JPH067186A - ダニ主要アレルゲンの製造方法 - Google Patents
ダニ主要アレルゲンの製造方法Info
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- JPH067186A JPH067186A JP26253891A JP26253891A JPH067186A JP H067186 A JPH067186 A JP H067186A JP 26253891 A JP26253891 A JP 26253891A JP 26253891 A JP26253891 A JP 26253891A JP H067186 A JPH067186 A JP H067186A
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- Japan
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- der
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- protein
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- plasmid
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ダニ主要アレルゲンDer f IIをコードする遺
伝子を含む複製ベクターで形質転換した原核生物または
真核生物を培養し、培養物からダニ主要アレルゲンを採
取することを特徴とするダニ主要アレルゲンの製造方
法。 【効果】 遺伝子工学を使ってヒョウヒダニ主要アレル
ゲン蛋白質Der f IIを発現しているクローンを培養し、
目的とするアレルゲン蛋白を、従来得られていた他の蛋
白との融合状態で生産させるのではなく、虫体から得ら
れるアレルゲンと殆ど同じアレルゲンを大量に調製する
ことができた。それゆえ、本発明に従えばダニ虫体由来
のDer f IIとほぼ同じダニ主要アレルゲンを大量に調製
する方法を提供することができる。この蛋白質を用いて
各種のアレルギー疾患の治療あるいは診断に使用するこ
とが可能となった。
伝子を含む複製ベクターで形質転換した原核生物または
真核生物を培養し、培養物からダニ主要アレルゲンを採
取することを特徴とするダニ主要アレルゲンの製造方
法。 【効果】 遺伝子工学を使ってヒョウヒダニ主要アレル
ゲン蛋白質Der f IIを発現しているクローンを培養し、
目的とするアレルゲン蛋白を、従来得られていた他の蛋
白との融合状態で生産させるのではなく、虫体から得ら
れるアレルゲンと殆ど同じアレルゲンを大量に調製する
ことができた。それゆえ、本発明に従えばダニ虫体由来
のDer f IIとほぼ同じダニ主要アレルゲンを大量に調製
する方法を提供することができる。この蛋白質を用いて
各種のアレルギー疾患の治療あるいは診断に使用するこ
とが可能となった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学によるヒョ
ウヒダニの主要アレルゲン（Der f II）の製造法に関す
る。
ウヒダニの主要アレルゲン（Der f II）の製造法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】アレルギー疾患の多くは、その疾患の原
因抗原に感作されることにより、血清および組織でアレ
ルゲンに特異的なIgＥ抗体（レアギン抗体）が産生さ
れ、再びその抗原に暴露されることにより、各組織上で
抗原とIgＥ抗体が抗原抗体反応を起こし、その際、生じ
る種々の症状によるものと考えられている。
因抗原に感作されることにより、血清および組織でアレ
ルゲンに特異的なIgＥ抗体（レアギン抗体）が産生さ
れ、再びその抗原に暴露されることにより、各組織上で
抗原とIgＥ抗体が抗原抗体反応を起こし、その際、生じ
る種々の症状によるものと考えられている。
【０００３】このアレルギー疾患を根本的に治療する方
法として、減感作療法がある。この方法は、その原因抗
原を少量ずつ、また、症状に応じて投与量を徐々に増量
しながら、反復投与する方法である。この療法により遮
断抗体産生、IgＥ抗体産生抑制、マスト細胞から遊離す
るヒスタミン量の低下が起こり、治療効果が得られると
考えられている。
法として、減感作療法がある。この方法は、その原因抗
原を少量ずつ、また、症状に応じて投与量を徐々に増量
しながら、反復投与する方法である。この療法により遮
断抗体産生、IgＥ抗体産生抑制、マスト細胞から遊離す
るヒスタミン量の低下が起こり、治療効果が得られると
考えられている。
【０００４】一方、気管支喘息、小児喘息、アトピー性
皮膚炎などのアレルギー性疾患は、室内塵中に生息して
いるダニに対するアレルギーが主な原因であることが明
らかになっており、既にいくつかのダニ主要アレルゲン
タンパク質が同定されている(プラッツミルズ（Platts-
Mills) ら、ザ・ジャーナル・オブ・アレルギー・アン
ド・クリニカル・イムノロジー（J. Allergy Clin. Imm
unol.)80巻、755 頁、1987年) 。従って、この主要アレ
ルゲンを用いた上記アレルギー疾患の減感作療法は、き
わめて有効であるが、多量の精製アレルゲンを必要とす
る。しかし、これまで精製ダニ主要アレルゲンを多量に
調製することは、実質的に不可能であった。また結城ら
によって開示されている精製ダニ主要アレルゲンの調製
法では、他の蛋白質、例えばβ−ガラクトシダーゼとの
融合蛋白質として得られ、ダニ虫体から得られる本来の
ダニ主要アレルゲンとは形が異なるものしか得られなか
った。すなわち、ＤＮＡによって得られるダニアレルゲ
ン蛋白質を、他の蛋白質との融合状態で得ることができ
た (特願平２−50848 号) 。しかし、この蛋白質から必
要なアレルゲンのみを単離することは困難であった。
皮膚炎などのアレルギー性疾患は、室内塵中に生息して
いるダニに対するアレルギーが主な原因であることが明
らかになっており、既にいくつかのダニ主要アレルゲン
タンパク質が同定されている(プラッツミルズ（Platts-
Mills) ら、ザ・ジャーナル・オブ・アレルギー・アン
ド・クリニカル・イムノロジー（J. Allergy Clin. Imm
unol.)80巻、755 頁、1987年) 。従って、この主要アレ
ルゲンを用いた上記アレルギー疾患の減感作療法は、き
わめて有効であるが、多量の精製アレルゲンを必要とす
る。しかし、これまで精製ダニ主要アレルゲンを多量に
調製することは、実質的に不可能であった。また結城ら
によって開示されている精製ダニ主要アレルゲンの調製
法では、他の蛋白質、例えばβ−ガラクトシダーゼとの
融合蛋白質として得られ、ダニ虫体から得られる本来の
ダニ主要アレルゲンとは形が異なるものしか得られなか
った。すなわち、ＤＮＡによって得られるダニアレルゲ
ン蛋白質を、他の蛋白質との融合状態で得ることができ
た (特願平２−50848 号) 。しかし、この蛋白質から必
要なアレルゲンのみを単離することは困難であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、既に開
示されているダニ主要アレルゲンDer f IIをコードして
いる遺伝子を遺伝子操作によって種々改変して発現させ
た後に、生成蛋白質を調べた結果、ダニ主要アレルゲン
Der f IIを融合蛋白質としてではなく、虫体由来のアレ
ルゲンとほぼ同等のアレルゲンを多量に調製できること
を見出した。
示されているダニ主要アレルゲンDer f IIをコードして
いる遺伝子を遺伝子操作によって種々改変して発現させ
た後に、生成蛋白質を調べた結果、ダニ主要アレルゲン
Der f IIを融合蛋白質としてではなく、虫体由来のアレ
ルゲンとほぼ同等のアレルゲンを多量に調製できること
を見出した。
【０００６】それ故、本発明の目的は遺伝子工学を用い
てダニ主要アレルゲン蛋白質をコードするＤＮＡ配列を
得ることであり、かつそのＤＮＡがコードしているダニ
主要アレルゲンを直接発現させ、目的とするアレルゲ
ン、Der f IIを多量に製造する方法を提供することであ
る。すなわち、ダニアレルゲンの有効物のみを効率的に
製造することを目的とする。
てダニ主要アレルゲン蛋白質をコードするＤＮＡ配列を
得ることであり、かつそのＤＮＡがコードしているダニ
主要アレルゲンを直接発現させ、目的とするアレルゲ
ン、Der f IIを多量に製造する方法を提供することであ
る。すなわち、ダニアレルゲンの有効物のみを効率的に
製造することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、コナヒョウヒ
ダニ主要アレルゲン（Der f II）を遺伝子工学的に大量
に調製する方法であり、ダニ主要アレルゲンDer f IIを
コードする遺伝子を含む複製ベクターで形質転換した原
核生物または真核生物を培養し、培養物からダニ主要ア
レルゲンを採取することを特徴とする。
ダニ主要アレルゲン（Der f II）を遺伝子工学的に大量
に調製する方法であり、ダニ主要アレルゲンDer f IIを
コードする遺伝子を含む複製ベクターで形質転換した原
核生物または真核生物を培養し、培養物からダニ主要ア
レルゲンを採取することを特徴とする。
【０００８】ダニ主要アレルゲンDer f IIをコードする
遺伝子およびその調製方法は、すでに結城らにより開示
されている（アレルギー（Japanese J. Allergology)、
39巻、557 頁、1990年) 。この遺伝子を種々の遺伝子工
学的手法によって改変し、さらにベクター及び宿主を選
択することによりダニ虫体由来のDer f IIと免疫学的に
同等であり、物質的にもほぼ同等のダニ主要アレルゲン
Der f IIを大量に調製することができることを見いだし
本発明を完成した。
遺伝子およびその調製方法は、すでに結城らにより開示
されている（アレルギー（Japanese J. Allergology)、
39巻、557 頁、1990年) 。この遺伝子を種々の遺伝子工
学的手法によって改変し、さらにベクター及び宿主を選
択することによりダニ虫体由来のDer f IIと免疫学的に
同等であり、物質的にもほぼ同等のダニ主要アレルゲン
Der f IIを大量に調製することができることを見いだし
本発明を完成した。
【０００９】結城らが報告しているプラスミドpFL11 を
制限酵素KpnIで完全に消化した後アガロースゲル電気泳
動を行い、消化ＤＮＡ断片を分離した。電気泳動終了後
のアガロースゲルからDer f II遺伝子を含む約 500塩基
対の KpnI 断片を得た。本ＤＮＡ断片はＮ末端アミノ
酸、アスパラギン酸に対応するコドン、ＧＡＴの上流に
シグナル配列をコードすると思われる30塩基の配列があ
る。虫体由来のDer f IIと同じ配列を持つ蛋白質を産生
させるためにこの配列を除去し、また翻訳効率を上げる
ために、終止コドン以降のポリＡ配列を除去した。
制限酵素KpnIで完全に消化した後アガロースゲル電気泳
動を行い、消化ＤＮＡ断片を分離した。電気泳動終了後
のアガロースゲルからDer f II遺伝子を含む約 500塩基
対の KpnI 断片を得た。本ＤＮＡ断片はＮ末端アミノ
酸、アスパラギン酸に対応するコドン、ＧＡＴの上流に
シグナル配列をコードすると思われる30塩基の配列があ
る。虫体由来のDer f IIと同じ配列を持つ蛋白質を産生
させるためにこの配列を除去し、また翻訳効率を上げる
ために、終止コドン以降のポリＡ配列を除去した。
【００１０】まず、得られたKpnI断片を制限酵素 Sau3A
I で完全消化、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、切出
し溶出して72塩基対の Sau3AI 断片を得た。この断片の
付着末端を埋めた後、制限酵素NcoIで消化して63塩基対
の断片とした。また、 KpnI断片を制限酵素 HinfIで消
化し生じた付着末端を埋めた後に、制限酵素NcoIで消化
した。しかる後にアガロースゲル電気泳動に供して 389
塩基対のＤＮＡ配列を単離した。
I で完全消化、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、切出
し溶出して72塩基対の Sau3AI 断片を得た。この断片の
付着末端を埋めた後、制限酵素NcoIで消化して63塩基対
の断片とした。また、 KpnI断片を制限酵素 HinfIで消
化し生じた付着末端を埋めた後に、制限酵素NcoIで消化
した。しかる後にアガロースゲル電気泳動に供して 389
塩基対のＤＮＡ配列を単離した。
【００１１】一方、ベクタープラスミドpKK233-2を制限
酵素NcoIで切断した後、付着末端を埋め、さらにアルカ
リフォスファターゼで処理した。直鎖状にしたベクター
と既に調製してある二つのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４リ
ガーゼで連結した。大腸菌JM105 を、この溶液で形質転
換し、得られた形質転換株を前記結城らによって開示さ
れている方法に従って、抗Der f II抗体を用いたコロニ
ーイムノアッセイに供した。ただし、発現を誘導するた
めに本プラスミドの場合はイソプロピル−β−チオガラ
クトピラノシドを用いた。抗Der f II抗体と反応する蛋
白を産生するコロニーを選択し、プラスミドの抽出を行
った。
酵素NcoIで切断した後、付着末端を埋め、さらにアルカ
リフォスファターゼで処理した。直鎖状にしたベクター
と既に調製してある二つのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４リ
ガーゼで連結した。大腸菌JM105 を、この溶液で形質転
換し、得られた形質転換株を前記結城らによって開示さ
れている方法に従って、抗Der f II抗体を用いたコロニ
ーイムノアッセイに供した。ただし、発現を誘導するた
めに本プラスミドの場合はイソプロピル−β−チオガラ
クトピラノシドを用いた。抗Der f II抗体と反応する蛋
白を産生するコロニーを選択し、プラスミドの抽出を行
った。
【００１２】しかして得られたプラスミドを図１に示す
ようにpFLK11と命名した。得られたプラスミドへ挿入さ
れているＤＮＡ断片の塩基配列を、ダイデオキシ法（サ
ンガー(Sanger F.) ら、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー (J. Mol.Biol.) 162巻、729-773
頁、1982年) で決定し、後記の配列表の配列番号１に示
される塩基配列であることを確認した。
ようにpFLK11と命名した。得られたプラスミドへ挿入さ
れているＤＮＡ断片の塩基配列を、ダイデオキシ法（サ
ンガー(Sanger F.) ら、ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー (J. Mol.Biol.) 162巻、729-773
頁、1982年) で決定し、後記の配列表の配列番号１に示
される塩基配列であることを確認した。
【００１３】プラスミドpFLK11で形質転換された大腸菌
の生産する蛋白で抗Der f II抗体と反応する蛋白が虫体
由来の当該蛋白と同じかどうかについて、さらに検討を
行った。形質転換株をアンピシリン (50μg/ml) の存在
下にＬブロス（１％バクトトリプトン、0.5 ％イースト
エキストラクト、0.5 ％塩化ナトリウム、pH 7.4) 中で
37℃、660nm の吸光度が0.7 まで培養し、その後、イソ
プロピル−β−チオガラクトピラノシドで発現を誘導
し、37℃でさらに２時間培養を継続した。培養終了後の
ブロスから目的とする蛋白を精製した。精製は、従来か
ら用いられている種々の精製法（生化学実験講座第１
巻、タンパク質の化学、山川民夫、今掘和友編、東京化
学同人）を組み合わせて使用できるが、逆相高速クロマ
トグラフィーを用いる方法が有利である。
の生産する蛋白で抗Der f II抗体と反応する蛋白が虫体
由来の当該蛋白と同じかどうかについて、さらに検討を
行った。形質転換株をアンピシリン (50μg/ml) の存在
下にＬブロス（１％バクトトリプトン、0.5 ％イースト
エキストラクト、0.5 ％塩化ナトリウム、pH 7.4) 中で
37℃、660nm の吸光度が0.7 まで培養し、その後、イソ
プロピル−β−チオガラクトピラノシドで発現を誘導
し、37℃でさらに２時間培養を継続した。培養終了後の
ブロスから目的とする蛋白を精製した。精製は、従来か
ら用いられている種々の精製法（生化学実験講座第１
巻、タンパク質の化学、山川民夫、今掘和友編、東京化
学同人）を組み合わせて使用できるが、逆相高速クロマ
トグラフィーを用いる方法が有利である。
【００１４】得られた形質転換株の生産するDer f II蛋
白を、ペプチドシーケンサー473A型（アプライドバイオ
システムズ社製) に供し、そのアミノ酸配列を決定し
た。Ｎ末端から24アミノ酸までを決定したところ、Ｎ末
端にメチオニンが一残基余分に付いている以外は、アミ
ノ酸配列は虫体由来の当該蛋白と全く同じであった。従
って、本発明によって生産されるダニ主要アレルゲン蛋
白、Der f IIは虫体由来の当該蛋白とほぼ同等のもので
あり、従来得られていた他の蛋白との融合ではないこと
が判明した。本発明で開示した遺伝子工学的手法によっ
て生産されるダニ主要アレルゲン、Der f IIのアレルギ
ー患者IgE との反応性を虫体由来の同蛋白と比較したと
ころ、全く同じ反応性が得られた。
白を、ペプチドシーケンサー473A型（アプライドバイオ
システムズ社製) に供し、そのアミノ酸配列を決定し
た。Ｎ末端から24アミノ酸までを決定したところ、Ｎ末
端にメチオニンが一残基余分に付いている以外は、アミ
ノ酸配列は虫体由来の当該蛋白と全く同じであった。従
って、本発明によって生産されるダニ主要アレルゲン蛋
白、Der f IIは虫体由来の当該蛋白とほぼ同等のもので
あり、従来得られていた他の蛋白との融合ではないこと
が判明した。本発明で開示した遺伝子工学的手法によっ
て生産されるダニ主要アレルゲン、Der f IIのアレルギ
ー患者IgE との反応性を虫体由来の同蛋白と比較したと
ころ、全く同じ反応性が得られた。
【００１５】次に、発現量を増加させる目的で作成した
プラスミド、pFLK11の複製開始点の変更を実施した。De
r f II遺伝子を含むプラスミド、pFLK11は複製開始点が
pBR系であり宿主内におけるコピー数が少ない。そこ
で、コピー数の多いpUC 系の複製開始点に変更した。プ
ラスミドpUC118を、制限酵素 PvuI 及び PvuIIで完全消
化して、複製開始点を含む約 1.4キロ塩基対のＤＮＡ断
片を得た。またプラスミドpFLK11も制限酵素 PvuI 及び
PvuIIで完全消化して、Der f II遺伝子を含む約3.4 キ
ロ塩基対のＤＮＡ断片を得た。調製した二つのＤＮＡ断
片をＴ４リガーゼで連結した。
プラスミド、pFLK11の複製開始点の変更を実施した。De
r f II遺伝子を含むプラスミド、pFLK11は複製開始点が
pBR系であり宿主内におけるコピー数が少ない。そこ
で、コピー数の多いpUC 系の複製開始点に変更した。プ
ラスミドpUC118を、制限酵素 PvuI 及び PvuIIで完全消
化して、複製開始点を含む約 1.4キロ塩基対のＤＮＡ断
片を得た。またプラスミドpFLK11も制限酵素 PvuI 及び
PvuIIで完全消化して、Der f II遺伝子を含む約3.4 キ
ロ塩基対のＤＮＡ断片を得た。調製した二つのＤＮＡ断
片をＴ４リガーゼで連結した。
【００１６】しかる後に、大腸菌JM105 を形質転換し、
アンピシリン50μg/mlの存在下、37℃、Ｌブロス寒天培
地上（１％バクトトリプトン、0.5 ％イーストエキスト
ラクト、0.5 ％塩化ナトリウム、1.5 ％バクトアガー、
pH7.4 ) で一晩培養した。生じたコロニーを、イソプロ
ピル−β−チオガラクトピラノシド200mM に浸漬して風
乾かしておいたニトロセルロースフィルター上に転写
し、フィルターを前述したＬブロス寒天培地上で37℃、
２時間培養し、外来蛋白質を生産させた。このフィルタ
ーをクロロホルム蒸気に暴露して溶菌させ、産生してい
る蛋白質をこのフィルター上に固定した。抗Der f II抗
体に反応する陽性クローンを選択し、保存しておいた元
の寒天プレートから大腸菌コロニーを選択した。前述し
たアンピシリン含有のＬブロス培地へ接種し、37℃で約
18時間培養後、培養液から菌体を集め常法のアルカリ抽
出法によってプラスミドを回収した。
アンピシリン50μg/mlの存在下、37℃、Ｌブロス寒天培
地上（１％バクトトリプトン、0.5 ％イーストエキスト
ラクト、0.5 ％塩化ナトリウム、1.5 ％バクトアガー、
pH7.4 ) で一晩培養した。生じたコロニーを、イソプロ
ピル−β−チオガラクトピラノシド200mM に浸漬して風
乾かしておいたニトロセルロースフィルター上に転写
し、フィルターを前述したＬブロス寒天培地上で37℃、
２時間培養し、外来蛋白質を生産させた。このフィルタ
ーをクロロホルム蒸気に暴露して溶菌させ、産生してい
る蛋白質をこのフィルター上に固定した。抗Der f II抗
体に反応する陽性クローンを選択し、保存しておいた元
の寒天プレートから大腸菌コロニーを選択した。前述し
たアンピシリン含有のＬブロス培地へ接種し、37℃で約
18時間培養後、培養液から菌体を集め常法のアルカリ抽
出法によってプラスミドを回収した。
【００１７】得られたプラスミドを種々の制限酵素で消
化した後、あるいは消化せずに、アガロースゲル電気泳
動に供し、図２に示す目的とするプラスミドpFLU11であ
ることを確認した。しかして得られたプラスミドpFLU11
及びpFLK11を大腸菌JM105 に導入し、得られた形質転換
株でDer f IIを産生させ両者の生産性を調べた。複製開
始点をpBR系からpUC 系に変更することにより当該蛋白
の生産性が向上した。
化した後、あるいは消化せずに、アガロースゲル電気泳
動に供し、図２に示す目的とするプラスミドpFLU11であ
ることを確認した。しかして得られたプラスミドpFLU11
及びpFLK11を大腸菌JM105 に導入し、得られた形質転換
株でDer f IIを産生させ両者の生産性を調べた。複製開
始点をpBR系からpUC 系に変更することにより当該蛋白
の生産性が向上した。
【００１８】さらにDer f IIを産生させる宿主を選択す
るために、大腸菌JM105 、JM109 、DH1 、HB101 および
MV1184を各々プラスミドpFLU11で形質転換させ、当該蛋
白の生産量を比較した。その結果、JM109 およびDH1 を
用いた場合、生産性が向上することが明らかとなった。
上記のごとく調製し大腸菌で発現させることができるダ
ニ主要アレルゲンDerf II遺伝子は、適当なベクター、
例えば YEp13（ブローチ(Broach J. R.)ら、ジーン(Gen
e)、8 巻、121-133 頁、1979年) などを用いて、酵母中
で発現させることができる。本発明によるダニDer f II
遺伝子を伴う発現カセットを持つ酵母ベクターを用い、
適当な酵母細胞を形質転換することができる。この目的
のため本発明によるＤＮＡ配列は、大腸菌プロモータで
はなく強力な真核性プロモータ、例えばΔＰ８（大竹
ら、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Agric. Biol. Chem.) 、52巻、2753-2762
頁、1988年) などの制御下におかなければならない。
るために、大腸菌JM105 、JM109 、DH1 、HB101 および
MV1184を各々プラスミドpFLU11で形質転換させ、当該蛋
白の生産量を比較した。その結果、JM109 およびDH1 を
用いた場合、生産性が向上することが明らかとなった。
上記のごとく調製し大腸菌で発現させることができるダ
ニ主要アレルゲンDerf II遺伝子は、適当なベクター、
例えば YEp13（ブローチ(Broach J. R.)ら、ジーン(Gen
e)、8 巻、121-133 頁、1979年) などを用いて、酵母中
で発現させることができる。本発明によるダニDer f II
遺伝子を伴う発現カセットを持つ酵母ベクターを用い、
適当な酵母細胞を形質転換することができる。この目的
のため本発明によるＤＮＡ配列は、大腸菌プロモータで
はなく強力な真核性プロモータ、例えばΔＰ８（大竹
ら、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Agric. Biol. Chem.) 、52巻、2753-2762
頁、1988年) などの制御下におかなければならない。
【００１９】遺伝子工学により調製した、本発明による
ダニDer f II蛋白質はダニに起因する各種のアレルギー
疾患の治療あるいは診断に使用できる。
ダニDer f II蛋白質はダニに起因する各種のアレルギー
疾患の治療あるいは診断に使用できる。
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、遺伝子工学を使ってヒ
ョウヒダニ主要アレルゲン蛋白質Derf IIを発現してい
るクローンを培養し、目的とするアレルゲン蛋白を、従
来得られていた他の蛋白との融合状態で生産させるので
はなく、虫体から得られるアレルゲンと殆ど同じアレル
ゲンを大量に調製することができた。
ョウヒダニ主要アレルゲン蛋白質Derf IIを発現してい
るクローンを培養し、目的とするアレルゲン蛋白を、従
来得られていた他の蛋白との融合状態で生産させるので
はなく、虫体から得られるアレルゲンと殆ど同じアレル
ゲンを大量に調製することができた。
【００２１】それゆえ、本発明に従えばダニ虫体由来の
Der f IIとほぼ同じダニ主要アレルゲンを大量に調製す
る方法を提供することができる。この蛋白質を用いて各
種のアレルギー疾患の治療あるいは診断に使用すること
が可能となった。
Der f IIとほぼ同じダニ主要アレルゲンを大量に調製す
る方法を提供することができる。この蛋白質を用いて各
種のアレルギー疾患の治療あるいは診断に使用すること
が可能となった。
【００２２】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づき一層具体的に
説明する。 実施例１Der f IIをコードする遺伝子の調製と発現ベクターへの
挿入 既に開示されているところのダニ主要アレルゲンDer f
IIのｃＤＮＡを保持しているプラスミドpFL11 （アレル
ギー（Japanese J. Allergology 、39巻、557頁、1990
年))からDer f IIをコードする遺伝子だけを調製した。
その概略を図１に示す。
説明する。 実施例１Der f IIをコードする遺伝子の調製と発現ベクターへの
挿入 既に開示されているところのダニ主要アレルゲンDer f
IIのｃＤＮＡを保持しているプラスミドpFL11 （アレル
ギー（Japanese J. Allergology 、39巻、557頁、1990
年))からDer f IIをコードする遺伝子だけを調製した。
その概略を図１に示す。
【００２３】pFL11 は発現用プラスミドpUEX1(アマシャ
ム社製) を元にして構築されたもので、その制限酵素 B
amHI部位にDer f IIのｃＤＮＡ遺伝子が合成ヌクレオチ
ドのアダプター（アマシャム社製）を介して挿入されて
いる。このpFL11 を合成ヌクレオチドアダプター中の制
限酵素KpnIで完全消化し、0.7 ％アガロース電気泳動に
供し消化ＤＮＡ断片を分離した。Der f IIｃＤＮＡを完
全に含んでいる約500塩基対の KpnI 断片を泳動後のア
ガロースゲルから抽出精製した。Der f II遺伝子とその
アダプターの塩基配列および推定されるアミノ酸配列を
図３に示す。
ム社製) を元にして構築されたもので、その制限酵素 B
amHI部位にDer f IIのｃＤＮＡ遺伝子が合成ヌクレオチ
ドのアダプター（アマシャム社製）を介して挿入されて
いる。このpFL11 を合成ヌクレオチドアダプター中の制
限酵素KpnIで完全消化し、0.7 ％アガロース電気泳動に
供し消化ＤＮＡ断片を分離した。Der f IIｃＤＮＡを完
全に含んでいる約500塩基対の KpnI 断片を泳動後のア
ガロースゲルから抽出精製した。Der f II遺伝子とその
アダプターの塩基配列および推定されるアミノ酸配列を
図３に示す。
【００２４】虫体抽出Der f II蛋白質は図３の34番目の
アスパラギン酸がそのＮ末端アミノ酸であり、その上流
の配列はプレ配列であると考えられる（アレルギー（Ja
panese J. Allergology 、39巻、557 頁、1990年))。そ
こで成熟型Der f II蛋白質を産生させるために、プレ配
列領域が欠損した遺伝子を調製した。また、翻訳効率に
影響するとされている３' 末端ポリＡ配列（図３）の除
去も同時に行った。すなわち、Ｎ末端アミノ酸アスパラ
ギン酸に対応するコドンGAT の位置に丁度切断部位が存
在する制限酵素 Sau3AI で、精製した KpnI 断片を完全
切断し、ＤＮＡポリメレースＩクレノウ（Klenow) フラ
グメントを用い、切断部位の突出末端を平滑化した。そ
の後、制限酵素 NcoI で完全切断し、５％のアクリルア
ミドゲル電気泳動に供し、63塩基対の Sau3AI(filled)-
NcoI 断片を分離精製した。同じようにKpnI断片をポリ
Ａ配列の直前に切断部位が存在する制限酵素HinfI で完
全分解した後、末端を平滑化した。その後、やはり Nco
I で切断後、アクリルアミドゲル電気泳動で分離精製し
389 塩基対の NcoI-HinfI(filled) 断片を得た。
アスパラギン酸がそのＮ末端アミノ酸であり、その上流
の配列はプレ配列であると考えられる（アレルギー（Ja
panese J. Allergology 、39巻、557 頁、1990年))。そ
こで成熟型Der f II蛋白質を産生させるために、プレ配
列領域が欠損した遺伝子を調製した。また、翻訳効率に
影響するとされている３' 末端ポリＡ配列（図３）の除
去も同時に行った。すなわち、Ｎ末端アミノ酸アスパラ
ギン酸に対応するコドンGAT の位置に丁度切断部位が存
在する制限酵素 Sau3AI で、精製した KpnI 断片を完全
切断し、ＤＮＡポリメレースＩクレノウ（Klenow) フラ
グメントを用い、切断部位の突出末端を平滑化した。そ
の後、制限酵素 NcoI で完全切断し、５％のアクリルア
ミドゲル電気泳動に供し、63塩基対の Sau3AI(filled)-
NcoI 断片を分離精製した。同じようにKpnI断片をポリ
Ａ配列の直前に切断部位が存在する制限酵素HinfI で完
全分解した後、末端を平滑化した。その後、やはり Nco
I で切断後、アクリルアミドゲル電気泳動で分離精製し
389 塩基対の NcoI-HinfI(filled) 断片を得た。
【００２５】大腸菌での発現ベクターには pKK233-2(フ
ァルマシア社製) を用いた (アマン(Amann) ら、ジーン
(Gene)、25巻、167 頁、1983年) 。同発現プラスミドは
転写プロモーターに強力なtrp-lac 融合プロモーターを
持ち、その開始コドンの位置に NcoI 切断配列が導入さ
れている。この位置に外来遺伝子を翻訳のフレームを合
わせて挿入すれば、その遺伝子の誘導発現を行うことが
できる。このpKK233-2を、 NcoI で完全切断し、突出末
端を平滑化した後、アルカリフォスファターゼ処理し
た。
ァルマシア社製) を用いた (アマン(Amann) ら、ジーン
(Gene)、25巻、167 頁、1983年) 。同発現プラスミドは
転写プロモーターに強力なtrp-lac 融合プロモーターを
持ち、その開始コドンの位置に NcoI 切断配列が導入さ
れている。この位置に外来遺伝子を翻訳のフレームを合
わせて挿入すれば、その遺伝子の誘導発現を行うことが
できる。このpKK233-2を、 NcoI で完全切断し、突出末
端を平滑化した後、アルカリフォスファターゼ処理し
た。
【００２６】得られたベクターＤＮＡ断片と、先の63塩
基対の Sau3AI(Filled)- NcoI 断片と389 塩基対の Nco
I-HinfI(filled) 断片を混合し、ＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造株式会社製) を用いてライゲーション反
応を行い、大腸菌JM105(遺伝子型 thi, rpsL, endA, s
bcB15, hsdR4, Δ ( lac− pro AB), 〔F', pro AB,la
cI q ΔDM15, tra D36〕) を形質転換した。
基対の Sau3AI(Filled)- NcoI 断片と389 塩基対の Nco
I-HinfI(filled) 断片を混合し、ＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造株式会社製) を用いてライゲーション反
応を行い、大腸菌JM105(遺伝子型 thi, rpsL, endA, s
bcB15, hsdR4, Δ ( lac− pro AB), 〔F', pro AB,la
cI q ΔDM15, tra D36〕) を形質転換した。
【００２７】ここで用いた遺伝子操作の基本実験法 (制
限酵素処理、修飾酵素処理等) はマニアテス (Maniati
s) らの方法 (モレキュラー クローニング(Molecular
Clon-ing)、コールド スプリング ハーバープレス 19
82 年) に準拠した。また大腸菌の形質転換には電気パ
ルス法 (バイオラッド社、ジーンパルサー) を用いた。
得られたアンピシリン耐性株よりコロニーイムノアッセ
イ法 (アグリカルチュアル アンド バイオロジカル
ケミストリー (Agric. Biol. Chem.) 55巻、1233頁、19
91年) により、ウサギ由来抗Der f II抗体と反応する、
すなわち、Der fII蛋白質を産生する株を選択した。陽
性株をＬ液体培地（１％バクトトリプトン（Tryptone,
ディフコ社) 、0.5 ％イースト・イクストラクト（Yeas
t Extract,ディフコ社) 、0.5 ％塩化ナトリウム) に接
種し、培養した後プラスミドを調製し、Der f II断片と
ベクターの連結部付近の塩基配列を決定し、予想される
塩基配列である事を確認した。塩基配列はサンガーのダ
イデオキシ法で決定し (サイエンス(Science) 214 巻、
1205〜1210頁、1981年) 、それに適したベクター(pUC11
8 及びpUC119 (メッシング(Messing) 等、メソッズ イ
ン エンザイモロジー(Methods in Enzymology) 101
巻、20〜78頁、1987年) を使用した。この様にして得ら
れた菌株をpFLK11/JM105と命名した (図１参照）。
限酵素処理、修飾酵素処理等) はマニアテス (Maniati
s) らの方法 (モレキュラー クローニング(Molecular
Clon-ing)、コールド スプリング ハーバープレス 19
82 年) に準拠した。また大腸菌の形質転換には電気パ
ルス法 (バイオラッド社、ジーンパルサー) を用いた。
得られたアンピシリン耐性株よりコロニーイムノアッセ
イ法 (アグリカルチュアル アンド バイオロジカル
ケミストリー (Agric. Biol. Chem.) 55巻、1233頁、19
91年) により、ウサギ由来抗Der f II抗体と反応する、
すなわち、Der fII蛋白質を産生する株を選択した。陽
性株をＬ液体培地（１％バクトトリプトン（Tryptone,
ディフコ社) 、0.5 ％イースト・イクストラクト（Yeas
t Extract,ディフコ社) 、0.5 ％塩化ナトリウム) に接
種し、培養した後プラスミドを調製し、Der f II断片と
ベクターの連結部付近の塩基配列を決定し、予想される
塩基配列である事を確認した。塩基配列はサンガーのダ
イデオキシ法で決定し (サイエンス(Science) 214 巻、
1205〜1210頁、1981年) 、それに適したベクター(pUC11
8 及びpUC119 (メッシング(Messing) 等、メソッズ イ
ン エンザイモロジー(Methods in Enzymology) 101
巻、20〜78頁、1987年) を使用した。この様にして得ら
れた菌株をpFLK11/JM105と命名した (図１参照）。
【００２８】実施例２ Der f IIの発現量の検討 発現量を増加させる事を目的に、実施例１で得られたプ
ラスミドの改良および大腸菌ホストの検討をおこなっ
た。一般的に組換え蛋白質の発現量は、菌体あたりの遺
伝子の数、すなわちプラスミドコピー数に依存すること
が知られている。実施例１で発現ベクターとして用いた
pKK233-2の菌体あたりのコピー数は約50と考えられる。
プラスミドコピー数をより高くすることを目的に、pFLK
11の複製開始点をpUC118 (コピー数：約200)のものと入
れ替えた (図２）。pUC118を、制限酵素 PvuI および P
vuIIで完全切断し、0.7 ％のアガロースゲル電気泳動で
断片を分離後、複製開始点を含む1.4キロ塩基対の断片
のみをゲルから抽出精製した。またpFLK11も PvuI と P
vuIIで完全切断し、1.7 キロ塩基対と3.4 キロ塩基対の
断片から、複製開始点を含まない3.4 キロ塩基対の断片
を精製した。抽出した両断片をライゲーションし、次い
で、大腸菌JM105 を形質転換した。アンピシリン耐性の
コロニーよりプラスミドを単離し、 PvuI および PvuII
にて消化して、断片の大きさを確認した。得られた菌株
をpFLU11/JM105と命名した (図２参照）。
ラスミドの改良および大腸菌ホストの検討をおこなっ
た。一般的に組換え蛋白質の発現量は、菌体あたりの遺
伝子の数、すなわちプラスミドコピー数に依存すること
が知られている。実施例１で発現ベクターとして用いた
pKK233-2の菌体あたりのコピー数は約50と考えられる。
プラスミドコピー数をより高くすることを目的に、pFLK
11の複製開始点をpUC118 (コピー数：約200)のものと入
れ替えた (図２）。pUC118を、制限酵素 PvuI および P
vuIIで完全切断し、0.7 ％のアガロースゲル電気泳動で
断片を分離後、複製開始点を含む1.4キロ塩基対の断片
のみをゲルから抽出精製した。またpFLK11も PvuI と P
vuIIで完全切断し、1.7 キロ塩基対と3.4 キロ塩基対の
断片から、複製開始点を含まない3.4 キロ塩基対の断片
を精製した。抽出した両断片をライゲーションし、次い
で、大腸菌JM105 を形質転換した。アンピシリン耐性の
コロニーよりプラスミドを単離し、 PvuI および PvuII
にて消化して、断片の大きさを確認した。得られた菌株
をpFLU11/JM105と命名した (図２参照）。
【００２９】pFLK11/JM105と、pFLU11/JM105を、それぞ
れ50μg/mlアンピシリンを含むＬ液体培地に接種し37℃
で振盪培養し、OD660nm が0.7 になったところで、イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド (ナカライ
テスク社製) を最終濃度１mMになるように加え、さらに
２時間培養した。培養後の菌体を遠心分離で回収した
後、ＳＤＳサンプルバッファー（10％(V/V) グリセリ
ン、５％（V/V)２−メルカプトエタノール、３％(W/V)
SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 、62mM Tris-HCl pH6.8)
に懸濁し、100 ℃で５分間、加熱処理することで菌体蛋
白質を抽出した。得られた蛋白質サンプルをSDS-ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（第一化学、垂直型カセット
電気泳動システム、ゲル濃度18％) で分離し、クマシー
ブリリアントブルーで染色した。その結果、pFLU11/JM1
05のDer f II産出量は明らかにpFLK11/JM105の産出量に
比べて向上していた。また、コピー数の増加について
は、等菌体量からそれぞれ抽出したpFLK11とpFLU11をア
ガロース電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色
して、そのプラスミドＤＮＡ量を比較した。その結果、
pFLK11に比し 3〜5 倍、pFLU11のコピー数が多いのが確
認された。
れ50μg/mlアンピシリンを含むＬ液体培地に接種し37℃
で振盪培養し、OD660nm が0.7 になったところで、イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド (ナカライ
テスク社製) を最終濃度１mMになるように加え、さらに
２時間培養した。培養後の菌体を遠心分離で回収した
後、ＳＤＳサンプルバッファー（10％(V/V) グリセリ
ン、５％（V/V)２−メルカプトエタノール、３％(W/V)
SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 、62mM Tris-HCl pH6.8)
に懸濁し、100 ℃で５分間、加熱処理することで菌体蛋
白質を抽出した。得られた蛋白質サンプルをSDS-ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（第一化学、垂直型カセット
電気泳動システム、ゲル濃度18％) で分離し、クマシー
ブリリアントブルーで染色した。その結果、pFLU11/JM1
05のDer f II産出量は明らかにpFLK11/JM105の産出量に
比べて向上していた。また、コピー数の増加について
は、等菌体量からそれぞれ抽出したpFLK11とpFLU11をア
ガロース電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色
して、そのプラスミドＤＮＡ量を比較した。その結果、
pFLK11に比し 3〜5 倍、pFLU11のコピー数が多いのが確
認された。
【００３０】さらにDer f II産生に適した大腸菌ホスト
を選択するために、pFLU11で大腸菌JM109(遺伝子型；re
cA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relA1, λ
- ,Δ(lac-proAB),〔F', proAB, lacI q Z ΔM15, traD
36 〕) 、DHI ( 遺伝子型；F - , recA1, endA1, gyrA9
6, thi-1, hsdR17 (rk - ,mk + ), supE44, relA1,
λ- ) 、HB101(遺伝子型 ; F- , hsdS20(rB - ,mB - ),
recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20(Sm'),
xyl-5, mtl-l, supE44,λ- , mcrA+ , mcrB- )およびM
V1184 (遺伝子型；Δ（srl-recA)306::TnΔ(lac-pro),
ara, thi, rpsL,φ80dlacZ ΔM15,〔F', proAB, lacI
q , lacZΔM15, traD36 〕) を各々形質転換した。得ら
れた形質転換株をそれぞれpFLU11/JM109、pFLU11/DH1、
pFLU11/HB101およびpFLU11/MV1184 と命名した。それぞ
れの菌株を前述した方法で培養し、発現産物の解析をお
こなったところ、JM109 およびDH1 を用いた場合、生産
性がより向上する事が明らかとなった。
を選択するために、pFLU11で大腸菌JM109(遺伝子型；re
cA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17, supE44, relA1, λ
- ,Δ(lac-proAB),〔F', proAB, lacI q Z ΔM15, traD
36 〕) 、DHI ( 遺伝子型；F - , recA1, endA1, gyrA9
6, thi-1, hsdR17 (rk - ,mk + ), supE44, relA1,
λ- ) 、HB101(遺伝子型 ; F- , hsdS20(rB - ,mB - ),
recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20(Sm'),
xyl-5, mtl-l, supE44,λ- , mcrA+ , mcrB- )およびM
V1184 (遺伝子型；Δ（srl-recA)306::TnΔ(lac-pro),
ara, thi, rpsL,φ80dlacZ ΔM15,〔F', proAB, lacI
q , lacZΔM15, traD36 〕) を各々形質転換した。得ら
れた形質転換株をそれぞれpFLU11/JM109、pFLU11/DH1、
pFLU11/HB101およびpFLU11/MV1184 と命名した。それぞ
れの菌株を前述した方法で培養し、発現産物の解析をお
こなったところ、JM109 およびDH1 を用いた場合、生産
性がより向上する事が明らかとなった。
【００３１】実施例３ 組換えDer f IIの抽出、精製 実施例２で得られたpFLU11/JM109をアンピシリンを含む
Ｌ培地にて37℃で一晩振盪培養した。この培養液10mlを
50μg/mlアンピシリンを含む1,000ml のＬ液体培地に加
え、37℃で振盪培養し、OD660nm が0.7 になったところ
でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド (ナ
カライテスク社製）を最終濃度１mMになるように加え、
さらに２時間培養した。この培養液を遠心分離（8,000
×ｇ、10分) して菌体を得た。得られた菌体を TEP緩衝
液（100mM Tris-HC1 (pH7.4)、10mM EDTA、１mM PMSF
(phenylmethy-sulfonyl fluoride ；シグマ社製))25ml
に懸濁し、急速凍結、融解をおこなった後に、氷中で超
音波処理し菌体を破砕した。この懸濁液を8,000 ×ｇで
15分、遠心分離した。
Ｌ培地にて37℃で一晩振盪培養した。この培養液10mlを
50μg/mlアンピシリンを含む1,000ml のＬ液体培地に加
え、37℃で振盪培養し、OD660nm が0.7 になったところ
でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド (ナ
カライテスク社製）を最終濃度１mMになるように加え、
さらに２時間培養した。この培養液を遠心分離（8,000
×ｇ、10分) して菌体を得た。得られた菌体を TEP緩衝
液（100mM Tris-HC1 (pH7.4)、10mM EDTA、１mM PMSF
(phenylmethy-sulfonyl fluoride ；シグマ社製))25ml
に懸濁し、急速凍結、融解をおこなった後に、氷中で超
音波処理し菌体を破砕した。この懸濁液を8,000 ×ｇで
15分、遠心分離した。
【００３２】残渣を TEP緩衝液で一回洗浄した後、25ml
の６M 尿素溶液に混合し、攪拌しながら一晩放置して可
溶化した。10,000×ｇで10分間、遠心分離して、不溶画
分を除いた後の上清を TEP緩衝液100ml に対して２回、
つづいて PBS緩衝液（ダルベッコ（Dulbecco) 等、ジャ
ーナル オブ イクスペリメンタル メディシン(J.Ex
p. Med.)、99巻、167 頁、1954年) 500ml に対して３回
透析して尿素を段階的に除いた。透析中に析出した不溶
画分を遠心分離（8,000 ×ｇ、10分) して除いたものを
組換えDer f IIサンプルとした。得られたDer f II蛋白
質の収量は10mgで、その純度は70％以上であった。
の６M 尿素溶液に混合し、攪拌しながら一晩放置して可
溶化した。10,000×ｇで10分間、遠心分離して、不溶画
分を除いた後の上清を TEP緩衝液100ml に対して２回、
つづいて PBS緩衝液（ダルベッコ（Dulbecco) 等、ジャ
ーナル オブ イクスペリメンタル メディシン(J.Ex
p. Med.)、99巻、167 頁、1954年) 500ml に対して３回
透析して尿素を段階的に除いた。透析中に析出した不溶
画分を遠心分離（8,000 ×ｇ、10分) して除いたものを
組換えDer f IIサンプルとした。得られたDer f II蛋白
質の収量は10mgで、その純度は70％以上であった。
【００３３】実施例４ 組換えDer f IIの各種抗体との
反応性 実施例３で得られた組換えDer f IIのウサギ由来抗Der
f II抗体、およびヒトIgE 抗体との反応性をウェスタン
ブロット法 (トウビン(Towbin)等、プロシーディング
イン ナショナル アカデミー オブ サイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、69巻、1409頁、1972
年) を用いて、ダニ虫体由来の精製Der fIIと比較し
た。
反応性 実施例３で得られた組換えDer f IIのウサギ由来抗Der
f II抗体、およびヒトIgE 抗体との反応性をウェスタン
ブロット法 (トウビン(Towbin)等、プロシーディング
イン ナショナル アカデミー オブ サイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 、69巻、1409頁、1972
年) を用いて、ダニ虫体由来の精製Der fIIと比較し
た。
【００３４】組換えDer f IIサンプルと虫体由来精製De
r f IIを、前述した方法を用いてSDS-ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に供し分離した。泳動後のゲルから合成
ポリマーPVDF（Polyvinylidene difluoride)膜、ミリポ
ア社製、商品名、イモビロン) のメンブラン フィルタ
ー上に蛋白質を電気的に転写した。この転写はセミドラ
イ型蛋白質転写装置 (アトー社、ホライズ ブロット)
を用いておこなった。ウサギ由来抗Der f II抗体との反
応は次のようにおこなった。
r f IIを、前述した方法を用いてSDS-ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に供し分離した。泳動後のゲルから合成
ポリマーPVDF（Polyvinylidene difluoride)膜、ミリポ
ア社製、商品名、イモビロン) のメンブラン フィルタ
ー上に蛋白質を電気的に転写した。この転写はセミドラ
イ型蛋白質転写装置 (アトー社、ホライズ ブロット)
を用いておこなった。ウサギ由来抗Der f II抗体との反
応は次のようにおこなった。
【００３５】転写後のメンブランを抗体の非特異的吸着
を防ぐため (ブロッキング操作) 、３％ウシ血清アルブ
ミンを含む PBS緩衝液で１時間振盪した。一次抗体とし
ては精製Der f IIで免疫したウサギの血清を PBS緩衝液
で2,000 倍に希釈して用いた。希釈抗体溶液にメンブラ
ンを浸し１時間振盪した。その後0.05％ツイーン20を含
む PBS緩衝液で３回洗浄して吸着しなかった一次抗体を
洗い流した。二次抗体はパーオキシターゼ標識した抗ウ
サギIgG 抗体 (バイオラッド社製) を用い、一次抗体の
時と同様に PBSで希釈（1,500 倍) し、吸着（１時
間）、洗浄操作をおこなった。発色試薬のクロロナフト
ール（４-chloro-1-naphthol) を、0.5mg/mlの濃度で P
BS緩衝液に溶解し、過酸化水素水を最終濃度0.05％にな
るように添加した後、メンブランを浸し染色をおこなっ
た。
を防ぐため (ブロッキング操作) 、３％ウシ血清アルブ
ミンを含む PBS緩衝液で１時間振盪した。一次抗体とし
ては精製Der f IIで免疫したウサギの血清を PBS緩衝液
で2,000 倍に希釈して用いた。希釈抗体溶液にメンブラ
ンを浸し１時間振盪した。その後0.05％ツイーン20を含
む PBS緩衝液で３回洗浄して吸着しなかった一次抗体を
洗い流した。二次抗体はパーオキシターゼ標識した抗ウ
サギIgG 抗体 (バイオラッド社製) を用い、一次抗体の
時と同様に PBSで希釈（1,500 倍) し、吸着（１時
間）、洗浄操作をおこなった。発色試薬のクロロナフト
ール（４-chloro-1-naphthol) を、0.5mg/mlの濃度で P
BS緩衝液に溶解し、過酸化水素水を最終濃度0.05％にな
るように添加した後、メンブランを浸し染色をおこなっ
た。
【００３６】ヒトIgＥ抗体に関しては、次のように条件
を変更しておこなった。ブロッキング操作は0.1 ％ツイ
ーン20(Tween20) を含む PBS緩衝液で１時間、振盪し
た。一次抗体としては、ダニに対してアレルギーを持つ
患者の血清（RAST試験でIgＥ量の多い一人の患者の血清
もしくは数人のアレルギー患者の血清を混ぜたプール血
清）を用いた。血清を PBS緩衝液で４倍に希釈した溶液
にメンブランを浸し、一晩、振盪した。二次抗体はパー
オキシターゼ標識した抗ヒトIgＥ抗体（ＩＣＮ社製）を
用い、PBS で希釈（500 倍) し、５時間、吸着させた。
を変更しておこなった。ブロッキング操作は0.1 ％ツイ
ーン20(Tween20) を含む PBS緩衝液で１時間、振盪し
た。一次抗体としては、ダニに対してアレルギーを持つ
患者の血清（RAST試験でIgＥ量の多い一人の患者の血清
もしくは数人のアレルギー患者の血清を混ぜたプール血
清）を用いた。血清を PBS緩衝液で４倍に希釈した溶液
にメンブランを浸し、一晩、振盪した。二次抗体はパー
オキシターゼ標識した抗ヒトIgＥ抗体（ＩＣＮ社製）を
用い、PBS で希釈（500 倍) し、５時間、吸着させた。
【００３７】この結果、組換えDer f IIはウサギ由来抗
Der f II抗体とも患者血清中のIgＥ抗体とも、虫体由来
のDer f IIと全く同じ反応性を示す事が確認された。
Der f II抗体とも患者血清中のIgＥ抗体とも、虫体由来
のDer f IIと全く同じ反応性を示す事が確認された。
【００３８】実施例５ 組換えDer f IIのＮ末端からの
アミノ酸配列決定 組換えDer f II蛋白質のＮ末端からのアミノ酸配列を、
エドマン法により決定した。配列決定用サンプルは松平
らの方法（ジャーナル オブ バイオロジカルケミスト
リー（J. Biol. Chem.) 262 巻、10035 頁、1987年) で
調製した。すなわち組換えDer f IIをSDS-ポリアクリル
アミド電気泳動後、PVDF膜（バイオラッド社製）に転写
し、クマシーブリリアントブルーで染色し、Der f II蛋
白質のバンド部分だけを切りとって直接、自動アミノ酸
シークエンサー（アプライド バイオ システム社製
（モデル473A))で分析した。24アミノ酸までを決定した
ところ、Ｎ末端に開始コドン由来のメチオニンが、１残
基余分に付いている以外は、虫体由来のDer f IIと全く
同じであった。
アミノ酸配列決定 組換えDer f II蛋白質のＮ末端からのアミノ酸配列を、
エドマン法により決定した。配列決定用サンプルは松平
らの方法（ジャーナル オブ バイオロジカルケミスト
リー（J. Biol. Chem.) 262 巻、10035 頁、1987年) で
調製した。すなわち組換えDer f IIをSDS-ポリアクリル
アミド電気泳動後、PVDF膜（バイオラッド社製）に転写
し、クマシーブリリアントブルーで染色し、Der f II蛋
白質のバンド部分だけを切りとって直接、自動アミノ酸
シークエンサー（アプライド バイオ システム社製
（モデル473A))で分析した。24アミノ酸までを決定した
ところ、Ｎ末端に開始コドン由来のメチオニンが、１残
基余分に付いている以外は、虫体由来のDer f IIと全く
同じであった。
【００３９】
【００４０】配列番号：１ 配列の長さ：３９３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 配列の特徴 起源：デルマトファゴイデス ファリナエ（Dermatopha
goides farinae) 特徴を決定した方法：Ｅ
goides farinae) 特徴を決定した方法：Ｅ
【図面の簡単な説明】
【図１】ダニ主要アレルゲンDer f IIのｃＤＮＡを保持
しているプラスミドpFL1からDer f II遺伝子のみを調製
して、発現ベクターpKK233-2に挿入する工程を示した図
である。
しているプラスミドpFL1からDer f II遺伝子のみを調製
して、発現ベクターpKK233-2に挿入する工程を示した図
である。
【図２】Der f II発現プラスミドpFLK11のプラスミドコ
ピー数を増大させるために、複製開始点をpUC118のもの
と交換する工程を示した図である。
ピー数を増大させるために、複製開始点をpUC118のもの
と交換する工程を示した図である。
【図３】クローニングしたDer f IIｃＤＮＡと合成ヌク
レオチドアダプターのＤＮＡ塩基配列およびそれより推
定されるアミノ酸配列を示した図である。
レオチドアダプターのＤＮＡ塩基配列およびそれより推
定されるアミノ酸配列を示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 奥村 康 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒビ ール株式会社応用技術研究所内 (72)発明者 山川 洋志 千葉県浦安市入船２丁目16番101号
Claims (6)
- 【請求項１】 ダニ主要アレルゲンDer f IIをコードす
る遺伝子を含む複製ベクターで形質転換した原核生物ま
たは真核生物を培養し、培養物からダニ主要アレルゲン
を採取することを特徴とするダニ主要アレルゲンの製造
方法。 - 【請求項２】 ダニ主要アレルゲンDer f IIをコードす
る遺伝子が次の配列表で示されるDNA 配列を有する請求
項１記載の方法。 【配列表】 - 【請求項３】 使用する複製ベクターがウィルス起源で
ある請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 使用する複製ベクターがプラスミド起源
である請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 原核生物が大腸菌である請求項１記載の
方法。 - 【請求項６】 真核生物が酵母である請求項１記載の方
法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3262538A JP2657861B2 (ja) | 1991-09-17 | 1991-09-17 | ダニ主要アレルゲンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3262538A JP2657861B2 (ja) | 1991-09-17 | 1991-09-17 | ダニ主要アレルゲンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH067186A true JPH067186A (ja) | 1994-01-18 |
| JP2657861B2 JP2657861B2 (ja) | 1997-09-30 |
Family
ID=17377201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3262538A Expired - Fee Related JP2657861B2 (ja) | 1991-09-17 | 1991-09-17 | ダニ主要アレルゲンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2657861B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995020599A1 (fr) * | 1994-01-31 | 1995-08-03 | Torii Pharmaceutical Co., Ltd. | Epitope a lymphocytes b d'allergene d'acariens |
| EP0819763A1 (en) * | 1995-03-28 | 1998-01-21 | Asahi Breweries, Ltd. | Engineered acarid allergen and process for producing the same |
| US6228374B1 (en) | 1994-10-14 | 2001-05-08 | Astra Aktiebolag | Peptides with immunomodulatory effects |
| WO2004078965A1 (ja) * | 2003-03-05 | 2004-09-16 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 大腸菌における異種蛋白質の製造方法 |
-
1991
- 1991-09-17 JP JP3262538A patent/JP2657861B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995020599A1 (fr) * | 1994-01-31 | 1995-08-03 | Torii Pharmaceutical Co., Ltd. | Epitope a lymphocytes b d'allergene d'acariens |
| US6228374B1 (en) | 1994-10-14 | 2001-05-08 | Astra Aktiebolag | Peptides with immunomodulatory effects |
| EP0819763A1 (en) * | 1995-03-28 | 1998-01-21 | Asahi Breweries, Ltd. | Engineered acarid allergen and process for producing the same |
| EP0819763A4 (en) * | 1995-03-28 | 2001-01-31 | Asahi Breweries Ltd | MITE ALLERGEN OBTAINED THROUGH GENETIC ENGINEERING AND METHOD OF MANUFACTURING |
| WO2004078965A1 (ja) * | 2003-03-05 | 2004-09-16 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | 大腸菌における異種蛋白質の製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2657861B2 (ja) | 1997-09-30 |
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