JPS63185385A - プラスミドベクタ− - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
て発現し、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺伝
子のクローニングに使用されるプラスミドベクター；ク
ローニングベクター及びヒト生長ホルモン構造遺伝子を
包含してなる組換ＤＮＡ分子；及び構造遺伝子を発現さ
せることができ、かつヒト生長ホルモンを高収率で産生
ずる組換ＤＮＡ分子によって形質転換された微生物に係
る。
子のクローニングに使用されるプラスミドベクター；ク
ローニングベクター及びヒト生長ホルモン構造遺伝子を
包含してなる組換ＤＮＡ分子；及び構造遺伝子を発現さ
せることができ、かつヒト生長ホルモンを高収率で産生
ずる組換ＤＮＡ分子によって形質転換された微生物に係
る。
本発明は、前記形質転換された微生物を好適な培養環境
で培養し、このようにして合成されたホルモンを菌から
回収することからなるヒト生長ホルモンの製法にも係る
。
で培養し、このようにして合成されたホルモンを菌から
回収することからなるヒト生長ホルモンの製法にも係る
。
ヒト生長ホルモン（ｈＧＨ）は、通常、各個人の生存中
、下垂体前葉で産生され、分泌されるもので、３一 成人期前では、その産生量も多い。
、下垂体前葉で産生され、分泌されるもので、３一 成人期前では、その産生量も多い。
このホルモンは、アミノ末端部に分泌シグナル配列及び
成熟ｈＧ）Ｉタンパク質の配列を含有する前駆体（ｐｒ
ｅ − ｈＧＨ）の形で産生される。分泌過程の間に、
シグナル配列は膜レベルにおいて除去され、成熟タンパ
ク質が分泌される。
成熟ｈＧ）Ｉタンパク質の配列を含有する前駆体（ｐｒ
ｅ − ｈＧＨ）の形で産生される。分泌過程の間に、
シグナル配列は膜レベルにおいて除去され、成熟タンパ
ク質が分泌される。
生長ホルモンはアミノ酸１９１個で構成されており、分
子量２１，５００ダルトンを有する。
子量２１，５００ダルトンを有する。
唐
作用機態は末だ明確ではないが、ｈＧＨは骨格の生長、
窒素の固定及びタンパク質合成を促進し、脂質及び糖質
の代謝に影響を及ぼす。
窒素の固定及びタンパク質合成を促進し、脂質及び糖質
の代謝に影響を及ぼす。
ホルモン欠損による各種障害は、これまで、死体の下垂
体から単離されたヒト生長ホルモンを使用して治療され
ていた。しかしながら、かかるホルモンの単離及び精製
の操作は煩雑であり、かつ高価である。
体から単離されたヒト生長ホルモンを使用して治療され
ていた。しかしながら、かかるホルモンの単離及び精製
の操作は煩雑であり、かつ高価である。
さらに、得られるホルモンの量が少ないため、ｈＱＨに
よる治療は最も重篤なケースにのみ限られており、従っ
て、このホルモンを手ごろなコスト、良好な生産量で製
造できる他の方法の開発が希求４一 されていた。
よる治療は最も重篤なケースにのみ限られており、従っ
て、このホルモンを手ごろなコスト、良好な生産量で製
造できる他の方法の開発が希求４一 されていた。
遺伝子工学の分野における近年の発展により、異種遺伝
子を含有するハイブリッドＤＮＡ分子を構成し、このハ
イブリッド分子によって形質転換された微生物を培養し
て、構造遺伝子に係る暗号づけタンパク質を生産できる
ようになってきた。
子を含有するハイブリッドＤＮＡ分子を構成し、このハ
イブリッド分子によって形質転換された微生物を培養し
て、構造遺伝子に係る暗号づけタンパク質を生産できる
ようになってきた。
各種技術文献及び特許明細書には組換ＤＮＡ技術による
ヒト生長ホルモンの生産に係る多数の方法が開示されて
いる。
ヒト生長ホルモンの生産に係る多数の方法が開示されて
いる。
英国特許出願第２，０５５，９８２号はハイブリッドプ
ラスミドベクターを構成し、このハイブリッドプラスミ
ドベクターを使用して形質転換せしめたエシェリキア−
］リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） （Ｅ 、
コリと表示する）の菌株を培養することによる半合
成遺伝子、さらに詳述すればｈＧＨ遺伝子の発現に関す
るものである。
ラスミドベクターを構成し、このハイブリッドプラスミ
ドベクターを使用して形質転換せしめたエシェリキア−
］リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） （Ｅ 、
コリと表示する）の菌株を培養することによる半合
成遺伝子、さらに詳述すればｈＧＨ遺伝子の発現に関す
るものである。
ヨーロッパ特許公開第２０，１４７号には、ヒト生長ホ
ルモンベクター及び該ベクターによって形質転換された
Ｅ，コリの菌株が開示されている。
ルモンベクター及び該ベクターによって形質転換された
Ｅ，コリの菌株が開示されている。
しかしながら、これらの公知の方法は、Ｅ．コリ （通
常、ヒト又は動物の腸管系に存在する病原性ダラム陰性
細菌である）での発現ベクターを使用してｈＧｌ（を生
産するものである。
常、ヒト又は動物の腸管系に存在する病原性ダラム陰性
細菌である）での発現ベクターを使用してｈＧｌ（を生
産するものである。
形質転換されたＥ、コリ の菌株を発酵させるためには
、汚染及び伝染を防止するよう制御された培養システム
を使用する必要がある。
、汚染及び伝染を防止するよう制御された培養システム
を使用する必要がある。
工業的には、バシラス属の菌は、Ｅ、コリ の菌株に代
わる好適な代用細菌である。これは、バシラス属の菌が
非病原性であり、容易に培養可能であり、かつ発酵工業
において長期間使用されてきているものである（Ｄｅ
ｂａｂｏｖ ｒザ・モレキュラー・バイオロジー・オン
・ザ・バシリー（７ｈｅＭｏｌｅ−ｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ） １ 、３
３２ （１９８２））ことによる。
わる好適な代用細菌である。これは、バシラス属の菌が
非病原性であり、容易に培養可能であり、かつ発酵工業
において長期間使用されてきているものである（Ｄｅ
ｂａｂｏｖ ｒザ・モレキュラー・バイオロジー・オン
・ザ・バシリー（７ｈｅＭｏｌｅ−ｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂａｃｉｌｌｉ） １ 、３
３２ （１９８２））ことによる。
しかし、異種タンパク質の生産における宿主微生物とし
てバシラス属の菌を使用することは、これまで制限され
ていた。これは、主として、異種遺伝子を有効に発現さ
せかつその暗号づけタンパク質を高収率で産生ずるクロ
ーニングベクターに欠けていたためである。
てバシラス属の菌を使用することは、これまで制限され
ていた。これは、主として、異種遺伝子を有効に発現さ
せかつその暗号づけタンパク質を高収率で産生ずるクロ
ーニングベクターに欠けていたためである。
発明者らは、バシラス属の菌の細胞内に好適な状態で保
有されうる（これにより、公知技術の問題点が解消され
る）クローニングベクターを開発し、本発明に至った。
有されうる（これにより、公知技術の問題点が解消され
る）クローニングベクターを開発し、本発明に至った。
従って、本発明の第１の目的はバシラス属の菌において
発現可能であって、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する
構造遺伝子をクローニングするために使用されるプラス
ミドベクターにある。
発現可能であって、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する
構造遺伝子をクローニングするために使用されるプラス
ミドベクターにある。
本発明の他の目的は、ヒト生長ホルモンを遺伝 ゛
暗号化するヌクレオチド配列にクローニングベクターを
結合せしめることにより得られるバシラス属細菌におい
てヒト生長ホルモンを発現する組換ＤＮＡ分子にある。
暗号化するヌクレオチド配列にクローニングベクターを
結合せしめることにより得られるバシラス属細菌におい
てヒト生長ホルモンを発現する組換ＤＮＡ分子にある。
本発明の他の目的は、生長ホルモン構造遺伝子を発現さ
せることができ、これにより、生長ホルモンを高収率で
産生しうる組換ＤＮＡ分子によって形質転換されたバシ
ラス属の微生物にある。
せることができ、これにより、生長ホルモンを高収率で
産生しうる組換ＤＮＡ分子によって形質転換されたバシ
ラス属の微生物にある。
本発明のさらに他の目的は、形質転換された微生物を適
当な培養環境で培養し、合成されたホルモンを菌から分
離することからなるヒト生長ホル７一 モンの製法にある。
当な培養環境で培養し、合成されたホルモンを菌から分
離することからなるヒト生長ホル７一 モンの製法にある。
本発明の他の目的については、後述の実施例等の記載よ
り明らかになるであろう。
り明らかになるであろう。
本発明によれば、クローニングベクターは、特開昭６１
−２５７，１８９号記載のベクターｐｓＭ １４３（Ａ
ＴＣＣ５３０３８）を源とし、７５０塩基対（ｂｐ）Ｘ
ｂａ Ｉ −ＥｃｏＲＩフラグメントを下記配列を有す
る合成７３ｂｐフラグメントにより置換することによっ
て構成される。
−２５７，１８９号記載のベクターｐｓＭ １４３（Ａ
ＴＣＣ５３０３８）を源とし、７５０塩基対（ｂｐ）Ｘ
ｂａ Ｉ −ＥｃｏＲＩフラグメントを下記配列を有す
る合成７３ｂｐフラグメントにより置換することによっ
て構成される。
７３ｂｐフラグメントを調製してプロモーター配列及び
リボゾーム認識配列（ＲＢＳ）を得る。これら両配列は
、ＲＮＡポリメラーゼ及びバシラス属細菌リボゾームに
よって認識されるものである。上述の配列のコントロー
ル下で配置されたヒト生長ホルモンの構造遺伝子を効果
的に発現させる。
リボゾーム認識配列（ＲＢＳ）を得る。これら両配列は
、ＲＮＡポリメラーゼ及びバシラス属細菌リボゾームに
よって認識されるものである。上述の配列のコントロー
ル下で配置されたヒト生長ホルモンの構造遺伝子を効果
的に発現させる。
さらに詳述すれば、プラスミドベクターｐｓＭ１４３（
その制限酵素地図を第１図に示す）を、緩衝液中、３７
６Ｃにおいて制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ Ｉで１時
間消化する。ついで、反応混合物をフェノール−クロロ
ホルム及びクロロホルム−イソアミルで処理することに
よって酵素反応を停止させ、ＤＮＡを沈殿、分離し、最
後に７３ｂｐ合成フラグメントに結合させる。この結合
反応は、緩衝液中、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、１
４℃において、約６時間で行なわれる。Ｅ、つり のコ
ンピテント菌を形質転換させるために全リガーゼ混合物
を使用し、形質転換された菌をアンピシリンを含有する
プレート上で選別する。
その制限酵素地図を第１図に示す）を、緩衝液中、３７
６Ｃにおいて制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ Ｉで１時
間消化する。ついで、反応混合物をフェノール−クロロ
ホルム及びクロロホルム−イソアミルで処理することに
よって酵素反応を停止させ、ＤＮＡを沈殿、分離し、最
後に７３ｂｐ合成フラグメントに結合させる。この結合
反応は、緩衝液中、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、１
４℃において、約６時間で行なわれる。Ｅ、つり のコ
ンピテント菌を形質転換させるために全リガーゼ混合物
を使用し、形質転換された菌をアンピシリンを含有する
プレート上で選別する。
得られた陽性のクローン（ＡｍｐＲ）の中から、７５０
ｂｐ７ラグメントＥｃｏＲＩ −Ｘｂａ Ｉが７３ｂｐ
合成フラグメントで置換されているプラスミドを含有す
るクローンを選別する。
ｂｐ７ラグメントＥｃｏＲＩ −Ｘｂａ Ｉが７３ｂｐ
合成フラグメントで置換されているプラスミドを含有す
るクローンを選別する。
ついで、このプラスミド（Ｔ）ＳＭ ２０８と称する）
を使用して、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺
伝子をクローン化し、組換ＤＮＡ分子を構成する。
を使用して、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺
伝子をクローン化し、組換ＤＮＡ分子を構成する。
生長ホルモンの構造遺伝子はＭａｎｉａｔｉｓらの方法
（「モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリー−
ｖ＝ユアル（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ＋
Ａ Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）ｊ ｐ
１３５．１４０．１４３−Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ １９８２）、実際に使用されている合成法
の１つ（［オリゴヌクレオチド・シンセシスープラクテ
ィカル・アプローチ・シリーズ（Ｏｌｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｓＳｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ ５ｅｒｉｅｓ）Ｊ ＩＲＬＰｒｅ
ｓｓ Ｌｉｍｌｔｅｄ発行）又はＧｏｅｄｄｅｌらの半
合成法（「ネーチ−？ −（Ｎａｔｕｒｅ）Ｊ ２８１
． ｐ ５４４（１９７９） ）により得られる。
（「モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリー−
ｖ＝ユアル（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ＋
Ａ Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ）ｊ ｐ
１３５．１４０．１４３−Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨ
ａｒｂｏｒ １９８２）、実際に使用されている合成法
の１つ（［オリゴヌクレオチド・シンセシスープラクテ
ィカル・アプローチ・シリーズ（Ｏｌｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅｓＳｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ ５ｅｒｉｅｓ）Ｊ ＩＲＬＰｒｅ
ｓｓ Ｌｉｍｌｔｅｄ発行）又はＧｏｅｄｄｅｌらの半
合成法（「ネーチ−？ −（Ｎａｔｕｒｅ）Ｊ ２８１
． ｐ ５４４（１９７９） ）により得られる。
遺伝子の調製法は本発明を限定するものではない。本発
明によればｈＧＨの構造遺伝子は、たとえば半合成法に
より調製される。
明によればｈＧＨの構造遺伝子は、たとえば半合成法に
より調製される。
さらに詳述すれば、全ＲＮＡをヒト下垂体組織から単離
し、その後、オリゴ（ｄＴ）セルロース上での親和性ク
ロマトグラフィーにより、ｍＲＮＡ（ＲＮＡポリアデニ
レート）を全ＲＮＡから分離する（Ｅｄｍｏｎｄｓら「
プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オン・サイイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド
・ステーブ・オン・アメリカ（Ｐｒｏｃ。
し、その後、オリゴ（ｄＴ）セルロース上での親和性ク
ロマトグラフィーにより、ｍＲＮＡ（ＲＮＡポリアデニ
レート）を全ＲＮＡから分離する（Ｅｄｍｏｎｄｓら「
プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オン・サイイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド
・ステーブ・オン・アメリカ（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ）Ｊ ６
８． ｐ １３３６（１９７１））。
８． ｐ １３３６（１９７１））。
ついで、得られたｍＲＮＡを使用し、Ｍａｎｉａｔｉｓ
らの方法（ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌｊｐ ２１７
． Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９ｇ２
）に従ってｃＤＮＡを合成する。
らの方法（ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌｊｐ ２１７
． Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９ｇ２
）に従ってｃＤＮＡを合成する。
得られた下垂体ｃＤＮＡ分子を旧ｎｄＩＩ［合成リンカ
−（Ｂｉｏｌａｂｓ）に結合させ、プラスミドｐＢＲ３
２２の旧ｎｄ■制限位置に挿入する。ついで、得られた
ハイブリッドプラスミド（ｐＢＲ３２２−ｃＤＮＡ）を
使用して、アンピシリン耐性を有するＥ、コリ の菌を
形質転換させる。
−（Ｂｉｏｌａｂｓ）に結合させ、プラスミドｐＢＲ３
２２の旧ｎｄ■制限位置に挿入する。ついで、得られた
ハイブリッドプラスミド（ｐＢＲ３２２−ｃＤＮＡ）を
使用して、アンピシリン耐性を有するＥ、コリ の菌を
形質転換させる。
陽性のクローンを、ハイブリダイゼーション法により、
ｈＧＨ遺伝子のヌクレオチド領域に対して相補的関係に
あるＤＮＡプローブを使用して検索し、ハイブリッドプ
ラスミドがｐＢＲ３２２及びｈＧＨ遺伝子のｃＤＮＡを
含有してなるものであるクローンを単離する。これらプ
ラスミドの１つからｈＧＨのｃＤＮＡを単離し、プラス
ミドｐＵＣ９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）にサブ−クロー
ン化して、プラスミドＩ）ＷＨＡ ４１を得る（第２図
）。
ｈＧＨ遺伝子のヌクレオチド領域に対して相補的関係に
あるＤＮＡプローブを使用して検索し、ハイブリッドプ
ラスミドがｐＢＲ３２２及びｈＧＨ遺伝子のｃＤＮＡを
含有してなるものであるクローンを単離する。これらプ
ラスミドの１つからｈＧＨのｃＤＮＡを単離し、プラス
ミドｐＵＣ９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）にサブ−クロー
ン化して、プラスミドＩ）ＷＨＡ ４１を得る（第２図
）。
次に、ＨｉｎｄｌＩ［リンカ−を、プラスミドｐＷＨＡ
４１内に、ｈＧＨを遺伝暗号化するｃＤＮＡの末端にお
いて挿入する。
４１内に、ｈＧＨを遺伝暗号化するｃＤＮＡの末端にお
いて挿入する。
さらに詳述すれば、プラスミドｐＷＨＡ ４１を制限酵
素Ｓｍａ Ｉ で切断し、沈殿せしめ、反応混合物か
ら分離する。
素Ｓｍａ Ｉ で切断し、沈殿せしめ、反応混合物か
ら分離する。
ついで、緩衝液中、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、２
３℃において約１４時間反応させることにより、得られ
たプラスミドＤＮＡを旧ｎｄＩＩ［ｄ（ＧＡＡＧＣＴＴ
Ｃ）合成リンカ−に結合させる。反応混合物をフェノー
ル−クロロホルム及びクロロホルム−イソアミルの溶液
で抽出することによって酵素反応を停止させプラスミド
ＤＮＡを沈殿、分離し、緩衝液中で制限酵素上ｎｄＩＩ
Ｉによって消化する。フェノール−クロロホルム及びク
ロロホルム−イソアミルによる抽出を行なって該酵素反
応を停止させ、ＤＮＡを沈殿させる。
３℃において約１４時間反応させることにより、得られ
たプラスミドＤＮＡを旧ｎｄＩＩ［ｄ（ＧＡＡＧＣＴＴ
Ｃ）合成リンカ−に結合させる。反応混合物をフェノー
ル−クロロホルム及びクロロホルム−イソアミルの溶液
で抽出することによって酵素反応を停止させプラスミド
ＤＮＡを沈殿、分離し、緩衝液中で制限酵素上ｎｄＩＩ
Ｉによって消化する。フェノール−クロロホルム及びク
ロロホルム−イソアミルによる抽出を行なって該酵素反
応を停止させ、ＤＮＡを沈殿させる。
ついで、沈殿物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、緩
衝液中に再懸濁化させ、１４°Ｃにおいて１４時間処理
した後、全リガーゼ混合物を使用してＥ、コリのコンピ
テント菌ＪＭ １０１（ＢＲＬ）を形質転換させる。
衝液中に再懸濁化させ、１４°Ｃにおいて１４時間処理
した後、全リガーゼ混合物を使用してＥ、コリのコンピ
テント菌ＪＭ １０１（ＢＲＬ）を形質転換させる。
得られた組換体から、アンピシリン含有プレート上での
選別により陽性コロニー（ＡｍｐＲ）を単離し、これか
らプラスミドＤＮＡを抽出し、分析する。
選別により陽性コロニー（ＡｍｐＲ）を単離し、これか
らプラスミドＤＮＡを抽出し、分析する。
分析の結果、上記コロニーからのＤＮＡは、Ｓｍａ Ｉ
部位の位置に旧ｎｄＩＩＩ制限部位を含有することが認
められる。
部位の位置に旧ｎｄＩＩＩ制限部位を含有することが認
められる。
プラスミドの酵素消化によって２つのフラグメントを生
成する。１つは約６８０個の塩基対を含有し、ｈＧＨの
構造遺伝子を代表するものである。陽性クローンの１つ
をＪＭ １１０１（ｐＳ ２０９）と称する。
成する。１つは約６８０個の塩基対を含有し、ｈＧＨの
構造遺伝子を代表するものである。陽性クローンの１つ
をＪＭ １１０１（ｐＳ ２０９）と称する。
ｐＳＭ ２０９から単離したプラスミドＤＮＡを使用し
て、アミノ酸１７からアミノ酸１９１までのｈＧ）Ｉを
単離する。
て、アミノ酸１７からアミノ酸１９１までのｈＧ）Ｉを
単離する。
プラスミドｐＳＭ ２０９を制限酵素ＦｎｕＤＩ［（Ｄ
ＮＡのレベルでアミノ酸１６と１７との間を切断する）
及びＨｉｎｄｌｌｌ （停止コドンの下手部を切断する
）により切断する（第２図）。
ＮＡのレベルでアミノ酸１６と１７との間を切断する）
及びＨｉｎｄｌｌｌ （停止コドンの下手部を切断する
）により切断する（第２図）。
消化反応を公知の一般法に従って行ない、ｈＧＨ１７−
１９１の遺伝暗号化配列を含有する５３０１）ｐ ＤＮ
ＡフラグメントＦｎｕｄ ｎ−旧ｎｄｌＩ を、アクリ
ルアミドゲル上での電気泳動によって反応混合物から分
離し、Ｍａｘａｍ及びＧｉ １ｂｅｒｔの方法（「メソ
ッズ・イン・エンザイモロギ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ）Ｊ６５巻、ｐ ４９９−５６０
（１９８０））によって溶出する。
１９１の遺伝暗号化配列を含有する５３０１）ｐ ＤＮ
ＡフラグメントＦｎｕｄ ｎ−旧ｎｄｌＩ を、アクリ
ルアミドゲル上での電気泳動によって反応混合物から分
離し、Ｍａｘａｍ及びＧｉ １ｂｅｒｔの方法（「メソ
ッズ・イン・エンザイモロギ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ）Ｊ６５巻、ｐ ４９９−５６０
（１９８０））によって溶出する。
ついで、ｈＧＨの初めの１６個のアミノ酸を遺伝暗号化
し、これによりＦｎｕＤ ＩＩ制限部位を再構成する４
７ ｂｐ配列に５３０ｂｐ配列を結合せしめることによ
り、ヒト生長ホルモンの完全配列を再構成する。
し、これによりＦｎｕＤ ＩＩ制限部位を再構成する４
７ ｂｐ配列に５３０ｂｐ配列を結合せしめることによ
り、ヒト生長ホルモンの完全配列を再構成する。
４７ｂｐ合成フラグメントについては、５３０ｂｌ）フ
ラグメントＦｎｕＤｎ−旧ｎｄＩＩＩへの結合前、リン
酸エステル化しておく。なお、４７ｂｐフラグメントの
配列は下記のとおりである。
ラグメントＦｎｕＤｎ−旧ｎｄＩＩＩへの結合前、リン
酸エステル化しておく。なお、４７ｂｐフラグメントの
配列は下記のとおりである。
ＴＴＣＣＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣ
ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＣＴＣＣＧＡＡＧ
ＧＧＴＴＧＧＴＡＡＧＧＧＡＡＴＡＧＧＴＣＣＧＡＡＡ
ＡＡＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＡＣＧＡＧＧＣＦｎｕＤＩ＋ リガーゼによる反応（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で
行なわれる）を、フェノール−クロロホルム及びクロロ
ホルム−イソアミルによって停止し、沈殿後、ＤＮＡを
酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉで消化する。
ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＣＴＣＣＧＡＡＧ
ＧＧＴＴＧＧＴＡＡＧＧＧＡＡＴＡＧＧＴＣＣＧＡＡＡ
ＡＡＣＴＧＴＴＧＣＧＡＴＡＣＧＡＧＧＣＦｎｕＤＩ＋ リガーゼによる反応（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で
行なわれる）を、フェノール−クロロホルム及びクロロ
ホルム−イソアミルによって停止し、沈殿後、ＤＮＡを
酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉで消化する。
ついで、全消化混合物をアクリルアミド上で１３０■、
３時間で展開する。直線状分子を含有する約５８０ ｂ
ｐのバンドは、直線状フラグメントＦｎｕＤｎ−Ｈｉｎ
ｄｎｌ （５３０ｂｐ）で構成されており、４７ ｂｐ
合成フラグメントを電気溶出する。
３時間で展開する。直線状分子を含有する約５８０ ｂ
ｐのバンドは、直線状フラグメントＦｎｕＤｎ−Ｈｉｎ
ｄｎｌ （５３０ｂｐ）で構成されており、４７ ｂｐ
合成フラグメントを電気溶出する。
４７ ｂｐ配列はＦｎｕｄ ｎ−旧ｎｄＩ［（５３０ｂ
ｐ）フラグメントに２つの方向で結合されうるが、その
一方のみがＰｎｕＤ ＩＩ制限部位を再構成し、これに
より、ヒト生長ホルモンの完全構造遺伝子を形成するも
のである。
ｐ）フラグメントに２つの方向で結合されうるが、その
一方のみがＰｎｕＤ ＩＩ制限部位を再構成し、これに
より、ヒト生長ホルモンの完全構造遺伝子を形成するも
のである。
１６一
本発明に従って、予じめ制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉ 及び
ＥｃｏＲＩにより消化し、下記配列を有する合成フラグ
メント（その末端３′にメチオニン遺伝暗号化トリプレ
ットを含有する）に結合せしめたプラスミドｐｕｃ ８
において、５８０ ｂｐフラグメントをクローン化する
。
ＥｃｏＲＩにより消化し、下記配列を有する合成フラグ
メント（その末端３′にメチオニン遺伝暗号化トリプレ
ットを含有する）に結合せしめたプラスミドｐｕｃ ８
において、５８０ ｂｐフラグメントをクローン化する
。
ＲＢＳ ｍｅｔ
ＡＡＴＴＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＴＴＴ
ＣＣＴＣＣＴ−ＴＡＡＧＡＡＴＡＣｃｏＲＩ この合成フラグメントは、前記プラスミドの末端５′に
相補的配列が存在するため、ｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ末端
にのみ結合しうる。
ＣＣＴＣＣＴ−ＴＡＡＧＡＡＴＡＣｃｏＲＩ この合成フラグメントは、前記プラスミドの末端５′に
相補的配列が存在するため、ｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ末端
にのみ結合しうる。
プラスミドｐＵＣ８と５８０ ｂｐフラグメントとの間
のりガーゼ反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、１
４℃において約６時間で行なわれる。
のりガーゼ反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、１
４℃において約６時間で行なわれる。
酵素を不活性化した後、リガーゼ混合物を使用して、Ｅ
、コリ ＪＭ １０１のコンピテント菌を形質転換せし
め、形質転換されたものをアンピシリン耐性に基き選別
する。
、コリ ＪＭ １０１のコンピテント菌を形質転換せし
め、形質転換されたものをアンピシリン耐性に基き選別
する。
ついで、プラスミドＤＮＡを陽性クローンから抽出し、
酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄ１ｍで消化し、アガロースゲ
ル上１００Ｖ、 ２時間で分離する。
酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄ１ｍで消化し、アガロースゲ
ル上１００Ｖ、 ２時間で分離する。
ｈＧｌ（構造遺伝子の完全配列及びメチオニン配列から
構成された５９０ ｂｐフラグメントを含有するハイブ
リッドプラスミドが見出だされる。５３０１）ｐフラグ
メントに対する４７ ｂｐ配列の結合方向が正しいこと
を、以下の方法によってチェックする。
構成された５９０ ｂｐフラグメントを含有するハイブ
リッドプラスミドが見出だされる。５３０１）ｐフラグ
メントに対する４７ ｂｐ配列の結合方向が正しいこと
を、以下の方法によってチェックする。
上述の如くして得られたハイブリッドプラスミドを酵素
ＦｎｕＤ ＩＩにより３７°Ｃにおいて１時間消化し、
酵素を不活性化した後、消化混合物をアクリルアミドゲ
ル上で１１０■で３時間展開する。この際、これらプラ
スミドの１つ（Ｔ）ＳＭ ２１０と称する）がｈＧＨの
構造遺伝子内で酵素ＦｎｕＤ ＩＩで切断されているこ
と（これにより、５３０ ｔ）ｐフラグメントに対して
４７ ｂｐ配列が正確な方向で結合していることを示す
）が観察される。
ＦｎｕＤ ＩＩにより３７°Ｃにおいて１時間消化し、
酵素を不活性化した後、消化混合物をアクリルアミドゲ
ル上で１１０■で３時間展開する。この際、これらプラ
スミドの１つ（Ｔ）ＳＭ ２１０と称する）がｈＧＨの
構造遺伝子内で酵素ＦｎｕＤ ＩＩで切断されているこ
と（これにより、５３０ ｔ）ｐフラグメントに対して
４７ ｂｐ配列が正確な方向で結合していることを示す
）が観察される。
本発明によれば、予じめ制限酵素によって切断せしめた
プラスミドベクターｐｓＭ ２０ｇを、ｐＳＭ ２１０
から単離された約５９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−旧ｎｄＩ［
Ｉフラグメントに結合させることによって組換ＤＮＡ分
子が構成される。
プラスミドベクターｐｓＭ ２０ｇを、ｐＳＭ ２１０
から単離された約５９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−旧ｎｄＩ［
Ｉフラグメントに結合させることによって組換ＤＮＡ分
子が構成される。
さらに詳述すれば、プラスミドｐＳＭ ２０８を緩衝液
中、３７℃において旧ｎｄｌＩＩ及びＥｃｏＲＩによっ
て連続して切断する。ついで、酵素反応を停止させ、Ｄ
ＮＡをエタノールで沈殿させ、反応混合物から分離する
。
中、３７℃において旧ｎｄｌＩＩ及びＥｃｏＲＩによっ
て連続して切断する。ついで、酵素反応を停止させ、Ｄ
ＮＡをエタノールで沈殿させ、反応混合物から分離する
。
つづいて、ｐＳＭ ２１０から単離したＥｃｏＲＩ −
Ｈｉｎｄ■フラグメントに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存
在下でＤＮＡを結合させ、全リガーゼ混合物を使用して
、バシラス属のコンピテント菌を形質転換させる。
Ｈｉｎｄ■フラグメントに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存
在下でＤＮＡを結合させ、全リガーゼ混合物を使用して
、バシラス属のコンピテント菌を形質転換させる。
宿主微生物として使用できるバシラス属の菌の例として
は、Ｂ、サチリス、Ｂ、アミロリキファシエンス（Ｂ
、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ、セレウ
ス（Ｂ 、ｃｅｒｅｕｓ）及びＢ、リケニホルミス（Ｂ
、１ｉｃｈｅｎｉ−ｆｏｒｍｉｓ）がある。これらの
中で、特にＢ、サチリスが好適である。
は、Ｂ、サチリス、Ｂ、アミロリキファシエンス（Ｂ
、ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ、セレウ
ス（Ｂ 、ｃｅｒｅｕｓ）及びＢ、リケニホルミス（Ｂ
、１ｉｃｈｅｎｉ−ｆｏｒｍｉｓ）がある。これらの
中で、特にＢ、サチリスが好適である。
本発明では、発明者らの実験室で単離されたＢ。
サチリスＳＭＳ １０８（ＮＲＲＬＢ １５８９８）
（ｈｉｓ、 ｌｅｕ、 ｍｅｔ。
（ｈｉｓ、 ｌｅｕ、 ｍｅｔ。
ｒｅｃＥ４． ｎｐｒ−）を使用する。このＢ サチリ
スを、Ｃｏｎｔｅｎｔｅ及びＤｕｂｎａｕにより開示さ
れた方法（ｒＭｏｌ。
スを、Ｃｏｎｔｅｎｔｅ及びＤｕｂｎａｕにより開示さ
れた方法（ｒＭｏｌ。
Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｔ、ｊ １６７、２５１−２５８ （
１９７９））によってコンピテントとし、形質転換体を
カナマイシン耐性に基いて選別する。ついで、陽性クロ
ーンをプラスミドＤＮＡの急速抽出法により検討する。
１９７９））によってコンピテントとし、形質転換体を
カナマイシン耐性に基いて選別する。ついで、陽性クロ
ーンをプラスミドＤＮＡの急速抽出法により検討する。
この際、これらの１つに、９８Ｍ２０８とｈＧＨの構造
遺伝子を含有する５９０ ｂｐフラグメントとから構成
されたハイブリッドプラスミドｐｓＭ ２１２を含有す
るものであることが観察される。なお、微生物Ｂ、サチ
リスＳＭ３１０８ （ｐＳＭ ２１２）については、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション・センタ
ー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）にＡＴＣＣ執６７
０９７として寄託しである（１９８６年４月１８日）。
遺伝子を含有する５９０ ｂｐフラグメントとから構成
されたハイブリッドプラスミドｐｓＭ ２１２を含有す
るものであることが観察される。なお、微生物Ｂ、サチ
リスＳＭ３１０８ （ｐＳＭ ２１２）については、ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション・センタ
ー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ）にＡＴＣＣ執６７
０９７として寄託しである（１９８６年４月１８日）。
本発明では、菌株Ｂ、サチリス（ｐＳＭ ２１２）を液
体培地で培養し、溶菌後、成熟ヒト生長ホルモンに相当
するタンパク質の存在を確認する。
体培地で培養し、溶菌後、成熟ヒト生長ホルモンに相当
するタンパク質の存在を確認する。
さらに詳述すれば、形質転換された菌株を、カナマイシ
ンを混入した■Ｙ培地（１）ＩＰｃｏ）中、温度３０な
いし４０℃、約２０時間で培養する。
ンを混入した■Ｙ培地（１）ＩＰｃｏ）中、温度３０な
いし４０℃、約２０時間で培養する。
この時間の経過後、菌懸濁液を遠心分離し、菌を回収し
、緩衝液で洗浄し、公知の一般法に従って溶菌処理する
。
、緩衝液で洗浄し、公知の一般法に従って溶菌処理する
。
つづいて、溶菌物中における生長ホルモンの存在を、エ
レクトロプロティング法（ＴｏｗｂｉｎらｒＰＮＡｓＪ
１９７９、７６、４３５０−４３５４）又はクマシーブ
ルーによる染色法（Ｂ、Ｄ、Ｈｏｍｅｓ及びり、 Ｒｉ
ｃｋｗｏｏｄ ｇｒゲル・エレクトロホレシス・オン・
プロテインズ：ア・プラクティカル・アプローチ（Ｇｅ
ｔ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ−ｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ）Ｊ ＩＲＬＰｒｅｓｓ Ｌｉｍｌｔｅｄ発行）
によって確認する。
レクトロプロティング法（ＴｏｗｂｉｎらｒＰＮＡｓＪ
１９７９、７６、４３５０−４３５４）又はクマシーブ
ルーによる染色法（Ｂ、Ｄ、Ｈｏｍｅｓ及びり、 Ｒｉ
ｃｋｗｏｏｄ ｇｒゲル・エレクトロホレシス・オン・
プロテインズ：ア・プラクティカル・アプローチ（Ｇｅ
ｔ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ−ｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ）Ｊ ＩＲＬＰｒｅｓｓ Ｌｉｍｌｔｅｄ発行）
によって確認する。
確認の結果、分子量２１，５００を有しかつ天然のｈＧ
）Ｉ標準品と同一のタンパク質が、存在する全タンパク
質の１５ないし２０％の量で溶菌物中に存在することを
示した。さらに、免疫プロッティング法による分析の結
果から明らかなように、このタンパク質は抗−ｈＧＨ抗
体と特異的に反応する。
）Ｉ標準品と同一のタンパク質が、存在する全タンパク
質の１５ないし２０％の量で溶菌物中に存在することを
示した。さらに、免疫プロッティング法による分析の結
果から明らかなように、このタンパク質は抗−ｈＧＨ抗
体と特異的に反応する。
エーシンマイヤーフラスコで培養したＢ、サチリスの菌
株５ｌＩＩＳ １０ｇ（ｐＳＭ ２１２）によって産生
されるｈＧＨノ量は、菌体ペースト６９／Ｑ、当り約２
ｏｏｍｇ／ｍ（ｌであった。
株５ｌＩＩＳ １０ｇ（ｐＳＭ ２１２）によって産生
されるｈＧＨノ量は、菌体ペースト６９／Ｑ、当り約２
ｏｏｍｇ／ｍ（ｌであった。
培養を発酵法で実施する場合には、ｈＧＨの量は２ｇ／
ρ以上である。
ρ以上である。
実施例１
プラスミドベクターｐＳＭ ２０８の調製プラスミドｐ
ＳＭ １４３ １１１９を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（！（ｐＨ７，５）、１００ｍＭ ＮａＣρ及び１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｆＬを含有する緩衝溶液２０μρ中、３７°
Ｃ，１時間で制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ Ｉ （Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） １単位により消化した。反応混
合物をフェノール−クロロホルム（１：１ｖ／ｖ）及び
クロロホルム−イソアミル（２４：１ｖ／ｖ）で抽出す
ることによって酵素反応を停止し、最終濃度が０．３Ｍ
となるような量の酢酸ナトリウム及びエタノール２１／
２容を添加してＤＮＡを沈殿させた。沈殿物を遠心分離
法により分離し、６６ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（４（＋）Ｈ７
，６）、１ ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣ（２２及
び１５ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液２０μρ中に再懸
濁化させ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１単位の存在下、１４
℃、６時間で下記の合成フラグメント０．２μｇに結合
させ。
ＳＭ １４３ １１１９を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（！（ｐＨ７，５）、１００ｍＭ ＮａＣρ及び１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｆＬを含有する緩衝溶液２０μρ中、３７°
Ｃ，１時間で制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ Ｉ （Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） １単位により消化した。反応混
合物をフェノール−クロロホルム（１：１ｖ／ｖ）及び
クロロホルム−イソアミル（２４：１ｖ／ｖ）で抽出す
ることによって酵素反応を停止し、最終濃度が０．３Ｍ
となるような量の酢酸ナトリウム及びエタノール２１／
２容を添加してＤＮＡを沈殿させた。沈殿物を遠心分離
法により分離し、６６ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（４（＋）Ｈ７
，６）、１ ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣ（２２及
び１５ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液２０μρ中に再懸
濁化させ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１単位の存在下、１４
℃、６時間で下記の合成フラグメント０．２μｇに結合
させ。
７０℃に１０分間維持することにより反応を停止させ、
Ｍｅｓｓｉｎｇの方法（ｒＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙＪ第１０１巻、２０−７８（１９８３
））によりコンピテントにしたＥ、コリ の菌株ＪＭ
１０１（ＢＲＬ）を形質転換させるために使用した。
Ｍｅｓｓｉｎｇの方法（ｒＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙＪ第１０１巻、２０−７８（１９８３
））によりコンピテントにしたＥ、コリ の菌株ＪＭ
１０１（ＢＲＬ）を形質転換させるために使用した。
形質転換された菌を、アンピシリン５０μｙ／ｍσを含
有するＬＢ（ＤＩＰＣＯ）プレート上でアンピシリ耐性
に基いて選別した。
有するＬＢ（ＤＩＰＣＯ）プレート上でアンピシリ耐性
に基いて選別した。
アンピシリ耐性（Ａｍｐ ）コロニーの１つから単離
されたプラスミドｐＳＭ ２０ｇは第１図に示す制限酵
素地図を有しており、ｐＳＭ １４３のＥｃｏＲＩ −
Ｘｂａ Ｉフラグメントが７３ｂｐ合成フラグメントに
よって置換されていた。
されたプラスミドｐＳＭ ２０ｇは第１図に示す制限酵
素地図を有しており、ｐＳＭ １４３のＥｃｏＲＩ −
Ｘｂａ Ｉフラグメントが７３ｂｐ合成フラグメントに
よって置換されていた。
実施例２
プラスミドｐＷＨＡ ４１における旧ｎｄｌｌＩ部位の
挿入プラスミドｐＷＨＡ ４１０．４μ９を、１５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐｌ（Ｌ５）、１５ｍＭ ＫＣ
ρ、６ ｍＭ ＭｇＣｌ２２及び６ｍＭメルカプトエタ
ノールを含有する緩衝液１０μσ中、２５０Ｃ１１時間
でＳｍａ Ｉ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） １単位によ
って切断した。最終濃度が２０ｍＭとなるまでＥＤＴＡ
（ｐＨ８）を添加し、フェノール−クロロホルム（１：
１ （ｖ／ｖ））及びクロロホルム−イソアミル（２
４： １ （ｖ／ｖ））で抽出することにより反応を
停止させた。反応混合物に最終濃度が０．３Ｍ となる
量で酢酸ナトリウムを添加すると共に、エタノール２１
／２容を添加し、温度 一８０℃に１５分間維持してＤＮＡを沈殿させた。Ｅｐ
ｐ−ｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（モデル５４５０）で遠心
分離した後、沈殿を分離し、減圧乾燥し、６６ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ２（１）Ｈ７，６）、１ ｍＭ ＡＴＰ
、 １ ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ ＭｇＣ＋２２
．１５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び子牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）０．２ｕ／ｚ（！を含有する緩衝
液中に再懸濁化させた。
挿入プラスミドｐＷＨＡ ４１０．４μ９を、１５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐｌ（Ｌ５）、１５ｍＭ ＫＣ
ρ、６ ｍＭ ＭｇＣｌ２２及び６ｍＭメルカプトエタ
ノールを含有する緩衝液１０μσ中、２５０Ｃ１１時間
でＳｍａ Ｉ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） １単位によ
って切断した。最終濃度が２０ｍＭとなるまでＥＤＴＡ
（ｐＨ８）を添加し、フェノール−クロロホルム（１：
１ （ｖ／ｖ））及びクロロホルム−イソアミル（２
４： １ （ｖ／ｖ））で抽出することにより反応を
停止させた。反応混合物に最終濃度が０．３Ｍ となる
量で酢酸ナトリウムを添加すると共に、エタノール２１
／２容を添加し、温度 一８０℃に１５分間維持してＤＮＡを沈殿させた。Ｅｐ
ｐ−ｅｎｄｏｒｆ遠心分離機（モデル５４５０）で遠心
分離した後、沈殿を分離し、減圧乾燥し、６６ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ２（１）Ｈ７，６）、１ ｍＭ ＡＴＰ
、 １ ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ ＭｇＣ＋２２
．１５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び子牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）０．２ｕ／ｚ（！を含有する緩衝
液中に再懸濁化させた。
ＨｉｎｄｌｌＩ ｄ（ＧＡＡＧＣＴＴＣ）リンカ−（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） １ ｐ ｇを、６６ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣ（２（ｐＨ７，６）、１ ｍＡ ＡＴＰ、
１ ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２２．１
５ｍＭ ＤＴＴ、 ＢＳＡ Ｏ，２ｍ９／ＩＩｃ及びＴ
４ ＤＮＡキナーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ） ２単位を含有
する緩衝液１０μρ中でリン酸エステル化させ、３７℃
で１時間インキュベートした。ついで、反応混合物を、
Ｓｍａ Ｉで切断したｐＹＨＡ ４１を含有する同じ溶
液１０μＣに添加し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼＩ単位の存
在下、２３°Ｃで１４時間インキュベートした。０．５
Ｍ ＥＤＴＡを含有する溶液（ｐＨ８）１μσを添加し
て反応を停止させ、フェノール−クロロホルムで１回及
びクロロホルム−イソアミルで１回抽出し、酢酸ナトリ
ウムを溶液に最終濃度が０．３Ｍとなる量で添加した後
、エタノール２１／２容を添加して沈殿させた。溶液を
８０℃に１５分間維持し、ついで１５分間遠心分離した
。このようにして分離したＤＮＡを、５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣ（２（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＮａＣＱ３．５０
ｍＭ ＮａＣＣ及び酵素上ｎｄＩＩＩ （Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ） ２０単位を含有する緩衝液１００μσ中に
再懸濁化し、３７°Ｃで２時間３０分インキュベートし
た。フェノール−クロロホルム及びクロロホルム−イソ
アミルでの抽出により反応を停止し、溶液に酢酸ナトリ
ウムを最終濃度が３Ｍとなるまで添加した後、エタノー
ル２１／２容を添加することによりＤＮＡを沈殿させた
。遠心分離した後、ｌｏｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（＋
）Ｈ８）、Ｉ ｍＭ ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ ＮａＣ
Ｑを含有する溶液５０ｍ１ｉ中にＤＮＡを再懸濁化し、
同じ緩衝液で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０（２
ｍ（１）カラムに注入した。溶出されたＤＮＡを上述の
如く沈殿させ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ （ｐＨ７
，６） 、１０ｍＭ ＭｇＣＬ、１０ｍＭ ＤＴＴＳｌ
ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ） １単位を含有する緩衝液２０μρに再懸濁
化し、１４°Ｃで１４時間インキュベートした。７０℃
に１０分間維持することにより反応を不活化し、Ｅ、コ
リＪＭ １０１（ＢＲＬ）のコンピテント菌Ｑ、３ｒｔ
ｔρを形質転換させるために使用した（ＤＮＡ ｌｎｇ
）。アンピシリン５０μ９／ｍ（ｌを含有するＬＢ（Ｄ
ＩＦＣＯ）プレート上での選別で得られた組換体から白
色のＡｍｐ Ｒコロニー１２個を単離した。
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） １ ｐ ｇを、６６ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣ（２（ｐＨ７，６）、１ ｍＡ ＡＴＰ、
１ ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２２．１
５ｍＭ ＤＴＴ、 ＢＳＡ Ｏ，２ｍ９／ＩＩｃ及びＴ
４ ＤＮＡキナーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ） ２単位を含有
する緩衝液１０μρ中でリン酸エステル化させ、３７℃
で１時間インキュベートした。ついで、反応混合物を、
Ｓｍａ Ｉで切断したｐＹＨＡ ４１を含有する同じ溶
液１０μＣに添加し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼＩ単位の存
在下、２３°Ｃで１４時間インキュベートした。０．５
Ｍ ＥＤＴＡを含有する溶液（ｐＨ８）１μσを添加し
て反応を停止させ、フェノール−クロロホルムで１回及
びクロロホルム−イソアミルで１回抽出し、酢酸ナトリ
ウムを溶液に最終濃度が０．３Ｍとなる量で添加した後
、エタノール２１／２容を添加して沈殿させた。溶液を
８０℃に１５分間維持し、ついで１５分間遠心分離した
。このようにして分離したＤＮＡを、５０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣ（２（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＮａＣＱ３．５０
ｍＭ ＮａＣＣ及び酵素上ｎｄＩＩＩ （Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ） ２０単位を含有する緩衝液１００μσ中に
再懸濁化し、３７°Ｃで２時間３０分インキュベートし
た。フェノール−クロロホルム及びクロロホルム−イソ
アミルでの抽出により反応を停止し、溶液に酢酸ナトリ
ウムを最終濃度が３Ｍとなるまで添加した後、エタノー
ル２１／２容を添加することによりＤＮＡを沈殿させた
。遠心分離した後、ｌｏｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（＋
）Ｈ８）、Ｉ ｍＭ ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ ＮａＣ
Ｑを含有する溶液５０ｍ１ｉ中にＤＮＡを再懸濁化し、
同じ緩衝液で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０（２
ｍ（１）カラムに注入した。溶出されたＤＮＡを上述の
如く沈殿させ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ （ｐＨ７
，６） 、１０ｍＭ ＭｇＣＬ、１０ｍＭ ＤＴＴＳｌ
ｍＭ ＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ） １単位を含有する緩衝液２０μρに再懸濁
化し、１４°Ｃで１４時間インキュベートした。７０℃
に１０分間維持することにより反応を不活化し、Ｅ、コ
リＪＭ １０１（ＢＲＬ）のコンピテント菌Ｑ、３ｒｔ
ｔρを形質転換させるために使用した（ＤＮＡ ｌｎｇ
）。アンピシリン５０μ９／ｍ（ｌを含有するＬＢ（Ｄ
ＩＦＣＯ）プレート上での選別で得られた組換体から白
色のＡｍｐ Ｒコロニー１２個を単離した。
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＴａ１ｔの方法（ｒＲｅｃｏｍ
ｂｉｎａｎｔ ＤＮＡＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ
ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＪ ｐ５０−５１． Ａｄ
ｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ、）によるプラスミドＤＮＡの急速抽出を行ない、
１２個のコロニーについて分析を行なった。得られたＤ
ＮＡ １／２０を、前述の反応混合物ＩＯμρ中、制限
酵素ＨｉｎｄｌｌＩ １単位で切断し、３７℃で３０
分間インキュベートした。７０℃に１０分間維持して酵
素を不活性化した後、ＤＮＡを０．８％アガロースゲル
上に置き、１０（ＩＶ、’２時間で処理し一２７＝ た。１２個すべてのコロニーがＳｍａ ｒ 部位の位
置にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有していた。予想した
ように、ＤＮＡを消化したところ２つのフラグメントに
分割され、その１つは約６９０個の塩基対を含有するも
のであり、ｈＧＨ遺伝子であった。
ｂｉｎａｎｔ ＤＮＡＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ
ＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎＪ ｐ５０−５１． Ａｄ
ｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ、）によるプラスミドＤＮＡの急速抽出を行ない、
１２個のコロニーについて分析を行なった。得られたＤ
ＮＡ １／２０を、前述の反応混合物ＩＯμρ中、制限
酵素ＨｉｎｄｌｌＩ １単位で切断し、３７℃で３０
分間インキュベートした。７０℃に１０分間維持して酵
素を不活性化した後、ＤＮＡを０．８％アガロースゲル
上に置き、１０（ＩＶ、’２時間で処理し一２７＝ た。１２個すべてのコロニーがＳｍａ ｒ 部位の位
置にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有していた。予想した
ように、ＤＮＡを消化したところ２つのフラグメントに
分割され、その１つは約６９０個の塩基対を含有するも
のであり、ｈＧＨ遺伝子であった。
さらに分析を行なうためコロニーの１つ（Ｊｉ１１１吋
（９８Ｍ２０９）と称する）を選択し、単離したプラス
ミドＤＮＡ （ｐＳＭ ２０９と称する）を、Ｍａｎ
ｉａｔ ｉｓら の方法（ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ’Ｍａｎｕａ
ｌ ＪＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８
２）により抽出した。
（９８Ｍ２０９）と称する）を選択し、単離したプラス
ミドＤＮＡ （ｐＳＭ ２０９と称する）を、Ｍａｎ
ｉａｔ ｉｓら の方法（ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ’Ｍａｎｕａ
ｌ ＪＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８
２）により抽出した。
実施例３
ｈＧ）Ｉ構造遺伝子の単離
アミノ酸１７からアミノ酸１９１までの成熟生長ホルモ
ンを遺伝暗号化するＤＮＡ配列を、プラスミドｐＳＭ
２０９から、制限酵素ＦｎｕＤｎ （ＤＮＡをアミノ酸
１６と１７との間で切断する）及び酵素上ｎｄｌｌＩ（
停止コドンの下手部を切断する（第２図））で処理する
ことにより単離した。
ンを遺伝暗号化するＤＮＡ配列を、プラスミドｐＳＭ
２０９から、制限酵素ＦｎｕＤｎ （ＤＮＡをアミノ酸
１６と１７との間で切断する）及び酵素上ｎｄｌｌＩ（
停止コドンの下手部を切断する（第２図））で処理する
ことにより単離した。
その後、プラスミドｐｓＭ ２０９５０ｕ９を、６ＪＴ
ｒｉｓ−ＨＣρ（ｐＨ７，４）。６ ｍＭ ＮａＣＱ、
６ ｍＭ ＭｇＣρ、及び６ｍＭβ−メルカプトエ
タノールを含有する反応混合物２００ｔｔＱ中、３７℃
、１時間で、酵素ＦｎｕＤ（Ｂｉｏｌａｂｓ） ５０単
位によって切断した。７０℃に１０分間維持することに
よって反応を不活化した後、溶液を５（１ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ８）、ｌ０ｍＭ ＭｇＣＱｔ及び５
０ｍＭ Ｎａ’ＣＱの濃度に調整し、酵素上ｎｄｌＩ［
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）５０単位の存在下、３７℃で
さらに１時間インキュベートした。フェノール−クロロ
ホルム及びクロロホルム−イソアミルによる抽出を行な
って反応を停止させ、ついで酢酸ナトリウムを最終濃度
０．３Ｍとなるまで添加した後、エタノール２１／２容
を添加してＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で１５分間イ
ンキュベートし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機で１５
分間遠心分離した後、沈殿物をＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｆｆ（１）Ｈ８）及び１ ｍＭ ＥＤＴＡ）５
０μρ中に再懸濁化し、６％アクリルアミドゲル上に置
いた。電圧１３０■ を３時間通電することによってＤ
會Ａを分離した後、Ｍａｙａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ ら
の方法（ｒＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙＪ第６５巻、ｐ ４９Ｌ−５４０，１９８’（１）に
従って、約５３Ｄｂｐのバンドを溶出した。このバンド
は、アミノ酸１７から１９１までのｈＧＨ遺伝暗号化配
列を有するフラグメントを含有する。
ｒｉｓ−ＨＣρ（ｐＨ７，４）。６ ｍＭ ＮａＣＱ、
６ ｍＭ ＭｇＣρ、及び６ｍＭβ−メルカプトエ
タノールを含有する反応混合物２００ｔｔＱ中、３７℃
、１時間で、酵素ＦｎｕＤ（Ｂｉｏｌａｂｓ） ５０単
位によって切断した。７０℃に１０分間維持することに
よって反応を不活化した後、溶液を５（１ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ８）、ｌ０ｍＭ ＭｇＣＱｔ及び５
０ｍＭ Ｎａ’ＣＱの濃度に調整し、酵素上ｎｄｌＩ［
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）５０単位の存在下、３７℃で
さらに１時間インキュベートした。フェノール−クロロ
ホルム及びクロロホルム−イソアミルによる抽出を行な
って反応を停止させ、ついで酢酸ナトリウムを最終濃度
０．３Ｍとなるまで添加した後、エタノール２１／２容
を添加してＤＮＡを沈殿させた。−８０℃で１５分間イ
ンキュベートし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機で１５
分間遠心分離した後、沈殿物をＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｆｆ（１）Ｈ８）及び１ ｍＭ ＥＤＴＡ）５
０μρ中に再懸濁化し、６％アクリルアミドゲル上に置
いた。電圧１３０■ を３時間通電することによってＤ
會Ａを分離した後、Ｍａｙａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ ら
の方法（ｒＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙＪ第６５巻、ｐ ４９Ｌ−５４０，１９８’（１）に
従って、約５３Ｄｂｐのバンドを溶出した。このバンド
は、アミノ酸１７から１９１までのｈＧＨ遺伝暗号化配
列を有するフラグメントを含有する。
ｈＧＨの初めのアミノ酸１６個を遺伝暗号化すると共に
、ＰｎｕＤ Ｈを再構成しうる下記配列の合成４７ｂｐ
フラグメントを使用することによって、ヒト生長ホルモ
ンの完全配列を再構成した。
、ＰｎｕＤ Ｈを再構成しうる下記配列の合成４７ｂｐ
フラグメントを使用することによって、ヒト生長ホルモ
ンの完全配列を再構成した。
ＴＴＣＣＣＡ Ａ ＣＣＡＴＴ ＣＣＣＴＴ Ａ ＴＣ
ＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡ ＣＡ Ａ ＣＧＣＴＡ Ｔ
ＧＣＴｆｌ：ＣＧＡＡＧＧＧＴＴＧＧＴＡ ＡＧＧＧＡ
ＡＴＡＧＧＴＣＣＧＡＡＡＡ Ａ ＣＴＧＴＴＧＣＧＡ
ＴＡＣＧＡＧＧＣｎｕＤ１１ ＤＮＡ合成装置ＳＹＳＴＥＭ ＯＮＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ
）を使用し、２種の相補的４７塩基ＤＮＡ鎖を合成した
。
ＣＡＧＧＣＴＴＴＴＴＧＡ ＣＡ Ａ ＣＧＣＴＡ Ｔ
ＧＣＴｆｌ：ＣＧＡＡＧＧＧＴＴＧＧＴＡ ＡＧＧＧＡ
ＡＴＡＧＧＴＣＣＧＡＡＡＡ Ａ ＣＴＧＴＴＧＣＧＡ
ＴＡＣＧＡＧＧＣｎｕＤ１１ ＤＮＡ合成装置ＳＹＳＴＥＭ ＯＮＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ
）を使用し、２種の相補的４７塩基ＤＮＡ鎖を合成した
。
合成４７ｂｐフラグメント１．２５μ９を、６６ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，６）、１ ｍＭ ＡＴＰ
、 １ ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ ＭｇＣ（ｂ、
１５ｍＭ ＤＴＴ、 ０．２Ｈ／ｍ（ｌ ＢＳＡ及びＴ
４ＤＮＡキナーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ） ２単位を含有す
る緩衝液２０μρ中、３７°Ｃ，１時間でリン酸エステ
ル化した。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，６）、１ ｍＭ ＡＴＰ
、 １ ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ ＭｇＣ（ｂ、
１５ｍＭ ＤＴＴ、 ０．２Ｈ／ｍ（ｌ ＢＳＡ及びＴ
４ＤＮＡキナーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ） ２単位を含有す
る緩衝液２０μρ中、３７°Ｃ，１時間でリン酸エステ
ル化した。
ついで、キナーゼ反応で使用したものと同じ緩衝液２５
０μＣ中、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ） ５単位の存在下、予じめｐＳＭ ２０９から単離
したＤＮＡ ＦｎｕＤＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩの５３０ｂ
ｐフラグメント３μ９に合成フラグメントを結合させた
。この反応を１４℃で１４時間行ない。その後、フェノ
ール−クロロホルム及びクロロホルム−イソアミルによ
る抽出を行なって酵素を不活性化し、上述の如く酢酸ナ
トリウム及びエタノールを添加した後、水相からＤＮＡ
を沈殿させた。
０μＣ中、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ） ５単位の存在下、予じめｐＳＭ ２０９から単離
したＤＮＡ ＦｎｕＤＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩの５３０ｂ
ｐフラグメント３μ９に合成フラグメントを結合させた
。この反応を１４℃で１４時間行ない。その後、フェノ
ール−クロロホルム及びクロロホルム−イソアミルによ
る抽出を行なって酵素を不活性化し、上述の如く酢酸ナ
トリウム及びエタノールを添加した後、水相からＤＮＡ
を沈殿させた。
沈殿物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ （ｐＨ８
）、１０ｍＭ ＭｇＣρ２及び５０ｍＭ ＮａＣρを含
有する緩衝液５０μρに再懸濁化し、酵素旧ｎｄ１１１
．５単位を使用して３７℃で３０分間消化した。７０℃
に１０分間維持することにより反応を停止し、６％アク
リルアミドゲル上に注入した。電気泳動（１３０Ｖ、
３時間）後、約５８０塩基対のバンドを単離、溶出した
。該バンドはＦｎｕＤｎ −ＨｌｎｄｌＩ［フラグメン
ト及び合成４７ｂｐフラグメントでなる直線状分子を含
有していた。この分子（合成フラグメントがＦｎｕＤ
Ｕ−旧ｎｄｌＩ［フラグメントに結合する際、２つの方
向性があるが、その１つの方向性を有するもの）は生長
ホルモンの完全構造遺伝子を再構成し、Ｅ、コリ プラ
スミドｐｕｃ ８ （ＢＲＬ）でクローン化される。
）、１０ｍＭ ＭｇＣρ２及び５０ｍＭ ＮａＣρを含
有する緩衝液５０μρに再懸濁化し、酵素旧ｎｄ１１１
．５単位を使用して３７℃で３０分間消化した。７０℃
に１０分間維持することにより反応を停止し、６％アク
リルアミドゲル上に注入した。電気泳動（１３０Ｖ、
３時間）後、約５８０塩基対のバンドを単離、溶出した
。該バンドはＦｎｕＤｎ −ＨｌｎｄｌＩ［フラグメン
ト及び合成４７ｂｐフラグメントでなる直線状分子を含
有していた。この分子（合成フラグメントがＦｎｕＤ
Ｕ−旧ｎｄｌＩ［フラグメントに結合する際、２つの方
向性があるが、その１つの方向性を有するもの）は生長
ホルモンの完全構造遺伝子を再構成し、Ｅ、コリ プラ
スミドｐｕｃ ８ （ＢＲＬ）でクローン化される。
実施例４
ｐＵＣ８における生長ホルモン構造遺伝子のクローニン
グ プラスミドｐＵＣ８２，５ｕ９を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ２（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＭｇＣ（ｂ及び５０
ｍｂｌ Ｎａ（４を含有する溶液中、３７℃、３０分間
で旧ｎｄｌＩ［２，５単位によって消化させた。酵素反
応を不活化し、ついでＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を最
終濃度１００ｍＭまで添加した後、３７°Ｃにおいて、
さらに３０分間、ＥｃｏＲＩ ２．５単位と共にイン
キュベートした。
グ プラスミドｐＵＣ８２，５ｕ９を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ２（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＭｇＣ（ｂ及び５０
ｍｂｌ Ｎａ（４を含有する溶液中、３７℃、３０分間
で旧ｎｄｌＩ［２，５単位によって消化させた。酵素反
応を不活化し、ついでＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を最
終濃度１００ｍＭまで添加した後、３７°Ｃにおいて、
さらに３０分間、ＥｃｏＲＩ ２．５単位と共にイン
キュベートした。
フェノール−クロロホルムにより反応を不活性化し、沈
殿、分離したＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！
（ｐＨ８）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ過塩素酸ナ
トリウムを含有する緩衝液５０μσ中に再懸濁化し、イ
ソプロパツール２５μρを添加することにより再度沈殿
させた。このようにして消化したｐＬｌｃ ８を、下記
配列を有する合成りＮＡフラグメントに結合させた。
殿、分離したＤＮＡを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！
（ｐＨ８）、１ ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭ過塩素酸ナ
トリウムを含有する緩衝液５０μσ中に再懸濁化し、イ
ソプロパツール２５μρを添加することにより再度沈殿
させた。このようにして消化したｐＬｌｃ ８を、下記
配列を有する合成りＮＡフラグメントに結合させた。
ＲＢＳ ｎｅｔ
ＡＡＴＴＡＡＡＧＧＡ（ｉＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＴＴ
ＴＣＣＴＣＣＴＴＡＡＧＡＡＴＡＣｃｏＲＩ このフラグメント（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＮＡ合成機を使
用して合成される）は、末端５′に相補的配列が存在す
るため、ｐＵｅ ８のＥｃｏＲＩ末端にのみ結合可能で
ある。
ＴＣＣＴＣＣＴＴＡＡＧＡＡＴＡＣｃｏＲＩ このフラグメント（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＮＡ合成機を使
用して合成される）は、末端５′に相補的配列が存在す
るため、ｐＵｅ ８のＥｃｏＲＩ末端にのみ結合可能で
ある。
６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，６）、１ ｍ
Ｍ ＡＴＰ、 １ ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ Ｍ
ｇ（４ｔ、１５ｍＭ ＤＴＴ、 ＢＳＡ Ｏ，２ｍ９／
πＱ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ１単位を含有する反応混
合物１２５μσ中において、前述の如（ＥｃｏＲＩ
及びＨｉｎｄＩＩ［により消化した１）ＵＣ８２，５μ
９に合成フラグメントＯ，１８５μ９を結合させ、１４
℃で６時間インキュベートした。ついで、７０℃に１０
分間維持して不活性化した反応混合物を、キナーゼ２単
位と混合し、３７℃においてさらに１時間インキュベー
トした。フェノール−クロロホルム及びクロロホルムー
イソアミルによる抽出を行なって反応を停止し、５ Ｍ
ＮａＣＣ０４１１５容を添加した後、イソプロパツー
ル０５容によりＤＮＡを沈殿させた。遠心分離後、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＱ（ｐＨ８）、１０ｍＭ Ｍｇ
ＣＱｐ及び５０ｍＭ ＮａＣＱを含有する緩衝液２５μ
ρに沈殿物を再懸濁化させ、Ｉ（ｉｎｄＩ［Ｉ ５単位
を使用して３７℃において１時間消化した。フェノール
−クロロホルム及びクロロホルム−イソアミルによる抽
出を行なって反応を停止し、酢酸ナトリウム及びエタノ
ールを使用してＤＮＡを沈殿させた。前述の如く合成フ
ラグメントが挿入されたＥ、コリ プラスミドｐＵＣ８
の直線状分子１μ９を、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（＋２
（１）Ｈ７，６）、１ｍＭＡＴＰ、 １０ｍＭ ＭｇＣ
Ｃｔ、１５ｍＭ ＤＴＴ及びＴ４ ＤＩＩＩＡリガーゼ
１単位を含有する緩衝液５０μＱ中、１４℃、６時間で
、完全ｈＧＨ構造遺伝子を再構成する直線状分子０８８
μ９に結合させた。酵素を不活性化した後、反応混合物
を使用して、Ｅ、コリ ＪＭ １０１のコンピテント菌
を形質転換させた。
Ｍ ＡＴＰ、 １ ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ Ｍ
ｇ（４ｔ、１５ｍＭ ＤＴＴ、 ＢＳＡ Ｏ，２ｍ９／
πＱ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ１単位を含有する反応混
合物１２５μσ中において、前述の如（ＥｃｏＲＩ
及びＨｉｎｄＩＩ［により消化した１）ＵＣ８２，５μ
９に合成フラグメントＯ，１８５μ９を結合させ、１４
℃で６時間インキュベートした。ついで、７０℃に１０
分間維持して不活性化した反応混合物を、キナーゼ２単
位と混合し、３７℃においてさらに１時間インキュベー
トした。フェノール−クロロホルム及びクロロホルムー
イソアミルによる抽出を行なって反応を停止し、５ Ｍ
ＮａＣＣ０４１１５容を添加した後、イソプロパツー
ル０５容によりＤＮＡを沈殿させた。遠心分離後、５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣＱ（ｐＨ８）、１０ｍＭ Ｍｇ
ＣＱｐ及び５０ｍＭ ＮａＣＱを含有する緩衝液２５μ
ρに沈殿物を再懸濁化させ、Ｉ（ｉｎｄＩ［Ｉ ５単位
を使用して３７℃において１時間消化した。フェノール
−クロロホルム及びクロロホルム−イソアミルによる抽
出を行なって反応を停止し、酢酸ナトリウム及びエタノ
ールを使用してＤＮＡを沈殿させた。前述の如く合成フ
ラグメントが挿入されたＥ、コリ プラスミドｐＵＣ８
の直線状分子１μ９を、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（＋２
（１）Ｈ７，６）、１ｍＭＡＴＰ、 １０ｍＭ ＭｇＣ
Ｃｔ、１５ｍＭ ＤＴＴ及びＴ４ ＤＩＩＩＡリガーゼ
１単位を含有する緩衝液５０μＱ中、１４℃、６時間で
、完全ｈＧＨ構造遺伝子を再構成する直線状分子０８８
μ９に結合させた。酵素を不活性化した後、反応混合物
を使用して、Ｅ、コリ ＪＭ １０１のコンピテント菌
を形質転換させた。
アンピシリン（５０ｇｇ／ ｍＱ）を含有するプレート
上での選別により得られた形質転換体の中でも、１２個
の白色コロニー（ＡｍｐＲ）についてプラスミドＤＮＡ
の急速抽出により分析を行なった。得られたＤＮＡ １
／２０を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ（２（＋１）Ｈ
８）、ＭｇＣＱ、ｌｏｍＭ及び５０ｍＭ ＮａＣｅを含
有する緩衝液２０μσ中、３７°０１３０分で、Ｅｃｏ
ＲＩ １単位及び旧ｎｄＩＩＩ １単位を使用して
消化した。ＤＮＡを０．８％アガロースゲル上に置き、
電位差１００■を２時間通電して分離せしめた。
上での選別により得られた形質転換体の中でも、１２個
の白色コロニー（ＡｍｐＲ）についてプラスミドＤＮＡ
の急速抽出により分析を行なった。得られたＤＮＡ １
／２０を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣ（２（＋１）Ｈ
８）、ＭｇＣＱ、ｌｏｍＭ及び５０ｍＭ ＮａＣｅを含
有する緩衝液２０μσ中、３７°０１３０分で、Ｅｃｏ
ＲＩ １単位及び旧ｎｄＩＩＩ １単位を使用して
消化した。ＤＮＡを０．８％アガロースゲル上に置き、
電位差１００■を２時間通電して分離せしめた。
１２個のコロニーから得られたプラスミドＤＮＡは、５
３０ｂｐフラグメントを含有する５９０ｂｐフラグメン
ト、４７ヌクレオチドの合成配列及びメチオニン遺伝暗
号づけトリプレットを有する同様の合成配列を含有する
ことを示した。
３０ｂｐフラグメントを含有する５９０ｂｐフラグメン
ト、４７ヌクレオチドの合成配列及びメチオニン遺伝暗
号づけトリプレットを有する同様の合成配列を含有する
ことを示した。
５３０ｂｐフラグメントに対して４７ｂｐ配列が正確に
結合されていることをチェックするため、プラスミ ド
ＤＮＡ ０．２μ９を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（２
（１）Ｈ８）、 １０ｍＭ ＭｇＣ（！２及び５０ｍＭ
ＮａＣｅを含有する緩衝液２０μρ中、３７℃、１時
間で、酵素ＦｎｕＤＩＩ １単位を使用して消化した。
結合されていることをチェックするため、プラスミ ド
ＤＮＡ ０．２μ９を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（２
（１）Ｈ８）、 １０ｍＭ ＭｇＣ（！２及び５０ｍＭ
ＮａＣｅを含有する緩衝液２０μρ中、３７℃、１時
間で、酵素ＦｎｕＤＩＩ １単位を使用して消化した。
酵素を不活性化した後、ＤＮＡを６％アクリルアミドゲ
ル上に置き、１２０Ｖで３時間処理した。１２個のプラ
スミドのうち５個が、ｈＧ）ｌ構造遺伝子内で、酵素Ｆ
ｎｕＤｎによって切断されていた。この結果、５３０ｂ
ｐフラグメントに対して合成４７ｂｐフラグメントが正
確に結合されていることが明らかである。これらのプラ
スミドの１つをｐＳＭ２１０と称する。
ル上に置き、１２０Ｖで３時間処理した。１２個のプラ
スミドのうち５個が、ｈＧ）ｌ構造遺伝子内で、酵素Ｆ
ｎｕＤｎによって切断されていた。この結果、５３０ｂ
ｐフラグメントに対して合成４７ｂｐフラグメントが正
確に結合されていることが明らかである。これらのプラ
スミドの１つをｐＳＭ２１０と称する。
実施例５
ｐＳＭ ２０８におけるｈＧＨのクローニングプラスミ
ドｐＳＭ ２０８２ ｕ９を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（２（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＭｇＣＱ２及び５０ｍＭ
ＮａＣｌ２を含有する溶液中、３７℃、３０分間で、
Ｈ４ｎｄＩＩＩ ２単位を使用して消化した。反応混合
物を不活性化し、Ｔｒｉｓ−ｎｃＩ２（ｐＨ８）を最終
濃度１００ｍＭまで添加した後、ＥｃｏＲＩ２単位と共
に、３７°Ｃにおいて、さらに３０分間インキュベート
した。フェノール−クロロホルム及びクロロポルム−イ
ソアミルによる抽出を行って反応を停止し、エタノール
を添加してＤＮＡを沈殿させた。
ドｐＳＭ ２０８２ ｕ９を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃ（２（ｐＨ８）、１０ｍＭ ＭｇＣＱ２及び５０ｍＭ
ＮａＣｌ２を含有する溶液中、３７℃、３０分間で、
Ｈ４ｎｄＩＩＩ ２単位を使用して消化した。反応混合
物を不活性化し、Ｔｒｉｓ−ｎｃＩ２（ｐＨ８）を最終
濃度１００ｍＭまで添加した後、ＥｃｏＲＩ２単位と共
に、３７°Ｃにおいて、さらに３０分間インキュベート
した。フェノール−クロロホルム及びクロロポルム−イ
ソアミルによる抽出を行って反応を停止し、エタノール
を添加してＤＮＡを沈殿させた。
プラスミドＩ）ＳＭ ２０８について記載した方法と同
様にして、プラスミドｐＳＭ ２１０３μｇを制限酵素
１１ｉｎｄｌｌＴ及びＥｃｏＲＩを使用して消化した。
様にして、プラスミドｐＳＭ ２１０３μｇを制限酵素
１１ｉｎｄｌｌＴ及びＥｃｏＲＩを使用して消化した。
エタノールを添加して沈殿させた後、ＤＮＡをＴＥ２０
μρ中に再懸濁化し、６％アクリルアミドゲル上に置い
た。電気泳動処理（１３０Ｖ、 ３時間）後、ｈＧＨの
完全構造遺伝子を含有する約５９０ｂｐバンドを単離し
、溶出した。ついで、ｈＧＨ構造遺伝子０．５μ９を、
６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，６）、Ｉ ｍ
Ｍ ＡＴＰ。
μρ中に再懸濁化し、６％アクリルアミドゲル上に置い
た。電気泳動処理（１３０Ｖ、 ３時間）後、ｈＧＨの
完全構造遺伝子を含有する約５９０ｂｐバンドを単離し
、溶出した。ついで、ｈＧＨ構造遺伝子０．５μ９を、
６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，６）、Ｉ ｍ
Ｍ ＡＴＰ。
１０ｍＭ ＭｇＣＱｗ、１５ｍＭ ＤＴＴ及びＴ４ Ｄ
ＩＩＩＡリガーゼｌ単位を含有する反応混合物２０μρ
中、１４℃、１４時間で、予じめＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄ
ＩＩＴで消化したプラスミドｐＳＭ ２０８２μ２に結
合させた。ついで、混合物１μ９を使用して、Ｃｏｎｔ
ｅｎｔｅ及びＤｕｂ−ｎａｕの記載（ｒＭｏｌ、 Ｇｅ
ｎ、 Ｇｅｎｅｔ、ｊ １６７、２５１−２５８゜１９
７９）に従ってコンピテントとしたＢ、サヂリスＳＭ３
１０８を形質転換させた。
ＩＩＩＡリガーゼｌ単位を含有する反応混合物２０μρ
中、１４℃、１４時間で、予じめＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄ
ＩＩＴで消化したプラスミドｐＳＭ ２０８２μ２に結
合させた。ついで、混合物１μ９を使用して、Ｃｏｎｔ
ｅｎｔｅ及びＤｕｂ−ｎａｕの記載（ｒＭｏｌ、 Ｇｅ
ｎ、 Ｇｅｎｅｔ、ｊ １６７、２５１−２５８゜１９
７９）に従ってコンピテントとしたＢ、サヂリスＳＭ３
１０８を形質転換させた。
発明者らの研究室で開発された菌株ＳＭ８１０ｇについ
ては、ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９８として、ノーザン・リ
ージョナル・リサーチ・センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
Ｒｅｇ−１ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ
）に寄託されている。
ては、ＮＲＲＬ Ｂ−１５８９８として、ノーザン・リ
ージョナル・リサーチ・センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
Ｒｅｇ−１ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ
）に寄託されている。
形質転換された菌を、カナマイシン５μＩｉｌ／ｍρを
含有するＶＹプレート上で選別した。
含有するＶＹプレート上で選別した。
ついて、陽性のカナマイシン耐性コロニー１２個につい
て、プラスミドＤＮＡの急速抽出によって検討をおこな
った。ｈＧＨ構造遺伝子を有するフラグメントとのハイ
ブリッドプラスミド（ｐｓＭ２１２）を含有するコロニ
ーの１つをＳＭＳ １１０１（ｐＳ ２１２）と称する
。
て、プラスミドＤＮＡの急速抽出によって検討をおこな
った。ｈＧＨ構造遺伝子を有するフラグメントとのハイ
ブリッドプラスミド（ｐｓＭ２１２）を含有するコロニ
ーの１つをＳＭＳ １１０１（ｐＳ ２１２）と称する
。
実施例６
Ｂ、サチリスＳＭ３１１０８（ｐＳ ２１２）における
ｈＧＨの発現 Ｂ、サチリスの菌株ＳＭＳ １０８ （ｐＳＭ ２１２
）でのｈＧＨ遺伝子の発現をチェックするため、該菌株
を液体培地で育成し、溶菌後、成熟生長ホルモンに相当
するタンパク質の存在を免疫プロット法（Ｔｏｗｂｉｎ
らｒＰＮＡｓＪ１９７９．第７６巻、Ｎｏ、 ９ 、
ｐ ４３５０−４３５４）によって検出した。
ｈＧＨの発現 Ｂ、サチリスの菌株ＳＭＳ １０８ （ｐＳＭ ２１２
）でのｈＧＨ遺伝子の発現をチェックするため、該菌株
を液体培地で育成し、溶菌後、成熟生長ホルモンに相当
するタンパク質の存在を免疫プロット法（Ｔｏｗｂｉｎ
らｒＰＮＡｓＪ１９７９．第７６巻、Ｎｏ、 ９ 、
ｐ ４３５０−４３５４）によって検出した。
３Ｍ３１０８ （ｐｓＭ ２１２）の培養物を、カナマ
イシン（濃度 ５μｇ／ｘ１２）含有ＶＹ培地（ＤＩＦ
ＣＯ子牛肉浸出ブイヨン（ｖｅａｌ １ｎｆｕｓｉｏｎ
ｂｒｏｔｈ）２５９／（７、ＤＩＦＣＯ酵母抽出酵母
抽出物５伸／Ｑて３７℃で２０時間育成した。
イシン（濃度 ５μｇ／ｘ１２）含有ＶＹ培地（ＤＩＦ
ＣＯ子牛肉浸出ブイヨン（ｖｅａｌ １ｎｆｕｓｉｏｎ
ｂｒｏｔｈ）２５９／（７、ＤＩＦＣＯ酵母抽出酵母
抽出物５伸／Ｑて３７℃で２０時間育成した。
培養基１０ｍＱを５ｏｒｖａｌｌ遠心分離機において５
０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、３０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｉ２（ＰＨ７，５）及び５０ｍＭ ＮａＣｌ２
を含有する緩衝液で菌を２回洗浄し、８Ｍ尿素、ＳＤＳ
１％、β−メルカプトエタノール１％及び６２．５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣρ（ｐＨ６，８）を含有する溶液１
０πρ中に再懸澗化した。Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕ
ｒｅＣｅ １１ （ＡＭ Ｉ ＮＣ０）を使用し、３６
０００Ｐｓｉて溶菌処理した。
０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、３０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｉ２（ＰＨ７，５）及び５０ｍＭ ＮａＣｌ２
を含有する緩衝液で菌を２回洗浄し、８Ｍ尿素、ＳＤＳ
１％、β−メルカプトエタノール１％及び６２．５ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣρ（ｐＨ６，８）を含有する溶液１
０πρ中に再懸澗化した。Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕ
ｒｅＣｅ １１ （ＡＭ Ｉ ＮＣ０）を使用し、３６
０００Ｐｓｉて溶菌処理した。
溶菌物２０μＣを１２．５％ポリアクリルアミドＳＴＳ
ゲル（ＬａｅｎｍｌｉｒＮａｔｕｒｅ Ｊ１９７０．第
２７７巻、 ６８０）上に置き、２５ｍＡで３時間電気
泳動処理した後、クマシーブルー （Ｂ、 Ｄ、 Ｈａ
ｍｅｓ及びり、 Ｒｉｃｋｗｏｄ編ｒＧｅｌｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ：
Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ ＪＩＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｌｔｅｄ発行）又はニトロセル
ロースフィルターへの移行（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
５ｃｈｕｌｌ、孔サイズ４５μｍ）（Ｔｏｗｂｉｎ）に
よってタンパク質を定置した。
ゲル（ＬａｅｎｍｌｉｒＮａｔｕｒｅ Ｊ１９７０．第
２７７巻、 ６８０）上に置き、２５ｍＡで３時間電気
泳動処理した後、クマシーブルー （Ｂ、 Ｄ、 Ｈａ
ｍｅｓ及びり、 Ｒｉｃｋｗｏｄ編ｒＧｅｌｅｌｅｃｔ
ｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ：
Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ ＪＩＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｌｔｅｄ発行）又はニトロセル
ロースフィルターへの移行（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
５ｃｈｕｌｌ、孔サイズ４５μｍ）（Ｔｏｗｂｉｎ）に
よってタンパク質を定置した。
Ｔｏｗｂｉｎの開示の如くフィルターを処理し、家兎抗
−ｈＧＨ抗体（Ｍｉｌｅｓ）及びペルオキシダーゼと接
合させた家兎抗−１ｇＧヤギ抗体を使用することにより
、ｈＧＨの存在が明らかになった。
−ｈＧＨ抗体（Ｍｉｌｅｓ）及びペルオキシダーゼと接
合させた家兎抗−１ｇＧヤギ抗体を使用することにより
、ｈＧＨの存在が明らかになった。
クマシーブルーによる染色では、見かけ分子量２１．５
００を有し、天然のｈＧＨ標準品（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ）と同一であり、かつ全タンパク質の約１５−２０％
を構成しているタンパク質の存在を示した（第３図参照
； Ａ：ＳＭＳ １０８． Ｂ・ＳＭＳ １１０８（ｐ
Ｓ ２１２）、Ｃ：天然ｈＧＨ、Ｄ：分子量標準品）。
００を有し、天然のｈＧＨ標準品（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ）と同一であり、かつ全タンパク質の約１５−２０％
を構成しているタンパク質の存在を示した（第３図参照
； Ａ：ＳＭＳ １０８． Ｂ・ＳＭＳ １１０８（ｐ
Ｓ ２１２）、Ｃ：天然ｈＧＨ、Ｄ：分子量標準品）。
このタンパク質は、免疫エレクトロプロット分析の結果
（第４図参照：Ａ・３Ｍ３１０ｇ、 Ｂ： ＳＭＳ １
１０８（ｐＳ ２１２）、 Ｃ：天然ｈＧ）Ｉ 、 Ｄ
：分子量標準品）から明らかなように、抗−ｈＧＨ抗体
と特異的に反応する。Ｂ、サチリスの菌株５Ｍ５（［）
ＳＭ ２１２）から産生されるｈＧ）ｌの量は、発酵を
実験質的条件（培養基１ρ当たり菌ペースト６９）下、
エーシンマイヤーフラスコで行なう場合には約２００π
９／ρである。培養を１０ｇ発酵槽で行なう場合には、
ｌρ当たりｈＧＨ２ｙ以上を得ることが可能であった。
（第４図参照：Ａ・３Ｍ３１０ｇ、 Ｂ： ＳＭＳ １
１０８（ｐＳ ２１２）、 Ｃ：天然ｈＧ）Ｉ 、 Ｄ
：分子量標準品）から明らかなように、抗−ｈＧＨ抗体
と特異的に反応する。Ｂ、サチリスの菌株５Ｍ５（［）
ＳＭ ２１２）から産生されるｈＧ）ｌの量は、発酵を
実験質的条件（培養基１ρ当たり菌ペースト６９）下、
エーシンマイヤーフラスコで行なう場合には約２００π
９／ρである。培養を１０ｇ発酵槽で行なう場合には、
ｌρ当たりｈＧＨ２ｙ以上を得ることが可能であった。
第１図はプラスミドｐｓＭ １４３． ｐＳＭ ２０ｇ
及び９３Ｍ２１２の制限酵素地図を示す図、第２図はプ
ラスミドｐＳＭ ２０９． ｐＳＭ ２１０及びｐＳＭ
２１２を構成するために要求される操作の概略図、第
３図はＢ、サチリスの各菌株から抽出されたタンパク質
の５ＤＳ−アクリルアミドゲル上での分離の状態を示す
写真、第４図は免疫プロッティングの結果を示す写真で
ある。 図面の浄書 ＰＩＴＬＪＩＴＡＲＹ ＧＬＡＮＤ ↓ ＲＮＡ 図面の浄書 ＡＢＣＤ 図面の浄書 八ＢＣ，Ｄ 手続補正書（方式） ％式％
及び９３Ｍ２１２の制限酵素地図を示す図、第２図はプ
ラスミドｐＳＭ ２０９． ｐＳＭ ２１０及びｐＳＭ
２１２を構成するために要求される操作の概略図、第
３図はＢ、サチリスの各菌株から抽出されたタンパク質
の５ＤＳ−アクリルアミドゲル上での分離の状態を示す
写真、第４図は免疫プロッティングの結果を示す写真で
ある。 図面の浄書 ＰＩＴＬＪＩＴＡＲＹ ＧＬＡＮＤ ↓ ＲＮＡ 図面の浄書 ＡＢＣＤ 図面の浄書 八ＢＣ，Ｄ 手続補正書（方式） ％式％
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌において発現
し、ヒト生長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺伝子のク
ローニングに使用されるプラスミドベクターであって、
プラスミドｐＳＭ １４３ ＡＴＣＣ ５３０３８の７
５０塩基対Ｘｂａ I −ＥｃｏＲ I フラグメントを下記
の配列を有する合成７３塩基対フラグメントで置換せし
めてなる、プラスミドベクター。 【遺伝子配列があります。】 ２ 特許請求の範囲第１項記載のプラスミドベクターを
制限酵素ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲ I で切断し、ついで
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、ヒト生長ホルモンを遺伝
暗号化する構造遺伝子に結合せしめてなる、ｐＳＭ２１
２組換ＤＮＡ分子。 ３ 特許請求の範囲第２項記載の組換ＤＮＡ分子をバシ
ラス属の菌に挿入し、形質転換された菌を好適な培養環
境で培養し、合成されたヒト生長ホルモンを前記バシラ
ス属の菌から回収する、ヒト生長ホルモンの製法。 ４ 特許請求の範囲第３項記載の方法において、前記菌
がバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
−ｌｉｓ）である、ヒト生長ホルモンの製法。 ５ 特許請求の範囲第４項記載の方法において、前記バ
シラス・サチリスがＮＮＲＬＢ１５８９８である、ヒト
生長ホルモンの製法。 ６ 特許請求の範囲第３項記載の方法において、ヒト生
長ホルモンを遺伝暗号化する構造遺伝子を含有する組換
ＤＮＡ分子によって形質転換された菌がバシラス・サチ
リスＡＴＣＣ６７０９である、ヒト生長ホルモン製法。 ７ 特許請求の範囲第３項記載の方法において、溶菌処
理後、バシラス・サチリスＡＴＣＣ６７０７からヒト生
長ホルモンを回収する、ヒト生長ホルモンの製法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT20345A/86 | 1986-05-07 | ||
| IT20345/86A IT1189104B (it) | 1986-05-07 | 1986-05-07 | Vettore plasmidico ad espressione in bacillus utile per il clonaggio del gene strutturale che codifica per l'ormone della crescita umano e procedimento per la produzione di detto ormone |
| US07/837,659 US5334531A (en) | 1986-05-07 | 1992-02-14 | Plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63185385A true JPS63185385A (ja) | 1988-07-30 |
| JP2540039B2 JP2540039B2 (ja) | 1996-10-02 |
Family
ID=26327499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62109916A Expired - Lifetime JP2540039B2 (ja) | 1986-05-07 | 1987-05-07 | プラスミドベクタ− |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5334531A (ja) |
| EP (1) | EP0245218B1 (ja) |
| JP (1) | JP2540039B2 (ja) |
| DE (1) | DE3788592T2 (ja) |
| ES (1) | ES2061524T3 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1228925B (it) * | 1987-08-07 | 1991-07-10 | Eniricerche Spa | Procedimento per la preparazione dell'ormone della crescita umano |
| IT1274168B (it) * | 1994-04-15 | 1997-07-15 | Eniricerche Spa | Vettore plasmidico e suo impiego per la produzione di proteine eterologhe |
| DE4437005C1 (de) * | 1994-10-15 | 1996-01-18 | Bernhardt Dr Med Hildebrandt | Wickelschutzvorrichtung für Motorsensen (Freischneider) mit Fadenschneidkopf |
| US6995246B1 (en) * | 2000-10-19 | 2006-02-07 | Akzo Nobel N.V. | Methods for removing suspended particles from soluble protein solutions |
| US20060024288A1 (en) * | 2004-08-02 | 2006-02-02 | Pfizer Inc. | tRNA synthetase fragments |
| US8282921B2 (en) * | 2004-08-02 | 2012-10-09 | Paul Glidden | tRNA synthetase fragments |
| CN101993887B (zh) * | 2010-08-13 | 2013-04-17 | 江南大学 | 一种芽孢杆菌高效分泌表达载体及其构建方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| IT1156317B (it) * | 1982-09-08 | 1987-02-04 | Anic Spa | Vettori plasmidici ad espressione in bacillus subtilis e procedimento per la loro preparazione |
| US4452775A (en) * | 1982-12-03 | 1984-06-05 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules |
| US4760025A (en) * | 1984-05-29 | 1988-07-26 | Genencor, Inc. | Modified enzymes and methods for making same |
| JPS60137291A (ja) * | 1983-12-26 | 1985-07-20 | Takeda Chem Ind Ltd | 発現ベクター |
| IT1208514B (it) * | 1985-03-19 | 1989-07-10 | Eniricerche Spa | Vettori plasmidici ad espressione in escherichia coli e/o bacillussubtilis. |
-
1987
- 1987-04-13 DE DE87830142T patent/DE3788592T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-13 ES ES87830142T patent/ES2061524T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-13 EP EP87830142A patent/EP0245218B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-07 JP JP62109916A patent/JP2540039B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-02-14 US US07/837,659 patent/US5334531A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5334531A (en) | 1994-08-02 |
| EP0245218A2 (en) | 1987-11-11 |
| EP0245218B1 (en) | 1993-12-29 |
| JP2540039B2 (ja) | 1996-10-02 |
| EP0245218A3 (en) | 1988-11-17 |
| DE3788592T2 (de) | 1994-04-28 |
| DE3788592D1 (de) | 1994-02-10 |
| ES2061524T3 (es) | 1994-12-16 |
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