CN110713545B - 一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1及其生产方法和应用 - Google Patents

一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1及其生产方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白‑1及其生产方法和用途，该蛋白含有一个附加的半胱氨酸标签用于功能性分子的标记，含有一个组氨酸标签用于蛋白的纯化，编码该蛋白的基因具有针对原核细胞表达优化的序列；生产方法为先将hPD‑1细胞外氨基酸的基因进行优化，利用PCR将优化的hPD‑1基因扩增后克隆到蛋白表达质粒，构建了hPD‑1原核表达载体；在大肠杆菌细胞内表达hPD‑1并利用组氨酸标签进行纯化，最后使用变性剂进行溶解，透析以对其进行复性，获得重组hPD‑1蛋白质，利用酶联免疫吸附试验验证蛋白质的活性。本发明所公开的hPD‑1生产方法工艺简单易行，所生产的hPD‑1蛋白质成本低，将为hPD‑1单克隆抗体的开发及进一步研发免疫检测技术和抗体医药提供重要工具。

Description

一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1及其生产方法和 应用
技术领域
本发明涉及蛋白生产和药物研发技术领域，具体说是一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1及其生产方法和应用。
背景技术
人源程序性细胞死亡因子受体蛋白1(Human Programmed Death Factor 1，hPD-1)是CD28家族的一个成员，主要在活化的T细胞、B细胞和单核细胞上表达。hPD-1及其配体hPD-L1的相互作用会抑制T细胞的功能，在阻断hPD-1/hPD-L1通路后，可使功能耗竭的T细胞恢复功能。最近的研究表明，hPD-1的表达量与疾病的进程有关。人体血液中的T细胞可以攻击早期形成的肿瘤细胞，但随着肿瘤细胞的扩散，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的hPD-L1大量表达，使T细胞将肿瘤细胞识别为自身细胞，从而停止攻击肿瘤细胞。肿瘤细胞表面的hPD-L1配体的存在使肿瘤不断生长和扩散。hPD-1抗体可与T细胞的hPD-1结合，从而阻止hPD-1与肿瘤细胞hPD-L1的结合，通过阻断hPD-1/hPD-L1信号通路，使T细胞恢复攻击肿瘤细胞的能力而起到治疗肿瘤的作用。
目前hPD-1蛋白的生产主要使用动物细胞，动物细胞的培养需要血清等贵重添加剂，因此现有技术工艺复杂、操作不易控制且产量低，hPD-1生产成本高。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的是提供一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1(hPD-1蛋白)及其生产方法和应用，该hPD-1蛋白能与hPD-L1特异性结合，用于免疫检测及抗体药物研发。该生产方法通过对蛋白质基因序列及生产条件的优化，实现了其在大肠杆菌细胞内的生产，生产的hPD-1蛋白具有生物活性，可用于免疫检测及抗体药物的研发。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1，在人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1的氮端附加了一段含有半胱氨酸的多肽，碳端含有组氨酸标签；人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1基因序列是针对原核细胞表达优化的序列，基因序列为SEQ ID NO：1。
本发明还包括人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1的生产方法，包括以下步骤：
首先，将编码人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1(hPD-1)细胞外氨基酸的基因进行优化，并在5’末端附加了一个编码含有半胱氨酸标签的基因，3’末端附加了能够编码组氨酸标签的基因，合成DNA后执行PCR，得到优化的hPD-1基因，将基因克隆到蛋白质表达质粒，得到含有优化hPD-1基因的表达载体；
其次，将含有优化hPD-1基因的表达载体导入大肠杆菌细胞表达蛋白，所使用的大肠杆菌在其细胞质内能够形成二硫键，重组hPD-1以可溶性部分和不溶性部分(包涵体)的形式表达，利用组氨酸标签对蛋白进行纯化；
最后，使用变性剂将hPD-1蛋白包涵体进行溶解与透析处理，得到复性的重组人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1；
其中，优化hPD-1基因的序列为SEQ ID NO:1。
优选的生产方法，扩增优化后的hPD-1基因的两个引物为：
引物1：NdeICysTagAgeIhPD1for：
5’-TATACATATGGCTCAAATCGAAGTAAACTGCTCTAATGAGACCGGTCTT
GATTCTCCGG-3’；
引物2：NotIhPD-1Back：
5’-CACCCGCGGCCGCCTGAAACTGCCCTGCTGGA-3’。
优选的生产方法，PCR扩增的反应条件为：94℃变性2分钟后，94℃30秒，55℃30秒，68℃1分钟，反应30个循环。
优选的生产方法，变性剂为8M的尿素。
进一步优选的生产方法，包括以下步骤：
①hPD-1基因的优化及扩增
将人源程序性细胞死亡因子受体蛋白25-167氨基酸的基因进行优化，使该蛋白质能够在大肠杆菌细胞内表达；通过设计引物，在蛋白氮端和碳端末端分别附加一个含有半胱氨酸的多肽和组氨酸标签，优化后的hPD-1基因的序列为SEQ ID NO：1；
合成了以下两个引物，扩增优化后的hPD-1基因：
引物1：NdeICysTagAgeIhPD1for：
5’-TATACATATGGCTCAAATCGAAGTAAACTGCTCTAATGAGACCGGTCTT GATTCTCCGG-3’及
引物2：NotIhPD-1Back：
5’-CACCCGCGGCCGCCTGAAACTGCCCTGCTGGA-3’；
以合成的基因片段为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为50微升，反应条件为：94℃变性2分钟后，94℃30秒，55℃30秒，68℃1分钟，反应30个循环后，用1％琼脂糖凝胶执行电泳，检测PCR产物，并回收目的基因片段；
②用于克隆hPD-1基因的DNA质粒的准备
用质粒原液转化大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞，涂LB平板，过夜培养，挑取单克隆菌落，4毫升37℃过夜培养后，抽提质粒，用NdeI和NotI进行处理，用1％琼脂糖凝胶执行电泳，检测质粒的酶切产物并回收目的基因片段；
③hPD-1基因的克隆
用TOYOBO的Ligation high v.2将酶切后的hPD-1基因和酶切后的质粒进行连接，得到重组质粒后将其导入大肠杆菌细胞XL10-Gold中，铺LB板，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落进行菌簇PCR；挑选菌落PCR产物长度符合预期的菌落，37℃过夜培养，抽提质粒后测序，选取基因序列正确的质粒用于表达蛋白质；
④hPD-1蛋白的表达与纯化
用构建成功的重组质粒转化宿主菌株SHuffle T7 express感受态细胞，铺LB培养基平板，37℃培养14h，挑取单菌落接种到含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的4mL LB液体培养基中，以200rpm的速度37℃过夜培养，次日将过夜培养的菌液转接至含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的100mL LB培养基中，30℃200rpm，继续培养3h，测定其吸光度值，当OD600到0.4和0.5之间时，停止培养，向菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),使其终浓度为0.4mmol/L，16℃200rpm，培养18到20h；
将培养得到的菌液6000×g离心20min，收集菌液沉淀，加入含有8mmol/LNa2HPO4·12H2O、47.9mmol/L NaH2PO4·2H2O、300mmol/L氯化钠、pH7.0的TALON缓冲液中，在冰水下进行功率为120W，工作时间为3s，间隔时间为2s的超声处理20min，静置30min后，在4℃下进行6000×g，20min的离心，收集上清液；取100μL TALON Metal Affinity Resin与9mL上清液于4℃条件用摇床在40rpm的速度下结合30分钟后，将上清混合液加入重力纯化柱，用8mmol/L Na2HPO4·12H2O、47.9mmol/L NaH2PO4·2H2O、300mmol/L氯化钠及5mmol/L咪唑、pH7.0的TALON洗涤缓冲液洗涤纯化柱后，用8mmol/L Na2HPO4·12H2O、47.9mmol/LNaH2PO4·2H2O、300mmol/L氯化钠及500mmol/L咪唑、pH7.0的洗脱缓冲液将特异性结合的hPD-1蛋白洗脱，并按顺序收集样品，对纯化蛋白执行SDS-PAGE，检测纯化蛋白的纯度及含量；
⑤不溶性蛋白的复性
取10mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)悬浮步骤4中离心破碎菌液所得沉淀，12,000rpm离心10min，重复三次后分离上清和沉淀(包涵体)；取25mL含20mM Tris-HCl、8M尿素、500mM氯化钠、5mM咪唑、pH8.0的结合/洗涤缓冲液溶解包涵体，并在室温下孵育30min，12,000rpm离心30min后除去剩余的不溶物，将上清转移至干净的离心管，加入500μL平衡后的TALONMetal Affinity Resin，4℃下在旋转震荡仪上与上清溶液混合30min，将含有树脂的混合液加入到平衡后的纯化柱中，用5mL结合/洗涤缓冲液清洗纯化柱三次，用含20mM Tris-HCl、8M尿素、500mM氯化钠、500mM咪唑、pH8.0的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；最后用10kD的透析膜在PBS缓冲液中进行透析处理，取样并执行电泳验证纯化结果，得到重组人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1。
本发明还包括人源程序性细胞死亡因子受体蛋白hPD-1在免疫检测及抗体药物研发中的应用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明将hPD-1基因针对原核细胞表达进行了优化，并将优化好的hPD-1基因克隆到蛋白表达质粒，构建了hPD-1表达载体，利用大肠杆菌表达hPD-1蛋白质并进行了纯化，利用酶联免疫吸附试验验证蛋白质的活性。以本发明所述方法生产出的hPD-1蛋白质，具有与hPD-L1特异性结合的活性，且成本低、工艺简单易行，为开发hPD-1单克隆抗体及进一步开发抗体医药提供了工具。
本发明的人源程序性细胞死亡因子受体蛋白的生产方法，通过优化hPD-1基因的密码子，实现了该蛋白质在原核生物大肠杆菌内的大量表达；由于大肠杆菌易于生长和控制，用于细菌培养的材料成本较低，从而提高了蛋白生产的产量和效率，降低了生产成本，为大规模生产人源程序性细胞死亡因子受体蛋白提供了技术支持；
本发明的人源程序性细胞死亡因子受体蛋白的生产方法，设计巧妙，将半胱氨酸标签和组氨酸标签导入该重组蛋白，前者可用于对蛋白进行荧光染料及酶的修饰，应用于疾病诊断及抗体药物筛选，而组氨酸是一种亲和标签，在亲和纯化过程中可以与镍离子结合，用来纯化重组蛋白，降低纯化成本。
附图说明
图1为人源程序性细胞死亡因子受体蛋白(hPD-1)基因组成示意图；
图2为优化后的25-167氨基酸部分的结构连接示意图；
图3为PCR扩增的hPD-1基因的电泳图；
图4为质粒酶切产物的电泳图；
图5为含有hPD-1表达载体的菌落PCR电泳图；
图6为重组hPD-1聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图7为复性hPD-1聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图8为酶联免疫吸附试验过程示意图；
图9为酶联免疫吸附试验结果示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1及其生产方法和用途，通过以下技术方案实现：
人程序性细胞死亡因子(hPD-1)是由288个氨基酸组成的蛋白质，其结构中包括一段由24个氨基酸组成的信号肽，由143个氨酸组成的细胞外部分及由127个氨基酸组成的细胞内序列。本发明将hPD-1细胞外部分氨基酸的基因进行了优化，使其能够在大肠杆菌细胞内进行表达，同时使用能够促进二硫键在细胞质能形成的大肠杆菌进行蛋白生产，保证蛋白质的结构和活性。构建蛋白质表达载体时，在hPD-1细胞外区域基因的5’末端附加了一个编码含有半胱氨酸的多肽标签基因，便于通过马来酰亚氨与巯基的反应来将含有马来酰亚氨的荧光染料及其他物质标记到纯化蛋白上；3’末端附加了编码组氨酸标签的基因，使通过大肠杆菌生产的蛋白质的C末端含有组氨酸标签，便于蛋白质的纯化。利用本方法生产的hPD-1蛋白大部分以包涵体的形式存在，但通过使用变性剂将其溶解，并使用透析的方法对其复性，每培养100毫升的大肠杆菌可以生产1.28mg的人源程序性细胞死亡因子受体蛋白hPD-1。
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的描述。
实施例1
一、hPD-1基因的优化及扩增
如图1所示，(图中SP代表信号肽，aa代表氨基酸)人源程序性细胞死亡因子受体蛋白(hPD-1)的基因是由信号肽(1-24)，细胞外功能区域(25-167)及细胞内功能区域(168-288)组成。如图2所示，为了保证hPD-1在原核细胞内的表达，本研究选取25-167氨基酸部分进行表达，为便于标记和纯化，在蛋白氮端和碳端分别附加一个Cys-tag标签多肽和组氨酸标签(图2中Cys-tag为一段含有半胱氨酸的多肽，His-tag为组氨酸标签)。利用GENEius软件进行计算，优化了编码hPD-1之25-167氨基酸的基因密码子，使该蛋白质能够在大肠杆菌细胞内表达。其中优化后的hPD-1基因的序列为SEQ ID NO：1；表达的hPD-1氨基酸的序列为SEQ ID NO：2；
为扩增hPD-1基因，合成了两个引物：
引物1：NdeICysTagAgeIhPD1for：
5’-TATACATATGGCTCAAATCGAAGTAAACTGCTCTAATGAGACCGGTCTTGATTCTCCGG-3’及
引物2：NotIhPD-1Back：5’-CACCCGCGGCCGCCTGAAACTGCCCTGCTGGA-3’；
其中上游引物含有NdeI酶切位点，下游引物中含有NotI酶切位点，实验所用质粒的序列上同样含有NdeI酶和NotI酶的酶切位点，因此用NdeI酶和NotI酶对基因进行克隆。以合成的DNA片段为模板执行聚合酶链式反应(PCR)扩增基因，PCR的反应体系为50微升，反应条件为：94℃变性2分钟后，94℃30秒，55℃30秒，68℃1分钟，反应30个循环后，用1％琼脂糖凝胶执行电泳，检测PCR产物。扩增的DNA如图3所示(图3中泳道M1：2kbp DNA marker；泳道1：PCR扩增的hPD-1基因)。使用上海生工生物的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段。
二、表达载体的制备及酶切处理
表达载体是通过大肠杆菌XL10-Gold来进行扩增。取50ng表达载体转化大肠杆菌XL10-Gold，涂LB平板，过夜培养，挑取单克隆菌落接种到含有100μg/mL氨卞青霉素的4mLLB液体培养基中，37℃过夜培养后，用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒。取2μg质粒，用限制酶NdeI和NotI进行处理后，使用1％琼脂糖凝胶执行电泳，检测质粒的酶切产物，其结果如图4所示(泳道M2：5kbp DNA marker；泳道2：双酶切后的DNA载体)。使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段。
三、hPD-1基因的克隆
用东洋纺的Ligation high v.2将酶切后的hPD-1基因和质粒进行连接，转化大肠杆菌XL10-Gold感受态细胞，铺LB板，37℃过夜培养，挑取8个菌落执行菌簇PCR。菌簇PCR产物的琼脂糖电泳图如图5所示(泳道M3:2kbp DNA marker；泳道3-10为菌落PCR的结果；泳道11:以酶切前DNA质粒为模版的PCR结果)。3、4、5、8、9和10号菌落中的载体所含基因长度与理论值一致，挑取以上菌落，接种到4mL的LB培养基中，37℃过夜培养，用试剂盒抽提质粒后测序，选取基因序列正确的质粒用于蛋白质的表达。
四、hPD-1蛋白的表达与纯化
用测序成功的重组质粒转化表达宿主大肠杆菌株SHuffle T7 express感受态细胞，在LB平板上37℃培养14h，挑取单菌落接种到含浓度为100μg/mL氨苄青霉素的4mL LB液体培养基中，在37℃200rpm速度下过夜培养。次日，将过夜培养的新鲜菌液转接至含100μg/mL氨苄青霉素的100mL LB培养基中，30℃200rpm下继续培养至其OD600上升到0.4-0.5时，停止培养，向菌液加入IPTG并调节其浓度为0.4mmol/L，16℃200rpm下继续培养18h。
将培养18小时得到的菌液以6000×g的速度离心20分钟，收集菌体沉淀，加入含有8mmol/L Na2HPO4·12H2O、47.9mmol/L NaH2PO4·2H2O、300mmol/L氯化钠、pH7.0的缓冲液中，在冰水中以功率120W，工作时间3s，间隔时间2s的条件超声处理20分钟，静置30分钟后在4℃下，以6000×g的速度离心20分钟，收集上清液。取100μL TANLON metal affinityresin，处理后与9mL上清液于4℃条件下，在旋转混合器上以40rpm的速度混合30分钟，将上清混合液加到空纯化柱上，用8mmol/L Na2HPO4·12H2O、47.9mmol/L NaH2PO4·2H2O、300mmol/L氯化钠及5mmol/L咪唑、pH7.0的TALON洗涤缓冲液洗涤纯化柱，用8mmol/LNa2HPO4·12H2O、47.9mmol/L NaH2PO4·2H2O、300mmol/L氯化钠及500mmol/L咪唑、pH7.0的洗脱缓冲液将结合到树脂上的hPD-1蛋白洗脱，并按洗脱顺序收集样品。为检测纯化蛋白的纯度，对纯化蛋白执行SDS-PAGE。电泳结果如图6所示，其中泳道M4为蛋白Marker，泳道12为hPD-1包涵体，泳道13为纯化回收滤液，泳道14-15为回收的可溶性hPD-1蛋白。该结果显示hPD-1蛋白得到很好的纯化。
五、不溶性蛋白的复性
hPD-1在大肠杆菌中的表达多以包涵体的形式存在。为了提高产量，用8M的尿素将包涵体溶解，利用His-tag标签纯化后，通过透析处理对包涵体进行了复性。
取10mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)悬浮步骤4中离心破碎菌液所得沉淀，12,000rpm离心10min，重复三次后分离上清和沉淀(包涵体)。取25mL含20mM Tris-HCl、8M尿素、500mM氯化钠、5mM咪唑、pH 8.0的结合/洗涤缓冲液溶解包涵体，并在室温下孵育30分钟，以12,000rpm的速度离心30分钟，除去不溶物，将上清转移至一个干净的离心管中。取500lTANLON metal affinity resin，并用结合/洗涤缓冲液清洗三次，将树脂加入上清溶液，在旋转震荡仪上在4℃下混合30分钟，将含有树脂的混合液加入空纯化柱中，使混合溶液完全通过纯化柱。用5mL结合/洗涤缓冲液清洗纯化柱三次，用含20mM Tris-HCl、8M尿素、500mM氯化钠、500mM咪唑、pH 8.0的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，最后用10kD的透析膜在PBS缓冲液对收集的洗脱溶液进行透析处理，收集样品，取10微升的样品执行电泳进行分析。电泳结果如图7所示，其中泳道M4为蛋白Marker，泳道16为复性后纯化所得可溶性hPD-1蛋白。从泳道16可以看出，所得样品为单一条带，说明hPD-1得以很好的纯化。本实验中，培养100毫升的重组大肠杆菌，获得了1.28mg纯化重组hPD-1蛋白。
六、酶联免疫吸附试验检测
通过执行酶联免疫吸附试验，检测纯化hPD-1蛋白的活性。
酶联免疫吸附试验方法如图8所示(图中BSA为牛血清蛋白；hPD-1为人程序性细胞死亡因子；hPD-L1为hPD-1的配体；Niv为噬菌体展示的抗hPD-1抗体；S为酶的底物；P为酶反应底物的产物)，在酶标板上包被纯化好的hPD-1蛋白(2μg/mL)及BSA(2μg/mL)，4度下孵育过夜，次日将包被溶液倒掉，加入2％的脱脂奶粉溶液，对酶标板进行封闭。封闭2小时后洗板，每个孔内加入展示抗hPD-1抗体的噬菌体溶液，其中一组样品中同时加入hPD-L1用于阻断hPD-1与抗hPD-1抗体的结合。室温下孵育1小时后，再次洗涤酶标板，加入HRP标记的抗噬菌体抗体，室温下浮育1小时，洗板后加入底物显色，测450nm时的吸光度。
其结果如图9所示，抗hPD-1抗体与实验组(hPD-1蛋白质)及对照组(牛血清蛋白BSA)在450nm处的吸光度存在有意差异，证明hPD-1蛋白能够与hPD-1抗体结合，具有生物活性。在以上反应体系中添加hPD-L1后，其吸光度显著降低，说明本技术生产的hPD-1蛋白具有与hPD-L1结合活性。
序列表
<110> 潍坊医学院
<120> 一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1 及其生产方法和应用
<140> 201910859265X
<141> 2019-09-11
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 504
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctcaaa tcgaagtaaa ctgctctaat gagaccggtc ttgattctcc ggatcgtccg 60
tggaatccgc ctacgttttc cccggcctta ctggtcgtga ccgaaggcga caatgcgacc 120
ttcacttgca gcttcagcaa cacgagtgag tcgtttgtgc tgaactggta tcgcatgagt 180
ccctcgaacc agaccgacaa actggctgcg tttccggaag atcgcagcca accaggacag 240
gattgccgct ttcgcgtgac gcaactgccg aatggtcgcg atttccacat gagcgttgta 300
cgggcacgtc gcaacgactc aggcacctac ctgtgtggtg cgatttcgct cgctccgaaa 360
gcgcagatca aggaatccct gcgtgcagag ttgcgggtca cagaacgccg tgccgaagtt 420
cctactgccc atccgtcacc ctctccacgt ccagcagggc agtttcaggc ggccgcgggt 480
ggctcacacc atcatcacca tcat 504
<210> 2
<211> 168
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Gln Ile Glu Val Asn Cys Ser Asn Glu Thr Gly Leu Asp Ser
1 5 10 15
Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val
20 25 30
Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr
35 40 45
Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln
50 55 60
Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln
65 70 75 80
Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His
85 90 95
Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys
100 105 110
Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg
115 120 125
Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His
130 135 140
Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Ala Ala Ala Gly
145 150 155 160
Gly Ser His His His His His His
165

Claims (3)

1.一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1，其特征在于：在人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1的氮端附加了一段含有半胱氨酸的多肽，碳端含有组氨酸标签；人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1基因序列针对原核细胞表达进行了优化，基因序列为SEQ ID NO：1。
2.权利要求1所述的一种人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1的生产方法，其特征在于：包括以下步骤：
①hPD-1基因的优化及扩增：
将编码人源程序性细胞死亡因子受体蛋白25-167氨基酸的基因密码子进行优化并合成，使该蛋白质能够在大肠杆菌细胞内表达；通过设计PCR引物和执行PCR，在蛋白的氮端和碳端分别附加一段含有半胱氨酸的多肽和组氨酸标签，优化后的hPD-1基因的序列为SEQID NO：1；
合成了以下两个引物，扩增优化后的hPD-1基因：
引物1：NdeICysTagAgeIhPD1for：
5’-TATACATATGGCTCAAATCGAAGTAAACTGCTCTAATGAGACCGGTCTTGATTCTCCGG-3’及
引物2：NotIhPD-1Back：
5’-CACCCGCGGCCGCCTGAAACTGCCCTGCTGGA-3’；
以合成的目的基因片段为模板进行PCR扩增，反应体系为50微升，反应条件为：94℃变性2分钟后，94℃30秒，55℃30秒，68℃1分钟，执行聚合酶链式反应，反应30个循环后，用1％琼脂糖凝胶执行电泳，检测PCR产物并回收目的基因片段；
②用于克隆hPD-1基因的DNA质粒的准备
用质粒原液转化大肠杆菌XL10-Gold，涂LB平板，过夜培养，挑取单克隆菌落，4毫升37℃过夜培养后，抽提质粒，用NdeI和NotI进行处理，用1％琼脂糖凝胶执行电泳，检测质粒的酶切产物并回收目的基因片段；
③hPD-1基因的克隆
使用TOYOBO的Ligation high v.2将酶切后的hPD-1基因和酶切后的质粒进行连接，得到重组质粒后将其导入大肠杆菌细胞XL10-Gold中，铺LB板，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落进行菌簇PCR；挑选菌落PCR产物长度符合预期的菌落，37℃过夜培养，抽提质粒后测序，选取基因序列正确的质粒用于表达蛋白质；
④hPD-1蛋白的表达与纯化
用构建成功的重组质粒转化宿主大肠杆菌株SHuffle T7 express感受态细胞，在LB培养基平板上37℃放置14h，挑取单菌落接种到含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素的4mL LB液体培养基中，以200rpm的速度37℃过夜培养，次日将过夜培养的菌液转接至含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的100mL LB培养基中，30℃200rpm，继续培养3h，测定其吸光度值，当OD600到0.4和0.5之间时，停止培养，向菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷，使其终浓度为0.4mmol/L，16℃200rpm，培养18到20h；
将培养得到的菌液6000×g离心20min，收集菌液沉淀，加入含有8mmol/L Na2HPO4·12H2O、47.9mmol/L NaH2PO4·2H2O、300mmol/L氯化钠、pH7.0的TALON缓冲液中，在冰水下进行功率为120W，工作时间为3s，间隔时间为2s的超声处理20min，静置30min后，在4℃下进行6000×g，20min的离心，收集上清液；取100μL TALON Metal Affinity Resin与9mL上清液于4℃条件用摇床在40rpm的速度下结合30分钟后，将上清混合液加入到重力纯化柱，用8mmol/L Na2HPO4·12H2O、47.9mmol/L NaH2PO4·2H2O、300mmol/L氯化钠及5mmol/L咪唑、pH7.0的TALON洗涤缓冲液洗涤纯化柱后，用8mmol/L Na2HPO4·12H2O、47.9mmol/LNaH2PO4·2H2O、300mmol/L氯化钠及500mmol/L咪唑、pH7.0的洗脱缓冲液将特异性结合的hPD-1蛋白洗脱，按洗脱顺序收集样品，对纯化蛋白执行聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测纯化蛋白的纯度及含量；
⑤不溶性蛋白的复性
取10mL磷酸缓冲盐溶液悬浮步骤4中离心超声破碎菌液所得沉淀，12,000rpm离心10min，重复三次后分离上清和沉淀；取25mL含20mM Tris-HCl、8M尿素、500mM氯化钠、5mM咪唑、pH8.0的结合/洗涤缓冲液溶解包涵体，并在室温下孵育30min，12,000rpm离心30min后除去剩余的不溶物，将上清转移至干净的离心管，加入500μL平衡后的TALON MetalAffinity Resin，4℃下在旋转震荡仪上与上清溶液混合30min，将含有树脂的混合液加入到平衡后的纯化柱中，用5mL结合/洗涤缓冲液清洗纯化柱三次，用含20mM Tris-HCl、8M尿素、500mM氯化钠、500mM咪唑、pH8.0的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；最后用10kD的透析膜在PBS缓冲液中进行透析处理，取样并执行电泳验证纯化结果，得到人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1。
3.权利要求1所述人源程序性细胞死亡因子受体蛋白-1的应用，其特征在于：在制备免疫检测药物及抗体药物中的应用。
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