JP3957630B2 - 組換えヒト副甲状腺ホルモンを生産する形質転換酵母及び該ホルモンの生産方法 - Google Patents
組換えヒト副甲状腺ホルモンを生産する形質転換酵母及び該ホルモンの生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3957630B2 JP3957630B2 JP2002524073A JP2002524073A JP3957630B2 JP 3957630 B2 JP3957630 B2 JP 3957630B2 JP 2002524073 A JP2002524073 A JP 2002524073A JP 2002524073 A JP2002524073 A JP 2002524073A JP 3957630 B2 JP3957630 B2 JP 3957630B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hpth
- gene
- yps3
- yeast
- yps1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 110
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 18
- 101001135770 Homo sapiens Parathyroid hormone Proteins 0.000 title claims description 7
- 101001135995 Homo sapiens Probable peptidyl-tRNA hydrolase Proteins 0.000 title claims description 7
- 102000058004 human PTH Human genes 0.000 title claims description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 108
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 101150008621 YPS1 gene Proteins 0.000 claims description 34
- 101100166113 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) SAP9 gene Proteins 0.000 claims description 28
- 101100184165 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MKC7 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 101100219555 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) SAP10 gene Proteins 0.000 claims description 21
- 101100160516 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YPS3 gene Proteins 0.000 claims description 21
- 101150014894 YPS3 gene Proteins 0.000 claims description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 101100160515 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YPS1 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 19
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 18
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 14
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 101000788159 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Aspartic proteinase 3 Proteins 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 3
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 101100319895 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YAP3 gene Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150071434 BAR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 2
- 101150045458 KEX2 gene Proteins 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 2
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 2
- 101100243377 Mus musculus Pepd gene Proteins 0.000 description 2
- 101100378536 Ovis aries ADRB1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150029183 PEP4 gene Proteins 0.000 description 2
- 101000577941 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Aspartic proteinase MKC7 Proteins 0.000 description 2
- 101100160518 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YPS6 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100160519 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YPS7 gene Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 1
- 101800000535 3C-like proteinase Proteins 0.000 description 1
- 101800002396 3C-like proteinase nsp5 Proteins 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710082738 Aspartic protease 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 description 1
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000010352 biotechnological method Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 230000003913 calcium metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002990 parathyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
- C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/94—Saccharomyces
- Y10S435/942—Saccharomyces cerevisiae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
発明の背景
1. 発明の分野
本発明は、ヒト副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone)(以降、「hPTH」とする)の製造に関する。より詳細には、この発明は、アスパラギン酸プロテアーゼのYPS1、YPS2及びYPS3のヤップシン(yapsin)ファミリーの少なくとも1つにおいて遺伝学的に崩壊(disrupt)し、hPTH遺伝子を有する発現ベクターで形質転換される、サッカロミセス・セレビシエ(Sacharomyces cerevisiae)変異株のホルモン産生における使用に関する。
【0002】
2. 従来技術の説明
hPTHは、副甲状腺によって生産される、84アミノ酸残基からなるペプチドである。hPTHは、カルシウムの代謝及び骨形成を促進する生理学的機能を有するので、腎臓と骨でカルシウムの恒常性を維持する。米国と欧州では、エストロゲン又はカルシトニンが骨粗鬆症の治療として広く使用されているが、骨吸収を妨げることが認められている。したがって、世界中の第一流の製薬会社が、hPTHの骨形成促進能力を利用することによって骨粗鬆症の治療剤を開発するため、徹底的かつ広範囲にわたってhPTHを研究している。特に、現代社会は高齢化社会になりつつあるので、骨粗鬆症の予防と治療に多くの重大な関心が払われている。上記の理由から、活発な研究は、今では、従来の骨粗鬆症の治療に代わる治療となることが期待されるhPTHを大量生産するためのバイオテクノロジーの手法を開発することに向けられている。
【0003】
例えば、原核細菌は比較的高い発現効率を示すので、宿主細胞として大腸菌を用いることによる組換えhPTHの大量生産方法の開発が、種々試みられている。しかし、大腸菌から生産される組換えタンパク質を再生し、精製することは、非常に難しい。これに対し、単細胞真核細胞である酵母は、遺伝子転写及び翻訳系ならびにそのタンパク質-分泌系において高等種に極めて近いので、適切に折りたたまれ、その結果、活性なタンパク質を発現し、分泌する利点を有する。したがって、酵母は、細胞外タンパク質をほとんど分泌せず、外因性タンパク質を回収し、精製しやすい点で、対象タンパク質の生産用宿主として有用である。さらに、酵母サッカロミセス・セレビシエは、身体に病原性でなく、内毒素を生産しない(一般に安全とされている)GRAS微生物である。医療用の組換えhPTHの生産体として極めて有用であるとの期待から、サッカロミセス・セレビシエは、hPTH発現系の開発で研究されている。組換えhPTHの生産用発現宿主としてのその種々の利点にもかかわらず、サッカロミセス・セレビシエは、そのような宿主として工業的には利用されていない。というのは、細胞外に分泌された組換えhPTHは、酵母自体の内因性タンパク質分解酵素によって分解され、完全なhPTH分子はごく少量しか回収できないからである(Gabrielsenら、Gene 90,255(1990))。
【0004】
最近の10年において、組換えhPTHのタンパク質分解の問題を解決するために、広範囲な研究が行われている。例えば、hPTHが、酵母ゴルジ体に存在するプロテアーゼであるKEX2の認識部位と同一のArg-25とLys-26との間で切断されるという知見に基づいて、リシンの代わりにアミノ酸配列の26位にグルタミンを有するhPTHの置換変異体が、hPTHを切断するとの推定上のプロテアーゼであるKEX2によるタンパク質分解を妨害する目的で作製された(Reppeら、J. Biol. Chem. 266, 14198(1991))。遺伝子組換え技術を用いては、hPTH-関連タンパク質を酵母ユビキチン遺伝子の3'-末端に直接連結して、切断不可能なhPTH-関連タンパク質が生産された(Rianら、Eur. J. Biochem., 213, 641(1993))。しかし、タンパク質変異体を医療に用いる場合には、一般的に新規な薬剤と認識されるため、その医療用途の認可を得るために厳重な試験が必要となる。遺伝子融合技術を用いる際には、予定される消化によって融合部位を除く必要がある。なぜなら、対象のタンパク質は融合部位があるために、比較的低い収率で生産される可能性があるためである。
【0005】
hPTHタンパク質の変異体又は融合体に頼ることなくhPTHの分解を妨げる研究の結果として、本発明者らは、培養培地にL-アルギニンを高濃度で単に添加することにより、hPTHの切断を有意な程度まで防止できる方法を開発した(Chung及びPark、Biotechnol. Bioeng. 57, 245 (1998))。培養培地中のL-アルギニンの存在によってhPTHの切断が有意な程度まで防止されるという事実は、hPTH切断が細胞内プロテアーゼKex2pによるよりむしろ細胞外プロテアーゼによって主に行われていることを示している。この知見から、本発明者らは、1個又は1対の塩基性アミノ酸のC-末端部又は中央部を切断でき、酵母の細胞質膜に結合する、KEX2のようなYap3p(酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3)が、酵母培養培地へ分泌されるhPTHの切断に特に責任を果たしていると推論した。この推論に基づいて、本発明者らは、YAP3遺伝子-崩壊酵母株(yap3Δ)を作製し、酵母変異体の使用によりhPTH生産系を構築した。フラスコでの培養によって、hPTH生産系は、80%と同じくらい高い効率でhPTHの切断を防止し、その結果、高収率で完全なhPTH分子を生産することが分かった(Kangら、Appl. Microbiol. Biotechnol., 50, 187(1998); 韓国特許登録第0246932号(12月8日1999年))。野生型株よりもかなり高いhPTH生産性を示すにもかかわらず、yap3Δ変異体は、高濃度培養の後期段階で有意な程度までhPTHを切断できることが認められた(Song及びChung、 Process Biochem 35, 503(2000)。これは、hPTHがYap3pによっては切断されず、後期の培養段階で他のプロテアーゼによって切断されることを示している。サッカロミセス・セレビシエは、構造及び機能の上でYap3pに極めて類似しているアスパラギン酸プロテアーゼMkc7pを有することが報告されている(Komano及びFuller, Proc Natl Acad Sci, USA, 92, 10752(1995))。本発明者らは、培養段階終期のhPTH切断に対する酵素の影響の観察で用いるため、双方の遺伝子が崩壊している(yap3Δ/mkc7Δ)酵母変異体を作製した。しかし、変異体yap3Δとyap3Δ/mkc7Δとで有意な相違は認められなかった(Choiら、J. Microbiol BiotEChnoL 9,679(1999))。これらの結果は、Mkc7pプロテアーゼが、Yap3pと高いホモロジーを有し(53%のホモロジー)、Kex2pの不在下でプロ-α-接合因子の処理に関与していることをとおして、hPTHの切断に大きく責任を果たしているわけではないことを立証した。
【0006】
最近開示されたサッカロミセス・セレビシエについてのゲノム情報の分析を通じて、YAP3(最近はYPS1に改名された)と同類の遺伝子について検索が行われ、PEP4及び BAR1に加えて、未知のアスパラギン酸プロテアーゼをコードする3個の新規な遺伝子が存在するとの知見が得られた(Olsenら、Biochem. J. 339, 407(1999))。YPS1及びYPS2のようなヤップシンファミリーのアスパラギン酸プロテアーゼの新たなメンバーをエンコードすると推測されることから、3個の新規な遺伝子は、それぞれYPS3、YPS6及びYPS7と命名された。YPS3はYPS1及びYPS2の双方と50%のホモロジーを有することが分かったが、YPS6とBAR1、ならびにYPS7とPEP4では、それぞれ35%及び25%のホモロジーが見られた。YPS3とYPS1とのホモロジーから、本発明者らは、yps1Δ(先のyap3Δ)株の終期培養段階に起こるhPTH切断はヤップシン 3によって行われている可能性があると推定した。
【0007】
発明の要約
前記の背景に留意して、本発明は、hPTHを高収率で生産できるタンパク質発現系を提供することを目的とする。
本発明の別の目的は、高収率のhPTHの生産法を提供することである。
hPTHの翻訳後修飾の知識によって、本発明に至る修飾及び適用が可能である。
徹底的な研究の結果として、またhPTHの生物学的生産の研究をとおして、本発明者らは、ヤップシン遺伝子の崩壊により、サッカロミセス・セレビシエでの組換えhPTHの内因性分解が驚くべきことに低下することを見出した。
本発明の観点によれば、YPS1及びYPS3遺伝子の双方、又はYPS1、YPS2及びYPS3遺伝子の全てが崩壊したサッカロミセス・セレビシエの変異株が提供される。
本発明の別の観点によれば、生産体としてサッカロミセス・セレビシエ変異株を用いることによるhPTHの生産方法が提供される。
【0008】
図面の簡単な説明
本発明の上記及び他の目的、特徴ならびに他の利点は、添付の図面に関連する以下の詳細な記載からより明らかに理解されるであろう。
図1は、ポップ-アウト(pop-out)のURA3選択マーカーの使用による、YPS3遺伝子崩壊用カセットの構築工程を示す図である;
図2は、サッカロミセス・セレビシエのYPS3遺伝子を崩壊させ、URA3選択マーカーを回収する工程を示す図である;
【0009】
図3は、24時間(a)及び48時間(b)成長させた、サッカロミセス・セレビシエ2805(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ 2805/pG10-hPTH1(レーン2及び3)、サッカロミセス・セレビシエ SY28Y3/pG10-hPTH1(レーン4及び5)ならびにサッカロミセス・セレビシエ SY28Y4/pG10-hPTH1(レーン6及び7)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断した(truncated)hPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している;
【0010】
図4は、24時間(a)及び48時間(b)成長させた、サッカロミセス・セレビシエL3262(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ L3262/pG10-hPTH1(レーン2及び3)、サッカロミセス・セレビシエ SLH15/pG10-hPTH1(レーン4及び5)、サッカロミセス・セレビシエ SLH16/ pG10-hPTH1(レーン6及び7)、サッカロミセス・セレビシエ SLH17/pG10-hPTH1(レーン8及び9)ならびにサッカロミセス・セレビシエ SLH18/pG10-hPTH1(レーン10及び11)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断したhPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している;及び
【0011】
図5は、ガラクトースを連続的に供給して72時間成長させた、サッカロミセス・セレビシエ L3262(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ L3262のYPS1/YPS3-二重崩壊体(a):サッカロミセス・セレビシエ L3262/pG10-hPTH1(レーン2〜7)及びサッカロミセス・セレビシエSLH11/pG10-hPTH1(レーン8〜13)、サッカロミセス・セレビシエ L3262のYPS1/YPS2/YPS3-三重崩壊体(b):サッカロミセス・セレビシエ SLH16/pG10-hPTH1(レーン2〜7)及びサッカロミセス・セレビシエ SLH18/pG10-hPTH1(レーン8〜13)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断したhPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している。
【0012】
発明の詳細な説明
本発明は、ヤップシンファミリーのYPS1、YPS2及びYPS3プロテアーゼの少なくとも1つを生産できない酵母宿主から、組換えhPTHを生産する方法に関する。
エキソプロテアーゼ活性はhPTHのC-又はN-末端からの残基の切断を示すので、プロテアーゼのヤップシン1(以降「YPS1」とする)、ヤップシン2(以降「YPS2」とする)又はヤップシン3(以降「YPS3」とする)は、酵母宿主で完全なhPTH分子を生産しにくくする。したがって、本発明は、3個のプロテアーゼYPS1、YPS2及びYPS3の少なくとも1つを発現できない酵母変異体を宿主細胞として用いることによる高収率での完全なhPTH分子の生産法からなる。
【0013】
YPS1とYPS2は、主としてhPTH生産用の形質転換体の初期培養段階で酵素活性を発揮するが、YPS3は、主に後期培養段階でhPTHを切断するものと考えられている。YPS1遺伝子が損傷しているyps1Δ株の場合、hPTHは、YPS1を欠いているために初期培養段階に高収率で得ることができるが、YPS3の必然的なタンパク質分解活性のために後期培養段階では低い収率で得られる。
したがって、酵母宿主の培養をとおしてhPTHの生産率を改善するには、好ましくはYPS1とYPS3の双方(yps1Δ/yps3Δ)、より好ましくはYPS1、YPS2及びYPS3の全て(yps1Δ/yps2Δ/yps3Δ)を欠く変異体が宿主として用いられる。
【0014】
プロテアーゼの欠失は、酵素選択マーカーの使用によって、YPS1、YPS2及びYPS3からなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子を崩壊させて行うことができる。
酵母の選択マーカーは特に限定されないが、ポップアウトできるものが好ましい。本発明の好ましい具体例では、URA3選択マーカーはカセットの形態で提供される。酵母選択マーカーを含むポップ-アウトカセットは、酵母ゲノムに含まれる標的遺伝子、つまりyps1、yps2及びyps3をホモロジー組換え法によって崩壊できるように、その両端にYPS1、YPS2及びYPS3のN-ならびにC-末端部位をコードする遺伝子フラグメントを有する。ゲノムにカセットを有する酵母を選択できれば、いずれの選択マーカーも用いることができる。ここで、yps3遺伝子がURA3選択マーカーによって崩壊しているyps3Δ変異体は、yps3::URA3と示される。
【0015】
この発明によれば、hPTH遺伝子は、発現ベクターによって酵母に保持される。したがって、この発明は、hPTH遺伝子が挿入されている組換え発現ベクターに関する。この発明で有用な発現ベクターは、酵母で遺伝子を発現させる手段であり、かつ発現を制御する手段を有する。ベクターの選択と組換えベクターの構築は当業者に自明であり、またその詳細を以下の実施例に記載する。
別の観点で、この発明は、組換え発現ベクターを用いてyps1Δ/yps3Δ又はyps1Δ/yps2Δ/yps3Δ酵母変異体から調製される形質転換体に関する。
【0016】
この発明の好ましい具体例で、組換えベクターpG10-hPTH1を、サッカロミセス・セレビシエ変異体(yps1Δ/yps3Δ及びyps1Δ/yps2Δ/yps3Δ)に形質転換し、形質転換体SLH16/pG10-hPTH及びSLH18/pG10-hPTHを作製した。これらは、2000年7月6日にそれぞれKCTC 0815BP及びKCTC 0816BPの受託番号で韓国生命工学研究所(KRIBB)の韓国の培養コレクション(Korean Collection for Type Culture)に寄託された。
この発明は、例示であって、この発明を限定しない以下の実施例に照らしてより良く理解される。
【0017】
実験株及びプラスミド
サッカロミセス・セレビシエでのhPTHの発現には、GAL10プロモーター ::ppL::hPTH::GAL7タミネーターからなるhPTH発現カセットを含むプラスミドpG10-hPTH1を用いた(Chung及びPark、Biotechnol. Bioeng. 57、245(1998))。ポップ-アウトのURA3選択マーカー(URA3::tc5)カセットは、pTcUR3由来の1.8kb BamHIフラグメントから調製した(Kangら、Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 575-582 (2000))。サッカロミセス・セレビシエ2805とサッカロミセス・セレビシエL3262aを、YPS3-欠失変異体調製用親細胞として用いた(Kangら、J. Microbiol. Biotechnol., 8, 42-48(1998))。また、本発明で用いた細胞は、YPS1遺伝子が欠失している、酵母株SLH11(Kangら、Appl. Microbiol. Biotechnol., 59, 187(1998))、 SLH12とSLH14(Choiら、J. Biosci. Bioengin., 89, 77(2000))(先のYAP3)、YPS2遺伝子(先のMKC7)又はその双方であった。酵母株の遺伝学的特徴を、以下の表1に要約する。
【0018】
【表1】
【0019】
培地組成及び培養条件
酵母株を、YPS3遺伝子を崩壊するURA3カセット又は発現ベクターpG10-hPTH1で形質転換する際、ウラシルを欠く合成培地SC-URAのみを用いた。得られたyps3::URA3変異体からURA選択マーカーを回収するために、5-FOA(5-フルオロテート(fluorotate))培地を用いた(Adamsら、Methods in yeast genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997)。GAL10 プロモーター制御下のhPTH発現の誘導で用いるため、YPDG(酵母抽出物1%、バクトペプトン2%、グルコース1%、ガラクトース 1%)培地で48時間のあいだ培養した。
【0020】
実施例1:YPS3遺伝子-崩壊酵母変異体の確立
YPS3遺伝子の崩壊で用いるためのURA3カセットを含む組換えベクターの構築を、図1に例示する。
YPS3遺伝子の崩壊をもたらすホモロジー組換えに必要なYPS3遺伝子のN-及びC-末端フラグメントを、GenBankに登録されたサッカロミセス・セレビシエのYPS3塩基配列に基づいて合成した2対のプライマーを用いてPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)により作製した。あとの遺伝子操作を簡便にするため、N-末端フラグメント増幅用のプライマーセット(5'-GACGAATTCCAGAAACGTCTGAGTGGAG-3' (SEQ ID NO:1)及び5'-GCAGGATCCGTACTCTACCGAATGCCG-3 (SEQ ID NO:2))を、各5'-末端部位にEcoRI及びBamHIの認識部位(下線部)を有するように設計したが、BamHI及びXbaIの認識部位を、C-末端フラグメントの増幅用のプライマーセット(5'-GACGAATTCCAGAAACGTCTGAGTGGAG-3' (SEQ ID NO:1)及び5'-GCAGGATCCGTACTCTACCGAATGCCG-3 (SEQ ID NO:2))の5'-末端部位に導入した(下線部)。PCRを、「GeneAmp PCR 2400」のようなPerkin Elmer製のサーマルサイクラーで、変性に95℃/30秒、アニーリングに55℃/30秒、かつ伸長に72℃/30秒からなる25サーマルサイクルを用いて行い、それぞれYPS3遺伝子領域のN-末端及びC-末端領域をエンコードする800bp及び700bp DNAフラグメントをサッカロミセス・セレビシエのゲノムDNAから作製した。PCR産物、つまりYPS3 N-末端及びC-末端フラグメントを、制限酵素EcoRI/BamHI及びBamHI/XbaIそれぞれを用いて二重に消化し、あらかじめEcoRI/XbaIで処理したpBluescript II KS(+)ベクター(Stratagen)に2つの制限酵素消化物を連結した。得られた組換えベクターpB-YPS3NCの2つの末端フラグメント間に位置するBamHI認識部位に、URA3ポップアウト選択マーカーを導入し、YPS3遺伝子の崩壊に使用するためのpB-yps3::URA3:tc5ベクターを構築した。
【0021】
次に、図2に例示するように、URA3カセットを用い、URA3選択マーカーをそれから回収することにより、サッカロミセス・セレビシエのYPS3遺伝子を崩壊させた。
詳細には、EcoRI/XbaIを用いるベクターpB-yps3::URA3:tc5の制限酵素処理によって得られるDNAフラグメントをサッカロミセス・セレビシエ 株2805、L3262a、SLH11 (yps1△)、SLH12 (yps2△)、及びSLH14 (yps1△/yps2△)にトランスフェクトした後、Ura+形質転換体の一次選択をSC-URA選択培地で行った。PCRを行い、Ura+形質転換体がYPS3遺伝子を崩壊させているかどうかを同定し、その後、こうして選択したyps3::URA3:tc5形質転換体を5-FOAプレートに広げ、ホモロジー組換えによるURA3遺伝子のポップアウトから生じるyps3::tcクローンを選択した。
【0022】
最終的に得られたyps3△変異体のYPS3遺伝子の崩壊をPCRによって再同定し、他のヤップシンプロテアーゼ遺伝子を任意に欠くyps3-崩壊体、S28Y4、 SLH15、 SLH16、SLH17及びSLH18を得た。これらの変異体株を以下の表2に要約する。
【0023】
【表2】
【0024】
実施例2: hPTH 発現性の組換え酵母株の確立及びhPTH発現の分析
サッカロミセス・セレビシエ野生型株2805及びL3262ならびにサッカロミセス・セレビシエ変異体S28Y4、SLH15 (yps3△)、SLH16 (yps1△/yps3△)、SLH17(yps2△/yps3△)及びSLH18(yps1△/yps2△/yps3△)を、発現ベクターpG10-hPTH1で形質転換し、次いでUra+形質転換体を選択した。hPTHを発現できる、これらの組換え酵母株を、hPTH発現分析に付した。
【0025】
酵母変異体を、最少選択培地(アミノ酸-欠損酵母窒素基質0.67%、グルコース2%、カサミノ酸(casamino acid) 0.5%)で24時間30℃で前培養した。各培養物をYPDG培地(酵母抽出物1%、バクトペプトン2%、グルコース1%、ガラクトース1%)に2%量で接種し、次いで48時間30℃で培養した。この培養中、試料を24時間と48時間で回収した。各試料500μlを5分5,000rpmで遠心分離し、バイオマスから上清を分離した。DOC(デオキシコール酸)とTCA(トリクロロ酢酸)それぞれを上清の1/10量で加え、次いで30分0℃に置き、中に含まれるタンパク質を沈澱させた。10分12,000 rpmで遠心分離して得たペレットを、アセトンで洗浄し、沈澱タンパク質中に残存するTCA溶液を除き、溶解緩衝液25μl中に溶解し、5分100℃で加熱して、細胞外タンパク質画分を得た。細胞外タンパク質画分10μlを15%ポリアクリルアミド分離ゲル(pH8.8、10cm幅、8cm長、0.7mm厚)に充填し、1.5時間125Vかつ25mAで電気泳動に付した。ゲルで動いたタンパク質をクマシーブルーで視覚化した。24時間の試料についての電気泳動の結果を図3aに、48時間の試料についての結果を図3bに示す。
【0026】
これらの電気泳動写真に見られるように、サッカロミセス・セレビシエ株から分泌される組換えhPTHをSDS-PAGEで分離したところ、3つのバンド:完全な分子についてのi(1-84);N-末端切断型分子についてのd1(27-84);及びC-末端切断型分子についてのd2(1〜80)として現れた。バンドi及びバンドd1に位置するタンパク質を、PVDF(ポリビニリデンジフルオライド)膜に移した。Milligen/Biosearch M6000タンパク質シーケンサーでのタンパク質のN-末端アミノ酸シークエンスにより、バンドi及びd1のタンパク質のN-末端領域でアミノ酸配列Ser-Val-Ser-Glu-Ile (SEQ ID NO:3)及びLys-Leu-Gln-Asp-Val (SEQ ID NO:4)がそれぞれ同定され、バンドiのタンパク質は完全なhPTH分子であるが、d1バンドのタンパク質は、hPTHのN-末端領域の26アミノ酸残基を欠く切断型(27〜84)であることが示された。バンドd2については、完全な分子より14kDa大きい電気泳動のバンドが示されたが、HPLC、MALDI質量分析及びC-末端アミノ酸シークエンスによって分析されるように、そのタンパク質が、C-末端(1〜79、80)の4〜5アミノ酸残基を欠く切断型hPTHであることが分かった。特徴的な電気泳動のパターンは、C-末端の除去によるタンパク質の配座変化に帰することが報告されている(Vad ら、Protein Expr. Purif. 13: 396-402 (1998))。
【0027】
実施例3:ヤップシンプロテアーゼ-欠損変異体におけるhPTH発現パターン
hPTH発現に対するYPS1及びYPS3遺伝子の崩壊の影響を調べるため、野生型サッカロミセス・セレビシエ株2805非形質転換体、野生型サッカロミセス・セレビシエ2805/pG10-hPTH1形質転換体、yps1△変異S28Y3/pG10-hPTH1形質転換体及びyps3△変異S28Y4/pG10-hPTH1形質転換体から分泌されるhPTH分子を、SDS-PAGE電気泳動に付した。電気泳動の結果を図3に示す。
【0028】
電気泳動写真に見られるように、非形質転換体の野生型株ではhPTH分子は発現されなかった(レーン1)。形質転換体の野生株2805で発現される約50%以上のhPTHが、切断型d1で存在した(レーン3及び4)。yps1△変異体S28Y3の場合には、24時間培養物から得た際に、培地に分泌されるhPTHの切断型は全hPTHの5%未満であった。これに対し、48時間培養物から得られるhPTHの約30〜40%は、d1型で存在することが分かった。YPS3遺伝子のみを崩壊させた株S28Y4は、hPTH発現パターンにおいて野生型株と異ならなかった:24時間以内に分泌されるhPTHの約50%以上が切断型で存在することが分かった。
【0029】
ひとまとめにして考慮すると、図3に示す結果は、初期培養段階でhPTH切断を引き起こす主たるプロテアーゼはヤップシン1であり、ヤップシン1以外のプロテアーゼは後期培養段階でhPTHの切断の原因であることを立証している。しかし、YPS3遺伝子のみを崩壊させた株の場合には、有意な作用は得られない。というのは、ヤップシン1の活性は、初期培養段階で有意な程度までhPTHを既に切断しているからである。
【0030】
したがって、YPS3遺伝子を他のヤップシン遺伝子YPS1及びYPS2と組み合わせて崩壊させた際の、hPTH生産の発現パターンについて調べた。この目的のため、野生型サッカロミセス・セレビシエL3262非形質転換体を対照として、L3262/pG10-hPTH1形質転換体、yps3△変異SLH15/pG10-hPTH1形質転換体、yps1△/yps3△ 変異SLH16/pG10-hPTH1形質転換体、yps2△/yps3△変異SLH17/pG10-hPTH1形質転換体及びyps1△/yps2△/yps3△変異SLH18/pG10-hPTH1形質転換体でhPTHを発現させた。分泌されるタンパク質を上記と同様にして電気泳動し、24時間培養後に回収した試料についての電気泳動の結果を図4a、48時間培養後に回収した試料についての結果を図4bに示す。
【0031】
図4に示されるように、非形質転換株でhPTHは検出されなかった(レーン1)。24時間での回収時、形質転換野生株(レーン2及び3)、YPS3-崩壊株(レーン4及び5)ならびにYPS2及びYPS3-二重崩壊株(レーン6及び7)から分泌されるhPTH の50%が、N-末端切断型d1で存在した。48時間後、hPTH切断は、切断型hPTHの割合をさらに増加させることが分かった。他方、興味深いことに、48時間で得たとしても、YPS1及びYPS3-二重崩壊株(レーン6及び7)、ならびにYPS1、YPS2、YPS3-三重崩壊株(レーン10及び11)から分泌されるhPTH分子は、いずれもN-末端切断型d1を有しなかった。さらに、バンドd2の切断型はYPS1及びYPS3-二重崩壊株から分泌される全hPTHの約20%であることが示されたが、バンドiの完全なhPTHは、YPS1/YPS2/YPS3-三重崩壊株の48時間培養後ですら観察される一方、d2バンドタンパク質は見られなかった。これらの結果は、ひとまとめにすると、野生型酵母株が有するhPTHの分解の問題が、YPS1、YPS2及びYPS3の遺伝子全てが崩壊している株の使用によりほぼ完全に解消することを示した。
【0032】
実施例4:高濃度培養におけるhPTH発現パターン
上記のように作製したヤップシンプロテアーゼ-欠損変異体から発現されるhPTHがタンパク質分解を受けるか否かを調べるために、実験を行った。これに関して、ガラクトースを、発酵槽での高濃度培養条件を模倣するためにフラスコに連続的に供給した。YPDG培地で24時間前培養後、株をさらに72時間培養したが、2%レベルで培地のガラクトース濃度を維持するため、24時間間隔でガラクトースを培地に供給した。
【0033】
これらの条件下、野生型サッカロミセス・セレビシエ L3262非形質転換体を対照として、L3262/pG10-hPTH1形質転換体、yps1△変異SLH11/pG10-hPTH1形質転換体、yps1△/yps3△変異SLH16/pG10-hPTH1形質転換体、及びyps1△/yps2△/yps3△変異SLH18/pG10-hPTH1形質転換体でhPTHを発現させた。分泌されたタンパク質を上記と同様にして電気泳動し、L3262/pG10-hPTH1及びSLH11/pG10-hPTH1株についての電気泳動の結果を図5a、SLH16/pG10-hPTH1及びSLH18/pG10-hPTH1についての結果を図5bに示す。
【0034】
図5に示すように、24時間での回収時、野生型酵母(レーン2〜7、図5a)から分泌されるhPTHの約50%が、N-末端切断型d1で既に存在していた。他方、yps1△変異体(図5a、レーン8〜13)及びyps1△/yps3△変異体(レーン2〜7、図5b)の培養物の場合、24時間培養ではhPTHは分解しなかったが、ガラクトースを連続的に与えた48時間の高濃度培養ではhPTH分解が有意に観察された。これに対し、yps1△/yps2△/yps3△変異体の培養物(レーン8〜13、図5b)は、72時間での回収時ですら、N-末端切断型d1のhPTHを有さず、完全なhPTH(iバンド)を有意に増加することが分かった。さらに144時間ですら、三重-崩壊変異体の培養物は、hPTHの切断型を有しないことが観察された。これらの結果は、後期の高濃度培養段階で生じるhPTHの分解の問題が、YPS1、YPS2及びYPS3の遺伝子全てが崩壊している変異体を用いて完全に解消できることを明らかにした。
【0035】
前記のとおり、ヤップシン1(先のYPA3)とヤップシン3遺伝子がともに崩壊している酵母変異体(yps1△/yps3△)、又はヤップシン1、ヤップシン2(先のMKC7)とヤップシン3遺伝子が全て崩壊している変異株(yps1△/yps2△/yps3△)は、種々の疾患の治療に有用な完全hPTHを、ホルモンペプチドを分解できないために、高収率で分泌することができる。
この発明は例示的に記載されており、使用される用語は限定ではなく、説明を意図していることが理解されるべきである。上記の示唆に照らして、本発明の多くの改変及び変更が可能である。したがって、添付の請求の範囲内で、本発明は、詳述される以外の点で実施され得ることが理解されるべきである。
【0036】
【表A】
【0037】
【表B】
【0038】
【図面の簡単な説明】
【図1】 ポップ-アウト(pop-out)のURA3選択マーカーの使用による、YPS3遺伝子崩壊用カセットの構築工程を示す図である。
【図2】 サッカロミセス・セレビシエのYPS3遺伝子を崩壊させ、URA3選択マーカーを回収する工程を示す図である。
【図3】 24時間(a)及び48時間(b)成長させた、サッカロミセス・セレビシエ2805(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ 2805/pG10-hPTH1(レーン2及び3)、サッカロミセス・セレビシエ SY28Y3/pG10-hPTH1(レーン4及び5)ならびにサッカロミセス・セレビシエ SY28Y4/pG10-hPTH1(レーン6及び7)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断した(truncated)hPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している。
【図4】 24時間(a)及び48時間(b)成長させた、サッカロミセス・セレビシエL3262(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ L3262/pG10-hPTH1(レーン2及び3)、サッカロミセス・セレビシエ SLH15/pG10-hPTH1(レーン4及び5)、サッカロミセス・セレビシエ SLH16/ pG10-hPTH1(レーン6及び7)、サッカロミセス・セレビシエ SLH17/pG10-hPTH1(レーン8及び9)ならびにサッカロミセス・セレビシエ SLH18/pG10-hPTH1(レーン10及び11)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断したhPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している。
【図5】 ガラクトースを連続的に供給して72時間成長させた、サッカロミセス・セレビシエ L3262(レーン1)、サッカロミセス・セレビシエ L3262のYPS1/YPS3-二重崩壊体(a):サッカロミセス・セレビシエ L3262/pG10-hPTH1(レーン2〜7)及びサッカロミセス・セレビシエSLH11/pG10-hPTH1(レーン8〜13)、サッカロミセス・セレビシエ L3262のYPS1/YPS2/YPS3-三重崩壊体(b):サッカロミセス・セレビシエ SLH16/pG10-hPTH1(レーン2〜7)及びサッカロミセス・セレビシエ SLH18/pG10-hPTH1(レーン8〜13)の培養物から得たhPTH分子のSDS-PAGEの結果を、1μgの天然のhPTH(C)及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー(M)とともに示す。バンドiは完全なhPTHを表し(1〜84a.a)、バンドd1は切断したhPTH(27〜84a.a)を表し、かつバンドd2はhPTH(1〜80a.a)を表している。
Claims (7)
- YPS1 遺伝子及びYPS3遺伝子の欠失変異を酵母宿主に付し;
ヒト副甲状腺ホルモンをエンコードする遺伝子を含む発現ベクターで酵母宿主を形質転換し;かつ
形質転換酵母宿主を適当な培地で培養する
工程からなる、酵母宿主からの組換えヒト副甲状腺ホルモン(hPTH)の生産方法。 - 欠失変異が、酵母選択マーカーを用いて、YPS1 遺伝子及びYPS3遺伝子を欠失させて行われる、請求項1に記載の方法。
- 酵母宿主が、YPS1遺伝子、YPS2遺伝子及びYPS3遺伝子の全てを欠失している、請求項1又は2に記載の方法。
- ヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を有する発現ベクターで、 YPS1 遺伝子及び YPS3 遺伝子を欠失している酵母変異体を形質転換して作製される、酵母株。
- 酵母株がサッカロミセス・セレビシエ SLH16/ pG10-hPTH(受託番号KCTC 0815BP)であり、発現ベクターがpG10-hPTH1である請求項4に記載の酵母株。
- ヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を有する発現ベクターで、 YPS1 遺伝子、 YPS2 遺伝子及び YPS3 遺伝子を欠失している酵母変異体を形質転換して作製される、酵母株。
- 酵母株がサッカロミセス・セレビシエSLH18/pG10-hPTH (KCTC 0816BP)であり、発現ベクターがpG10-hPTH1である請求項6に記載の酵母株。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2000-0051267A KR100386836B1 (ko) | 2000-08-31 | 2000-08-31 | 재조합 인체 부갑상선 호르몬을 생산하는 형질전환효모 및재조합 인체 부갑상선 호르몬의 생산방법 |
PCT/KR2001/001447 WO2002018570A1 (en) | 2000-08-31 | 2001-08-27 | Yeast transformant producing recombinant human parathyroid hormone and method for producing the hormone |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004507270A JP2004507270A (ja) | 2004-03-11 |
JP2004507270A5 JP2004507270A5 (ja) | 2005-04-28 |
JP3957630B2 true JP3957630B2 (ja) | 2007-08-15 |
Family
ID=36829916
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002524073A Expired - Fee Related JP3957630B2 (ja) | 2000-08-31 | 2001-08-27 | 組換えヒト副甲状腺ホルモンを生産する形質転換酵母及び該ホルモンの生産方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7244591B2 (ja) |
EP (1) | EP1313848B1 (ja) |
JP (1) | JP3957630B2 (ja) |
KR (1) | KR100386836B1 (ja) |
CN (1) | CN1449441A (ja) |
AU (1) | AU2001280242A1 (ja) |
DE (1) | DE10196565B4 (ja) |
ES (1) | ES2258371B1 (ja) |
GB (1) | GB2381273B (ja) |
WO (1) | WO2002018570A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100386836B1 (ko) * | 2000-08-31 | 2003-06-09 | 동국제약 주식회사 | 재조합 인체 부갑상선 호르몬을 생산하는 형질전환효모 및재조합 인체 부갑상선 호르몬의 생산방법 |
KR100470978B1 (ko) * | 2003-01-02 | 2005-03-10 | 한국생명공학연구원 | 앱신 다중 결손 효모 변이 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법 |
JP2007521232A (ja) | 2003-08-08 | 2007-08-02 | アブジェニックス・インコーポレーテッド | 副甲状腺ホルモン(pth)に対する抗体およびその使用 |
US7318925B2 (en) * | 2003-08-08 | 2008-01-15 | Amgen Fremont, Inc. | Methods of use for antibodies against parathyroid hormone |
CA2617832A1 (en) * | 2005-08-03 | 2007-02-08 | Asahi Glass Company, Limited | Yeast host, transformant and method for producing heterologous proteins |
EP2134853B1 (en) | 2007-04-03 | 2018-07-18 | Oxyrane UK Limited | Glycosylation of molecules |
CA2775938C (en) | 2009-09-29 | 2021-08-10 | Oxyrane Uk Limited | Hydrolysis of mannose-1-phospho-6-mannose linkage to phospho-6-mannose |
CN102834509A (zh) | 2009-11-19 | 2012-12-19 | 奥克西雷恩英国有限公司 | 生成哺乳动物样复合n-聚糖的酵母菌株 |
WO2012042386A2 (en) | 2010-09-29 | 2012-04-05 | Oxyrane Uk Limited | Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated n-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins |
EP2622089B1 (en) | 2010-09-29 | 2023-11-01 | Oxyrane UK Limited | De-mannosylation of phosphorylated n-glycans |
SG11201403506TA (en) * | 2011-12-30 | 2014-07-30 | Oxyrane Uk Ltd | Methods and materials for reducing degradation of recombinant proteins |
CA2867237C (en) | 2012-03-15 | 2024-01-02 | Wouter Vervecken | Methods and materials for treatment of pompe's disease |
WO2023215221A2 (en) * | 2022-05-02 | 2023-11-09 | North Carolina State University | Engineered microorganisms with enhanced protein expression and secretion |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2777132B2 (ja) * | 1986-10-22 | 1998-07-16 | カーレ・エンム・ガウトビク | 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産 |
US5420242A (en) * | 1986-10-22 | 1995-05-30 | Kaare M. Gautvik | Production of human parathyroid hormone from microorganisms |
KR100246932B1 (ko) * | 1997-09-12 | 2000-03-15 | 박호군 | Yap3 유전자가 결손된 신규한 효모균주 및 그를 이용한 재조합 인체 부갑상선호르몬의 생산 |
AU2241699A (en) * | 1998-01-27 | 1999-08-09 | Board Of Regents Of The University And Community College System Of Nevada, The | Expression of proteolytically-sensitive peptides |
KR100386836B1 (ko) * | 2000-08-31 | 2003-06-09 | 동국제약 주식회사 | 재조합 인체 부갑상선 호르몬을 생산하는 형질전환효모 및재조합 인체 부갑상선 호르몬의 생산방법 |
-
2000
- 2000-08-31 KR KR10-2000-0051267A patent/KR100386836B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-08-31 ES ES200350014A patent/ES2258371B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-08-27 JP JP2002524073A patent/JP3957630B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-27 EP EP01958618A patent/EP1313848B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-27 US US10/363,329 patent/US7244591B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-27 AU AU2001280242A patent/AU2001280242A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-27 DE DE10196565T patent/DE10196565B4/de not_active Expired - Fee Related
- 2001-08-27 CN CN01814919A patent/CN1449441A/zh active Pending
- 2001-08-27 WO PCT/KR2001/001447 patent/WO2002018570A1/en active IP Right Grant
- 2001-08-27 GB GB0303081A patent/GB2381273B/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2001280242A1 (en) | 2002-03-13 |
GB0303081D0 (en) | 2003-03-19 |
GB2381273B (en) | 2004-12-22 |
DE10196565B4 (de) | 2007-02-01 |
US20040029252A1 (en) | 2004-02-12 |
GB2381273A (en) | 2003-04-30 |
EP1313848B1 (en) | 2006-07-05 |
ES2258371A1 (es) | 2006-08-16 |
DE10196565T1 (de) | 2003-07-03 |
KR20020017754A (ko) | 2002-03-07 |
CN1449441A (zh) | 2003-10-15 |
EP1313848A1 (en) | 2003-05-28 |
KR100386836B1 (ko) | 2003-06-09 |
US7244591B2 (en) | 2007-07-17 |
ES2258371B1 (es) | 2007-05-16 |
JP2004507270A (ja) | 2004-03-11 |
WO2002018570A1 (en) | 2002-03-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3957630B2 (ja) | 組換えヒト副甲状腺ホルモンを生産する形質転換酵母及び該ホルモンの生産方法 | |
JPH03500370A (ja) | ペプチドおよびdna配列 | |
US20070148733A1 (en) | Yeast expression vectors for production of ITF | |
US11447780B2 (en) | Preparation of wheat cysteine protease triticain-alpha produced in soluble form and method of producing same | |
JP2012105675A (ja) | 難発現性タンパク質の分泌のためのタンパク質融合因子(tfp)を明らかにする方法、タンパク質融合因子(tfp)ライブラリーを製造する方法、及び難発現性タンパク質の組み換え的生産方法 | |
KR100496758B1 (ko) | 한세눌라 폴리모르파 앱신 유전자 결손 변이주 및 이를이용한 재조합 단백질 생산 방법 | |
TWI282370B (en) | Improved method for the recombinant production of polypeptides | |
KR100803095B1 (ko) | 바실러스 서브틸리스 ch2 유래의 키토산아제를 코딩하는유전자, 이 유전자를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로형질전환된 형질전환체 및 이로부터 생산되는 단백질의정제방법 | |
KR100677828B1 (ko) | OmpF와 목적단백질의 동시 발현을 통한 목적 단백질의세포외 분비·생산 방법 | |
EP3904520A1 (en) | Gene expression cassette for expressing n-terminal methionine-truncated protein of interest and method for producing n-terminal methionine-truncated protein of interest by using same | |
KR101077783B1 (ko) | 재조합 인간성장호르몬 단백질, 이의 발현 벡터, 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질의 제조방법 | |
WO1986003779A1 (en) | Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms | |
US8956848B2 (en) | UBP1 protease mutant, and its coding sequence, their application and methods of production | |
KR100246932B1 (ko) | Yap3 유전자가 결손된 신규한 효모균주 및 그를 이용한 재조합 인체 부갑상선호르몬의 생산 | |
JP2009525749A (ja) | 組換えタンパク質の精製のためのアフィニティーポリペプチド | |
NO326247B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av modent insulin eller et modent insulin derivat. | |
Treerattrakool et al. | Secretion of Pem-CMG, a Peptide in the CHH/MIH/GIH Family of Penaeus monodon, in Pichia pastoris Is Directed by Secretion Signal of the α-Mating Factor from Saccharomyces cerevisiae | |
JPH08103278A (ja) | 活性型ヒトaltの製造方法 | |
US7354994B2 (en) | Recombinant IGF expression systems | |
WO2024119434A1 (zh) | 一种提高重组蛋白表达效率的酸性表面助溶短肽标签 | |
WO2007012334A1 (en) | Improved protein expression | |
JPH067186A (ja) | ダニ主要アレルゲンの製造方法 | |
JP4252299B2 (ja) | 新規ジスルフィド酸化還元酵素、および、該酵素を用いたタンパク質の活性化方法 | |
CN117756925A (zh) | 一种重组弹性蛋白Pro.ELP及其制备方法和应用 | |
CN114702560A (zh) | 一种钝齿棒杆菌表面蛋白Ncgl1337及其在表面展示系统中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070109 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070329 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070424 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070508 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3957630 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110518 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110518 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120518 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130518 Year of fee payment: 6 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140518 Year of fee payment: 7 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |