CN101892253A - 在大肠杆菌中无需包涵体复性制备溶栓药物瑞替普酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无需包涵体复性、直接通过大肠杆菌表达系统制备溶栓药物瑞替普酶(Reteplase，rPA)的方法。通过PCR扩增得到rPA的基因片断，将该基因片断克隆到载体pET40b中，构建得到pET40b-rPA重组质粒，且使rPA与载体pET40b中的二硫键异构酶DsbC融合表达。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，分别优化确立了IPTG及乳糖的诱导表达条件。所获得目的融合蛋白主要以可溶性成分表达，经镍柱亲和层析纯化后，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)处理可获得高纯度的rPA目的蛋白。纤维蛋白平板法检测结果显示：本方法所获得的融合蛋白DsbC-rPA及去除标签纯化所得rPA蛋白均具有显著的溶栓活性。

Description

在大肠杆菌中无需包涵体复性制备溶栓药物瑞替普酶的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域中的重组蛋白质药物制备技术，具体涉及一种无需包涵体复性、直接在大肠杆菌中表达生产活性溶栓药物瑞替普酶(Reteplase，rPA)的方法。

背景技术

目前，心血管疾病，尤其是血栓栓塞性疾病是危害人类健康的一大杀手。溶栓治疗是血栓性疾病安全而有效的治疗手段。rPA是分子量为39.6kD的单链蛋白，由355个氨基酸组成，它是人组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂(Tissue type plasminogen activator，tPA)缺失4-175位氨基酸序列的缺失变体。rPA一级结构中不含tPA分子中的Kringle1、Finger、EGF结构域(domain)，但保留了Kringle2及丝氨酸蛋白酶结构域。由于rPA缺失了tPA的部分结构域，rPA与纤维蛋白的结合能力稍弱，但rPA分子中保留的Kringle2结构域具有对纤维蛋白适中的亲和性，更容易作用于血栓内部的纤溶酶原，溶栓速度快于tPA。另外rPA与肝细胞受体结合的Kringle1及EGF结构域的缺失使rPA在体内的半衰期较tPA大大延长，可达18min，因此rPA作为新型溶栓药物可更好地应用于治疗急性心肌梗塞，在疗效和临床使用等方面均优于tPA，具有纤溶效果强、再通率高、起效迅速和副作用小等优点，是目前临床上应用最好的第三代溶栓药物之一。

中国专利CN200710303763.3公开了一种在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法，尽管它也是将瑞替普酶基因插入到原核表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体，再将该重组表达载体与质粒pREP4共转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌，表达得到瑞替普酶。但该方法中存在的问题在于：(1)需要两个质粒共转化，并因此在培养过程中需要同时添加氨苄青霉素和卡那霉素两种抗生素，一方面致使重组大肠杆菌遗传稳定性相对降低，另一方面也较大程度上为工业化生产及后续临床应用中如何避免抗生素残留污染增加了困难；(2)所获得的rPA重组蛋白质仅通过western blot进行鉴定，未能就其溶栓活性加以验证，无法确保实现正确的临床应用。

目前，国内外采用基因工程方法生产rPA的研究主要是应用酵母及哺乳动物细胞等真核表达系统中，成本较高，生产周期长，产率很低，且真核细胞内表达产物易产生糖基化而影响生物活性。利用大肠杆菌等原核表达系统则可以大大降低生产成本，提高产率，然而尽管也有不少学者尝试在大肠杆菌系统中表达rPA基因，但由于rPA富含9对二硫键，大肠杆菌系统很难直接形成正确的空间构象，致使表达产物多以包涵体蛋白形式存在，必须将细胞破碎后才能将其分离出来，分离过程中要用蛋白质变性剂，最后还要再把蛋白质复性，复性过程中有许多会错接形成结构异常的分子，同时，菌体残余蛋白是基因工程药物生产过程中不易消除的物质，不但收率较低，而且容易影响产品的质量，从而影响到药物的疗效。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种无需包涵体复性、直接在大肠杆菌中表达制备活性溶栓药物瑞替普酶(rPA)的方法。

本发明是将溶栓药物瑞替普酶rPA基因插入到原核表达载体pET40b的多克隆位点，使其位于DsbC信号肽及其编码基因下游，得到重组表达载体，再将该重组表达载体转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌，表达、分离纯化得到rPA。为实现此目的本发明提供如下的技术方案：

一种无需包涵体复性、直接在大肠杆菌中表达瑞替普酶的方法，其特征在于包括如下的步骤：

(1)表达载体的构建：将rPA编码基因插入到表达载体pET40b的多克隆位点，使其位于DsbC信号肽及其编码基因下游，经T4DNA连接酶连接，构建得到pET40b-rPA重组质粒；

(2)将pET40b-rPA转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌；其中重组大肠杆菌pET40b-rPA氨基酸序列如序列表4。

(3)培养该重组大肠杆菌，诱导表达；

(4)收集菌液，超声离心后，分别对上清及沉淀进行SDS-PAGE检测；

(5)分离纯化得到目的融合蛋白DsbC-rPA，或经镍柱亲和层析纯化，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)处理，去除DsbC标签，得到高纯度、高活性的rPA目的蛋白。

本发明所述的方法，其中步骤(1)中rPA基因片段与载体中的二硫键异构酶DsbC以融合蛋白形式表达，在DsbC的辅助作用下催化二硫键形成，无需进行包涵体复性。

本发明所述的方法，其中所述的培养该重组大肠杆菌的过程中需加入IPTG或乳糖进行诱导表达。

本发明所述的方法，其中所述的IPTG终浓度为0.6mM于25℃诱导3h，乳糖终浓度为30mM于30℃诱导5h。

本发明所述的方法，其中所述的融合标签DsbC和rPA间是通过凝血酶、Xa因子及甲酸蛋白质切割位点相连，融和蛋白DsbC-rPA利用Xa因子(或甲酸、凝血酶)处理后即可将二者分离获得独立的rPA蛋白质。

本发明所述的方法，其中所述的rPA编码基因克隆插入pET40b载体所用PCR引物序列为：

上游引物：5’-CGGggatccGATCGAAGGTCGTTCTTACCAAGGAAACAGTG-3’；

下游引物：5’-GGGctcgagATTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAG-3’。其中在上下游引物中分别引入BamHI和XhoI酶切位点；同时在上游引物中同时引入了Xa因子蛋白酶切位点和甲酸蛋白切割位点的编码DNA。

本发明为了确保目的蛋白形成正确的二硫键与空间构象，将rPA编码基因克隆到二硫键异构酶DsbC信号肽及其编码基因下游。DsbC信号肽可将融合蛋白转运到大肠杆菌细胞周质空间，然后在DsbC的辅助作用下催化二硫键的形成，成功的实现了rPA重组蛋白的高效可溶性表达，目的蛋白在不需进行包涵体复性操作且在未切去DsbC标签的情况下，即可表现出明显的溶栓活性，进一步经镍柱亲和层析纯化后，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)处理可获得高纯度、高活性的rPA目的蛋白。从而大大简化了利用大肠杆菌这一目前最为成熟、成本最低廉的表达系统制备可溶性、活性rPA的操作方法。

本发明的方法成功实现了rPA重组蛋白的高效可溶性表达，用BCA蛋白定量法计算得到在上清液中的可溶性目的蛋白的含量占总蛋白量的40％左右，且目的蛋白在不需进行包涵体复性操作且在未切去DsbC标签的情况下，即可表现出明显的溶栓活性，进一步经镍柱亲和层析纯化后，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)处理可获得高纯度、高活性的rPA目的蛋白。

本发明的制备方法简单易行，回收率高，缩短了rPA生产工艺，降低了生产成本，为更好的大规模工业化生产rPA奠定了坚实的基础，对其它富含二硫键的蛋白质的工业化生产也具有重要的指导意义。

附图说明

图1是乳糖和IPTG诱导DsbC-rPA在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE检测。1：蛋白质Marker；2：IPTG诱导rPA重组大肠杆菌；3：IPTG诱导pET40b空质粒转化的大肠杆菌；4：乳糖诱导rPA重组大肠杆菌。

图2是镍柱法亲和层析纯化DsbC-rPA融合蛋白。

图3是用Xa因子处理DsbC-rPA融合蛋白释放rPA蛋白质的SDS-PAGE检测。1：Xa因子切割融合蛋白DsbC-rPA 2：DsbC-rPA融合蛋白3：蛋白质Marker。

图4是DsbC-rPA和rPA的溶栓活性检测。1：pET40b空质粒转化的大肠杆菌的表达产物2：DsbC-rPA融合蛋白3：经Xa因子处理获得的rPA蛋白质4：tPA标准品5：经凝血酶处理获得的rPA蛋白质6：尿激酶(uPA)标准品。

具体实施方式

为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。在下述实施例中所给出的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。其中所用试剂均有市售。

实施例1

rPA基因工程菌的构建

1、以本实验室前期研究中构建的pMD18T-tPA质粒作为模板(江洁，江成英，杜连祥等.Reteplase基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达.华南理工大学学报自然科学版，2006，34(12)：25-29)。

采用上游引物：

5’-CGGggatccGATCGAAGGTCGTTCTTACCAAGGAAACAGTG-3’(序列表；1)；

下游引物：

5’-GGGctcgagATTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAG-3’，(序列表：2)进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶纯化方法纯化回收获得rPA基因片段。

为方便后续操作，在上下游引物中分别引入了BamHI和XhoI酶切位点(黑体小写部分)，同时为便于切割去除DsbC融合标签，在上游引物中同时引入了Xa因子蛋白酶切位点(黑体斜体部分)和甲酸蛋白切割位点(下划线部分)的编码DNA。

经过序列比较证实：PCR扩增得到的rPA编码基因序列与已知的rPA基因序列完全一致，具体序列如下所示(序列表：3)：

TCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGG

CACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCC

TGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGG

CAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTG

CTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTG

CGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCC

GACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCC

CGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTG

CCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGC

AGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAAT

ACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTG

CAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGT

GTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCG

GCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCT

CATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAAC

AGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCA

AACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACG

ATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAA

GGATGTCCCGGGTGTGTACACCAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACA

ACATGCGACCGTAA

2、将rPA基因和pET40b质粒(购买于Novagen公司)用BamHI和XhoI双酶切后，经T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，培养12h后挑取单克隆，提取质粒用BamHI和XhoI双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测有1.1kb rPA目的片段的重组质粒经测序鉴定正确后，命名为pET40b-rPA。在该重组质粒pET40b-rPA中，rPA被置于DsbC信号肽及其成熟肽下游，以同一读码框以融合蛋白形式表达，且在DsbC与rPA间存在组氨酸标签(His Tag)以及凝血酶、甲酸及凝血因子Xa等蛋白质切割位点。(序列表：4，下划线部分为rPA氨基酸序列)

MKKGFMLFTLLAAFSGFAQADDAAIQQTLAKMGIKSSDIQPAPVAGMKTVLTNSGVL

YITDDGKHIIQGPMYDVSGTAPVNVTNKMLLKQLNALEKEMIVYKAPQEKHVITVFTD

ITCGYCHKLHEQMADYNALGITVRYLAFPRQGLDSDAEKEMKAIWCAKDKNKAFDD

VMAGKSVAPASCDVDIADHYALGVQLGVSGTPAVVLSNGTLVPGYQPPKEMKEFLDE

HQKMTSGKGSTSGSGHHHHHHSAGLVPRGSTAIGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTD

DDDKSPGFSSTMAISDPIEGRSYQGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILI

GKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGL

RQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQE

RFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCA

QESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQ

HLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLG

CGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP

3、采用氯化钙转化法，将pET40b-rPA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(天津科技大学工业微生物教育部重点实验室提供)，获得rPA重组大肠杆菌。实验同时转化pET40b空质粒作为对照。

4、实验结果表明：rPA原核表达质粒构建完全成功。

实施例2

rPA在大肠杆菌中的诱导表达

1、将rPA重组大肠杆菌及转化pET40b空质粒的大肠杆菌分别接种到5mL含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养过夜。

2、将上一步骤中所得过夜培养物分别按1％的体积比转接到200mL含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，培养至其OD600为0.6时加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或乳糖进行诱导表达。具体最佳诱导表达条件：IPTG为终浓度0.6mM于25℃诱导3h，乳糖为终浓度30mM于30℃诱导5h。

3、诱导表达结束后，分别收集菌液，超声破碎后于12000rpm离心后，分别对上清及沉淀进行SDS-PAGE检测，见图1。

4、实验结果表明：rPA主要以可溶性成分表达，在上清中的可溶性目的蛋白的含量占总蛋白量的40％左右。

实施例3

DsbC-rPA融合蛋白的分离纯化

1、利用pET-40b载体上带有His-Tag，可采用Ni离子亲和色谱法纯化融合蛋白。首先将镍琼脂糖凝胶FF装柱，1.6×20cm，柱床体积为10mL。

2、用缓冲液1(20mmol/L Tris-HCl pH7.9，0.5mol/L NaCl，10％甘油)以2mL/min平衡2-5个床体积后，将20ml细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1mL/min。

3、用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为2mL/min。然后用分别含10、20、50、100、200、300、400mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2mL/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度。结果表明：融合蛋白DsbC-rPA主要被含10mM咪唑缓冲液从镍柱上洗脱下来，见图2。

4、对所获得的DsbC-rPA目的蛋白质，利用Xa因子(或甲酸、凝血酶)进行处理以去除DsbC融合标签，释放rPA蛋白质。以Xa因子为例，具体操作为：先用BCA蛋白浓度测定试剂盒对样品进行定量，然后按照1U Xa因子能够有效裂解50μg融合蛋白计算，于离心管中混合Xa因子与纯化后的融合蛋白，裂解缓冲液含有50mmol/L Tris-HCl，PH8.0，0.1mol/L NaCl，5mmol/L CaCl₂。21℃孵育16小时，随后取20μL进行Tricine-SDS-PAGE电泳分析鉴定。

5、实验结果表明：DsbC-rPA经Xa因子(或甲酸、凝血酶)处理后，能够释放出目的蛋白rPA和DsbC标签蛋白质。见图3。

实施例4

重组蛋白质溶栓活性检测

1、制备纤维蛋白平板：称取0.02g纤维蛋白迅速加到装有5mL PBS的小锥形瓶中，混匀后置于37℃预热10min使其溶解。同时另取适量凝血酶放入装有1mL PBS的EP管，轻吹一下，放入37℃预热。

2、称取0.07克琼脂糖用7mL PBS溶解，加热使溶解后，冷却至适宜温度。将凝血酶溶液迅速混入纤维蛋白溶液中，立即混匀后加入至琼脂糖溶液中摇匀后，将混合液倒入平板中使其冷却固化。

3、用打孔器在事先准备好的纤维蛋白平板上打孔，加入10μL待测样品，37℃下孵育12h，检测溶栓圈大小。实验同时检测pET40b转化大肠杆菌的诱导表达产物作为阴性对照，检测人组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂tPA(中国药品生物制品检定所提供)及尿激酶uPA(天津市药品检验所提供)标准品作为阳性对照。

4、实验结果表明：经镍柱亲和层析纯化，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)处理去除DsbC标签后所获得的独立rPA目的蛋白具有显著的溶栓活性。而且，DsbC-rPA融和蛋白在无需进行包涵体复性操作且在未切去DsbC标签的情况下，也可以表现出明显的溶栓活性，且二者与阳性对照品tPA和uPA相比，活性相当。具体见图4。

Claims (7)

1.一种无需包涵体复性、直接在大肠杆菌中高效表达瑞替普酶的方法，其特征在于包括如下的步骤：

(1)将rPA编码基因插入到表达载体pET40b的多克隆位点，使其位于DsbC信号肽及其编码基因下游，构建得到pET40b-rPA重组质粒；

(2)将pET40b-rPA转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌；

(3)培养该重组大肠杆菌，诱导表达；

(4)收集菌液，超声离心后，分别对上清及沉淀进行SDS-PAGE检测；

(5)分离纯化得到目的融合蛋白DsbC-rPA，或经镍柱亲和层析纯化，用Xa因子(或甲酸、凝血酶)处理，去除DsbC标签，得到高纯度、高活性的rPA目的蛋白。

2.权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中rPA基因片段与载体中的二硫键异构酶DsbC以融合蛋白形式表达，在DsbC的辅助作用下催化二硫键形成，无需进行包涵体复性。

3.权利要求1所述的方法，其中所述的培养该重组大肠杆菌的过程中需加入IPTG或乳糖进行诱导表达。

4.权利要求3所述的方法，其中所述的IPTG终浓度为0.6mM于25℃诱导3h，乳糖终浓度为30mM于30℃诱导5h。

5.权利要求1所述的方法，其中重组大肠杆菌pET40b-rPA的氨基酸序列如序列表4。

6.权利要求1所述的方法，其中所述的融合标签DsbC和rPA间是通过凝血酶、Xa因子及甲酸蛋白质切割位点相连，融合蛋白DsbC-rPA利用Xa因子、甲酸或凝血酶处理后即可将二者分离获得独立的rPA蛋白质。

7.权利要求1所述的方法，其中所述的rPA编码基因克隆插入pET40b载体所用PCR引物序列为：

上游引物：5’-CGGggatccGATCGAAGGTCGTTCTTACCAAGGAAACAGTG-3’；

下游引物：5’-GGGctcgagATTACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAG-3’。

其中在上下游引物中分别引入BamHI和XhoI酶切位点；同时在上游引物中同时引入Xa因子蛋白酶切位点和甲酸蛋白切割位点的编码DNA。

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