KR100227167B1 - 인체혈청알부민의 n-말단 단편을 함유하는 융합단백질 - Google Patents

인체혈청알부민의 n-말단 단편을 함유하는 융합단백질 Download PDF

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Abstract

N-말단부의 최소한 일부로서, HSA의 N-말단부 또는 그 변이체와, C-말단부의 최소한 일부로서는, 상기 HSA의 N-말단부가 1-n부(여기서 n은 369∼419) 또는 그 변이체일 때 폴리펩티드가 인체 피브로넥틴의 585-1578로 또는 2 변이체를 포함하는 다양한 특정 단위인 것을 제외할 기타의 폴리펩티를 포함하는 융합 폴리펩티드.
HSA-유사부는 분비선도 배열(신호 배열)과 같은 별도의 N-말단 잔기를 가질 수 있다. C-말단부는 바람직하게는 인체 폴리스 미 피브로넥틴의 585-1578부이다. N-말단부및 C-말단부는 분열가능하여 C-말단부를 유리하며, N-말단부는 숙주로 부터의 분비를 용이하게하는 역활을 한다.

Description

인체혈청알부민의 N-말단 단편을 함유하는 융합 단백질
본 발명은, 2개의 각각의 폴리펩티드 또는 그 일부가 융합되어 단일 아미노산 사슬을 형성하는, 융합 폴리펩티드에 관한것이다. 이와 같은 융합은, 재조합 DNA 기술에 의하여 형성된 단일 연속 코드화 배열의 발현으로 부터 일어날 수 있다.
융합 폴리펩티드는, 예를 들면, 처리공정의 궁극적인 목표 생성물인 폴리펩티드가, 세포로 부터 폴리펩티드의 분비를 촉진 또는 허용하는 N-말단 ''선도배열''로 발현되는 것들로 알려져 있다. 하나의 예가 EP-A-116 201(Chiron)에 개시되어 있다.
인체 혈성 알부민(HSA)은 혈액에서 발견되는 공지의 단백질이다. EP-A-147 198(Delta Biotechnology사)은 이 경우 효모인, 형질전환 숙주에서의 발현을 개시하고 있다. 본 발명자들이 앞서 출원한 EP-A-322 094는, 잔기 1-n(n은 369∼419)으로 구성되어 있는, HSA의 N-말단 단편을 개시하고 있는데, 이들은 치료상 용도가 있다. 상기 출원은, 상기와 같은 분자들의 C-말단 잔기를 기타 무명(無名)의 폴리펩티드로 융합시킬 수 있는 가능성도 언급하고 있다.
하나의 관점에시 본 발명은, N-말단부의 최소한 일부로서 HSA의 N-말단부 또는 그 변이체와, C-말단부의 최소한 일부로서는 상기 HSA의 N-말단부가 1-n부(여기서 n은 369~419) 또는 그 변이체일 때 폴리펩티드가, (a) 인체 피브로넥틴(fibronectin)의 585∼1578부 또는 그 변이체, (b) CD4의 1∼368부 또는 그 변이체, (c)혈소판 유래 성장인자 또는 그 변이체, (d) 형질전환 성장인자 β 또는 그 변이체, (e) 성숙 인체 플라스마 피브로넥틴의 1∼261부 또는 그 변이체, (f) 성숙 인체 플라스마 피브로넥틴의 278∼578부 또는 그 변이체, (g) 성숙 인체 본 윌레브란드 인자(Von Willebrand's Factor)의 1-272부 또는 그 변이체 또는 (h) 알파-1-아티트립신 또는 그 변이체인 것을 제외한, 기타의 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.
HSA의 N-말단부는 바람직하게는 상기 1-n부, 1-177부(시스테인까지 포함), 1-200부(시스테인까지 이나, 시스테인을 포함하지는 않음) 또는 1-177 및 1-200부의 중간부이다.
인체 혈청 알부민 (HSA)이라는 용어는 공지의 또는 언젠가는 발견될 다형태(多形態)의 HSA를 포함하는 것을 의미한다 (그러나 반드시 이것만에 제한을 받는 것은 아니다). 예를 들면, 알부민 나스카피(Naskapi)는 Glu-372에 대신에 Lys-372를 가지며 프로-알부민 크리스트처치(Christchurch)는 수식된 프로-시퀀스(altered pro-sequence)를 갖는다. ''변이체''(''variants'')라는 용어는 배열내에 인위적인 작은 변형을 포함(그러나 반드시 이것만에 국한되는 것은 아니다)한다는 의미이다(하나 또는 2,3개의 잔기가 결핍되어 있으며, 잔기의 보전적 치환 또는 부차적 삽입현상을 가지며, 또는 아미노산 구조에 미소한 변형이 있는 분자와 같은). HSA와 80％, 바람직하게는 85％, 90％, 95％ 또는 99％의 상동성을 갖는 펩티드들은 ''변이체''로 간주된다. 이와 같은 변이체들이 HSA와 생리학적으로 동등한 것이 또한 바람직한데, 이것은 말하자면, 변이체는 바람직하게는 최소한 하나의 약리학적 용도를 공유한다는 것이다. 또한, 약리학적으로 사용될 임의의 추정 변이체는 치료 대상 동물(특히 인체)내에서 비면역성이어야한다.
보전적 치환체란, 폴리펩티드 화학분야의 숙련자가, 폴리펩티드의 최소한 2차 구조, 바람직하게는 3차 구조가 실질적으로 불변이라고 기대할 수 있을 정도의 유사성이 있는 것으로, 하나 이상의 아미노산이 치환된 것을 말한다. 예를 들면, 전형적인 이와 같은 치환에는 글루타민을 아스파라긴, 아스파라긴을 세린 및 라이신을 아르기닌으로 치환하는 것이 포함된다. 변이체는 천연 HSA의 대응부에 비하여, 선택적으로 또는 선호적으로 10개까지의(바람직하게는 단지 1 또는 2개의) 중간 아미노산 잔기(즉, 상기 HSA의 N-말단부의 말단에 있지 않는)가 결핍될 수 있는데, 바람직하게는 이와 같은 탈락은 분자의 100∼369부에서 발생한다(성숙 HSA 자체에 대하여). 마찬가지로, 10개 까지의, 바람직하게는 단지 1 또는 2개의 아미노산이 다시 100∼369부에 첨가될 수도 있다. ''생리학적 기능상 동등물이라는 용어는, 상기배열과 N-말단에 있는 다른 배열(예를 들면, 프로-HSA, 프레(pre)-프로(Pro)-HSA 및 met-HSA)을 포함하는 보다 큰 분자들을 또한 내포한다.
분명히, 본 발명의 융합 화합물의 상기 ''기타 폴리펩티드''는 HSA의 나머지 다른 부분일 수 없는데, 그렇지 않으면 전 폴리펩티드가 HSA가 되어, 이것은 ''융합 폴리펩티드가 아니기 때문이다. 비록 HSA-유사부가 상기 HSA의 1-n부가 아니라 하더라도, 비(非)-HSA부가 상기 (a)∼(h) 실체중의 하나가 되는 것이 바람직하다.
CD4의 1-368부는 인체 T 림포사이트 CD4 단백질의 최초 4개의 디술피트-결합 면역 글로부린형 영역 그 유전자 및 아미노산배열을 나타내는데, 이들은 스미스(D.Smith) 등(1987)의 Science 328, 1704-1707페이지에 개시되어 있다. 이것은 HIV 감염증과 싸우는데 이용된다.
인체 혈소판 유래 성장인자(PDGF)의 배열은 콜린스(Collins)등 (1985)의 Nature316, 748-750페지에 기술되어 있다. 마찬가지로, 형질전환 성장인자 β(TGF-β)의 배열은 데린크(Derynck)등 (1985)의 Nature 316, 701-705페이지에 기술되어 있다. 이들 성장인자는 상처의 치료에 유용하다.
Fn의 1-261부에 대한 cDNA 배열이 EP-A-207 751에 개시되어 있다(엔도뉴클리아제 PvuII를 지닌 플라스미드 pFH6으로 부터 얻음). 이 부분은 피브린과 결합하여 융합된 화합물을 혈병(blood clot)으로 되게 하는데 사용될 수 있다.
오웬스(R.J.Owens) 및 바랄레(F.E. Baralle)에 의하여, 콜라겐-결합 도메인을 함유하는, Fn의 278-578부에 대한 cDNA 배열이 1986 E.M.B.O.J. 5, 2825-2830페이지에 개시되어 있다. 이부분은 혈소판에 결합된다.
본 월레브랜드 인자의 1-272부는 인자 VIII와 결합하여 안정시킨다. 이 배열은 본삼(Bontham)등의 Nuc1. Acids Res.14, 7125-7127페이지에 제시되어 있다.
알파-1-안티트립신의 변이체는, 로젠버그(Rosenburg)등 (1984)의 Nature 312, 77-80페이지에 개시된 것들을 포함한다. 특히, 본 발명은 피츠버그 변이체(Met358이 Arg로 돌연변이 된다) 및 pro357및 Met358이 각각 알라닌 및 아르기닌으로 돌연변이된 변이체를 포함한다. 이들 화합물은 패혈증성 쇼크 및 폐질환의 치료에 유용하다.
본 발명의 폴리펩티드의 비 HSA부의 변이체는 보전적 아미노산 치환체를 지닌 것을 포함하여, HSA부와 관련하여 상술한 변이체 및 기타 종류와의 상동체를 포함한다.
본 발명의 융합 폴리펩티드는, HSA의 N-말단부에 대응하는 부분을 지나서 뻗는 N-말단 아미노산을 가질 수도 있다. 예를들면, HSA-유사부가 성숙 HSA의 N-말단부에 대응하면, 효모 알파-인자 선도배열과 같은, 프레-, 프로-, 또는 프레-프로 배열이 첨가될 수 있다. WO 90/01063의 융합된 선도부가 사용될 수 있다. HSA부로 융합된 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드를 포함하여, 천연발생 폴리펩티드, 그 단편 또는 신규의 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예 3에서, 피브로넥틴의 단편이 4 아미노산 링커를 통하여 HSA부로 융합된다.
HSA 분자의 아미노 말단부는, 진핵세포에서 본 발명의 융합화합물의 효율적인 전위 및 방출을 조력하도록 구성되어 있다는 것이 발견되었다.
제2 관점에서 본 발명은, 상술한 바와 같은 융합 폴리펩티드를 발현하도록 배열된 뉴클레오티드 배열을 갖는 형질전환된 숙주를 재공한다. 여기서 ''...하도록 배열된''이라는 것은, 예를 들면, 뉴클레오티드 배열이 적절한 RNA 폴리머라제 결합부위 및 번역개시 배열을 지닌 옳바른 판독 프레임에 존재하며, 적절한 촉진인자의 조절하에 있다는 것을 의미한다. 촉진인자는 숙주와 상동이거나 이종일 수 있다. 공지된 바와 같이, 필요한 경우 하류(3') 조절배열이 포함될 수 있다. 숙주는 바람직하게는 효모(예를 들면 S. cerevisiae와 같은 사카로미세스 종;피치아(Pichia) 종; 또는 S.pombe와 같은 시조사카로미세스(schizosaccharomyces)종)이기는 하나 E. Coli, B. Subtilis, Aspergillus종, 포유동물세포, 식물세포, 또는 곤충세포와 같은 기타 적절한 숙주일 수도 있다.
제3 관점에서 본 발명은, 본 발명의 제2 관점에 의한 형질전환 숙주를 배양한 후 유용한 형태로 융합 폴리펩티드를 분리함으로써, 본 발명의 제1 관점에 의한 융합 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
제4 관점에서 본 발명은, 이와 같은 융합 폴리펩티드의 복용을 포함하는, 인체 또는 기타 동물의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 본 발명자들은 효모로 부터 유용한 치료용 인체 단백질을 분비하는 효율을 개선하는데 특히 관심을 두었으며, 정상적으로는 단지 비효율적으로만 분비되는 이들 단백질인 HSA의 아미노-말단부로 융합시키는 착상을 하게 되었다.
이와 같은 단백질의 하나는 피브로넥틴의 아미노산 585-1578(이하 Fn 585-1578이라 한다)을 나타내는 잠재적으로 유용한 상처 치료용 폴리펩티드이다. 별도의 출원(본 출원과 동시출원)에서 본 발명자들이 기술한 바와 같이, 이 분자는 상처치료에 유용한 세포 전개, 주화(走化)활성 및 케모키네틱 활성(chemokinetic activity)을 함유한다. C-말단부가 Fn 585-1578인 본 발명의 융합 폴리펩티드는, 특히 혼성 인체 단백질이 원칙적으로 적용되는 경우에, 생합성체와 같이 상처치료용으로 사용될 수 있다. 그러나, 인체 피브로넥틴의 아미노산 585-1578을 나타내는 부분은, 필요한 경우, 피브로넥틴부의 제1 아미노산을 인자 X 분활부위를 포함하는 아미노산에 선향시킴으로써, 융합단백질로 부터 회수될 수 있다. 배양 상청액으로 부터 융합 단백질을 분리한 후, 소정의 분자는 인자 X 분활에 의하여 방출되며, 적절한 크로마토그라피(예를 들면, 이온교환 크로마토그라피)에 의하여 정제된다. N-말단부 및 C-말단부를 적절히 병치(倂置)시키거나 또는 그 사이에 적절한 링커를 삽입시킴으로써 효소적 또는 화학적 분활에 대비하는 다른 부위가 제공될 수 있다.
특히 상기 CD4 및 vWF 단면, PDGF 및 α1AT를 포함하는 본발명의 융합 폴리펩티드의 최소한 일부는 또한 혈액중 증가된 반감기를 가짐으로써, 비 HSA부분 분자의 치료적 용도라는 장점 및 치료적 용도가 있다. α1AT 및 기타의 경우, 화합물을 장기간이 아니라 단기간에 걸쳐 단일회 또는 단지 2,3회 투여로서 복용되기 때문에 면역반응을 일으키지 않는다.
요약
별도의 언급이 없는 한 표준 제조합 DNA 방법은 마니아티스(Maniatis)등(1982년 및 최근 제2판)에 의하여 기술된 바와같다. 파지 N13 재조합 클론은 멧싱(Messing)(1983)및 생거(Sanger)등 (1977)이 기술한 바와 같다.
하기 분자의 구성에 사용된 인체혈청 알부민의 부분을 코드화하는 DNA 배열은 플라스미드 mHOB12 및 pDBD2(EP-A-322 094, Delta Biotechnology Ltd, 그 관련부분은 아래에 재생성된다)로부터 유도되거나 또는 이 배열의 부분과 동등한 올리고뉴클레오티드의 합성에 의하여 유도된다. 인체 피브로넥틴의 부분을 코드화하는 DNA 배열은 플라스미드 pFHDEL1로 부터 유도되거나 또는 이 배열의 부분과 동등한 올리고뉴클레오티드의 합성에 의하여 유도된다. 플라스마 피브로넥틴을 코드화하는 완전 인체 cDNA를 함유하는 플라스미드 pFHDEL1은, 플라스미드 pFH6, 16, 154 및 1로 부터 유도된 DNA의 연결 반응에 의하여 얻었다.
(EP-A-207 751 ; Delta Biotechnology Ltd.)
이 DNA는 'ED' 배열을 함유하지 않은 mRNA를 나타내는데, III-CS 영역의 89-아미노산 변이체를 갖고 있다 (오웬스(R.J.Owens), 콘블리트(A.R. Kornblihtt) 및 바랄레(F.E. Baralle)(1986) 진핵 유전자에 대한 옥스포드 조사(Oxford Surveys on Eukaryotic Genes)로 141-160페이지). 이 벡터의 지도는 제11도에 개시되어 있으며 이 cDNA의 발현에 의하여 생성된 성숙 폴리펩티드의 단백질 배열이 제5도에 도시되어 있다.
제조자의 추천에 따라, Applied Biosystems 380B 올리고뉴클레오티드 합성 장치로 올리고뉴클레오티드를 합성하였다(Applied Biosystems사, 영국 체셔 와링톤).
HSA 분비 시그널 및 아미노산 585-1578을 나타내는 인체 피브로넥틴의 세그먼트를 코드화하는 DNA로 프레임으로 융합된 387아미노산 루이신까지를 포함하는 성숙 HSA가 EP-A-258 067(Delta Biotechnology사)이 혼성 촉진인자의 하류에 위치하는 하나의 발현 벡터를 구성하였는데, 상기 혼성 촉진인자는 사카로미세스 세레비지에에서 기능을 갖는 매우 효율적인 가락토스-유도성 촉진인자이다. 인체 피브로넥틴의 1578 아미노산에 대한 코돈 다음에 직접 정지 코돈(TAA)가 뒤따르며 다음에 사카로미세스 세레비지에 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 유전자 전사 종결인자가 이어진다. 다음에 이 벡터는 형질전환에 의하여 사카로미세스 세레비지에로 도입되는데, 여기서 인체 피브로넥틴의 아미노산 585-1578로 C-말단식으로 융합된 HSA의 N-말단 387 아미노산을 나타내는 혼성 분자가 세포로 부터 발현 및 분비된다.
제2 실시예에서, 인체 피브로넥틴의 아미노산 585-1578로 C-말단식으로 융합된 HSA의 N-말단 95 아미노산을 나타내는 혼성분자의 사카로미세스 세레비지에에 의한 분비가 가능하도로고 유사한 벡터가 구성되었다.
본 발명의 관점들을 실시예 및 첨부된 도면을 참고로 하여 설명한다.
제1도(2매)는, 별도의 HSA(1-n)의 c-말단을 가진(네모안에), 천연 HSA의 가장 대표적인 것으로 일반적으로 생각되는 아미노산 배열을 나타낸다.
제2도(2매)는, 성숙 HSA를 코드화하는 DNA 배열을 나타내는데, 링커 3에 내포된 베열에는 밑줄을 쳤다.
제3도는 mHOB16의 구조를 개략적으로 예시한다.
제4도는 pHOB31의 구조를 개략적으로 예시한다.
제5도(6매)는 Fn 플라스미드 pFHDEL1에 의하여 코드화된 성숙 단백질 배열을 나타낸다.
제6도는, 8개 조성의 올리고뉴클레오티드를 나타내는 링커 5를 설명한다.
제7도는 플라스미드 pDBDF2의 구성을 개락적으로 도시한다.
제8도는 플라스미드 pDBDF5의 구성을 걔략적으로 도시한다.
제9도는 플라스미드 pDBDF9의 구성을 개락적으로 도시한다.
제10도는, 플라스미드 pFHDEL1을 이용하여, 플라스미드 pDBDF12의 구성을 개략적으로 도시한다.
제11도는 플라스미드 pFHDEL1의 지도를 나타낸다.
(실시예 1)
Fn 585-1578로 융합된 HSA 1-387)
다음은, EP-A-322 094에 개시된 바와 같은, HSA의 일부를 코드화하는 배열을 포함하는 플라스미드의 제조방법에 관한 설명이다.
하기 분자를 구성하는데 사용된 인체혈청 알부민 코드화 배열은 플라스미드 M13mp19.7(EP-A-201 239, Delta Biotechnology Ltd.)로 부터 유도되거나 이 배열의 부분과 동등한 올리고뉴클레오티드의 합성에 의하여 유도된다. 올리고뉴클레오티드는, 제조업자의 추천에 따라서 포스포르아미다이트 화학(phosphoramidite chemistry)을 이용하여 Applied Biosystems 380B 올리고뉴클레오티드 합성장지로 합성되었다(AB Inc, 영국 체셔르 와링톤).
하나의 올리고뉴클레오티드가 합성되었는데(링커 A) 이것은 PstI 부위(1235-1240, 제2도)로 부터, 코돈이 GTG로 부터 GTC로 변경된 발린 381에 대한 코돈까지의 공지의 HSA 코드화 배열의 일부를 나타낸다.
(링커 1)
링커 1은 PstI HindII로 다이제스트된 벡터 M13mp19(노란더(Norrander)등,1983)속으로 연결되며 연결 혼합물을 E. Coli 균주 XL1-블루(Stratagene Cloning Systems사, 카나다 산디아고)를 형질이입시키는데 사용된다. 재조합 클론은, IPTG(이소프로필티오-β-가락토시드)의 존재하에 발색 지시약 X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-가락토시드)을 함유하는 매체상에 청색을 나타내지 않음으로써 확인된다. 재조합 클론의 박테리오파지 입자로 부터 제조된 주형 DNA의 DNA 배열 분석 결과, mHOB12(제3도)라고 명명된 소정의 DNA 배열을 하나의 분자로 간주하게 되었다.
M13mp19.7은, HSA의 제1 아미노산에 대한 코돈, GAT가 아래와 같이 유일 XhoI 부위를 중복시키도록, M13mp19(Norrander등,1983)의 숙성 HSA의 코드화 영역으로 구성된다.
(EP-A-210 239). M13mp 19.7은 Xho I로 다이제스되어 S1-뉴클리아제 처리에 의하여 평탄 단부로 되고(flush-ended) 다음에 하기 올리고뉴클레오티드(링커 2)와 연결된다.
링커2
다음에 연결 혼합물 E. coli XL1-블루를 형질이입 시키는데 사용되었으며 주형 DNA는 몇개의 플라크(plaque)로 부터 제조된 후 DNA 배열결정에 의하여 분석되어 하나의 클론, pDBD1(제3도)이 옳바른 배열임을 확인하였다.
HSA 코드화 영역의 5' 단부및 삽입된 올리고뉴클레오티드 링커의 1/2을 나타내는 1.1kb Hind III-Pst I 단편이 아가로스 겔 전기영동법에 의하여 pDBD1로 부터 유리되었다. 다음에 이 단편은, 이미 Hind III 및 Pst I로 다이제스트된 그중 사슬 mHO12와 연결된후, 연결 혼합물은 E. coli XL1-블루를 형질이입시키는데 사용된다.단일 사슬 주형 DNA는 몇개의 프라크의 성숙 박테리오파지 입자로부터 제조되었다. DNA는, 디옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에 DNA 폴리머라제 I의 몰제나우(Klenow) 단편으로 아닐링 처리된 배열결정 프라이머로 부터의 연장에 의하여, 실험관내에서 그중 사슬로 만들어 진다. 이 DNA의 제한효소 분석결과, 옳바른 형상의 클론인 mHOB15(제4도)임이 확인 되었다.
하기 올리고뉴클레오티드(링커 3)는, 성숙 HSA 382 아미노산에 대한 코돈(글루타메이트, GAA)으로 부터, 종결 코돈든(TAT) 및Hind III 부위와 다음에 Bam HI 접착말단이 뒤따르는, 라이신389에 대한 코돈까지를 나타낸다.
링커 3
이것은, 이미 Hinc II 및 Bam HI로 다이제스트된, 2중사슬 mHOB15로 연결된다. 연결반응 후, DNA는 Hinc II로 다이제스트 되어 모든 비(非)재조합 분자를 파괴한후, E. coil XL-1블루를 형질이입하는데 사용된다. 단일 사슬 DNA는 수많은 클론의 박테리오파지 입자로 부터 제조되어 DNA배열이 분석되있다. 옳바른 DNA배열을 갖는 클론을 mHOB16(제4도)이라 한다.
성숙 HSA코드화 영역이 HSA분비 시그널로 융합된 분자가, pDBD2(제4도)를 형성하기 위하여 링커 4를 Bam HI 및 Xho I 다이제스트 M13mp 19.7로 삽입함으로써 생성되었다.
링커-4
이 링커에서, HSA 프레-프로 선도배열(로운Lown)등, 1981) 내의 트레오닌에 대한 ACC인, 개시 메티오닌후의 4번째 아미노산에 대한 코돈은 세린에 대한 AGC로 변경되어 Hind III부위를 생성한다.
공지의 피브로넥틴 코드화 배열(콘볼리트등, 1985)의 일부(아미노산 585-640, 제2도)로 융합된 공지의 HSA코드화 배열(로운등, 1981)의 일부(아미노산 382-387, 제2도)를 나타내는 합성 DNA의 배열이 6개의 올리고뉴클레오티드(링커5, 제6도)를 합성함으로써 제조되었다. 올리고뉴클레오티드 2,3,4,6,7, 및 8은 T4 폴리뉴클레오티드는 키나제를 이용하여 인산화한 후 올리고뉴클레오티드는 표준 상태에서의 쌍으로, 즉 1+8, 2+7, 3+6, 4+5로 아닐링 처리되있다. 처리된 올리고뉴클레오티드 다음에, 미리 제한효소 Hinc II및 Eco RI로 다이제스트된 mHOB12와 함께 혼합되어 연결된다. 연결반응 혼합물은 다음에 E. coli XL1-블루(Stratagene Cloning Systems사, 카나다, 산디아고)를 형질이입하는데 사용되었다. 다음에 단일사슬 주형 DNA는 맬게의 독립된 플라크로 부터 유도된 성숙 박테리오파지 입자로 부터 제조된 후, DNA배열결정에 의하여 분석되었다. 예상 배열의 링커가 벡터속으로 옳바르게 삽입된 클론을 pDBDF1(제7도)이라고 명명하였다. 이 플라스미드는 다음에 Pst I 및 Eco RI로 다이제스트되고, 약0.24kb 단편이 정제된 후 pDBD2(제7도)의 1.29kb Hi-Pst I로 단편 및 Bam HI+Eco RI로 다이제스트 pUC19(야니쉬-페론(Yanish-Perron)등, 1985)와 연결반응하여 pDBD2(제7도)를 형성한다.
전장(全長)의 인체 피브로넥틴을 코드화하는 DNA배열을 함유하는 플라스미드, pFHDEL1이 Eco RI 및 Xho I로 다이제스트되고, 0.77kb Eco RI-Xho I 단편(제8도)이 유리된 후, Eco RI 및 Sal I 다이제스트 M13mp18(노랜더등, 1983)과 연결 반응하여 pDBDF3(제8도)를 형성하였다.
EP-A-207 751호의 피브로넥틴 배열의 4784-4791에 있는 Pst I 부위로 부터, 종결 코돈(TAA), Hind III 부위 및 Bam HI접착단부가 뒤따르는, 티로신 1578(제5도)에 대한 코돈까지를 나타내는 하기 올리고뉴클레오티드 링커(링커 6)가 합성되었다.
링커 6
다음에 이 링커는 Pst I 및 Hind III 다이제스트 pDBDF3와 연결반응하여 pDBDF4(제8도)를 형성한다. 하기 DNA단편, 즉 pDBDF4의 0.68kb Eco RI-Bam Hi 단편, pDBDF2의 1.5kb Bam HI-Stu I 단편 및 pFHDEL1의 2.2kb Stu I-Eco RI 단편은 다음에 제8도에 도시한 바와 같이 Bal II 다이제스트 pKV50(EP-A-258 067)과 연결된다. 얻어진 플라스미드 pDBDF5(제8도)는 EP-A-258 067의 촉진인자를 내포하에, 성숙 HSA의 DNA코드화 아미노산 1-387로 융합되고 다음에 인체 피브로넥틴의 DNA코드화 아미노산 585-1578과 융합되고 그후 번역이 종결 코돈 TAA에서 정지되는 HSA분비 신호의 발현을 지시한다. 다음에는 사카로미세스 세레비리에 PGK 유전자 전사 종결인자가 뒤따른다. 플라스미드는 또한 E.coli 및 사카로미세스 세레비리에 에서의 분비및 유리를 허용하는 배열을 함유한다(EP-A-258 067).
이 폴리스미드는 표준 방법(베그스(Beggs), 1978)에 의하여 사카로내세스 세레비리에 S150-2B(leu2-3 leu2-112 ura3-52 trpl1-289 his3-1)속으로 도입되었다. 형질전환체는 다음에 분석되어 HSA-피브로넥틴 융합단백질을 생성하는 것을 발견하였다.
(실시예 2)
Fn 585-1578로 융합된 HSA1-195)
제2 실시예에서, 인제혈청 알부민의 제1영역(아미노산1-195)이 인체 피브로넥틴의 아미노산 585-1578로 융합되었다.
플라스미드 pDBD2는 Bam HI 및 Bgl II로 다이제스트되고 0.79kb 단편은 정제된 후 Bam HI-다이제스트 M13mp19와 연결반응하여 pBDBF6(제9도)를 형성하였다. Amersham International PLC사 제품 키트를 이용하는 시험관내 돌연변이에 의하여 pDBDF6에 Xho I부위를 생성하기 위하여 돌연변이 프라이머로서 하기 올리고뉴클레오티드가 이용되었다:
이 부위는 HSA의 염기번호 696을 T로부터 G로 변경시킴으로써 생성된다(제2도). 이와 같이 형성된 플라스미드는 pDBDF7(제9도)라고 명명된다. 다음에 하기 링커는, 새로히 생성된 Xho I부위로 부터 HSA의 라이신 195에 대한 코돈(AAA)까지및 피브로넥틴의 이소루이신 585에 대한 콘돈으로 부터 제6도에 도시한 올리고뉴클레오티드 1및 8의 단부까지를 나타내도록 합성된다.
링커 7
이 링커는, Xho 및 Eco RI 다이제스트 pDBDF7과 함께 제3도에 도시한 아닐링처리 올리고뉴클레오티드, 즉 2+7, 3+6 및 4+5와 연결반응하여 pDBDF8(제9도)를 형성한다. 원래의 HSA DNA배열, 따라서 아미노산 배열을 재생하기 위하여, 링커 7및 기타 올리고뉴클레오티드의 pDBDF 7으로의 삽입은 Xho I부위를 회복시키지 않음을 유의하여야 한다.
pDBDF 8의 0.83kb Bam HI-Stu I 단편은 정제된 후, pDBDF2의 0.68kb Eco RI-Bam HI 및 pFHDEL 1의 2,22kb Stu I-Eco RI 단편과 함께 Bgl II-다이제스트 pKV50으로 연결되어 pDBDF9(제9도)를 형성한다. 이 플라스미드는, pDBDF5에서와 같은 1-387이 아니라 단지 HSA의 1-195잔기만을 규정한다는 것을 제외하고는, pDBDF5와 유사하다.
상기와 같이 사카로미세스 세레비지에 S150-2B로 도입되면, 플라스미드는 피브로넥틴의 잔기 585-1578로 융합된 HSA의 잔기 1-195를 포함하는 혼성 분자의 발현및 분비를 지시한다.
(실시예 3)
분열가능한 분자로서의, Fn 585-1578로 융합된 HSA 1-387)
피브로넥틴의 잔기 585-1578의 다량 생산을 용이하게 하기위하여, HSA의 DNA코드화 잔기 1-387이 하기 배열에 의하여 피브로넥틴의 DNA코드화 잔기 585-1578로 부터 분리된 구성체를 제조하였다:
상기 배열은 혈액응고인자 X에 대한 분열인식 부위를 규정한다. 따라서 정제된 분비 생성물은 인자 X로 처리될 수 있으며, 다음에 분자의 피브로넥틴 부분은 HSA부분으로 부터 분리될 수 있다.
이를 시행하기 위하여 2개의 올리고뉴클레오티드가 합성된 후 아닐링처리되어 링커 8을 형성한다.
링커 8
이 링커는 다음에 제6도에 도시된 아닐링처리 올리고뉴클레오티드, 즉 2+7, 3+6 및 4+5와 함께 Hin cII 및 Eco RI 다이제스트 mHOB12로 연결되어 pDBDF10(제7도)을 형성한다. 다음에 이 플라스미드는 Pst I 및 Eco RI로 다이제스트 되고 약 0.24kb 단편이 정제된 후, pDBD2의 1,29kb Bam HI-Pst 단편과 Bam HI 및 Eco RI 다이제스트 pUC19와 연결반응하여 pDBDF17(제10도)를 형성한다.
pDBDF11의 1.5kb Bam HI-Stu I 단편은 다음에 pDBDF4의 0.68kb Eco IR-Bam HI 단편및 pFHDEL 1의 2.2kb Stu I-Eco RI 단편과 함께 Bgl II-다이제스트 pKV50으로 연결되어 pDBDF12(제10도)를 형성한다. 이 플라스미드는 다음에 시카로미세스 세레비지에 S150-2B로 도입된다. 정제된 분비융합 단백질은 인자X로 처리되어 천연분자의 잔기 585-1578 잔기를 나타내는 피브로넥틴 단편을 유리시킨다.
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Claims (9)

  1. N-말단부의 최소한의 일부로서, HSA의 N-말단부 또는 그 변이체와, C-말단부의 최소한 일부로서는, 상기 HSA의 N-말단부가 1-n(여기서 n은 369-419)또는 그 변이체일 때 폴리펩티드가, (a) 인체 피브로넥틴(fibronectin)의 585-1578부 또는 그 변이체, (b) CD4의 1-368부 또는 그 변이체, (c) 혈소판 유래 성장인자 또는 그 변이체, (d) 형질전환 성장인자 β 또는 그 변이체, (e) 성숙 인체 플라스마 피브로넥틴의 1-261부 또는 그 변이체, (f) 성숙 인체 플라스마 피브로넥틴의 278-578부 또는 그 변이체, (g) 성숙 인체 본 윌레브란드 인자(Von Willebrand's Factor)의 1-272부 또는 그 변이체 또는 (h) 알파-1-안티트립신을 또는 그 변이체인 것을 제외한, 기타의 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, HSA의 N-말단부에 대응하는 부분을 지나서 뻗는 하나 이상의 N-말단 아미노산을 추가로 포함하는 융합 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기의 N-말단 또는 C-말단부의 연결부위에 절단되는 자리를 갖는 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩티드.
  4. 제3항에 있어서, C-말단 부위가 인체 플라즈마 피브로넥틴의 585-1578부 또는 그 변이체인 것을 특징으로 하는 융합 폴리펩타이드.
  5. 전항 중의 어느 한 항에 따른 융합 폴리펩티드를 발현하도록 배열된, 뉴클레오티드 배열을 갖는 형질전환 또는 형질이입된 숙주.
  6. 제5항에 의한 숙주를 배양한 후 유용한 형태로 융합 폴리펩티드를 분리함으로써 융합 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  7. 치료용 목적의 제1항 또는 제2항에 의한 융합 폴리펩티드.
  8. 치료용 목적의, 제3항에 의한 융합 폴리펩티드.
  9. 치료용 목적의, 제4항에 의한 융합 폴리펩티드.
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