CN107022031A - 融合蛋白HSA1-Vβ1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了融合蛋白HSA1‑Vβ1及其应用。本发明所提供的融合蛋白HSA1‑Vβ1，自N末端至C末端依次包括N端元件和C端元件；所述N端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第1至585位所示；所述C端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第601至711位所示。实验结果表明，对SEB中毒小鼠注射融合蛋白HSA1‑Vβ1后，小鼠血清中TNF‑α的含量和IFN‑γ的含量均比中毒休克组均显著降低；对SEB中毒小鼠延迟半小时注射融合蛋白HSA1‑Vβ1，小鼠血清中TNF‑α的含量和IFN‑γ的含量仍比中毒休克组均显著降低，可见融合蛋白HSA1‑Vβ1对SEB引起的中毒休克有救治作用。

Description

融合蛋白HSA1-Vβ1及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及融合蛋白HSA1-Vβ1及其应用，尤其涉及融合蛋白HSA1-Vβ1及其对金黄色葡萄球菌肠毒素B中毒休克的救治作用。
背景技术
金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxin，SE)是由金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)产生的一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的胞外蛋白质，因其主要作用于肠道，故称为肠毒素。金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcalenterotoxin B，SEB)是金黄色葡萄球菌所产生的多种外毒素中产量最高的一种，且其对热稳定，同时SEB还具有产毒菌株容易获得、制备工艺简单、性质稳定，适合装备弹头，并通过生物战剂气溶胶形式释放等特点，目前已经成为美国公布装备的八种“标准”生物战剂之一，也是生物武器核查单上的失能性战剂。SEB还是引起日常食物中毒的常见毒素。
T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)主要是由α链和β链组成，SEB激活T细胞需要SEB与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子形成复合体，然后与TCR的Vβ链结合，导致带有特异Vβ亚型T细胞大量增殖。
SEB最早于1954年从一名患“急性非特异性腹泻”儿童分离，是典型的超抗原(Superantigen，SAg)。所谓超抗原是一类不需要抗原提呈细胞(APC)处理而能够直接与MHCⅡ类分子结合，导致带有特异Vβ节段T细胞大量增殖的抗原分子。超抗原对T细胞的激活不受MHCⅡ类分子的限制，且激活能力是普通抗原的2000-50000倍，因此只需极低浓度(1～10pg/ml)即可激活多克隆T细胞产生很强的免疫应答。SEB能抗蛋白酶降解，在pH4～pH10均有活性，中毒剂量低，在0.0004μg/kg的剂量下即可使受试者失能达2周时间；对人的致吐剂量为0.4μg/kg，少量吸入就可导致呕吐和腹泻，13小时内体温升至41℃以上，引起人体的多器官、多系统的损伤，造成机体免疫功能失调，临床表现为发热、低血压，严重的甚至引起致死性休克，具有很高的致残率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何对金黄色葡萄球菌肠毒素B引起的中毒休克进行救治。
为解决上述问题，本发明首先提供了一种融合蛋白。
本发明所提供的融合蛋白，自N末端至C末端依次可包括N端元件和C端元件；
所述N端元件的氨基酸序列可如序列表中序列2自N末端起第1至585位所示；
所述C端元件的氨基酸序列可如序列表中序列2自N末端起第601至711位所示。
所述融合蛋白中还可包括LINKER区段，所述LINKER区段位于所述N端元件和所述C端元件之间。
所述LINKER区段的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第586至600位所示。
所述融合蛋白可为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有抑制细胞分泌炎症因子和/或与金黄色葡萄球菌肠毒素结合和/或治疗金黄色葡萄球菌肠毒素中毒和/或预防金黄色葡萄球菌肠毒素中毒作用的蛋白质。
其中，序列表中序列2可由711个氨基酸残基组成。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述a3)中的融合蛋白，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a3)中的融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a3)中的融合蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述融合蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述编码所述融合蛋白的核酸分子，自5’末端至3’末端依次可包括区段甲和区段乙；
所述区段甲的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第1至1755位所示；
所述区段乙的核苷酸序列可如序列表中序列1自5’末端起第1801至2133位所示。
所述编码所述融合蛋白的核酸分子可为如下e1)或e2)或e3)所示的DNA分子：
e1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述融合蛋白的DNA分子；
e3)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述融合蛋白的DNA分子。
含有所述编码所述融合蛋白的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
所述融合蛋白，或，所述编码所述融合蛋白的核酸分子在制备产品中的应用也属于本发明的保护范围；所述产品的功能可为抑制细胞分泌炎症因子和/或与金黄色葡萄球菌肠毒素结合和/或治疗金黄色葡萄球菌肠毒素中毒和/或预防金黄色葡萄球菌肠毒素中毒。
所述细胞可为人外周血单个核细胞。
所述炎症因子可为TNF-α和/或IFN-γ。
本发明还提供了一种产品。
本发明所提供的产品，其活性成分可为如下(D1)、(D2)或(D3)：
(D1)所述融合蛋白；
(D2)所述编码所述融合蛋白的核酸分子；
(D3)含有所述编码所述融合蛋白的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
所述产品的功能可为抑制细胞分泌炎症因子和/或与金黄色葡萄球菌肠毒素结合和/或治疗金黄色葡萄球菌肠毒素中毒和/或预防金黄色葡萄球菌肠毒素中毒。
所述N端元件作为功能片段的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述功能片段的用途可为与Vβ蛋白的N端融合从而使其具有抑制细胞分泌炎症因子和/或与金黄色葡萄球菌肠毒素结合和/或治疗金黄色葡萄球菌肠毒素中毒和/或预防金黄色葡萄球菌肠毒素中毒的功能。
编码所述N端元件的核酸分子或编码所述C端元件的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述编码所述N端元件的核酸分子为如下c1)或c2)或c3)所示的DNA分子：
c1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第1至1755位所示的DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述N端元件的DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述N端元件的DNA分子。
所述编码所述N端元件的核酸分子可为如下d1)或d2)或d3)所示的DNA分子：
d1)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第1801至2133位所示的DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述N端元件的DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述N端元件的DNA分子。
上述任一所述金黄色葡萄球菌肠毒素具体可为金黄色葡萄球菌肠毒素B。
本发明还提供了一种制备融合蛋白的方法。
本发明所提供的制备融合蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将所述编码所述融合蛋白的核酸分子插入酵母表达载体，得到重组表达载体；
(2)将步骤(1)所述重组表达载体导入酵母宿主菌，得到重组菌；
(3)培养步骤(2)所述重组菌，得到融合蛋白。
上述方法中，所述酵母表达载体可为载体pPIC9K。
上述方法中，所述重组表达载体可为重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1。所述重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1具体可为向载体pPIC9K的XhoI和EcoRI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子。
上述方法中，所述酵母宿主菌可为毕赤酵母宿主菌GS115。
上述方法中，所述步骤(3)中，所述培养可采用BMMY培养基。
上述方法中，所述步骤(3)可为：采用BMMY培养基培养所述重组菌，培养过程中采用甲醇进行诱导。所述甲醇在所述培养的体系中的浓度可为0.5％。
上述方法中，所述步骤(3)具体可为：采用BMMY培养基培养所述重组菌；所述培养的条件为30℃、250rpm振荡培养168h；所述培养的过程中，每24小时加入甲醇并使其在体系中的体积百分含量为0.5％(第一次加入甲醇的时间为培养24小时后)。
所述BMMY培养基的溶质及其浓度可为：1％(质量百分比)酵母提取物、2％(质量百分比)蛋白胨、1.34％(质量百分比)酵母氮碱、4×10-5％(质量百分比)生物素和0.5％(质量百分比)甲醇，BMMY培养基的溶剂可为pH6.0、100mM磷酸钾缓冲液。
实验证明，本发明所提供的融合蛋白HSA1-Vβ1可对金黄色葡萄球菌肠毒素B引起的中毒休克进行救治：对SEB中毒小鼠注射融合蛋白HSA1-Vβ1后，小鼠血清中TNF-α的含量和IFN-γ的含量均比中毒休克组均显著降低；对SEB中毒小鼠延迟半小时注射融合蛋白HSA1-Vβ1，小鼠血清中TNF-α的含量和IFN-γ的含量仍比中毒休克组均显著降低。可见融合蛋白HSA1-Vβ1对SEB引起的中毒休克有救治作用，具有重要的应用。
附图说明
图1为HSA1基因和Vβ1基因的PCR扩增产物。
其中M1为DNA Marker，泳道1为实施例1中的PCR扩增产物1，泳道2为实施例1中的PCR扩增产物2。
图2为HSA1和Vβ1融合后的PCR扩增产物。
其中M1为DNA Marker，泳道1为实施例1中的PCR扩增产物3。
图3为重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1的酶切鉴定结果。
图4为融合蛋白HSA1-Vβ1表达的SDS-PAGE。
图5为融合蛋白HSA1-Vβ1纯化的SDS-PAGE。
图6为蛋白Vβ表达的SDS-PAGE。
图7为蛋白Vβ纯化的SDS-PAGE。
图8为蛋白Vβ纯化的SDS-PAGE。
图9为Vβ1基因的PCR扩增产物。
其中M1为DNA Marker，泳道1为实施例1中的PCR扩增产物4。
图10为蛋白Vβ1表达的SDS-PAGE。
图11为蛋白Vβ1与SEB的结合活性。
图12为融合蛋白HSA1-Vβ1与金黄色葡萄球菌肠毒素B的亲和力分析。
图13为HSA与金黄色葡萄球菌肠毒素B的亲和力分析。
图14为融合蛋白HSA1-Vβ1体外抑制PBMC分泌细胞因子TNF-α。
图15为融合蛋白HSA1-Vβ1体外抑制PBMC分泌细胞因子IFN-γ。
图16为融合蛋白HSA1-Vβ1和金黄色葡萄球菌肠毒素B共孵育体内救治中毒休克小鼠。
图17为融合蛋白HSA1-Vβ1降低小鼠血清中TNF-α含量。
图18为融合蛋白HSA1-Vβ1降低小鼠血清中IFN-γ含量。
图19为融合蛋白HSA1-Vβ1推迟30min给药对小鼠的体内救治。
图20为延迟半小时注射融合蛋白HSA1-Vβ1降低小鼠血清中IFN-γ含量。
图21为延迟半小时注射融合蛋白HSA1-Vβ1降低小鼠血清中TNF-α含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
ForteBio BLItz单样本分子相互作用分析仪为Pal l Life Sciences公司产品；AKTA FPLC蛋白纯化仪为GE公司产品，用于表达蛋白的纯化；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪为BIORAD公司产品，用于纯化蛋白的纯度分析。
金黄色葡萄球菌肠毒素B标准产毒株FRI S-6记载在如下文献中：葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，雷祚荣，1992年9月第一版，中国科学技术出版社。
人细胞因子TNF-α测定ELISA试剂盒、人细胞因子IFN-γ测定ELISA试剂盒、鼠细胞因子IFN-γ测定ELISA试剂盒和鼠细胞因子TNF-α测定ELISA试剂盒均为欣博盛生物科技有限公司产品，产品目录号依次为Cat#EHC103a、Cat#EHC102g、Cat#EMC101g和Cat#EMC102a；脱盐柱为Thermo scientific公司产品，产品目录号为B2162579；人血清白蛋白(HSA)为华兰生物工程重庆有限公司产品，国药准字S20110310，批号为201206003；Biotin标记试剂盒为Thermo公司产品，产品目录号为21335；毕赤酵母宿主菌GS115为Invitrogen公司产品，货号为K1710-01；载体pPIC9K为Invitrogen公司产品，产品目录号为V175-20；载体pET43.1a为Novagen公司产品，货号为70939-3；载体pUC57为Biomics Biotech公司产品，货号为BK0033；Phenyl HP为GE公司产品，产品目录号为18-1172-87 AC；S30Q柱为GE公司产品，产品目录号为17-1275-01；DEAE层析柱为GE公司产品，产品目录号为71-5017-51 AG；Source30S为GE公司产品，产品目录号为17-1273-20。
BMGY培养基的溶质及其浓度为：1％(质量百分比)酵母提取物、2％(质量百分比)蛋白胨、1.34％(质量百分比)酵母氮碱、4×10-5％(质量百分比)生物素和1％(质量百分比)甘油，BMGY培养基的溶剂为pH6.0、100mM磷酸钾缓冲液。
BMMY培养基的溶质及其浓度为：1％(质量百分比)酵母提取物、2％(质量百分比)蛋白胨、1.34％(质量百分比)酵母氮碱、4×10-5％(质量百分比)生物素和0.5％(质量百分比)甲醇，BMMY培养基的溶剂为pH6.0、100mM磷酸钾缓冲液。
封闭液：向pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液中加入牛血清蛋白(BSA)，使牛血清蛋白含量为3％(质量百分比)。
洗涤液：含0.5‰吐温-20的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液。
在下述实施例中，根据文献中记载的制备方法制备金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B，SEB)；SEB的制备方法记载在如下文献中：Gu L，etal.Evaluation of a recombinant double mutant of staphylococcal enterotoxin B(SEB-H32Q/K173E)with enhanced antitumor activity effects and decreasedpyrexia.PLoS One.2013；8(2)：e55892.doi：10.1371/journal.pone.0055892.Epub 2013Feb 6.。SEB的核苷酸序列如序列表中序列5所示，编码序列表中序列6所示的氨基酸序列。
C57BL/6鼠为解放军军事医学科学院实验动物中心产品，在下文中命名为小鼠。Balb/c小鼠为解放军军事医学科学院实验动物中心产品。
实施例1、融合蛋白HSA1-Vβ1的表达和纯化
一、重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1的构建
1、序列表序列3为未经密码子优化的Vβ基因的核苷酸序列，其编码的蛋白质(以下简称蛋白Vβ)的氨基酸序列如序列表序列2的第601位至第711位所示。
经过大量预实验，对序列表中序列3所示的Vβ基因按照毕赤酵母密码子偏爱性进行优化，优化后的基因命名为Vβ1基因，其核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端第1801至2133位所示，编码的蛋白质(以下简称蛋白Vβ1)的氨基酸序列如序列表序列2的第601位至第711位所示。
2、人工合成序列表中序列1自5’末端第1801至2133位所示的双链DNA分子。
3、向载体pUC57的限制性内切酶EcoRV的识别位点插入步骤2合成的双链DNA分子，得到重组质粒pUC57-Vβ1。
4、以步骤3得到的重组质粒pUC57-Vβ1为模板，以人工合成的Vβ1-F:5’- GAAGCTGTTGTTACTC-3’(双下划线的序列为部分linker的核苷酸序列，单下划线的序列为序列表中序列1自5’末端第1801至1816位所示)和Vβ1-R:5’-GCTTACAAGACGGACAATCTGGTAC-3’(波浪线为限制性内切酶EcoRI的识别序列，单下划线为序列表中序列1自5’末端第2114至2133位的反向互补序列)为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物1。
反应程序：95℃3min预变性；95℃30sec，55℃30sec，72℃40sec，30个循环；72℃延伸10min。
5、反应结束后，对PCR扩增产物1进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。结果表明，步骤4扩增获得了长度约为378bp的PCR扩增产物1(命名为DNA片段1)。回收并纯化DNA片段1。
6、序列表序列4为未经密码子优化的HSA基因的核苷酸序列，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第585位所示。
经过大量预实验，对序列表中序列4所示的HSA基因按照毕赤酵母密码子偏爱性进行优化，优化后的基因命名为HSA1基因，其核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端第1至1755位所示，编码的蛋白质(以下简称蛋白HSA1)的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第585位所示。
7、人工合成序列表中序列1自5’末端第1至1755位所示的双链DNA分子。
8、向载体pUC57的限制性内切酶EcoRV的识别位点插入步骤7合成的双链DNA分子，得到重组质粒pUC57-HSA1。
9、以步骤8得到的重组质粒pUC57-HSA1为模板，以人工合成的HSA1-F:5’-CCGAAAAGAGATGCTCATAAGTCTG-3’(波浪线为限制性内切酶XhoI的识别序列，单下划线为序列表中序列1自5’末端第1至16位所示)和HSA-1R:5’- CAGTCCAAGAGCAGCT-3’(双下划线的序列为部分l inker的核苷酸序列，单下划线的序列为序列表中序列1自5’末端第1740至1755位的反向互补序列)为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2。
反应程序：95℃3min预变性；95℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。
10、反应结束后，对PCR扩增产物2进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。结果表明，步骤9扩增获得了长度约为1.8kb的PCR扩增产物2(命名为DNA片段2)。回收并纯化DNA片段2。
11、将1μg DNA片段1和1μg DNA片段2混合并作为模板，以步骤9中所述HSA1-F和步骤4中所述Vβ1-R为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物3。
反应程序：95℃3min预变性；95℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min。
12、反应结束后，对PCR扩增产物3进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。结果表明，步骤11扩增获得了长度约为2133bp的PCR扩增产物3(命名为DNA片段3)。回收并纯化DNA片段3。
13、用限制性内切酶XhoI和EcoR I双酶切步骤12获得的DNA片段3，回收酶切产物1。
14、用限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切载体pPIC9K，回收约9.3kb载体骨架1。
15、将酶切产物1和载体骨架1连接，得到重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1。用限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1，酶切产物中仅有两种DNA片段且其大小分别为2133bp和9300bp(图3)。
根据测序结果，对步骤15获得的重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1进行结构描述如下：向载体pPIC9K的XhoI和EcoRI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子。
重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1表达的蛋白为融合蛋白HSA1-Vβ1，融合蛋白HSA1-Vβ1的氨基酸序列如序列表序列2的所示。
蛋白HSA1的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第585位所示。
蛋白Vβ1的氨基酸序列如序列表序列2的第601位至第711位所示。
二、融合蛋白HSA1-Vβ1的表达和纯化
取步骤一构建的重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1，用限制性内切酶SalI酶切，进行线性化，获得线性化重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1。
将线性化重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115中，得到含有重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1的转基因酵母，命名为GS115/pPIC9K-HSA1-Vβ1。
将载体pPIC9K电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115中，得到含有载体pPIC9K的转基因酵母，命名为GS115/pPIC9K，作为阴性对照。
按照下述步骤进行融合蛋白HSA1-Vβ1的表达和纯化：
1、将GS115/pPIC9K-HSA1-Vβ1单菌落接种于5mL BMGY培养基，30℃、250rpm振荡培养36小时得到培养菌液；将2mL培养菌液收集于离心管，以3000g离心力离心5min，弃上清，收集菌体。
2、将步骤1收集的菌体用30mL BMMY培养基重悬，得到菌悬液，然后30℃、250rpm振荡培养168h(培养过程中，每24小时加入甲醇并使其在体系中的体积百分含量为0.5％，第一次加入甲醇的时间为培养24小时后)。培养过程中每24小时取样1mL，11000rpm离心1min，收集上清液。
3、将步骤2得到的各个上清液进行SDS-PAGE。结果见图4(图4中，M1为蛋白质分子量Marker；泳道1至8依次为GS115/pPIC9K-HSA1-Vβ1培养0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h后的上清液；泳道9为GS115/pPIC9K培养72h后的上清液)；结果表明，融合蛋白HSA1-Vβ1存在于培养GS115/pPIC9K-HSA1-Vβ1得到的上清液中，融合蛋白HSA1-Vβ1的分子量为78kDa。
4、完成步骤2后，取GS115/pPIC9K-HSA1-Vβ1培养168h后的上清液，8000离心20min，过滤，将上清液浓缩至原有体积的1/10～1/20，命名为浓缩上清液。
5、向步骤4获得的浓缩上清液中加入2倍体积的pH8.0、50mM Tris-HCl缓冲液和硫酸铵，得到上样液；硫酸铵在上样液中的浓度为1M。
6、将步骤5制备的上样液上样至Phenyl HP(上样速度为3mL/min)，然后按照下述步骤进行洗脱：
(1)用含1M硫酸铵的pH7.5～8.2、20mM Tris-HCl缓冲液洗脱1～2个柱体积以洗去非特异性结合的杂蛋白。
(2)完成步骤(1)后，用pH7.5～8.2、20mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集并合并紫外吸收峰高于基线50～100mAu的洗脱产物。
(3)将步骤(2)收集的洗脱产物用脱盐柱透析除盐，再置换入20mM Tris-HCl缓冲液中。
(4)将完成步骤(3)的产物上样至S30Q柱，用pH7.8～8.2、20mM Tris-HCl缓冲液洗脱1～2个柱体积以洗去非特异性结合的杂蛋白。
(5)完成步骤(4)后，用含1M NaCl的pH7.8～8.2、20mM Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集并合并紫外吸收峰高于基线50～100mAu的洗脱产物，得到的溶液即为融合蛋白HSA1-Vβ1溶液。
用GS115/pPIC9K代替GS115/pPIC9K-HSA1-Vβ1进行上述步骤，得到对照溶液。
将步骤(5)收集的不同的洗脱峰进行SDS-PAGE，测定融合蛋白HSA1-Vβ1的纯度。SDS-PAGE实验结果见图5(M为蛋白质分子量Marker，泳道1为紫外吸收峰高于基线50Au的洗脱产物，泳道2为紫外吸收峰高于基线80Au的洗脱产物)，结果表明，融合蛋白HSA1-Vβ1溶液中融合蛋白HSA1-Vβ1的纯度大于90％。
实施例2、蛋白Vβ的表达和纯化
一、重组质粒pET43.1a-Vβ的构建
(1)人工合成序列表中序列3所示的双链DNA分子。
(2)以步骤1合成的双链DNA分子为模板，以人工合成的Vβ-F:cgCATATGGAGGCTGTCGTCACCCAAAGCCCAA(下划线为限制性内切酶NdeI的识别序列)和Vβ-R:GGAATTCTTATAGGACCGATAGTCGGGTGCCCGCA(下划线为限制性内切酶EcoRI的识别序列)为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
反应程序：97℃预变性7min；95℃1min，60℃1min，72℃30sec，30个循环；72℃延伸7min。
(3)用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切步骤2获得的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(4)用限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切载体pET43.1a，回收约7.3kb载体骨架。
(5)将步骤(3)得到的酶切产物和步骤(4)得到的载体骨架连接，得到重组质粒pET43.1a-Vβ。
根据测序结果，对步骤(5)获得的重组质粒pET43.1a-Vβ进行结构描述如下：向载体pET43.1a的NdeI和EcoRI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列3所示的DNA分子。
二、蛋白Vβ的表达
取步骤一构建的重组质粒pET43.1a-Vβ转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pET43.1a-Vβ的重组大肠杆菌，命名为BL21/pET43.1a-Vβ。
1、将BL21/pET43.1a-Vβ单菌落接种于5mL LB培养基(将10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g NaCl氯化钠溶于1L蒸馏水)，37℃、180rpm振荡培养4小时得到培养菌液。
2、向步骤1得到的培养菌液中加入IPTG，使IPTG在体系中的浓度为1mM，然后37℃、180rpm振荡培养4小时，以3000g离心力离心15min，弃上清，收集菌体。
3、取步骤2收集的菌体，用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液重悬，然后超声破碎，得到菌体破碎液。将该菌体破碎液8000rpm离心10min，得到菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀。
将步骤3得到的菌体破碎上清液和菌体破碎沉淀分别进行SDS-PAGE。
实验结果见图6(泳道M为蛋白质分子量Marker，泳道1为菌体破碎上清液，泳道2为菌体破碎沉淀，箭头所指为蛋白Vβ)。结果表明，蛋白Vβ主要存在于包涵体，大小约为14kD。
三、蛋白Vβ的纯化
1、取步骤二中3得到的菌体破碎液，首先依次用含0.1％Triton X-100和2M脲的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液洗涤，然后用含8M脲的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液溶解包涵体，命名为溶解液。
2、用A1液(含8M脲的pH8.0、0.02mol/L Tris-HCl缓冲液)透析步骤1获得的溶解液，获得透析液1。
3、用5倍柱体积的A1液平衡DEAE层析柱，然后上样步骤2获得的透析液1(收集上样穿透液)，然后进行如下洗脱(洗脱过程中实时监测紫外吸收值，检测波长为280nm)：首先用10％B1液(含8M脲和1M NaCl的PH8.0、0.02mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱(紫外吸收值从50Au开始继续上升然后下降至80Au，出现第一个峰)，然后用20％B1液洗脱(紫外吸收值从50Au开始继续上升然后下降至80Au，出现第二个峰)，然后用B1液洗脱(紫外吸收值从50Au开始继续上升然后下降至80Au，出现第三个峰)，每种洗脱液收集峰值对应的20mL过柱后溶液。10％B1液由1体积份B1液和9体积份A1液组成。20％B1液由2体积份B1液和8体积份A1液组成。
进行SDS-PAGE，实验结果见图7(泳道M为蛋白质分子量Marker，S1为上样液，C1为穿透液，10％B1为用10％B1液进行洗脱的洗脱收集液，20％B1用20％B1液进行洗脱的洗脱收集液，100％B1用B1液进行洗脱的洗脱收集液)。结果表明，蛋白Vβ几乎全部穿透。
4、用A2液(含8M脲的pH 4.9、25mmol/L NaAc-HAc缓冲液)透析步骤3用B1液洗脱获得的洗脱收集液，获得透析液2。
5、用5倍柱体积的A2液平衡Source 30s层析柱，然后上样步骤4获得的透析液2(收集上样穿透液)，然后进行如下洗脱(洗脱过程中实时监测紫外吸收值，检测波长为280nm)：首先用2％B2液(含8M脲和1M NaCl的pH 4.9、25mmol/L NaAc-HAc缓冲液)洗脱(紫外吸收值从50Au开始继续上升然后下降至80Au，出现第一个峰)，然后用B2液洗脱(紫外吸收值从50Au开始继续上升然后下降至80Au，出现第二个峰)，实验过程中，2％B2液洗脱液收集峰值对应的20mL过柱后溶液(5mL/管，共4管)，B2液洗脱液收集峰值对应的20mL过柱后溶液(20mL/管，共2管)。2％B2液由2体积份B2液和98体积份A2液组成。
进行SDS-PAGE，实验结果见图8(泳道M为蛋白质分子量Marker，S2为上样液，C2-1为穿透液-1，C2-2为穿透液-2，2％B2-1、2％B-2、2％B-3和2％B-4为用2％B2液进行洗脱的洗脱收集液，100％B2为用B2液进行洗脱的洗脱收集液)。结果表明，用2％B2液进行洗脱的洗脱液中蛋白Vβ的纯度较高，用B2液进行洗脱的洗脱液中含有蛋白Vβ和杂蛋白。
步骤5收集的洗脱产物即为蛋白Vβ溶液，蛋白Vβ溶液中蛋白Vβ浓度为1mg/mL。
结果表明，蛋白Vβ可以实现很好的分离纯化，纯度>95％。
四、蛋白Vβ的复性条件摸索
(1)不同pH值蛋白复性缓冲液对复性的影响
取步骤1的蛋白Vβ溶液，用pH7.5、0.01mol/L PBS缓冲液、pH8.0、0.01mol/L PBS缓冲液、pH8.5、0.01mol/L PBS缓冲液、pH9.0、0.01mol/L PBS缓冲液或pH9.5、0.01mol/L PBS缓冲液处理48h。结果表明，用pH7.5、0.01mol/L PBS缓冲液或pH8.0、0.01mol/L PBS缓冲液处理后，蛋白Vβ均在去除变性剂的过程中发生聚集沉淀，用pH8.5、0.01mol/L PBS缓冲液、pH9.0、0.01mol/L PBS缓冲液或pH9.5、0.01mol/L PBS缓冲液处理后，蛋白Vβ均在全部去除变性剂后发生聚集沉淀。
(2)梯度降低变性剂浓度对复性的影响
取步骤1的蛋白Vβ溶液，然后采用透析复性的方法，梯度降低复性液中变性剂的浓度，即由含8M脲的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液依次降低为含4M脲的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液、含2M脲的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液、含1M脲的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液、含0.5M脲的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液和pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液。
结果表明，在含1M脲的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液降低为含0.5M脲的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液的透析复性过程中，蛋白Vβ发生聚集沉淀。
(3)不同蛋白Vβ浓度对复性的影响
取步骤1的蛋白Vβ溶液，用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液分别稀释至0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.06mg/mL和0.05mg/mL，获得溶液1、溶液2、溶液3和溶液4。
取溶液1、溶液2、溶液3或溶液4，按照步骤(2)的方法，进行透析复性。结果表明，蛋白Vβ均在全部去除变性剂后发生聚集沉淀。
(4)稀释复性对复性的影响
取步骤1的蛋白Vβ溶液，用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释至50倍体积或100倍体积，得到蛋白稀释液。取所述蛋白稀释液，用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液处理48h，然后浓缩20倍，按照步骤(2)的方法，进行透析复性。结果表明，蛋白Vβ在全部去除变性剂后发生聚集沉淀。
上述结果表明，经过大量复性实验，仍未获得Vβ蛋白。
实施例3、蛋白Vβ1的表达和纯化
一、重组质粒pPIC9K-Vβ1的构建
1、以实施例1步骤一3得到的重组质粒pUC57-Vβ1为模板，以人工合成的Vβ1-XhoI：5’-CTCGAGAAAAGAGAAGCTGTTGTTAC-3’(下划线为限制性内切酶XhoI的识别序列)和Vβ1-EcoRI：5’-GGAATTCCTTACAAGACGGACAATCTGGTAC-3’(下划线为限制性内切酶EcoRI的识别序列)为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物4。
反应程序：95℃3min预变性；95℃30sec，55℃30sec，72℃40sec，30个循环；72℃延伸10min。
2、反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图9。结果表明，步骤1扩增获得了长度约为355bp的PCR扩增产物(命名为DNA片段4)。回收并纯化DNA片段4。
3、用限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切步骤2获得的DNA片段4，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切载体pPIC9K，回收约9.3kb载体骨架。
5、将酶切产物和载体骨架连接，得到重组质粒pPIC9K-Vβ1。
根据测序结果，对步骤5获得的重组质粒pPIC9K-Vβ1进行结构描述如下：向载体pPIC9K的XhoI和EcoRI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1自5’末端第1801至2133位所示的DNA分子。
二、蛋白Vβ1的表达
取步骤一构建的重组质粒pPIC9K-Vβ1，用限制性内切酶SalI酶切，进行线性化，获得线性化重组质粒pPIC9K-HSA1-Vβ1。
将线性化重组质粒pPIC9K-Vβ1电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115中，得到含有重组质粒pPIC9K-Vβ1的转基因酵母，命名为GS115/pPIC9K-Vβ1。
将载体pPIC9K电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115中，得到含有载体pPIC9K的转基因酵母，命名为GS115/pPIC9K，作为阴性对照。
按照下述步骤进行蛋白Vβ1的表达：
1、将GS115/pPIC9K-Vβ1或GS115/pPIC9K单菌落接种于5mL BMGY培养基，30℃、250rpm振荡培养36小时得到培养菌液；将2mL培养菌液收集于离心管，以3000g离心力离心5min，弃上清，收集菌体。
2、将步骤1收集的菌体用30mL BMMY培养基重悬，得到菌悬液，然后30℃、250rpm振荡培养168h(培养过程中，每24小时加入0.5％(体积比)甲醇，第一次加入甲醇的时间为培养24小时后)。培养过程中每24小时取样1mL，11000rpm离心1min，收集上清液。
3、将步骤2得到的各个上清液进行SDS-PAGE。结果见图10(图10中，M1为蛋白质分子量Marker；泳道1至7依次为GS115/pPIC9K-HSA1-Vβ1培养24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h后的上清液；泳道8为GS115/pPIC9K培养72h后的上清液)；结果表明，蛋白Vβ1存在于培养GS115/pPIC9K-HSA1-Vβ1得到的上清液中，蛋白Vβ1的分子量为14kD。
三、蛋白Vβ1与SEB的结合活性
1、蛋白Vβ1与SEB的结合活性
(1)取酶标板，用步骤二中2的GS115/pPIC9K-Vβ1培养168h后的上清液作为包被原进行包被(用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释步骤二中2的GS115/pPIC9K-Vβ1培养168h后的上清液中的蛋白Vβ1，设置包被浓度为25μg/mL或50μg/mL，每孔加入100μL)。
(2)完成步骤(1)后，向酶标板每孔加入200μl封闭液，用封口膜封好微孔板，37℃封闭90min，然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；
(3)完成步骤(2)后，每孔加入100μl SEB溶液(用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释SEB，使其浓度分别为0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL或10ng/mL)，用封口膜封好，37℃孵育30min；然后弃上清，用洗涤液洗涤(洗涤5次，每次加入300μl洗涤液，每次洗涤3min)，拍干；
(4)完成步骤(3)后，测量在450nm处的吸光值。
2、按照上述方法，将GS115/pPIC9K-Vβ1培养168h后的上清液替换为GS115/pPIC9K培养168h后的上清液，其它步骤均不变，作为阴性对照。
3、取酶标板，用SEB单克隆抗体(制备方式具体为用SEB免疫Balb/c小鼠，然后取脾与同系骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤，筛选阳性的杂交瘤克隆腹腔接种Balb/c小鼠，收集腹水纯化即得到SEB单克隆抗体，以下简称SEB单抗，制备方法具体参考文献：葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病，雷祚荣，第109页，1992年9月第一版，中国科学技术出版社。)作为包被原进行包被(用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释SEB单抗，设置包被浓度为5μg/mL，每孔加入100μL)，然后按照步骤1中(2)至(4)的方法，其它步骤均不变，作为阳性对照。
实验结果见图11，结果表明，蛋白Vβ1没有SEB结合活性。
实施例4、融合蛋白HSA1-Vβ1与SEB的亲和力测定
1、Biotin-SEB蛋白溶液的制备
参考Biotin标记试剂盒的操作步骤，将SEB进行生物素标记，具体步骤如下：
1)取脱盐柱，放入15mL离心管中，1000g离心2min，弃液体。
2)向完成步骤1)的脱盐柱中加入pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液2.5mL，1000g离心2min，弃液体。
3)重复步骤2)两次。
4)取完成步骤3)的脱盐柱，置于新的15mL离心管中，然后加入浓度为1mg/mL SEB溶液(溶剂为pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液)1mL，1000g离心2min，收集液体。
5)取步骤4)收集的液体，加入生物素化试剂(Biotin标记试剂盒中的组件)70μl和ddH2O 180μl；4℃标记2.5h，获得标记的蛋白溶液。
6)另取脱盐柱，重复步骤1)、2)和3)。
7)将步骤5)获得的标记的蛋白溶液加入完成步骤6)的脱盐柱，1000g离心2min，收集液体，即为Biotin-SEB蛋白溶液。
2、融合蛋白HSA1-Vβ1与SEB的亲和力测定
(1)取步骤1制备的Biotin-SEB蛋白溶液，用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释至Biotin-SEB蛋白的浓度为50μg/mL，得到Biotin-SEB蛋白工作液。
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释实施例1制备的融合蛋白HSA1-Vβ1溶液，依次获得融合蛋白HSA1-Vβ1浓度为3197nM的溶液1、319.7nM的溶液2、31.97nM的溶液3和15.98nM的溶液4。
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释HSA，依次获得HSA浓度为3108nM的溶液5、310.8nM的溶液6、31.08nM的溶液7和15.54nM的溶液8。
(2)参照ForteBio BLItz单样本分子相互作用分析仪的操作步骤，先将Biotin-SEB蛋白工作液中的Biotin-SEB蛋白包被到SA sensor上，然后将已包被Biotin-SEB蛋白的SA sensor置于步骤(1)配制的溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5、溶液6、溶液7或溶液8；设置结合和解离时间均为120s。
(3)运用ForteBio BLItz单样本分子相互作用分析仪软件计算亲和力常数。
融合蛋白HSA1-Vβ1与SEB的亲和力测定实验结果见图12。HSA与SEB的亲和力测定实验结果见图13。结果表明，融合蛋白HSA1-Vβ1与SEB的亲和力常数为7.272×10-9M，HSA与SEB基本没有亲和力。
实施例5、融合蛋白HSA1-Vβ1抑制外周血单个核细胞(Peripheral bloodmononuclear cell，PBMC)分泌炎症因子
1、人PBMC的分离
(1)将1体积份人全血和1体积份不含小牛血清的1640培养基(Gibco公司产品，货号为C11875500BT)混匀，获得细胞溶液。
(2)取10mL离心管，加入淋巴细胞分离液(GE公司产品，货号为17-1440-02)到三分之一处，然后用吸管将步骤(1)获得的细胞溶液贴着管壁缓缓加入，到离心管的10mL刻度处，保持界面清晰；2000rpm离心25min。
(3)完成步骤(2)后，取所述离心管，吸取中间细胞层，即为外周血单个核细胞层细胞。
(4)取50mL灭菌离心管，先加入步骤(3)获得的外周血单个核细胞层细胞，再加入5倍体积的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液洗涤，1500rpm离心10min。
(5)取完成步骤(4)后的下层液相置于新的50mL灭菌离心管，加入5倍体积的pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液洗涤，1500rpm离心10min。
(6)取完成步骤(5)后的下层液相(即人PBMC)，加入1mL含10％FBS的1640培养基(Gibco公司,货号C11875500BT)重悬，获得人PBMC悬浮液。
2、融合蛋白HSA1-Vβ1抑制PBMC分泌炎症因子
(1)用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释实施例1制备的融合蛋白HSA1-Vβ1溶液，获得浓度不同的融合蛋白HSA1-Vβ1稀释液。用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液稀释HSA，获得HSA稀释液。
(2)取24孔细胞培养板，每孔加入1mL步骤1分离的人PBMC悬浮液(每孔约1×106个细胞)，然后加入SEB(每孔10μL，SEB在孔中的浓度为10ng/mL)。
(3)完成步骤(2)后，加入步骤(1)配制的融合蛋白HSA1-Vβ1稀释液(每孔10μL，使融合蛋白HSA1-Vβ1在孔中的浓度为16nM、32nM、63.9nM)，5％CO2、37℃孵育16h，收集上清，然后按照人细胞因子TNF-α测定ELISA试剂盒和人细胞因子IFN-γ测定ELISA试剂盒的操作步骤，检测上清中细胞因子的含量。测定方法和步骤按自带说明书进行。
(4)完成步骤(2)后，加入步骤(1)配制的HSA稀释液(每孔10μL，使HSA在孔中的浓度为63.9nM)，5％CO2、37℃孵育16h，收集上清，然后用人细胞因子TNF-α测定ELISA试剂盒和人细胞因子IFN-γ测定ELISA试剂盒分别检测上清中细胞因子的含量。测定方法和步骤按自带说明书进行。
在24孔细胞培养板中设置阳性对照孔，每个阳性对照孔加入1mL步骤1分离的人PBMC悬浮液(每孔约1×106个细胞)和SEB(每孔10μL，SEB在孔中的浓度为10ng/mL)。在24孔细胞培养板中设置阴性对照孔，每个阴性对照孔加入1mL pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液。将阳性对照孔和阴性对照孔在5％CO2、37℃孵育16h，收集上清，然后用人细胞因子TNF-α测定ELISA试剂盒和人细胞因子IFN-γ测定ELISA试剂盒分别检测上清中细胞因子的含量，测定方法和步骤按自带说明书进行。
实验结果见图14和图15(其中PBS为阴性对照，SEB为阳性对照)。结果表明，融合蛋白HSA1-Vβ1可以显著抑制炎症因子TNF-α和IFN-γ的表达，且具有量效关系，抑制率分别达到80％和49％。HSA则不能抑制炎症因子TNF-α和IFN-γ的表达。
实施例6、融合蛋白HSA1-Vβ1体内救治SEB中毒休克小鼠
一、不同剂量融合蛋白HSA1-Vβ1与SEB预孵育的中毒救治实验
1、预孵育混合液的配制
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液溶解SEB，获得浓度为0.3nmol/mL的SEB溶液1。
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液溶解融合蛋白HSA1-Vβ1，获得浓度为3.2nmol/mL的融合蛋白HSA1-Vβ1溶液1。
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液溶解融合蛋白HSA1-Vβ1，获得浓度为16nmol/mL的融合蛋白HSA1-Vβ1溶液2。
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液溶解HSA，获得浓度为3.2nmol/mL的HSA溶液1。
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液溶解HSA，获得浓度为16nmol/mL的HSA溶液2。
预孵育混合液1：将100μL的SEB溶液1和100μL的融合蛋白HSA1-Vβ1溶液1混合，4℃孵育12h，得到预孵育混合液1；预孵育混合液1中融合蛋白HSA1-Vβ1和SEB的摩尔比为10：1。
预孵育混合液2：将100μL的SEB溶液1和100μL的融合蛋白HSA1-Vβ1溶液2混合，4℃孵育12h，得到预孵育混合液2；预孵育混合液2中融合蛋白HSA1-Vβ1和SEB的摩尔比为50：1。
预孵育混合液3由100μL的SEB溶液1和100μL的HSA溶液1混合，4℃孵育12h，得到预孵育混合液3；预孵育混合液3中HSA和SEB的摩尔比为10：1。
预孵育混合液4由100μL的SEB溶液1和100μL的HSA溶液2混合，4℃孵育12h，得到预孵育混合液4；预孵育混合液4中HSA和SEB的摩尔比为50：1。
2、将80只8周龄体重为20～22g左右的小鼠随机分成八组(每组10只)，分别进行如下处理：
PBS：腹腔注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液处理，注射剂量为200μL/只；
SEB+LPS(中毒休克组)：先腹腔注射SEB溶液1，注射剂量为0.03nmol/只；4h后，腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只；
LPS：腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只；
SEB：腹腔注射SEB溶液1处理，注射剂量为0.03nmol/只；
SEB+HSA1-Vβ1组1(1.6μM HSA1-Vβ1救治组1)：腹腔注射预孵育混合液1，注射剂量为200μL/只；4h后，腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只；
SEB+HSA1-Vβ1组2(8μM HSA1-Vβ1救治组2)：腹腔注射预孵育混合液2，注射剂量为200μL/只；4h后，腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只；
SEB+LPS+HSA组1(1.6μM HSA对照组1)：腹腔注射预孵育混合液3，注射剂量为200μL/只；4h后，腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只；
SEB+LPS+HSA组2(8μM HSA对照组2)：腹腔注射预孵育混合液4，注射剂量为200μL/只；4h后，腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只。
3、步骤2各处理完成2h后，从小鼠尾静脉取血，然后用鼠细胞因子IFN-γ测定ELISA试剂盒和鼠细胞因子TNF-α测定ELISA试剂盒分别检测小鼠血清中细胞因子的含量，测定方法和步骤按自带说明书进行。步骤2各处理完成72h内，对小鼠的存活率进行统计(时间点为0h、12h、24h、36h、48h、60h或72h)。
小鼠的存活率的实验结果见图16。结果表明，1.6μM HSA1-Vβ1救治组1中60％的小鼠存活超过72小时，具有显著的统计学意义；1.6μM HSA救治组1中约20％～30％的小鼠存活超过72小时。
小鼠血清中细胞因子的含量的检测结果见图17和图18，结果表明，8μM HSA1-Vβ1救治组1中TNF-α的含量为中毒休克组的18.3％，1.6μM HSA1-Vβ1救治组2中TNF-α的含量为中毒休克组的33％，1.6μM HSA1-Vβ1救治组1中IFN-γ的含量为中毒休克组的10.8％，8μMHSA1-Vβ1救治组2中IFN-γ的含量为中毒休克组的16％，均显著降低。
二、延迟半小时注射融合蛋白HSA1-Vβ1的中毒救治效果评价
1、预孵育混合液的配制
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液溶解SEB，获得浓度为0.15nmol/mL的SEB溶液1。
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液溶解融合蛋白HSA1-Vβ1，获得浓度为1.6nmol/mL的融合蛋白HSA1-Vβ1溶液3。
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液溶解融合蛋白HSA1-Vβ1，获得浓度为8nmol/mL的融合蛋白HSA1-Vβ1溶液4。
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液溶解HSA，获得浓度为1.6nmol/mL的HSA溶液3。
用pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液溶解HSA，获得浓度为8nmol/mL的HSA溶液4。
2、将80只8周龄体重为18～22g左右的小鼠随机分成八组(每组10只)，分别进行如下处理：
PBS：腹腔注射pH7.2、0.01mol/L PBS缓冲液处理，注射剂量为200μL/只；
SEB+LPS(中毒休克组)：先腹腔注射SEB溶液1，注射剂量为0.03nmol/只；4h后，腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只；
LPS：腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只；
SEB：腹腔注射SEB溶液1处理，注射剂量为0.03nmol/只；
SEB+LPS+HSA1-Vβ1组3(1.6μM HSA1-Vβ1救治组3)：先腹腔注射SEB溶液1，注射剂量为200μL/只；半小时后，腹腔注射融合蛋白HSA1-Vβ1溶液3，注射剂量为200μL/只；3.5h后，腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只；
SEB+LPS+HSA1-Vβ1组4(8μM HSA1-Vβ1救治组4)：先腹腔注射SEB溶液1，注射剂量为200μL/只；半小时后，腹腔注射融合蛋白HSA1-Vβ1溶液4，注射剂量为200μL/只；3.5小时后，腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只；
SEB+LPS+HSA组3(1.6μM HSA对照组3)：先腹腔注射SEB溶液1，注射剂量为200μL/只；半小时后，腹腔注射HSA溶液3，注射剂量为200μL/只；3.5小时后，腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只；
SEB+LPS+HSA组4(8μM HSA对照组4)：先腹腔注射SEB溶液1，注射剂量为200μL/只；半小时后，腹腔注射HSA溶液4，注射剂量为200μL/只；3.5小时后，腹腔注射LPS处理，注射剂量为80μg/只。
3、步骤2各处理完成2h后，从小鼠尾静脉取血，然后用鼠细胞因子IFN-γ测定ELISA试剂盒和鼠细胞因子TNF-α测定ELISA试剂盒分别检测小鼠血清中细胞因子的含量，测定方法和步骤按自带说明书进行。步骤2各处理完成72h内，对小鼠的存活率进行统计(时间点为0h、12h、24h、36h、48h、60h或72h)。
延迟半小时注射融合蛋白HSA1-Vβ1，小鼠的存活率的实验结果见图19。结果表明，1.6μM HSA1-Vβ1救治组3中70％的小鼠存活超过72小时，具有显著的统计学意义；1.6μMHSA救治组3中仅20％的小鼠存活超过72小时。
延迟半小时注射融合蛋白HSA1-Vβ1，小鼠血清中细胞因子的含量的检测结果见图20和图21，结果表明，1.6μM HSA1-Vβ1救治组3中TNF-α的含量为中毒休克组的34.6％，1.6μM HSA1-Vβ1救治组3中IFN-γ的含量为中毒休克组的20.3％，均显著降低。

Claims (10)

1.融合蛋白，自N末端至C末端依次包括N端元件和C端元件；
所述N端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第1至585位所示；
所述C端元件的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第601至711位所示。
2.如权利要求1所述融合蛋白中还包括LINKER区段，所述LINKER区段位于所述N端元件和所述C端元件之间；所述LINKER区段的氨基酸序列如序列表中序列2自N末端起第586至600位所示。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有抑制细胞分泌炎症因子和/或与金黄色葡萄球菌肠毒素结合和/或治疗金黄色葡萄球菌肠毒素中毒和/或预防金黄色葡萄球菌肠毒素中毒作用的蛋白质。
4.编码权利要求1至3任一所述融合蛋白的核酸分子，自5’末端至3’末端依次包括区段甲和区段乙；
所述区段甲的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第1至1755位所示；
所述区段乙的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第1801至2133位所示。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下e1)或e2)或e3)所示的DNA分子：
e1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1至3任一所述融合蛋白的DNA分子；
e3)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1至3任一所述融合蛋白的DNA分子。
6.权利要求1至3任一所述融合蛋白，或，权利要求4或5所述核酸分子在制备产品中的应用；
所述产品的功能为抑制细胞分泌炎症因子和/或与金黄色葡萄球菌肠毒素结合和/或治疗金黄色葡萄球菌肠毒素中毒和/或预防金黄色葡萄球菌肠毒素中毒。
7.一种产品，其活性成分为如下(D1)、(D2)或(D3)：
(D1)权利要求1至3任一所述融合蛋白；
(D2)权利要求4或5所述核酸分子
(D3)含有权利要求4或5所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系；
所述产品的功能为抑制细胞分泌炎症因子和/或与金黄色葡萄球菌肠毒素结合和/或治疗金黄色葡萄球菌肠毒素中毒和/或预防金黄色葡萄球菌肠毒素中毒。
8.权利要求1中所述N端元件作为功能片段的应用；所述功能片段的用途为与Vβ蛋白的N端融合从而使其具有抑制细胞分泌炎症因子和/或与金黄色葡萄球菌肠毒素结合和/或治疗金黄色葡萄球菌肠毒素中毒和/或预防金黄色葡萄球菌肠毒素中毒的功能。
9.编码权利要求1所述N端元件的核酸分子或编码权利要求1所述C端元件的核酸分子。
10.一种制备融合蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)将权利要求4或5所述核酸分子插入酵母表达载体，得到重组表达载体；
(2)将步骤(1)所述重组表达载体导入酵母宿主菌，得到重组菌；
(3)培养步骤(2)所述重组菌，得到融合蛋白。
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