JP2609446B2 - スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子 - Google Patents

スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子

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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） スーパーオキシドジスムターゼ（Super oxide dismut
ase）（「SOD」）は確かに、ほとんどの生物において見
出される種々の異なる酵素である、哺乳動物における１
つの機能は、食作用中に天然に産生される物質であるス
ーパーオキシドを破壊することである。スーパーオキシ
ドジスムターゼは、酵素と会合した金属に基礎を置くフ
ァミリーとして特徴付けられ、この金属は鉄、マンガ
ン、銅、及び銅−亜鉛の間で異る。例えばウシ−肝臓か
らのスーパーオキシドジスムターゼは臨床的に使用され
ており、特に、ヒトを含む動物における抗炎症剤として
使用されている。他の用途には、宿主が種々のスーパー
オキシド導発剤、例えば放射線、パラコート等に暴露さ
れることによって生ずるスーパーオキシドイオンの除
去、ある種の変性疾患、例えば気腫の予防又は治療、食
物の防腐、等が含まれる。
従って、特に、抗炎症剤として又は他の医療目的のた
めに生体内で使用するために、生理的に許容されるスー
パーオキシドジスムターゼが安定供給されることが重要
である。ヒトに適用するためには、生ずる可能性がある
免疫応答を回避し又は最小にするために均質な酵素を用
いるのが好ましい。組織DNA技法を用いることにより、
スーパーオキシドジスムターゼの所望の生物学的活性、
例えば免疫活性及び酵素活性を有する生成物を効率的に
製造する機会が存在する。
（従来の技術） ヒト−赤血球Cu−Znスーパーオキシドジスムターゼの
アミノ酸配列は、Jabusch等、Biochemistry（1980）19:
2310−2316;及びBarra等、FEBS Letters（1980）120:53
−55に記載されている。ウシ−赤血球Cu−Zn SODがStei
nman等、J.Biol.Chem.（1974）249:7326−7388に記載さ
れている。SOD−1cDNAクローンがLineman−Hurwitz等、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1982）79:2808−2811に記載
されている。開始コドンから上流の非翻訳領域の変化が
翻訳の効率に及ぼす影響については、Gheysen等、Gene
（1982）17:55−63;Thummel等、J.Virol.（1981）37:68
3−697;及びMatteucci及びHeyneker、Nucl.Acids Res.
（1983）11:3113−3121を参照のこと。
（発明の概要） ヒト−Cu−Znスーパーオキシドジスムターゼの生物学
的活性を示すポリペプチドの効率的な産生が、構造遺伝
子の大部分のcDNAを調製い、リボゾーム結合部位からコ
ード領域中の退化ヌクレオチドに伸びる種々の配列をも
たらすアダプターの混合物に連結し、そして翻訳シグナ
ルを有する完全遺伝子を発現ベクターに挿入することに
より示される。微生物を形質転換することにより、ヒト
−Cu−Znスーパーオキシドジスムターゼの生物学的活性
を示す有効なポリペプチドの効率的な生産がもたらされ
る。遺伝子はさらに、適当な宿主における分泌のための
分泌及びプロセシングシグナルと結合するために使用す
ることができる。
ポリペプチドの発現を増強するための新規な方法が提
供され、この方法においては、翻訳開始領域の種々の配
列、すなわちリボゾーム結合部位と翻訳開始部位との間
の領域及びポリペプチドの最初の幾つかの５′−コドン
中の種々の配列（遺伝子コードの冗長な制約により許容
される場合において）を有するアダプターの混合物が使
用される。
Ｎ−末端においてアセチル化されたポリペプチド、及
びこのアセチル化ポリペプチドの製造方法も提供され
る。目的ポリペプチドの構造遺伝子の５′末端に特定の
アセチル化シグナル配列を設けることにより、この遺伝
子が酵母中で発現される場合にＮ−末端アミノ酸がアセ
チル化されるであろう。アセチル化シグナル配列は、少
なくとも最初の２個のＮ−末端アミノ酸をコードし、こ
こで第１のアミノ酸はアラニン又はグリシンのいずれか
であり、そして第２のアミノ酸は極性アミノ酸であっ
て、通常はスレオニン、セリン又はアスパラギン酸であ
る。酵母中で産生されるヒト−スーパーオキシドジスム
ターゼのアセチル化は最初の２個のアミノ酸がそれぞれ
アラニン及びスレオニンである場合に示される。
（具体的な説明） ヒト−Cu−Znスーパーオキシドジスムターゼ（sSOD）
の生物学的活性を有するポリペプチドの効率的な発現の
ための方法及び構成物が提供される。この方法は、発現
宿主における発現のために最適化された翻訳開始領域と
共にhSODのアミノ酸配列の実質的な部分をコードするDN
A配列（hSOD遺伝子）を使用する。このhSOD遺伝子は、
便利には細胞外培地からSOD生成物を回収するために分
泌を可能にする条件のもとで、宿主中での発現に適する
ベクターに挿入する。
hSOD及び他のポリペプチドのＮ−末端アセチル化のた
めの方法及び構成物も提供される。これ以後、アセチル
化とはポリペプチド及び蛋白質のアミノ末端への付加を
意味し、天然にも観察されるようなアミノ酸側鎖、例え
ばリジンの修飾と対照される。ポリペプチド及び蛋白質
のアセチル化は多くの理由により有用である。細胞質hS
ODの場合のようにポリペプチドの天然状態がアセチル化
を含む場合、アセチル化を含む発現法は、望ましい天然
構造及び配置を有する生成物を提供する。生成物が医療
として使用され、そして／又は試験管内もしくは生体内
診断に使用される場合、アセチル化物は、宿主に投与さ
れ、そして／又は生物学的サンプルに暴露された場合
に、免疫原性を最小にし又は除去するであろう。さら
に、アセチル化ポリペプチドは一層安定でありそしてプ
ロテアーゼによる分解に対して一層耐性であり、それ故
に細胞、血液、体液及び組織液中に長時間存在するであ
ろう。
hSOD又は他のポリペプチドの構造遺伝子はその５′−
末端にアセチル化シグナル配列を含有し、このシグナル
配列は酵母発現宿主にアセチル化を行わせる。アセチル
化シグナル配列はポリペプチド中の少なくとも最初の２
個のＮ−末端アミノ酸をコードする。第１のアミノ酸は
アラリン、グリシン又はセリンであり、第２のアミノ酸
は極性アミノ酸又は芳香族アミノ酸であり、通常はスレ
オニン、セリン、アスパラギン酸又はフェニルアラニン
である。
これらのアミノ酸は、発現されるべきポリペプチド中
に天然に存在する天然Ｎ−末端アミノ酸であってよい。
これは、第１アミノ酸及び第２アミノ酸がそれぞれアラ
ニン及びスレオニンであるhSODの場合である。酵母中で
発現されそしてアセチル化されるであろう他の天然アセ
チル化蛋白質には次のものが含まれる。
この発明はまた、天然にはアセチル化されないポリペ
プチド及び蛋白質をアセチル化するためにも有用であ
る。アセチル化は、ポリペプチドの構造遺伝子の５′−
末端にアセチル化シグナル配列を連結することによって
達成される。このアセチル化シグナル配列は少なくとも
２個のアミノ酸（上に記載した）をコードし、そして10
個まで又はそれ以上のアミノ酸、好ましくは５個より少
ないアミノ酸をコードすることができる。ポリペプチド
の目的とする活性の妨害又は喪失を制限するために追加
されるアミノ酸が少ない方が一般に望ましい。便利に
は、よく知られている方法に従ってシグナル配列を合成
し、そして構造遺伝子に連結する。
アセチル化シグナル配列を構造遺伝子に付加する代り
に、ポリペプチドの最初の２個のアミノ酸の内の１個又
は両者を置き換えるために構造遺伝子の５′−末端を変
形することも場合によっては可能であろう。このような
変形は種々の常法に従って行うことができる。例えば、
構造遺伝子をその５′−末端の近傍で切断して既知数の
ヌクレオチドを除去する。次に、切断後の接着末端に合
成オリゴヌクレオチドを連結する。このオリゴヌクレオ
チドは塩基対を復元しそして置き換えて所望のアセチル
化シグナル配列をもたらすであろう。この方法に代え
て、例えばファージM13を用いる部位特定変異誘発法を
用いて構造遺伝子の５′−末端に適当な変形を行うこと
ができる。
hSODを製造するためにはhSODをコードするDNA配列を
得ることが必要である。このような配列を完成するため
の１つの方法は、hSODを産生する細胞由来のメッセンジ
ャーRNAからcDNAをクローニングする方法である。便利
には、この目的のためにヒト肝臓細胞を用いることがで
きる。DNAコー配列は未知であるが少なくとも一部分の
アミノ酸配列が知られている場合、cDNAをクローニング
した後、このcDNAを、アミノ酸残基の特定の連鎖をコー
ドするヌクレオチドの可能性のあるすべての配列を有す
るプローブ混合物を用いてスクリーニングする。合成す
べき異るヌクレオチド配列の数を最少にするようにアミ
ノ酸残基を選択するのが一般的であるが、ヌクレオチド
がコードするアミノ酸残基の選択は幾分任意である。
hSODについては、少なくとも19−24位のアミノ酸残基
をコードするDNA配列を便利に使用することができ、特
に、約15以上で且つ約20以下の塩基を有するプローブ、
さらに便利には約17塩基を有するプローブを使用する。
次に、ラベルされたプローブとハイブリド形成したと思
われるクローンを制限酵素で消化し、DNA断片を画分
し、そしてhSOD中のアミノ酸残基の前記の場合と異る連
鎖をコードする第２シリーズのプローブを特に用いてハ
イブリド形成を繰り返す。便利には、これらのアミノ酸
残基は109−114位の残基である。両プローブに陽性であ
る１個又は複数個のクローンを見出し、そしてこれを、
hSODの少なくとも実質的な部分をコードする。cDNAの入
手源として使用することができよう。
全く驚くべきことに、hSODについて発表されているア
ミノ酸配列とcDNAによってコードされているアミノ酸配
列とが、有意な個数の残基において異ることが見出され
た。具体的には、２つの公表された配列〔Jahusch等、B
iochemistry（1980）19:2310−2316;及びBarra等、FEBS
Letters（1980）120:153−156）が異っている場合、正
しい帰属は11位の残基がアスパラギン酸;17位の残基が
イソロイシン;26位の残基がアスパラギン;49位の残基が
グルタミン酸;52位の残基がアスパラギン酸;53位の残基
がアスパラギン;92位の残基がアスパラギン酸;98位の残
基がセリンである（第４図参照のこと）。
リボゾーム結合部位と一般にAUGである翻訳開始コド
ンとの間の分離が翻訳に及ぼす影響がはっきりしないた
め、この発明の方法は、リボゾーム結合部位と開始コド
ンとを分離する距離及びヌクレオチドを変える技法を提
供する。リボゾーム結合部位と開始コドンとの間のスペ
ーサー中に、一般に約６〜15個、さらに一般には約６〜
12個のヌクレオチドが存在する。開始コドンから下流の
塩基配列もまた翻訳効率に影響するから、この発明の方
法はさらに、遺伝的コードの冗長な制限によって許容さ
れるように、ポリペプチドの最初の数個の５′−コドン
の範囲内でヌクレオチド配列の変化（但し長さの変化で
はない）を提供する。この変形は、開始部位から下流の
４コドン以下、さらに一般には２コドンを意図する。
多数のリンカーを調製する。このリンカーにおいて
は、２個以上のヌクレオチド、通常は３個以上のヌクレ
オチドであって10個以下のヌクレオチド、通常は約６個
以下のヌクレオチドが異なり、これには、スペーサー内
であれば４ヌクレオチドのそれぞれ、あるいはポリペプ
チド構造遺伝子中であれば遺伝的コードの冗長性によっ
て許容されるように２個,3個又は４個のヌクレオチドの
構成員が含まれる。さらにヌクレオチドの構成員を異に
するリンカーを調製して配列のみならず長さも異る１群
のリンカーを得る。長さの相違は、リンカーの合成中に
支持体の一部を取り出し、そして適当であれば次の段階
において合成を継続し、種々の配列長さを有するリンカ
ーを得る。通常、リンカー混合物は１個以上６個以下、
通常は４個以下のヌクレオチドにより長さを異にするで
あろう。
これは、不存在塩基が末端にある場合に便利に例示す
ることができる。各段階の支持体の一部分を取り出し、
そして各段階において４種類すべてのヌクレオチド（dN
TP）を与えながら、支持体に結合した鎖を用いながら合
成を続ける。次に、これらの単鎖を部分的に相補的な単
鎖にハイブリド形成せしめる。この場合可変領域はオー
バーハングとなるであろう。こうして、ヌクレオチド及
び長さの両方において異るオーバハングを有する種々な
一連のリンカーが得られるであろう。この後のハイブリ
ド形成操作、連結操作又はクローニング操作中の適当な
時点でオーバーハング領域を満たし（fill in）て、さ
らに操作することができる二重鎖材料を得る。この方法
は一般に、そして好ましくは試験管内において、DNAポ
リメラーゼＩのKlenow断片を用いて行う。この方法に代
えて、ある場合には、オーバハングを単鎖としてクロー
ニングし、形質転換（transform又はtransfect）された
宿主中で満たす（fill in）することができる。相補鎖
へのハイブリド形成は、可変ヌクレオチド連鎖から上流
に、リンカーが連結されるべき末端配列中に存在する配
列に相補的である５′−配列を有することによって達成
することができる。次に、欠損塩基を試験管内又は生体
内において満たす。
リンカーはその配列内に、リボゾーム結合部位と開始
コドンとの間の領域の少なくとも一部分を含有し、好ま
しくは開始コドンに近い側のヌクレオチドを含有する。
リンカーはさらに、開始コドン及び構造遺伝子の部分、
リボゾーム結合部位、並びにリボゾーム結合部位から上
流の塩基（転写制御配列を含み又は含まない）を含有す
ることができる。
通常、リンカーは約５塩基以上、さらに一般的には約
20塩基以上であり、そして通常約200以下、さらに一般
的には約100塩基以下である。リンカーが約35塩基より
大である場合、これは通常は次のようにして集成される
であろう。すなわち、相補鎖の一部分のみと相同な約10
〜35塩基の単鎖配列を用い、すなわちオーバハングを有
する相補的なオーバーラップ配列を得、そして種々の単
鎖をハイブリド形成し、連結し、そして変化及び／又は
種々の長さのオーバーハングを上記のようにして満たし
て接着末端及び／又は平滑末端を有する所望のリンカー
を調製する。
構造遺伝子が、開始コドンから通常約50塩基以下下流
に便利な制限部位を有する場合には、構造遺伝子を含有
する断片を制限酵素処理し、そしてリンカーの相補的な
接着末端に連結し、又は平滑末端に満たしてこの平滑末
端をリンカーの平滑末端に連結する。構造遺伝子が完全
であり、そしてリーディングフレームが開始コドンと整
合することを保証するようにリンカーを工夫する。
前記のように、リンカーの調製において、ヌクレオチ
ド、すなわちコード鎖中の４種類の可能なヌクレオチド
のそれぞれの無作為な連鎖（前記の遺伝的コードの制限
の規則に従う）を有し、そしてリボゾーム結合部位と開
始コドンを中介又は架橋する領域を規定するヌクレオチ
ドの１個又は複数個が欠けて種々の長さを有する一連の
リンカーを得る。単鎖から調製されるこれらのリンカー
を他の単鎖又は二重鎖DNA鎖に連結して、リボゾーム結
合部位のみならずリボゾーム結合部位から上流の塩基も
含むことができる延長されたリンカーを得ることができ
る。これに代えて、リンカーは比較的小形であり、リボ
ゾーム結合部位の内側又はこれに隣接する部位から始ま
り開始コドン部位又は構造遺伝子の内側に延びるもので
あってもよい。
この発明の構成物を得るために種々の断片を連結する
特定の順番は臨界的ではないが、便利にはまず構造遺伝
子をリンカーに連結する。このDNA構成物は、構造遺伝
子のみならず、リボゾーム結合部位及びリボゾーム結合
部位から上流の任意の追加のヌクレオチドを含むであろ
う。さらに、リボゾーム結合部位と開始コドンとの間の
ヌクレオチド鎖のヌクレオチドの種類及び個数に実質的
な多様性が存在するであろう。この発明のDNA構成物
は、該DNA構成挿入部位から上流に必要な転写開始制御
配列を有し、下流に転写停止制御配列を有する適当な発
現ベクターに挿入される。すなわち、リンカーはその
５′末端において転写開始制御シグナル配列に接しそし
てその３′においてヨード領域の少なくとも一部分、及
び転写及び翻訳停止配列に接して位置するであろう。
（５′−及び３′−は転写の方向を意味する。） 適当な宿主に導入するためのプラスミド又はウイルス
DNAを調製した後（通常、操作の適当な段階において種
々のオーバーハング領域を満たすことを含む）、宿主を
形質転換（それぞれ、trans−form又はtransfect）し、
クローニングし、クローンをストリークし、そして目的
生成物、例えばhSODの産生を測定することによって効率
的な発現について個々のクローンを選択する。生成物の
種々の産生レベルを決定するためにスクリーニングすべ
きクローンの数は、合成リンカーに導入された長さの多
様性及び配列の変化の程度に依存し、そして比例するで
あろう。例えばこの発明の具体例において、４種類の長
さの変化、及びリンカー中の６個のヌクレオチドの各々
における４重の変化が存在すれば、可能な組織配列の数
は5440である。通通、少なくとも数百、好ましくは数千
又はそれより多くのクローンをスクリーニングするであ
ろう。スクリーニングは、ニトロセルロース又は他の適
当な材料の紙に移した宿主細胞コロニー又はウイルス
プラークのウエスタンブロット法（生成物の抗体検出）
を用いて効率的に行うことができる。この方法に代え
て、電気泳動法により、多数のレーンを用意して各レー
ンに個々のクローンを割り合て、生成物のバンドの染色
強度、オートラジオグラフィー又はウエスタンブロット
の観察により、直接的に比較して最も効率的に発現する
クローンを見出すことができる。適当であれば、さらに
定量的な免疫測定又は酵素測定を使用することができる
が、通常は前記のスクリーニング法で十分である。
所望により、この構成物を、この発現構成物の制御シ
グナルを認識する他の宿主に移すことができ、あるいは
他の宿主における効率的な発現を得るために必要な制御
シグナルを適当な部位に導入することによって発現構成
物を変形することができる。
所望により、hSODを第２のリーダー及びプロセシング
シグナルに連結して、hSODの分泌及びプロセシングを得
ることができる。種々の分泌リーダー及びプロセシング
シグナルが文献に記載されている。例えば、米国特許第
4,336,336号、及び同第4,338,397号、並びに1983年８月
12日に出願された係属中の米国特許出願第522,909号、
及び1983年４月26日に出願された係属中の米国特許出願
第488,857号を参照のこと。これらの対応部分を引用に
よりこの明細書に組み入れる。
宿主として特に好ましいものは、細菌、藻類、菌類等
のごとき原核生物及び真核生物の両者を含む単細胞微生
物である。特に、E.コリ（E.coli）、B.ズブチリス（B.
subtillis）、S.セレビシエー（S.cerevisiae）、スト
レプトミセス（Streptomyces）、ニューロスポラ（Neur
os−pora）が宿主となり得る。
単細胞微生物中で用いるために広範囲の種類のベクタ
ーを使用することができ、ベクターはプラスミド及びウ
イルスから誘導することができる。ベクターは単コピー
ベクター、又は低コピーもしくは高コピーベクターのい
ずれであってもよい。ベクターはクローニング及び／又
は発現のために機能するであろう。ベクターに関する多
くの文献が存在し、多くのベクターを商業的に入手する
ことができ、そしてベクター及びその制限地図並びに特
性を記載した手引書まで存在するから、ここでさらに検
討する必要はない。よく知られているように、ベクター
は選択を可能にするマーカーを含有するのが普通であ
り、このマーカーは細胞毒剤耐性、栄養要求性又は免疫
性をもたらすであろう。しばしば、異る特性をもたらす
多数のマーカーが使用される。
マーカーのほかに、ベクターは複製水を有し、そして
発現ベクターの場合には通常、転写開始及び停止の両制
御シグナル、例えばプロモーター（単一プロモーター又
は多数縦列プロモーター）、mRNAキャップ配列、TATAボ
ックス、エンハンサー、ターミネータ、ポリアデニル化
配列、及びターミネーターと関連する１個又は複数個の
終止コドンを含有するであろう。翻訳のためには、リボ
ゾーム結合部位及び１個又は複数個の終止コドンがしば
しば存在するであろう。もっとも、終止コドンは通常は
構造遺伝子と関連しているであろう。これとは異って、
これらの制御配列は、ベクターに導入される構造遺伝子
を含有する断片上に存在することもできる。
通常、構造遺伝子を発現ベクターに挿入するために便
利な位置に１個又は複数個の制限部位が存在するであろ
う。一旦挿入した後、構造遺伝子を含有する発現ベクタ
ーを適当なベクターに導入し、そして宿主をクローニン
グしてhSODの効率的な発現を得ることができよう。
ある場合には、特殊な性質、例えば発現の温度感受
性、転写制御のためのオペレーター又はアクチベーター
等をベクターに備えることができる。特に有利なもの
は、外的手段、例えば温度、インデューサー、コンプレ
ッサー等により転写を制御することができる能力であ
り、この能力がある場合には外的化合物、通常は有機化
合物により転写を誘導し又は抑制することができる。
hSODが細胞内に産生される場合には、細胞培養物が高
濃度に達した時に便利には遠心分離により細胞を分離
し、溶解し、そして種々の方法、例えば抽出、アフィニ
ティークロマトグラフィー、電気泳動、透析、又はこれ
らの組合わせによりhSODを分離する。生成物が分泌され
る場合には、培地について上記と同様の方法を用いる。
しかしながらこの場合、細胞溶解物の場合に比べて、培
地中の全蛋白質に対する目的生成物の割合が実質上高い
であろう。
産生されたhSODは天然のヒト−スーパーオキシドジス
ムターゼと実質上同一のアミノ酸配列を有し、アミノ酸
の相違は一般に５個より少なく、さらに一般的には２個
より少ない。組換hSOD（ｒ−hSOD）は、天然のhSODと実
質上同一の生物学的性質を有する。生物学的性質には免
疫的性質が含まれ、真正なhSODに対して生じた抗体がｒ
−hSODと交差反応する。さらに、hSODについて用いる一
般的なバイオアッセイにおいて、ｒ−hSOD生成物は蛋白
質重量に対して実質的な比率を示し、通常は真正なhSOD
の約10％以上、好ましくは約50％以上、さらに好ましく
は約80％以上である。代表的な測定法がMarklund及びMa
rklund,Eur.J.Biochem.（1974）47:469−474に記載され
ている。
次に、例によりこの発明をさらに詳細に説明する。但
し、これによりこの発明の範囲を限定するものではな
い。
実験 hSOD cDNAの分子クローニング 成人の肝臓から、グアニジニウムチオシアナート／塩
化リチウム法〔Cathala等、DNA（1983）2:329−335〕に
より全RNAを調製した。ポリA RNAを用いて２重鎖cDNAを
合成し（Maniatis等、Molecular Cloning,213−242,Col
d Spring Harbor,1982）、そしてこれをセファロースLC
4Bカラムに通して350bpより大きい。cDNAを濃縮した〔F
iddes及びGoodman,Nature（1979）281:351−356〕。cDN
Aをp lot 4のPst I部位に挿入した。p lot 4は、pBR322
の誘導体であって、Pst I−Eco RI部位に代えて次の配
列を有する。
cDNAの挿入にはオリゴdG:dCテーリング法（Maniatis
等、前掲）を使用した。この混合物によりE.コリD1210
株を形質転換し、そして形質転換体を10μg/mlのテトラ
サイクリンを含有するＬ−寒天〔Kushner S.R.（1978）
In:Genetic Engineering,Boyer H.B.及びNicosia S.
編、（エルゼビル／北オランダ、アムステルダム）17
頁〕上で選択した。肝臓cDNAライブラリーを構成するプ
ラスミドDNAを、直径9cmのペトリ皿当り約3,000コロニ
ーの密度でプレートした約62,000個の組換コロニーから
直接に調製した（Maniatis等、Molecular Cloning,86〜
94頁、Cold SPring Harbor,1982）。
γ−hSODクローンの分離 菌株D1210を肝臓cDNAライブラリーにより形質転換
し、そして約40,000のクローンが直径14cmのペトリ皿９
枚の上に増殖した。コロニーをニトロセルロース紙上に
移し、そしてプラスミドDNAのクロラムフェニコール増
幅を行った後、細胞を溶解し、そして紙をハイブリド
形成のために調製した〔Ish−Horowicz及びBurke,Nucle
ic Acids Research（1981）９:2989−2998〕。オリゴヌ
クレオチドプローブを使用してハイブリド形成によるス
クリーニングを行った。このプローブは、蛋白質のアミ
ノ酸残基第19−24位をコードするmRNAに相補的な酵素的
に放射性ラベルした化学合DNA分子から成り（Jabusch
等、前掲;Barra等、前掲）、このプローブ混合物は次の
配列を有する。
ペプチドをコードするために示された可能性のすべて
（32種類）を調製した。
プローブを、32Pを用いて比活性が１〜３×108cpm/μ
ｇとなるようにラベルし、そしてミリポアフィルター
（0.45μｍ）で過して使用した。紙を、30℃にて６
時間、４×SSC、２×デンハート溶液、40mM燐酸ナトリ
ウム、pH7.5、300μg/ml、超音波処理したサケ試験DNA
中で前ハイブリド形成した。ハイブリド形成は、２×10
6cpm/ml hSOD DNAブロープを含有する上記と同じ溶液中
で30℃にて20時間行った。紙を、４×SSC中で15分間
室温にて１回洗浄し、そして15分間ずつ２回30℃にて洗
浄し、吸取紙を用いて乾燥し、そして増強スクリーンを
用いて−70℃にて24時間オートラジオグラフ処理した。
二重陽性シグナルに対応するマスタープレート上の領域
をＬ−ブロスに拾い上げ、そしてミニスクリーン法（Ma
niatis等、Molecular Cloning,178,368−369,Cold Spri
ng Harbor,1982）によりプラスミドDNAを調製した。こ
のDNAをPst Iで切断し、そしてサザンブロセット分析
〔Southern J.,Mol.Biol.（1975）98:503−517〕にかけ
た。この方法においては、まず、あらかじめラベルした
プローブ（アミノ酸残基第19−24位に対応）とハイブリ
ド形成せしめ、そして次に追加の放射性ラベルプローブ
とハイブリド形成せしめた。このプローブはアミノ酸残
基第109−114位に対応し、そして次の配列を有する（可
能なすべての変形、すなわち72種類の変形が存在す
る）。
１つのプラスミドプール（sPOD1）が両プローブとハ
イブリド形成する520bpのcDNA挿入部を含有していた。
コロニーを精製し、そしてこのクローンからプラスミド
DNAを調製した後、Maxam及びGilbertの方法〔Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA（1977）74:560−564〕により配列決定
した。結果を第４図に示す。hSOD cDNAクローンpSOD1
は、hSODのアミノ酸10−153位のコード領域、１個の翻
訳終止コドン、及び３′非翻訳領域を構成する。従っ
て、発現ベクター構成物においては、アミノ酸１−９位
をコードする領域の塩基配列はhSODの公表されているア
ミノ酸配列（Jabusch等、前掲;Barra等、前掲）から導
き、そして多様なリンカーセグメントの部分として化学
的に合成する（下記を参照のこと）。
プラスミドp lot 5の造成（第２図及び第３図参照のこ
と） ハイブリドtrp−lac（tac）プロモーター〔De Boer
等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80:21−25〕を含
有するプラスミドp lot 1を次のようにして造成した。p
trp L1〔Edman等、Nature（1981）291;503−506〕の18
0bp Hgi A−Taq I断片、及びpKB268〔Bachman及びPtash
ne,Cell（1978）13:65−71〕からの58bp Hpa II−Eco R
I断片をゲル分離し、そしてこれらの断片を、Pst I及び
Eco RIにより消化したpBR322に連結する。得られたプラ
スミドを用いてD1210株を形質転換し、そしてテトラサ
イクリン耐性についてクローンを選択した。プラスミド
p lot 3を次のようにして造成した。tacプロモーターを
含有するp lot 1の155bp Fnu 4HI−Eco RI断片〔Fnu 4H
I部位はDNAポリメラーゼＩのKlenow断片（「pol IK」又
は「pol.Keln.」）を用いて平滑末端化したもの〕、及
び次の配列、 を有するΠAN7の18bp Eco RI−Pst Iポリリンが断片を
ゲル分離した。pBR322をEco RIで消化し、pol IKを用い
て平滑末端化し、次にPst Iで消化し、そしてゲル精製
して得た断片に、上記２個の断片を連結した。この連結
混合物を用いてD1210株を形質転換し、そして10μg/ml
のテトラサイクリンを含有するＬ−プレート上で選択し
た。
プラスミドp lot 5を次のようにして造成した。ま
ず、pBR322中のEco RI−Rvu II間をΠAN7のポリリンカ
ーで換き代えたプラスミドを造成した。これを行うため
に、プラスミドΠAN7をHind IIIで消化し、pol IKを用
いて満たすことによって平滑末端化し、そしてこうして
変形したプラスミドΠAN7に、合成した自己相補的Pvu I
Iリンカー分子（ｄ（５′−CCAGCTGG−３′））を連結
した。Eco RI及びPvu IIで消化した後、得られた44bpの
ポリリンカー断片（４塩基のオーバーハングを有する）
をゲル分離し、そしてEco RI−Rvu II置換体としてpBR3
22にクローニングした。
プラスミドp lot 3をEco RIで消化し、そしてフェノ
ール／クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行った
後、突出している５′−未満をSlヌクレアーゼ〔Palmit
er,Biochemistry（1974）13:3606−3615;Hallewell及び
Emtage,Gene（1980）９:27−47〕で処理することによっ
て平滑末端化した。フェノール／クロロホルム抽出及び
エタノール沈澱を行った後、DNAをCla Iで消化し、pol
IKにより平滑末端化し、そして調製用ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によりtacプロモーターを含有する237bp
断片を分離した。次に、この平滑末端tacプロモーター
断片をpBR322ポリリンカープラスミド（第３図参照）の
Pvu II部位に挿入し、そしてtacプロモーターがpBR322
のβ−ラクタムマーゼ遺伝子の方向に転写を指令するク
ローンを得た。
γ−hSODを発現するplot5誘導体の造成 第１図に示す合成DNA分子Ｆ（26）、Ｃ（16）、Ｂ（3
1）、Ｄ（11）、Ｅ（13）、及び４（24）をホスホルア
ミダイト法により合成した。単鎖４（24）は、Ｘで示さ
れている各部位において４種類すべての塩基を用いて合
成した。さらに、24マーの他に21マー、22マー、及び23
マーが得られる様に24マーの合成からシリカを除去し
た。シリカ支持体から取り出した後、４種類の混合物を
適当な比率で混合して可能な単鎖のそれぞれが等モル量
となるようにした。この混合物を次の段階において単一
生成物として処理した。
分子Ｆ（26）、Ｃ（16）、Ｂ（31）、及びＤ（11）を
等モル量に混合し、そして10μｇをT4ポリヌクレオチド
キナーゼを用いて燐酸化した。フェノール／エーテル抽
出の後、追加の非燐酸化合成DNA分子４（24）、及びＥ
（13）を加え、すべての断片が等モル量となるようにし
た。この等モル混合物は、133μの0.3Xキナーゼ緩衝
液中に13μｇのDNAを含有する。
一定速度で70℃から20℃に60分間にわたって冷却する
ことによりアニーリングした後、200μの連結混合物
中14℃にて４時間単鎖を連結し、フェノール／クロロホ
ルム抽出、及びエタノール沈澱を行い、そして４（24）
及びＥ（13）の５′−末端をT4ポリヌクレオチドキナー
ゼ（Maniatis等、前掲）を用いて燐酸化した。調製用ゲ
ル電気泳動を用いて、５′−及び３′−オーバーハング
を有する完全に連結された53bpの材料を分離した。
次に、上記の精製断片混合物を、第１図に示すように
hSOD cDNAの460bp Taq I−Pst I断片に連結した。この
断片自体は、454bp Taq I−Alu I hSOD断片を分離し、
これをpol IKを用いて平滑末端化し、そしてこれをp lo
t 5のEcoRI−Sal I部位（第３図）（同様にして平滑末
端化しておく）に挿入することにより造成した。その組
換体からプラスミドDNAを調製した後、460bp Taq I−Ps
t I hSOD断片を調製用ポリアクリルアミド電気泳動によ
り分離した。抽出及び沈澱を行った後、460bp Taq I−P
st I hSOD断片に合成断片を連結することによって得ら
れた515bp断片をpol IKにより満たし（525−528pb）、
そして次にSal Iで消化し、そして得られた519−522bp
hSOD断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離
した。次に、この断片を、Pvu II及びSal Iで消化しそ
して次にアルカリホスファターゼで処理したp lot 5に
挿入した。こうして得られたプラスミドを使用してD121
0株を形質転換した。D1210株の形質転換後に得られた組
換体を100μg/mlのアンピシリンを含有するＬ−寒天上
で選択して、種種のSOD発現を行う１群のクローン（p l
ot 5/SODと称する）を得た。
γ−hSODの発現及びplot5/SODプラスミドの選択 全E.コリ蛋白質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分析するために、１夜培養したものを1mlの
Ｌ−ブロス中に30倍に稀釈し、そして37℃にて90分間振
とうして増殖せしめO.D.650を約0.2とした。IPTG（イソ
プロピルチオガラクトシド）を最終濃度が2mMとなるよ
うに加え、そして培養物をさらに３時間インキュベート
した。遠心分離した後、細胞ペレットを50μのゲルロ
ーディング緩衝液〔Laemmli,Nature（1970）227:680−6
85〕に再懸濁し、そして１分間凍結し、２分間煮沸し、
そして10秒間渦流撹拌する操作を３回反復することによ
って溶解した。
電気泳動による分離（Laemmli,前掲）を行った後、蛋
白質バンドをクーマシーブルーにより染色し、そして各
クローンにより産生されたSODの量を算出した。次のこ
の結果を、真正ヒトSODに対する抗体を用いるウエスタ
ンブロット法により確認した。300を超えるクローンを
分析した。示されたSOD発現レベルは、ほとんど又は全
く発現しないものから全可溶性細胞蛋白質の５〜10％に
達するものまで多様であった。300以上のクローンの内
６クローンについての結果を、Maxam及びGilbertの方法
（前掲）により決定したDNA分子４（24）の特定の配列
と共に第１表に示す。
γ−hSODの測定 酵素測定を行うため、100mlの培養物を上記のように
してインキュベートした。細胞ペレットを同容量の直径
0.45〜0.5mmのガラスビーズ（Braun AG）及び同容量の
測定緩衝液（50mM Tris−カコジレート、pH8.2、1mMジ
エチレントリアミンペンタ酢酸）と共に1.5mlのミクロ
フュージチューブ中４℃にて渦流撹拌する（10×20秒
間）ことにより可溶性細胞抽出物を調製した。このチュ
ーブをミクロフュージ（Beckman）中で１分間回転せし
めることにより細胞片をペレット化した。上清液を、1m
M硫酸亜鉛及び1mM硫酸銅を含有する測定緩衝液に対し
て、４℃にて４時間透析した。
ピロガロール法（Marklund及びMarklund、前掲）の方
法を用いてSODの測定を行った。反応混合物として測定
緩衝液中0.2mMピロガロールを用い、５分間にわたって
反応速度を測定した。この測定においては、Hewlett−P
ackard 8450分光光度計を420mmにて使用した。４種類の
異る測定サンプル、すなわちE.コリ抽出物、真正hSOD、
及び真正hSODに対するラビット抗体と共に前インキュベ
ートした前記２種類のサンプルを調製した。各サンプル
をキュベット中で25℃にて１分間インキュベートした
後、ピロガロールを加え、そして25℃において測定し
た。抗体サンプルは、測定緩衝液中で５μの抗体と共
に室温にて10分間前インキュベートした。これらの条件
は、100ngの純hSODを不活性化するのに十分であること
が見出された。
次の第２表に試験したクローンの１つ（pSOD X8）の
結果を示す。
これらのデータは、全可溶性細胞蛋白質の約15％がhS
ODであることを示している（対照として使用した純−ヒ
トCu−Zn SODが十分に活性であると仮定する）。全可溶
性細胞蛋白質の５〜10％がhSODとして移動することを示
す前記の電気泳動データと相まって、実質的な画分、お
そらく産生されたhSODの大部分が活性であることが明ら
かである。
クローニングされた遺伝子の正しい配列をMaxam及びG
ilbert（前掲）の方法により決定した。さらに、Ｎ−末
端の最初の12アミノ酸を自動エドマン分解法により決定
した。検出されたアミノ酸酸列を次に示す。
ALA−THR−LYS−ALA−VAL−（CYS）−VAL−LEU−LYS−G
LY−ASP−GLY− 検出された第1ALA残基はインプットしたペプチドの濃
度とおよそ等モルの濃度で存在し、プロックされたアミ
ノ酸末端が存在しないことが示された。使用したアミノ
酸分析法によってはCYS残基は検出されなかったが、こ
の存在はヌクレオチド配列から推定された。
すなわち、（Ｎ−ホルミル）メチオニンは細菌発現生
成物から除去されており、そしてこの物質は正しいアミ
ノ酸配列、すなわち、細胞質hSOD残基１−10について報
告されている配列と同一であったが、Ｎ−末端ALA残基
はアセチル化されていなかった。さらに、E.コリ中で産
生されたポリペプチドは、荷電の相違を検出する１％ア
がロースゲル（pH8.6）電気泳動（コーニングユニバー
サル電気泳動フィルム;Clausen,Immunochemical Techni
que,530−531頁に従って染色）において天然蛋白質より
ゆっくりと移動し、やはりアセチル化の不存在が示され
た。さらに、細菌hSODポリペプチド及び精製された真正
な（アセチル化された）天然蛋白質の両者のトリプシン
分解ペプチドの分析から、すべてのトリプシン分解ペプ
チドは同一であるが、細菌Ｎ−末端ペプチドのみは異る
移動、すなわちＮ−アセチル基が欠けているペプチドに
ついて予想される荷電を伴う移動をすることが示され
た。
酵母における発現 γ−hSOD遺伝子を酵母ベクターに移すために、p lot
5/SODプラスミドクローンを、コード領域の５′−末端
におけるNco I制限部位についてスクリーニングした。A
TG開始コドンの５′に存在する可変ヌクレオチドがCCで
あるプラスミドにおいて、配列CCATGGがNco I部位を与
える。クローンをスクリーニングし、そして１個を選択
し、そしてphSODと命名した。
プラスミドphSODをNco I及びSal Iで消化し、そして5
50bpの断片を得た。この断片は、５′−末端の１個の非
翻訳ヌクレオチド、及びhSODの完全なコード領域を含有
する、pPGAP（GAPプロモーターを担持する酵母発現ベク
ター、後記の方法により調製）をNco I及びSal Iにより
消化し、そしてアルカリホスファターゼで処理し、そし
てpPGAP中のNco I−Sal I断片を前記のsal I−Nco I断
片で置換してpPGAPSODを得た。pPGAPSODをBam HIで消化
して2kb断片を得、これをゲル分離し、これをpC1/1、及
びpC1/1GAL4/370のBam HI部位に挿入し、それぞれプラ
スミドpC1/1GAPSOD、及びpC1/1GALGAPSODを得た。
プラスミドpC1/1はpJDB219〔Beggs,Nature（1978）27
5:104〕の誘導体であり、pJDB219中の細菌プラスミドpM
B9に対応する領域が、pC1/1においてはpBR322により置
き換えられている。分泌及びプロセシングシグナルを有
する発現ベクターの調製については米国特許出願第522,
909号を参照のこと。
GAL1/GAL10制御領域（GAL4遺伝子発現生成物により制
御される）を含有する制御され得る酵母発現ベクターで
あるプラスミドpC1/1GAL4/370は後記のようにして調製
する。
プラスミドpC1/1GAPSOD、及びpC1/1GALGAPSODを、す
でに記載されているようにして〔Hinnen等、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA（1978）75:1929−1933〕、酵母2150−２
−３株（ワシントン大学、Lee Hartwellから入手でき
る）に形質転換した。次の第３表に示す発現結果が得ら
れた。
hSODレベルを、標準として真正hSODを用いる標準的放
射免疫測定法により測定した。GAPプロモーターからの
構成的合成は全細胞蛋白質の10〜30％のオーダーの非常
に高レベルのhSODの産生を導いた。ガラクトースによる
誘導もほとんど同様に機能し細胞蛋白質の約７％をhSOD
として産生した。
hSODがこのような高レベルで産生される場合には、完
全な酵素的すなわち触媒的活性を回収するために、補欠
群として亜鉛イオン及び銅イオンを、生成蛋白質に、硫
酸亜鉛及び硫酸銅の両者の1mM溶液に対する透析により
与えることが必要である。この方法に代えて、亜鉛イオ
ン及び／又は銅イオンを10の増殖培地に含有せしめるこ
とができ、この方法はさらに、高レベルのhSODを産生す
る菌株を選択するための手段、及び／又は非選択培地で
のhSODを発現するプラスミドベクターの喪失を回避する
ための手段を提供する。
pPGAPの造成 pBR322のHind III部位にGAPDH遺伝子GAP49〔Holland
及びHolland,J.Biol.Ceem.（1979）254:5466−5474〕を
含有するHind III断片を挿入することにより調製された
プラスミドpGAP1をHinf Iで消化し、そして500bp断片を
分離した。この断片をBal31で切断して約50bp又は90bp
を除去し、次にHind IIIリンカーに連結し、そしてHind
IIIで消化した。pBR322をHind IIIで消化し、次にアル
カリホスファターゼで処理し、そして約450bp又は410bp
の断片を挿入してpGAP128を得た。
pGAP128をHind IIIで消化し、この断片をKlenow断片
及びdNTPにより平滑末端化し、そして生成した450bp断
片をゲル電気泳動により分離した。この断片をSma Iで
消化し、アルカリホスファターゼで処理したplot5に挿
入してプラスミドplot5pGAP128を得た。このプラスミド
は約−400〜＋27bpのGAPDHプロモーター及びコード領域
を含有する。
GAPDHターミネーターとショートプロモーター領域の
間に多制限部位リンカーを有する酵母発現ベクターpPGA
Pを次のようにして調製した。プラスミドplot5pGA128を
Bam HI及びTaq Iで消化して−400〜−26bpのGAPDHプロ
モーターを有する約390bp Bam HI−Taq I断片を得た。B
am HI−Taq I断片を、−25〜−1bpのGAPDHプロモーター
及びNco Iを含む幾つかの制限部位を含有し、そして次
の配列、 CGA2TA3（CA）3TA3CA3CACCATG3A2T2CGT2AG2 T2AT3（GT）3AT3GT3GTGGTAC3T2A2GCA2TC2AGCT を有する合成断片に連結してBam HI−Sal I断片を得、
これをBam HI及びSal Iにより消化し、そしてこれを用
いて、Bam HI−Sal I消化されアルカリホスファターゼ
処理されたpBR322のBam HI−Sal I断片と置き換えた。
連結した後、プラスミドpGAPNRSを得、これをBam HI及
びSal Iで消化して400bp Bam I−Sal I断片を生成せし
め、これをゲル分離した。この断片を、GAPDHターミネ
ーター領域及び３′コード領域のショートセグメントを
含有する約900bp Sal I−Bam HI断片に連結し、そして
生成した1.4kb Bam HI−Bam HI断片を Bam HIで消化し
た。GAPDH遺伝子GAP49（Holland及びHolland、前掲）を
含有する3.3kb Bam HI断片をpBR322のBam HI部位に挿入
することによって得られたプラスミドであるpGAP2をSal
I及びBam HIで消化することにより、Sal I−Bam HI GA
PDHターミネータ断片を得た。プラスミドpGAP2及びpGAP
1は次のようして得た。全酵母DNAを制限酵素Sau 3Aによ
り部分消化した後に得られた断片をλ−ファージCharon
28〔Blattner等、Science（1977）196:161−169〕に挿
入することにより酵母遺伝子ライブラリーを調製した。
このファージライブラリーを、酵母GAPDHmRNAに相補的
なDNAを用いてスクリーニングし、そしてこれらのクロ
ーンの１つからの酵母GAPDH遺伝子を、pBR322のBam HI
部位における約3.3kbBam HI断片（pGAP−２）として、
又はpBR322のHind III部位における約2.1kb Hind III断
片（pGAP−１）としてサブクローニングした。
pBR322をEco RI及びSal Iで消化し、平滑末端化し、
そしてBam HIリンカーに連結し、次にBam HIで消化し、
そしてBam HI−Bam HI3.8kb断片をゲル分離し、自己連
結により再環化し、クローニングし、そしてpBRΔR1−S
alと命名した。1.4kb Bam HI−Bam HI断片を、Bam HIで
消化されそしてアルカリホスファターゼで処理されたpB
RΔR1−Salベクターに挿入して、amp γの逆向きに方向
付けられた約5.3kbのプラスミドpPGAPを得た。
制御されたGALを含有するプラスミドの造成 プラスミドpLGSD5はGuarente等、（1982）前掲に記載
されている方法により調製する。このプラスミドを次の
ようにして操作した。Xho Iにより制限処理した後、オ
ーバーハングをDNAポリメラーゼＩのKnenow断片（Kleno
w断片）を用いて満たし、Eco RIリンカー（GGAATTCC）
と連結し、そして次にEco RI及びSau 3Aを用いて完全消
化して370bp断片を得、そしてゲル電気泳動により分離
した。この断片は、酵母のGAL1遺伝子及びGAL10遺伝子
の間に遺伝子間配列（intergenic sequence）を含み、
そしてGAL1遺伝子及びGAL10遺伝子のGAL4制御配列を備
える。
この断片を、Eco RI及びBam HIで完全消化されそして
次にアルカリホスファターゼで処理してオリゴマー化を
防止したpBR322に挿入し、プラスミドpBRGAL4を得た。
プラスミドpBRGAL4をSau 3Aにより完全消化し、オー
バーハングをKlenow断片で満たし、そして得られた平滑
末端化断片をSal Iリンカー（CGTCGACG）に連結し、次
にSal I及びXho Iで消化した。得られた370bp断片をゲ
ル電気泳動により分離した。この断片は、Xho及びSal I
末端を伴ってもとの370bp酵母GAL4制御配列を有する。
次に、この断片をプラスミドplot5にクローニングし
た。次の配列、 を有する40bpポリリンカー断片をEco RI−Pvu II置換体
としてpBR322に挿入し、次にtrp−lacプロモーター〔Ru
ssell及びBennett,Gene（1982）20:230−245〕をBvu II
部位中に、転写の方向がホリリンター配列に向けられる
ように挿入することによってplot5を調製した。plot5を
Sal Iにより完全に消化し、次にアルカリホスファター
ゼで処理し、そして370bp断片をplot5に挿入することに
よってプラスミドplot5GAL4/370を得た。次に、このプ
ラスミドをBam HI及びSal Iにより完全に消化して、ポ
リリンカー断片の6bpによって延長された個有の断片を
得た。次にこの断片を、Bam HI及びSal Iで完全に消化
されそして再環化を防止するためにアルカリホスファタ
ーゼで処理されたpC1/1に連結した。得られたプラスミ
ドをpC1/1GAL4/370と命令した。Bam HI−Sal I断片はベ
クターpC1/1のpBR322部分中に位置する。
酵母において産生されたphSODポリペプチドは天然の
ヒト−蛋白質と同一であることが示された。酵母におい
て産生されたhSODの移動は、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ドデシル硫酸ナトリウムを用いる又は用いな
い）、及びアガロースゲル電気泳動（前記参照）のいず
れにおいてもヒト−蛋白質と同一であった。さらに、高
度に精製した酵母ポリペプチドを12サイクルのエドマン
分解にかけた場合、その配列はE.コリにおいて産生され
た前記のヒト蛋白質（残基−10）について報告されてい
る配列と同一であった。しかしながら、検出レベルは蛋
白質インプットについてのモル基準で期待されるレベル
の５〜10％に過ぎなかった。この低下した検出レベル
は、Ｎ−末端アミノ酸がブロックされていること、すな
わちおそらくアセチル化されていることを示している。
この結果を、酵母酸生hSOD及び真正アセチル化ヒト物質
からのトリプシン分解ペプチドの比較分析により確認し
た。その結果により、すべての予想されたトリプシン分
解蛋白質はＮ−末端の分解物を含む２つのサンプルにお
いて同一であり、従って酵母発現生成物中にアセチル化
Ｎ−末端ALAが存在することが示された。
ヒトSOD遺伝子の分離 ヒトSOD遺伝子を分離するために、ヒトゲノムを代表
するバクテリオファージλライブラリー〔R.Lawn等、
（1978）Cell 15:1157−1174〕を、ヒトSODcDNAから作
られた放射性ラベルDNAプローブを用いてスクリーニン
グした。100万個のファージプラークをスクリーニング
し、13個のハイブリド形成陽性のプラークを精製した。
ファージDNAの制限エンドヌクレオチド分析により、少
なくとも５つの異る遺伝子が存在することが示され、他
のSOD関連遺伝子及び遺伝子生成物が存在することが示
唆された。このような遺伝子の１つの候補は最近発見さ
れた細胞外Cu/Zn SOD〔S.Marklund、（1982）Proc.Nat
l.Sci.USA 79:7634−7638〕である。真正細胞質Cu/Zn S
OD遺伝子を関連遺伝子から区別するために、本発明者等
は、アミノ酸残基19−26、及び３′非翻訳領域中のター
ミネーターコドンから３′のヌクレオチド193−213に対
応する合成DNAプローブ５′−AATGCTTCCCCACACC−
３′、及び５′−CTCAGTTAAAATGTCTGTTTG−３′を用い
た。13のゲノムDNAの内の１個のみがこれらのプローブ
とハイブリド形成し、これが真正なヒト細胞質SOD遺伝
子であることが示された。このことは、第５図に示すよ
うに、Ｎ−末端領域のDNA配列分析により確認された。
この場合、蛋白質配列により決定されたアミノ酸酸列が
確認される。これはまた、SODについてプレ蛋白質が存
在しないことを示している。開始メチオニンコドンから
９ヌクレオチド５′側にイン−フレームターミネーショ
ンコドンが存在するからである。第５図に示すように、
ヒトCu/Zn SOD遺伝子は介在配列を含有する。第６図に
示すSOD遺伝子の地図は、１個より多くの介在配列が存
在することを示す。
以上、例示及び例によりこの発明を詳細に説明した
が、この発明の範囲内において多くの変化・変法が考え
られよう。
なお、E.コリD1210（pSOD×８）株は1983年９月27日
にATCCに寄託され、ATCC No39453の受託番号が与えられ
た。酵母2150−２−３（pC1/1GAPSOD）株、並びにE.コ
リD1210（pSOD11）株及びD1210（pS20R）株が1984年５
月９日にATCCに寄託され、それぞれ受託番号ATCC No207
08,No39679,及びNo39680が与えられた。
なお、この発明は次の方法を含む。
微生物においてスーパーオキシドジスムターゼを製造
する方法であって、該微生物を栄養培地中で増殖せしめ
ることを含んで成り、該微生物が微生物中で機能するDN
A構成物を含有し、該DNA構成物が転写の下流方向に、 （１） プロモーター； （２） リボゾーム結合部位； （３） 開始コドン； （４） 前記開始コドンとリーディングフレーム が整合しており、そして３′−末端に終止コドンを有す
るヒト−スーパーオキシドジスムターゼ構造遺伝子；及
び （５） 転写ターミネーター； を含有し、これによって前記スーパーオキシドジスムタ
ーゼを産生することを特徴とする方法。
【図面の簡単な説明】
第１図はDNAリンカー配列及びその使用を示す流れ図で
あり；第２図及び第３図はp lot 5/SODの調製を示す流
れ図であり；第４図はヒトSODcDNAのコード鎖（５′→
３′）及び得られる翻訳生成物のそれぞれの配列を示
し；第５図は分離されたヒトSOD遺伝子の配列を示し；
そして第６図は分離されたSOD遺伝子の制限地図を示
す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） 審判番号 平5−8117 (72)発明者 ガイ テイー．ミユレンバツハ アメリカ合衆国，カリフオルニア 94618，オークランド，シツクステイー サード ストリート 309 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．〔80〕（1983）Ｐ. 5465−5469 Ｒ．Ｗ．オールド，Ｓ．Ｂ．プリムロ ーズ共著「遺伝子操作の原理」（株）培 風館（昭58−９−10）Ｐ．122−145、 171−174、185−190

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒト−スーパーオキシドジスムターゼのア
    ミノ酸配列を有するポリペプチドの製造方法であって、 ヒト−スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝
    子を含むDNA構成物を大腸菌に導入し、形質転換体を作
    製する工程； 該形質転換体を適切な培地中で増殖させ、該ポリペプチ
    ドを発現させる工程；および 該形質転換体で発現された該ポリペプチドを単離する工
    程；を含み、 ここで、該DNA構成物はヒト−スーパーオキシドジスム
    ターゼ構造遺伝子の直前にスペーサーを有し、該スペー
    サーのヌクレオチド配列が、以下の配列： ５′−AACA−３′； ５′−GTAT−３′； ５′−ACAT−３′； ５′−AATC−３′； ５′−ATTT−３′；および ５′−AACT−３′； からなる群から選択される配列である、方法。
  2. 【請求項２】前記DNA構成物が、転写下流方向にプロモ
    ーター、スペーサー、ヒト−スーパーオキシドジスムタ
    ーゼ構造遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記DNA構成物が、前記プロモーターと前
    記スペーサーとの間にリボゾーム結合部位を含む、請求
    項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記DNA構成物が、前記スペーサーおよび
    ヒト−スーパーオキシドジスムターゼの開始コドンから
    いくつかのヌクレオチドを含む配列を有し、該ヌクレオ
    チドを含む配列が、以下の配列： ５′−AACAATGGCAACG−３′； ５′−GTATATGGCTACG−３′； ５′−ACATATGGCAACA−３′； ５′−AATCATGGCAACA−３′； ５′−ATTTATGGCTACT−３′；および ５′−AACTATGGCAACG−３′； からなる群から選択される配列である、請求項１ないし
    ３いずれかに記載の方法。
  5. 【請求項５】染色体外での複製および維持のための複製
    システムに連結されている、請求項１ないし４いずれか
    の項に記載の方法。
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