JPS6214795A - 蛋白質及びポリペプチドの製造法 - Google Patents
蛋白質及びポリペプチドの製造法Info
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- JPS6214795A JPS6214795A JP61154269A JP15426986A JPS6214795A JP S6214795 A JPS6214795 A JP S6214795A JP 61154269 A JP61154269 A JP 61154269A JP 15426986 A JP15426986 A JP 15426986A JP S6214795 A JPS6214795 A JP S6214795A
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- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生物特異的蛋白質又はポリペプチドｆＩ）、及
び製造する目的の蛋白質又は標識蛋白質であるもう１個
の蛋白質（ＩＩ）を指定する夫々のＤＮＡ配列を一諸に
クローン化し、これら２個１個又はそれ以上のアミノ酸
を含む短鎖にグテド＋ｍ）を指定するＤＮＡ配列を間に
挟んで結合させることによる蛋白質の製造法に関する。
び製造する目的の蛋白質又は標識蛋白質であるもう１個
の蛋白質（ＩＩ）を指定する夫々のＤＮＡ配列を一諸に
クローン化し、これら２個１個又はそれ以上のアミノ酸
を含む短鎖にグテド＋ｍ）を指定するＤＮＡ配列を間に
挟んで結合させることによる蛋白質の製造法に関する。
この新規なＤＮＡ断片は、適当な遺伝子操作によって、
宿主生物に導入し、転写、翻訳及び発現を行なわせろ。
宿主生物に導入し、転写、翻訳及び発現を行なわせろ。
この様にして得られた組合わせ蛋白質はアフイニテイク
ロマトグラフイばよって精製し、酵素によって開裂する
。
ロマトグラフイばよって精製し、酵素によって開裂する
。
蛋白質の邊伝子工学的製造法に於ては、常に多数の物質
の中から発現蛋白質を純粋な形で単離することが問題に
なる。
の中から発現蛋白質を純粋な形で単離することが問題に
なる。
蛋白質及びポリペプチドを所謂標識蛋白質を用いて一緒
にクローン化することは公知である。これら標識蛋白質
は、目的とする蛋白質又はポリペプチドの発現を可能な
らしめ、そして発現生成物の検出を容易にする役目を有
する。この様な場合、標識蛋白質と目的蛋白質との結合
はアミノ酸の１種メチ、□％を経由して起こる。この場
合は、臭化シアンを使用すると、容易に切断する。併し
、この方法は、メチテラを含む全ての結合を切断する、
即ち目的の蛋白質が１箇所又はそれ以上の位置にメチメ
３を含んでいると、この切断によって破壊されてしまう
のが欠点である。
にクローン化することは公知である。これら標識蛋白質
は、目的とする蛋白質又はポリペプチドの発現を可能な
らしめ、そして発現生成物の検出を容易にする役目を有
する。この様な場合、標識蛋白質と目的蛋白質との結合
はアミノ酸の１種メチ、□％を経由して起こる。この場
合は、臭化シアンを使用すると、容易に切断する。併し
、この方法は、メチテラを含む全ての結合を切断する、
即ち目的の蛋白質が１箇所又はそれ以上の位置にメチメ
３を含んでいると、この切断によって破壊されてしまう
のが欠点である。
本発明は、遺伝子工学による製造を非常に単純化して、
蛋白質及びポリペプチドを得る方法を与えた。
蛋白質及びポリペプチドを得る方法を与えた。
即ち、本発明は、
α） 生物特異的蛋白質又はポリペプチドＣＩ）を指定
するＤＮＡ配列と、製造目的の蛋白質か、 ′
又は標識蛋白質であるもう１個の蛋白質（ＴＩ
）を指定するＤＮＡ配列とを、切断部位を特定する短鎖
ペプチド（ＴＩＩ）を指定するＤＮＡ配列を挟んで結合
し、 ｂ） このようにして得られた新規なＤＮＡ断片を、適
切な遺伝子操作によって宿主生物の１Ｊ Ｎ Ａ中に、
クローン化ＤＮＡ配列に相当する数種のペプチドからな
る組合わせ蛋白質の発現を実行出来る様な方法で導入し
。
するＤＮＡ配列と、製造目的の蛋白質か、 ′
又は標識蛋白質であるもう１個の蛋白質（ＴＩ
）を指定するＤＮＡ配列とを、切断部位を特定する短鎖
ペプチド（ＴＩＩ）を指定するＤＮＡ配列を挟んで結合
し、 ｂ） このようにして得られた新規なＤＮＡ断片を、適
切な遺伝子操作によって宿主生物の１Ｊ Ｎ Ａ中に、
クローン化ＤＮＡ配列に相当する数種のペプチドからな
る組合わせ蛋白質の発現を実行出来る様な方法で導入し
。
Ｃ） 宿主生物が絹合わせ蛋白質を生成するように培養
し、 ｄ） 得られた培養系の、組合わせ蛋白質を含む画分を
、適当に他の成分を除去してから、上記の生物特異的蛋
白質又はポリペプチドに対して相補的であり、そして反
応条件下に担体と強力に結合する物質が結合している適
当な担体材料からなる固定系に接触させ、 ６） 組合わせ蛋白質が結合した固定系を、適当な方法
で他の成分から分離し、１個又はそれ以上の酵素を使用
して特異的に開裂させ、ｆ） 上記生物特異的蛋白質又
はポリペプチド（Ｉ）を蛋白質（ＩＩ）から分離して、
特定の目的物質を得る蛋白質の製造方法に於て、短鎖ペ
プチドｔｍ）が切断配列に加えて、更に１個又はそれ以
上の、切断特異性及び／又は切断速度を増加させるアミ
ノ酸を含むことを特徴とする蛋白質の製造法に関する。
し、 ｄ） 得られた培養系の、組合わせ蛋白質を含む画分を
、適当に他の成分を除去してから、上記の生物特異的蛋
白質又はポリペプチドに対して相補的であり、そして反
応条件下に担体と強力に結合する物質が結合している適
当な担体材料からなる固定系に接触させ、 ６） 組合わせ蛋白質が結合した固定系を、適当な方法
で他の成分から分離し、１個又はそれ以上の酵素を使用
して特異的に開裂させ、ｆ） 上記生物特異的蛋白質又
はポリペプチド（Ｉ）を蛋白質（ＩＩ）から分離して、
特定の目的物質を得る蛋白質の製造方法に於て、短鎖ペ
プチドｔｍ）が切断配列に加えて、更に１個又はそれ以
上の、切断特異性及び／又は切断速度を増加させるアミ
ノ酸を含むことを特徴とする蛋白質の製造法に関する。
切断配列は、蛋白分解酵素によって特異的に認識され同
酵素によって加水分解的に切断されるアミノ酸配列であ
る。同切断配列は、分断予定部位（ｉｎｔｇｎｄｔｒＬ
ｆｒａｇｍｅｎｔαｔｉｏｎ ｚｉｔａ ）とし
て機能する。本発明では、特定切断部位を認識し、同部
位を切断出来る酵素は全て使用することが出来る。カリ
クレインが、加水分解酵素として好ましく使用される。
酵素によって加水分解的に切断されるアミノ酸配列であ
る。同切断配列は、分断予定部位（ｉｎｔｇｎｄｔｒＬ
ｆｒａｇｍｅｎｔαｔｉｏｎ ｚｉｔａ ）とし
て機能する。本発明では、特定切断部位を認識し、同部
位を切断出来る酵素は全て使用することが出来る。カリ
クレインが、加水分解酵素として好ましく使用される。
対応する切断配列は、カリノン又はその誘導体である。
組合わせ蛋白質の切断に酵素を列用することは大きな進
歩である。酵素利用はその基質特異性の故に、高度に特
異的な切断に特に適している。更に生物特異的蛋白質又
はぼりペプチド（Ｉ）のクローン化及びその発現によシ
、他の蛋白質から発現生成物を分離することを容易にす
ることが出来る。酵素が認識できる切断配列を、生物特
異的蛋白質又はポリペプチド（Ｉ）と目的の又は標識蛋
白質であるもう１個の蛋白質（ＩＩ）との間に挿入する
には、切断用酵素の使用が必須である。この切断配列に
加えて、１個又はそれ以上のアミノ酸を挿入すると、切
断特異性及び／又は切断速度はかなり大きく増加させる
ことが出来る。本発明の方法は、生物特異的蛋白質又は
ポリペプチド（Ｉ）と共にクローン化し、発現した蛋白
質（ＩＩ）を製造するのに、又は生物特異的蛋白質又は
ポリペプチド（Ｉ）を製造するのに適しているだけでな
く、同時にその両者を製造するのにも適している。結合
者として作用するクローン化ペプチド＋Ｉｎ）のアミノ
酸配列は、目的生成物によって決められる。
歩である。酵素利用はその基質特異性の故に、高度に特
異的な切断に特に適している。更に生物特異的蛋白質又
はぼりペプチド（Ｉ）のクローン化及びその発現によシ
、他の蛋白質から発現生成物を分離することを容易にす
ることが出来る。酵素が認識できる切断配列を、生物特
異的蛋白質又はポリペプチド（Ｉ）と目的の又は標識蛋
白質であるもう１個の蛋白質（ＩＩ）との間に挿入する
には、切断用酵素の使用が必須である。この切断配列に
加えて、１個又はそれ以上のアミノ酸を挿入すると、切
断特異性及び／又は切断速度はかなり大きく増加させる
ことが出来る。本発明の方法は、生物特異的蛋白質又は
ポリペプチド（Ｉ）と共にクローン化し、発現した蛋白
質（ＩＩ）を製造するのに、又は生物特異的蛋白質又は
ポリペプチド（Ｉ）を製造するのに適しているだけでな
く、同時にその両者を製造するのにも適している。結合
者として作用するクローン化ペプチド＋Ｉｎ）のアミノ
酸配列は、目的生成物によって決められる。
本発明の原理を、下記にカリクレインを切断部として使
用し、カリノンを切断配列とした例について図示した。
用し、カリノンを切断配列とした例について図示した。
此処では、生物特異的ポリペプチドはアブロトニンであ
り、相補物質（ｃｏｍｐＬｅ−ｒｎｅｎｔａｒｙ ｚ
ｗｂｚｔαｎｃｔ ） であるトリプシンと強力に結
合することが出来る。
り、相補物質（ｃｏｍｐＬｅ−ｒｎｅｎｔａｒｙ ｚ
ｗｂｚｔαｎｃｔ ） であるトリプシンと強力に結
合することが出来る。
カリクレインは、その天然産基質である天然型キニノケ
°ンを同時に２箇所で速い反応速度で切断し、デカペプ
チド、カリノンを生成スる。
°ンを同時に２箇所で速い反応速度で切断し、デカペプ
チド、カリノンを生成スる。
キニノｒン配列
一−−５ｅｔ−ＬｅｔＬ−Ｍｅｔ−Ｌｙｅ−Ａｒｔｌ−
Ｐｒｏ−Ｐ↑ 一−−−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ、−Ｍａｔ−ＯＨＩＩ −Ｌｙ
ｚ−Ａｒｇ−Ｐｒ ｏ −Ｐｒカリジン（デカ被プチ
ド、中 ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−５ｔｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒ
ｇ−５ｔｒ−↑ ＶａＬ−ＧｌｒＬ−一−− Ｈ−Ｓｇｒ−ＶａＬ−Ｇｌｎ−−−− ｏ−ＧＬｙ−Ｐｈｅ−５ｔｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−ＯＨ間４プテド） 切断部位にある程度近い部分のアミノ酸配列はカリクレ
インによる切断効率を高める上で重要である。
Ｐｒｏ−Ｐ↑ 一−−−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ、−Ｍａｔ−ＯＨＩＩ −Ｌｙ
ｚ−Ａｒｇ−Ｐｒ ｏ −Ｐｒカリジン（デカ被プチ
ド、中 ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−５ｔｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒ
ｇ−５ｔｒ−↑ ＶａＬ−ＧｌｒＬ−一−− Ｈ−Ｓｇｒ−ＶａＬ−Ｇｌｎ−−−− ｏ−ＧＬｙ−Ｐｈｅ−５ｔｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−ＯＨ間４プテド） 切断部位にある程度近い部分のアミノ酸配列はカリクレ
インによる切断効率を高める上で重要である。
カリクレインによる切断効率、即ちその特異性及び速度
が、生物特異性−ＩＪ ｄゾチドのアプロチニンと、短
鎖ペグチドであるカリソンとの間に、更に、その配列が
切断部イ五に於けるキニノｒン配列に対応するか又は類
似しているトリペプチドを挿入することによって増進さ
せることが出来ることが発見された。
が、生物特異性−ＩＪ ｄゾチドのアプロチニンと、短
鎖ペグチドであるカリソンとの間に、更に、その配列が
切断部イ五に於けるキニノｒン配列に対応するか又は類
似しているトリペプチドを挿入することによって増進さ
せることが出来ることが発見された。
適切なトリペプチドを挿入する時は、アプロチニンはカ
リヅンのＣ−末端又はＮ−末端の何れにも結合出来るの
で、２ｓ類の組合わせ蛋白質の生成が可能である。得ら
れる融合蛋白質は、下記の様になる。
リヅンのＣ−末端又はＮ−末端の何れにも結合出来るの
で、２ｓ類の組合わせ蛋白質の生成が可能である。得ら
れる融合蛋白質は、下記の様になる。
この例では、
α） アプロチニンを指定するＤＮＡ配列、トリペプチ
ド、Ｈ−Ａ、−Ａ、−Ａ、−ＯＭ、好ましくけＨ−５ｔ
ｒ−ＬａｔＬ−Ｍａｔ −ＯＨを指定するＤＮＡ配列、
カリソンを指定するＤＮＡ配５ｔｒ−ＶａＬ −ＧＬｎ
−ＯＨを指定するＤＮＡ配列、及びアプロチニンを指定
するＤＮＡ配列を、挙げた順序に結合し、 ｈ） このようにして得た新規なＤＮＡ断片を、適当な
遺伝子操作によって宿主生物のＤＮＡ中に、クローン化
された各ＤＮＡ配列に相当する蛋白質からなる組合わせ
蛋白質が発現出来るような方法で導入し、 Ｃ） 宿主生物が組合わせ蛋白質を生成するように培養
し、 ｄ） 培養系の組合わせ蛋白質を含む画分を、もし適当
ならば、他の成分を除いてから、適当な担体物質と、そ
れに結合しており、生物特異性ポリペプチドであるアプ
ロチニンに対して相補関係に有り１反応条件下ではアプ
ロチニンに強力に結合する物質とからなる固定化系と接
触させ、−） 組合わせ蛋白質の結合した固定化系は、
他の成分から適当な方法で分離し、次いで結合している
組合わせ蛋白質から特異的にカリソンを解離するカリク
レインで処理し、そして ｆ） この方法で遊離した目的蛋白質は、適当な方法で
他の成分から分離して得る、工程の何れをも含む新規な
蛋白質製造法を説明したものである。
ド、Ｈ−Ａ、−Ａ、−Ａ、−ＯＭ、好ましくけＨ−５ｔ
ｒ−ＬａｔＬ−Ｍａｔ −ＯＨを指定するＤＮＡ配列、
カリソンを指定するＤＮＡ配５ｔｒ−ＶａＬ −ＧＬｎ
−ＯＨを指定するＤＮＡ配列、及びアプロチニンを指定
するＤＮＡ配列を、挙げた順序に結合し、 ｈ） このようにして得た新規なＤＮＡ断片を、適当な
遺伝子操作によって宿主生物のＤＮＡ中に、クローン化
された各ＤＮＡ配列に相当する蛋白質からなる組合わせ
蛋白質が発現出来るような方法で導入し、 Ｃ） 宿主生物が組合わせ蛋白質を生成するように培養
し、 ｄ） 培養系の組合わせ蛋白質を含む画分を、もし適当
ならば、他の成分を除いてから、適当な担体物質と、そ
れに結合しており、生物特異性ポリペプチドであるアプ
ロチニンに対して相補関係に有り１反応条件下ではアプ
ロチニンに強力に結合する物質とからなる固定化系と接
触させ、−） 組合わせ蛋白質の結合した固定化系は、
他の成分から適当な方法で分離し、次いで結合している
組合わせ蛋白質から特異的にカリソンを解離するカリク
レインで処理し、そして ｆ） この方法で遊離した目的蛋白質は、適当な方法で
他の成分から分離して得る、工程の何れをも含む新規な
蛋白質製造法を説明したものである。
この例によって説明した本発明は、カリクレインによる
融合蛋白質の切断特異性を向上させるものである。挿入
されたトリペプチドによってカリソンとアプロチニンと
の間の切断部位は、カリクレインにとって理想的になる
。カリソンと目的蛋白質との間の切断部位の運営さは、
２種類のクローン化の中のどの場合を選ぶかによって決
る。もしカリクレインによる組合わせ蛋白質の切断に、
目的蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列の辱うか目的蛋白質
のＣ−末端アミノ酸配列より、効果的に適しているので
あれば、上に示したように、クローン化は、Ａの場合が
勧められるし、その反応の場合には、Ｂの場合が良い。
融合蛋白質の切断特異性を向上させるものである。挿入
されたトリペプチドによってカリソンとアプロチニンと
の間の切断部位は、カリクレインにとって理想的になる
。カリソンと目的蛋白質との間の切断部位の運営さは、
２種類のクローン化の中のどの場合を選ぶかによって決
る。もしカリクレインによる組合わせ蛋白質の切断に、
目的蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列の辱うか目的蛋白質
のＣ−末端アミノ酸配列より、効果的に適しているので
あれば、上に示したように、クローン化は、Ａの場合が
勧められるし、その反応の場合には、Ｂの場合が良い。
斯くして、Ｃ−末端クローン化とＮ−末端クローン化の
いずれを選択するかの方案は、目的蛋白質のアミノ酸配
列が、カリクレインによる切断予定部位に対してどちら
がより好都合であるかによって決められる。
いずれを選択するかの方案は、目的蛋白質のアミノ酸配
列が、カリクレインによる切断予定部位に対してどちら
がより好都合であるかによって決められる。
この例では、クローン化されたアプロチニンは担体、及
び生物特異的相補体と結合し、担体とそれに結合してい
る組合わせ蛋白質の両者を媒体中の他の成分から分離す
る働きを有する−この為には、アプロチニン／補体物質
系は適用される反応条件下で強力に結合していることが
要求される。
び生物特異的相補体と結合し、担体とそれに結合してい
る組合わせ蛋白質の両者を媒体中の他の成分から分離す
る働きを有する−この為には、アプロチニン／補体物質
系は適用される反応条件下で強力に結合していることが
要求される。
生物学的に活性なポリペプチド例えば酵素は。
生物学的に活性な相補体と例えば抑制剤と結合し、例え
ば酵素−抑制剤錯体を形成することが出来る。
ば酵素−抑制剤錯体を形成することが出来る。
生物特異的に形成されたこの種の酵素−抑制剤錯体は、
高い結合親和性を有する。従ってそれらの解離定数は低
い。
高い結合親和性を有する。従ってそれらの解離定数は低
い。
例えば１本発明で好ましいものとして挙げられる、酵素
のトリプシンとその酵素抑制剤であるアプロチニンとか
ら形成されるトリプシンーアプロチニン鎖体がある。
のトリプシンとその酵素抑制剤であるアプロチニンとか
ら形成されるトリプシンーアプロチニン鎖体がある。
この錯体の解離定数Ｋｉは僅かに６Ｘ １ （１−１１
ｍ ｏ ｌ ／ ｌ （ｐＨ＝ａＯ１Ｔ＝２５℃）であ
り、錯体生成速度ｔ は６．５秒である。従って、
Ｉ／！ トリプシンーアプロチニン錯体は、非常に速い速度で生
成され、適用条件下では非常に安定である。
ｍ ｏ ｌ ／ ｌ （ｐＨ＝ａＯ１Ｔ＝２５℃）であ
り、錯体生成速度ｔ は６．５秒である。従って、
Ｉ／！ トリプシンーアプロチニン錯体は、非常に速い速度で生
成され、適用条件下では非常に安定である。
但し、トリプシン−アプロチニン錯体の安定性は、溶液
のＰＨによって変化し、ｐＨが下がるほど低下する。約
２．０のｐＨでは、トリプシン−アプロチニン錯体は、
はぼ完全に解離する。この挙動は、本発明の観点からは
、この方法によって担体に結合した相補体を容易に再生
出来るので特に望ましい。又生物特異的、４１Ｊペプチ
ドと担体に結合してい、？）相補体との間の結合生成速
度も高く、これも望ましい。この様にして、担体に結合
している相補体が組合わせポリベグテド上の他の位置と
結合しようとする競争反応を減少させることが可能とな
る。
のＰＨによって変化し、ｐＨが下がるほど低下する。約
２．０のｐＨでは、トリプシン−アプロチニン錯体は、
はぼ完全に解離する。この挙動は、本発明の観点からは
、この方法によって担体に結合した相補体を容易に再生
出来るので特に望ましい。又生物特異的、４１Ｊペプチ
ドと担体に結合してい、？）相補体との間の結合生成速
度も高く、これも望ましい。この様にして、担体に結合
している相補体が組合わせポリベグテド上の他の位置と
結合しようとする競争反応を減少させることが可能とな
る。
生物特異的吸着は、好ましくは水に不溶であり、そして
それに生物特異的相補体が結合している担体を使用して
実施する。この両者の結合は公知の固定化方法で、中間
分子をその間に挟むか、又は挟まずに直接実施すること
が出来る。
それに生物特異的相補体が結合している担体を使用して
実施する。この両者の結合は公知の固定化方法で、中間
分子をその間に挟むか、又は挟まずに直接実施すること
が出来る。
上記成分のＤＮＡ配列は遺伝子工学によってクローン化
出来、こうして得られたＤＮＡは宿主生物中に例えばシ
ラスミドの中に、遺伝子操作によって転移される。適当
な微生物が宿主生物として使用することが出来、例えば
細菌、寿に大腸菌（Ｅ、ｃｏＬｉ ）並びに枯草菌（Ｂ
ａｃ、ｚｗｈｔｉ−Ｌｉｓ ）又は酵母が挙げられる。
出来、こうして得られたＤＮＡは宿主生物中に例えばシ
ラスミドの中に、遺伝子操作によって転移される。適当
な微生物が宿主生物として使用することが出来、例えば
細菌、寿に大腸菌（Ｅ、ｃｏＬｉ ）並びに枯草菌（Ｂ
ａｃ、ｚｗｈｔｉ−Ｌｉｓ ）又は酵母が挙げられる。
クローン化ＤＮＡの発現は、この微生物を培養している
間に起こる。
間に起こる。
もしクローン化ペプチドを含む目的蛋白質が、発酵溶液
中に存在するならば、例えば遠心法又は交差流濾過法（
ｃｒｏｓｓ−ｆＬｏｙｕ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に
よって細胞を除き、培養炉液から分離する。もしクロー
ン化ペプチドを含む目的蛋白質が細胞それ自体の中に存
在するならば、細胞を分離し、破壊しそして破壊した細
胞の破片を除く。培養ヂ液又は細胞抽出液は、目的のク
ローン化、組合わせ蛋白質を含むだけでなく、多くの他
の蛋白質並びに栄養媒体中の付着成分（ａｄｈｅｒｅｒ
Ｌｔ ｃｏｒＬｚ−ｔｉｔｕｇｎｔＳ ）＾む。目的
組合わせ蛋白質は、この複雑な組成物溶液から単離され
、そして精製される。これは、生物特異的相補物質の結
合した担体、例えば固定化トリプシンを培養Ｆ液に加え
るか又は抽出によって実施する。各成分の水不溶性錯体
、即ち担体＋生物特異的相補物質十組合わせ蛋白質の生
成は、高い生成速度で直ちに進行する。
中に存在するならば、例えば遠心法又は交差流濾過法（
ｃｒｏｓｓ−ｆＬｏｙｕ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に
よって細胞を除き、培養炉液から分離する。もしクロー
ン化ペプチドを含む目的蛋白質が細胞それ自体の中に存
在するならば、細胞を分離し、破壊しそして破壊した細
胞の破片を除く。培養ヂ液又は細胞抽出液は、目的のク
ローン化、組合わせ蛋白質を含むだけでなく、多くの他
の蛋白質並びに栄養媒体中の付着成分（ａｄｈｅｒｅｒ
Ｌｔ ｃｏｒＬｚ−ｔｉｔｕｇｎｔＳ ）＾む。目的
組合わせ蛋白質は、この複雑な組成物溶液から単離され
、そして精製される。これは、生物特異的相補物質の結
合した担体、例えば固定化トリプシンを培養Ｆ液に加え
るか又は抽出によって実施する。各成分の水不溶性錯体
、即ち担体＋生物特異的相補物質十組合わせ蛋白質の生
成は、高い生成速度で直ちに進行する。
生物特異的相補物質が結合した担体の添加は、室温で、
あるいは錯体生成速度が速い場合には、低温で例えば＋
２℃で行なうことが出来る。水不溶錯体は発酵溶液の他
の成分から、そして他の全ての不純物から直接簡単に濾
過して分離することが出来る。
あるいは錯体生成速度が速い場合には、低温で例えば＋
２℃で行なうことが出来る。水不溶錯体は発酵溶液の他
の成分から、そして他の全ての不純物から直接簡単に濾
過して分離することが出来る。
もし、蛋白分解酵素、例えばトリプシンを生物特異的相
補物質として使用した時は、発酵溶液に添加する前に、
これを低分子１：の阻害剤で飽和させることが出来る。
補物質として使用した時は、発酵溶液に添加する前に、
これを低分子１：の阻害剤で飽和させることが出来る。
但し、低分子量阻害剤の解離定数は、アプロチニンの解
離定数よりも大きくなければならない。解離定数が異な
るので、低分子量阻害剤は、発酵溶液に添加されると、
生物特異的蛋白質から引き離される。担体結合トリプシ
ンに使用出来る低分子量阻害剤としては、例えば解離定
数１ａ×１ａ−６ｍｏｌ／ｌのベンズアミノン又は解離
定数７２×１Ｏ−６７７Ｌ０１／ｌのフェニルグアニソ
ンがある。
離定数よりも大きくなければならない。解離定数が異な
るので、低分子量阻害剤は、発酵溶液に添加されると、
生物特異的蛋白質から引き離される。担体結合トリプシ
ンに使用出来る低分子量阻害剤としては、例えば解離定
数１ａ×１ａ−６ｍｏｌ／ｌのベンズアミノン又は解離
定数７２×１Ｏ−６７７Ｌ０１／ｌのフェニルグアニソ
ンがある。
あるいは又、担体に結合した生物特異的相補物質は、カ
ラムに充填させることが出来る。培養温液又は細胞抽出
液はこのカラムの中を通過させる。
ラムに充填させることが出来る。培養温液又は細胞抽出
液はこのカラムの中を通過させる。
この場合、目的の組合わせ蛋白質だけが、生物特異的ポ
リペプチドを挟んで固体担体に結合し、一方他の全ての
蛋白質及び全ての不純物は、カラムを通過する。担体に
結合している生物特異的相補ポリペプチドは、結合する
錯体で出来るだけ完全に飽和させるべきである。残りの
付着不純物は。
リペプチドを挟んで固体担体に結合し、一方他の全ての
蛋白質及び全ての不純物は、カラムを通過する。担体に
結合している生物特異的相補ポリペプチドは、結合する
錯体で出来るだけ完全に飽和させるべきである。残りの
付着不純物は。
カラムから緩衝溶液で洗浄するか、又はその他の適当な
溶液で洗浄して除去することが出来る。錯体生成速度が
高い時は、低温でカラムに供給することも可能である。
溶液で洗浄して除去することが出来る。錯体生成速度が
高い時は、低温でカラムに供給することも可能である。
最後に、担体に結合している組合わせ蛋白質は、特定酵
素、例えばカリノン中の４プチド結合だけを切断するカ
リクレインを作用させて切断する。
素、例えばカリノン中の４プチド結合だけを切断するカ
リクレインを作用させて切断する。
目的蛋白質は、カリノンと共に溶出され、カリノンから
は公知の方法、例えばモレキュラーシープクロマトグラ
フィーによって分ｊ雅することが出来る。こうして得ら
れた目的蛋白質は、純粋である。組合わせ蛋白質中に分
断予定部位として短鎖ペプチドを挿入すると、切断後に
、一般的には高分子址の目的蛋白質を、少さな短鎖ペプ
チドから分離するのが容易になシ、有利である。
は公知の方法、例えばモレキュラーシープクロマトグラ
フィーによって分ｊ雅することが出来る。こうして得ら
れた目的蛋白質は、純粋である。組合わせ蛋白質中に分
断予定部位として短鎖ペプチドを挿入すると、切断後に
、一般的には高分子址の目的蛋白質を、少さな短鎖ペプ
チドから分離するのが容易になシ、有利である。
溶出条件下では、アプロチニン及びそれに結合している
トリペプチドは相補物質を経由して結合り、で残る。例
えば緩衝溶液のｐＨを変えるだけで、例えばｐＨを２〜
３にして、アプロチニン及び結合しているトリペプチド
を離し、カラムから洗い出す。カラムは、更に洗浄して
から、緩衝溶液を用いて適当なｐＨに、例えばトリジシ
ン／アプロチニンを使用した際は、ｐＨ８，，０に調整
して別の実験に再利用出来る。
トリペプチドは相補物質を経由して結合り、で残る。例
えば緩衝溶液のｐＨを変えるだけで、例えばｐＨを２〜
３にして、アプロチニン及び結合しているトリペプチド
を離し、カラムから洗い出す。カラムは、更に洗浄して
から、緩衝溶液を用いて適当なｐＨに、例えばトリジシ
ン／アプロチニンを使用した際は、ｐＨ８，，０に調整
して別の実験に再利用出来る。
第１図及び第２図は、本発明の方法を図式で表したもの
である。
である。
上で説明した方法で、トリペプチドの代りにソペプテド
又はテトラペプチドを使用することも可能である。
又はテトラペプチドを使用することも可能である。
既に示したように、本発明の方法は生物特異的蛋白質又
はポリペプチド（Ｉ）の製造にも使用することが出来る
。
はポリペプチド（Ｉ）の製造にも使用することが出来る
。
この場合について、アプロチニン製造を例として詳しく
説明する。
説明する。
即ち、アプロチニン又はアプロチニン誘導体の製造法は
α） アプロチニン又はアプロチニン誘導体を指定する
ＤＮＡ配列、カリノンを指定するＤＮＡ配列、トリペプ
チド１ｌ−Ａ１’−、（２’ −Ａ２’−０１１、好ま
しくはｌｌ−５ＥＲ−Ｖａｎ−ＧＬｎ−ＯＩＩを指定す
るＤＮＡ配列及び標識蛋白質を指定するＤＮＡ配列を挙
げた顆序に結合し、ｈ） こうして得られたＤＮＡ断片
を適当な遺伝子操作によって宿主生物のＤＮＡ中に、ク
ローン化ＤＮＡ配列に対応する幾つかのペプチドからな
る組合わせ蛋白質の発現が実施出来るように導入し、 Ｃ） 宿主生物を組合わせ蛋白質が生成するように培養
し、 ｄ） 培養系の組合わせ蛋白質を含む画分を、もし適当
ならば他の成分を除去してから、適当な担体物質と、そ
れと結合し、アプロチニン又はアプロチニン誘導体に対
して相補の関係にあり、そして適用される反応条件下で
はこれらと強力に結合する物質とからなる固定化系と接
触させ、ｅ） 組合わせ蛋白の結合している固定化系を
、適当な方法で他の成分から分離し、結合した’ｌ’ｌ
！、 ”ｌ’Ｆわせ蛋白質からカリノンを特異的に脱離
させるカリクレインで処理し。
ＤＮＡ配列、カリノンを指定するＤＮＡ配列、トリペプ
チド１ｌ−Ａ１’−、（２’ −Ａ２’−０１１、好ま
しくはｌｌ−５ＥＲ−Ｖａｎ−ＧＬｎ−ＯＩＩを指定す
るＤＮＡ配列及び標識蛋白質を指定するＤＮＡ配列を挙
げた顆序に結合し、ｈ） こうして得られたＤＮＡ断片
を適当な遺伝子操作によって宿主生物のＤＮＡ中に、ク
ローン化ＤＮＡ配列に対応する幾つかのペプチドからな
る組合わせ蛋白質の発現が実施出来るように導入し、 Ｃ） 宿主生物を組合わせ蛋白質が生成するように培養
し、 ｄ） 培養系の組合わせ蛋白質を含む画分を、もし適当
ならば他の成分を除去してから、適当な担体物質と、そ
れと結合し、アプロチニン又はアプロチニン誘導体に対
して相補の関係にあり、そして適用される反応条件下で
はこれらと強力に結合する物質とからなる固定化系と接
触させ、ｅ） 組合わせ蛋白の結合している固定化系を
、適当な方法で他の成分から分離し、結合した’ｌ’ｌ
！、 ”ｌ’Ｆわせ蛋白質からカリノンを特異的に脱離
させるカリクレインで処理し。
ｆ） 組合わせ蛋白質の遊離した成分を適当な方法でア
プロチニン又はアプロチニン誘導体だけが結合している
固定化系から分離し、そしてｇ） アプロチニン及びア
プロチニン誘導体を固定化系から適当な溶出方法で分離
して得る、工程から成る。
プロチニン又はアプロチニン誘導体だけが結合している
固定化系から分離し、そしてｇ） アプロチニン及びア
プロチニン誘導体を固定化系から適当な溶出方法で分離
して得る、工程から成る。
アプロチニン及びアプロチニン誘導体は、Ｅ。
ｃａｄｉの細胞中で、不融合蛋白質として比較的大量に
発現させることは不可能である。融合蛋白質の形で、例
えばＣ−末端又はＮ−末端での酵素、例えばβ−がラク
トシダーゼとの融合の形でのみ大量の発現が可能になる
。融合の後は、目的のアプロチニンを不要な融合相手か
ら分離する問題が起こって来る。
発現させることは不可能である。融合蛋白質の形で、例
えばＣ−末端又はＮ−末端での酵素、例えばβ−がラク
トシダーゼとの融合の形でのみ大量の発現が可能になる
。融合の後は、目的のアプロチニンを不要な融合相手か
ら分離する問題が起こって来る。
アプロチニンを他の蛋白質と、結合、花としてのメチオ
ニンを挟んで直接融合するのは、この融合位置でのＢ
ｒ Ｃ’ Ｎ切断によってアプロチニンのアミノ酸配列
の５２番目の位置にあるメチオニン基が切断され、アプ
ロチニンが分解されるので、実際的ではない。５２番目
に別のアミノ酸を有するアプロチニン誘導体だけがＢｒ
ＣＮ切断法に適している。
ニンを挟んで直接融合するのは、この融合位置でのＢ
ｒ Ｃ’ Ｎ切断によってアプロチニンのアミノ酸配列
の５２番目の位置にあるメチオニン基が切断され、アプ
ロチニンが分解されるので、実際的ではない。５２番目
に別のアミノ酸を有するアプロチニン誘導体だけがＢｒ
ＣＮ切断法に適している。
本発明は如何なるアプロチニン変種（ｖａｒｉ−αルｔ
Ｊ′）も製造できる新しい方法を可能にした。
Ｊ′）も製造できる新しい方法を可能にした。
上述したアプロチニン又はアプロチニン誘導体の他のペ
プチドとのクローン化は下記の構造を有する融合蛋白質
を与える。
プチドとのクローン化は下記の構造を有する融合蛋白質
を与える。
融合蛋白質は、高度に特異的な酵素カリクレインを使用
してデカペプチドのカリソンを切出すことによって、目
的アプロチニン、又はアプロチニン誘導体を含む５個の
部分に分断される。
してデカペプチドのカリソンを切出すことによって、目
的アプロチニン、又はアプロチニン誘導体を含む５個の
部分に分断される。
カリクレインは天然産基質、即ち天然キニノｒンを同時
に２箇所で速い反応速度で切断し、デカペプチドのカリ
ソンを遊離させる。
に２箇所で速い反応速度で切断し、デカペプチドのカリ
ソンを遊離させる。
キニノｒン配列
一−−５ｅｒ−Ｌｅｕ、−Ｍｅｔ−Ｌｙｒ−Ａｒｇ−Ｐ
ｒｏ−Ｐ↑ 一−−−５ｔｒ−ＬａｔＬ−Ｍｅｔ−ＯＨＨ−Ｌｙｒ−
Ａｒｇ−Ｐｒｏ− カリソン（デカペプチド、 ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｇ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｔ−Ａｒ
ｇ−，５ｔｒ−↑ ＶａＬ−ＧＬｎ−−−− Ｈ−Ｓ ａ ｒ −Ｙ ａ ｌ −Ｇ ｌ ｎ −−−
−Ｐｒｏ−ＧＬｙ−Ｐｈｔ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐ ル
ｔ−Ａｒｇ−０ｔｒ中間ペプチド） 第３図は本発明の方法を図式的に示したもの−ある。使
用する標識蛋白質は、通常その活性にって容易に検出出
来る酵素である。例えば、アカリ性ホスファターゼ、β
−がラクトシダーゼーヒニクロラムフエＳとアセチルト
ランスフエラゼが挙げられる。
ｒｏ−Ｐ↑ 一−−−５ｔｒ−ＬａｔＬ−Ｍｅｔ−ＯＨＨ−Ｌｙｒ−
Ａｒｇ−Ｐｒｏ− カリソン（デカペプチド、 ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｇ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｔ−Ａｒ
ｇ−，５ｔｒ−↑ ＶａＬ−ＧＬｎ−−−− Ｈ−Ｓ ａ ｒ −Ｙ ａ ｌ −Ｇ ｌ ｎ −−−
−Ｐｒｏ−ＧＬｙ−Ｐｈｔ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐ ル
ｔ−Ａｒｇ−０ｔｒ中間ペプチド） 第３図は本発明の方法を図式的に示したもの−ある。使
用する標識蛋白質は、通常その活性にって容易に検出出
来る酵素である。例えば、アカリ性ホスファターゼ、β
−がラクトシダーゼーヒニクロラムフエＳとアセチルト
ランスフエラゼが挙げられる。
融合蛋白質の単離には、トリプシンに加えて物持異的に
相補物質である他の酵素又は蛋白質使用することが出来
る。予め要求されることはこれらの酵素又は蛋白質が、
アミノ酸配列が修されたアプロチニン又はアプロチニン
誘導体と体を生成することである。
相補物質である他の酵素又は蛋白質使用することが出来
る。予め要求されることはこれらの酵素又は蛋白質が、
アミノ酸配列が修されたアプロチニン又はアプロチニン
誘導体と体を生成することである。
第１図、第２図及び第６図は本発明の方法をす図である
。 峯１図
。 峯１図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ａ）生物特異的蛋白質又はポリペプチド（ I ）を
指定するＤＮＡ配列と、製造目的の蛋白質か、又は標識
蛋白質であるもう１個の蛋白質（II）を指定するＤＮＡ
配列とを、切断部位を特定する短鎖ペプチド（III）を
指定するＤＮＡ配列を挟んで結合し、 ｂ）このようにして得られた新規なＤＮＡ断片を、適切
な遺伝子操作によつて宿主生物のＤＮＡ中に、クローン
化ＤＮＡ配列に相当する数種のペプチドからなる組合わ
せ蛋白質の発現を実行出来る様な方法で導入し、 ｃ）宿主生物が組合わせ蛋白質を生成するように培養し
、 ｄ）得られた培養系の、組合わせ蛋白質を含む画分を、
適当に他の成分を除去してから、上記の生物特異的蛋白
質又はポリペプチドに対して相補的であり、そして反応
条件下に担体と強力に結合する物質が結合している適当
な担体材料からなる固定系に接触させ、 ｅ）組合わせ蛋白質が結合した固定系を、適当な方法で
他の成分から分離し、１固又はそれ以上の酵素を使用し
て特異的に開裂させ、 ｆ）上記生物特異的蛋白質又はポリペプチド（ I ）を
蛋白質（II）から分離して、特定の目的蛋白質を得る蛋
白質の製造方法に於て、短鎖ペプチド（III）が切断配
列に加えて、更に１個又はそれ以上の、切断特異性及び
／又は切断速度を増加させるアミノ酸を含むことを特徴
とする蛋白質の製造法。 ２、製造目的の蛋白質が蛋白質（II）であり、生物特異
的蛋白質又はポリペプチド（ I ）が短鎖ペプチドを挟
んで蛋白質（II）と結合する際に、短鎖ペプチドの切断
部位が蛋白質（II）と結合し、そして更に追加アミノ酸
が該生物特異的蛋白質又はポリペプチド（ I ）と結合
する様に結合することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の製造法。 ３、製造する蛋白質が生物特異的蛋白質又はポリペプチ
ド（ I ）であり、そして蛋白質（II）が標識蛋白質で
あり、該２個の蛋白質が、切断配列が直接該生物特異的
蛋白質又はポリペプチドに結合し、そして該追加アミノ
酸が標識蛋白質と結合するように一体に結合することを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ４、短鎖ペプチドが（III）が切断配列及び、Ｃ−末端
又はＮ−末端の何れかに結合している３個の追加アミノ
酸からなることを特徴とする特許請求の範囲第１ないし
第３項記載の方法。 ５、切断酵素がカリクレインであり、そして短鎖ペプチ
ド（III）が、そのＣ−末端に、Ｈ−Ｓｅｒ−Ｖαｌ−
Ｇｌｎ−ＯＨ配列の３個のアミノ酸が、又はＮ−末端に
Ｈ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＯＨ配列の３個のアミノ
酸が結合しているカリジンであることを特徴とする特許
請求の範囲第１ないし第４項記載の方法。 ６、該生物特異的蛋白質又はポリペプチド（ I ）が酵
素、抑制剤、ホルモン、抗体、又は受容体であり、そし
てそれに対する相補物質が適当な担体に結合しているこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第３項記載
の方法。 ７、該生物特異的蛋白質又はポリペプチド（ I ）がア
プロチニンであり、そしてそれに対する相補物質がトリ
プシン又はキモトリプシンであることを特徴とする特許
請求の範囲第１項ないし第３項又は第６項記載の方法。 ８、該生物特異的蛋白質又はポリペプチド（ I ）が生
物特異性が改質されたアプロチニン誘導体であり、そし
てそれに対する相補物質が酵素又は蛋白質であることを
特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第３項又は第６
項記載の方法。 ９、該生物特異的蛋白質又はポリペプチド（ I ）がア
プロチニン又はアプロチニン誘導体であり、そして標識
蛋白質が酵素であることを特徴とする特許請求の範囲第
１項ないし第３項又は第７項又は第８項記載の方法。 １０、蛋白質（II）がホルモン、血漿蛋白質、凝集因子
、酵素、抗体又はワクチンであることを特徴とする特許
請求の範囲第１項ないし第２項又は第４項ないし第８項
記載の方法。 １１、製造する蛋白質が因子VIIIであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１０項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3523701.5 | 1985-07-03 | ||
| DE19853523701 DE3523701A1 (de) | 1985-07-03 | 1985-07-03 | Verfahren zur herstellung von proteinen und polypeptiden |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6214795A true JPS6214795A (ja) | 1987-01-23 |
Family
ID=6274792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61154269A Pending JPS6214795A (ja) | 1985-07-03 | 1986-07-02 | 蛋白質及びポリペプチドの製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0207402A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6214795A (ja) |
| KR (1) | KR870001311A (ja) |
| DE (1) | DE3523701A1 (ja) |
| DK (1) | DK314786A (ja) |
| IL (1) | IL79290A0 (ja) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2188322A (en) * | 1986-03-26 | 1987-09-30 | Bayer Ag | Aprotinin and analogues thereof produced by a recombinant host |
| GB2188933A (en) * | 1986-04-10 | 1987-10-14 | Bayer Ag | Expression vectors for production of polypeptides, method for enhanced expression of polypeptides, hosts containing the expression vectors, products manufactured thereby |
| US5032573A (en) * | 1987-03-23 | 1991-07-16 | Bayer Aktiengesellschaft | Homologs of aprotinin produced from a recombinant host, process, expression vector and recombinant host therefor and pharmaceutical use thereof |
| DE3724570A1 (de) * | 1987-06-27 | 1989-01-05 | Bayer Ag | Human-aprotinin, dessen lys-rest in position 15 gegen einen anderen protogenen aminosaeurerest ausgetauscht ist |
| US5270176A (en) * | 1987-11-20 | 1993-12-14 | Hoechst Aktiengesellschaft | Method for the selective cleavage of fusion proteins with lysostaphin |
| DE3739347A1 (de) * | 1987-11-20 | 1989-06-01 | Hoechst Ag | Verfahren zur selektiven spaltung von fusionsproteinen |
| EP0428615A4 (en) * | 1988-08-11 | 1991-11-13 | California Biotechnology, Inc. | Method for stabilizing heterologous protein expression and vectors for use therein |
| SE8802939D0 (sv) * | 1988-08-19 | 1988-08-19 | Kabigen Ab | A method for the production and isolation of a fusion protein in eukaryotic cells |
| US5225538A (en) * | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US6406697B1 (en) | 1989-02-23 | 2002-06-18 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| GB8927722D0 (en) * | 1989-12-07 | 1990-02-07 | British Bio Technology | Proteins and nucleic acids |
| US5595887A (en) * | 1990-07-16 | 1997-01-21 | Bionebraska, Inc. | Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment |
| DE4105400A1 (de) * | 1991-02-21 | 1992-08-27 | Behringwerke Ag | Definierte beschichtung mit rekombinanten fusionsproteinen aus konstantem fusionspartner und variablem antigenanteil in diagnostischen testsystemen |
| US5440237A (en) * | 1993-06-01 | 1995-08-08 | Incontrol Solutions, Inc. | Electronic force sensing with sensor normalization |
| WO1996017941A2 (en) * | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Bionebraska, Inc. | Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs |
| US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL60184A (en) * | 1979-05-31 | 1984-05-31 | Schering Ag | Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins |
| CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
| DE3410437A1 (de) * | 1984-03-22 | 1985-09-26 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Verfahren zur herstellung von proteinen |
-
1985
- 1985-07-03 DE DE19853523701 patent/DE3523701A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-06-20 EP EP86108436A patent/EP0207402A3/de not_active Withdrawn
- 1986-06-30 IL IL79290A patent/IL79290A0/xx unknown
- 1986-07-02 KR KR1019860005341A patent/KR870001311A/ko not_active Application Discontinuation
- 1986-07-02 JP JP61154269A patent/JPS6214795A/ja active Pending
- 1986-07-02 DK DK314786A patent/DK314786A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
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|---|---|
| KR870001311A (ko) | 1987-03-13 |
| DK314786A (da) | 1987-01-04 |
| EP0207402A3 (de) | 1988-06-08 |
| DE3523701A1 (de) | 1987-01-08 |
| DK314786D0 (da) | 1986-07-02 |
| IL79290A0 (en) | 1986-09-30 |
| EP0207402A2 (de) | 1987-01-07 |
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