽，或者以任何其它方式连接，直接连接或由包含一些氨基酸的接头介导连接。
另外，本发明这一方面还涵盖保留白蛋白结合的白蛋白多肽的片段。产生具有保留的结合特异性的野生型三螺旋结构域的片段的可能性由Braisted AC et al在Proc Natl Acad Sci USA 93:5688-5692(1996)中示出。在该论文中描述的实验中，使用基于结构的设计及噬菌体展示方法，59个残基的三螺旋束的结合结构域被降低为33个残基的产生的二螺旋衍生物。这通过逐步选择来自不同区域的随机突变而实现，其槽中稳定性和结合亲和性迭代改良。基于相同理由，用本发明的多肽，技术人员能获得“最小化”白蛋白结合多肽，其具有与“亲代”白蛋白结合多肽相同的结合性质。因此，组成本发明的多肽的片段并基本上保留白蛋白结合的多肽属于本发明范围。作为非限制性例子，片段可以相应于上述白蛋白结合多肽，其是N-末端截短的。这种截短可例如是1-3个氨基酸。
如上所述，本发明还涵盖具有对白蛋白的亲和性的多肽的多聚体，即包含至少二个白蛋白结合多肽或其片段作为单体单位的多肽链。可能感兴趣的是例如在白蛋白的纯化方法中或者在利用白蛋白结合功能的治疗方法中，用本发明的一个多肽获得甚至更强的白蛋白结合是可能的。在这种情况中，提供多聚体如二聚体、三聚体或四聚体多肽可提供必需的亲合力作用。多聚体可由合适数目的本发明多肽组成。本发明的这些多肽结构域在这种多聚体中形成单体，可以全部具有相同的氨基酸序列，但是也可能它们具有不同的氨基酸序列。如上所述，在本发明的多聚体中的连接的多肽“单位”可使用已知的有机化学方法通过共价偶联连接，或者在用于多肽的重组表达的系统中表达为一或多个融合多肽，或者以任何其它方式连接，直接连接或由包含一些氨基酸的接头介导。
另外，“异种”融合多肽或蛋白或缀合物也包括在本发明范围内，其中本发明的白蛋白结合多肽或其片段或多聚体组成第一个结构域或第一个部分，第二个和进一步的部分具有非结合白蛋白的其它功能。在这种蛋白质中的融合多肽或缀合物的第二个和进一步的部分合适地具有希望的生物学活性。这种希望的生物学活性的非限制性例子包括治疗活性，结合活性和酶活性。在本发明这个方面的一些实施方案中，第二个部分和任何进一步的部分选自如下一组：GLP-1(胰高血糖素样肽1)；HGH(人生长激素)；G-CSF(粒细胞集落刺激因子)；IL-1受体激动剂(白介素1受体激动剂)；TNF-α肿瘤坏死因子α)；和凝血因子VII、VIII、IX和X。在其他实施方案中，所述第二个和任何进一步的部分选自能与靶分子选择性相互作用(结合)的结合部分，所述靶分子典型地是除白蛋白之外的靶分子，尽管白蛋白不除外。这种结合部分合适地选自如下一组：抗体及其基本上保留抗体结合活性的片段和结构域；微体,maxybodies,高亲合性多聚体(avimer)及其他小含二硫键蛋白质；及衍生自选自如下一组骨架的结合蛋白，所述的组由如下组成：葡萄球菌蛋白A及其结构域；lipocalins,锚蛋白重复结构域，纤维素结合结构域，γ晶体，绿色荧光蛋白，人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4，蛋白酶抑制剂，PDZ结构域，肽适体(aptamer)，葡萄球菌核酸酶，tendamistats,纤连蛋白III型结构域，锌指，芋螺毒素和Kunitz结构域。在本发明的一些实施方案中，用于结合所述靶结合部分的靶分子选自如下一组：Aβ肽；其他疾病相关淀粉样肽；毒素，如细菌毒素和蛇毒；凝血因子，如von Willebrand因子；白介素，如IL-13；肌抑素(myostatin)；促炎因子，如TNF-α,TNF-α受体和IL-8；补体因子，如C3a和C5a；过敏介质，如组胺和IgE；肿瘤相关抗原，如CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD40,CD52,CD70,cMet,HER1,HER2,HER3,HER4,CA9,CEA,IL-2受体,MUC1,PSMA,TAG-72。
产生融合多肽或缀合物的其它可能性也包括在内。因此，本发明第一方面的白蛋白结合多肽可以共价偶联于第二个或进一步的部分，其除了靶结合之外或代替靶结合展示其它功能。一个例子是一或多个白蛋白结合多肽与作为报道或效应部分的酶学活性多肽的融合。可与白蛋白结合多肽偶联形成然后对比的报道酶的例子是技术人员已知的并包括酶如β-半乳糖苷酶，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，羧基肽酶。本发明的融合多肽或缀合物的第二个和进一步的部分的其它选择还非限制性包括荧光多肽如绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白，萤光素酶及其变体。
对于掺入本发明的白蛋白结合多肽的融合蛋白或缀合物的以上描述，应注意第一个、第二个和进一步的部分的命名是为清楚起见，以区分本发明的白蛋白结合多肽和具有其它功能的部分。这些命名不是指不同结构域在融合蛋白或缀合物的多肽链中的实际顺序。因此，例如所述第一个部分不加限制地出现在融合蛋白或缀合物的N-末端，在中部或者在C-末端。
本发明还涵盖这样的多肽，其中上述白蛋白结合多肽已被提供标记，如选自由荧光染料和金属、生色染料、化学发光化合物及生物发光蛋白、酶、放射性核素和颗粒组成的组，例如用于体外或体内检测多肽。
本发明的相关方面提供了编码上述多肽的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的表达载体及包含所述表达载体的宿主细胞。本发明的后三个方面是产生本发明多肽的工具，鉴于本文的有关待表达多肽的信息以及蛋白质重组表达领域的当前技术水平，技术人员无需过多负担即能够获得它们并将它们用于实际应用。因此，本发明的其它相关方面是产生本发明第一方面的多肽的方法，包括表达本文所述的多核苷酸，例如通过将本文所述宿主细胞在允许从表达载体表达多肽的条件下培养，以及分离多肽。
如背景部分描述以及本领域技术人员熟知，具有对白蛋白的结合亲和性的多肽分子的可能应用有几种。本发明的白蛋白结合多肽以及其片段、多聚体和融合蛋白或缀合物可以用于任一或多种这些应用中。
作为上述白蛋白结合多肽的应用的非限制性例子，本发明在另一方面提供了本发明第一方面的白蛋白结合多肽与具有希望的生物学活性(如上定义)的多肽的融合蛋白或缀合物在制备药物中的应用，所述药物显示比具有希望的生物学活性的多肽的体内半衰期更长的体内半衰期。换句话说，本发明提供了延长具有希望的生物学活性的多肽的体内半衰期的方法，其通过将这种多肽与本发明第一方面的白蛋白结合多肽融合或缀合进行。对于白蛋白结合分子的这一应用的细节，参见例如PCT申请WO91/01743和WO01/45746，其引入本文作参考。
作为另一个应用的非限制性例子，本发明在另一方面提供了本发明第一方面的白蛋白结合多肽与具有希望的生物学活性(如上定义)的多肽的融合蛋白或缀合物在制备药物中的应用，与给予哺乳动物具有希望的生物学活性的多肽本身所引起的免疫应答相比，所述药物在给予哺乳动物时不引起或引起降低的免疫应答。换句话说，本发明提供了降低具有希望的生物学活性的多肽的免疫原性的方法，其通过将这种多肽与本发明第一方面的白蛋白结合多肽融合或缀合进行。对于白蛋白结合分子的这一应用的细节，参见例如PCT申请WO2005/097202，其引入本文作参考。
本发明另一系列方面设计提供新手段，增加可溶性差的化合物的水溶解度，其通过与白蛋白结合多肽偶联而进行。可溶性差的化合物与白蛋白结合多肽的复合物能够与白蛋白体内或体外缔合，所述缔合增加水溶解度。可用本发明增加水溶解度的化合物的例子可典型地包括用于癌症化疗的可溶性差的细胞毒性剂。使用这一方法，例如在药物组合物的配制中，使得能冻干所得制剂，然后其可以在水溶液中重配。另外，本发明这些方面提供了与化合物本身相比具有降低的聚集倾向的制剂。
因此，本发明另一方面提供了组合物，其包含：
化合物，其本身在水中溶解度不超过100 μg/ml；该化合物偶联于
白蛋白结合多肽，其具有对白蛋白的亲和性，从而所述相互作用的KD不超过1x 10-6M。
在一个实施方案中，化合物本身具有不超过10 μg/ml、如不超过1μg/ml的水中溶解度。
在一个实施方案中，白蛋白结合多肽具有对白蛋白的亲和性，从而所述相互作用的KD不超过1x 10-7M，如不超过1x 10-8M，例如不超过1x10-9M，如不超过1x 10-10M，如不超过1x 10-11M，例如不超过1x 10-12M。
在一些实施方案中，化合物可以是药物活性化合物，例如细胞毒性剂。细胞毒性剂的非限制性例子是选自calicheamycin,auhstatin,阿霉素、maytansinoid、紫杉醇、ecteinascidin、格尔德霉素及其衍生物以及其组合的那些。或者，细胞毒性剂可以是非衍生自天然发生的化合物的合成的化学毒素。
化合物和白蛋白结合多肽可以非共价缔合，但是其优选是共价偶联在一起。
本发明这个方面的组合物包含白蛋白结合多肽。在一个实施方案中，白蛋白结合多肽是天然发生的多肽或其白蛋白结合片段或衍生物。白蛋白结合多肽可以作为非限制性例子选自由白蛋白结合蛋白M1/Emm1、M3/Emm3、M12/Emm12、EmmL55/Emm55、Emm49/EmmL49、H、G、MAG、ZAG、PPL和PAB组成的组。在更具体的实施方案中，白蛋白结合多肽是链球菌蛋白G或其白蛋白结合片段或衍生物。在还更具体的实施方案中，能结合白蛋白的多肽选自由链球菌菌株G148的蛋白G的结构域GA1、结构域GA2和结构域GA3组成的组，因此可例如是GA3结构域。
在一个实施方案中，白蛋白结合多肽包含大约5至大约214个氨基酸残基，如大约5至大约46个氨基酸残基，例如大约10至大约20个氨基酸残基。
在本发明这个方面的另一个实施方案中，白蛋白结合多肽包含选DICLPRWGCLW、DLCLRDWGCLW和DICLARWGCLW的氨基酸序列。
在本发明这些方面的另一个实施方案中，白蛋白结合多肽包含本发明第一方面的任一白蛋白结合多肽，即通过其白蛋白结合基序定义一类新的白蛋白结合多肽的本发明的方面。
在本发明这些方面的另一个实施方案中，白蛋白结合多肽能与人血清白蛋白的至少一个、优选全部残基F228、A229、A322、V325、F326和M329相互作用，从而增强该分子与白蛋白的结合。例如，白蛋白结合多肽包括形成与人血清白蛋白中的M329残基的相互作用的氨基酸残基，从而增强该分子与白蛋白的结合。另外，或者，白蛋白结合多肽可包括一氨基酸残基，其与人血清白蛋白结构域IIB中的螺旋7形成相互作用，从而增强该分子与白蛋白的结合。另外，或者，白蛋白结合多肽可包括一氨基酸残基，其与人血清白蛋白结构域IIA中的残基形成相互作用，从而增强该分子与白蛋白的结合。另外，或者，白蛋白结合多肽可包括一氨基酸残基，其与人血清白蛋白的螺旋2或3之间的残基形成相互作用，从而增强该分子与白蛋白的结合。
除了可溶性差的化合物和白蛋白结合多肽之外，本发明这个方面的组合物在一些实施方案中还可包括具有对临床相关靶的亲和性的结合多肽。这一结合多肽适当地不同于白蛋白结合多肽，并可以非共价或共价偶联于本发明组合物的其它组分。作为非限制性例子，具有对临床相关靶的亲和性的结合多肽可以选自如下一组：抗体及其基本上保留抗体结合活性的片段和结构域；微体,maxybodies,高亲合性多聚体及其他小含二硫键蛋白质；及衍生自选自如下一组骨架的结合蛋白，所述的组由如下组成：葡萄球菌蛋白A及其结构域；lipocalins,锚蛋白重复结构域，纤维素结合结构域，γ晶体，绿色荧光蛋白，人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4，蛋白酶抑制剂，PDZ结构域，肽适体(aptamer)，葡萄球菌核酸酶，tendamistats,纤连蛋白III型结构域，锌指，芋螺毒素和Kunitz结构域。
本发明上述方面的组合物通过提供在白蛋白结合多肽组合物中而具有与白蛋白体内或体外缔合的能力。在一些情况中，可能有利的是形成与活生物体外的白蛋白的组合物复合物，即向组合物中加入外源白蛋白。因此，本发明还提供了上述组合物，其进一步包含白蛋白，如人血清白蛋白。
本发明还提供了上述方面的组合物用作药物，当化合物是治疗活性化合物时。适当地，提供白蛋白结合多肽和任选地白蛋白不毁坏性影响活性化合物的治疗功效，因此本发明组合物用于化合物本身适用的治疗或预后情况中。
本发明的相关方面提供了制备上述组合物的方法。所述方法包括：
提供化合物，所述化合物本身在水中溶解度不超过100μg/ml；及
将所述化合物与白蛋白结合多肽共价偶联，所述多肽具有对白蛋白的亲和性，从而所述相互作用的KD不超过1x 10-6M，由此形成化合物与白蛋白结合多肽的共价复合物。
在白蛋白被包括在组合物中的本发明的实施方案中，所述方法可有利地包括额外步骤，将化合物和白蛋白结合多肽的所述复合物与白蛋白混合，由此形成组合物，其包含i)化合物和白蛋白结合多肽的共价复合物和ii)白蛋白的非共价复合物。这一非共价复合物的两种组分的相对比例可以例如是1:1，从而一个单位的可溶性差的化合物和白蛋白结合多肽的复合物与一个分子的白蛋白缔合。在一个实施方案中，所述方法额外包括冻干所述非共价复合物以活动冻干的组合物。
在另一个密切相关方面中，本发明提供了增加化合物的水溶解度的方法，包括：
提供化合物，所述化合物本身在水中溶解度不超过100μg/ml；
将所述化合物与白蛋白结合多肽共价偶联，所述多肽具有对白蛋白的亲和性，从而所述相互作用的KD不超过1x 10-6M，由此形成化合物与白蛋白结合多肽的共价复合物；及
在促进白蛋白结合多肽与白蛋白的非共价缔合的条件下将化合物和白蛋白结合多肽的所述复合物与白蛋白混合；
由此所述复合物中的化合物在水中的溶解度大于化合物本身在水中的溶解度。
在关于可溶性差的化合物的溶解度的这些方法方面中，各种组分的任选特征如前述组合物方面所述。
如上所述，本发明这些方面的实施方案特别涉及靶向都统与白蛋白结合多肽的组合，这一分子与例如化学毒素的缀合，以及配制和给予具有白蛋白的所得化学毒素缀合物以避免低溶解度问题。
化学毒素通常是疏水性化合物。因此，溶解度差是处理和配制化学毒素缀合物包括与化学毒素缀合的抗体的一个挑战。当试图将毒素分子簇与一个载体蛋白偶联时这一问题加重了。相反，与白蛋白分子复合的化学毒素缀合的白蛋白结合融合蛋白具有源于白蛋白增溶性质的优异溶解度，这由白蛋白作为血浆中许多小分子的载体的作用而反映。本发明这些实施方案的一个方面是白蛋白结合结构域与白蛋白的强缔合以防止可能导致非缔合的白蛋白结合蛋白缀合物的沉淀的其它相互作用。
单克隆抗体从血液的缓慢外渗已经被认为是限制抗体介导的疗法的生物学屏障之一(Wu and Senter,Nature Biotechnology 23:1137-46,2005)。令人感兴趣地，在平衡时，在人类中大约60％的血清白蛋白被发现在间隙中，而仅40％发现在血液中。因此，本发明提供的与白蛋白的缔合被认为是获得血液外广泛分布的优异手段。与血清白蛋白的缔合的亲和性合适地特征在于解离速率(复合物解体)足够慢，从而仅微小部分的复合物在从血液转运到间质过程中解离。但是，相互作用不是必须是共价的，因为在转运期间再结合是可能的。
外渗和广泛分布的一个可能贡献机制是在血清白蛋白与FcRn受体结合后主动转运。结果，为获得相似分布，对白蛋白结合融合蛋白中的白蛋白结合部分有一定要求。例如，亲和性在受体在细胞中转运过程中遇到的酸性环境中可能在低至pH低于6的环境中也非常紧密。
附图简述
图1是包含在本发明的白蛋白结合多肽中的白蛋白结合基序例子的氨基酸序列列表(SEQ ID NO:1-257)，本发明白蛋白结合多肽例子的氨基酸序列列表(SEQ ID NO:258-514)及来自链球菌菌株G148的蛋白G的GA3结构域氨基酸序列列表(SEQ ID NO:515)。
图2是是表达载体pAY1075中的编码插入序列的主要特征示意图，该表达载体不具有(A)和具有(B)编码变体ABD分子的螺旋2和3的盒。
图3A显示了在制备表达载体pAY1075的编码插入序列中用于扩增编码虚拟、Zwt和GIII的DNA片段的策略。图3B示出用于产生完整编码插入序列的这些片段的重叠。
图4是表达载体pAY1075的载体图谱，如实施例1所述制备。
图5是表达载体pAY1075-ABD的载体图谱，如实施例1所述制备。
图6是一个表，显示如实施例1所述用AFFI-793寡核苷酸混合物产生的ABD变体亚文库中每个变化位置的氨基酸变化的理论值(阴影栏)和实验(透明栏)值。
图7是一个表，显示如实施例1所述用AFFI-794寡核苷酸混合物产生的ABD变体亚文库中每个变化位置的氨基酸变化的理论值(阴影栏)和实验(透明栏)值。
图8是根据实施例2的描述在pAY442载体中表达的ABD变体的氨基酸序列的示意图。
图9A-9C示出当在用Z00342包被的ELISA平板上分析时，如实施例4所述在0-45天从用Z00342注射的灵长类动物获得的血清的ELISA滴定曲线。
图10A-10C示出当在用Z00342-ABD00003包被的ELISA平板上分析时，如实施例4所述在0-45天从用Z00342-ABD00003注射的灵长类动物获得的血清的ELISA滴定曲线。
图11示出特异于如实施例4所述在0-45天从用Z00342及Z00342-ABD00003注射的灵长类动物获得的血清中Z变体的IgG中位浓度。
图12示出如实施例4所述用夹心ELISA分析的随时间推移血液循环中A)Z00342和B)Z00342-ABD00003的量。
图13A-13B示出当在用(Z01154)2包被的ELISA平板上分析时，如实施例5所述在0-45天从用(Z01154)2注射的灵长类动物获得的血清的ELISA滴定曲线。
图14A-14B示出当在用(Z01154)2-ABD00239包被的ELISA平板上分析时，如实施例5所述在0-45天从用(Z01154)2-ABD00239注射的灵长类动物获得的血清的ELISA滴定曲线。
图15示出分别在图13和图14中分析的A)(Z01154)2和B)(Z01154)2-ABD00239样品的标准化值。样品吸光度针对1600x稀释度的阳性对照标准化。
本发明将通过所进行的非限制性实验描述进一步描述。除非另外说明，使用常规化学和分子生物学方法。
实施例
实施例1
构建白蛋白结合多肽变体的噬菌体展示文库
概述
在本实施例中，产生了多肽变体的噬菌体展示文库，其通过在链球菌菌株G148的白蛋白结合结构域GA3(以下称为“ABD”)的螺旋2和3的16个位置的变化产生。ABD的野生型序列("ABDwt")在图1中的SEQ IDNO:491和后附的序列表中示出。基于先前描述的pAffi1载体(etal,J Biotechnol 128:162-183,2007)的新噬菌体展示载体(pAY1075)被构建用于这一新文库。变化的ABD片段(螺旋2-3)用限制酶SacI和NheI克隆进pAY1075。纯化连接液并电穿孔进大肠杆菌RR1ΔM15细胞(Rüther,Nucleic Acids Res 10:5765-5772,1982)。新构建的文库命名为LibABDmat2005并由2个亚文库组成，取决于哪些寡核苷酸被用于产生螺旋2和3的变化的序列。一个在ABD分子上构建，另一个在ABD的位置17和18之间插入一额外氨基酸，一些与ABD同源的蛋白质具有其(参见例如Rozak et al,Biochemistry 45:3263-3271,2006)。LibABDmat2005的大小是1x 109个成员(每个亚文库5x 108)。新文库的质量是满意的，DNA测序显示大约87％的克隆是功能性的并且氨基酸相对频率的测量值与理论值良好符合。
构建噬菌粒载体pAY1075
构建了新噬菌体展示载体(pAY1075)用于该新文库。pAY1075基于噬菌粒载体pAffi1(et al，supra)。为产生pAY1075，pAffi1用XhoI和XmaI(10单位/μl；New England Biolabs)消化，产生新的插入序列或克隆盒并连接进载体。所述新插入序列含有DNA，编码ABDwt的螺旋1、虚拟序列、凝血酶位点、Zwt(基于葡萄球菌蛋白A的结构域B的工程化IgG结合结构域，参见Nilsson et al，Prot Eng 1：107-113，1987)、截短的GIII(残基249-406)、终止结构域TT和一些额外的限制酶位点。由这一插入序列编码的元件的示意图见图2A。图2B显示了当虚拟序列被编码剩余ABD变体多肽的序列置换时表达载体的插入序列(见下述)。在克隆实验和文库构建中用作引物的各种DNA寡核苷酸和模板的序列见下表1。
表1：寡核苷酸引物和模板
| Oligo | Sequence |
| AFFI-21 | 5’-tgcttccggctcgtatgttgtgtg-3’ |
| AFFI-22 | 5’-cggaaccagagccaccaccgg-3’ |
| AFFI-40 | 5’-tccccccgggttaagactccttattacgcag-3’ |
| AFFI-72 | 5’-biotin-cggaaccagagccaccaccgg-3’ |
| AFFI-772 | 5’-gaagccctcgagttagctgaagctaaag-3’ |
| AFFI-773 | 5’-gttagctgaagctaaagtcttagctaacagagagctctgaaagcttggcttatgc-3’ |
| AFFI-774 | 5’-cgcgcggaaagctagccaaacttcggatag-3’ |
| AFFI-775 | 5’-ctagctttccgcgcgtagacaacaaattcaac-3’ |
| AFFI-776 | 5’-ccggactatacgtatttcggcgcctgagc-3’ |
| AFFI-777 | 5’-gaaatacgtatagtccggtggtggctc-3’ |
| AFFI-791 | 5’-acagagagctcgacaaatatggag-3’ |
| AFFI-792 | 5’-cggaaagctagcaggtaatgcagc-3’ |
Oligo：寡核苷酸sequence：引物biotin：生物素
为了产生用于pAY1075的新的克隆盒，用图3A的引物，从pAffi1经PCR扩增虚拟片段和GIII，从质粒pEZZ18(et al，Gene58：87-97，1987)扩增Zwt。新产生的片段互相有重叠节段，如图3B所示。PCR片段用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)根据厂商推荐凝胶纯化，之后在组装PCR中用寡核苷酸AFFI-772(图3B)组装在一起。用外部引物AFFI-772和AFFI-40进行另外的PCR反应以扩增完整片段。PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)根据厂商推荐纯化。
质粒pAffi1用QIAgenTMmidi-prep试剂盒(Qiagen)根据厂商推荐纯化。之后，pAffi1和用于克隆盒的扩增的PCR片段用XhoI和XmaI(10单位/μl；New England Biolabs)在NEB4缓冲液(20mM Tris acetate,10mM醋酸镁,50mM醋酸钾,1mM二硫苏糖醇,pH 7.9；New EnglandBiolabs)中于37℃消化1小时，载体之后用牛肠碱性磷酸酶(CIAP；Fermentas)去磷酸化。消化液在1％琼脂糖凝胶上用QIAquick凝胶提取试剂盒根据厂商推荐纯化。新片段在室温用T4DNA连接酶(5单位/μl；Fermentas)连接进XhoI和XmaI裂解的pAffi11小时。部分连接混合物用1mm小池电穿孔进E.coli TG1细胞(Stratagene)。细胞铺板于补加200μg/ml氨苄青霉素的胰蛋白月示血琼脂基平板(TBAB平板；30g/l TBAB)上。具有正确插入序列的克隆经PCR鉴别，使用3种不同引物对AFFI-21/AFFI-42,AFFI-47/AFFI-40及AFFI-21/AFFI-40。PCR片段在1％琼脂糖凝胶上分析，阳性克隆用QIAprep Miniprep试剂盒(Qiagen)根据厂商推荐质粒纯化，置于用引物AFFI-38,40,71,72和772使用ABIBigDyeTMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒3.1(AppliedBiosystems)测序。测序PCR反应在Magnathx 8000仪器(MagneticBiosolutions)上纯化，核苷酸序列用ABI3100Genetic analyzer(Applied Biosystems)确定。SequencerTMv 4.0.5(Gene Codes Corporation)用于记录和分析序列数据。测序揭示了新的噬菌粒载体已成功产生。具有虚拟序列的载体(pAY1075)或具有编码变化的ABD螺旋2和3的序列的载体(pAY1075-ABD)的载体图谱分别示于图4和图5。
设计变体ABD序列文库
如下制备了一组具有针对ABD分子的螺旋2和3的随机序列的寡核苷酸。这些寡核苷酸随后用于置换pAY1075中的虚拟序列，以产生pAY1075-ABD(图2B和图5)。pAY1075-ABD载体随后用于在噬菌体表面上表达ABD变体文库。
设计是基于来自ABD的丙氨酸突变(Linhult et al,Protein Science11:206-213,2002)、ALB8-HSA复合物研究(Lejon et al,J Biol Chem279:42924-42928,2004)、与其它已知白蛋白结合结构域的序列同源性及寡核苷酸制备的容易性的信息。选择了SEQ ID NO:491代表的ABDwt序列中16个氨基酸位置用于一定程度随机化，并基于如下特征分成4组：(I)疏水核心，(II)保守位置，(III)静电相互作用和(IV)其它：
(I)位置Y20、L24、L27和I41参与产生中心疏水核心，与血清白蛋白相互作用。这些位置在与ABD同源的结构域中是高度保守的，这些位置中的随机化测试是否另一个疏水氨基酸残基可以改良疏水相互作用。
(II)位置18'、S18、T30、E32和G33在白蛋白结合结构域中非常保守。位置S18和T30参与2个分子间H键，随机化的基本原理是相似的极性氨基酸如苏氨酸(T)和天冬酰胺(N)也可行。E32和G33不与结合表面相互作用至任何高程度。但是它们可能对于蛋白质结构是重要的，感兴趣的是了解另一个氨基酸是否可行。ABDwt的序列不包含位置18’(即18’代表在ABDwt的位置17和18之间的添加的氨基酸残基)，但是同源结构域在该位置具有苏氨酸或丝氨酸。感兴趣的是了解用这一额外氨基酸是否可改良结合。
(III)位置N23、N27、K29和E40参与或可以参与静电相互作用。在这些位置的随机化基于有兴趣了解是否可以增强或抑制这些氨基酸残基与白蛋白的吸引或排斥相互作用的一些。
(IV)位置A36、K35和D39由于其它类似考虑被随机化。
为了在每个位置产生希望的氨基酸残基混合物，根据表2变化ABDwt序列。变异被分为“随机化的”或“掺杂的”。在“随机化的”位置中，所有选择的氨基酸均比其它更常见，即该位置朝向原始氨基酸偏倚(biased)。
表2:变体ABD序列的设计策略
Randomized position:随机化的位置position：位置desired variation：希望的变化condon combination：密码子组合codon:密码子amino acid：氨基酸
All except aromatic：除芳香族之外的所有all：所有doped position：掺杂的位置no codon：无密码子
1N＝任何核苷酸
2“掺杂”或偏倚朝向下划线的氨基酸残基
从Scandinavian 5 Gene Synthesis AB获得寡核苷酸混合物AFFI-793和AFFI-794，其相应于编码根据表2修饰的ABDwt的残基13-46的DNA并包括限制位点。AFFI-794包括由位置18’代表的额外氨基酸。
AFFI-793：
AFFI-794：
表3总结了在实现表2所述文库设计所需的寡核苷酸混合物中的所需的核苷酸分布百分比。
表3：AFFI-793和AFFI-794寡核苷酸混合物中的核苷酸分布
Nucleotide：核苷酸position：位置
文库构建
下述程序用于产生编码ABD变体的基因文库LibABDmat2005。在一个组装反应中，寡核苷酸AFFI-791和寡核苷酸混合物AFFI-793或AFFI-794退火并用Taq DNA聚合酶延伸。进行使用外部引物AFFI-791和AFFI-792的PCR反应以扩增片段。PCR产物用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)根据厂商推荐纯化。
用Qiagen plasmid midi试剂盒(Qiagen)根据厂商推荐从250ml过夜培养物(tryptic soy broth,2％葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素)制备噬菌粒pAY1075。该噬菌粒用SacI和NheI(10单位/μl；New England Biolabs)在NEB4缓冲液(20mM Tris acetate,10mM醋酸镁,20mM醋酸钾,1mM二硫苏糖醇,pH 7.9；New England Biolabs)中于37℃消化3小时。该溶液用酚/氯仿纯化和乙醇沉淀，载体然后从1％琼脂糖凝胶用QIAquick gelextraction试剂盒(Qiagen)根据厂商推荐纯化。
来自AFFI-791和AFFI-793或AFFI-794之间的组装反应的PCR扩增片段用SacI和NheI在NEB4缓冲液中于37℃消化3小时。DNA片段从1％琼脂糖凝胶用QIAquick gel extraction试剂盒(Qiagen)根据厂商推荐纯化。所得的编码两个亚文库ABD变体的基因片段在室温用T4 DNA连接酶(5单位/μl；Fermentas)连接进SacI和NheI裂解的pAY1075中。
连接反应然后酚/氯仿提取，乙醇沉淀并溶解于小体积的10mM Tris中。电感受态E.coli RR1ΔM15细胞(Rüther,1982,supra)用60等份的两个亚文库的每一个的连接材料转化，使用0.2cm间隔大小的小池，于ECM630set(BTX)中，使用参数2.5kV,125Ω和50μF。细胞在SOC培养基(47ml TSB+YE(30g/l tryptic soy broth,5g/l酵母膏)，补加1％葡萄糖、10mMMgCl2、10mM MgSO4、10mM NaCl和2.5mM KCl)中生长50分钟，转移到10个Erlenmayer瓶中，每个瓶含有1L补加2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的TSB+YE(30g/l tryptic soy broth,5g/l酵母膏)，并在37℃生长过夜。细胞然后在6000g离心，重悬于PBS/甘油溶液(PBS:2.68mMKCl,1.47mM KH2PO4,137mM NaCl,8.1mM Na2HPO4,pH7.4)至最终大约浓度为20％甘油。细胞然后等份化并储存在-80℃。电穿孔、扩增和转移至甘油原液后的细胞数在补加200μg/ml氨苄青霉素的TBAB平板上滴定。
每个亚文库的大小是5x 108，即文库LibABDmat2005的总大小是1x109。该文库被扩增大约50000次，甘油原液的密度大约为1x 1011细胞/ml。在此，文库的“大小”是指包括在文库中的成员总数，不考虑由文库编码的独特的变体的数目。
来自两个亚文库各96个集落被挑取进行DNA测序以核实具有征求读框的克隆的设计和频率。这些随机挑取的集落从甘油原液培养并源自每个文库的集合，其用寡核苷酸AFFI-21和AFFI-22进行PCR扩增。用ABIdGTP,BigDyeTMTerminator v3.0Ready Reaction CycleSequencing试剂盒(Applied Biosystems)根据厂商推荐用生物素化寡核苷酸AFFI-72进行扩增片段的测序。测序反应通过用Magnathx 8000(Magnetic Biosolutions)结合链霉抗生物素蛋白包被的磁珠而纯化，并在ABIGenetic Analyser(Applied Biosystems)上分析。
在用AFFI-793产生的亚文库中，3个克隆不能读出，11个是不正确的，7个克隆是来自其它亚文库的污染。这个亚文库中的氨基酸分布从测序数据推导出，与理论值比较，结果见图6。
关于使用AFFI-794产生的亚文库，3个克隆不能读出，16个是不正确的。这个亚文库中的氨基酸分布从测序数据推导出，与理论值比较，结果见图7。
每个氨基酸的频率与预期值符合良好，大约87％的克隆具有正确读框。
实施例2
白蛋白结合多肽变体的噬菌体展示选择和鉴定
概述
生物素化人血清白蛋白(HSA)在使用实施例1构建的文库的噬菌体展示选择中用作靶。选择用各种条件进行以最大化获得具有对白蛋白高亲和性的ABD变体的可能性。在进化选择的噬菌体后，相应于的表达的蛋白质在ELISA中被测试对白蛋白的亲和性。鉴别阳性克隆并测序，相应的多肽及其白蛋白结合基序的预测氨基酸序列被推导，其产生大量本发明的白蛋白结合多肽的序列。推导的白蛋白结合基序的氨基酸序列列于图1和序列表中的SEQ ID NO:1-257，相应的全长ABD变体的氨基酸序列列于图1和序列表中的SEQ ID NO:258-514。
人血清白蛋白的生物素化
冻干的人血清白蛋白(Sigma,cat.no.A3782-5G)溶解在PBS中(2.68mM KCl,1.47mM KH2PO4,137mM NaCl,8.1mM Na2HPO4,pH 7.4)至终浓度为10mg/ml。EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce,cat.no.21335)溶解在水中至终浓度为1mg/ml并且5和10倍摩尔过量被加入到在总体积0.5ml中的500mg白蛋白中。混合物在室温保温30分钟。未结合的生物素通过用透析盒(Slide-A-Lyser,10kDa；Pierce)对PBS透析除去。
噬菌体展示选择
总共进行5轮选择，使用增加的严格条件。在最初3轮主要建立合适选择方案后，从实施例1制备的甘油原液制备所得噬菌体原液。然后用表4所列选择缓冲液、靶浓度和固体支持物的组合进行2轮选择。
表4:HSA选择的选择条件
| 样品名称 | 选择缓冲液 | 靶浓度(pM) | 珠(μg) | |
| 第4轮 | A | 明胶 | 1000 | 100 |
| B | 明胶 | 200 | 100 | |
| C | BSA | 400 | 100 | |
| D | BSA | 100 | 100 | |
| 第5轮 | A | 明胶 | 500 | 50 |
| B | 明胶 | 50 | 50 | |
| C | BSA | 100 | 50 | |
| D | BSA | 10 | 50 |
选择程序中用的所有试管和珠在TPBSB(5％)(0.05％Tween 20,5％牛血清白蛋白(BSA),0.02％叠氮化钠于PBS中)或明胶(0.5％)中在室温温和搅拌下预封闭30分钟，随后不搅拌4℃过夜。
选择溶液(1ml)含有生物素化人血清白蛋白、噬菌体、叠氮化钠(0.02％)、Tween 20(0.05％)和BSA(3％)或明胶(0.1％)，如表4，并在PBS中制备。噬菌体与生物素化人血清白蛋白靶在第4轮的3天期间及在第5轮的1天期间在4℃保温，随后在搅拌下在室温保温1小时。选择样品转移至封闭的链霉抗生物素蛋白珠，在室温搅拌下保温15分钟。珠用1ml选择缓冲液(即TPBSB(3％)(0.05％Tween 20,3％牛血清白蛋白(BSA),0.02％叠氮化钠于PBS中)或GT(0.1％)(0.1％明胶,0.1％Tween 20和0.02％叠氮化钠于PBS中))洗10次，随后用PBS洗10次，其中第2次至最后一次洗涤用时2小时。噬菌体用1000ml 0.05M甘油-HCl,pH 2.2在室温进化10分钟，随后用补加100ml 1M Tris-HCl,pH 8.0的900ml PBS立即中和，或者用1000μl胰蛋白酶(2mg/ml)在室温进化30分钟，随后添加1000μl抑酶肽。每轮选择后，进化的噬菌体(3/4体积)用于感染50ml对数期E.coli RR1ΔM15细胞(Rüther,1982,supra)。温和搅拌保温30分钟和在37℃剧烈搅拌30分钟后，离心细胞，沉淀溶于小体积并涂布于TSB+YE平板(30g/l tryptic soy broth,5g/l酵母膏)，最后在37℃保温过夜。
选择循环导致满意数目的进化噬菌体。
噬菌体原液制备
来自平板的细胞重悬于TSB培养基中(30g/l tryptic soy broth)，细胞浓度通过测量600nm的光密度确定，假定OD600＝1相应于5x 108细胞/ml。细胞在100ml补加2％葡萄糖和100mg/ml氨苄青霉素的TSB+YE培养基中保温(细胞相比于进化噬菌体大约100倍过量)，并在37℃生长至大约OD600＝0.5-0.7。之后，10ml转移至新培养瓶并用25倍过量的M13K07辅助噬菌体(1x 1012cfu/ml；New England Biolabs,cat.no.NO315S)感染，并缓慢搅拌保温30分钟。细胞在2000g离心10分钟并重悬于100ml补加100mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)、50mg/ml卡那霉素和100mg/ml氨苄青霉素的TSB+YE培养基中，在100rpm、25℃生长过夜。一部分重悬细胞在-80℃储存作为甘油原液。
诱导的培养物在2500rpm离心10分钟，通过加入1/4体积的沉淀缓冲液(PEG/NaCl)沉淀上清中的噬菌体并在冰上保温1小时。沉淀的噬菌体在4℃10000g离心30分钟而沉淀，重悬于20ml PBS中，之后噬菌体溶液过滤经过0.45μm滤膜。重复沉淀程序，噬菌体最终重悬于1ml PBS中。
选择溶液在选择后与每一轮选择后的洗涤和进化溶液一起滴定。噬菌体溶液在微滴板中于无菌水中稀释，向每一噬菌体稀释液中加入100μl对数期E.coli RR1ΔM15细胞。在室温保温20分钟后，来自每个滴定的5μl滴加到TYE平板(15g琼脂、10g胰胨、5g酵母膏、3g NaCl，补加2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素)上并在37℃保温过夜。所得菌落计数并计算效价(cfu/ml)。
白蛋白结合的ELISA分析
来自每个选择的克隆加上ABDwt被表达和筛选HSA结合活性，使用使得能检测具有对血清白蛋白的从10nM至低pM的KD值的结合剂的ELISA设置。随机挑取的菌落在96孔深孔板中表达，这通过将每个菌落接种于1ml补加100mg/ml氨苄青霉素和1mM IPTG的TSB+YE培养基中并在37℃生长过夜而进行。细胞在3000g离心15分钟沉淀，重悬于400μl PBS-T(0.5％Tween 20于PBS中)并在-80℃冷冻。冷冻样品在水浴中解冻，在3700g沉淀细胞碎片40分钟。收集含有ABD变体-Zwt融合蛋白的上清并4℃储存直至用于如下ELISA中。
微滴定孔(Costar)用100μl HSA在4℃包被过夜，及用对照大鼠血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA)和小鼠血清白蛋白(MSA)各在1孔中包被，浓度为0.4μg/ml于ELISA包被缓冲液(0.1M碳酸钠,pH 9.5)中。孔用封闭缓冲液(2％牛奶于PBS中)在室温封闭2小时。向每孔中加入100μl的制备的ABD变体-Zwt融合蛋白，平板在室温保温1.5小时。向孔中加入浓度为0.5mg/ml于洗涤缓冲液中(0.5％Tween 20于PBS中)的生物素化IgG并保温1.5小时，从而任何白蛋白结合融合蛋白的Zwt部分可以结合IgG。结合的复合物用在洗涤缓冲液中1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白(Dako,cat.no.P0397)检测，并在室温保温1小时。通过将等体积的TMB底物A和B(ImmunoPure TMB,Pierce)混合制备显色溶液，并将100μl加入到每孔中。黑暗中保温30分钟后，加入100μl终止溶液(2M H2SO4)。平板在ELISA分光光度计(Basic Sunrise,Tecan)中在A450读数。在加入每种新试剂之前，用洗涤缓冲液洗4次。
总共372个克隆(表4样品A-D的每种选择各93个克隆)被随机挑取用于用上述ELISA设置分析其HSA结合活性。大多数分析的克隆相比于低皮摩尔结合(70pM；未公布结果)的ABDwt与大鼠血清白蛋白相互作用给出更高的对HSA的信号基于这个实验的结果，挑取克隆如下测序。
测序ELISA阳性克隆
来自选择的菌落的PCR片段用寡核苷酸AFFI-69(5'-gtgagcggataacaattcccctc-3')和AFFI-70(5'-cagcaaaaaacccctcaagaccc-3')扩增。用ABIdGTP,BigDyeTMTerminator v3.0Ready Reaction CycleSequencing试剂盒(Applied Biosystems)根据厂商推荐用生物素化寡核苷酸AFFI-202(5'-生物素-gtgagcggataacaattcccctc-3')进行扩增片段的测序。测序反应通过用Magnathx 8000仪器(Magnetic Biosolutions)结合链霉抗生物素蛋白包被的磁珠纯化，最后在ABI3100Genetic Analyser(Applied Biosystems)上分析。
对在ELISA筛选中显示最高A450值的克隆测序它们的ABD变体插入序列。257个不同的鉴别的ABD变体命名为ABD#####，其中#####是针对讨论的变体的5位独特标记。这些鉴别的ABD变体的序列列于图1作为SEQ ID NO：258-514。基因野生型或“亲代”ABD的白蛋白结合性质的现有知识，鉴别的ABD变体的白蛋白结合基序被降低至位于螺旋2和3中，相应于从氨基酸位置G16至I41的序列段。鉴别的ABD变体的白蛋白结合基序以ABM#####命名，其中#####是针对讨论的基序的5位独特标记。鉴别的白蛋白结合基序的序列列于图1作为SEQ ID NO：1-257。令人感兴趣地，鉴别的序列的一个亚集合包含在相应于ABDwt的位置38的自发突变，尽管这一位置在产生变体文库时未被随机化。
ABD变体亚克隆进pAY442
编码ABDwt的DNA(SEQ ID NO：515)和来自选择的12个克隆被选择用于亚克隆进表达载体pAY442(et al，supra)中。参照图1，选择的ABD变体克隆是ABD00002，ABD00003，ABD00009，ABD00015，ABD00025，ABD00027，ABD00046，ABD00049，ABD00053，ABD00054，ABD00055和ABD00245。含有编码这些ABD变体分子的插入序列的质粒使用Qiagen Mini试剂盒(Qiagen)根据厂商推荐从2ml E.coliRR1ΔM15细胞(Rüther，1982，supra)的过夜培养物(tryptic soy broth培养基(30g/l)，补加2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素)中纯化。
编码ABDwt和ABD变体分子的DNA通过AccI-NotI PCR粘末端克隆(10单位/μl每种酶；New England Biolabs)被亚克隆进表达载体pAY442，使用表5所列引物对AFFI-780，-898和AFFI-782，-899：
表5：寡核苷酸引物
| Oligo | Sequence |
| AFFI-780 | 5’-P-agacttagctgaagctaaagtcttagc-3’ |
| AFFI-782 | 5’-acttagctgaagctaaagtcttagc-3’ |
| AFFI-898 | 5’-gctttaaggtaatgcagctaaaat-3’ |
| AFFI-899 | 5’-P-ggccgctttaaggtaatgcagctaaaat-3’ |
Oligo：寡核苷酸sequence：序列
从文库载体pAY1075针对每个ABD变体分子产生2个重叠PCR产物，导致大约25％的具有AccI-NotI位点的正确片段。表达载体pAY442在二步中在37℃消化4小时，使用分别在NEB4缓冲液(20mM Tris acetate,10mM醋酸镁,50mM醋酸钾,1mM二硫苏糖醇,pH 7.9；New EnglandBiolabs)和NEB3缓冲液(50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100mM NaCl,1mM二硫苏糖醇,pH 7.9；New England Biolabs)中的AccI和NotI，并且用牛肠碱性磷酸酶(CIAP；Fermentas)在37℃去磷酸化1小时。裂解的质粒和片段用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)根据厂商推荐纯化。
PCR产物杂交并连接进AccI-NotI消化和去磷酸化的pAY442，反应实验T4DNA连接酶(5单位/μl；Fermentas)在室温进行1小时。部分连接液电穿孔进E.coli BL21(DE3)细胞(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3))，电穿孔用1mm小池和ECM 630装置(BTX)，使用参数1700V,200Ω和25μF。细胞在补加50μg/ml卡那霉素的胰蛋白月示血琼脂基平板(TBAB)铺板并在37℃保温过夜。阳性克隆首先在细菌PCR产物的琼脂糖凝胶上核实，最后用DNA序列分析核实。
含有亚克隆的ABD变体的pAY442克隆编码图8所述构建体，即基本上是His6标记的ABD变体。
His6标记的ABD变体的变体和纯化
ABDwt和12个ABD变体均亚克隆在上述pAY442中，在E.coliBL21(DE3)中表达为与N-末端His6标记的融合体，并用IMAC纯化。每个ABD变体的菌落用于接种5ml补加50μg/ml卡那霉素的TSB培养基。培养物在37℃生长过夜。第二天，将50μl每种培养物单独接种在1升培养瓶中的100ml补加50μg/ml卡那霉素的TSB+YE培养基。培养物在100rpm于37℃生长至OD600为0.7-1，之后加入IPTG至终浓度为0.5mM，细胞在100rpm于室温保温过夜。在8000g离心5分钟收集培养物，沉淀储存在冰箱中直至蛋白质制备。
在变性条件下用Ni-NTA Superflow柱和QIAsoft 4.1,protein/Ni-NTASuperflow 96denaturing large scale 2Vac4-24样品在Biorobot 3000(Qiagen)上IMAC纯化His6标记的蛋白质。通过用透析盒(Slide-A-Lyser,3.5kDa；Pierce cat.no.66330)对5升PBS透析2小时将缓冲液置换为PBS，随后进一步过夜透析。
蛋白质浓度用A280和BCA Protein Assay Reagent试剂盒(Pierce)如厂商推荐确定。蛋白质纯度在4-12％Novex凝胶上经SDS-PAGE分析并用考马斯蓝R染色，这一分析显示仅少量杂质存在。
生物传感器分析ABD变体对HSA和MSA的亲和性
在Biacore2000仪器(Biacore)上的生物传感器分析用经胺偶联到CM-5芯片(研究级；Biacore)表面上的羧基化葡聚糖层固定化的MSA、HSA和RSA根据厂商推荐进行。芯片上的表面1被活化和失活并用作注射期间的参考细胞(cell)，而表面2包含用350RU(共振单位)固定化的MSA，表面3包含用360RU固定化的HSA，表面4包含用340RU固定化的RSA。如上所述表达和纯化的ABD变体和ABDwt在HBS-EP(Biacore)中稀释至25nM并以恒定流速25μl/min注射10分钟，随后注射HBS-EP 30分钟。表面用两次注射20μl 15mM HCl随后0.05％SDS和一次注射20μl HCl而再生。
Biacore研究的进行不是为了确定变体对人和小鼠血清白蛋白的亲和性的精确参数，而是结果提供了这些分子对白蛋白的相对亲和性的定性测量。结合MSA和HSA的结果见表6。
表6：ABD变体结合来自小鼠和人的血清白蛋白的生物传感器分析
| MSA | HSA | |
| KD(M) | KD(M) | |
| ABDwt | 4.9×10-9 | 1.5×10-9 |
| ABD00025 | 2.2×10-9 | 2.7×10-11 |
| ABD00049 | 7.9×10-10 | 2.2×10-11 |
| ABD00245 | 6.5×10-10 | 6.0×10-11 |
| ABD00003 | 3.3×10-9 | 1.6×10-11 |
| ABD00009 | 1.9×10-9 | 5.4×10-11 |
| ABD00053 | 5.9×10-9 | 1.1×10-11 |
| ABD00054 | 1.3×10-9 | 2.0×10-11 |
| ABD00015 | 3.2×10-9 | 4.5×10-11 |
| ABD00027 | 1.5×10-9 | 4.1×10-11 |
| ABD00046 | 8.9×10-9 | 1.2×10-10 |
| ABD00055 | 1.1×10-9 | 5.4×10-11 |
如表所证明，所有测试的ABD变体均具有比野生型ABD分子高得多的对人血清白蛋白的亲和性，KD值至少低一个数量级，经常接近低二个数量级。另外，对小鼠血清白蛋白的相当的和/或更高的亲和性也由全部变体显示。
实施例3
选择的ABD变体的额外的生物传感器鉴定
概述
在本实施例中，选择的ABD变体ABD00003,ABD00053和ABD00239加上ABDwt全部如实施例2所述亚克隆进pAY442，并以更大规模表达及用His GravitrapTM试剂盒纯化。表达的分子用Biacore仪器鉴定对HSA的亲和性。
His6标记的ABD变体的蛋白质表达和纯化
用实施例2所述构建体将ABD00003,ABD00053,ABD00239和ABDwt在E.coli BL21(DE3)细胞中表达为与N-末端His6标记的融合体并经IMAC纯化。每个ABD变体的一个菌落用于接种10ml补加50μg/ml卡那霉素的TSB培养基。培养物在37℃生长过夜。第二天，500μl每种培养物分别接种在5升培养瓶中的500ml补加50μg/ml卡那霉素的TSB+YE培养基。培养物在37℃在100rpm生长至OD600为0.7-1，随后加入IPTG至终浓度为0.5mM并在室温保温过夜。在8000g离心5分钟收集培养物，沉淀储存于-20℃直至蛋白质制备。
His6标记的蛋白质在变性条件下用His-GravitrapTM试剂盒(GEHealthcare)经IMAC纯化。沉淀(涡旋)重悬于20ml变性缓冲液B-7M(100mM NaH2PO4,10mM Tris-CI,7M脲,pH 8)，加入8μl benzonase。溶液在室温以200rpm保温30分钟。加入另外20ml缓冲液B-7M，溶液转移至50ml Falcon试管并在冰上如下超声化：在3分钟期间3秒开/关，并具有40％振幅。细胞碎片通过在25000g离心40分钟除去。GravitrapTM柱用缓冲液B-7M平衡并加入样品。柱然后用10ml缓冲液B-7M,20ml结合缓冲液(20mM NaPO4,500mM NaCl,20mM咪唑)及最后用10ml洗涤缓冲液(20mN NaPO4，500mM NaCl，60mM咪唑)洗涤。ABD分子用3ml洗脱缓冲液(20mN NaPO4，500mM NaCl，500mM咪唑)洗脱。
用Slide-A-Lyser透析盒(3.5kDa；Pierce，cat.no.66330)进行的缓冲液交换为PBS pH 7.2是如下进行：对5升PBS pH7.2透析2小时，随后过夜透析，最终根据厂商推荐用PD10柱(GE Healthcare)交换缓冲液为PBSpH 5。蛋白质浓度用Abs280确定，蛋白质纯度在4-12％Novex凝胶上用SDS-PAGE分析并用考马斯蓝R染色。
蛋白质以可接受收率被成功表达和纯化。凝胶电泳分析显示不存在杂质(未示出)。
对人血清白蛋白的结合动力学的生物传感器分析
在Biacore2000仪器(Biacore)上的生物传感器分析用经胺偶联到CM-5芯片(研究级；Biacore)表面上的羧基化葡聚糖层固定化的HSA根据厂商推荐进行。HSA的固定化产生450共振单位的信号。芯片上的一个细胞(cell)表面被活化和失活并在注射期间用作参考细胞。纯化的His6-ABD样品在HBS-EP(Biacore)中稀释至4，10，40，100和400nM(针对ABDwt)，及0.2，0.8，2，5和20nM(针对选择的ABD变体)。样品以恒定流速25μl/min注射10分钟，随后注射HBS-EP 3小时。表面用两次注射20μl 5和10mM HCl再生。估计并在表7中给出，证实实施例2的结果，即获得了显示非常高的对HSA的亲和性的分子。
表7：纯化的ABD分子对HSA的动力学参数(ka、kd和KD)
| ka(Ms-1) | kd(s-1) | KD(M) | |
| ABDwt | 5.5×105 | 6.5×10-4 | 1.2×10-9 |
| ABD00003 | 8.0×106 | 3.0×10-5 | 3.8×10-12 |
| ABD00053 | 3.0×106 | 1.5×10-5 | 5.0×10-12 |
| ABD00239 | 3.0×107 | 1.5×10-5 | 5.0×10-13 |
实施例4
与第一个ABD变体融合的Z变体多肽的灵长类免疫原性和药动学
概述
先前在小鼠和大鼠中的研究表明与ABDwt融合的各种Z变体产生与仅Z变体相比更低的抗体应答。本研究目的在于1)在灵长类中证实这些结果并将其扩展到显示相比ABDwt高103倍的对白蛋白的结合亲和性的ABD的突变变体，和2)比较ABD融合的和裸的Z变体的血清半衰期。将具有对HER2受体的亲和性的Z变体给予灵长类，有或没有ABD变体作为融合配偶体。在45天期间重复免疫和放血过程。用ELISA测定分析对Z变体分子的特异抗体应答及Z变体分子的血清半衰期。
研究的分子
Z00342:Z蛋白的变体，依次衍生自葡萄球菌蛋白A的B结构域，具有对HER2受体的亲和性。这个变体经重组DNA技术产生。用阳离子交换和反向层析方法进行纯化，随后在Detoxi-GelTMAffinityPakTMPre-packed柱(Pierce,cat no 2034)根据厂商推荐除去内毒素。Z00342分子的详细描述见Orlova et al,Cancer Res 66:8,4339-48(2006)，在该文章中其被称为ZHer2:342。
Z00342-ABD00003:Z变体Z00342与实施例2中选择的变体ABD分子ABD00003的融合蛋白。这个融合蛋白用重组DNA技术产生。用在HSA-sepharose上的亲和性捕获和反向层析纯化并如上除去内毒素。
方法
给予及取样方案:在SMI(Smittskyddsinsitutet)，Solna,Sweden进行动物研究，当地道德动物委员会准许(N196/06)。在给予测试分子和取血样前灵长类给予镇静剂，肌肉内给予氯胺酮()。10个短尾猴灵长类(cynomolgus primates)Macaca fascicularis分成2组，根据表8方案静脉内注射测试分子。
表8:测试分子的给予
给予和放血时间点见表9。PK是指用于药动学研究的样品。血液储存在4℃过夜，血清随后在-20℃保持。
表9:给予测试分子和取血样的时间点
| 天 | 活动 |
| 0 | 在0、30、60分钟、4小时(PK)放血&注射1 |
| 1 | 放血(PK) |
| 2 | 放血(PK) |
| 3 | 放血(PK) |
| 7 | 放血(PK)&注射2 |
| 14 | 放血&注射3 |
| 21 | 放血&注射4 |
| 28 | 放血&注射5 |
| 35 | 放血&注射6 |
| 45 | 放血 |
一般ELISA方法:一般地，对于所有保温步骤使用每孔50μl体积，除了封闭时使用100μl体积。平板在4℃在包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.6)中包被过夜，并用自来水洗涤。封闭和稀释在具有0.5％酪蛋白的PBS中进行。室温的保温时间对于封闭和血清是1-2小时，对于第二抗体是1小时，对于底物溶液(TMB,Pierce,cat no34021)是10分钟。在所有步骤之间用自动化ELISA SkanWasher 300(Skatron)用每孔4x250μl PBS-T(具有0.05％Tween 20的PBS)洗涤。颜色反应通过加入50μl 2M H2SO4终止，平板在450nm用配有Magellan软件v3.11(Tecan)的Ultra384读板器(Tecan)读出。
抗Z00342IgG特异性ELISA:平板用在包被缓冲液中稀释的0.3μg/ml Z00342包被并在4℃保温过夜。洗涤后，平板如上所述封闭。来自灵长类的血清以起自1/100的2倍系列稀释液加入。来此超免疫的灵长类的纯化血清用作阳性对照并以起自8μg/ml的2倍稀释液加入。保温后，洗涤平板，加入HRP缀合的抗人IgG二抗(Southern Biotech cat.no.2040-05)(1/10000稀释)。最终保温后，洗涤平板并如上所述显色。
用于PK分析的血清-Z特异性ELISA:平板用2μg/ml亲和性纯化的山羊抗Z Ig(in-house生产，特异于所有Z变体共有的表位)并4℃保温过夜。洗涤后，如上所述封闭平板。来自用Z00342或Z00342-ABD00003注射的灵长类的血清以起自1/40(对于Z00342)或1/80(对于Z00342-ABD00003)的二倍系列稀释液加入。以起自20ng/ml的二倍系列稀释液加入每种分子的标准。保温后，洗涤平板，加入第二步抗体(对Z00342，2μg/ml兔抗Z IgG(in-house生产)；对于Z00342-ABD00003，1/5000o兔抗Z-ABD IgG(in-house生产))。保温后，洗涤平板，加入1:5000稀释的HRP缀合的抗兔Ig(Dako cat.no.0448)。最终保温后，洗涤平板并如上所述显色。
结果
在用Z00342注射的灵长类中的特异于Z的IgG:经ELISA分析来自每次放血的血清中特异于Z变体的IgG的存在(图9A-9C)。在第0天除了一个具有中等水平预形成抗体的灵长类(9039)之外均检测到低水平IgG。在第14天后，在三个动物(9039,10025,11019)中抗体效价稳定增加并在第28-35天达到最大，而两个动物显示在45天期间低抗体应答(9023和10105)。
在用Z00342-ABD00003注射的灵长类中的特异于Z的IgG:经ELISA分析来自每次放血的血清中特异于Z-ABD00003分子的IgG的存在(图10A-10C)。在两个灵长类(12047和12065)中未观测到抗体应答，而两个灵长类(12041和12061)显示高应答。第5个灵长类(12031)具有高血清前水平抗体，其在45天期间几乎不改变。
特异于Z变体的抗体浓度:血清中特异于Z变体的IgG的浓度用阳性对照作为标准用线性回归计算(图11)。在每组灵长类中有个体差异。在第45天，组1和组2中特异性IgG的中位浓度分别是2和0.1单位/ml，表示与ABD00003的融合降低了抗Z00342的抗体应答。
Z00342在血清中的药动学:在药动学分析中比较了Z00342和Z00342-ABD00003的循环时间。从标准曲线计算分子随时间推移的浓度，标准曲线分别从已知量的Z00342和Z00342-ABD00003的系列稀释液产生。结果显示融合于ABD00003的ABD融合的Z00342与仅Z00342相比在血液循环中保持更长(图12)。Z00342在4小时内从循环消失，而ABD00003融合的分子在7天后仍可检测。
概述
这个研究的结果表明ABD融合的Z变体分子与不含白蛋白结合融合配偶体的Z变体分子相比产生更低的免疫应答及显示延长的消失半衰期。
实施例5
与第二个ABD变体融合的Z变体多肽的灵长类免疫原性
研究的分子
在实施例4的这个延伸中，具有更高的对白蛋白的亲和性(KD＝10-13M)的第二个ABD变体与二聚体Z变体融合并用于灵长类免疫原性研究。
(Z01154)2:蛋白Z的二聚体变体，依次衍生自葡萄球菌蛋白A的B结构域。这个二聚体变体由重组DNA技术产生。用阳离子交换、反向层析和阴离子交换方法纯化，之后在Detoxi-GelTMAffinityPakTMPre-packed柱(Pierce cat no 2034)上除去内毒素。单体Z01154分子的详述见Gunneriusson E et al,Protein Eng 12:10,873-878(1999)，在那里其被称为ZTaq4:1。
(Z01154)2-ABD00239:(Z01154)2二聚体和实施例2选择的变体ABD分子ABD00239的融合蛋白。这个融合蛋白由重组DNA技术产生。用在HSA-sepharose上的亲和性捕获和反向层析纯化随后如上除去内毒素。
方法
给予及取样方案:在SMI(Smittskyddsinsitutet)，Solna,Sweden进行动物研究，当地道德动物委员会准许(N196/06)。在给予测试分子和取血样前灵长类给予镇静剂，肌肉内给予氯胺酮()。7个短尾猴灵长类Macaca fascicularis分成2组，分别为3个和4个，根据表10静脉内注射测试分子。
表10:测试分子的给予
给予和放血时间点见表11。
表11:给予测试分子和取血样的时间点
| 天 | 活动 |
| 0 | 放血1&注射1 |
| 7 | 放血2 |
| 14 | 放血3&注射2 |
| 21 | 放血4 |
| 28 | 放血5&注射3 |
| 35 | 放血6 |
| 45 | 放血7 |
特异性ELISA分析血浆样品:用在包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.6)中稀释至终浓度为2μg/ml的(Z01154)2或(Z01154)2-ABD00239包被平板。每孔使用50μl溶液，平板在4℃保温过夜。在室温用PBS+0.5％酪蛋白进行1-2小时。加入起自在封闭缓冲液中1/100稀释的2倍系列稀释血清。来自超免疫灵长类的纯化的血清用作阳性对照。保温在室温进行1-2小时，用自动化ELISA SkanWasher 300(Skatron)用每孔4x175μl PBS-T(具有0.05％Tween 20的PBS)洗涤。在室温进行与二抗在封闭缓冲液中1:5000稀释的HRP缀合的山羊抗人IgG(Fab)2(Jackson cat.no.109-035-097)的保温1-2小时。进行如上所述的自动化洗涤。检测用TMB(Pierce cat.no.34021)进行，其中反应在12分钟后通过加入2M H2SO4猝灭。平板在450nm用配有Magellan软件v3.11(Tecan)的Ultra384读板器(Tecan)读出。
结果
用(Z01154) 2 和(Z01154) 2 -ABD00239免疫:来自用裸或ABD00239-融合的(Z01154)2免疫的灵长类的血清分别在were titrated on(Z01154)2and(Z01154)2-ABD00239包被的板上滴定，滴定曲线示于图13A-13B和图14A-14B。来自超免疫猴的血清包括在滴定中作为阳性对照。1600x稀释的阳性对照的吸光度设为100％并用于标准化。图15示出个体应答的标准化值。结果显示所有3个动物均应答(Z01154)2，尽管一个灵长类(E89)的数量级较低。相反，4个动物中仅1个应答(Z01154)2-ABD00239。
实施例6
与白蛋白复合后阿霉素缀合物的增加的溶解度
概述
产生融合蛋白ABDwt-(Z00342)2-Cys(重组产生的融合蛋白，包含野生型ABD结构域和Z变体Z00342的二聚体，具有对HER2受体的亲和性)与结构式如下的非极性分子马来酰亚胺-间隔接头-阿霉素之间的缀合物：
游离接头及缀合物均具有在水性溶剂中的低溶解度。例如，需要30％的有机溶剂以保持缀合物在溶液中。但是向水溶液中添加人血清白蛋白大大改善溶解度。
缀合
马来酰亚胺-间隔接头-阿霉素(Syntarga B.V.,Netherlands)溶于N,N-二甲基甲酰胺(Sigma,cat.no.D-4551)至终浓度为4μmol/ml，并储存在-80℃备用。将4ml以1.9mg/ml于PBS中的融合蛋白ABDwt-(Z00342)2-Cys用20mM DTT(Acros Organics,cat.no.165680250)在40℃还原30分钟。过量DTT通过在PD-10柱上缓冲液交换至PBS(2.68mM KCl,1.47mMKH2PO4,137mM NaCl,8.1mM Na2HPO4,pH 7.4)。蛋白质样品通过加入3ml乙腈(AcN,Merck,cat.no.1.14291.2500)调整至30％(v/v)有机溶剂。198μl或2倍摩尔过量的马来酰亚胺-间隔接头-阿霉素加入到蛋白质溶液中。混合30分钟后，溶液在4℃保温过夜。反应混合物最终在用去离子水/AcN(70:30,v/v)平衡的HiPrep 26/10脱盐柱(GE,cat.no.17-5087-01)上纯化。通过测量在280nm的UV吸收确定蛋白质浓度为0.44mg/ml。
1.1mg蛋白质等份在Alpha 2-4LSC冻干仪(Martin Christ GmbH,Germany)中冻干。小瓶在冻干后充氮气，加盖并在4℃储存。
溶解度研究
三种溶液用于溶解度测试：
1.DMEM,Dulbecco改良的Eagle's培养基(Cambrex Bio Science,cat.no.BE12-917F),
2.如1中的DMEM，但是补加人血清白蛋白(HSA),6mg/ml(Sigma,cat.no.A1887-5G),及
3.如1中的DMEM，但是补加10％胎牛血清(FCS)。
溶液1和2过滤通过0.22μMillex-GV无菌滤膜(Millipore,cat.no.SLGV033RB)。
冻干的缀合重溶于分别含有0.5ml每种溶液的小瓶中。在37℃保温30分钟后，样品经肉眼观察评价。在具有溶液1和3的小瓶中可见大部分不溶材料，而在具有溶液2的小瓶中未观察到可见沉淀。
重配的缀合物的LC-MS分析
来自每小瓶(溶液1-3)的30μl在eppendorf离心机中以13000rpm离心10分钟。用在线质谱检测(Agilent 1100,LC-MS)经液相层析分析20μl所得上清。柱Zorbax 300SB-C18(4.6x150mm,3.5u)用65％溶剂A(0.1％TFA于去离子水中)和35％溶剂B(0.1％TFA于can中)以流速0.5ml/min平衡。记录在220,280,254和495nm的UV吸收。样品组分用50-60％溶剂B的浅(shallow)线性梯度在35分钟期间洗脱。比较样品间的相应于溶液中缀合物分子的量的峰面积。
结果示于表12。溶于补加HSA的DMEM(溶液2)的缀合物示出比溶于仅DMEM(溶液1)的样品大10倍的面积，及比溶于补加10％FCS的DMEM(溶液3)的样品大4倍的面积。
表12:重配的缀合物的LC-MS分析
| 溶剂 | 峰面积(mAU*s) | 与DMEM之比 |
| DMEM | 2347.4 | 1.00 |
| DMEM+HSA | 22659.6 | 9.65 |
| DMEM+FCS | 5872.0 | 2.50 |
Claims (74)
1.包含白蛋白结合基序的白蛋白结合多肽，所述基序由如下氨基酸序列组成：
GVSDX5YKX8X9I X11X12AX14TVEGVX20ALX23X24X25I
其中各自独立地，
X5选自Y和F；
X8选自N,R和S；
X9选自V,I,L,M,F和Y；
X11选自N,S,E和D；
X12选自R,K和N；
X14选自K和R；
X20选自D,N,Q,E,H,S,R和K；
X23选自K,I和T；
X24选自A,S,T,G,H,L和D；和
X25选自H,E和D；
条件是所述氨基酸序列不是
GVSDYYKNLI NNAKTVEGVK ALIDEI；
所述白蛋白结合多肽结合白蛋白，从而相互作用的KD值最大为1x10-9M。
2.权利要求1的白蛋白结合多肽其中X5是Y。
3.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其中X8选自N和R。
4.权利要求3的白蛋白结合多肽，其中X8是R。
5.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其中X9是L。
6.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其中X11选自N和S。
7.权利要求6的白蛋白结合多肽，其中X11是N。
8.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其中X12选自R和K。
9.权利要求8的白蛋白结合多肽，其中X12是R。
10.权利要求8的白蛋白结合多肽，其中X12是K。
11.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其中X14是K.
12.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其中X20选自D,N,Q,E,H,R和S。
13.权利要求12的白蛋白结合多肽，其中X20是E。
14.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其中X23选自K和I。
15.权利要求14的白蛋白结合多肽，其中X23是K。
16.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其中X24选自A,S,T,G,H和L。
17.权利要求16的白蛋白结合多肽，其中X24是L。
18.权利要求17的白蛋白结合多肽，其中X23X24是KL。
19.权利要求17的白蛋白结合多肽，其中X23X24是TL。
20.权利要求16的白蛋白结合多肽，其中X24选自A,S,T,G和H。
21.权利要求20的白蛋白结合多肽，其中X23是I。
22.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其中X25是H。
23.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合基序由选自SEQ ID NO:1-257的氨基酸序列组成。
24.权利要求23的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合基序由选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:53,SEQ IDNO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:155,SEQ ID NO:239,SEQ ID NO:240,SEQ ID NO:241,SEQ ID NO:242,SEQ ID NO:243,SEQ ID NO:244和SEQID NO:245的氨基酸序列组成。
25.权利要求24的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合基序由选自SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:239的氨基酸序列组成。
26.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。
27.权利要求26的白蛋白结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自由细菌受体蛋白的三螺旋结构域组成的组。
28.权利要求27的白蛋白结合多肽，其中所述细菌受体蛋白选自由来自链球菌(Streptococcus)、消化链球菌(Peptostreptococcus)和Finegoldia的物种的白蛋白结合受体蛋白组成的组。
29.权利要求28的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合受体蛋白选自由G；MAG；ZAG；PPL；和PAB组成的组。
30.权利要求29的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合受体蛋白是蛋白G。
31.权利要求30的白蛋白结合多肽，其中所述白蛋白结合受体蛋白是来自链球菌菌株G148的蛋白G。
32.权利要求31的白蛋白结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自由来自链球菌菌株G148的蛋白G的结构域GA1、结构域GA2和结构域GA3组成的组。
33.权利要求32的白蛋白结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域是来自链球菌菌株G148的蛋白G的结构域GA3。
34.权利要求27的白蛋白结合多肽，其中所述细菌受体蛋白是来自金黄色葡萄球菌的蛋白A。
35.权利要求34的白蛋白结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自蛋白A结构域A、B、C、D和E组成的组。
36.权利要求34的白蛋白结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域是源自来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域B的蛋白Z。
37.权利要求26的白蛋白结合多肽，其包含氨基酸序列：
LAEAKXaXbAXcXd ELXeKY-[ABM]-LAALP
其中
[ABM]是权利要求1-25任一项定义的白蛋白结合基序，
以及，各自独立地，
Xa选自V和E；
Xb选自L,E和D；
Xc选自N,L和I；
Xd选自R和K；及
Xe选自D和K。
38.权利要求37的白蛋白结合多肽，其中Xa是V。
39.权利要求37-38任一项的白蛋白结合多肽，其中Xb是L。
40.权利要求37-39任一项的白蛋白结合多肽，其中Xc是N。
41.权利要求37-40任一项的白蛋白结合多肽，其中Xd是R。
42.权利要求37-41任一项的白蛋白结合多肽，其中Xe是D。
43.白蛋白结合多肽，其氨基酸序列包含满足选自如下的一种定义的序列：
i)其选自SEQ ID NO:258-514；
i)其是与选自SEQ ID NO:258-514的序列有85％或更高相同性的氨基酸序列。
44.权利要求43的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列包含满足选自如下的一种定义的序列：
iii)其选自SEQ ID NO:259,SEQ ID NO:260,SEQ ID NO:266,SEQ IDNO:272,SEQ ID NO:282,SEQ ID NO:284,SEQ ID NO:303,SEQ IDNO:306,SEQ ID NO:310,SEQ ID NO:311,SEQ ID NO:312,SEQ ID NO:412,SEQ ID NO:496,SEQ ID NO:497,SEQ ID NO:498,SEQ ID NO:499,SEQ IDNO:500,SEQ ID NO:501和SEQ ID NO:502；
iv)其是与iii)的序列有85％或更高相同性的氨基酸序列。
45.权利要求44的白蛋白结合多肽，其氨基酸序列包含满足选自如下的一种定义的序列：
v)其选自SEQ ID NO:260,SEQ ID NO:310和SEQ ID NO:496；
vi)其是与v)的序列有85％或更高相同性的氨基酸序列。
46.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其结合白蛋白，从而相互作用的KD值最大为1x 10-10M。
47.权利要求46的白蛋白结合多肽，其结合白蛋白，从而相互作用的KD值最大为1x 10-11M。
48.权利要求47的白蛋白结合多肽，其结合白蛋白，从而相互作用的KD值最大为1x 10-12M。
49.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，其结合人血清白蛋白。
50.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽，进一步包含位于白蛋白结合基序一侧或两侧的一或多个额外氨基酸。
51.权利要求50的白蛋白结合多肽，其中所述额外氨基酸增强白蛋白被多肽的结合。
52.权利要求50的白蛋白结合多肽，其中所述额外氨基酸改良选自生产、纯化、体内或体外稳定化、多肽的偶联或检测及其任意组合的特征。
53.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽的片段，所述片段基本上保留白蛋白结合。
54.权利要求53的片段，相应于N-末端截短的权利要求1-52任一项的白蛋白结合多肽。
55.权利要求54的片段，其中N-末端截短是1-3个氨基酸截短。
56.前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽或其片段的多聚体，包含至少二个白蛋白结合多肽或其片段作为单体单位。
57.权利要求56的多聚体，其中单体单位的氨基酸序列相同。
58.权利要求56的多聚体，其中单体单位的氨基酸序列不同。
59.融合蛋白或缀合物，包含
i)第一部分，由前述任一项权利要求的白蛋白结合多肽、片段或多聚体组成；及
ii)第二部分，由具有希望的生物学活性的多肽组成。
60.权利要求59的融合蛋白或缀合物，其中所述希望的生物学活性是治疗活性。
61.权利要求59的融合蛋白或缀合物，其中所述希望的生物学活性是结合活性。
62.权利要求59的融合蛋白或缀合物，其中所述希望的生物学活性是酶活性。
63.权利要求59的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分选自由GLP-1；HGH；G-CSF；IL-1受体激动剂；TNF-α；和凝血因子VII、VIII、IX和X组成的组。
64.权利要求59的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分是能与靶分子选择性相互作用的结合部分，所述结合部分选自如下一组：抗体及其基本上保留抗体结合活性的片段和结构域；微体,maxybodies,高亲合性多聚体及其他小含二硫键蛋白质；及衍生自选自下组的骨架的结合蛋白：葡萄球菌蛋白A及其结构域；lipocalins,锚蛋白重复结构域，纤维素结合结构域，γ晶体，绿色荧光蛋白，人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4，蛋白酶抑制剂，PDZ结构域，肽适体，葡萄球菌核酸酶，tendamistats,纤连蛋白III型结构域，锌指，芋螺毒素和Kunitz结构域。
65.权利要求64的融合蛋白或缀合物，其中所述靶分子选自如下一组：Aβ肽；其他疾病相关淀粉样肽；毒素，如细菌毒素和蛇毒；凝血因子，如von Willebrand因子；白介素，如IL-13；肌抑素；促炎因子，如TNF-α,TNF-α受体和IL-8；补体因子，如C3a和C5a；过敏介质，如组胺和IgE；肿瘤相关抗原，如CD19,CD20,CD22,CD30,CD33,CD40,CD52,CD70,cMet,HER1,HER2,HER3,HER4,CA9,CEA,IL-2受体,MUC1,PSMA,TAG-72。
66.前述任一项权利要求的多肽，进一步包含标记。
67.权利要求66的多肽，其中所述标记选自由荧光染料和荧光金属、生色染料、化学发光化合物及生物发光蛋白、酶、放射性核素和颗粒组成的组。
68.编码权利要求1-65任一项的多肽的多核苷酸。
69.产生权利要求1-65任一项的多肽的方法，包括表达权利要求68的多核苷酸。
70.包含权利要求69的多核苷酸的表达载体。
71.包含权利要求70的表达载体的宿主细胞。
72.产生权利要求1-65任一项的多肽的方法，包括
在允许多肽从所述表达载体表达的条件下培养权利要求71的宿主细胞，及
分离所述多肽。
73.权利要求59-65任一项的融合蛋白或缀合物在制备药物中的应用，所述药物显示比具有希望的生物学活性的多肽本身的体内半衰期更长的体内半衰期。
74.权利要求59-65任一项的融合蛋白或缀合物在制备药物中的应用，所述药物与在将具有希望的生物学活性的多肽本身给予哺乳动物引起的免疫应答相比在给予哺乳动物时不引起免疫应答或引起降低的免疫应答。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US96261807P | 2007-07-31 | 2007-07-31 | |
| EP07113533 | 2007-07-31 | ||
| EP07113533.9 | 2007-07-31 | ||
| US60/962,618 | 2007-07-31 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200880101168.4A Division CN101765608B (zh) | 2007-07-31 | 2008-07-17 | 新白蛋白结合组合物、方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104710518A true CN104710518A (zh) | 2015-06-17 |
Family
ID=40057660
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200880101168.4A Active CN101765608B (zh) | 2007-07-31 | 2008-07-17 | 新白蛋白结合组合物、方法及应用 |
| CN201510071238.8A Pending CN104710518A (zh) | 2007-07-31 | 2008-07-17 | 新白蛋白结合组合物、方法及应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200880101168.4A Active CN101765608B (zh) | 2007-07-31 | 2008-07-17 | 新白蛋白结合组合物、方法及应用 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8937153B2 (zh) |
| EP (2) | EP2190863B1 (zh) |
| JP (1) | JP5718638B2 (zh) |
| CN (2) | CN101765608B (zh) |
| AU (1) | AU2008281913B2 (zh) |
| CA (1) | CA2694139C (zh) |
| DE (1) | DE08786222T1 (zh) |
| DK (1) | DK2190863T3 (zh) |
| ES (1) | ES2346178T3 (zh) |
| HK (1) | HK1211040A1 (zh) |
| WO (1) | WO2009016043A2 (zh) |
Families Citing this family (68)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2190863B1 (en) * | 2007-07-31 | 2015-09-02 | Affibody AB | New albumin binding compositions, methods and uses |
| US20120134984A1 (en) * | 2009-06-01 | 2012-05-31 | Olga Lubman | Molecules with extended half-lives and uses thereof |
| JP5951509B2 (ja) * | 2010-03-08 | 2016-07-13 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | 免疫グロブリンＧＦｃ領域結合ポリペプチド |
| CA2793715A1 (en) * | 2010-04-30 | 2011-11-03 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. | Peptide for improving in vivo stability of physiologically active substance or the like and physiologically active substance with improved in vivo stability |
| ES2540114T3 (es) * | 2010-07-09 | 2015-07-08 | Affibody Ab | Polipéptidos |
| CA2807127C (en) * | 2010-08-02 | 2019-02-12 | Leslie S. Johnson | Covalent diabodies and uses thereof |
| ES2873253T3 (es) * | 2010-09-28 | 2021-11-03 | Amryt Pharmaceuticals Inc | Leptinas altamente solubles |
| CA2812951A1 (en) | 2010-09-28 | 2012-04-19 | Amylin Pharmaceuticals, Llc | Engineered polypeptides having enhanced duration of action |
| RU2636552C2 (ru) | 2010-11-26 | 2017-11-23 | Молекьюлер Партнерс Аг | Улучшенные n-терминальные кэппинг модули для сконструированных белков с анкириновым повтором |
| UA111612C2 (uk) * | 2011-05-21 | 2016-05-25 | Макродженікс, Інк. | Домени, які зв'язуються з деімунізованою сироваткою, і їхнє застосування для збільшення часу напівжиття в сироватці |
| JP6006309B2 (ja) * | 2011-07-08 | 2016-10-12 | アミリン・ファーマシューティカルズ，リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＡｍｙｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｌｌｃ | 作用持続期間が増大し、免疫原性が減少した操作されたポリペプチド |
| WO2013009539A1 (en) | 2011-07-08 | 2013-01-17 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Engineered polypeptides having enhanced duration of action and reduced immunogenicity |
| LT2817329T (lt) | 2012-02-20 | 2019-04-10 | Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) | Polipeptidai, prisijungiantys prie žmogaus komplemento c5 |
| WO2013148966A1 (en) * | 2012-03-28 | 2013-10-03 | Amylin Pharmaceuticals, Llc | Transmucosal delivery of engineered polypeptides |
| JP2020033372A (ja) * | 2012-03-28 | 2020-03-05 | アフィボディ・アーベー | 経口投与 |
| KR20210075191A (ko) | 2012-03-28 | 2021-06-22 | 애피바디 에이비 | 경구투여 |
| EA036487B1 (ru) | 2012-05-25 | 2020-11-16 | Янссен Байотек, Инк. | Искусственный альбумин-связывающий домен и содержащий его слитый белок для доставки биоактивного агента |
| JP6590695B2 (ja) * | 2012-09-25 | 2019-10-16 | アフィボディ・アーベー | アルブミン結合ポリペプチド |
| CN104768976B (zh) | 2012-10-05 | 2020-09-22 | 阿菲博迪公司 | Her3结合多肽 |
| AU2013336646B2 (en) * | 2012-10-25 | 2016-07-14 | Affibody Ab | ABD binding polypeptide |
| JP6396303B2 (ja) * | 2012-10-25 | 2018-09-26 | アフィボディ・アーベー | アルブミン結合を含有するタンパク質の分離方法 |
| WO2014076179A1 (en) | 2012-11-14 | 2014-05-22 | Affibody Ab | New polypeptide |
| US9255262B2 (en) * | 2013-03-06 | 2016-02-09 | Vision Global Holdings Ltd. | Albumin-binding arginine deminase and the use thereof |
| USRE48805E1 (en) | 2013-03-06 | 2021-11-02 | Vision Global Holdings Ltd. | Method for cancer targeting treatment and detection of arginine using albumin-binding arginine deiminase fusion protein |
| WO2014140210A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-18 | Pieris Ag | Novel binding proteins for pcsk9 |
| AU2014229549B2 (en) * | 2013-03-14 | 2018-11-01 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Scaffolded peptidic libraries and methods of making and screening the same |
| MY171407A (en) | 2013-03-15 | 2019-10-11 | Affibody Ab | New polypeptides |
| MX2015014438A (es) | 2013-04-18 | 2016-05-18 | Armo Biosciences Inc | Metodos de uso de interleucina-10 para tratar enfermedades y trastornos. |
| EP3434277A1 (en) | 2013-06-17 | 2019-01-30 | Armo Biosciences, Inc. | Method for assessing protein identity and stability |
| MY176200A (en) | 2013-08-28 | 2020-07-24 | Affibody Ab | Binding polypeptides having a mutated scaffold |
| RU2733897C2 (ru) | 2013-08-28 | 2020-10-09 | Сведиш Орфан Биовитрум Аб (Пабл) | Стабильные полипептиды, связывающиеся с с5 комплемента человека |
| CA2920679A1 (en) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
| AU2014346537A1 (en) | 2013-11-11 | 2016-05-19 | Armo Biosciences, Inc. | Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders |
| WO2015091957A1 (en) | 2013-12-20 | 2015-06-25 | Affibody Ab | Engineered albumin binding polypeptide |
| CN106573072A (zh) | 2014-06-02 | 2017-04-19 | 阿尔莫生物科技股份有限公司 | 降低血清胆固醇的方法 |
| CN106573966B (zh) | 2014-07-30 | 2022-03-01 | Ngm生物制药有限公司 | 用于治疗代谢异常的组合物和方法 |
| MY180477A (en) | 2014-09-17 | 2020-11-30 | Affibody Ab | New polypeptides |
| CA2963989A1 (en) | 2014-10-14 | 2016-04-21 | Armo Biosciences, Inc. | Interleukin-15 compositions and uses thereof |
| MX2017004983A (es) | 2014-10-22 | 2017-11-13 | Armo Biosciences Inc | Metodos para usar interleucina 10 para tratar enfermedades y trastornos. |
| CA2961587A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-06 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
| CA2972683A1 (en) | 2015-01-12 | 2016-07-21 | Affibody Ab | Il-17a-binding polypeptides |
| US10618970B2 (en) | 2015-02-03 | 2020-04-14 | Armo Biosciences, Inc. | Method of treating cancer with IL-10 and antibodies that induce ADCC |
| US11052133B2 (en) | 2015-05-06 | 2021-07-06 | Protomer Technologies, Inc. | Glucose responsive insulins |
| CN107847583A (zh) | 2015-05-28 | 2018-03-27 | 阿尔莫生物科技股份有限公司 | 用于治疗癌症的聚乙二醇化白细胞介素‑10 |
| MX2018001511A (es) | 2015-08-04 | 2018-08-01 | Univ Duke | Polimeros furtivos desordenados de forma intrinseca codificados geneticamente para suministro y metodos para usar los mismos. |
| MX2018002298A (es) | 2015-08-25 | 2018-07-06 | Armo Biosciences Inc | Metodos de uso de interleucina 10 para el tratamiento de enfermedades y trastornos. |
| US11752213B2 (en) | 2015-12-21 | 2023-09-12 | Duke University | Surfaces having reduced non-specific binding and antigenicity |
| CN107022031A (zh) * | 2016-01-29 | 2017-08-08 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 融合蛋白HSA1-Vβ1及其应用 |
| US11467156B2 (en) | 2016-06-01 | 2022-10-11 | Duke University | Nonfouling biosensors |
| CN107952080A (zh) * | 2016-10-14 | 2018-04-24 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种肿瘤靶向多肽-药物偶联衍生物、其制备方法及应用 |
| WO2018132732A1 (en) | 2017-01-12 | 2018-07-19 | Duke University | Genetically encoded lipid-polypeptide hybrid biomaterials that exhibit temperature triggered hierarchical self-assembly |
| WO2018213320A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Duke University | Recombinant production of hybrid lipid-biopolymer materials that self-assemble and encapsulate agents |
| US11680083B2 (en) | 2017-06-30 | 2023-06-20 | Duke University | Order and disorder as a design principle for stimuli-responsive biopolymer networks |
| CN111164104A (zh) | 2017-08-09 | 2020-05-15 | 麻省理工学院 | 白蛋白结合肽缀合物及其方法 |
| WO2019071150A1 (en) * | 2017-10-06 | 2019-04-11 | University Of Utah Research Foundation | FUSION PROTEIN FOR TARGETED THERAPY OF AUTOIMMUNE DISEASE |
| US20200239575A1 (en) * | 2017-10-06 | 2020-07-30 | University Of Utah Research Foundation | A fusion protein for targeted therapy of autoimmune disease |
| WO2019175176A1 (en) | 2018-03-13 | 2019-09-19 | Affibody Ab | Polypeptides based on a novel scaffold |
| WO2020028806A1 (en) | 2018-08-02 | 2020-02-06 | Duke University | Dual agonist fusion proteins |
| US11512314B2 (en) | 2019-07-12 | 2022-11-29 | Duke University | Amphiphilic polynucleotides |
| WO2021043757A1 (en) | 2019-09-02 | 2021-03-11 | Biotest Ag | Factor viii protein with increased half-life |
| EP3785726A1 (en) | 2019-09-02 | 2021-03-03 | Biotest AG | Factor viii protein with increased half-life |
| WO2021089695A1 (en) | 2019-11-05 | 2021-05-14 | Affibody Ab | Polypeptides |
| WO2021165226A1 (en) | 2020-02-17 | 2021-08-26 | Biotest Ag | Subcutaneous administration of factor viii |
| WO2022098743A1 (en) | 2020-11-03 | 2022-05-12 | Indi Molecular, Inc. | Compositions, imaging, and therapeutic methods targeting folate receptor 1 (folr1) |
| WO2022098745A1 (en) | 2020-11-03 | 2022-05-12 | Indi Molecular, Inc. | Compositions, delivery systems, and methods useful in tumor therapy |
| AU2021405360A1 (en) | 2020-12-21 | 2023-06-22 | Affibody Ab | New polypeptide |
| US20240124533A1 (en) | 2021-02-15 | 2024-04-18 | Affibody Ab | New her2-binding polypeptide |
| WO2023152144A1 (en) | 2022-02-08 | 2023-08-17 | Affibody Ab | Protein z variants binding thymic stromal lymphopoietin and their medical use |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE509359C2 (sv) | 1989-08-01 | 1999-01-18 | Cemu Bioteknik Ab | Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel |
| FR2718452B1 (fr) * | 1994-04-06 | 1996-06-28 | Pf Medicament | Elément d'immunogène, agent immunogène, composition pharmaceutique et procédé de préparation. |
| FR2726471B1 (fr) * | 1994-11-07 | 1997-01-31 | Pf Medicament | Procede pour ameliorer l'immunogenicite d'un compose immunogene ou d'un haptene et application a la preparation de vaccins |
| DE19742706B4 (de) * | 1997-09-26 | 2013-07-25 | Pieris Proteolab Ag | Lipocalinmuteine |
| GB9823071D0 (en) * | 1998-10-21 | 1998-12-16 | Affibody Technology Ab | A method |
| GB9911287D0 (en) * | 1999-05-14 | 1999-07-14 | Affibody Technology Sweden Ab | Self-assembling protein structures |
| US20040001827A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-01-01 | Dennis Mark S. | Serum albumin binding peptides for tumor targeting |
| DE60030323T2 (de) | 1999-12-24 | 2007-10-11 | Genentech, Inc., South San Francisco | Verfahren und verbindungen zur verlängerung der halbwertzeiten bei der ausscheidung von biowirksamen verbindungen |
| CN1169827C (zh) | 2001-08-07 | 2004-10-06 | 沈阳三生制药股份有限公司 | 一种增强多肽在体内稳定性药物的生产方法及其应用 |
| WO2003029471A1 (en) * | 2001-09-27 | 2003-04-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of apolipoprotein d |
| WO2003029462A1 (en) * | 2001-09-27 | 2003-04-10 | Pieris Proteolab Ag | Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins |
| SE0400274D0 (sv) * | 2004-02-09 | 2004-02-09 | Affibody Ab | New polypeptide |
| US8642743B2 (en) * | 2004-04-06 | 2014-02-04 | Affibody Ab | Method for reducing the immune response to a biologically active protein |
| EP1814988A2 (en) * | 2004-11-26 | 2007-08-08 | Pieris AG | Compound with affinity for the cytotoxic t lymphocyte-associated antigen (ctla-4) |
| EP2190863B1 (en) * | 2007-07-31 | 2015-09-02 | Affibody AB | New albumin binding compositions, methods and uses |
| EP2496598B1 (en) * | 2009-11-04 | 2017-08-02 | Affibody AB | Her3 binding polypeptides |
-
2008
- 2008-07-17 EP EP08786222.3A patent/EP2190863B1/en active Active
- 2008-07-17 CN CN200880101168.4A patent/CN101765608B/zh active Active
- 2008-07-17 WO PCT/EP2008/059389 patent/WO2009016043A2/en active Application Filing
- 2008-07-17 US US12/452,731 patent/US8937153B2/en active Active
- 2008-07-17 EP EP12176805.5A patent/EP2546261A3/en not_active Withdrawn
- 2008-07-17 ES ES08786222.3T patent/ES2346178T3/es active Active
- 2008-07-17 CN CN201510071238.8A patent/CN104710518A/zh active Pending
- 2008-07-17 AU AU2008281913A patent/AU2008281913B2/en active Active
- 2008-07-17 CA CA2694139A patent/CA2694139C/en active Active
- 2008-07-17 DK DK08786222.3T patent/DK2190863T3/da active
- 2008-07-17 JP JP2010518606A patent/JP5718638B2/ja active Active
- 2008-07-17 DE DE08786222T patent/DE08786222T1/de active Pending
-
2014
- 2014-11-24 US US14/551,931 patent/US10118949B2/en active Active
-
2015
- 2015-12-02 HK HK15111838.6A patent/HK1211040A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8937153B2 (en) | 2015-01-20 |
| CN101765608A (zh) | 2010-06-30 |
| DE08786222T1 (de) | 2010-11-25 |
| US20100273979A1 (en) | 2010-10-28 |
| EP2190863B1 (en) | 2015-09-02 |
| EP2190863A2 (en) | 2010-06-02 |
| JP2010534486A (ja) | 2010-11-11 |
| CA2694139A1 (en) | 2009-02-05 |
| US20150158916A1 (en) | 2015-06-11 |
| CA2694139C (en) | 2018-06-05 |
| EP2546261A3 (en) | 2013-08-14 |
| HK1211040A1 (zh) | 2016-05-13 |
| DK2190863T3 (en) | 2015-11-30 |
| ES2346178T1 (es) | 2010-10-13 |
| CN101765608B (zh) | 2015-03-11 |
| ES2346178T3 (es) | 2015-11-02 |
| JP5718638B2 (ja) | 2015-05-13 |
| WO2009016043A3 (en) | 2009-06-04 |
| WO2009016043A2 (en) | 2009-02-05 |
| US10118949B2 (en) | 2018-11-06 |
| AU2008281913A1 (en) | 2009-02-05 |
| AU2008281913B2 (en) | 2013-11-07 |
| EP2546261A2 (en) | 2013-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101765608B (zh) | 新白蛋白结合组合物、方法及应用 | |
| Feldwisch et al. | Design of an optimized scaffold for affibody molecules | |
| EP2690173B1 (en) | Protein for affinity-separation matrix | |
| KR101782790B1 (ko) | 혈청 알부민에 결합하는 설계된 반복 단백질 | |
| JP4089920B2 (ja) | 細菌レセプター構造体 | |
| CN103443120B (zh) | 免疫球蛋白结合性新型多肽 | |
| KR102123457B1 (ko) | 알부민 결합 폴리펩타이드 | |
| AU2005216126B2 (en) | Binding peptidomimetics and uses of the same | |
| CN108026148A (zh) | 融合蛋白合成的方法和产品 | |
| US9994626B2 (en) | Stable polypeptides binding to human complement C5 | |
| CN108064286A (zh) | 突变型免疫球蛋白κ链可变区结合性肽 | |
| EP4130279A1 (en) | Fusion protein of z-domain and calsequestrin, having improved reactivity, stability, and antibody recovery, and method for isolation and purification of antibody using same | |
| JP2013509200A (ja) | 抗体模倣足場 | |
| WO2024074762A1 (en) | Ultrastable antibody fragments with a novel disuldide bridge | |
| WO2024084203A1 (en) | Single domain antibodies binding to albumin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1211040 Country of ref document: HK |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150617 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: WD Ref document number: 1211040 Country of ref document: HK |