PT607080E - Nova sequencia pro que permite a secrecao de proteinas heterologas a partir de uma celula de levedura - Google Patents

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DESCRIÇÃO

NOVA SEQUÊNCIA PRO QUE PERMITE A SECREÇÃO DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS A PARTIR DE UMA CÉLULA DE LEVEDURA A presente invenção está relacionada com uma nova sequência pro capaz de promover a maturação de precursores de proteínas heterólogas e a secreção das referidas proteínas heterólogas, a partir de uma célula de levedura recombinada. A nova sequência pro é derivada do precursor da defensina A de insecto. A invenção está relacionada, mais particularmente, com uma cassete de expressão, com um vector, com uma célula de levedura contendo um fragmento de ADN que codifica a referida sequência pro, assim como com um processo de preparação de proteínas heterólogas que utiliza uma tal sequência. A presente invenção destina-se particularmente à produção pela levedura, especialmente uma levedura do género Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), de proteínas heterólogas que apresentam um interesse industrial, as quais serão segregadas no meio de cultura das leveduras onde poderão ser recuperadas.

As leveduras são organismos eucariotas unicelulares. Há já vários anos que as leveduras e, mais particularmente, as leveduras do género S. ceravisiae são correntemente utilizadas para a produção de proteínas de interesse industrial. Com efeito, a genética e a bioquímica desta estirpe têm sido intensamente estudadas em laboratório. O seu interesse como células hospedeiras repousa no facto de se tratarem de organismos que se multiplicam rapidamente em meios que não são caros e cuja genética pode ser facilmente manipulada, utilizando as técnicas do ADN recombinado.

Estabeleceu-se que a levedura é capaz de segregar algumas proteínas para o meio externo. De uma maneira geral, o processo de secreção é um processo complexo, o qual necessita da passagem da proteína a segregar do citoplasma no retículo endoplasmático para, no final, ser segregada para o meio externo.

De uma forma geral, as proteínas segregáveis são expressas sob a forma de um precursor que contém uma sequência de sinal amino-terminal. Numerosos precursores de proteínas segregadas e de proteínas membranares têm sido descritos na literatura, tanto nos procariotas como nos eucariotas. 1

De uma maneira geral, uma sequência de sinal contém um grande número de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. A sua função é promover a passagem de um precursor de uma proteína antes de ser segregada, no retículo endoplasmático. No decurso desta etapa da segregação, a sequência de sinal é clivada por uma endopeptidase associada à membrana, também denominada peptidase de sinal, para originar a proteína totalmente desenvolvida.

Assim, para que uma proteína heteróloga seja segregada na levedura, ele deve ser precedida de uma sequência de sinal, também denominada sequência pré, reconhecida pela levedura. Em geral, utiliza-se uma sequência de sinal homóloga, proveniente de uma proteína segregável da levedura, que vai orientar a secreção da proteína de fusão: sequência de sinal homóloga-proteína heteróloga totalmente desenvolvida.

Além disso, a secreção pode necessitar da presença adicional de uma sequência no precursor da proteína destinada a ser segregada, sendo esta sequência suplementar denominada sequência pro. Desta forma, a proteína a segregar é expressa sob a forma de um precursor pré-pro-proteína. Várias proteínas de levedura segregadas naturalmente contêm, além da sequência pré, uma sequência pro.

Assim, o factor <x (MFa), que deriva do gene MFa1, é uma feromona sexual segregada peias células haplóides de S. cerevisiae do tipo ΜΑΤα. O factor MFori é inicialmente sintetizado sob a forma de um precursor pré-pro-factor α. O referido precursor consiste numa sequência de sinal ou sequência pré com 19 aminoácidos, seguida de uma sequência pro com 64 aminoácidos contendo três locais de glicosilação, ela própria seguida de uma sequência Lys-Arg que precede 4 cópias do factor α separadas por péptidos espaçadores contendo, entre outros, o dipéptido Lys-Arg (Kurjan e Herskowitz, Cell, 1982, 30, 933-943).

Sabe-se que o sistema endógeno de secreção da levedura pode ser utilizado para permitir a secreção de proteínas heterólogas totalmente desenvolvidas no meio de cultura. É um sistema particularmente vantajoso de um ponto de vista industrial, uma vez que a proteína heteróloga pode ser recuperada directamente do meio de cultura, evitando assim as etapas de trituração ou rompimento das células difíceis de manusear e eliminando os riscos de degradação intracelular devido às numerosas proteases contidas numa levedura. 2

Desta forma, várias publicações relatam a utilização das sequências pré e pro do factor α codificadas pelo gene MFa1 (pré MFa1, pro MFa1), para produzir um grande número de proteínas estranhas à levedura, por exemplo, a hirudina. A hirudina é um inibidor muito específico e eficaz da trombina. Trata-se portanto de um agente terapêutico muito interessante, que apresenta uma actividade anticoagulante. Um determinado número de variantes da hirudina foram identificadas e produzidas em estirpes de S. cerevisiae, utilizando o processo de secreção que usa as sequências pré e pro MFa1, como está descrito nos pedidos EPA 0252854 e EPA 0273800 em nome da requerente.

Por outro lado, Dimarcq et al. (EMBO J., 1990, 9,2507-2515) colocaram recentemente em evidência que as larvas do insecto Photmia terranovae, nas quais haviam sido injectadas bactérias, produzem e segregam no sangue um produto bactericída anti-gram+, também denominado defensina A. Estes autores publicaram a sequência de um ADN complementar (ADNc) que codifica um precursor da defensina A. O precursor é constituído por 94 aminoácidos, entre os quais os 40 aminoácidos C-terminais correspondem à defensina A totalmente desenvolvida. A sequência pré compreende os 23 ou 28 primeiros aminoácidos N-terminais e apresenta todas as características de uma sequência de sinal (natureza hidrofóbica e presença de um potencial local de clivagem por uma peptidase de sinal, após a alanina na posição 23 ou a alanina na posição 28). A sequência pré é seguida de uma sequência pro com 31 ou 26 aminoácidos, de acordo com o comprimento da sequência pré, que termina com um dípéptido básico Lys-Arg.

Finalmente, Reichhart et al. (invertebrate Reproduction and Development, 1992, 21:1,15-26) mencionam que a levedura é capaz de exprimir e segregar a defensina A de insecto.

Verificou-se agora que a sequência pro do precursor da defensina A pode ser utilizada para segregar eficazmente proteínas heterólogas na levedura, particularmente na levedura do género S. cerevisiae. A utilização da referida sequência pro de defensina A é especialmente útil para produzir, na levedura, proteínas heterólogas que apresentam um interesse industrial, como sejam a hirudina ou a trofoblastina de ovino contendo adicionalmente uma extensão N-terminal constituída pelo dipéptido Ala-Pro, não tendo a referida extensão qualquer efeito sobre a actividade biológica do produto (Degryse et al., Gene, 1992, 118,47-53). 3 A presente invenção tem pois como objecto uma cassete de expressão que permite a síntese de uma proteína heteróloga totalmente desenvolvida, com exclusão da defensina de Phormia terranovae, a qual compreende, pelo menos, um fragmento de ADN que codifica um precursor da referida proteína heteróloga; compreendendo o referido precursor: - uma sequência pré funcional na levedura, - a sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae, uma variante ou um fragmento funcional desta, e - uma sequência que corresponde à da referida proteína heteróloga sob a forma totalmente desenvolvida; estando o referido fragmento de ADN sob o controlo dos elementos necessários à sua expressão.

Por proteína heteróloga, entende-se qualquer proteína que não é produzida naturalmente pela levedura, assim como qualquer proteína que não é produzida naturalmente por Phormia terranovae.

As proteínas heterólogas totalmente desenvolvidas que podem ser sintetizadas num tal sistema podem ser constituídas por qualquer proteína heteróloga totalmente desenvolvida nativa. No entanto, de uma forma alternativa, uma proteína heteróloga totalmente desenvolvida pode ser constituída pela fusão de dois ou mais polipéptidos de interesse, de diferentes origens, ou por uma proteína heteróloga mutada relativamente à proteína heteróloga nativa, de forma a apresentar uma actividade biológica melhorada ou modificada.

Como exemplo, cita-se a hirudina, especialmente a sua variante rHV2-Lys47, a trofoblastina ovina que compreende uma extensão N-terminal constituída pelo dipéptido Ala-Pro, assim como as xenoxinas, família de péptidos isolados de Xenopus laevis (Kolbe et al., J. of Biol. Chem., 1993, 268,16458-16464). 4

Por sequência pré, entende-se uma sequência pré principalmente de natureza hidrofóbica, presente na extremidade N-terminal da forma precursora de uma proteína destinada a ser segregada e cuja função é permitir ao precursor da referida proteína entrar no percurso de secreção, em particular no retículo endoplasmático, de uma célula de levedura. A sequência pré é normalmente clivada, durante o processo de secreção, por uma peptidase de sinal endógena. A sequência pré pode ser natural ou sintética, heteróloga ou homóloga à levedura ou constituída por uma variante de uma sequência pré natural ou por um fragmento funcional desta. Por fragmento funcional, entende-se qualquer fragmento de uma sequência pré natural capaz de assegurar a entrada de um precursor de uma proteína segregável no percurso de secreção de uma célula de levedura. De preferência, utilizar-se-á um fragmento de ADN que codifica um precursor cuja sequência pré é uma sequência pré homóloga à levedura, por exemplo, a sequência pré do precursor do factor α (MFa1), da invertase ou da β-glucanase 2 (BGL2) de S. cerevisiae.

Uma sequência pro do precursor codificado pelo fragmento de ADN utilizado na cassete de expressão de acordo com a invenção pode particularmente ter uma sequência tal como ilustrada no identificador de sequência SEQID NO:1, começando no aminoácido na posição +1 ou +6 e terminando no aminoácido +31, na qual, em conjunto ou separadamente, o resíduo Xaa na posição +2 é um resíduo de prolina ou cisteína, o resíduo Xaa na posição +6 é um resíduo de aianina ou cisteína, o resíduo Xaa na posição +9 ó um resíduo de aianina, cisteína ou treonina, o resíduo Xaa na posição +17 é um resíduo de aianina ou cisteína, o resíduo Xaa na posição +28 é um resíduo de arginina ou prolina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de arginina ou lisina.

Prefere utilizar-se especialmente a sequência pro nativa do precursor da defensina A de Phormia terranovaa, tal como ilustrada no identificador de sequência SEQ ID NO: 2.

Uma variante da sequência pro pode comportar várias mutações relativamente à sequência pro nativa do precursor da defensina A de Phormia terranovaa, particularmente a substituição, a adição ou a eliminação de um ou vários aminoácidos, na condição dessa variante ser capaz de conduzir um precursor de uma proteína heteróloga segregável, do retículo endoplasmático para o aparelho de Golgi, e depois permitir a secreção da referida proteína heteróloga para o meio de cultura de uma célula de levedura. Cita-se, mais 5 particularmente, as variantes que compreendem um resíduo de cisteína nas posições +2, +6, +9 ou +17 e/ou um resíduo de prolina na posição +29.

De forma mais particular, uma sequência pro possui especiaimente uma sequência cujo grau de homologia com a sequência pro nativa do precursor da defensina A de Phormia terranovae é superior a 80%, vantajosamente, superior a 90%, e, de preferência, superior a 95%.

Durante o processo de secreção, a sequência pro é clivada por uma endoprotease, a qual reconhece, na extremidade C-termínal da referida sequência pro, uma sequência alvo constituída por um dipéptido básico do tipo Lys-Arg ou Arg-Arg e cliva após a referida sequência alvo, libertando assim a proteína heteróloga totalmente desenvolvida. A endoprotease pode ser homóloga ou heteróloga à levedura e constituída por uma variante ou por um fragmento funcional desta. Por endoprotease, entende-se qualquer endoprotease capaz de reconhecer e clivar após uma sequência alvo situada na extremidade C-terminal da referida sequência pro, especialmente após um dipéptido básico Lys-Arg ou Arg-Arg. Pode citar-se, por exemplo, o produto de todo ou parte do gene KEX2 de S. cerevisiaa ou uma endoprotease heteróloga expressa na célula de levedura, como seja a furina das células de mamíferos.

Desta forma, a sequência pro comporta, na sua extremidade C-terminal, um dipéptido básico Lys-Arg ou Arg-Arg que permite clivar a sequência pro da proteína a segregar, provavelmente no aparelho de Golgi, libertando assim a forma totalmente desenvolvida da referida proteína.

De acordo com uma forma de realização preferida, a sequência pro possui a sequência de aminoácidos tal como ilustrada no identificador de sequência SEQ ID NO: 1, começando no aminoácido na posição +1 ou + 6 e terminando no aminoácido +31, na qual o resíduo Xaa na posição +2 é um resíduo de prolina, o resíduo Xaa na posição +6 é um resíduo de alanina, o resíduo Xaa na posição +9 é um resíduo de alanina ou treonina, o resíduo Xaa na posição +17 é um resíduo de alanina, o resíduo Xaa na posição +28 é um resíduo de arginina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de arginina ou Usina.

Assim, a sequência pro é seleccionada vantajosamente entre: 6 (1) a sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae, começando no aminoácido na posição +1 e terminando no aminoácido +31, na qual o resíduo Xaa na posição +9 é um resíduo de alanina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de arginina. (2) a sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae, começando no aminoácido na posição +1 e terminando no aminoácido +31, na qual o resíduo Xaa na posição +9 é um resíduo de treonina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de arginina. (3) a sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae, começando no aminoácido na posição +1 e terminando no aminoácido +31, na qual o resíduo Xaa na posição +9 é um resíduo de alanina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de lisina. (4) a sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae, começando no aminoácido na posição +1 e terminando no aminoácido +31, na qual o resíduo Xaa na posição +9 é um resíduo de treonina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de lisina. (5) a sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae, começando no aminoácido na posição +6 e terminando no aminoácido +31, na qual o resíduo Xaa na posição +9 é um resíduo de alanina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de arginina. (6) a sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae, começando no aminoácido na posição +6 e terminando no aminoácido +31, na qual o resíduo Xaa na posição +9 é um resíduo de treonina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de arginina. (7) a sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae, começando no aminoácido na posição +6 e terminando no aminoácido +31, na qual o resíduo Xaa na posição +9 é um resíduo de alanina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de lisina. 7 (8) a sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae, começando no aminoácido na posição +6 e terminando no aminoácido +31, na qual o resíduo Xaa na posição +9 é um resíduo de treonina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de lisina.

Por elementos necessários à expressão do fragmento de ADN que codifica um precursor de uma proteína heteróloga, entende-se o conjunto dos elementos que permitem a transcrição do referido fragmento de ADN em ARN mensageiro (ARNm) e a tradução do ARNm em proteína. A cassete de expressão de acordo com a invenção comporta especialmente um promotor funcional numa célula de levedura. Tais promotores são bem conhecidos do perito e são inseridos na cassete de expressão a montante do fragmento de ADN a transcrever, através das técnicas convencionais de engenharia genética. Citar-se-ão, por exemplo, os promotores do gene PGK (fosfoglicerato cinase), do gene MF£1 e do gene ADH (álcool desidrogenase) de levedura.

Uma cassete de expressão de acordo com a invenção, que apresenta um interesse particular, é aquela que associa um fragmento de ADN codificando um precursor da hirudina, o qual comporta a sequência pré do precursor do factor <x da levedura; a sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae, começando no aminoácido na posição +1 e terminando no aminoácido +31, na qual o resíduo Xaa na posição +9 é um resíduo de alanina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de lisina; e a sequência correspondente à da variante rHV2-Lys47 da hirudina; estando o referido fragmento de ADN sob o controlo do promotor do gene MFa1 da levedura.

Finalmente, a cassete de expressão de acordo com a invenção pode compreender, adicionalmente, uma sequência de terminação da transcrição funcional na levedura; por exemplo, uma sequência de terminação do gene PGK. A cassete de expressão de acordo com a invenção pode ser inserida num vector de expressão, que serve para transformar uma célula de levedura hospedeira. Os vectores de expressão de acordo com a invenção serão, geralmente, plasmídeos de replicação autónoma. Estes plasmídeos podem comportar elementos que asseguram a sua replicação; isto é, uma origem de replicação, tal como aquela do plasmídeo 2μ de 8 levedura, e elementos de selecção, tais como os genes ura3 ou Ieu2 que asseguram a complementação dos mutantes de levedura ura3 ou Ieu2. Em particular, poderá utilizar-se vantajosamente um gene de selecção cujo promotor foi eliminado, de forma a aumentar o número de cópias de plasmídeos numa célula de levedura.

Estes plasmídeos podem igualmente comportar elementos que asseguram a sua replicação em Escherichia coli (E. coli), quando o plasmídeo deve ser um plasmídeo vaivém; por exemplo, uma origem de replicação como aquela do plasmídeo pBR322, uma marca de resistência como o gene da β-lactamase que confere resistência à ampicilina e/ou outros elementos conhecidos pelo perito.

De forma preferida, o vector de expressão de acordo com a invenção compreende, adicionaimente, uma ou várias cópias de todo ou parte do gene KEX2, conduzindo a um aumento da actividade proteoiítica da endoprotease yscF. Pode ser utilizado o gene completo munido do seu próprio promotor, assim como fragmentos deste gene, como está descrito no pedido EPA 39636 em nome da requerente. A invenção estende-se igualmente a uma estirpe de levedura transformada com um vector de expressão, de acordo com a invenção, ou compreendendo uma cassete de expressão, de acordo com a invenção, integrada no seu genoma. Entre todas as estirpes de levedura utilizáveis, podem citar-se as leveduras Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris e Kluyveromyces lactis. Entretanto, utilizar-se-ão, de preferência, as estirpes do género Saccharomyces, especialmente da espécie cerevisiae. Utilizar-se-á, por exemplo, uma estirpe com o genótipo ura3 ou leU2 ou outra que possa ser complementada com o vector de acordo com a invenção, para assegurar a manutenção do vector na levedura através de uma pressão selectiva apropriada. Poderá também utilizar-se uma estirpe superprodutora da endoprotease yscF, compreendendo, no seu genoma, uma ou várias cópias de todo ou parte do gene KEX2. A invenção está igualmente relacionada com um processo de preparação por leveduras de uma proteína heteróloga totalmente desenvolvida, de acordo com o qual se cresce a estirpe de levedura de acordo com a invenção num meio de cultura apropriado e se recupera a proteína heteróloga totalmente desenvolvida segregada no meio de cultura. 9

Finalmente, a invenção tem como objecto uma proteína heteróloga totalmente desenvolvida, obtida através da realização de um processo de acordo com a invenção.

Os exemplos apresentados a seguir permitirão colocar em evidência outras características e vantagens da presente invenção. Estes exemplos serão ilustrados pelas figuras que se seguem. A Figura 1 representa a reconstituição do gene sintético da defensina A de insecto por ligação de 9 oligonucleótidos. A Figura 2 representa o perfil cromatográfico obtido após análise por HPLC analítica em fase reversa dos sobrenadantes de cultura de A: a estirpe de S. cerevisiae TGY47.1 transformada com pTG6823; e B: a estirpe de S. cerevisiae TGY47.1 transformada com PTG6824. A Figura 3 representa o perfil cromatográfico obtido após análise por HPLC analítica em fase reversa dos sobrenadantes de cultura de A: a estirpe de S. cerevisiae TGY47.1 transformada com pTG8835; e B: a estirpe de S. cerevisiae TGY47.1 transformada com pTG8836. A Figura 4 mostra a separação em gel de SDS-PAGE a 12,5% das amostras provenientes das culturas de 2: a estirpe S. cerevisiae TGY47.1 não transformada; 3: a estirpe S. cerevisiae TGY47.1 transformada com o plasmídeo pTG8840; e 4: a estirpe S. cerevisiae TGY47.1 transformada com o plasmídeo pTG8843. A linha 1 corresponde ao padrão de proteínas cujo peso molecular em kDa está indicado no lado esquerdo da Figura. O gel está corado com azul de Coommassie. EXEMPLO 1: construção dos vectores pTG6823 e pTG6824 e produção de rHV2-Lys47 no meio de cultura por uma estirpe de levedura transformada com os referidos vectores. O gene sintético da defensina A de Phormia terranovae é reconstituído por ligação de 9 oligonucleótidos, como indicado na Figura 1. A porção 5’ do gene da defensina A, à qual foram acrescentados 15 nucleótidos que codificam os 5 aminoácidos C-terminais da sequência pro MFccl de levedura (Ser-Leu- 10

Asp-Lys-Arg) e cujo codão que codifica a serina foi modificado para gerar em 5’ um local HincAW, deriva da ligação de três oligonucleótidos descritos nas SEQ ID NO: 3, 4 e 5 (bloco A na Figura 1). A porção 3’ do gene da defensina A de insecto é obtida por ligação de seis oligonucleótidos descritos nas SEQ ID NO: 6 a 11 (bloco B na Figura 1). Os oligonucleótidos ligados são introduzidos entre os locais KprH e EcoRI do fago M13TG131 (Kieny et al., Gene, 1983, 26, 91-99). A porção 5’ é, em seguida, inserida entre os locais HincAW e KprA do vector fágico anterior, gerando desta forma o fago M13TG3849 que contém o gene completo da defensina A de insecto. 0 fragmento HincAW-BamH\ que compreende a sequência que codifica a Ser-Leu-Asp-Lys-Arg-defensina A é isolado de M13TG3849. Paralelamente, purifica-se um fragmento SphI-HincAW de M13TG3868. O fago M13TG3868 contém a sequência que codifica uma proteína de fusão composta pela sequência pré e pela sequência pro MFa1 que termina com o dipéptido Lys-Arg, seguida da sequência que corresponde à da variante rHV2-Lys47 da hirudina, colocadas sob o controlo do promotor do gene de levedura MFa1. Pode assinalar-se que a sequência pro MFa1 contém um local artificial HincAW ao nível do codão que codifica a serina situada 5 aminoácidos antes da extremidade C-terminal da referida sequência pro. Além disso, o promotor incluído em M13TG3868 é uma versão modificada do promotor do gene MFa1 (Inokuchi et al., Mol. Cell. Biol., 1987, 7, 3185-3193). Na verdade, o promotor é modificado pela substituição do local EcoRI 5’ por um local Sph\ e pela destruição do local BglII interno através de um tratamento com o grande fragmento da ADN polimerase I de E. coli. O fragmento Sp/il-H/ndlll de M13TG3868 contém então a sequência correspondente à seguinte proteína de fusão: sequência pré MFctl, sequência pro MFa1 desprovida dos 5 aminoácidos C-terminais Ser-Leu-Asp-Lys-Arg, estando o conjunto global sob o controlo do promotor modificado do gene MF<x1.

Os dois fragmentos são purificados em gel e ligados ao vector M13mp18 (Gibco BRL), no qual o local único HincAW foi destruído através de um tratamento com o grande fragmento da ADN polimerase I de E. coli. A estirpe E. coli NM522 é transformada com a mistura de ligação, e por digestão enzimática identifica-se um clone que compreende o promotor modificado do gene MFa1 a montante da sequência pré MF<x1, da sequência pro MFa1 que termina com o dipéptido Lys-Arg e da sequência sintética que codifica a defensina A de Phormia terranovae. O referido clone é designado M13TG4813. 11 O vector M13TG4813 é submetido a uma mutagénese dirigida utilizando o otigonucleótido descrito na SEQ ID NO: 12, a fim de introduzir um local NheI na porção 3’ da sequência que codifica o péptido pré MFa1.0 fago assim modificado constitui o vector M13TG5879.

Isola-se um fragmento Sph\-BamH\ de M13TG5879, contendo o referido fragmento um bloco de expressão constituído pelo promotor modificado do gene MFa1 e pela sequência que codifica uma proteína de fusão, a qual compreende a sequência pré MFa1, a sequência pro MFa1 e a sequência da defensina A totalmente desenvolvida. Introduz-se o fragmento purificado entre os locais Sph\ e SamHI do plasmídeo pTG3828 (Achstetter et ai., Gene, 1992, 110, 25-31). Transforma-se a estirpe E. coli 1106 com a mistura de ligação. Isola-se um clone que apresenta o mapa de restrição esperado, o qual é denominado pTG5896. Assim, o bloco de expressão acima descrito é introduzido num vector de expressão da levedura. O vector M13JM212 é um vector derivado de M13mp18, que compreende a sequência ADNc natural que codifica a defensina A e uma extensão de 65 pb (Dimarcq et al., EMBO J., 1990, 9,2507-2515). Na sua extremidade 3’, a inserção ADNc contém cerca de 60 pb que correspondem à região não codificante do ARNm da defensina A. Além disso, a inserção ADNc está munida, nas suas duas extremidades, de “linkers” EcoRI. O vector M13JM212 é submetido a uma mutagénese dirigida utilizando o otigonucleótido descrito na SEQ ID NO: 13. A sequência do ADNc é modificada de forma a introduzir um local de restrição HindW, dando lugar ao vector M13TG5824.

Reconstitui-se a sequência de ADN que codifica a "versão curta” da sequência pro da defensina A, começando no aminoácido +6 e teminando no aminoácido +31 da SEQ ID NO: 2, utilizando para tal dois oligonucleótidos sintéticos descritos nas SEQ ID NO: 14 e 15. Uma vez ligados, estes oligonucleótidos formam um fragmento Nhd-AM. O fragmento sintético inclui a junção com a sequência pré MFa1, assim como a junção com a sequência que codifica a defensina A totalmente desenvolvida. O fragmento sintético Nhei-AflII, assim como o fragmento Aflll-Sa/I isolado de M13TG5824 são ligados ao vector pTG5896 digerido com as enzimas NheI e SalI. Transforma-se a estirpe E. coli 1106 com a mistura de ligação. Identifica-se um clone que apresenta uma digestão de restrição correcta, o qual é designado pTG5897. O vector pTG5897 contém então um bloco de expressão que compreende a proteína de fusão composta pela 12 sequência pré MFori, pela sequência pro versão curta do precursor da defensina A (aminoácidos +6 a +31) e pela defensina A totalmente desenvolvida, colocadas sob o controlo do promotor modificado do gene MFa1. O referido bloco de expressão é isolado de pTG5897 sob a forma de um fragmento Sphl-SaA. Introduz-se o referido fragmento no vector M13TG3868 digerido com as enzimas Sph\ e SalI, gerando assim o vector M13TG6801. O vector M13TG6801 é submetido a uma mutagénese dirigida, a fim de gerar a “versão longa” (aminoácidos +1 a +31) da sequência pro do precursor da defensina A, utilizando o oligonucleótido descrito na SEQ ID NO: 16. Paralelamente, no decurso da mesma reacção, modificou-se também a sequência correspondente à junção entre a sequência pro do precursor da defensina A e a sequência totaimente desenvolvida da defensina A. Introduziram-se aí 5 codões, que compreendem um local Acd e codificam os 5 aminoácidos N-terminais de rHV2-Lys47, utilizando para tal o oligonucleótido descrito na SEQ ID NO: 17. O vector M13TG6806 assim gerado codifica a sequência pré MFori, a sequência pro do precursor da defensina A (aminoácidos +1 a +31), o péptido Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp e a defensina A totalmente desenvolvida.

Isola-se do vector M13TG3868 um fragmento Acd-SaA compreendendo a sequência que codifica a rHV2-Lys47, na qual os 5 pares de bases (pb) que codificam, em parte, o péptido Ile-Thr N-terminal foram eliminados. O fragmento é introduzido no vector M13TG6806 digerido com Acd e SaA, dando lugar a M13TG6807, o qual contém o promotor modificado do gene MFori precedendo a seguinte proteína de fusão: sequência pré MFori, sequência pro do precursor da defensina A (aminoácidos +1 a +31) e sequência da variante rHV2-Lys47 da hirudina.

Este bloco de expressão é isolado de M13TG6807 sob a forma de um fragmento Sph\-SaA. O fragmento é inserido no vector de expressão pTG3828 da levedura, digerido com as enzimas Sph\ e SaA, dando lugar ao vector pTG6823.

Paralelamente, o fragmento SphA-SaA isolado de M13TG6807 é introduzido entre os locais Sph\ e SaA do vector pTG4812.0 vector pTG4812 é derivado do vector pTG3828, no qual se introduziu uma cópia do gene KEX2 de levedura ao nível da junção da porção 2μ e da porção pBR322 do vector. Transforma-se a estirpe E. coli NM522 com a mistura de 13 ligação, e identifica-se um clone que apresenta um perfil de digestão correcto. O vector pTG6824 assim gerado compreende a mesma cassete de expressão de rHV2-Lys47 que pTG6823, assim como uma cópia do gene KEX2 inserida exteriormente à referida cassete de expressão.

Transforma-se a estirpe S. cerevisiae TGY47.1 (MATa, pra1, prb1, prc1, cps1, ura3-delta5, leu2-3, Ieu2-112, his) ou a estirpe TGY48.1, que deriva da estirpe TGY47.1, mas apresenta uma prototrofia para a leucina (Leu+) com os vectores de expressão pTG6823 e pTG6824. As células de levedura são transformadas de acordo com a técnica estandardizada do acetato de lítio (Ito et al., J. Bacteriol., 1983, 133). Podem igualmente utilizar-se outros protocolos de transformação da levedura. Os transformantes prototrofos Ura+ são seleccionados em meio mínimo (0,67% de bases azotadas para levedura YNB (“Yeast Nitrogen Base”) sem aminoácidos, 1% de hidrolisados de caseína (“casamino acids”), 2% de glucose e 2% de bacto agar). Verifica-se a estabilidade do fenótipo Ura+ em caixas de agar de meio selectivo contendo o meio descrito acima.

Os transformantes TGY47.1/pTG6823 e TGY47.1/pTG6824 são crescidos em erlenmeyers, a 28SC, num meio selectivo (0,67% de YNB sem aminoácidos, 1% de hidrolisados de caseína (“casamino acids”) e 2% de glucose). Após 48h de crescimento, separam-se as células e os sobrenadantes por filtração de uma alíquota da cultura numa membrana de 0,22μ. Uma fracção do sobrenadante é submetida a uma HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Pressão) analítica em fase reversa, nas condições descritas em Achstetter et al. (Gene, 1992, 110, 25-31). Mede-se a absorvância do efluente a 205 nm. Os perfis de cromatografia obtidos para os efluentes provenientes das culturas TGY47.1/pTG6823 e TGY47.1/pTG6824 estão apresentados nas Figuras 2A e 2B, respectivamente.

Submete-se o material eluído da coluna e que apresenta um tempo de retenção de cerca de 10,25 min a uma sequenciação dos aminoácidos N-terminais. O material derivado da cultura TGY47.1/pTG6823 mostra um perfil de cromatografia heterogéneo, no qual são lidos dois tipos de sequências N-terminais em quantidade quase equivalente: (1) a sequência descrita na SEQ ID NO: 18, na qual Xaa representa os aminoácidos que não puderam ser identificados de forma clara. Esta sequência corresponde à sequência N-terminal esperada para a variante rHV2-Lys47 totalmente desenvolvida e 14 (2) a sequência descrita na SEQ ID NO: 19, na qual Xaa representa os aminoácidos que não puderam ser identificados de forma clara. A referida sequência corresponde à sequência N-terminal da rHV2-Lys47 que compreende, além disso, uma extensão N-terminal com três aminoácidos, proveniente da sequência pro do precursor da defensina A de insecto.

Por outro lado, com o material proveniente da cultura TGY47.1/pTG6824, obtém-se um pico homogéneo e único que dá lugar à sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 20, correspondente à sequência N-terminal da rHV2-Lys47 totalmente desenvolvida (Xaa representa os aminoácidos que não puderam ser identificados de forma clara). Assim, a co-expressão do gene KEX2 produz uma proteína heteróloga totalmente desenvolvida e homogénea.

Além disso, determina-se a actividade inibidora da variante rHV2-Lys47 segregada relativamente à trombina, utilizando um teste colorimétrico (actividade proteolítica sobre um substrato sintético, a cromozima TH, Boehringer Mannheim). A tabela 1 apresenta os resultados dos doseamentos. A actividade da rHV2-Lys47 é expressa em ATU/Aeoo (1-2 x 107 células/ml correspondente a 1 unidade Aeoonm).

Tabela 1 Plasmídeos KEX2 rHV2-Lys4/ (ATU/Aeoonm) PTG6823 • 8,6 PTG6824 + 25,6

Pode ver-se que a presença do gene KEX2 no plasmídeo pTG6824 permite um aumento de um factor de 3 da produção de rHV2-Lys47 sob a forma activa. EXEMPLO 2: construção dos vectores pTG8835 e pTG8836 e produção de rHV2-Lys47 no meio de cultura de uma estirpe de levedura transformada com os referidos vectores. 15 O vector M13TG6807 é submetido a uma mutagénese dirigida, a fim de substituir o resíduo de alanina na posição +9 da sequência pro “versão longa” da defensina A por um resíduo de treonina, utilizando o oligonucleótido descrito na SEQ ID NO: 21. O fago mutado é verificado por sequenciação e dá origem a M13TG8832. A cassete de expressão compreendendo o promotor modificado do gene MFort que dirige a expressão da sequência que codifica a sequência pré MFa1, a sequência pro “versão longa” (Ala9 -> Thr) do precursor da defensina A de Phormia terranovae e a rHV2-Lys47 totaimente desenvolvida é isolada de M13TG8832, sob a forma de um fragmento Sph\-SalI. O fragmento purificado é inserido no vector pTG3828 digerido com as enzimas Sph\ e SalI, dando lugar ao vector pTG8835.

Paralelamente, o fragmento Sph\-SaH de M13TG8832 purificado é igualmente clonado entre os locais Sph\ e Sa/l do vector pTG4812, o qual contém uma cópia do gene KEX2 de levedura.

Transformam-se as células de levedura com os plasmídeos pTG8835 e pTG8836 e analisam-se os transformantes obtidos, de acordo com o protocolo descrito anteriormente.

Os perfis cromatográficos obtidos estão apresentados nas Figuras 3A e 3B, correspondendo, respectivamente, aos efluentes provenientes das culturas TGY47.1/pTG8835 e TGY47.1/pTG8836. Os resultados dos doseamentos da actividade antitrombina estão apresentados na tabela 2.

Tabela 2 Plasmídeos KEX2 rHV2-Lys4/ (ATU/Aeoonm) pTG8835 10,4 pTG8836 + 25,6

Pode constatar-se que a presença do gene KEX2 na construção de acordo com a invenção (pTG8836) reduz o número de picos produzidos aquando da análise dos sobrenadantes da cultura por cromatografia e melhora a produção de rHV2-Lys47 activa de um factor de 2,5 vezes. Por outro lado, a mutação da alanina na posição +9 da 16 sequência pro do precursor da defensina A de insecto em treonina só tem um efeito menor na qualidade e quantidade de rHV2-Lys47 produzida. EXEMPLO 3: construção dos vectores pTG8840 e pTG8843 e produção de Ala-Pro-trofoblastina ovina no meio de cultura de uma estirpe de levedura transformada com os referidos vectores. O vector M13TG7720 (Degryse et al., Gene, 1992, 118,47-53) é digerido com as enzimas H/ndlll e EcoRI e depois tratado com o grande fragmento da ADN polimerase I de E. coli. O fragmento de 0,5 kb resultante deste tratamento é purificado em gel de agarose e inserido no vector M13TG6807, previamente digerido com Acd e tratado com o grande fragmento da ADN polimerase I de E coli. Transforma-se a estirpe E coli NM522 com a mistura de ligação e identifica-se um fago que tenha incorporado o fragmento de 0,5 kb. O clone é designado M13TG8818. 0 vector M13TG8818 é submetido a uma mutagénese dirigida, a fim de introduzir, a montante da sequência que codifica a extremidade N-terminal da trofoblastina ovina, uma sequência que codifica o dipéptido Ala-Pro, utilizando o oligonucleótido descrito na SEQ ID NO: 22. Após a mutagénese, a sequência dos clones produzidos é verificada. Selecciona-se um clone que contém a mutação desejada, designado M13TG8834. O vector M13TG8834 é, pelo seu lado, modificado por mutagénese dirigida, utilizando o oligonucleótido descrito na SEQ ID NO: 23. A mutagénese permite gerar uma junção correcta entre as sequências que codificam a extremidade 3’ da sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae e a proteína heteróloga Ala-Pro-trofoblastina. Identifica-se um clone mutado através de sequenciação, dando lugar ao vector M13TG8838. Este último contém uma cassete de expressão composta pela versão modificada do promotor do gene MFa1, a montante da sequência que codifica uma proteína de fusão composta pela sequência pré MFa1, pela sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae (31 aminoácidos) e pela Ala-Pro-trofoblastina.

Digere-se o vector M13TG8838 com a enzima EcoRI e trata-se com o grande fragmento da ADN polimerase I de E coli. O fragmento assim produzido, contendo a cassete de expressão descrita acima, é purificado e inserido no vector pTG3828 linearizado com Smal. Identifica-se um transformante que tenha integrada a cassete de expressão na 17 orientação correcta relativamente à sequência de terminação de PGK. A construção é designada pTG8840.

Paralelamente, o fragmento EcoRI isolado de M13TG8838 e tratado de forma a ter as extremidades livres é igualmente inserido no vector pTG4812 linearizado com SmaI. Identifica-se por análise de restrição um clone que apresenta a cassete de expressão na orientação correcta reiativamente à sequência de terminação PGK. O clone é denominado pTG8843.

Transforma-se a estirpe de levedura TGY47.1 com os vectores de expressão pTG8840 e pTG8843, de acordo com o método descrito anteriormente.

Crescem-se transformantes de cada tipo em erlenmeyers, a 28QC, num meio selectivo (0,67% de YNB sem aminoácidos, 1% de hidrolisados de caseína (“casamino acids”) e 2% de glucose). Após 48h de crescimento, separam-se as células e os sobrenadantes por filtração de uma fracção da cultura numa membrana de 0,22μ. O sobrenadante obtido é concentrado por ultrafiltração (Centricon YM5, limite de exclusão 5 kDa). Submete-se uma alíquota do filtrado obtido a uma electroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). A amostra é aquecida a 95fiC durante 5 min, antes de ser carregada num gel de poliacrilamida a 12,5%. Após a migração, o gel é corado com azul de Coomassie para se visualizar o conjunto das proteínas (Figura 4). No material proveniente das leveduras transformadas com os vectores pTG8840 e pTG8843, visualiza-se uma dupla de bandas: uma a 15 kDa e a outra apresentando uma mobilidade electroforética ligeiramente superior. Adicionalmente, detectam-se igualmente outras bandas que apresentam uma mobilidade electroforética inferior, que também não estão presentes na amostra correspondente ao controlo negativo. O conjunto das bandas especificamente detectadas nas amostras pTG8840 e pTG8843 é, além disso, revelado em “Western blot” por um antisoro de coelho antitrofoblastina ovina. O material de mobilidade electroforética mais elevada pode ser devido a produtos de degradação da trofoblastina ou a um artefacto da electroforese. Por outro lado, o material de mobilidade electroforética inferior, reconhecido pelos anticorpos de coelho antitrofoblastina ovina, pode ser devido a agregados proteicos que se podem formar, apesar do tratamento das amostras a 95SC.

As bandas que formam uma dupla a cerca de 15 a 18 kDa são transferidas para uma membrana de PVDF (difluoreto de polivinilideno). Submete-se o material transferido a 18 uma análise da sequência de aminoácidos N-terminais. Obtém-se uma única sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 24, que corresponde à sequência esperada para uma proteína heteróloga Ala-Pro-trofobastina e na qual Xaa representa os aminoácidos que não puderam ser identificados de forma clara. EXEMPLO 4: vectores de expressão de rHV2-Lys47, nos quais a sequência pro da defensina A compreende um resíduo de cisteína na posição 2,6,9 ou 17. O vector M13TG6807 é submetido a uma mutagénese dirigida, a fim de substituir o resíduo de prolina na posição +2 ou um dos resíduos de aianina na posição +6, +9 ou +17 por um resíduo de cisteína. Utilizam-se os oligonucleótidos mutagénicos descritos, respectivamente, nas SEQ ID NO: 25 a 28. Obtêm-se os vectores M13TG9836, M13TG9838, M13TG9839 e M13TG9840.

Isola-se um fragmento Sph\-Sall de 1,4 kb de cada um dos vectores anteriores, antes de ser inserido seja no vector pTG3828 ou no vector pTG4812, igualmente digeridos com Sph\ e SalI. Transformam-se as células de levedura com os vectores obtidos e avalia-se a actividade antitrombina nos sobrenadantes da cultura, como indicado anteriormente. A actividade antitrombina da rHV2-Lys47 segregada com as construções que utilizam as variantes Cys+2, Cys*6, Cys+9 e Cys+17 da sequência pro da defensina A é comparável à obtida com a sequência pro do tipo selvagem.

Como anteriormente, observa-se uma produção de rHV2-Lys47 activa melhorada de um factor de 2,5 a 3 vezes nas construções derivadas de pTG4812, que incluem o gene KEX2. EXEMPLO 5: construção de vectores que compreendem a sequência pré BGL2, a sequência pro da defensina A, na qual o resíduo de arginina na posição 28 é substituído por um resíduo de prolina (Arg28 -> Pro), e a sequência que codifica a rHV2-Lys47, sob o controlo do promotor modificado do gene MFa1.

Isola-se um fragmento Pstt de M13TG4815. Este compreende o promotor MFoc1 modificado, mas inclui, além disso, um local Xh(A na posição -12 relativamente ao ATG iniciador (Xhol-12), seguido da sequência pré BGL2, da sequência pro MFa1 e da 19 sequência sintética que codifica a defensina A de Phormia terranovae. A sequência pré BGL2 está descrita em Klebl e Tanner (J. Bacteriol., 1989, 171, 6259-6264). Este fragmento PstI de 768 pb que compreende o promotor MFa1, tal como descrito acima, assim como os 8 primeiros aminoácidos da sequência pré BGL2 é subclonado no vector M13TG4813 digerido com Ps/I. Resulta deste processo M13TG5871.

Isola-se o fragmento Spbl-BamHI de M13TG5871 que compreende o promotor MFa1 (X/joI-12), uma sequência pré de fusão composta pelos resíduos 1 a 8 da sequência pré BGL2 e pelos resíduos 8 a 18 da sequência MFa1, a sequência pro MFa1 e o gene sintético defensina A. Este fragmento é introduzido em pTG3828, igualmente tratado com as enzimas Sph\ e BamH\, para originar pTG5885.

Por outro lado, o vector M13TG6801 já mencionado é submetido a uma mutagénese dirigida, a fim de gerar a versão longa (aminoácidos +1 a +31) da sequência pro da defensina A, com a ajuda do oligonucleótido OTG3051 (SEQ ID NO: 29). Na mesma ocasião, introduz-se um local Nhd em 3’ da sequência pré MFa1. Obtém-se pTG6820. Introduz-se o fragmento Sph\-BamH\ de pTG6820 purificado entre os mesmos locais de pTG3828, para produzir pTG6821. O vector pTG5885 é digerido com as enzimas Xhd e Sall e depois ligado na presença de dois fragmentos: um Xhd-Nhd proveniente da rehibridação dos oligonucleótidos sintéticos OTG3070 e OTG3071 (SEQ ID NO: 30 e 31) e o outro Nhd-SaU isolado de pTG6821 e correspondendo à extremidade 3’ da sequência pré da defensina A, a sequência pro (versão longa) e a sequência da defensina A totalmente desenvolvida. Obtém-se o vector pTG6880.

Por outro lado, o vector pTG3828 é parcialmente digerido com Xba\ e tratado com o grande fragmento Klenow da ADN polimerase I de E. coli, antes de ser religado; esta ligação dá lugar a pTG6888, no qual o local Xba\ situado no 2μ é destruído. Este vector é digerido com Sph\ e BamHI, locais entre os quais se introduz o fragmento Sph\-BamH\ isolado de M13TG8883. Este último compreende uma cassete de expressão composta pelo promotor modificado do gene MFa1, que dirige a expressão de um precursor “sequência pré BGL2, sequência pro MFa1, sequência que codifica a proteína OspA totalmente desenvolvida” (Bergstrom et ai., Mol. Microbiol., 1989, 3, 479-486). Obtém-se pTG8890. 20

Amplifica-se por PCR, a partir da matriz pTG8890 e dos iniciadores OTG4442 e OTG4443 (SEQ ID NO: 32 e 33), um fragmento que transporta o promotor modificado do gene MFori, seguido da sequência pré BGL2.

Paralelamente, amplifica-se igualmente por PCR um fragmento que transporta a sequência pro da defensina A, a partir de pTG6880 e dos iniciadores OTG4444 (SEQ ID NO: 34) e OTG4445 (SEQ ID NO: 35). Os iniciadores permitem introduzir também mutações silenciosas para gerar um local Eagl junto da extremidade 3’ da sequência pro e um local KprA mais longe desta extremidade. Depois reúnem-se os dois fragmentos PCR para formar um fragmento linear Sph\-Kpn\ através de um duplo PCR, com a ajuda dos oligonucleótidos OTG4442 (SEQ ID NO: 32) e OTG4445 (SEQ ID NO: 35). Ele é inserido no vector M13TG131, igualmente tratado com Sph\ e Kpn\, para originar M13TG8898.

Submete-se este vector a uma mutagénese dirigida para corrigir uma mutação A -> G na posição -5 relativamente ao ATG iniciador. Utiliza-se o oligonucleótido OTG4637 (SEQ ID NO: 36) para gerar M13TG9800.

Isola-se por PCR a sequência que codifica a rHV2-Lys47 munida de uma extensão N-terminal correspondente aos últimos aminoácidos da sequência pro da defensina A, cujos codões que codificam os resíduos nas posições 27 e 28 foram modificados silenciosamente de forma a introduzir um local de restrição Eagl. Por outro lado, introduz-se em 3’ do codão stop de rHV2-Lys47 um local Sa/I. Utiliza-se como matriz o vector M13TG6807 e os dois iniciadores OTG5074 e OTG5075 ilustrados nas SEQ ID NO: 37 e 38.

Introduz-se o fragmento Eagi-Sali gerado por PCR entre os mesmos locais de M13TG9800. Obtém-se M13TG9853, o qual é digerido com Sa/I e depois tratado com o grande fragmento da ADN polimerase I de E. coli, antes de ser religado sobre si mesmo (destruição do local SalI). Produz-se M13TG9854.

Este último é clivado com Eagl e Acd e depois ligado a um adaptador constituído pelos 2 oligonucleótidos OTG5136 e OTG5137 rehibridados (SEQ ID NO: 39 e 40). Após transformação da mistura de ligação em E. coli, isolam-se alguns clones nos quais se verifica a sequência através das técnicas estandardizadas. Selecciona-se um clone cuja sequência está correcta, designado a seguir por M13TG9856. 21

Isola-se o fragmento Sph\-Bgli\ de 1,4 kb de M13TG9856, o qual é inserido entre os locais Sph\ e Bgh\ de pTG3828 ou Sph\ e BamHI de pTG4812, para originar, respectivamente, pTG9860 e pTG9863.

Como anteriormente, após transformação da estirpe de levedura TGY47.1 com estes 2 vectores de expressão, determina-se a actividade antitrombina da hirudina rHV2-Lys47 segregada no sobrenadante das culturas correspondentes. A actividade medida a partir das construções que compreendem a sequência pro (Arg28 -> Pro) da defensina A é comparável à obtida com os vectores que incluem uma sequência pro do tipo selvagem. Observa-se igualmente uma melhoria de um factor de 3 quando o vector inclui o gene KEX2 (pTG9863 versus pTG9860). EXEMPLO 6: construção do vector pTG8709 e produção da xenoxina-1 no meio de cultura de uma estirpe de levedura transformada com o referido vector.

Amplifica-se por PCR a sequência que codifica a xenoxina-1 totalmente desenvolvida, munida de um local EagI em 5’ e de um local SalI em 3’. Utiliza-se como matriz M13TG4414 ou pTG4414 (Kolbe et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 16458-16464) e os iniciadores OTG5770 e OTG5771 (SEQ ID NO: 41 e 42). O fragmento assim gerado é integrado em M13TG9800, previamente digerido com EagI e Sail, para originar M13TG8703. Este compreende uma cassete de expressão composta pelo promotor MFa1 modificado, que dirige a expressão de um precursor “sequência pré BGL2, sequência pro MFort, sequência que codifica a xenoxina-1 totalmente desenvolvida”. A sequência em aminoácidos desta última está indicada na SEQ ID NO: 43.

Introduz-se o fragmento Sp/tl-Sa/l, isolado de M13TG8703 e que transporta a cassete de expressão, entre os mesmos locais de pTG4812. Obtém-se pTG8709, com o qual se transforma a estirpe S. ceravisiae TGY73.4, que deriva de TGY47.1, mas apresenta uma prototrofia para a leucina (Leu+). Selecciona-se um transformante Ura+ que se faz crescer em meio selectivo (descrito no exemplo 1) durante 60 horas. O sobrenadante da cultura é concentrado por ultrafiltração numa membrana YM2 e por centrifugação, de acordo com as técnicas convencionais. O concentrado é submetido a uma electroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (15,3% em poliacrilamida). 22

As proteínas são transferidas para uma membrana de PVDF, e o material correspondente ao peso molecular esperado (cerca de 7 kDa) é submetido a uma sequenciação dos aminoácidos N-terminais. Lê-se uma sequência, presente em quantidade maioritária, que corresponde à sequência N-terminal esperada para a xenoxina-1 totalmente desenvolvida (SEQ ID NO: 44; Xaa representa os aminoácidos que não puderam ser identificados de forma clara). 23

LISTA DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) DEPOSITANTE: (A) NOME: Transgene S.A. (B) RUA: 11 rue de Molsheim (C) CIDADE: Estrasburgo (E) PAÍS: França (F) CÓDIGO POSTAL: 67000 (G) TELEFONE: (33) 88 27 91 00 (H) FAX: (33) 88 22 58 07 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Nova sequência pro que permite a secreção de proteínas heterólogas a partir de uma célula de levedura. (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 44 (iv) FORMA LIDA POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: disco flexível (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (OEB) (vi) ELEMENTOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE DEPÓSITO: FR 90 00171 (B) DATA DO DEPÓSITO: 11 de Janeiro de 1993 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURAÇÃO: linear 24 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (v) TIPO DO FRAGMENTO: interno (vi) ORIGEM:

(A) ORGANISMO: sequência pro da defensina A (B) ESTIRPE: Phormia terranovae (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: lie Xaa Ala Asp Ala Xaa Asn Asp Xaa His Phe Vai Asp Gly Vai Gin 15 10 15

Xaa Leu Lys Glu lie Glu Pro Glu Leu His Gly Xaa Tyr Xaa Arg 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 31 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (v) TIPO DO FRAGMENTO: interno 25 (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: sequência pro da defensina A de Phormia terranovae (B) ESTIRPE: Phormia terranovae (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 2: lle Pro Ala Asp Ala Ala Asn Asp Ala His Phe Vai Asp Gly Vai Gin 15 10 15

Ala Leu Lys Glu lle Glu Pro Glu Leu His Gly Arg Tyr Lys Arg 20 25 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Phormia terranovae

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de reconstituição do gene defensina A (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: AGCTTGGACA AGAGAGCTAC CTGTGACTTG TTGTCCGGTA C 41 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ΑΝΤΙ SENSO: SIM (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Phormia terranovae

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de reconstituição do gene defensina A (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: ACAGGTAGCT CTCTTGTCCA 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 13 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 27 (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Phormia terranovae

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de reconstituição do gene defensina A (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 5: CGGACAACAA GTC 13 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 40 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (II) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Phormia terranovae

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de reconstituição do gene defensina A (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: CGGTATTAAC CACTCCGCTT GTGCTGCTCA CTGTTTGTTG 40 28 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Phormia terranovae

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de reconstituição do gene defensina A (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: AGCACAAGCG GAGTGGTTAA TACCGGTAC 29 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 29 (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Phormia terranovae

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de reconstituição do gene defensina A (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 8: AGAGGTAACA GAGGTGGCTA CTGTAACGGT AAGGGTGT 38 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9:

(í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Phormia terranovae

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de reconstituição do gene defensina A (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: AGTAGCCACC TCTGTTACCT CTCAACAAAC AGTGAGC 37 30 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Phormia terranovae

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de reconstituição do gene defensina A (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: TTGTCTTTCT ACAAACTAAC CATCCC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 46 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 31 (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Phormia terranovae

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de reconstituição do gene defensina A (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 11: AATTCGGATC CTTAGTTTCT ACAAACACAA ACACCCTTAC CGTTAC 46 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 37 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (li) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (Iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: TCGCAGCATC CTCCGCGCTA GCTGCTCCAG TCAACAC 37 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 13: 32

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 13: ATGTTGCTCT CTTGTCAAAG CTTTGTAATC CTTGGC 36 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 88 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: 33 (B) ESTIRPE: Phormia terranovae (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de reconstituição da sequência pro curta (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: 40 80 8

CTAGCTGCCA ACGATGCACA TTTTGTTGAT GGCGTTCAGG CTTTAAAAGA AATTGAACCC GAATTACATG GCCGTTACAA GAGAGCAA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 15:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 88 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (B) ESTIRPE: Phormia terranovae (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de reconstituição da sequência pro curta (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: CATGTTGCTC TCTTGTAACG GCCATGTAAT TCGGGTTCAA 40 TTTCTTTTAA AGCCTGAACG CCATCAACAA AATGTGCATC 80 GTTGGCAG 8 34 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 16:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: TCCTCCGCGC TAGCTATTCC TGCTGATGCT GCCAACGATG CACAT 45 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 17:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO 35 (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17: GGCCGTTACA AGAGAATTAC TATACAGAC GCAACATGTG ATTTA 45 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 18:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DO FRAGMENTO: N-terminal (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: sequenciação N-terminal do material TGY47.1/pTG6823 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: lie Thr Tyr Thr Xaa Xaa Thr Glu Ser Gly Gin 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 19:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CONFIGURAÇÃO: linear 36 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DO FRAGMENTO: N-terminal (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: sequenciação do material da cultura TGY47.1/pTG6823 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 19:

Tyr Xaa Xaa lie Thr Tyr Thr Asp Xaa Thr Glu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 20:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 15aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DO FRAGMENTO: N-terminal (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: sequenciação do material da cultura TGY47.1/pTG6824 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20: lie Thr Tyr Thr Asp Xaa Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Xaa Leu 15 10 15 37 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 21:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21: GATGCTGCCA ACGATACACA TTTTGTTGAT GGC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 22:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO 38 (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 22: GTTACAAGAG AATTACGTGC TCCATGTTAC CTATCTCAG 39 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 23:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23: CATGGCCGTT ACAAGAGAGC TCCATGTTAC CTATCT 36 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 24:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURAÇÃO: linear 39

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DO FRAGMENTO: N-terminal (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: sequenciação do material da cultura TGY47.1/pTG8840 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24:

Ala Pro Xaa Tyr Leu Ser Gin Arg Leu Met Leu Asp Ala 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 25:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG4864 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (pro def A Pro2 -> Cys) (vii) FONTE IMEDIATA: 40 (B) CLONE: M13TG9836 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 25: TCCGCGCTAG CTATTTGTGC TGATGCTGCC AA 32 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 26:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG4865 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (sequ pro def A Ala6 -> Cys) (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: M13TG9838 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 26: ATTCCTGCTG ATGCTCTTAA CGATGCACAT TT 32 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 27:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA 41 (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG4866 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (sequência pro def A Ala9 -> Cys) (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: M13TG9839 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 27: GATGCTGCCA ACGATTGTCA TTTTGTTGAT GGC 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 28:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 42 (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG4867 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (sequ pro def A Ala17 -> Cys) (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: M13TG9840 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 28: GTTGATGGCG TTCAGTGTTT AAAAGAAATT GAA 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 29:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG3051 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 29: TCCTCCGCGC TAGCTATTCC TGCTGATGCT GCCAACGATG CACAT 45 43 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 30:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 75 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG3070 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 30: TCGAGTAAAA GAATGAAATT CTTCATGGTA TTCGTTGTTA 40 CTTTCTGCTT AGCAGTTTGT TTTGTCTCCC AATCG 75 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 31:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 75 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 44 (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG3071 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 31: CTAGCGATTG GGAGACAAAA CAAACTGCTA AGCAGAAAGT 40 AACAACGAAT ACCATGAAGA ATTTCATTCT TTTAC 75 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 32:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG4442 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: iniciador PCR para um fragmento “prom Mfa1pha1-sequ pré BGL2” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 32: CTCGATATCG CATGCTATTG ATAAGATTTA AAGGTA 36 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 33: 45

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG4443 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: iniciador PCR para um fragmento “prom Mfa1pha1-sequ pré BGL2” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 33: TGTGCATCGT TGGCAGCATC AGCAGGAATA GCTGAAAC 38 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 34:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 59 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO 46 (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG4444 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: iniciador PCR para isolar a sequência pro def A (local Eagl) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 34: CTATTTTTCA CAGCCTCCCA AGTTTCAGCT ATTCCTGCTG ATGCTGCCAA CGATGCACA 59 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 35:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG4445 (B) ESTIRPE: iniciador PCR para isolar a sequência pro def A (local Eagl) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 35: AAGCTAAGTG GTACCTCTCT TGTAACGGCC GTGTAATTCG GGTTC 45 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 36:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA 47 (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG4637 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: oligonucleótido de mutagénese (correcção mutação prom MF1) (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: M13TG9800 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 36: TAAACGATTA AAAGAATGCG T 21 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 37:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO 48 (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG5074

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: iniciador PCR (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 37: GCATGATCCT CGGCCGTTAC AAGAGAATTA CGTATACAGA CT 42 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 38:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 43 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG5075

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: iniciador PCR (vii) FONTE IMEDIATA: (B) CLONE: M13TG9800 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 38: GATGCTGTGA GTCGACCATT TTTCATTGTA AATATTCTTC TGG 43 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 39:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA 49 (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG5136 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: adaptador (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 39: GGCCCATACA AGAGAATTAC GT 22 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 40:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG5137 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: adaptador 50 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 40: ATACGTAATT CTCTTGTATG 20 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 41:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómíco)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iii) ANTISENSO: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG5770 (C) INDIVIDUAL ISOLADO: iniciador de PCR (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 41: TACGTCGGCC GTTACAAGAG ACTGAAATGT GTGAATTTAC AAGCG 45 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 42:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) NÚMERO DE CADEIAS: simples (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 51 (iii) ANTISENSO: SIM (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: OTG5771

(C) INDIVIDUAL ISOLADO: iniciador de PCR (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 42: AGTTTGTCGA CTCAAGCATT GCACATGTTT CCT 33 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 43:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 66 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NÃO (vi) ORIGEM: (A) ORGANISMO: Xenoxina (B) ESTIRPE: Xenopus laevis (ix) CARACTERÍSTICA ADICIONAL: (A) NOME/CHAVE: Proteína (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 61 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 43:

Leu Lys Cys Val Asn Leu Gin Ala Asn Gly lle Lys Met Thr Gin 52 15 1 5 Cys Ala Lys Glu Asp Thr 10

Lys Cys Leu Thr Leu Arg Ser Leu Lys Lys 20 25 30

Thr Leu Lys Phe Cys Ala Ser Gly Arg Thr Cys Thr Thr Met Lys lie 35 40 45

Met Ser Leu Pro Gly Glu Gin lie Thr Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys 50 55 60

Asn Ala 65 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQID NO: 44:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) CONFIGURAÇÃO: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (v) TIPO DO FRAGMENTO: N-terminal (vi) ORIGEM: (C) INDIVIDUAL ISOLADO: sequenciação do material da cultura TGY73.4/pTG8709 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 44:

Leu Lys Xaa Vai Asn Leu Gin Ala Asn Gly lie Lys Met Xaa Gin 15 10 15 53

Lisboa, 3 1 JUL 2801 Por TRANSGENE S.A.

Agente Oficia! da Propriedade Industriai Arco da Conceição, 3,1S -1100 LISBOA

Claims (14)

1. t REIVINDICAÇÕES 1. Cassete de expressão que permite a síntese de uma proteína heteróloga totalmente desenvolvida, com exclusão da defensina A de Phormia terranovae, e compreende, pelo menos, um fragmento de ADN que codifica um precursor da referida proteína heteróloga; compreendendo o referido precursor: - uma sequência pré funcional na levedura, - a sequência pro do precursor da defensina A de Phormia terranovae, uma variante ou um fragmento funcional desta, e - uma sequência correspondente à da referida proteína heteróloga sob a forma totalmente desenvolvida; estando o referido fragmento de ADN sob o controlo dos elementos necessários à sua expressão.
2. 2. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fragmento de ADN codificar um precursor que compreende uma sequência pré que é aquela do precursor do factor α da levedura Saccharomyces cerevisiae.
3. 3. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pela sequência pro ter uma sequência de aminoácidos tal como ilustrado na SEQ ID NO: 1, começando no aminoácido na posição +1 ou +6 e terminando no aminoácido +31, na qual, em conjunto ou separadamente, o resíduo Xaa na posição +2 é um resíduo de prolina ou cisteína, o resíduo Xaa na posição +6 é um resíduo de alanina ou cisteína, o resíduo Xaa na posição +9 é um resíduo de alanina, cisteína ou treonina, o resíduo Xaa na posição +17 é um resíduo de alanina ou cisteína, o resíduo Xaa na posição +28 é um resíduo de arginina ou prolina e o resíduo Xaa na posição +30 é um resíduo de arginina ou lisina.
4. 4. Cassete de expressão de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela sequência pro ter uma sequência de aminoácidos tal como ilustrada na SEQ ID NO: 2. 1
5. 5. Cassete de expressão de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fragmento de ADN comportar uma sequência correspondente à da hirudina.
6. 6. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fragmento de ADN comportar uma sequência correspondente à da variante rHV2-Lys47 da hirudina.
7. 7. Cassete de expressão de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fragmento de ADN comportar uma sequência correspondente à da trofoblastina ovina, compreendendo, na sua extremidade 5’, uma extensão constituída pelo dipéptido Ala-Pro.
8. 8. Cassete de expressão de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fragmento de ADN comportar uma sequência correspondente à de um péptido da família das xenoxinas.
9. 9. Cassete de expressão de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pela referida cassete de expressão compreender, além disso, uma sequência de terminação da transcrição funcional na levedura.
10. 10. Vector de expressão que compreende uma cassete de expressão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
11. 11. Vector de expressão de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender, além disso, uma ou várias cópias de todo ou parte do gene KEX2.
12. 12. Estirpe de levedura que compreende uma cassete de expressão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou um vector de expressão, de acordo com a reivindicação 10 ou 11.
13. 13. Estirpe de levedura de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pela referida estirpe ser seleccionada entre as leveduras Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris e Kluyveromyces lactis.
14. 14. Processo de preparação de uma proteína heteróloga, de acordo com o qual: 2 - se cresce uma levedura, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, num meio apropriado e - se recupera a proteína heteróloga a partir do meio de cultura, sob a forma totalmente desenvolvida. Lisboa, 31JUL. 2001 Por TRANSGENE S.A.

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