JPH06319556A - ヒトインスリン様成長因子ｉ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメチオ
ニン残基を有するペプチドであって、その保護ペプチド
の該メチオニン残基を介してインスリン様成長因子Ｉと
融合している保護ペプチド融合インスリン成長因子Ｉを
コードする２個以上のシストロンを有する多シストロン
性遺伝子。 【効果】 この多シストロン性遺伝子を用いることによ
りＩＧＦ−Ｉを効率よく生産することが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、ヒトインスリン様成
長因子Ｉ（以下ＩＧＦ−Ｉという）の改良された製法に
関するものである。より詳しくは保護ペプチドが最終の
アミノ酸としてメチオニン残基を有するぺプチドであっ
て、その保護ペプチドの該メチオニン残基を介してＩＧ
ＦＩと融合している保護ペプチド融合ＩＧＦ−Ｉ（以
下、融合ＩＧＦ−Ｉという）をコードする２個以上のシ
ストロンを有する多シストロン性遺伝子を有する発現プ
ラスミドにより形質転換された微生物を培地に培養し、
得られる培養液から融合ＩＧＦ−Ｉを回収し、次いで得
られる融合ＩＧＦ−Ｉを保護ペプチドの臭化シアンを用
いた脱離反応に付し、ＩＧＦ−Ｉを得ることからなるＩ
ＧＦ−Ｉの製造に用いられる遺伝子、プラスミドおよび
形質転換体に関するものである。ＩＧＦ−Ｉが次の配列
の７０個のアミノ酸から成ることは既知である：

【０００２】

【化１】 この発明の発明者らは、次の各基本工程を用いることに
より、ＩＧＦ−Ｉを好収率で製造することに成功した：工程１ 融合ＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子（以下融合ＩＧＦ−
Ｉ遺伝子という）を製造する工程。工程２ 多シストロン性融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を有する発現プラ
スミドを製造する工程。工程３ 該発現プラスミドにより宿主生物を形質転換することか
らなる形質転換体製造工程。

【０００３】工程４ 該形質転換体を適当な培地中で培養することからなる融
合ＩＧＦ−Ｉ製造工程。工程５ 宿主生物細胞から融合ＩＧＦ−Ｉを単離する工程。工程６ 該融合ＩＧＦ−Ｉを保護ペプチドの脱離反応に付し、Ｉ
ＧＦ−Ｉを得るＩＧＦ−Ｉの製造工程。保護ペプチド
は、宿主生物の細胞中のプロテアーゼによる分解からＩ
ＧＦ−Ｉを保護するために使用され、前記融合ＩＧＦ−
Ｉの保護ペプチド脱離反応によって除去される。すなわ
ち、該融合ＩＧＦ−Ｉは該脱離反応によってＩＧＦ−Ｉ
を製造するための中間体であり、従って、該保護ペプチ
ドには、天然または合成のペプチドまたはそれらの断片
が包含される。好適な「融合ＩＧＦ−Ｉ」には、保護ペ
プチドのメチオニンを介して保護ペプチドと融合したＩ
ＧＦ−Ｉが包含される。保護ペプチドの好適な例の一つ
は「ペプチドＬＨ」であり、そのアミノ酸配列は次の通
りである。

【０００４】

【化２】 ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉをコードする好適遺伝子
（４２２ｂｐ）は次の通りである。

【０００５】

【化３】

【０００６】

【化４】

【０００７】

【化５】 この発明で用いられるプロモーター遺伝子は、通常用い
られる種々のプロモーター系から適宜選択されるもので
あってよい。その好適な例としては、たとえば大腸菌の
トリプトファンプロモーターのヌクレオチド配列に基づ
く、この発明の発明者により合成された合成プロモータ
ー遺伝子（例えば合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子等）
が包含される。該合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子のＤ
ＮＡ配列は次の通りである。

【０００８】

【化６】 合成ｔｒｐプロモーターＩ遺伝子中のプロモーター領域
およびシャインダルガノ領域（ＳＤ領域）を上記式中に
示した。

【０００９】この発明の製造法では、２個以上の融合Ｉ
ＧＦ−Ｉ遺伝子をプラスミドに順次挿入して、多シスト
ロン性融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を有する発現プラスミドを
得る。プロモーター遺伝子および融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子
を適切なプラスミドと、所望により適切なＤＮＡ断片
（たとえばリンカー、他の制限部位等）を用いて、常法
（たとえば制限酵素による消化、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼを用いてのホスホリル化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
を用いてのライゲーション）により、順次、環状に連結
することにより、多シストロン性遺伝子を有する発現プ
ラスミドを得ることができる。適当なプラスミドにはｐ
ＢＲ３２２等がある。このようにして得た多シストロン
性遺伝子を有する発現プラスミドを常法（たとえば形質
転換、顕微注射等）により微生物（宿主細胞）に挿入す
ることにより、形質転換体を得ることができる。適当な
宿主生物には、大腸菌、すなわちエシエリキア（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ；以下Ｅ．という）コリ（ｃｏｌｉ）
（たとえばＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１等）などが包含さ
れる。この発明の方法によって融合ＩＧＦ−Ｉを製造す
るには、このようにして得た発現プラスミド含有形質転
換体を栄養培地中で培養する。

【００１０】栄養培地は炭素源（たとえばグルコース、
グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトース
等）および無機または有機の窒素源（硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、カゼイン加水分解物、酵母エキ
ス、ポリペプトン、バクトトリプトン、牛肉エキス等）
を含有する。所望により、他の栄養源［たとえば無機塩
（たとえば重リン酸ナトリウムまたはカリウム、リン酸
水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化カルシウム）、ビタミン類（たとえばビタミン
Ｂ₁ ）、抗生物質（たとえばアンピシリン）等］を培地
に加えてもよい。形質転換体の培養は一般に、ｐＨ５．
５〜８．５（好ましくはｐＨ７〜７．５）、１８〜４０
℃（好ましくは２５〜３８℃）で、５〜５０時間にわた
って行えばよい。こうして生産された融合ＩＧＦ−Ｉは
培養された形質転換体の細胞中に存在するのが普通であ
るので、細胞を濾過または遠心分離によって集め、それ
らの細胞壁および／または細胞膜を常法（たとえば超音
波処理および／またはリソチーム処理等）により破壊し
て、デブリスを得る。このデブリスから、天然または合
成の蛋白を単離、精製するのに一般に採用される常法
［たとえば適当な溶媒（たとえば８Ｍ尿素水溶液、６Ｍ
塩酸グアニジン等）を用いての蛋白の溶解、透析、ゲル
濾過、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグ
ラフィー等］により、融合ＩＧＦ−Ｉを単離、精製でき
る。かくして得られる融合ＩＧＦ−Ｉの好適な例の一つ
として、「ペプチドＬＨと融合したＩＧＦ−Ｉ」が挙げ
られ、そのアミノ酸配列は次の通りである。

【００１１】

【化７】 次いで、上記で得られた融合ＩＧＦ−Ｉを保護ペプチド
の脱離反応に付いてＩＧＦ−Ｉを得る。本脱離反応は、
反応に悪影響を及ぼさない慣用の溶媒中で、緩和な条件
下に実施することができる。

【００１２】この明細書中の配列において、Ａ、Ｇ、Ｃ
およびＴはそれぞれ式

【化８】 を意味し、５’−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式

【化９】 を意味し、３’−末端Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはそれぞれ式

【化１０】 を意味する。

【００１３】

【実施例】以下の実施例は本発明をより詳細に説明する
ために記載するものである。実施例１ プラスミドｐＵＣ−ＳＳ１の構築 特開昭６１−１３９６号公報に記載された方法によって
得られたペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ発現プラスミド
（ｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐ）（１００μｇ）をＨｐａＩ
（１８０単位）によりＨｐａＩ消化用緩衝液中３７℃で
１時間消化した。０．８％アガロースゲル上で完全消化
を検知したのち、１ＭＮａＣｌとＰｓｔＩ（１８０単
位）を混合物に加え、混合物を３７℃で１時間インキュ
ベートして、２種のＤＮＡ断片（３．７ｋｂｐおよび
０．８ｋｂｐ）を得た。大きい方のＤＮＡ断片（３．７
ｋｂｐ）を０．８％アガロースゲル上で分離し、ＤＥＡ
Ｅトヨパール６５０Ｍカラム（ジエチルアミノエチル基
を有する陰イオン交換樹脂、東洋曹達工業株式会社製）
クロマトグラフィーにより精製し、続いてエタノールで
沈殿させ、ＨｐａＩ−ＰｓｔＩ消化ＤＮＡ断片（３．７
ｋｂｐ）（４０μｇ）を得た。このＤＮＡ断片（３５μ
ｇ）をＨｉｎｃＩＩ緩衝液中ＨｉｎｃＩＩ（６３単位）
により３７℃で１８分間部分消化して、６種のＤＮＡ断
片（３６９０、３４１７、２９５８、７３２、４５９お
よび２７３ｂｐ）を得た。７３２ｂｐのＤＮＡ断片（２
μｇ）を分取用の０．８％アガロースゲル電気泳動およ
びＤＥＡＥトヨパール６５０Ｍカラムクロマトグラフィ
ーにより精製した。他方、プラスミドｐＵＣ９（ファル
マシアから購入）（１０μｇ）をＨｉｎｃＩＩ（１２０
単位）を用いて３７℃で１時間消化し、ｐＵＣ９のＨｉ
ｎｃＩＩＤＮＡ断片（２μｇ）を得た。このＤＮＡ断片
（１．９μｇ）を仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（以
下ＣＩＰという）（ベーリンガーマンハイムから購入）
（２０単位）と共に３０分間３７℃でインキュベート
し、つぎにＣＩＰ（２０単位）を追加して３０分間、３
７℃でインキュベートした。６５℃で１５分間加熱して
酵素を不活化したのち、フェノール−クロロホルム抽出
およびそれに続くセファデックスＧ−５０スーパーファ
イン（ファルマシア製）スパンカラムクロマトグラフィ
ーおよびエタノール沈殿によって精製して、ｐＵＣ９の
脱ホスホリルＨｉｎｃＩＩ消化ＤＮＡ断片（１．５μ
ｇ）を得た。このＤＮＡ断片（１．２μｇ）を、上で調
製したペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ遺伝子含有ＨｐａＩ
−ＨｉｎｃＩＩ消化ＤＮＡ断片（７３２ｂｐ）と、ライ
ゲーション緩衝液中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（８単位）存
在下に、１６℃で２０時間にわたってライゲートさせ
た。ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４
に導入して形質転換し、多数のアンピシリン耐性コロニ
ーを得た。２２コロニー中の１つが所望のプラスミドｐ
ＵＣ−ＳＳ１であった。これはＰｓｔＩ（３．４ｋｂ
ｐ）およびＢａｍＨＩ（２．９ｋｂｐおよび０．４５ｋ
ｂｐ）を用いての制限エンドヌクレアーゼ分析によって
確認した。このプロセスを図１に示す。

【００１４】発現プラスミドｐＬＳ−Ｔ２およびｐＬＳ
−Ｔ３の構築 プラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐ（５０μｇ）をＢａｍ
ＨＩ（１２０単位）によりＢａｍＨＩ消化用緩衝液中、
３７℃で１時間消化し、続いて０．８％アガロースゲル
を用いて電気泳動を行って、２種のＤＮＡ断片を得た。
大きい方のＤＮＡ断片（４．５ｋｂｐ）（１６μｇ）を
ＣＩＰで処理して、ｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐの脱ホスホリ
ル化ＢａｍＨＩ消化断片（４μｇ）を得た。他方、ｐＵ
Ｃ−ＳＳ１（１０μｇ）をＢａｍＨＩ（６０単位）で消
化して、２種のＤＮＡ断片（２．６ｋｂｐおよび４６４
ｂｐ）を得た。小さい方のＤＮＡ断片（４６４ｂｐ）を
０．８％アガロースゲルを用いる電気泳動によって精製
した。得られたＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片（４６４ｂ
ｐ）（３６ｎｇ）および上記ｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐの脱
ホスホリル化ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片（２００ｎｇ）
とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（４単位）の存在下に１６℃で
２０時間インキュベートした。このライゲーション混合
物によりＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１を形質転換し、アン
ピシリン耐性コロニーを得た。１２コロニーのうちの７
つは、２シストロン性のペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ遺
伝子を有するプラスミド（ｐＬＳ−Ｔ２と名付ける）で
あり、１つは３シストロン性のペプチドＬＨ融合ＩＧＦ
−Ｉ遺伝子を有するプラスミド（ｐＬＳ−Ｔ３と名付け
る）であった。これらは制限エンドヌクレアーゼ分析に
より確認された［ｐＬＳ−Ｔ２：ＰｓｔＩ−ＰｖｕＩＩ
（１．５、３．４ｋｂｐ）、ＥｃｏＲＩ（１９８、２６
６ｂｐ）、ＰｓｔＩ−ＳａｌＩ（３．０、２．０ｋｂ
ｐ）、ＨｐａＩ（４．９８ｋｂｐ）；ｐＬＳ−Ｔ３：Ｐ
ｓｔＩ−ＰｖｕＩＩ（１．５、３．９ｋｂｐ）、Ｅｃｏ
ＲＩ（１９８、２６６ｂｐ）、ＰｓｔＩ−ＳａｌＩ
（３．０、２．５ｋｂｐ）、ＨｐａＩ（５．４５ｋｂ
ｐ）］。このプロセスを図２に示す。プラスミドｐＬＳ
−Ｔ２を含有するＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１をＥ．ｃｏ
ｌｉＦ−１０、プラスミドｐＬＳ−Ｔ３を含有するＥ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１をＥ．ｃｏｌｉ Ｆ−１１と名付
けた。

【００１５】実施例２ ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−ＩのＥ．ｃｏｌｉ Ｆ−１０
での生産 ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬブロス中で
のＥ．ｃｏｌｉ Ｆ−１０の一夜培養物を、グルコース
０．２％、カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）０．５
％、ビタミンＢ₁ ５０μｇ／ｍｌおよびアンピシリン２
５μｇ／ｍｌを含有するＭ９培地で１：２０に稀釈し
た。Ａ₆₀₀ が約０．５となったとき、β−インドールア
クリル酸を最終濃度１０μｇ／ｍｌになるよう添加し
た。つぎに、細胞をインキュベートし、アリコート（培
養液２０ｍｌ）を遠心分離（７ｋｒｐｍ、４０℃、５分
間）で集めた。

【００１６】実施例３ ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−ＩのＥ．ｃｏｌｉ Ｆ−１１
での生産 ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬブロス中で
のＥ．ｃｏｌｉ Ｆ−１１の一夜培養物をグルコース
０．２％、カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）０．５
％、ビタミンＢ₁ ５０μｇ／ｍｌおよびアンピシリン２
５μｇ／ｍｌを含有するＭ９培地で１：２０に稀釈し
た。Ａ₆₀₀ が約０．５となったとき、β−インドールア
クリル酸を最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるよう添加し
た。つぎに、細胞をインキュベートし、アリコート（培
養液２０ｍｌ）を遠心分離（７ｋｒｐｍ、４℃、５分
間）により集めた。

【００１７】実施例４ ペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉの単離と精製Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｆ−１１を誘導後４時間培養し、遠心分離（１４ｋｒ
ｐｍ、４℃）で集めた。湿潤細胞ペースト（１２０ｇ：
培養液２０リットルから）を１０ｍＭリン酸塩緩衝食塩
水（以下ＰＢＳという）−１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）３００ｍｌに懸濁し、−８０℃で凍結した。こ
の混合物を融解し、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ５０ｍｌおよ
び１０ｍｇ／ｍｌリソチーム溶液５０ｍｌに加えた。０
℃で１時間かき混ぜたのち、混合物をホモジナイズし
た。細胞デブリスを２５ｍＭ ＰＢＳ−１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ−０．５％サルコシルナトリウム（ｐＨ８．０）２
リットル中に懸濁し、つぎにこの混合物をホモジナイズ
した。０℃で１時間かき混ぜたのち、混合物を７，００
０ｒｐｍ、４℃で３５分間遠心分離にかけた。ペレット
を１０ｍＭ ＰＢＳ−１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）に懸濁した。混合物をホモジナイズし、上と同じ方
法で遠心分離した。ペレットを６Ｍ塩酸グアニジン−１
００ｍＭトリス−塩酸−１０ｍＭ ＥＤＴＡ−１００ｍ
Ｍ ＤＴＴ（ｐＨ８．０）２００ｍｌに溶解し、４０ｋ
ｒｐｍ、２０℃で１時間遠心分離した。上澄みを集め、
０．１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．０）／８Ｍ尿素および
１０ｍＭ２−メルカプトエタノールで平衡化したセファ
クリルＳ３００スーパーファインカラム（５．０×８
６．６ｃｍ；樹脂１７００ｍｌ）にかけた。溶出は、平
衡化緩衝液を用い、流速０．６ｍｌ／分で、４℃で行っ
た。セファクリルＳ３００（ファルマシア製）クロマト
グラフィーを行って、３５ｍｌの画分を集めた。全ての
クロマトグラフィー工程について、分画の直後にアッセ
イを行った。活性画分を集め、プールした画分５００ｍ
ｌを、１Ｍ酢酸水溶液１６リットルに対して室温で３時
間透析し、つぎに新鮮な１Ｍ酢酸水溶液１６リットルに
対して一夜透析した。透析ずみ画分を凍結乾燥して、所
望の成分を含有するペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉ（１．
２６ｇ）を得た。このペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉは、
１５％ＳＤＳ ＰＡＧＥにおいて分子量１５，５００の
位置にバンドを示す。

【００１８】実施例５ 培養液中のペプチドＬＨ融合ＩＧＦ−Ｉの含量を、放射
免疫検定法（以下ＲＩＡという）を用いて測定し、ＩＧ
Ｆ−Ｉ含量として計算した。ＩＧＦ−Ｉの放射免疫検定
は、矢内原の方法［矢内原ら：ペプチド・ホルモンズ・
イン・パンクレアス，３，２８（１９８３）］に従って
実施した。 方法：上記の試料または標準試料［ＩＧＦ−Ｉ断片（２
６−４６）］０．１ｍｌと試料緩衝液［０．０１Ｍ Ｐ
ＢＳおよび０．０２５ＭＥＤＴＡ中の０．５％牛血清ア
ルブミン（以下、ＢＳＡという）（０．４ｍｌ）］、Ｉ
ＧＦ−Ｉ（２６−４６）のウサギ抗血清（０．１ｍｌ）
および ¹²⁵Ｉ−ＩＧＦ−Ｉ（２６−４６）（０．１ｍ
ｌ）を混合した。混合物を４℃で４８時間放置し、つぎ
に、ウサギ血清（０．１ｍｌ）、ウサギγ−グロブリン
抗血清（０．１ｍｌ）および５％ＰＥＧ６０００ ０．
９ｍｌ）を添加した。さらに２時間４℃に放置したの
ち、遠心分離（３ｋｒｐｍ、４℃、３０分間）によって
ペレットを集め、γ−カウンターにより放射能を測定し
た。この放射能からＩＧＦ−Ｉ含量を計算した。

【００１９】結果：それぞれ実施例２および実施例３に
記載の方法によって調製した培養液（２０ｍｌ）（Ｍ９
ブロス中でＥ．ｃｏｌｉ Ｆ−１０およびＥ．ｃｏｌｉ
Ｆ−１１を培養した液）を７，０００ｒｐｍで遠心分
離した。得られた細胞を８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０）（２ｍｌ）に懸濁し、つぎに超音波によ
り破壊した。懸濁液を遠心分離し（１８，０００ｒｐ
ｍ、３０分間、４℃）、上澄みを０．５％ＢＳＡ、１０
ｍＭ ＰＢＳ、２５ｍｌ ＥＤＴＡで稀釈し、ＲＩＡお
よびＨＰＬＣ用の試料として使用した。ＩＧＦ−Ｉ含量
を、発現プラスミドｐＬＨＳｄＭｍｔｒｐを含有する
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆ−６を用いて同様にして調製した培養
液のそれと比較した。

【００２０】

【表１】

【００２１】

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドｐＵＣ−ＳＳ１の構築のプロセス
を示す図である。

【図２】 プラスミドｐＬＳ−Ｔ２およびプラスミドｐ
ＬＳ−Ｔ３の構築を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＤＰ 8314−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 北口 忠司 尼崎市久々知西町１−９−９ (72)発明者 小野 裕樹 大阪府三島郡島本町青葉３−12 シャルマ ンコーポ水無瀬３−402

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメ
   チオニン残基を有するペプチドであって、その保護ペプ
   チドの該メチオニン残基を介してインスリン様成長因子
   Ｉと融合している保護ペプチド融合インスリン成長因子
   Ｉをコードする２個以上のシストロンを有する多シスト
   ロン性遺伝子。
2. 【請求項２】 保護ペプチドが最終のアミノ酸としてメ
   チオニン残基を有するペプチドであって、その保護ペプ
   チドの該メチオニン残基を介してインスリン様成長因子
   Ｉと融合している保護ペプチド融合インスリン成長因子
   Ｉをコードする２個以上のシストロンを有する多シスト
   ロン性遺伝子を含有する発現プラスミドにより形質転換
   された微生物。