TW202406930A - 重組肉毒桿菌毒素及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種重組肉毒桿菌毒素及其製備方法。本發明通過對重組肉毒桿菌毒素重鏈和輕鏈序列的設計改良，實現了不因添加和切割蛋白標簽引入肉毒桿菌毒素本身序列不存在的氨基酸殘基，同時能夠進行肉毒桿菌毒素的高效穩定表達和活性肉毒桿菌毒素的製備，還能夠極大地簡化毒素蛋白的純化製程，實現活性肉毒桿菌毒素的高效製備。本發明提供的肉毒桿菌毒素製備方法能夠快速、高效地製備肉毒桿菌毒素，易於規模化放大生產，極大地降低了肉毒桿菌毒素的生產成本。

Description

重組肉毒桿菌毒素及其製備方法
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種重組肉毒桿菌毒素及其製備方法。
肉毒桿菌毒素是由一種肉毒梭狀芽胞桿菌分泌產生的神經毒素，根據抗原性，可以將其分成A-G共7個血清型。肉毒桿菌毒素具有强烈的神經毒性，可以在極小的劑量下引起神經麻痺，當人食入含有肉毒桿菌毒素的食物後，潜伏期6 h到12 天，一般3~4 天出現臨床症狀，患者最終因呼吸衰竭而死亡。肉毒桿菌毒素的毒性很强，相當於氰化鉀的一萬倍。
肉毒梭狀芽胞桿菌本身可以產生分子量大小在900 kD的毒蛋白複合體，由紅細胞凝集素蛋白(HA)、非毒素非血凝素蛋白 (NTNH)和神經毒蛋白三部分組成。其中，神經毒蛋白的分子量大小為150 kD，由肉毒梭狀芽胞桿菌在厭氧條件下產生，之後被肉毒梭狀芽胞桿菌自身產生的蛋白酶酶切，成為輕、重兩條肽段，輕鏈靠近N端，為催化結構域，重鏈靠近C端，為受體結合域。重鏈、輕鏈之間由二硫鍵相連後，成為有毒性的肉毒桿菌毒素。當人類誤食含有肉毒桿菌毒素的食品之後，由於保護蛋白的存在，消化道內的蛋白酶無法將其降解，使得有效成分通過腸壁進入血液；之後，通過血液循環，其結合至運動或交感神經細胞的受體部位，重鏈與受體相結合；肉毒桿菌毒素依靠神經細胞的內吞作用進入神經細胞，由於細胞質基質呈現還原性環境，重鏈、輕鏈之間的雙鍵被還原打開，輕鏈從複合體中釋放出來，酶切突觸後膜的snap-25蛋白，阻止SNARE複合蛋白的合成，抑制乙醯膽鹼的釋放，使肌肉出現嚴重麻痺的症狀，進而抑制呼吸，導致死亡。
因具有神經麻痺的作用，肉毒桿菌毒素起初被用於治療面部肌肉痙攣和其他肌肉運動紊亂症，利用肉毒桿菌毒素麻痺肌肉神經，以達到停止肌肉痙攣的目的。肉毒桿菌毒素也被應用於醫學美容，通過阻斷神經與肌肉間的神經衝動，使過度收縮的小肌肉放鬆，進而達到除皺的效果；或者是利用其可以暫時麻痺肌肉的特性，使肌肉因失去功能而萎縮，以達到雕塑機體線條的目的。此外，肉毒桿菌毒素還有抑制肢體痙攣和抗抑鬱的效果。
習知的肉毒桿菌毒素的提取方法主要是通過肉毒梭狀芽胞桿菌厭氧發酵表達蛋白，之後經過多級純化，簡單來說，是通過透析和一系列酸沉澱從培養液中純化肉毒桿菌毒素，該方法從發酵到最終得到肉毒桿菌毒素蛋白需要5天左右的時間。通過該方法得到的有效成分是900 kD肉毒桿菌毒素複合體，進一步經過離子交換方法將肉毒桿菌毒素的一部分凝集素蛋白去除，得到450 kD左右的毒素複合體；再通過改變pH的方法去除其他蛋白，得到150 kD的肉毒桿菌毒素。
肉毒梭狀芽胞桿菌原位提取肉毒桿菌毒素是相對傳統的方法，其理論較為成熟。但是由於肉毒梭狀芽胞桿菌的發酵需要非常嚴格的厭氧環境，並且對溫度非常敏感。因此，需要專門的發酵設備才能進行規模化生產。另外，由於表達的肉毒桿菌毒素沒有攜帶親和層析標簽，在提取中需要多步純化步驟才能得到相對純淨的蛋白。而且，由於肉毒桿菌毒素的强毒性，製備流程越長，期間造成意外污染的概率越大。
除肉毒梭狀芽胞桿菌原位提取肉毒桿菌毒素方法外，還可利用其他底盤細胞異源表達重組肉毒桿菌毒素。目前重組肉毒桿菌毒素的表達基本上都是以大腸桿菌作為底盤細胞。大腸桿菌製備肉毒桿菌毒素的方法主要為：利用質粒轉染技術，將用於表達肉毒毒素的質粒轉入大腸桿菌中，利用誘導劑(如IPTG)誘導表達150 kD的肉毒桿菌神經毒蛋白。
習知的肉毒桿菌毒素的重組表達分為單鏈和雙鏈表達兩種方式。雙鏈表達是依照習知的蛋白結構(protein data bank id：3V0C)設計的。在該結構中，重鏈和輕鏈之間有明顯的相互作用位點。通過共表達，可以得到肉毒桿菌毒素輕重鏈複合體，由於輕鏈的羧基末端和重鏈的氨基末端存在半胱氨酸殘基，輕鏈、重鏈之間可以形成二硫鍵，從而形成有活性的蛋白複合體。另外也有重組表達單鏈的肉毒桿菌毒素的方法，但由於大腸桿菌缺乏必要的蛋白酶，無法將全長的單鏈蛋白進行消化，因此需要在輕鏈、重鏈之間外源引入蛋白酶酶切位點，通過體外酶切的方式將蛋白活化。經過活化後的蛋白與商業化的肉毒桿菌毒素產品具有相似的活性。
儘管大腸桿菌重組表達肉毒桿菌毒素具有速度快等優勢，但是，為了避免引入肉毒桿菌毒素本身序列不存在的氨基酸殘基，習知技術中表達的是沒有親和標簽的蛋白，提純方法仍以硫酸銨沉澱為主，製程繁雜，而肉毒桿菌毒素毒性大，仍存在造成意外污染的可能性。而單鏈融合表達，必需在重鏈和輕鏈之間引入蛋白酶酶切位點，也會引入額外的氨基酸殘基。而引入額外的序列可能會引入未知的抗原性，注射體內後可能引發未知的免疫反應，會對機體造成潜在的不利影響，因此儘管重組肉毒桿菌毒素活性與天然毒素相比活性相當，但是目前仍然沒有相關產品獲得使用批准。
本發明的目的在於提供一種重組肉毒桿菌毒素及其製備方法。
本發明旨在製備具有天然序列和生物活性的肉毒桿菌毒素蛋白，並實現蛋白在生物底盤中高效穩定的表達。為此，本發明首先對重組肉毒桿菌毒素的重鏈和輕鏈的序列進行了特異的設計和改良。為簡化後續提純製程並儘量避免引入肉毒桿菌毒素本身序列不存在的氨基酸殘基，本發明採用雙鏈表達方式，並引入蛋白標簽。本發明經大量研究發現，在雙鏈表達重組肉毒桿菌毒素過程中，輕鏈表達量遠遠高於重鏈表達量，因此確定將蛋白標簽添加在重鏈上，以減少多餘的輕鏈對純化造成的干擾。在引入蛋白標簽和去除標簽過程中，通常會導致肉毒桿菌毒素本身序列不存在的氨基酸殘基的引入。本發明通過序列設計避免了額外氨基酸殘基的引入。
具體地，本發明提供以下技術方案：
第一方面，本發明提供一種重組肉毒桿菌毒素，所述重組肉毒桿菌毒素包括由二硫鍵連接的重鏈和輕鏈；所述重鏈的氨基酸序列從N端到C端的方向依次包含蛋白標簽序列、ENLYFQ多肽序列和肉毒桿菌毒素的重鏈序列，其中，肉毒桿菌毒素的重鏈序列的N端第1位氨基酸為甘氨酸。
上述重組肉毒桿菌毒素的重鏈序列中引入的蛋白標簽可以為任意便於蛋白純化的蛋白標簽，包括但不限於His-tag、Gst、MBP、Strep、Flag等標簽。
在本發明的一些實施方式中，所述蛋白標簽以His-tag作為示例性說明，實際應用時並不侷限於此。
上述肉毒桿菌毒素的重鏈序列可為肉毒桿菌毒素的完整重鏈序列或截取其中的一部分序列，但需要保證序列N端的第1位氨基酸為甘氨酸，且與輕鏈通過二硫鍵連接後具有肉毒桿菌毒素的活性。 本發明提供的上述重組肉毒桿菌毒素的重鏈組成結構適用於肉毒桿菌毒素的各血清型(例如：A型、E型等)。
具體而言，對於肉毒桿菌毒素A，從肉毒桿菌毒素A全長單鏈的第445位甘氨酸開始截取至C末端作為重鏈，在第445位甘氨酸的N端引入TEV蛋白酶的酶切序列(ENLYFQ↓G，箭頭標注為酶切位置)的N端6個氨基酸殘基，並在TEV蛋白酶的酶切序列的N端6個氨基酸殘基的N端引入蛋白標簽序列。上述序列設計使得重鏈經TEV酶酶切後，不會殘留任何其本身序列不存在的氨基酸殘基(即不會殘留人工引入的蛋白標簽序列和酶切位點序列，肉毒桿菌毒素重鏈仍保持其原有序列)，而且，酶切後的重鏈在與輕鏈通過二硫鍵鏈接後，具有天然肉毒桿菌毒素的生物活性。
在本發明的一些實施方式中，上述肉毒桿菌毒素的重鏈序列為肉毒桿菌毒素A的第445位至第1296位氨基酸序列。
以上所述的肉毒桿菌毒素A的第445位至第1296位氨基酸序列中，第445位氨基酸為甘氨酸。肉毒桿菌毒素A的第445位至第1296位氨基酸序列可為天然肉毒桿菌毒素A的序列(例如SEQ ID NO.1所示的序列的第445位至第1296位)，也可為突變的肉毒桿菌毒素A序列，突變的肉毒桿菌毒素序列仍需要保證第445位氨基酸為甘氨酸，且能夠與輕鏈連接形成有生物活性的肉毒桿菌毒素。
在本發明的一些實施方式中，以上所述的肉毒桿菌毒素A的第445位至第1296位氨基酸序列是以SEQ ID NO.1所示的肉毒桿菌毒素A序列為依據的(SEQ ID NO.1所示的肉毒桿菌毒素的編碼基因序列如SEQ ID NO.5所示，SEQ ID NO.5所示序列為經序列改良的，適於在大腸桿菌中表達的序列)。肉毒桿菌毒素A的第445位至第1296位氨基酸序列也可採用上述氨基酸序列的變體，只需保證第445位氨基酸為甘氨酸且能夠與輕鏈連接形成有生物活性的肉毒桿菌毒素即可。
上述重組肉毒桿菌毒素經TEV蛋白酶酶切後可產生完全去除蛋白標簽序列的肉毒桿菌毒素，且不會殘留肉毒桿菌毒素本身序列不存在的氨基酸殘基。
較佳地，所述重組肉毒桿菌毒素的重鏈的氨基酸序列在蛋白標簽序列的N端還包括從N端至C端方向的甲硫氨酸和由1~3個除半胱氨酸以外的氨基酸殘基組成的氨基酸序列；
在本發明的一些實施方式中，所述重鏈的氨基酸序列為從N端至C端方向依次為：M-由1~3個除半胱氨酸以外的氨基酸殘基組成的氨基酸序列-蛋白標簽序列-ENLYFQ-肉毒桿菌毒素重鏈序列(N端第1位為甘氨酸G)。
在本發明的一些實施方式中，所述重鏈的氨基酸序列為從N端至C端方向依次為：M-由1~3個除半胱氨酸以外的氨基酸殘基組成的氨基酸序列-蛋白標簽序列-ENLYFQ-肉毒桿菌毒素A的第445位至第1296位氨基酸。
在本發明的一些實施方式中，所述重鏈的氨基酸序列為從N端至C端方向依次為：MK-蛋白標簽序列-ENLYFQ-肉毒桿菌毒素A的第445位至第1296位氨基酸。
在本發明的一些實施方式中，所述重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述重組肉毒桿菌毒素的重鏈的氨基酸序列為攜帶蛋白標簽的序列，可通過TEV蛋白酶酶切去除蛋白標簽，產生不含有標簽和酶切位點殘留氨基酸殘基的重鏈，不會產生肉毒桿菌毒素以外的抗原性。
在上述重鏈序列的基礎上，本發明嘗試對輕鏈序列進行選擇和改良，確定從肉毒桿菌毒素全長單鏈的N末端截取至第438位賴氨酸的位置，以此作為輕鏈序列能夠很好地保證輕鏈的生物活性。上述設計的輕鏈和重鏈能夠高效形成二硫鍵，經TEV蛋白酶酶切後產生不引入任何肉毒桿菌毒素本身序列不存在的氨基酸殘基、具有生物活性的肉毒桿菌毒素。
較佳地，上述重組肉毒桿菌毒素中，所述輕鏈的氨基酸序列為肉毒桿菌毒素A的第1位至第438位。
肉毒桿菌毒素A的第1位至第438位氨基酸序列可為天然肉毒桿菌毒素A的序列(例如SEQ ID NO.1所示序列的第1位至第438位)，也可為突變的肉毒桿菌毒素A的序列，突變的肉毒桿菌毒素A序列能夠與上述重鏈連接形成有生物活性的肉毒桿菌毒素即可。
在本發明的一些實施方式中，所述輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的第1位至第438位所示。
以上所述的重鏈和輕鏈在對應於肉毒桿菌毒素A全長單鏈430、454位的氨基酸的位置上仍保留原有的半胱氨酸，因此輕鏈和重鏈之間可以形成二硫鍵，並且採用上述設計的輕鏈和重鏈有利於二硫鍵的高效形成。
第二方面，本發明提供一種核酸分子，所述核酸分子編碼以上所述的重組肉毒桿菌毒素。
根據上述重組肉毒桿菌毒素的重鏈和輕鏈的氨基酸序列，本領域技術人員可以獲得編碼上述重鏈和輕鏈的核酸分子的核苷酸序列。基於密碼子的簡並性，上述核酸分子的核苷酸序列並不唯一，所有能夠編碼上述重鏈和輕鏈的核酸分子均在本發明的保護範圍內。
在本發明的一些實施方式中，編碼重鏈的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本發明的一些實施方式中，編碼輕鏈的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
上述核酸分子能夠實現在大腸桿菌和需鈉弧菌中高效穩定表達輕鏈和重鏈。
第三方面，本發明提供包含以上所述的核酸分子的生物材料；所述生物材料為表達盒、載體或宿主細胞。
在本發明的一些實施方式中，含有所述核酸分子的表達盒由啓動子和所述核酸分子可操作性地連接得到。
根據表達需要以及表達盒上下游序列的不同，表達盒中還可包含終止子、增强子等其他轉錄、翻譯調控元件。
在本發明的一些實施方式中，含有所述核酸分子的載體為質粒載體，這些質粒載體包括複製型載體和非複製型載體。含有所述核酸分子的載體不侷限於質粒載體，還可為噬菌體、病毒等載體。
在本發明的一些實施方式中，所述質粒載體含有編碼上述重鏈的核酸分子和/或編碼上述輕鏈的核酸分子。
在本發明的一些實施方式中，所述質粒載體為以PQlink為骨架載體，在其中串聯連入編碼上述重鏈的核酸分子和編碼上述輕鏈的核酸分子。編碼上述重鏈的核酸分子和編碼上述輕鏈的核酸分子各自包含相應的蛋白表達基因，並且均擁有獨立的啓動子，調控因子，核糖體結合位點和終止子。
在本發明的一些實施方式中，所述宿主細胞為大腸桿菌或需鈉弧菌，但宿主細胞的種類並不侷限於此，可以為任意的微生物細胞或可用於蛋白表達的動物細胞。
第四方面，本發明提供一種用於生產重組肉毒桿菌毒素的工程菌，所述工程菌含有以上所述的核酸分子。
在本發明的一些實施方式中，所述工程菌為大腸桿菌或需鈉弧菌。
本發明中，大腸桿菌和需鈉弧菌均可作為底盤菌用於表達重組肉毒桿菌毒素。然而，本發明意外地發現，需鈉弧菌能夠更為高效地促進肉毒桿菌毒素的輕鏈和重鏈之間形成二硫鍵，進而能夠更快、更好地成功合成出具有生物活性的肉毒桿菌毒素。
不僅如此，相對於大腸桿菌易被噬菌體感染而發生細胞破裂，導致內容物溶出，以需鈉弧菌作為底盤菌進行肉毒桿菌毒素的製備還可以減少噬菌體感染風險，有效降低毒蛋白對環境造成污染的風險，並且縮短菌體培養周期。在本發明的一些實施方式中，所述工程菌含有攜帶以上所述的核酸分子的質粒載體。
在本發明的一些實施方式中，所述工程菌為在需鈉弧菌中導入攜帶以上所述的核酸分子的質粒載體得到。其中編碼重鏈的核酸分子和編碼輕鏈的核酸分子可以在同一質粒載體上，也可分別在不同的質粒載體上。
在本發明的一些實施方式中，所述工程菌為在大腸桿菌中導入攜帶以上所述的核酸分子的質粒載體得到。其中編碼重鏈的核酸分子和編碼輕鏈的核酸分子可以在同一質粒載體上，也可分別在不同的質粒載體上。
第五方面，本發明提供以上所述的重組肉毒桿菌毒素或所述核酸分子或所述生物材料或所述重組需鈉弧菌在製備肉毒桿菌毒素中的應用。
在本發明的一些實施方式中，上述應用包括：修飾宿主細胞以使得所述宿主細胞表達以上所述的重組肉毒桿菌毒素或含有所述核酸分子，培養宿主細胞，收集其表達的重組肉毒桿菌毒素，經親和層析純化和TEV蛋白酶酶切制得去除蛋白標簽的肉毒桿菌毒素。
在本發明的一些實施方式中，上述應用包括：培養所述重組需鈉弧菌，收集其表達的重組肉毒桿菌毒素，經親和層析純化和TEV蛋白酶酶切制得去除蛋白標簽的肉毒桿菌毒素。
第六方面，本發明提供一種肉毒桿菌毒素的製備方法，所述方法包括：修飾宿主細胞以使得所述宿主細胞表達以上所述的重組肉毒桿菌毒素，培養所述宿主細胞，採用親和層析從培養物中純化所述重組肉毒桿菌毒素，將純化後的重組肉毒桿菌毒素進行TEV蛋白酶酶切。
上述方法中，所述親和層析的使用的柱材可根據重鏈所含有的蛋白標簽進行選擇。
在本發明的一些實施方式中，對應所採用的His-tag蛋白標簽，使用His-tag親和層析柱進行。實際應用時，可根據不同的蛋白標簽序列，選擇使用對應的純化方法。
上述方法中，培養宿主細胞得到培養物，經裂解細胞後分離上清液進行親和層析純化。
在本發明的一些實施方式中，所述方法還包括在TEV蛋白酶酶切後依次進行陰離子交換層析和分子篩層析純化的步驟。
上述純化中，陰離子交換層析可採用陰離子交換柱(例如Source Q)進行。分子篩層析可採用SuperDex200等分子篩柱材進行。
採用上述純化方法能夠顯著提高重組肉毒桿菌毒素的純化效率和純度。
上述方法中，整個純化過程不到一天的時間即可完成，相比於無標簽蛋白的繁瑣純化過程，極大地簡化了純化流程，節省了人力和物料，有效減少了對儀器等環境造成意外污染的可能性。
對於宿主細胞，在本發明的一些實施方式中，所述宿主為需鈉弧菌。
本發明意外地發現，需鈉弧菌能夠更為高效地促進肉毒桿菌毒素的輕鏈和重鏈之間形成二硫鍵，進而能夠更快、更好地成功合成出具有生物活性的肉毒桿菌毒素。
不僅如此，相對於大腸桿菌易被噬菌體感染而發生細胞破裂，導致內容物溶出，以需鈉弧菌作為底盤菌進行肉毒桿菌毒素的製備還可以減少噬菌體感染風險，有效降低毒蛋白對環境造成污染的風險，並且縮短菌體培養周期。
本發明的有益效果在於：本發明通過對重組肉毒桿菌毒素重鏈和輕鏈序列的設計改良，實現了不會因添加和切割蛋白標簽引入肉毒桿菌毒素本身序列不存在的氨基酸殘基，同時能夠進行肉毒桿菌毒素的高效穩定表達和活性肉毒桿菌毒素的製備，還能夠極大地簡化毒素蛋白的純化製程，實現活性肉毒桿菌毒素的高效製備。
本發明提供的肉毒桿菌毒素製備方法能夠快速、高效地製備肉毒桿菌毒素，宿主培養周期短、不易污染噬菌體，毒素蛋白純化過程簡單易行，易於規模化放大生產，極大地降低了肉毒桿菌毒素製備的成本，製備肉毒桿菌毒素具有預期的生物活性，與天然肉毒桿菌毒素相當，具有較好的應用前景。
為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合本發明中的附圖，對本發明中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有進行過度實驗前提下所獲得的所有其他實施例，都屬本發明保護的範圍。
實施例1 肉毒桿菌輕鏈重鏈表達載體的構建
從優寶生物購買PQlink表達載體(http://www.youbio.cn/product/vt8126)，依據NCBI(美國國家生物信息中心，網址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的肉毒梭狀芽胞桿菌表達的肉毒桿菌蛋白序列(UniProtKB/Swiss-Prot:P0DPI0.1)，進行設計，委托金斯瑞生物科技股份有限公司合成肉毒桿菌毒素編碼基因。
採用PCR擴增的方法，分別在輕、重鏈上下游引入PQLink同源臂，並在重鏈的上游引入His標簽和TEV酶切位點。利用KOD Mix體系，各進行20μL體系反應。擴增程序為：95℃，15s變性；56℃，10s退火，68℃延伸30s，整個反應34個循環。利用核酸膠電泳收集反應片段，記為P1，P2。另用PQlink相應引子對載體進行PCR擴增，將載體線性化，利用核酸膠電泳收集反應片段，記為P3，反應體系為50μL，擴增程序為：95℃，15s變性；56℃，10s退火，68℃延伸60s，整個反應34個循環。結果如圖1所示，P1條帶大小在1200bp左右，P2條帶大小在2600bp左右，P3條帶在5000bp左右。大小均符合預期。所用引子如下。 引子BotLc-5：5’- GAGGAGAAATTAACTATGCCGTTCGTTAACAAACAGTTC-3’ 引子BotLc-3：5’- GTCCTAGGCGGCCGCTTATTTAGAGGTGATGATACCACG-3’ 引子BotHc-5： 5’- GAGGAGAAATTAACTATGAAACATCACCATCACCATCACGAGAATCTTTATTTTCAGGGTTACAACAAAGCTCTGAACGA-3’ 引子BotHc-3：5’- GTCCTAGGCGGCCGCTTACAGCGGACGTTCACCCCAACCGT-3’(下劃線表示PQlink同源臂) 引子PQlink-5v：5’-TAAGCGGCCGCCTAGGACCCAGC-3’ 引子PQlink-3v：5’-CATAGTTAATTTCTCCTCTTTAA-3’。
將PCR反應條帶切膠，利用TIANGEN膠回收試劑盒回收，操作步驟同說明書。將輕重鏈回收片段P1，P2分別與P3進行同源重組，試劑盒選擇諾唯贊同源重組試劑盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)，操作步驟同說明書。
取反應產物10μL，加入TOP10感受態(市售購買獲得)，42℃熱激90s；加入200μL新鮮LB培養基孵育30min，然後塗布於抗性LB固體平板板(含50μg/mL氨苄西林)，37℃過夜培養。挑取轉化子進行擴培，然後抽提質粒，先後進行PCR(引子選擇輕、重鏈各自對應的引子)以及測序驗證，測序公司為北京睿博興科生物技術有限公司，測序引子為公司通用引子PQlink-F、PQlink-R。 引子PQlink-F：5’-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3’ 引子PQlink-R：5’-CCAGTGATTTTTTTCTCCATTTT-3’。
上述PCR擴增得到的肉毒桿菌毒素的重鏈的編碼基因序列如SEQ ID NO.3所示，編碼重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，輕鏈的編碼基因序列如SEQ ID NO.4所示，編碼輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.1的第1-438位所示。
實施例2 肉毒桿菌輕鏈重鏈串聯共表達載體的構建
由實施例1得到輕鏈、重鏈單獨表達的質粒，依次記為B1與B2。
將B2進行SwaI酶酶切(SwaI與buffer3.1均購自NEB公司)，酶切體系為：2μL質粒，0.5μL酶，1μL Buffer3.1，水補齊至10μL。室溫酶切2h。之後將體系置於65℃，30min，產物記為P4。
以B1為模板，進行PCR反應，反應體系20μL，擴增程序為：95℃，15s變性；56℃，10s退火，68℃延伸30s，整個反應34個循環。引子如下： 引子PQlink-5ter：5’-TAACAACACCATTTGTCGAGAA-3’； 引子PQlink-3ter：5’-CCATTTGTAACCACTCCATTT-3’。
利用核酸膠電泳收集反應片段，將PCR反應條帶切膠，利用TIANGEN膠回收試劑盒回收，操作步驟同說明書，產物記為P5。將回收片段P4與P5進行同源重組，試劑盒選擇諾唯贊同源重組試劑盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)，操作步驟同說明書。
取反應產物10μL，加入TOP10感受態(市售購買獲得)，42℃熱激90s；加入200μL新鮮LB培養基孵育30min，然後塗布於抗性LB固體平板板(含50μg/mL氨苄西林)，37℃過夜培養。挑取轉化子進行擴培，然後抽提質粒，先後進行PCR(引子選擇BotHc-5、BotLc-3)以及測序驗證。如圖2所示，其中第2道，第4道為4000bp左右，大小符合預期，選取對應菌株進行測序，測序公司為北京睿博興科生物技術有限公司，測序引子為公司通用引子PQlink-F，PQlink-R。 引子PQlink-F：5’-TATAAAAATAGGCGTATCACGAGG-3’； 引子PQlink-R：5’-CCAGTGATTTTTTTCTCCATTTT-3’。
結果顯示，測序結果正確。構建質粒圖譜示意圖如圖3所示，圖中Bonta HC為N端攜帶His標簽的肉毒桿菌毒素重鏈，Bonta LC為肉毒桿菌毒素輕鏈，重鏈和輕鏈基因的啓動子均為t5啓動子，調控元件為lac operator，終止子為lambda t0 terminator。
實施例3 利用大腸桿菌表達重組肉毒桿菌毒素
取實施例2制得的共表達質粒2μL，加入Origami DE3感受態(市售購買獲得)，42℃熱激90s；加入200μL新鮮LB培養基孵育30min，然後塗布於抗性LB固體平板板(每升成分，NaCl 10g，胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，瓊脂10g，含50μg/mL氨苄西林)，37℃過夜培養。
取單克隆轉化，接菌於10 mL LB培養基中(每升成分，NaCl 10g，胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，含50μg/mL氨苄西林)，在搖床中220rpm 37℃過夜培養。之後將菌液接菌於1L LB培養基中(含50μg/mL氨苄西林)，220rpm 37℃培養。培養6小時，OD至1.5，降溫至18℃，加入500mM IPTG 400μL誘導。
實施例4 利用需鈉弧菌表達重組肉毒桿菌毒素
需鈉弧菌感受態購置於synthetic genomics，商品名Vmax ™Express。取實施例2制得的共表達質粒2μL加入需鈉弧菌感受態細胞，電擊轉化1500V，5ms。電擊轉化杯購於biorad，貨號165-2086 2mm。電擊轉化產物加入高鹽LB培養基(每升成分，NaCl 30g，胰蛋白腖10g，酵母提取物5g)1mL。37℃振蕩培養1小時。塗布至高鹽LB平板上(每升成分，NaCl 30g，胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，瓊脂10g，含50μg/mL氨苄西林)。
取單克隆轉化，接菌於10mL 高鹽LB培養基中(每升成分，NaCl 30g，胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，含50μg/mL氨苄西林)，在搖床中220rpm 37℃過夜培養。之後將菌液接菌於1L高鹽LB培養基中(每升成分，NaCl 30g，胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，含50μg/mL氨苄西林)，220rpm 37℃培養。培養3小時，OD至1.5，降溫至18℃，加入500mM IPTG 400μL誘導。
實施例5 肉毒桿菌毒素的純化
對實施例3和4中表達的重組肉毒桿菌毒素，同時在以下相同條件下純化需鈉弧菌Vmax和大腸桿菌Origami表達的肉毒毒素蛋白：
收集菌液，低速大容量離心機3800 rpm離心十分鐘。除去上清，每升菌實體用25mL lysis buffer(25mM Tris 8.0，150mM NaCl)重懸。
超聲裂解，條件：變幅桿10, 功率350W，超聲2s，停2s，每升菌實體用時4min(例如，收集6L菌，超聲時間應為24min)，超聲至菌液澄清。
50mL離心管為容器，高速離心13000rpm，1小時。取上清液。
高速離心上清液，過His-tag柱材，每升菌實體，柱材用量3mL。過兩遍。
Wash buffer (25mM Tris 8.0，150mM NaCl，10mM 咪唑)，每升菌實體洗50mL。
Elute buffer(25mM Tris 8.0，50mM NaCl，250mM 咪唑)，每升菌實體洗10mL，收集洗脫液。10mL 洗脫液加入100U的TEV酶(購於碧雲天 產品編號: P2307)進行酶切處理。
電泳檢測，5×非變性非還原蛋白上樣緩衝液購於YeasenChina，貨號20317ES，制樣方法參見說明書。其中，離心沉澱，離心上清上樣量為2μL，高咪唑洗脫液上樣量為5μL，進行聚丙烯醯胺凝膠電泳。檢測結果如圖4所示。
將需鈉弧菌與大腸桿菌Origami表達重組肉毒桿菌毒素的結果進行對比，大腸桿菌Origami細胞質二硫化物還原途徑在trxB/gor存在兩個突變，可以增加大腸桿菌細胞質中二硫鍵的形成。出乎意料的是，在需鈉弧菌中，肉毒桿菌毒素重鏈、輕鏈之間也可以形成正常的二硫鍵，而且需鈉弧菌表達的蛋白純度與Origami表達結果相似。在圖4中顯示為，高咪唑洗脫過程中，需鈉弧菌與大腸桿菌蛋白條帶純度相似。蛋白分子量大小均在135kD以上，幾乎不存在重鏈100kD，輕鏈50kD的條帶。
將需鈉弧菌的高咪唑洗脫進一步通過陰離子交換柱/SuperDex200分子篩純化，陰離子交換柱的A buffer 配方為：25mM Tris 8.0，B buffer配方為：1M NaCl，25mM Tris 8.0。將洗脫液電導稀釋至7mS/cm，過陰離子交換柱Source Q，收集流穿液(FT)，洗脫程序為線性提升至60%B buffer，總洗脫體積200mL。洗脫UV280nm檢測結果如圖5所示，並對相應樣品進行收集，蛋白制樣，每道上樣量為5μL，進行聚丙烯醯胺凝膠電泳。結果如圖6所示。其中第7管，第8管蛋白純度較高。
收集7-8管，使用50kD Millipore蛋白濃縮管，2000g轉速，濃縮至2mL，上樣至分子篩SuperDex200，流動相為lysis buffer。洗脫UV280nm檢測結果如圖7所示，並對相應樣品進行收集，蛋白製樣，每道上樣量為5μL，進行聚丙烯醯胺凝膠電泳。結果如圖6所示。其中第14管蛋白處於峰尖。收集第14管。分子篩SUPERDEX200純化SDS-PAGE檢測結果如圖8所示。
以上樣品進行聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的預製凝膠均購置於碧雲天，實驗實施方法依照其說明書進行。
實施例6 利用Western-blot檢測肉毒桿菌毒素的組氨酸標簽殘留
選擇實施例5分子篩洗脫第14管以及陽性對照進行SDS-PAGE電泳，上樣緩衝液為還原緩衝液，購於聚合美，M5 5×SDS-PAGE還原性5×蛋白上樣緩衝液，貨號MF145-10。陽性對照依照實施例4進行，與樣品的區別僅在於中間未進行TEV酶酶切。
凝膠進行免疫印迹轉印至硝酸纖維膜。電壓25v，時間30min，轉膜液購置於碧雲天。抗體購於金斯瑞，THE ™His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse，使用參照其說明進行。轉膜之後顯影液購於thermo，SuperSignal ™。結果如圖9所示，經過還原，蛋白在聚丙烯醯胺凝膠電泳中，分離成重鏈、輕鏈兩條帶。其中，重鏈大小在100kD-135kD之間。TEV酶切的樣品沒有陽性條帶，對照組陽性較强。
實施例7 肉毒桿菌毒素的活性檢測
利用小鼠腓腸肌注射實驗檢測實施例5製備的肉毒桿菌毒素的活性，具體如下：
將實施例5得到的蛋白樣品稀釋至0.25ng/mL(檢測方法為酶聯免疫吸附劑測定ELISA，試劑盒購於上海欽誠生物，工作曲線如圖10所示，回歸方程中，Abs值的是吸光值讀數，[Protein]指的是肉毒桿菌毒素濃度，R值大於0.99，數據質量可靠)，溶劑為0.5‰BSA，9‰氯化鈉溶液。右後腿腓腸肌注射50μL肉毒桿菌毒素試劑、左後腿腓腸肌注射50μL陰性對照(溶劑)。如圖11所示，5pg的蛋白量可以在12小時內引起小鼠的右腿癱瘓，而左腿沒有影響。
最後應說明的是：以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的精神和範圍。
無
為了更清楚地說明本發明或習知技術中的技術方案，下面將對實施例或習知技術描述中所需要使用的附圖逐一簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不進行過度實驗的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1為本發明實施例1中產物P1，P2，P3的PCR條帶； 圖2為本發明實施例2中PCR篩選條帶，其中2,4符合預期； 圖3為本發明實施例2中串聯質粒結構圖； 圖4為本發明實施例5中His-tag親和層析純化結果； 圖5為本發明實施例5中陰離子交換柱純化結果； 圖6為本發明實施例5中陰離子交換柱純化SDS-Page驗證結果，FT為流穿液，數字7-14分別為圖5中陰離子交換柱收集管編號； 圖7為本發明實施例5中分子篩SUPERDEX200純化結果； 圖8為本發明實施例5中分子篩SUPERDEX200純化SDS-PAGE驗證結果，其中，數字11-18分別為圖7中分子篩SUPERDEX200收集管編號； 圖9為本發明實施例6中分子篩SUPERDEX200純化SDS-PAGE驗證結果； 圖10為本發明實施例7中肉毒桿菌毒素蛋白濃度工作曲線圖； 圖11為本發明實施例7中小鼠腓腸肌注射實驗12小時後結果。
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Claims (10)

  1. 一種重組肉毒桿菌毒素，其包括由二硫鍵連接的重鏈和輕鏈，該重鏈的氨基酸序列從N端到C端的方向依次包含蛋白標簽序列、ENLYFQ多肽序列和肉毒桿菌毒素的重鏈序列，其中 該肉毒桿菌毒素的重鏈序列的N端第1位氨基酸為甘氨酸。
  2. 如請求項1所述之重組肉毒桿菌毒素，其中，該肉毒桿菌毒素的重鏈序列為肉毒桿菌毒素A的第445位至第1296位氨基酸序列； 較佳地，該重組肉毒桿菌毒素的重鏈的氨基酸序列在蛋白標簽序列的N端進一步包括從N端至C端方向的甲硫氨酸和由1~3個除半胱氨酸以外的氨基酸殘基組成的氨基酸序列； 更佳地，該重組肉毒桿菌毒素的重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
  3. 如請求項1或2所述之重組肉毒桿菌毒素，其中，該輕鏈的氨基酸序列為肉毒桿菌毒素A的第1位至第438位； 較佳地，該輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示序列的第1位至第438位所示。
  4. 一種核酸分子，其中，該核酸分子編碼如請求項1~3任一項所述之重組肉毒桿菌毒素，其中 編碼該重組肉毒桿菌毒素重鏈的該核酸分子如SEQ ID NO.3所示；以及 編碼該重組肉毒桿菌毒素輕鏈的該核酸分子如SEQ ID NO.4所示。
  5. 一種生物材料，其包含如請求項4所述之核酸分子，其中該生物材料為表達盒、載體或宿主細胞。
  6. 一種用於生產重組肉毒桿菌毒素的工程菌，其含有如請求項4所述之核酸分子。
  7. 如請求項6所述之工程菌，其中該工程菌為大腸桿菌或需鈉弧菌。
  8. 一種肉毒桿菌毒素的製備方法，其方法包括：修飾宿主細胞以使得該宿主細胞表達如請求項1~3任一項所述之重組肉毒桿菌毒素，培養該宿主細胞，採用親和層析從培養物中純化該重組肉毒桿菌毒素，將純化後的該重組肉毒桿菌毒素進行TEV蛋白酶酶切。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該方法進一步包括在TEV蛋白酶酶切後依次進行陰離子交換層析和分子篩層析純化的步驟。
  10. 如請求項8或9所述之方法，其中該宿主細胞為需鈉弧菌。
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