JPS6291199A - ヒトインスリン様成長因子１の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、ヒトインスリン様成長因子Ｉ（以下Ｉ　Ｇ
Ｆ−Ｉという）の改良された製法に関するものである。

より詳しくは保護ペプチド融合Ｉ　ＧＦ−Ｉ　（以下、
融合Ｉ　ＧＦ−Ｉという）をコードする多シストロン性
遺伝子を有する発現プラスミドにより形質転換された微
生物を培地に培養し、得られる培養液から融合ＩＧＦ−
Ｉを回収し、次いで得られる融合ＩＣＦ−Ｉを保護ペプ
チドの脱離反応に付し、ＩＧＦ−Ｉを得ることからなる
Ｉ　ＧＦ−Ｉの製造法および上記Ｉ　ＧＦ−Ｉの製造法
で用いられるプラスミドに関するものである。

ＩＧＦ−Ｉが次の配列の７０個のアミノ酸から成ること
は既知である： Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　
−Ｇｌｙ−Ａ　１ａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ　１−Ａｓ
ｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｖａ　１−Ｃｙ
ｓ　−Ｇ　ｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｙｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−９ｅｒ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ
−工１ｅ−Ｖａｌ−Ａｓ　ｐ−Ｇ　１ｕ−Ｃｙ　ｓ　−
Ｃｙ　ｓ　−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ
−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｍ
ｅｔ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ　−Ａｌａ−Ｌｙｓ−６ｅｒ−Ａｌａ この発明の発明者らは、次の各基本工程を用いることに
より、ＩＧＦ−Ｉを好収率で製造することに成功した： 工程１ 融合ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子（１）、下融合Ｉ　
ＧＦ−Ｉ遺伝子という）を製造する工程。

工程２ 多シストロン性融合ｒＧＦ−Ｉ遺伝子を有する発現プラ
スミドを製造する工程。

工程３ 該発現プラスミドにより宿主生物を形質転換することか
らなる形質転換体製造工程。

工程４ 該形質転換体を適当な培地中で培養することからなる融
合ＩＧＦ−１製造工程。

工程５ 宿主生物細胞から融合ＩＧＦ−Ｉを単離する工程。

工程６ 該融合ＩＧＦ−Ｉを保護ペプチドの脱離反応に付し、Ｉ
ＧＦ−Ｉを得るＩＧＦ−Ｉの製造工程。

保護ペプチドは、宿主生物の細胞中のプロテアーゼによ
る分解からＩ　ＧＦ−１を保護するために使用され、前
記融合ＩＧＦ−Ｉの保護ペプチド脱離反応によって除去
される。

すなわち、該融合Ｉ　ＧＦ−Ｉは該脱離反応によってＩ
　ＧＦ−Ｉを製造するための中間体であり、従って、該
保護ペプチドには、天然または合成のペプチドまたはそ
れらの断片が包含される。

好適な１融合ＩＧＦ−１」には、保護ペプチドのメチオ
ニンを介して保護ペプチドと融合した■ＧＦ−Ｉが包含
される。

保護ペプチドの好適な例の一つは「ペプチドしＨ」であ
り、そのアミノ酸配列は次の通りである。

Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−ＧＩｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｙｒ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ　−Ｇ　１ｕ
−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−
Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ　−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−
Ｖａ　１−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−９ｅ
ｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−工１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｉｎ
−５ｅｒ−Ｇｌｎ−工１ｅ−Ｖａｌ−９ｅｒ−Ｐｈｅ−
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１
−Ｌｙｓ−Ｔ（ｉＳ−Ｇ　ｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔペプチ
ドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉをフードする好適遺伝子（４２２
ｂｐ）は次の通りである。

ＥｃｏＲ工Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇ１ｎ５
’−ＡＡＴＴＣ−ＡＴＧ−ＴＧＴ−ＴＡＣ−ＴＧＣ−Ｃ
ＡＧ−３’−Ｇ−ＴＡＣ−ＡＣＡ−ＡＴＧ−ＡＣＧ−Ｇ
ＴＣ−Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌ
ｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＬｙｓ　
Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ入ＡＡ−ＴＡＣ−ＴＴＴ
−ＡＡＴ−ＧＣＡ−ＧＧＴ−ＣＡＴ−ＴＣＡ−ｃＡＴ−
ＧＴＡ−Ｇｃｃ−ＴＴＴ−ＡＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＡ−Ｃ
ＧＴ−ＣＣＡ−ＧＴＡ−ＡＧＴ−ＣＴＡ−ＣＡＴ−ＣＧ
Ｃ−Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＧＡＴ−ＡＡ
Ｔ−ＧＧＡ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＴＴＣ−ＴＴＡ−ＧＧＣ
−ＡＴＴ−ＴＴＧ−ＡＡＧ−ＣＴＡ−ＴＴＡ−ＣＣＴ−
ＴＧＡ−ＧＭ−ＭＧ−ＭＴ−ＣＣＧ−ＴＭ−ＡＡＣ−Ｔ
ＴＣ−Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅ
ｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　工ｌｅ　ＭｅｔＭＴ−Ｔ
ＧＧ−ＡＡＡ−ＧＡＧ−ＧＡＧ−ＡＧＴ−ＧＡＣ−ＡＧ
Ａ−ＡＡＡ−ＡＴＡ−ＡＴＧ−ＴＴＡ−ＡＣＣ−ＴＴＴ
−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＴＣＡ−ＣＴＧ−ＴＣＴ−ＴＴＴ−
ＴＡＴ−ＴＡＣ−５０　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　Ｈｉｎｄエエエｇｉｎ　Ｓｅｒ　
Ｇｉｎ工ｌｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＣＡＧ−ＡＧＣ−ＣＡＡ−ＡＴＴ−
ＧＴＣ−ＴＣＣ−ＴＴＴ−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＭＧ−ＣＴ
Ｔ−ＧＴＣ−ＴＣＧ−ＧＴＴ−ＴＡＡ−ＣＡＧ−ＡＧＧ
−ＡＡＡ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴＣ−ＧＡＡ−Ｇｌｕ　
Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｇ
ｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＧ入Ａ−ＧＴＡ−〜す、
−ＣＡＴ−ＧＡＡ−ＴＴＣ−ＡＴＧ−ＧＧＴ−ＣＣＴ−
ＧＡＡ−ＡＣＴ−ＣＴＴ−ＣＡＴ−ＴＴＴ−ＧＴＡ−Ｃ
ＴＴ−ＡＡＧ−ＴＡＣ−ＣＣＡ−ＧＧＡ−ＣＴＴ−ＴＧ
Ａ−Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ
　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＧｌｎＣＴＧ−Ｔ
ＧＣ−ＧＧＣ−ＧＣＴ−ＧＡＡ−ＣＴＧ−ＧＴＴ−ＧＡ
Ｃ−ＧＣＴ−ＣＴＧ−ＣＡＡ−ＧＡＣ−ＡＣＧ−ＣＣＧ
−ＣＧＡ−ＣＴＴ−ＧＡＣ−ＣＡＡ−ＣＴＧ−ＣＧＡ−
ＧＡＣ−ＧＴＴ−Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓ
ｎＴＴＴ−ＧＴＡ−ＴＧＴ−ＧＧＴ−ＧＡＴ−ＣＧＴ−
ＧＧＴ−ＴＴＣ−ＴＡＣ−ＴＴＣ−ＡＡＣ−Ａ入Ａ−Ｃ
ＡＴ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−ＣＴＡ−ＧＣＡ−ＣＣＡ−人Ａ
Ｇ−ＡＴＧ−ＡＡＧ−ＴＴＧ−Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ
　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　
Ａｒｇ　ＡｒｇＡＡＡ−ＣＣＧ−ＡＣＣ−ＧＧＣ−ＴＡ
Ｔ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＡＧＣ−ＴＣＴ−ＣＧＴ−ＣＧＣ
−ＴＴＴ−ＧＧＣ−ＴＧＧ−ＣＣＧ−ＡＴＡ−ＣＣＧ−
ＡＧＧ−ＴＣＧ−ＡＧＡ−ＧＣＡ−ＧＣＧ−Ａｌａ　Ｐ
ｒｏ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｇ１１ｙ　工１ｅ　Ｖａｌ　Ａ
ｓｐ　Ｇ：Ｌｕ　Ｃｙｓ　ＣｙｓＧＣＡ−ＣＣＧ−ＣＡ
Ｇ−ＡＣＴ−ＧＧＴ−ＡＴＣ−ＧＴＡ−ＧＡＣ−ＧＡＡ
−ＴＧＣ−ＴＧＴ−ＣＧＴ−ＧＧＣ−ＧＴＣ−ＴＧＡ−
ＣＣＡ−ＴＡＧ−ＣＡＴ−ＣＴＧ−ＣＴＴ−ＡＣＧ−Ａ
ＣＡ−Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅ
ｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＭｅｔＴｙｒ　
Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａ
ｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＡｌａＳヒｏｐ　５ｔｏｐ　Ｂ
ａｍＨＩ ＴＧＡ−ＴＡＧ−３’ ＡＣＴ−ＡＴＣ−ＣＴＡＧ−５’ この発明で用いられるプロモーター遺伝子は、通常用い
られる種々のプロモーター系から適宜選択きれるもので
あってよい。その好適な例としては、たとえば大腸菌の
トリプトファンプロモーターのヌクレオチド配列に基づ
く、この発明の発明者により合成された合成プロモータ
ー遺伝子（例えば合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子等）
が包含きれる。該合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子のＤ
ＮＡ配列は次の通りである。

ＥｃＯＲ工 に−プロモーター領域−一一一一一ゴ ＴＡＣＴＣＧＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＴＡＧＴＡＧＣ
ＴＴＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣ−ＧＴＴＣＡＡ
ＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＡＴＡＧＣＴＴＡＡ−５’
合成ｔｒｐプロモーターエ遺伝子中のプロモーター領域
およびシャインダルガノ領域（ＳＤ領領域を上記式中に
示した。

この発明の製造法では、２個以上の融合ＩＧＦ−■遺伝
子をプラスミドに順次挿入して、多シストロン性融合Ｉ
　ＧＦ−Ｉ遺伝子を有する発現プラスミドを得る。

プロモーター遺伝子および融合Ｉ　ＧＦ−Ｉ遺伝子を適
切なプラスミドと、所望により適切なりＮＡ断片（たと
えばリンカ−２他の制限部位等）を用いて、常法（たと
えば制限酵素による消化、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてのホスホリル化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
てのライゲーション）により、順次、環状に連結するこ
とにより、多シストロン性遺伝子を有する発現プラスミ
ドを得ることができる。

適当なプラスミドにはｐＢＲ３２２等がある。

このようにして得た多シストロン性遺伝子を有する発現
プラスミドを常法（たとえば形質転換、顕微注射等）に
より微生物（宿主細胞）に挿入することにより、形質転
換体を得ることができる。

適当な宿主生物には、大腸菌、すなわちエシェリキア（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　；以下旦、という）コリ（製
晶）（たとえばＥ−、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯｌ等）などが
包含される。

この発明の方法によって融合ＩＧＦ−Ｉを製造するには
、このようにして得た発現プラスミド含有形質転換体を
栄養培地中で培養する。

栄養培地は炭素ｆｉ（たとえばグルコース、グリセリン
、マンニトール、フルクトース、ラクトース等）および
無機または有機の窒素ｆＡ（硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、カゼイン加水分解物、酵母エキス、ポリペ
プトン、バタトトリブトン、牛肉エキス等）を含有する
。所望により、他の栄養ｆＡ［たとえば無機塩（たとえ
ば重リン酸ナトリウムまたはカリウム、リン酸水素二カ
リウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カ
ルシウム）、ビタミン類（たとえばビタミンＢ１）、抗
生物質（たとえばアンピシリン）等コを培地に加えても
よい。

形質転換体の培養は一般に、ｐＨ５，５〜８．５（好ま
しくはｐＨ７〜７．５）、１８〜４０℃（好ましくは２
５〜３８℃）で、５〜５０時間にわたって行えばよい。

こうして生産された融合ＩＧＦ−Ｉは培養きれた形質転
換体の細胞中に存在するのが普通であるので、細胞を濾
過または遠心分離によって集め、それらの細胞壁および
／または細胞膜を常法（たとえば超音波処理および／ま
たはリソチーム処理等）により破壊して、デブリスを得
る。このデブリスから、天然または合成の１白を単離、
精製するのに一般に採用される常法［たとえば適当な溶
媒（たとえば８Ｍ尿素水溶液、６Ｍ塩酸グアニジン等）
を用いての蛋白の溶解、透析、ゲル濾過、カラムクロマ
トグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等コにより
、融合ＩＧＦ−Ｉを単離、精製できる。

かくして得られる融合ＩＧＦ−１の好適な例の一つとし
て、′ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉ、が挙げられ
、そのアミノ酸配列は次の通りである。

Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　−Ｇｉｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−
Ｔｙｒ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ−Ｇｌ′ｕ−Ａｌａ−Ｇ　１
ｕ−Ａ５　ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　−Ｌｙ　ｓ　−Ｔｙｒ
−Ｐｈｅ−Ａｓ　ｎ−Ａ　ｌａ　−Ｇ　１ｙ−Ｈｉ　ｓ
　−Ｓ　ｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａ　１−７１１．ａ−Ａｓｐ
−Ａｓｎ−Ｇ　］−］ｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ
−Ｌｙｓ−工１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−
工１ｅ−Ｖａ１−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ　−Ｈｉ　ｓ
−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｓｔ−Ｇ　ｌｙ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　
１ｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇ　１ｙ−Ａｌａ　−
Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕ　−Ｖａ　１−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｐｈｅ　−Ｖａ　ｌ−Ｃｙ　ｓ−Ｇ　
１ｙ−Ａｓ　ｐ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ｔｙｒ−Ｇｌｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ａｒ
ｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｒｏｌ１０５ｅｒ−５ｅｒ−Ａ
ｒ工１ｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−
Ｔｙｒ−Ｃｙｓ　−Ａ　１−ａ−Ｐ　ｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙ　ｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａｌａ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ａｌ
ａ 次いで、上記で得られた融合ＩＧＦ−Ｉを保護ペプチド
の脱離反応に付いてＩＧＦ−Ｉを得る。

本脱離反応は、反応に悪影響を及ぼさない慣用の溶媒中
で、緩和な条件下に実施することができる。

この明細書中の配列において、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそ
れぞれ式 を意味し、５′−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味し、３′−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式 を意味する。

以下の実施例は本発明をより詳細に説明するために記載
するものである。

実施例１ プラスミドｐＵｃ−５５１の構築 特開昭６１−１３９６号公報に記載きれた方法によって
得られたペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ発現プラスミド（
ｐＬＨ５ｄＭｍｔｒｐ　）　（ｔｏｏ＜　）をＨｐａＩ
（１８０単位）によりＨｐａＩ消化用緩衝液中３７°Ｃ
で１時間消化した。

０．８％アガロースゲル上で完全消化を検知したのち、
Ｉ　ＭＮａＣｌとＰｓｔＩ　（１８０単位）を混合物に
加え、混合物を３７℃で１時間インキュベートして、２
種のＤＮＡ断片（３，７ｋｂｐおよび０．８ｋｂｐ　）
を得た。大きい方のＤＮＡ断片（３，７ｋｂｐ　）を０
．８％アガロースゲル上で分離し、ＤＥＡＥトヨパール
６５０Ｍカラム（ジエチルアミンエチル基を有する陰イ
オン交換樹脂、東洋曹達工業株式会社製）クロマトグラ
フィーにより精製し、読いてエタノールで沈殿させ、Ｈ
ｐａＩ−ＰｓｔＩ消化ＤＮＡ断片（３，７ｋｂｐ　）　
（４ｏ＜　）を得た。このＤＮＡ断片（３５鴎）をＨｉ
ｎｃｌ［緩衝液中Ｈｉｎｃ　ＩＩ　（６３単位）により
３７°Ｃで１８分間部分消化して、６種のＤＮＡ断片（
３６９０，３４１７，２９５８，７３２，４５９および
２７３ｂｐ　）を得た。７３２ｂｐのＤＮＡ断片（２（
）を分取用の０．８％アガロースゲル電気泳動およびＤ
ＥＡＥ　トヨバール６５０Ｍカラムクロマトグラフィー
により精製した。

他方、プラスミドｐＬＩＣ９（ファルマシアから購入）
　（１０＜　）をＨｉｎｅＩ［（１２０単位）を用いて
３７°Ｃで１時間消化し、ｐｕｃ　９のＨｉｎｃｌ［Ｄ
　Ｎ　Ａ断片（２（）を得た。このＤＮＡ断片（１，９
＜）を仔つシ腸アルカリホスファターゼ（以下ＣＩＰと
いう）（べ−リンガーマンハイムから購入）（２０単位
）と共に３０分間３７℃でインキュベートシ、つぎにＣ
ＩＰ〈２０単位）を追加して３０分間、３７℃でインキ
ュベートした。６５℃で１５分間加熱して酵素を不活化
したのち、フェノール−クロロホルム抽出およびそれに
統＜セファデックスＧ−５０スーパーフアイン（ファル
マシア製）スパンカラムクロマトグラフィーおよびエタ
ノール沈殿によってを精製して、ｐｕｃ　９の脱ホスホ
リルＨｉｎｃ　ＩＦ消化ＤＮＡ断片（１，５に）を得た
。このＤＮＡ断片（１，２ｇ　）を、上で調製したペプ
チドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子含有Ｈｐａ　Ｉ　−Ｈｌ
ｎｃ　ｎ消化ＤＮＡ断片（７３２ｂｐ）と、ライゲーシ
ョン緩衝液中、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ（８単位）存在
下に、１６℃で２０時間にわたってライゲートさせた。

ライゲーション混合物を旦、竺具聞２９４に導入して形
質転換し、多数のアンピシリン耐性コロニーを得た。２
２コロニー中の１つが所望のプラスミドｐｕｃ−ｓｓ　
１であった。これはＰｓｔ　Ｉ　（３，４ｋｂｐ　）お
よびＢａｍＨＩ　（２，９ｋｂｐおよび０．４５ｋｂｐ
　）を用いての制限エンドヌクレアーゼ分析によって確
認した。

このプロセスを第１図に示す。

プラスミドｐＬＨ５ｄＭｍｔｒｐ　（ｓｏ＜　）をＢａ
ｍＨＩ　（１２０単位）によりＢａｍＨＩ消化用緩衝液
中、３７°Ｃで１時間消化し、続いて０．８％アガロー
スゲルを用いて電気泳動を行って、２種のＤＮＡ断片を
得た。大きい方のＤＮＡ断片（４，５ｋｂｐ　）　（１
６Ｋ　）をＣＩＰで処理して、ｐＬＨ５ｄＭｍｔｒｐの
脱ホスホリル化ＢａｍＨＩ消化断片（４（）を得た。

他方、ｐＵＣ−５５１（１０ｘ　）をＢａｍＨＩ　（６
０単位）で消化して、２種のＤＮＡ断片（２，６ｋｂｐ
および４６４ｂｐ　：を得た。小さい方のＤＮＡ断片（
４６４ｂｐ　）を０．８％アガロースゲルを用いる電気
泳動によって精製した。得られたＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ
断片（４６４ｂｐ　）　（３６ｎｇ）および上記ｐＬＨ
５ｄＭｍｔｒｐの脱ホスホリル化ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ
断片（２００ｎｇ　）とをＴ　４　ＤＮＡリガーゼ（４
単位）の存在下に１６℃で２０時間インキュベートした
。このライゲーション混合物によりＥ、　ｃｏｌｉＨＢ
ＩＯＩを形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを得た
。１２コロニーのうちの７つは、２シストロン性のペプ
チドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を有するプラスミド（ｐ
Ｌｓ　−Ｔ２と名付ける）であり、１つは３シストロン
性のペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−■遺伝子を有するプラス
ミド（ｐＬＳ−Ｔ３と名付ける）であった。これらは制
限エンドヌクレアーゼ分析により確認された［ｐＬＳ−
Ｔ２　：ＰｓｔＩ　−ＰｖｕｌＩ（１，５，３，４ｋｂ
ｐ　）、ＥｃｏＲＩ　（１９８，２６６ｂｐ　）、Ｐｓ
ｔｌ　−５ａｌＩ　（３，０，２，０ｋｂｐ　）、Ｈｐ
ａ　Ｉ　（４，９８ｋｂｐ　）；ｐＬｓ　　Ｔ３　：Ｐ
ｓｔ、Ｉ　−Ｐｖｕｆｆ　（１５，３，９ｋｂｐ　）、
ＥｃｏＲＩ　（１９８，２６６ｂｐ　）、ｆ’ｓｔｌ　
−５ａｌＩ　（３，０，２，５ｋｂｐ　）、Ｈｐａ　Ｉ
　（５，４５ｋｂｐ　）コ。このプロセスを第２図に示
す。

プラスミドｐｔ、ｓ−Ｔ　２を含有するＥ−、ｃｏｌｉ
　）ＩＢＩＯＩを旦、臼晶Ｆ−１０、プラスミドｐＬＳ
−Ｔ　３を含有する互、蛇１ｉ　ＨＢＩＯＩを旦、肛旦
Ｆ−１１と名付けた。

実施例２ ペプチドＬＨ融合ｒＧＦ−ＩのＥ、　ｃｏｌｉ　Ｆ　−
１０での生産 ５０ｘ／ｍＱのアンピシリンを含有するしブロス中での
旦、四環、Ｆ−１０の一夜培養物を、グルコース０．２
％、カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）０．５％、ビタ
ミンＢ１５０Ｐｇ／　ｍＱおよびアンピシリン２５（／
戚を含有するＭ９培地で１：２０に稀釈した。

Ａ６ｏｏが約０，５となったとき、β−インドールアク
リル酸を最終濃度１０ｘ／ｍＱになるよう添加した。

つぎに、細胞をインキュベートし、アリフート（培養液
２０［１１ｆｉ　）を遠心分離（７ｋｒｐｍ、　４０’
Ｃ１５分間）で集めた。

実施例３ ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉの旦、汐其Ｆ−１１での生
産 ５０＜／ｍ１１のアンピシリンを含有するしブロス中で
の５．臼旦Ｆ−１１の一夜培養物をグルコース０．２％
、カザミノ酸（＃加水分解カゼイン）０．５％、ビタミ
ンＢ１ｓｏｇ／ｍＱおよびアンピシリン２５（／ｍＱを
含有するＭ９培地で１：２０に稀釈した。

Ａ６ｏｏが約０，５となったとき、β−インドールアク
リル酸を最終濃度１０■／　ｍｌｌとなるよう添加した
。

つぎに、細胞をインキュベートし、アリコート（培養液
２０ｍ１１）を遠心分＠　（７ｋｒｐｍ、　４℃、５分
間）により集めた。

実施例４ ペプチドＬＨ融合Ｉ　ＧＦ−１の単離と精製旦、製旦Ｆ
−１１を誘導後４時間培養し、遠心分離（Ｌ４ｋｒｐｍ
、　　４　”Ｃ）で集めた。湿潤細胞ペースト（１２０
ｇ：培養液２０リツトルから）を１０ｍＭリン酸塩綴衝
食塩水（以下ＰＢＳという）　−１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　
（ｐＨ８、０）　３００ｍＱに懸濁し、−８０°Ｃで凍
結した。この混合物を融解し、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ　５
０ｍＱおよび１０ｍｇ／ｍリソチーム溶液５９ｍＱに加
えた。０℃で１時間がき混ぜたのち、混合物をホモジナ
イズした。細胞デブリスを２５ｍＭ　ＰＢＳ　−１０ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ　−０，５％サルコシルナトリウム（ｐＨ
８，０）２リツトル中に懸濁し、つぎにこの混合物をホ
モジナイズした。Ｏ”Ｃで１時間かき混ぜたのち、混合
物を７．０００ｒｐｍ、４℃で３５分間遠心分離にかけ
た。ペレットを１０ｍＭ　ＰＢＳ　−１０ｍＭＥＤＩＡ
　（ｐＨ８、Ｏ）に懸濁した。混合物をホモジナイズし
、上と同じ方法で遠心分離した。ペレットを６Ｍ塩酸グ
アニジン−１００ｍＭ　トリス−塩酸−１０ｍＭＥＤＩ
Ａ　−１００ｍＭ　ＤＴＴ（ｐＨ８，０）２００ｍＱに
溶解し、４０ｋｒｐｍ。

２０゛Ｃで１時間遠心分離した。上澄みを集め、０．１
Ｍ’トリスー塩＃（ｐＨ８，０）／８Ｍ尿素および１０
ｍＭ２−メルカプトエタノールで平衡化したセファクリ
ル５３０１−バー７フインカラム（５，ＯＸ　８６．６
ＣＴｎ　：樹脂１７００ｍＮ　）にかけた、溶出は、平
衡化緩衝液を用い、流速０．６１１１１１７分で、４℃
で行った。セフアクＩＪ　ルＳ　３００（ファルマシア
製）クロマトグラフィーヲ行って、３５ｍａの両分を集
めた。全てのクロマトグラフィ一工程について、分画の
直後にアッセイを行った。活性画分を集め、プールした
画分５００ｍ１１を、１Ｍ酢酸水溶液１６リツトルに対
して室温で３時間透析し、つぎに新鮮な１Ｍ酢酸水溶液
１６リツトルに対して一夜透析した。透析ずみ画分を凍
結乾燥して、所望の成分を含有するペプチドＬＨ融合Ｉ
　ＧＦ　−Ｉ　Ｃ１，２６ｇ　）を得た。このペプチド
ＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉは、１５％ＳＤＳ　ＰＡＧＥにおい
て分子量１５．５００の位置に／ベンドを示す。

実施例５ 培養液中のペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉの含量を、放射
免疫検定法（以下ＲＩＡという）を用いて測定し、ＩＧ
Ｆ−Ｉ含量として計算した。

ＩＧＦ−Ｉの放射免疫検定は、矢内原の方法［矢内原ら
：ペプチド・ホルモンズ・イン・バンクレアス、　３　
、２８（１９８３）　］に従って実施した。

方法： 上記の試料または標準試料［ＩＧＦ−Ｉ断片（２６−４
６）コ０．１戒と試料緩衝液［０，ＯＩＭ　ＰＢＳおよ
び０．０２５ＭＥＤＴＡ中の０．５％牛血清アルブミン
（以下、ＢＳＡという＞（０，４ｍ１１　）　］、Ｉ　
ＧＦ−Ｉ　（２６−４６）（７）ウサギ抗血清（ｏ、ｔ
ｍｉ＞および１２５Ｉ　−Ｉ　ＧＦ−Ｉ（２６−４６）
　（０，ｔ、ｍＡ　）を混合した。混合物を４°Ｃで４
８時間放置し、つぎに、ウサギ血清（０，１１１Ｑ）、
ウサギＺ−グロブリン抗血清（ｏ、ｔｍａ）および５％
ＰＥＧ６００００．９ｍｌ！　）を添力目した。さらに
２時間４℃に放置したのち、遠心分離（３ｋｒｐｍ、　
４°Ｃ１３０分間）によってペレットを集め、７−カウ
ンターにより放射能を測定した。この放射能からＩＧＦ
−■含量を計算した。

結果： それぞれ実施例２および実施例３に記載の方法によって
調製した培養液（２ｏｍｕ）（Ｍ９ブロス中でＥ、　ｃ
ｏｌｉ　Ｆ　−１０およびＥ、　ｃｏｌｉ　Ｆ−１１を
培養した液）を７．　ＯＯＯｒｐｍで遠心分離した。得
られた細胞を８Ｍ、Ｉｔ素、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐ
Ｈ８，０）　（２ｍＡ　）に懸濁し、つぎに超音波によ
り破壊した。懸濁液を遠心分離しく　１８．０００ｒｐ
ｍ、　３０分間、４°Ｃ）、上澄みを０．５％ＢＳＡ、
　１０ｍＭ　ＰＢＳ、　２５ｍＭ　ＥＤＴＡで稀釈し、
ＲＩＡおよびＨＰＬＣ用の試料として使用した。

ＩＧＦ−１含量を、発現プラスミドｐＬＨ５ｄＭｍｔｒ
ｐを含有する耳、　ｃｏｌｉ　Ｆ〜６を用いて同様にし
て調製した培養液のそれと比較した。

培養液　　　　　培養時間（時間） ｐＬＨ５ｄＭｍｔｒｐ　　　　３．５　　　７．７　　
１２．０　　１５．０ｐＬＳ−Ｔ　２　　　３．９　　
　９，３　　１４．３　　１６．０ｐＬｓ　−Ｔ　３　
　　　６．７　　１０．８　　１５．６　　２０．６

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＵｃ−５５１の構築のプロセスを
示す図であり、第２図はプラスミドｐＬｓ−Ｔ　２およ
びプラスミドｐＬｓ−Ｔ３の構築を示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）保護ペプチド融合ヒトインスリン様成長因子 I
   をコードする多シストロン性遺伝子を有する発現プラス
   ミドにより形質転換された微生物を培地に培養し、得ら
   れる培養液から保護ペプチド融合ヒトインスリン様成長
   因子 I を回収し、次いで得られる保護ペプチド融合ヒ
   トインスリン様成長因子 I を保護ペプチドの脱離反応
   に付し、ヒトインスリン様成長因子 I を得ることを特
   徴とするヒトインスリン様成長因子 I の製造法。
2. （２）保護ペプチド融合ヒトインスリン様成長因子 I
   をコードする多シストロン性遺伝子を有する発現プラス
   ミド。