JPH04229188A - 融合タンパク質の試験管内プロセシング - Google Patents

融合タンパク質の試験管内プロセシング

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JPH04229188A
JPH04229188A JP3176552A JP17655291A JPH04229188A JP H04229188 A JPH04229188 A JP H04229188A JP 3176552 A JP3176552 A JP 3176552A JP 17655291 A JP17655291 A JP 17655291A JP H04229188 A JPH04229188 A JP H04229188A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、融合タンパク質の試験
管内プロセシングによる成熟タンパク質の製造方法、お
よびそのような融合タンパク質の調製に必要な手段に関
する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】医薬
上適用できるかまたは酵素的に活性なタンパク質の製造
は、めざましく発展しているバイオテクノロジー産業の
重要な領域である。組換えＤＮＡ技術の領域の始まり以
来、非常に多数の有効な異種タンパク質が、前記タンパ
ク質をコードするＤＮＡ配列を含む適当な発現ベクター
により形質転換された原核および真核宿主細胞中で発現
されている。しかしながら、多くの場合、十分な量の純
粋なタンパク質を生産することは大きな困難が伴う。特
に低分子量タンパク質の場合には、様々な量の分解副生
成物、特にＣ末端の分解副生成物のため生成物が不純で
あり、収量を低下させそして生成を困難な作業にするこ
とがしばしば観察される。他の場合では、所望のタンパ
ク質の全収量が不十分であり、そして方法の変更（例え
ば特定のベクターおよび宿主株の選択、培養条件）によ
り有意に増加させることができない。更に、タンパク質
の精製は取るに足らない作業ではない。最初の単離混合
物が極少量しか所望のタンパク質を含まず、宿主特異的
タンパク質が優勢であることがしばしばある。所望のタ
ンパク質の生物活性および構造的完全性を維持しながら
のそれらの宿主特異的タンパク質の分離は、深刻な問題
を引き起こし得る。 【０００３】言及した難点を克服するための１つのアプ
ローチは、所望のタンパク質を融合タンパク質として発
現せしめること、即ち、所望のタンパク質のＣ末端また
は特にＮ末端を安定化および／または保護ポリペプチド
に結合させることである。このポリペプチドは、解決す
べき課題（分解、精製等）および融合タンパク質の発現
に使用する宿主に応じて選択される。そのような融合タ
ンパク質は、所望のタンパク質の分解の防止および精製
操作の促進に効果的であることがわかっている。融合タ
ンパク質中の融合相手として使用されている多数のポリ
ペプチドが記載されている。例えば、Ｈ．Ｍ．Ｓａｓｓ
ｅｎｆｅｌｄ，　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ　８　，８８−９３　（１９９０）　を参
照のこと。模範的なポリペプチドとしては、β−ガラク
トシダーゼ、プロテインＡおよびクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼが挙げられる。ほとんどの
場合そして明白な理由で（抗原性等）融合タンパク質は
そのままでは実際的な実用性がないので、発現および精
製後に所望のタンパク質から融合相手を除去することが
要求される（あるいは、融合タンパク質が別の異種タン
パク質であることができ、分離が２つの所望のタンパク
質をもたらす）。これは一般に、所望のタンパク質を融
合相手に連結しそして化学的または酵素的手段により選
択的に開裂させることができる開裂部位を含むリンカー
配列を用いて行うことができる。そのような開裂部位と
しては、例えば、臭化シアンの攻撃に感受性であるメチ
オニン残基、またはＬｙｓ　の後側でエンテロキナーゼ
により開裂されるテトラペプチド残基Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ　を含むポリペプチド鎖が挙げられる。 そのようなアミノ酸配列が所望のタンパク質の表面に存
在しなければならないことは明白である。融合相手の便
利な除去は最も重要な解決すべき課題であるので、融合
相手からの所望のタンパク質の穏和で且つ特異的な遊離
を可能にする代替方法への要望がある。そのような方法
を提供することが本発明の目的である。 【０００４】プロテアーゼ　ｙｓｃＦ（またはＫＥＸ２
によりコードされるエンドプロテアーゼ）およびペプチ
ダーゼ　ｙｓｃα（またはＫＥＸ１によりコードされる
カルボキシペプチダーゼ）は、酵母中での交配α因子前
駆体の成熟を招き、成熟α因子フェロモンを生ぜしめる
ことが同定されている。プロテアーゼ　ｙｓｃＦは、中
性ｐＨ域で活性でありそして完全にＣａ２＋イオン依存
性である膜結合エンドプロテアーゼである。カルボキシ
末端付近に、膜結合に関与することが同定されている疎
水性領域を有する。この膜結合性領域の除去は、未だ酵
素活性および特異性、すなわちＬｙｓ−Ａｒｇ　または
Ａｒｇ−Ａｒｇ　といった塩基性アミノ酸ペアのＣ末端
部位での開裂、を保持している可溶性　ｙｓｃＦ誘導体
をもたらす　Ｒ．Ｓ．Ｆｕｌｌｅｒ　ら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　８６，　１４３
４−１４３８（１９８９）　参照　　。他方、プロテア
ーゼ　ｙｓｃαは、６　〜７．５　のｐＨにおいてＣ末
端塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，　Ｌｙｓ）に対して非常に
活性である膜結合カルボキシペプチダーゼである。　ｙ
ｓｃＦと同様、　ｙｓｃαはＣ末端付近に疎水性膜結合
性セグメントを含む。この膜結合性領域の除去は、酵素
活性および特異性を保持している可溶性　ｙｓｃα誘導
体をもたらす　Ａ．Ｃｏｏｐｅｒ　およびＨ．Ｂｕｓｓ
ｅｙ，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．９，　２７０６
−２７１４（１９８９）　。適当に調製された融合タン
パク質の試験管内プロセシングによる成熟タンパク質の
製造にプロテアーゼ　ｙｓｃＦとｙｓｃ　αを組み合わ
せて有利に使用できることが発見された。 【０００５】 【課題を解決するための手段】従って、本発明は、生物
活性タンパク質の製造方法であって、 （１）　前記生物活性タンパク質から各々成る１または
複数の連続タンパク質セグメントであって、それのＣ末
端アミノ酸がリンカーポリペプチド配列Ｌに連結してお
り、Ｎ末端の１番目および２番目、そして複数の連続タ
ンパク質セグメントの場合には更に前記リンカーポリペ
プチド配列ＬのＣ末端の最後から２番目および最後のア
ミノ酸残基が　Ｌｙｓおよび　Ａｒｇから選択された塩
基性アミノ酸である、１または複数の連続タンパク質セ
グメント、および （２）　前記連続タンパク質セグメントのＣ末端アミノ
酸に連結しているポリペプチド　ｔａｇ、または（１）
　Ｎ末端アミノ酸に連結しているポリペプチド　ｔａｇ
、および （２）　リンカーポリペプチド配列Ｌから各々成る複数
の連続タンパク質セグメントであって、前記リンカーポ
リペプチド配列ＬのＮ末端の１番目および２番目並びに
Ｃ末端の最後から２番目および最後のアミノ酸残基が　
Ｌｙｓおよび　Ａｒｇから選択された塩基性アミノ酸で
あり、そして前記リンカーポリペプチド配列Ｌの最後の
塩基性アミノ酸が前記生物活性なタンパク質に連結して
いる、複数の連続タンパク質セグメント、から成る融合
タンパク質を、可溶性酵母エンドプロテアーゼ　ｙｓｃ
Ｆおよび可溶性酵母カルボキシペプチダーゼ　ｙｓｃα
で処理し、そして前記生物活性タンパク質を単離するこ
とを含んで成る方法に関する。 【０００６】融合タンパク質は下記式：（Ｐ−Ｌ）ｍ　
−Ｔ　　　　　　（Ｉ）　またはＴ−（Ｌ−Ｐ）ｎ　　
　　　（ＩＩ） （上式中、Ｐは生物活性タンパク質であり、Ｌは上記に
与えられた意味を有し、Ｔはポリペプチド　ｔａｇであ
り、ｍは１〜１０の整数であり、そしてｎは２〜１０の
整数である）により表すことができる。 【０００７】生物活性タンパク質は、生物学的に興味が
あり且つ原核生物または特に真核生物、特に高等真核生
物、例えば哺乳類（動物およびヒトを含む）起源の任意
のタンパク質であることができ、例えば、栄養素の生産
のためおよび化学もしくは分子生物学において酵素反応
を実施するために用いることができる酵素、またはヒト
もしは動物の病気の治療もしは予防に有用であり且つ有
効であるタンパク質、例えばホルモン、免疫活性調節性
、抗ウイルス性および抗腫瘍性を有するポリペプチド、
抗体、ウイルス抗原、血液凝固因子、繊維素溶解剤また
は成長調節因子、更には食料品等である。 【０００８】そのようなタンパク質の例としては、ホル
モン、例えばセクレチン、キモシン、レラキシン、カル
シトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、副腎
皮質刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、β−リ
ポトロピン、ウロガステロン、インスリン、増殖因子、
例えば表皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子
（ＩＧＦ）、例えばＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ、マ
スト細胞増殖因子、神経成長因子、グリア由来神経細胞
増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、または形
質転換増殖因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦβ、成長ホル
モン、例えばヒトもしくはウシ成長ホルモン、インター
ロイキン、例えばインターロイキン−１もしくは−２、
ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、インター
フェロン、例えばヒトα−インターフェロン、例えばイ
ンターフェロン−αＡ，αＢ，αＤもしくはαＦ、β−
インターフェロン、γ−インターフェロンまたはハイブ
リッドインターフェロン、例えばαＡ−αＤ−もしくは
αＢ−αＤ−ハイブリッドインターフェロン、特にハイ
ブリッドインターフェロンＢＤＢＢ、プロテイナーゼ阻
害剤、例えばα１　−抗トリプシン、ＳＬＰＩ等、肝炎
ウイルス抗原、例えばＢ型肝炎ウイルス表面もしくはコ
ア抗原またはＡ型肝炎ウイルス抗原、または非Ａ非Ｂ型
肝炎抗原、プラスミノーゲン活性化因子、例えば組織プ
ラスミノーゲン活性化因子もしくはウロキナーゼ、ハイ
ブリッドプラスミノーゲン活性化因子、例えばＫ２　ｔ
ｕＰＡ、マダニ抗凝固ペプチド（ＴＡＰ）、腫瘍壊死因
子、ソマトスタチン、レニン、免疫グロブリン、例えば
免疫グロブリンＤ，ＥもしくはＧの軽鎖および／または
重鎖、またはヒト−マウスハイブリッド免疫グロブリン
、免疫グロブリン結合因子、例えば免疫グロブリンＥ結
合因子、ヒトカルシトニン関連ペプチド、血液凝固因子
、例えば第ＩＸもしくはＶＩＩＩｃ　因子、血小板因子
４、エリトロポイエチン、エグリン、例えばエグリンＣ
、デスルフェートヒルジン、例えばデスルフェートヒル
ジン変種ＨＶ１，ＨＶ２もしくはＰＡ、コルチコスタチ
ン、エキスタチン、シスタチン、ヒトスーパーオキシド
ジスムターゼ、ウイルスチミジンキナーゼ、β−ラクタ
マーゼまたはグルコースイソメラーゼが挙げられる。好
ましい遺伝子は、ヒトα−インターフェロン、例えばイ
ンターフェロンαＢまたはハイブリッドインターフェロ
ン、特にハイブリッドインターフェロンＢＤＢＢ（ＥＰ
　２０５，４０４参照）、ヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子（ｔ−ＰＡ）、ヒト一本鎖ウロキナーゼ型プラ
スミノーゲン活性化因子（ｓｃｕ−ＰＡ）　、ハイブリ
ッドプラスミノーゲン活性化因子Ｋ２　ｔｕＰＡ（ＥＰ
　２７７，３１３参照）、形質転換増殖因子β、ヒトカ
ルシトニン、インスリン様増殖因子ＩもしくはＩＩ、お
よびデスルフェートヒルジン、例えば変種ＨＶ１をコー
ドする遺伝子である。タンパク質表面に暴露されており
従ってタンパク質分解的開裂を受けることができる塩基
性アミノ酸ペア、例えばＡｒｇ−Ａｒｇ，　Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ，　Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　およびＡｒｇ−Ｌｙｓ　を含
むタンパク質は、本発明の方法に適さないので、生物活
性に影響を及ぼすことなく連続する塩基性アミノ酸のう
ちの１つが別の非塩基性アミノ酸に置き換わるように変
更しなければならない。生物活性にとって不可欠である
Ｃ末端塩基性アミノ酸を有するタンパク質は、そのよう
なタンパク質のＣ末端に追加の非塩基性保護アミノ酸を
付加しない限り、本発明の方法により製造することがで
きない（この塩基性アミノ酸が可溶性　ｙｓｃαにより
除去されるため）。 【０００９】リンカーポリペプチド配列Ｌは、２〜約２
０、特に２〜１２個のアミノ酸残基を含んで成り、そし
て１または複数、特に１〜５個の塩基性アミノ酸ペア、
例えばＡｒｇ−Ａｒｇ，　Ｌｙｓ−Ａｒｇ，　Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ　またはＡｒｇ−Ｌｙｓ　を含み、ただし式Ｉ（
ｍ＞１）およびＩＩの化合物では、Ｎ末端の１番目およ
び２番目並びにＣ末端の最後から２番目および最後のア
ミノ酸残基がそのような塩基性アミノ酸ペアを表し、一
方式Ｉ（ｍ＝１）の化合物では、単にＮ末端の１番目お
よび２番目のアミノ酸残基がそのような塩基性アミノ酸
ペアを表すことを前提とする。個々の塩基性アミノ酸ペ
アを連結しそして／または塩基性アミノ酸残基ペアをポ
リペプチド　ｔａｇに結合している（ｍ＝１を有する式
Ｉの化合物を参照）アミノ酸残基の選択は重要でない。 例えば、遺伝子的にコードされる中性アミノ酸のいずれ
かをこの目的で選択することができる。最も単純なリン
カーポリペプチド配列Ｌは、Ａｒｇ−Ａｒｇ，　Ｌｙｓ
−Ａｒｇ，　Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　およびＡｒｇ−Ｌｙｓ　
から選択されたジペプチド残基である。 【００１０】小または中サイズの生物活性タンパク質の
延長は安定性に好ましい影響を有するので、ポリペプチ
ドｔａｇ　Ｔは、理論上、想像できる任意の合成ポリペ
プチドまたは任意の天然ポリペプチドもしくはその部分
であることができる。好ましくは、ポリペプチドｔａｇ
　Ｔは、約１０〜約１０００、特に３０〜３００　のア
ミノ酸残基から成り、そして融合タンパク質の発現に使
用される宿主において良好に発現される全長ポリペプチ
ド（下記参照）またはその部分を表す。精製を容易にす
ることが主目的であるならば、アフィニティークロマト
グラフィーしやすいポリペプチドｔａｇ　（例えば、ポ
リペプチドｔａｇ　が入手可能なモノクローナルもしく
はポリクローナル抗体により認識されるか、またはセル
ロースのような特定物質に結合される）またはイオン交
換クロマトグラフィーしやすいポリペプチドｔａｇ　（
ポリペプチドｔａｇ　が多数の酸性または塩基性アミノ
酸残基を含む）を使用することが好ましい。そのような
ポリペプチドｔａｇ　の例としては、例えば特に酵母を
宿主として使用する時は酵母酸ホスファターゼＰＨ０５
、酵母インベルターゼまたは酵母カルボキシペプチダー
ゼＹ、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）　を宿主として使用
する時はＭＳ２ファージのポリメラーゼ、β−ガラクト
シダーゼまたは大腸菌酸ホスファターゼ、特に哺乳動物
宿主細胞を使用する時はネオマイシン、ホスホトランス
フェラーゼ、デヒドロ葉酸レダクターゼ、免疫グロブリ
ンまたはレクチン、更にはデスルフェートヒルジン、エ
グリンＣ、キモシン、インターロイキンＩ、セルロモナ
ス・フィミ　（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　　ｆｉｍｉ
）　の　Ｅｘｇタンパク質等が挙げられ、それらのポリ
ペプチドの断片を使用することも可能である。 【００１１】好ましくは、ｍは１〜５の整数であり、そ
してｎは２〜５の整数である。 【００１２】可溶性酵母エンドプロテアーゼ　ｙｓｃＦ
および酵母カルボキシペプチダーゼ　ｙｓｃαは、疎水
性膜結合部位が除去されている　ｙｓｃＦおよび　ｙｓ
ｃαの変異体である。８１４　残基のプロテアーゼ　ｙ
ｓｃＦのアミノ酸配列はＫ．Ｍｉｚｕｎｏら　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．　１
５６，　２４６−２５４（１９８８）　から既知である
。膜結合部位は領域Ｔｙｒ６７９〜Ｍｅｔ６９９に位置
する。本発明の可溶性　ｙｓｃＦエンドプロテアーゼで
は、膜結合部位が選択的に除去されており、よって例え
ば７００位のアミノ酸（Ｌｙｓ）　で始まるＣ末端がま
だ存在しているか、または膜結合部位を含む全Ｃ末端、
即ちＣ末端から１３６　〜約２００　個のアミノ酸が除
去されている。そのような可溶性　ｙｓｃＦ欠失変異体
は、例えばＥＰ　３２７，３７７またはＲ．Ｓ．Ｆｕｌ
ｌｅｒら（前掲）において記載されている。７２９　残
基のペプチダーゼ　ｙｓｃαも同様に既知である　Ａ．
Ｄｍｏｃｈｏｗｓｋａ　ら，Ｃｅｌｌ　５０，　５７３
−５８４　（１９８７）　　。膜結合部位は領域Ａｌａ
６１９〜Ｔｙｒ６３７に位置する。上記と同様、本発明
の可溶性　ｙｓｃαカルボキシペプチダーゼでは、膜結
合部位が選択的に除去されており、よって例えばアミノ
酸６３８（Ａｓｐ）で始まるＣ末端がそのまま残ってい
るか、または膜結合部位を含む全Ｃ末端、即ちＣ末端か
ら　９３　〜約１１０　個のアミノ酸が除去されている
。そのような可溶性　ｙｓｃαカルボキシペプチダーゼ
変異体は、Ａ．ＣｏｏｐｅｒおよびＨ．Ｂｕｓｓｅｙ（
前掲）により記載されている。本発明の好ましい可溶性
　ｙｓｃＦエンドプロテアーゼは配列表中の配列番号１
のもとに記載された配列を有し、本発明の好ましい可溶
性　ｙｓｃαカルボキシペプチダーゼは配列表中の配列
番号２のもとに記載された配列を有する。 【００１３】可溶性　ｙｓｃＦおよび可溶性　ｙｓｃα
による融合タンパク質の消化は、　ｙｓｃＦおよび　ｙ
ｓｃαが最も良く作用することが知られている条件を使
って、即ち約６．０　〜約７．５　、好ましくは約７．
０　のｐＨの緩衝液中で、約２５℃〜約３７℃の温度範
囲でそして約１〜４時間、好ましくはＨＰＬＣ対照によ
り評価して消化が完了するまで、行われる。　ｙｓｃＦ
は強力にＣａ２＋イオン依存性であるので、カルシウム
塩、例えば塩化カルシウムが消化混合物に添加される。 融合タンパク質：可溶性　ｙｓｃＦ：可溶性　ｙｓｃα
のモル比は１：１：１〜１０４　：１：１の範囲内であ
る。Ｃａ２＋イオンのモル濃度は０．１　ｍＭ〜１０　
ｍＭ　の範囲内である。所望により、　ｙｓｃＦがそれ
により活性化されることが知られているので、低濃度（
＜１％）の非イオン性洗剤、例えばＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−
１００を混合物に添加してもよい。 融合タンパク質は、可溶性　ｙｓｃＦと可溶性　ｙｓｃ
αの両方を含む消化混合物で処理することができ、また
は可溶性　ｙｓｃＦでまず処理し、そして消化が十分に
進行したかまたは完了した時、好ましくはその場で、即
ち最初の消化段階の生成物を単離することなく、直ちに
可溶性　ｙｓｃαで処理することができる。 【００１４】生物活性タンパク質は、常用手段を使って
消化混合物から単離することができる。適当な精製段階
は、例えば、脱塩、クロマトグラフィー方法、例えばイ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、分配クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬ
Ｃ、ゲル電気泳動、無担体電気泳動、アフィニティーク
ロマトグラフィー、例えば不溶性マトリックスに結合さ
せたモノクローナル抗体を用いたアフィニティークロマ
トグラフィー等、またはそれらのいずれかの組合せを含
む。 【００１５】例えばジスルフィド結合（システイン残基
が存在する場合）の不正な形成のため、所望のタンパク
質が正しい三次元構造を取らない場合、それを変性形態
に維持するのに適当である条件下でそれを可溶化し、次
いでジスルフィド結合（システイン残基が存在する場合
）の同時カップリングによりそれを再生することが必要
であるかもしれない。多数のタンパク質について適当な
方法が知られている。そうでなければ、当業界で既知の
方法を遭遇する特定の課題に適合させることが必要であ
る。 【００１６】上記に言及したように、幾つかの可溶性　
ｙｓｃＦおよび　ｙｓｃα欠失変異体が文献から既知で
ある。本発明の他の欠失変異体は、当業界で既知の方法
、例えば前記変異体をコードする対応するＤＮＡを調製
し、それを発現調節配列の支配下において適当なベクタ
ーＤＮＡに挿入し、形成された発現ベクターを用いて適
当な宿主微生物を形質転換せしめ、形質転換された宿主
微生物を適当な培地中で培養し、そして生産された変異
体を単離することにより調製することができる。前記変
異体のいずれかをコードするＤＮＡは、例えば、ｙｓｃ
Ｆ（ＫＥＸ２）または　ｙｓｃα（ＫＥＸ１）をコード
するＤＮＡを含むプラスミドを取り、そして（１）　そ
れを、膜結合部位をコードするＤＮＡ領域の内部または
３′を開裂する制限酵素（例えば、ＫＥＸ２の場合には
ＥｃｏＲＩ，　ＢｓｔＸＩまたはＮａｒＩ、そしてＫＥ
Ｘ１の場合にはＨｇｉＡＩ，　ＴａｑＩＩまたはＣｌａ
Ｉ）で消化し、開裂されたＤＮＡを適当なエンドヌクレ
アーゼ、例えばＢａｌ３１　で消化し、前記ＤＮＡ領域
を除去しそして平滑末端連結等により線状プラスミドを
再環化せしめ；または（２）　膜結合部位をコードする
ＤＮＡの５′側に１制限部位そして３′側に１制限部位
を選択または造成し（例えば部位特異的突然変異誘発に
より）（例えばＫＥＸ２の場合にはＰｖｕＩＩ　とＮａ
ｒＩまたはＥｃｏＲＩ　、そしてＫＥＸ１の場合にはＸ
ｈｏＩ，　ＳｔｕＩまたはＸｃａＩ；ここで前記３′制
限部位はＫＥＸ２またはＫＥＸ１遺伝子の翻訳終結シグ
ナルに隣接するプラスミドＤＮＡ内に存在してもよい）
、前記制限部位を認識する制限酵素で該プラスミドを消
化し、そして線状プラスミドを平滑末端連結等により再
環化せしめ；または（３）ループ形成突然変異誘発によ
り膜結合部位をコードするＤＮＡ領域を除去し；または
（４）　ＫＥＸ２の場合にはＰｖｕＩＩ　でそしてＫＥ
Ｘ１の場合にはＸｈｏＩ，　ＳｔｕＩまたはＳｃｉＩで
それぞれ消化し、そして平滑末端連結等により再環化せ
しめることによりＣ末端を削除する、ことにより作製す
ることができる。ＫＥＸ２およびＫＥＸ１のＤＮＡ配列
が既知であるので（Ｋ．Ｍｉｚｕｎｏ　ら、Ａ．Ｄｍｏ
ｃｈｏｗｓｋａら、前掲）　、適当な変異原性オリゴヌ
クレオチドを容易に考案し、そしてＭ１３クローニング
系を適用して前記ＤＮＡ領域を削除するのに用いること
ができる。突然変異させたＫＥＸ２またはＫＥＸ１遺伝
子が翻訳終結シグナル（ＴＡＡ，　ＴＡＧまたはＴＧＡ
）を含むことに注意を払わなければならない。必要であ
れば、合成リンカーＤＮＡによりそのような終結シグナ
ルを所望の位置に導入することができ、または隣接ベク
ターＤＮＡによりそれを提供することができる。従って
、突然変異させたＫＥＸ２またはＫＥＸ１遺伝子は、可
溶性　ｙｓｃＦおよび　ｙｓｃα変異体のＣ末端の少数
（例えば２〜２０個）の追加のアミノ酸をコードするベ
クターＤＮＡに由来するコドンをそれらの３′末端に含
むことができる。 それらの方法は全て常法を利用する。 【００１７】融合タンパク質の調製 本発明の融合タンパク質は、形質転換された宿主を融合
タンパク質の発現を許容する条件下で培養し、そして融
合タンパク質を単離することを含む組換えＤＮＡ技術に
より調製することができる。より詳しくは、所望の化合
物は、 ａ）前記融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む
発現カセットを含んで成る発現ベクターを提供し、ｂ）
前記発現ベクターを受容体宿主中に移入し、ｃ）融合タ
ンパク質の発現を許容する条件下で形質転換宿主を培養
し、そして ｄ）融合タンパク質を単離する、 ことにより生産される。組換えＤＮＡ技術による融合タ
ンパク質の調製に含まれる段階は、更に詳細に後述され
るだろう。 【００１８】発現ベクター 本発明は、 （１）　前記生物活性タンパク質から各々成る１または
複数の連続タンパク質セグメントであって、それのＣ末
端アミノ酸がリンカーポリペプチド配列Ｌに連結してお
り、Ｎ末端の１番目および２番目、そして複数の連続タ
ンパク質セグメントの場合には更に前記リンカーポリペ
プチド配列ＬのＣ末端の最後から２番目および最後のア
ミノ酸残基が　Ｌｙｓおよび　Ａｒｇから選択された塩
基性アミノ酸である、１または複数の連続タンパク質セ
グメント、および （２）　前記連続タンパク質セグメントのＣ末端アミノ
酸に連結しているポリペプチド　ｔａｇ、または（１）
　Ｎ末端アミノ酸に連結しているポリペプチド　ｔａｇ
、および （２）　リンカーポリペプチド配列Ｌから各々成る複数
の連続タンパク質セグメントであって、前記リンカーポ
リペプチド配列ＬのＮ末端の１番目および２番目並びに
Ｃ末端の最後から２番目および最後のアミノ酸残基が　
Ｌｙｓおよび　Ａｒｇから選択された塩基性アミノ酸で
あり、そして前記リンカーポリペプチド配列Ｌの最後の
塩基性アミノ酸が前記生物活性なタンパク質に連結して
いる、複数の連続タンパク質セグメント、から成る融合
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセット
を含んで成る発現ベクター並びにその調製方法に関する
。 【００１９】発現カセットは、式： Ｐｒ−Ｓ−（ＤＰ　−ＤＬ　−ＤＴ　）ｍ　−Ｔ　　　
　（ＩＩＩ）（上式中、Ｐｒは発現調節配列であり、Ｓ
は結合であるかまたはシグナルペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を表し、ＤＰ　は生物活性タンパク質をコード
するＤＮＡ配列を表し、ＤＬ　はリンカーポリペプチド
ＬをコードするＤＮＡ配列であり、ここでＤＰ　の３′
末端に隣接した１番目および２番目のコドン、そしてｍ
が１でない時には更にＤＴ　の５′末端に隣接した最後
から２番目および１番目のコドンはＬｙｓ　およびＡｒ
ｇ　から選択された塩基性アミノ酸をコードし、ＤＴ　
はポリペプチドｔａｇ　をコードするＤＮＡ配列を表し
、そしてＴは転写終結シグナルを含むＤＮＡ配列を表し
、ここでＳ，ＤＰ　，ＤＬ　およびＤＴ　は同じ読み枠
内にあり、そしてｍは１〜１０の整数である）または式
： Ｐｒ−Ｓ−（ＤＴ　−ＤＬ　−ＤＰ　）ｎ　−Ｔ　　　
　（ＩＶ）　（上式中、Ｐｒ，Ｓ，ＤＴ　，ＤＬ　，Ｄ
Ｐ　およびＴは上記に与えられた意味を有し、そしてＳ
，ＤＴ　，ＤＬ　およびＤＰ　は同じ読み枠内にあり、
そしてｎは２〜２０の整数である）により表すことがで
きる。 【００２０】ＳがシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
配列を表す構成物が好ましい。 【００２１】ベクターは、形質転換をもくろむ宿主細胞
に依存して選択される。理論上は、選択した宿主中で本
発明の遺伝子を複製および発現する全てのベクターが適
当である。適当な宿主の例は、制限酵素または修飾酵素
を欠くかまたは乏しく且つｙｓＦまたはｙｓＦ関連活性
を欠く原核生物および真核生物、例えば細菌、例えばエ
シェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
）またはバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ　）、酵母、例えばサッカロミセス・セ
レビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）、特にｋｅｘ２変異体、および更には哺乳
動物細胞、とくに確立されたヒトまたは動物細胞系、例
えばミエローマ細胞、ヒト胚芽肺繊維芽細胞　Ｌ−１３
２、マウスＬＴＫ細胞、ヒト悪性メラノーマＢｏｗｅｓ
　細胞、ＨｅＬａ細胞、アフリカミドリザルＣＯＳ−７
　のＳＶ−４０　ウイルス形質転換腎細胞またはチャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）　細胞、並びにそれら
の変種である。チャイニーズハムスター卵巣細胞並びに
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）およびサッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株が、宿主
微生物として好ましい。 【００２２】酵母および大腸菌中で使用されるベクター
大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ　）株中での融合タンパク質の
発現に適当であるベクターの例は、バクテリオファージ
、例えばバクテリオファージλの誘導体、またはプラス
ミド、例えばプラスミドｃｏｌＥ１　およびその誘導体
、例えばｐＭＢ９，　ｐＳＦ２１２４，　ｐＢＲ３１７
　またはｐＢＲ３２２である。適当なベクターは、完全
なレプリコンおよびマーカー遺伝子を含有する。マーカ
ー遺伝子は発現プラスミドにより形質転換された微生物
の表現型特徴による選択および同定を可能にする。適当
なマーカー遺伝子は、例えば重金属、抗生物質、例えば
アンピシリンまたはテトラサイクリン等に対する耐性を
微生物に付与する。 【００２３】大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ　）中で発現カセ
ットを調節するのに幾つかの発現調節配列Ｐｒを使用す
ることができる。特に強力に発現される遺伝子のプロモ
ーターが使用される。適当なプロモーターは、ｌａｃ，
　ｔａｃ，　ｔｒｐ　およびｌｐｐ　プロモーター、更
にファージλＮまたはファージλｐＬプロモーター等で
ある。本発明において、大腸菌中での使用に好ましいプ
ロモーターはλｐＬ，　ｔｒｐ　およびｌａｃ　プロモ
ーターである。 【００２４】Ｓ．セレビシェー（Ｓ．　　ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）中での複製および発現に適当なベクターは、
酵母複製開始点および酵母のための選択的遺伝標識形質
を含有する。酵母複製開始点、例えば染色体自己複製配
列（ＡＲＳ）を含むハイブリッドベクターは、形質転換
後に酵母細胞中に染色体外的に維持され、そして有糸分
裂中に自律的に複製される。また、酵母２μプラスミド
ＤＮＡに相同の配列を含むか、またはＡＲＳと染色体動
原体の配列、例えばＣＥＮ４を含むハイブリッドベクタ
ーを使用することができる。酵母のための適当なマーカ
ー遺伝子は、特に宿主に抗生物質耐性を付与する遺伝子
、または栄養素要求性酵母突然変異体の場合には宿主の
損傷を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は、例え
ば抗生物質シクロヘキシミドに対する耐性を付与するか
または栄養素要求性酵母突然変異体における原栄養性に
備え、例えばＵＲＡ３，　ＬＥＵ２，　ＨＩＳ３または
ＴＲＰＩ遺伝子である。 【００２５】好ましくは、酵母ハイブリッドベクターは
、該ハイブリッドベクターおよびその前駆体の作製およ
びクローニングが大腸菌中で実施できるように、細菌宿
主、特に大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ　）のための複製開始
点およびマーカー遺伝子を更に含有する。酵母中での発
現に適当な発現調節配列Ｐｒは、例えば、ＣＹＣ１，　
ＧＡＬ１／１０　またはＰＨ０５遺伝子のもの、および
グリコリシスに関与するプロモーター、例えば　ＰＧＫ
またはＧＡＰ　（５′端が切り取られたＧＡＰ　を含む
）　プロモーター、更にはα因子プロモーターおよびハ
イブリッドプロモーター、例えばＰＨ０５−ＧＡＰ　プ
ロモーターである。 【００２６】シグナルペプチドＳをコードするＤＮＡ配
列（「シグナル配列」）は、通常に分泌されるポリペプ
チドをコードする微生物宿主の遺伝子から誘導される。 大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ　）を宿主微生物として使用す
る時、ｏｍｐＡ、ｌｐｐ　、マルトース結合タンパク質
、λレセプター、酸ホスファターゼまたはβ−ラクタマ
ーゼシグナル配列を選択することができる。酵母中での
使用に適当なシグナル配列Ｓは、例えば、酵母インベル
ターゼ、フェロモンペプチダーゼ（ＫＥＸ１）、「キラ
ー毒素」並びに抑制性酸ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺
伝子のシグナルおよびプレプロ配列、α因子リーダー配
列およびアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ　）由来のグルコアミラーゼシ
グナル配列である。あるいは、使用するプロモーターに
天然に連結した遺伝子（例えばＰＨ０５）のシグナル配
列（もしあれば）の一部分を、生物活性タンパク質のシ
グナル配列（もしあれば）の一部分と連結せしめること
により、融合シグナル配列を作製することができる。 それらの組合せは、シグナルペプチドと融合タンパク質
アミノ酸配列との間の正確な開裂を可能にするのに有利
である。 【００２７】転写終結シグナルＴを含むＤＮＡ配列は、
好ましくは転写終結のための適切なシグナルを含む選択
された微生物宿主由来の遺伝子の３′フランキング配列
である。適当な３′フランキング配列は、例えば、使用
するプロモーターに天然に連結した遺伝子のものである
。 【００２８】哺乳動物細胞において使用されるベクター
哺乳動物細胞中での複製および発現のためのベクターに
は、しばしばウイルス起源、例えばシミアンウイルス４
０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデ
ノウイルス２、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）、パポバ
ウイルスＢＫ変異体（ＢＫＶ）、またはマウスもしくは
ヒトシトメガロウイルス（それぞれＭＣＭＶおよびＨＣ
ＭＶ）由来のＤＮＡが提供される。 【００２９】哺乳動物細胞における使用に適する発現調
節配列Ｐｒとしては、特に、ＳＶ４０の初期および後期
プロモーター、アデノウイルスの主要後期プロモーター
、マウスメタロチオネイン遺伝子のプロモーターおよび
マウスまたはヒトシトメガロウイルス主要最初期遺伝子
のエンハンサー−プロモーター領域、ヒト免疫グロブリ
ンエンハンサー−プロモーター領域、所望によりＳＶ４
０エンハンサーと組み合わされることがあるヒトα−グ
ロビンプロモーター、および熱ショック遺伝子由来のプ
ロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞において使用さ
れるシグナル配列Ｓは、例えば、インフルエンザ血球凝
集素、ヒトｔ−ＰＡおよびプレプロ−インスリン由来の
シグナル配列である。 【００３０】哺乳動物細胞に適当なマーカー遺伝子は、
例えば、それぞれ抗生物質Ｇ４１８およびブレオマイシ
ン型抗生物質に対する耐性を付与するトランスポゾンＴ
ｎ５　からのｎｅｏ　およびｂｌｅ　遺伝子、大腸菌ヒ
グロマイシンＢ耐性遺伝子、ＤＨＦＲ−　細胞の表現型
をＤＨＦＲ＋　細胞に変えそして／またはメトトレキセ
ートに対する耐性を付与する哺乳動物細胞または大腸菌
由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）、
並びにＴＫ−　細胞を表現型的にＴＫ＋　細胞にする単
純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子である。 【００３１】好ましくは、哺乳動物細胞のためのハイブ
リッドベクターは、正しい転写終結およびポリアデニル
化のためのシグナルを含む哺乳動物遺伝子の３′非翻訳
領域（Ｔ）、例えばβ−グロビン遺伝子の３′フランキ
ング領域を含む。有利には、ポリペプチコード領域に隣
接する領域は、それらの末端に適当なスプライシングシ
グナルを有する１または複数の生来のイントロンを含む
。そのような付加は、通常そのような転写およびプロセ
シングシグナルを欠くｃＤＮＡおよび原核生物ＤＮＡ、
例えば上記の選択遺伝子の時に必要であると思われる。 【００３２】好ましくは、そのようなベクターは、大腸
菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）中での繁殖のために複製開始点お
よび抗生物質耐性遺伝子を含む。哺乳動物の複製開始点
は、ベクター構成物中に真核生物起源、例えばＳＶ４０
もしくは他のウイルス起源を含めることにより、または
宿主細胞染色体中へのベクターの組み込みによる宿主細
胞染色体により、提供することができる。 【００３３】生物活性タンパク質およびポリペプチドｔ
ａｇ　をコードするＤＮＡ配列ＤＰ　およびＤＴ　は既
知であるか、または未知であれば、既知のアミノ酸配列
から推定し、そしてそれ自体既知の方法を適用して合成
的に製造することができる。リンカーポリペプチドＬを
コードするＤＮＡ配列ＤＬ　は、好ましくは上記に明記
した塩基性アミノ酸ペアを含む合成ＤＮＡ配列であり、
常法を使って合成的に調製される。 【００３４】本発明の発現カセットにおいて、コード配
列Ｓ，ＤＰ　，ＤＬ　およびＤＴ　は、５′末端がＡＴ
Ｇで始まりそして３末端が翻訳終結シグナル（ＴＡＡ，
ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わる中断されない１つの読み
枠において一緒に結合される。コード配列Ｓ−（ＤＰ　
−ＤＬ　−ＤＴ　）ｍ　およびＳ−（ＤＴ　−ＤＬ　−
ＤＰ　）ｎ　は、発現調節配列Ｐｒに作用可能に連結さ
れる。 【００３５】本発明の発現カセットは、常用の連結技術
を適用する当業界で既知の方法により、例えば、（予め
調製した）発現カセットをそのままでまたは発現カセッ
トの成分を予め決められた順序で連続的にベクターＤＮ
Ａに連結せしめることにより、調製することができる。 発現カセットの成分は、常用の制限部位を通しておよび
／または合成ＤＮＡリンカー分子を用いておよび／また
は平滑末端連結により連結される。 【００３６】形質転換宿主 本発明の別の観点は、（１）　前記生物活性タンパク質
から各々成る１または複数の連続タンパク質セグメント
であって、それのＣ末端アミノ酸がリンカーポリペプチ
ド配列Ｌに連結しており、Ｎ末端の１番目および２番目
、そして複数の連続タンパク質セグメントの場合には更
に前記リンカーポリペプチド配列ＬのＣ末端の最後から
２番目および最後のアミノ酸残基が　Ｌｙｓおよび　Ａ
ｒｇから選択された塩基性アミノ酸である、１または複
数の連続タンパク質セグメント、および（２）　前記連
続タンパク質セグメントのＣ末端アミノ酸に連結してい
るポリペプチド　ｔａｇ、または（１）　Ｎ末端アミノ
酸に連結しているポリペプチド　ｔａｇ、および（２）
　リンカーポリペプチド配列Ｌから各々成る複数の連続
タンパク質セグメントであって、前記リンカーポリペプ
チド配列ＬのＮ末端の１番目および２番目並びにＣ末端
の最後から２番目および最後のアミノ酸残基が　Ｌｙｓ
および　Ａｒｇから選択された塩基性アミノ酸であり、
そして前記リンカーポリペプチド配列Ｌの最後の塩基性
アミノ酸が前記生物活性なタンパク質に連結している複
数の連続タンパク質セグメント、から成る融合タンパク
質をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットを含んで
成る発現ベクターにより形質転換された宿主細胞、並び
にその調製方法を包含する。 【００３７】原核生物および真核生物宿主を含む適当な
宿主の例は、上記に明記したものである。形質転換され
た宿主細胞の調製方法は、上記の発現ベクターを用いて
宿主細胞を形質転換せしめることを含んで成る。 【００３８】真核宿主細胞の形質転換は当業界で既知の
方法により達成される。例えば、ハイブリッドベクター
を用いた酵母の形質転換は、Ｈｉｎｎｅｎら　Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５，１９１
９（１９７８）　により記載された方法に従って達成さ
れる。この方法は、次の３段階に分けることができる： （１）　酵母細胞壁またはその一部分の除去。 （２）　ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）　およびＣ
ａ２＋イオンの存在下における発現ベクターでの「裸の
」酵母細胞（スフェロプラスト）の処理。 （３）　細胞壁の再生および固体寒天層中での形質転換
細胞の選択。 【００３９】哺乳動物細胞中への発現ベクターの導入は
、ヘルパー化合物、例えばジエチルアミノエチルデキス
トラン、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ポリエ
チレングリコール等の存在下でのトランスフェクション
により、またはベクターＤＮＡとリン酸カルシウムの共
沈物として、行われる。更に適当な方法としては、細胞
核中へのベクターＤＮＡの直接導入、およびエレクトロ
ポレーション、即ち細胞膜の透過性を増加させる短い電
気パルスによるＤＮＡの導入が挙げられる。その後のト
ランスフェクエトされた細胞の選択は、発現ベクター中
に共有結合的に組み込まれるかまたは別々の存在として
添加される選択マーカーを使って行うことができる。 選択マーカーとしては、抗生物質に対する耐性を付与す
る遺伝子または宿主細胞の遺伝的損傷を補完する遺伝子
が挙げられる（前掲）。 【００４０】本発明の発現ベクターを用いた細菌宿主株
の形質転換は、例えば、Ｂ．　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　　Ａ
ｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓら，　Ｊ．　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ，　８１，　７４１（１９６１）　およびＥ．
　ｃｏｌｉ　　Ｍ．Ｍａｎｄｅｌ　ら，　Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ，　５３，　１５９（１９７０）　の文献に記
載されたようにして行われる。形質転換宿主細胞の単離
は、例えば、発現プラスミド中に含まれるマーカー遺伝
子が耐性を付与する殺生剤が添加されている選択栄養培
地から有利に行われる。例えば、ハイブリッドベクター
が　ａｍｐＲ　遺伝子を含む場合、それに応じてアンピ
シリンが栄養培地に添加される。ハイブリッドベクター
を含まない細胞はそのような培地中で駆除される。 【００４１】形質転換宿主細胞の培養 本発明は、更に、（１）　前記生物活性タンパク質から
各々成る１または複数の連続タンパク質セグメントであ
って、それのＣ末端アミノ酸がリンカーポリペプチド配
列Ｌに連結しており、Ｎ末端の１番目および２番目、そ
して複数の連続タンパク質セグメントの場合には更に前
記リンカーポリペプチド配列ＬのＣ末端の最後から２番
目および最後のアミノ酸残基が　Ｌｙｓおよび　Ａｒｇ
から選択された塩基性アミノ酸である、１または複数の
連続タンパク質セグメント、および（２）　前記連続タ
ンパク質セグメントのＣ末端アミノ酸に連結しているポ
リペプチド　ｔａｇ、または（１）　Ｎ末端アミノ酸に
連結しているポリペプチド　ｔａｇ、および（２）　リ
ンカーポリペプチド配列Ｌから各々成る複数の連続タン
パク質セグメントであって、前記リンカーポリペプチド
配列ＬのＮ末端の１番目および２番目並びにＣ末端の最
後から２番目および最後のアミノ酸残基が　Ｌｙｓおよ
び　Ａｒｇから選択された塩基性アミノ酸であり、そし
て前記リンカーポリペプチド配列Ｌの最後の塩基性アミ
ノ酸が前記生物活性なタンパク質に連結している複数の
連続タンパク質セグメント、から成る融合タンパク質の
製造方法であって、前記融合タンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列を含んで成る発現ベクターを含有する形質転換
宿主細胞を、適当な栄養条件下で培養し、そして前記融
合タンパク質を単離することを含んで成る方法に関する
。 【００４２】形質転換された宿主細胞は、同化可能な炭
素源、窒素源および無機塩類を含有する液体培地中で、
当業界で既知の方法により培養される。本発明に従って
形質転換された大腸菌および酵母細胞の培養に様々な炭
素源を使用することができる。好ましい炭素源の例は、
同化可能な炭水化物、例えばグルコース、マルトース、
マンニトールもしくはラクトース、またはアセテートで
あり、これらは単独でも適当な混合物においても使用す
ることができる。適当な窒素源の例は、アミノ酸、例え
ばカザミノ酸、ペプチドおよびタンパク質並びにそれら
の分解生成物、例えばトリプトン、ペプトンまたは肉エ
キス、更には酵母エキス、麦芽エキス、並びにアンモニ
ウム塩、例えば塩化、硫酸または硝酸アンモニウムが挙
げられ、これらは単独でも適当な混合物でも使用するこ
とができる。使用することができる無機塩類は、例えば
、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウ
ムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩および炭酸塩である。 培地は、例えば増殖促進物質、例えば微量元素、例えば
鉄、亜鉛、マンガン等；および好ましくは選択圧力を及
ぼしそして発現プラスミドを失った細胞の増殖を防ぐ物
質を更に含有する。例えば、例えば必須アミノ酸につい
て栄養素要求性である酵母株が宿主細胞として使用され
る場合、プラスミドは好ましくは宿主の欠損を補完する
酵素をコードする遺伝子を含む。酵母株の培養は前記ア
ミノ酸が不足した最少培地中で行われる。 【００４３】培養は当業界で既知である方法によって行
われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ値および培
養時間は、本発明の融合タンパク質の最大力価か得られ
るように選択される。酵母株は、約２０〜４０℃、好ま
しくは約３０℃の温度、および約５〜８のｐＨ値、好ま
しくは約ｐＨ７において、約４〜３０時間、好ましくは
本発明のタンパク質の最大収量に達するまで、振盪また
は攪拌しながら浸漬培養により、好気条件下で培養され
る。哺乳動物細胞は、所望により増殖促進物質および／
または哺乳動物血清が補足された市販の培地を使って、
組織培養条件下で培養される。細胞は、固体支持体、例
えば微小担体または多孔質ガラス繊維に付着させて、ま
たは適当な培養容器中に自由浮遊させて増殖させる。培
地は、選択圧力を及ぼしそして遺伝標識形質を有するハ
イブリッドベクターＤＮＡをまだ含んでいる細胞のみが
生き残るようにして選択される。例えば、ハイブリッド
ベクターが抗生物質耐性遺伝子を含む時、対応する抗生
物質が培地に添加される。 【００４４】細胞密度が十分な値に達した時、培養を中
断しそしてタンパク質を単離する。発現カセットがシグ
ナル配列を含むならば、所望の融合タンパク質は培地中
に分泌され得る。生成物を含有する培地を細胞から分離
し、これに新鮮な培地を供給しそして連続生産に使うこ
とができる。酵母細胞または大腸菌細胞が使用される時
、タンパク質が細胞内、特に細胞周辺腔内にも蓄積し得
る。後者の場合、融合タンパク質の回収のための第一段
階は、細胞内部からタンパク質を遊離させることを含ん
で成る。まずグルコシダーゼでの酵素消化により細胞壁
を除去し（前掲）、あるいは化学的薬剤、例えばチオー
ル試薬もしくはＥＤＴＡでの処理により細胞壁をまず除
去し、これは細胞壁の損傷を引き起こし、生産されたタ
ンパク質の放出を可能にする。生じた混合物を常用手段
、例えばポリエチレンイミンでの処理、硫酸アンモニウ
ムを使ったタンパク質の沈澱、ゲル電気泳動、透析、ク
ロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィ
ー（特に融合タンパク質のポリペプチドｔａｇ　が多数
の酸性または塩基性アミノ酸を含む時に好ましい）、サ
イズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰ
ＬＣ、適当なＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラム上での分
子篩等によって融合タンパク質を濃縮せしめる。予備精
製された生成物の最終精製は、例えば、アフィニティー
クロマトグラフィー、例えば抗体アフィニティークロマ
トグラフィー、特に当業界で既知の手段によって不溶性
マトリックス上に固定された抗体（この抗体は、例えば
、融合タンパク質のポリペプチドｔａｇ　内に存在する
エピトープを認識する）を使ったモノクローナル抗体ア
フィニティークロマトグラフィーにより達成される。 【００４５】本発明は、更に生物活性タンパク質の生産
のための有効な中間体である本発明に係る融合タンパク
質それ自体に関する。本発明は、特に実施例において記
載されるような、発現ベクター、形質転換宿主、融合タ
ンパク質およびその調製方法並びに生物活性タンパク質
の調製方法に関する。 【００４６】 【実施例】次の実施例は、本発明を例示するものであり
、限定するものと解釈してはならない。 実施例１：可溶性　ｙｓｃＦ変異体をコードする短縮Ｋ
ＥＸ２遺伝子の作製 酵母ＫＥＸ２遺伝子は、ゴルジ装置中に存在する膜結合
タンパク質であるｙｓｃＦと称するエンドプロテアーゼ
をコードする。　ｙｓｃＦタンパク質は、Ｎ末端触媒領
域、高Ｓｅｒ／Ｔｈｒ　領域、膜貫通領域および　ｙｓ
ｃＦタンパク質のゴルジ局在化を担うＣ末端尾から成る
。高Ｓｅｒ／Ｔｈｒ　領域、膜貫通領域およびＣ末端尾
を含む２００　個のＣ末端アミノ酸を欠く変異　ｙｓｃ
Ｆ酵素は、まだプロテアーゼ活性を保持している　Ｆｕ
ｌｌｅｒ　ら，１９８９，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　８６，　１４３４−１４３８
　；Ｆｕｌｌｅｒ　ら，１９８９，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　
２４６，　４８２−４８５　　。可溶性ｙｓｃＦプロテ
アーゼ活性を得るために、Ｃ末端の２００　アミノ酸を
コードする６００ｂｐ　を欠く変異ＫＥＸ２遺伝子を作
製する。先端を切り取られた遺伝子は、−１〜−５０２
に及ぶＫＥＸ２プロモーターの支配下に置かれる。翻訳
はｐＵＣ１８　のポリリンカーに由来する終結コドン（
ＴＡＡ）　のところで終了する。 【００４７】詳しくは、プラスミドｐＵＣ１９　　Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ，　ＦＲ
Ｇ　　をＨｉｎｄＩＩＩ　で完全消化し、２６８６ｂｐ
断片を単離する。両末端をフィルインし、そして断片を
再連結せしめる。連結混合物のアリコートを、カルシウ
ム処理した形質転換コンピテント大腸菌　（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０１　　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　Ｓａｎ　
Ｄｉｅｇｏ，　ＵＳＡ　　細胞に添加する。１２個の形
質転換されたアンピシリン耐性大腸菌形質転換体を１０
０　μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下で増殖させる。 プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ　並
びにＢａｍＨＩ　での消化により分析する。ＨｉｎｄＩ
ＩＩ　部位を欠くプラスミドをｐＵＣ１９ｗｏＨと命名
する。 【００４８】３２０７ｂｐのＢａｌＩ−ＡｈａＩＩＩ　
ＫＥＸ２断片（全ゲノム酵母ＤＮＡから得られる）の両
端にＢａｍＨＩ　リンカーを付加し、次いでＢａｍＨＩ
　で完全消化する。プラスミドｐＵＣ１９ｗｏＨをＢａ
ｍＨＩ　で完全に切断し、直鎖状の２６９０ｂｐ断片を
単離し、これを上述のＢａｍＨＩ　ＫＥＸ２断片と連結
せしめる。連結混合物のアリコートを用いて大腸菌ＪＭ
１０１　細胞を形質転換せしめる。１２個の形質転換さ
れたアンピシリン耐性コロニーをアンピシリン（１００
μｇ／ｍｌ）　含有ＬＢ培地中で増殖させ、プラスミド
ＤＮＡを抽出し、そしてＢａｍＨＩ　での消化により分
析する。期待された制限断片を有する１つのクローンを
選択し、ｐＫＳ３０１ｂ　と命名する。 【００４９】本質的にはプラスミドｐＤＰ３４　に対応
する　２μｍ　酵母ベクターｐＡＢ２４　をＢａｍＨＩ
　で完全に消化し、直鎖状ｐＡＢ２４　断片を単離する
。プラスミドｐＫＳ３０１ｂ　をＢａｍＨＩ　で消化し
、そして完全なＫＥＸ２遺伝子を含む断片を単離し、線
状化された酵母ベクターｐＡＢ２４　と連結せしめる。 連結混合物のアリコートを用いて大腸菌　ＪＭ１０１細
胞を形質転換させ、１２個の陽性クローンのプラスミド
ＤＮＡをＢａｍＨＩ　消化により分析する。期待された
制限断片を有する１つのクローンをｐＡＢ２２６と命名
する。 【００５０】プラスミドｐＫＳ３０１ｂ　をＳｐｈＩ，
　ＰｖｕＩＩ　およびＳｃａＩで完全に消化する。−５
０２〜＋１８４３　のＫＥＸ２配列を含む２．３７ｋｂ
のＳｐｈＩ−ＰｖｕＩＩ断片および　ｐＵＣ１９ポリリ
ンカーの一部分を単離する。プラスミドｐＵＣ１８　　
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，　ＦＲＧ　
をＳｐｈＩとＳｍａＩで完全に切断する。２６６０ｂｐ
のＳｐｈＩ−ＳｍａＩ　ｐＵＣ１８　断片をＳｐｈＩ／
ＳｐｈＩ　およびＰｖｕＩＩ／ＳｍａＩ連結により２．
３７ｋｂのＳｐｈＩ−ＰｖｕＩＩ　　ＫＥＸ２断片と連
結せしめる。ＰｖｕＩＩ／ＳｍａＩ連結は、６１４　ア
ミノ酸をコードするＫＥＸ２　ＯＲＦと７個の追加のＣ
末端アミノ酸（−Ｇ−Ｖ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｎ−Ｓ）をコー
ドし終結コドン（ＴＡＡ）　が続くｐＵＣ１８　配列中
のＯＲＦ　との融合をもたらす。連結混合物のアリコー
トを用いて大腸菌ＪＭ１０１　細胞を形質転換させる。 アンピシリン耐性大腸菌形質転換体からプラスミドＤＮ
Ａを単離し、そしてＳｐｈＩとＥｃｏＲＩ　並びにＨｉ
ｎｄＩＩＩ　での消化により分析する。期待された制限
パターンを有する１つのクローンをｐ１８ｋｅｘｐ　と
命名する。配列表の配列番号１のもとに、ＫＥＸ２由来
のＤＮＡを有する可溶性　ｙｓｃＦをコードするＯＲＦ
　を示す。 【００５１】プラスミドｐ１８ｋｅｘｐ　をＰｖｕＩＩ
，　ＳａｌＩ　およびＳｃａＩで完全に切断する。−５
０２〜＋１８４３　に及ぶＫＥＸ２配列および２０６ｂ
ｐ　のｐＵＣ１８　配列を含む２５５２ｂｐのＳａｌＩ
−ＰｖｕＩＩ断片を単離する。プラスミドｐＤＰ３４　
をＢａｍＨＩ　で消化し、線状化されたプラスミドの末
端をフィルインする。Ｔ４ポリメラーゼの不活性化後、
線状化されフィルインされたプラスミドをＳａｌＩで切
断し、１１．７８ｋｂ　断片を単離する。ＳａｌＩ／Ｓ
ａｌＩ　および　ＢａｍＨＩ＊　／ＰｖｕＩＩ連結によ
り、ＤＰ３４の　ＢａｍＨＩ＊　−ＳａｌＩ　断片を２
５５２ｂｐ　ＳａｌＩ−ＰｖｕＩＩ　断片と連結せしめ
る（ＢａｍＨＩ＊　：　フィルインされたＢａｍＨＩ）
。連結混合物のアリコートを用いてコンピテント大腸菌
　（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１細胞を形質転換させる。 アンピシリン耐性細胞からプラスミドＤＮＡを抽出し、
そしてＳａｌＩ，　ＮｃｏＩ，　ＳｍａＩ，　ＸｂａＩ
，　ＥｃｏＲＩ　での制限分析により分析する。期待さ
れた制限断片を有する１つのクローンをｐＤＰｋｅｘｐ
　と命名する。 【００５２】 実施例２：エンドプロテアーゼ活性の分析細胞を実施例
３に記載のようにして培養する。培養ブロスを遠心し、
細胞と培養上清に分離する。エンドプロテアーゼ活性を
培地中、完全細胞の表面上および「浸透性が高められた
」細胞中において測定する。細胞を１容の０．２Ｍ　Ｈ
ＥＰＥＳ　　４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
−１−エタンスルホン酸，Ｆｌｕｋａ，　Ｓｗｉｔｚｅ
ｒｌａｎｄ　　ｐＨ７．０　で１回洗浄し、そして完全
細胞の表面上での測定用には１容の０．２Ｍ　ＨＥＰＥ
Ｓ　ｐＨ７．０に再懸濁させ、または「浸透性が高めら
れた」細胞を生じるために０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ
−１００　を含む１容の０．２Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７
．０に再懸濁させる。エンドプロテアーゼ活性は次のよ
うにして測定する。　９００μｌ　のアッセイ混合物（
０．２Ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．０，　１ｍＭ　ＣａＣ
ｌ２，　０．５ｍＭ　ＰＭＳＦ　浸透性が高められた細
胞の活性を測定するためには更に０．１％　Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−１００　）　を５０μｌ　の試料と共に３７℃
にて２分間インキュベートし、そしてこのインキュベー
ション期間中のＡ４０５ｎｍ　の増加を分光光度的に測
定する。基質なしではこのプレインキュベーション期間
中のＡ４０５ｎｍ　の変化は全く観察されない。基質（
５０μｌ　の１０ｍＭベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
チロシル−Ｌ−リジル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロア
ニリド，Ｂａｃｈｅｍ，　Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，　　Ｓ
ｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の添加により反応を開始し、そ
してエンドプロテアーゼ活性の計算のためにＡ４０５ｎ
ｍ　の増加を読み取る。１Ｕエンドプロテアーゼ活性は
、記載のアッセイ条件下で１分間あたり１μモルの４−
ニトロアニリドが生成したものとして定義される。約９
０％の　ｙｓｃＦ活性が培地中に見出される。 【００５３】実施例３：Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０　株の形質転換 Ｄｏｈｍｅｎら　１９８９，　Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．
　１５，　３１９−３２５　　により記載された形質転
換プロトコルに従って、プラスミドｐＤＰ３４，　ｐＡ
Ｂ２２６　およびｐＤＰｋｅｘｐ　を用いてサッカロミ
セス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０　（ＡＴＣＣ　２０７
９６）を形質転換せしめる。形質転換された酵母細胞を
、ウラシルが不足しているアミノ酸／ヌクレオチド混合
物が補足された酵母最少プレート上で選択する（アミノ
酸／ヌクレオチド混合物は、培地にアデニン　１２ｍｇ
／ｍｌ、アルギニン　４０ｍｇ／ｍｌ、ヒスチジン　４
０ｍｇ／ｍｌ、イソロイシン　６０ｍｇ／ｍｌ、ロイシ
ン　６０ｍｇ／ｍｌ、リジン　６０ｍｇ／ｍｌ、メチオ
ニン　４０ｍｇ／ｍｌ、フェニルアラニン　５０ｍｇ／
ｍｌ、スレオニン　６０ｍｇ／ｍｌ、トリプトファン４
０ｍｇ／ｍｌ、チロシン　１５ｍｇ／ｍｌ、ウラシル　
４０ｍｇ／ｍｌ、バリン　６０ｍｇ／ｍｌを補足する）
。 単一の酵母クローンが単離され、これを次のように命名
する： 【００５４】サッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０
／ｐＤＰ３４　サッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１
１０／ｐＡＢ２２６ サッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０／ｐＤＰｋ
ｅｘｐ　【００５５】実施例４：実験室スケールでの形
質転換酵母株の醗酵 Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１
１０／ｐＤＰ３４　、Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０／ｐＡＢ２２６およびＳ．セ
レビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０／
ｐＤＰｋｅｘｐ　を、次の成分から成る１０ｍｌの予備
培養物中で増殖させる。 　　　　　　　　Ｄｉｆｃｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｏｇ
ｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　　
　　　　　　　６．７　ｇ／ｌ　　　　　　　　グルコ
ース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２０．０　ｇ／ｌ　　
　　　　　　ＨＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２４．０　ｇ／ｌロイシンが不足しているアミ
ノ酸／ヌクレオチド混合物（実施例３に記載）を培地に
補足し、ｐＨを７．０　に設定する。予備培養物を３０
℃および１８０　ｒ．ｐ．ｍ．において４８時間増殖さ
せる。 【００５６】主要培地は下記の成分： 　　　　　　　　Ｄｉｆｃｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｏｇ
ｅｎ　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　　
　　　　　　　６．７　ｇ／ｌ　　　　　　　　グルコ
ース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　４０．０　ｇ／ｌ　　
　　　　　　アルギニン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８．０　ｇ／ｌ　　　　　　　　Ｄｉｆｃｏ　カザミノ
酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　８．５　ｇ／ｌ　　　　　　　　Ｈ
ＥＰＥＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２４．
０　ｇ／ｌから成り、ｐＨは７．０　に設定される。 【００５７】主要培地に約１％（ｖ／ｖ）　の予備培養
物を接種し、そして３０℃および１８０　ｒ．ｐ．ｍ．
においてインキュベートする。醗酵中の数回の時点で培
養物のアリコートを取り、細胞密度、培養ブロスのｐＨ
およびエンドプロテアーゼ活性について分析する。酵母
ベクターのみを有する形質転換体ＡＢ１１０／ｐＤＰ３
４　および完全な　ｙｓｃＦタンパク質を発現する形質
転換体ＡＢ１１０／ｐＡＢ２２６と比較した時、Ｓ．セ
レビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０／
ｐＤＰｋｅｘｐ　形質転換体が細胞外　ｙｓｃＦ活性を
合成するという事実は、可溶性　ｙｓｃＦ変異体が発現
されることを証明する。 【００５８】実施例５：Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０／ｐＤＰｋｅｘｐ　形質転
換体の培地中の先端を切り取られた可溶性　ｙｓｃＦタ
ンパク質の免疫学的証拠Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０／ｐＤＰｋｅｘｐ　および
ＡＢ１１０／ｐＤＰ３４　株を実施例４に記載のように
して増殖させる。培養ブロスを遠心により細胞と培養上
清に分離する。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３００００　フィ
ルター（Ａｍｉｃｏｎ）を使って培養上清をもとの体積
の１／５　に濃縮する。様々な量の濃縮上清を１，４−
ジチオ−ＤＬ−トレイトールで還元し、変性条件下で８
％ポリアクリルアミドゲル上で分離する。 タンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色する
か、またはニトロセルロースフィルター上にブロットす
る（ウエスタンブロット）。ＰＡＧＥおよびウエスタン
ブロットの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　１９８９，
　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　　第２版，
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　に記載さ
れている。ニトロセルロースフィルターを１０ｍＭ　Ｎ
ａＨ２ＰＯ４，　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　１％　ＢＳ
Ａ，　ｐＨ７．２中で３７℃にて　２時間インキュベー
トし、次にｌａｃＺ−ｙｓｃＦ　融合体に対してラット
中で惹起された追加のポリクローナル抗体を新たに含む
同溶液中で同条件下で第二のインキュベーションを行う
。（抗体の生産および精製は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，　
１９８９，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　
　第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
　に記載されている。）フィルターを１０ｍＭ　ＮａＨ
２ＰＯ４，　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１％　Ｔｒｉｔｏ
ｎ　Ｘ−１００，　０．１％　ＢＳＡ，　ｐＨ７．２中
で３７℃にて３０分間３回洗浄する。その洗浄後にヤギ
抗−ウサギＩｇ接合アルカリホスファターゼ　（ＴＡＧ
Ｏ，Ｉｎｃ．，　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）（この
アルカリホスファターゼはウサギにおいて惹起させた抗
体の定常領域に特異的な抗体に接合されている）とのハ
イブリダイゼーション反応を行う。この反応は、抗−ウ
サギＩｇ接合アルカリホスファターゼを含む１０ｍＭ　
ＮａＨ２ＰＯ４，　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　０．０１
％　Ｔｗｅｅｎ２０，　０．１％　ＢＳＡ，　ｐＨ７．
２　中で行う。ブロットを１０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４，
　１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，　０．０１％　Ｔｗｅｅｎ　
２０，　０．１％　ＢＳＡ，　ｐＨ７．２　中で３０分
間３回洗浄する。 特異的結合の可視化は、Ｏ．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　
ｐＨ８．８，　１００ｍＭ　ＮａＣｌ，　２ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２，　１０ｍｇ／１００ｍｌの５−ブロム−４−ク
ロルインドリル−ホスファット（ＢＣＩＰ）および１０
０ｍｇ／１００ｍｌ　のニトロブルー−テトラゾリウム
−クロリド（ＮＢＴ）　から成る溶液中でブロットをイ
ンキュベートすることにより起こる。Ｓ．セレビシェー
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０／ｐＤＰ３４
　の培養上清に比較すると、Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０／ｐＤＰｋｅｘｐ　の
培養上清中には追加の６８ｋＤａ　タンパク質が見出さ
れる。この６８ｋＤａ　タンパク質は、　ｙｓｃＦタン
パク質の一部分に対して生起された抗体と反応する。 【００５９】実施例６：プレ−プロ−ＩＧＦ１の試験管
内プロセシング ＩＧＦ１は、Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）α因子前駆体のリーダー配列と融合した成熟ＩＧ
Ｆ１から成る細胞内融合タンパク質としてＳ．セレビシ
ェー中で発現される。この融合タンパク質は、次の構造
を有する：Ｎ−（α因子リーダー）−ＩＧＦ１−Ｃアミ
ノ酸配列Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　　が８９アミノ酸の
α因子リーダー配列のＣ末端であり　Ｋｕｒｊａｎ，Ｊ
．およびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．　１９８２，　Ｃ
ｅｌｌ　　３０，　９３３−９４３　、そして　ｙｓｃ
Ｆプロテアーゼの基質である。この融合タンパク質は先
端を切り取られた可溶性　ｙｓｃＦプロテアーゼにより
開裂され、消化生成物Ｎ−プレ−プロ−α因子−Ｃと成
熟ＩＧＦ１をもたらす。 【００６０】各々５０ピコモルのα因子リーダーＩＧＦ
１融合タンパク質を含むＳ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）粗抽出試料を、各々５　ｍＵの可溶性
　ｙｓｃＦエンドプロテアーゼ活性（実施例２に記載の
エンドプロテアーゼ活性アッセイから算出）を有するＳ
．セレビシェー　ＡＢ１１０／ｐＤＰｋｅｘｐの培養上
清試料と共にインキュベートする。様々な時間の間１０
μｌ　の５０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液　ｐＨ７．５中で反
応を行う。試験管内プロセシング操作から誘導された成
熟ＩＧＦ１を、「ウエスタンブロット」分析により検出
する。この方法は実施例５に記載されている。成熟ＩＧ
Ｆ１に対してウサギにおいて惹起されたポリクローナル
抗体を使ってハイブリダイゼーションを実施する。特異
的結合の検出は実施例５に記載されている。ウエスタン
ブロット分析は、Ｓ．セレビシェー　ＡＢ１１０／ｐＤ
Ｐｋｅｘｐ形質転換体から分泌された可溶性　ｙｓｃＦ
プロテアーゼ変異体を含む培養上清によるプレ−プロ−
ＩＧＦ１タンパク質のプロセシングを示す。プレ−プロ
−ＩＧＦ１は、記載のアッセイ条件を使って３０〜１２
０　分以内に成熟ＩＧＦ１タンパク質にプロセシングさ
れる。 【００６１】実施例７：　ＧＡＰＦＬプロモーターとＫ
ＥＸ１構造遺伝子を含むハイブリッド遺伝子の作製欧州
特許出願第　３４１，２１５号において開示されたよう
にして、全ゲノムサッカロミセス・セレビシェー（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮ
Ａから３．１　ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ断片において全長
ＫＥＸ１遺伝子を単離する。この断片を酵母プラスミド
ｐＪＤＢ２０７　　Ｂｅｇｇｓ，Ｊ．Ｄ．，　１９８１
，　Ｄ．ｖｏｎ　Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎら編，　Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ，Ａ
ｌｆｒｅｄ　Ｂｅｎｚｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　１６
．　Ｍｕｎｓｇａａｒｄ，　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ　　
のユニークＨｉｎｄＩＩＩ　部位中にクローニングする
。生じたプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＫＥＸ１を用いて
大腸菌　ＨＢ１０１を形質転換せしめる。形質転換され
た大腸菌株を大腸菌ＨＢ１０１／ＫＥＸ１と命名する。 【００６２】分泌可溶性形の　ｙｓｃα（ＫＥＸ１によ
りコードされるタンパク質）の高レベル発現を獲得する
ために、ＨｉｎｄＩＩＩ　断片上に存在するごく弱いＫ
ＥＸ１プロモーターを、酵母グリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（欧州特許出願第
２２５，６３３　号）の強力構成プロモーター要素（Ｇ
ＡＰＦＬ）　と交換する。ＧＡＰＦＬプロモーターは４
７８ｂｐ　ＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片上に含まれるので
、まずＫＥＸ１コード領域中のＥｃｏＲＩ　部位を試験
管内突然変異誘発により削除し、次いでＫＥＸ１の　Ａ
ＴＧコドンのすぐ５′側に新たなＥｃｏＲＩ　部位を導
入してＧＡＰＦＬ　プロモーターとＫＥＸ１コード領域
との適切な融合を可能にする。 【００６３】詳しくは、ＫＥＸ１を含む３．１ｋｂ　の
ＨｉｎｄＩＩＩ　断片を、　Ｍ１３由来ベクターｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　Ｃａ．　ＵＳＡ）　のＨｉｎｄ
ＩＩＩ　部位にサブクローニングし、ＫＳ＋／ＫＥＸ１
を与える。５　′−ＨｉｎｄＩＩＩ　部位の４２０ｂｐ
　上流に位置する内部ＥｃｏＲＩ　部位を除去するため
に、次のオリゴヌクレオチドを合成する： ５′−ＣＣＴＴＴＴＡＧＧＧＴＣＡＡＴＴＣＡＧＡＣＧ
ＧＴ−３′ 【００６４】記載された通りに（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｍｕ
ｔａ−Ｇｅｎｅ　Ｍ１３　キット，Ｂｉｏ−Ｒａｄ，　
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，　Ｃａ．　ＵＳＡ）部位特異的試験
管内突然変異誘発を行う。まず、ＫＳ＋／ＫＥＸ１を用
いて大腸菌ＣＪ２３６　をトランスフェクトせしめ、ウ
ラシルを組み込む（Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ　キット，　前
掲）。トランスフェクトされた大腸菌　ＣＪ２３６から
、Ｍ１３　ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
　前掲）を使って一本鎖ＤＮＡを単離する。３　μｌ　
の１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．０，　０．３μｌ
　の１Ｍ　ＭｇＣｌ２，　０．７５μｌ　の０．２Ｍ　
ＤＴＴ，　０．６　μｌ　の２０ｍＭ　ＡＴＰを含む全
容量３０μｌ　中で２００　ピコモルのオリゴヌクレオ
チドプライマーをリン酸化する。４．５　単位のＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼを添加し、そして混合物を３７
℃にて４５分間および６５℃にて１０分間インキュベー
トする。 【００６５】リン酸化されたオリゴヌクレオチドを次の
条件下で鋳型ＤＮＡにアニーリングする：ＫＳ＋／ＫＥ
Ｘ１由来のウラシル含有ＤＮＡ　０．１ピコモルを全容
量１０μｌ　のアニーリング緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．４，　２ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　５
０ｍＭ　ＮａＣｌ）　中で２ピコモルのリン酸化された
プライマーと共にインキュベートする。混合物を湯浴中
で８０℃に加熱し、次いで周囲温度に達するまでゆっく
りと放冷する。次の条件下で相補鎖を形成せしめる：ア
ニーリング混合物を　４μｌ　の２ｍＭ　ｄＮＴＰ，　
０．７５μｌ　の０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７
．４，　　０．７５μｌ　の０．１Ｍ　ＭｇＣｌ２，　
２．１５μｌ　の０．２Ｍ　ＤＴＴ，　１　単位のＴ４
　ＤＮＡポリメラーゼおよび　２単位のＴ４　ＤＮＡリ
ガーゼと共にインキュベートする。反応混合物をまず氷
上で５　分間次に２５℃で５　分間そして最後に３７℃
で９０分間インキュベートする。得られた二本鎖ＤＮＡ
を用いて、ウラシル含有鋳型を効果的に除去する株であ
る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１　（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ，　前掲）を形質転換せしめ、突然変異させた相補鎖
を複製させる。プラスミドを調製しそして　ＥｃｏＲＩ
部位の欠失について分析する。正しい突然変異誘発を配
列分析により更に確認する。正しい内部ＥｃｏＲＩ　部
位の崩壊を有する１つのプラスミドをＫＳ＋／ＫＥＸ１
（−ＥｃｏＲＩ）と命名する。 【００６６】プライマーとして次のオリゴヌクレオチド
を使って、新規　ＥｃｏＲＩ部位をＫＳ＋／ＫＥＸ１（
−ＥｃｏＲＩ）中に導入する： ５　′−ＡＧＡＴＡＡＡＧＡＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡ
ＴＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴ−３　′【００６７】正確に上
記に記載のようにして試験管内突然変異誘発を実施する
。出発コドンのすぐ隣の新規　ＥｃｏＲＩ部位の存在に
ついて制限分析によりおよび配列分析によりプラスミド
を調べた。正しい新規　ＥｃｏＲＩ部位を有する１つの
プラスミドをＫＳ＋／ＫＥＸ１（ＥｃｏＲＩｎｅｗ）と
命名する。 ＫＳ＋／ＫＥＸ１（ＥｃｏＲＩｎｅｗ）をＥｃｏＲＩ　
とＨｉｎｄＩＩＩ　で消化し、３．０ｋｂ　のＫＥＸ１
含有断片を０．８％調製用アガロースゲル上で分離し、
そしてＧｅｎｅｃｌｅａｎ　（Ｂｉｏ　１０１　Ｉｎｃ
．，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）　を使っ
て単離する。 【００６８】ＧＡＰＦＬ　プロモーター断片を得るため
に、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ　
（欧州特許出願第　２２５，６３３号）をＳａｌＩとＥ
ｃｏＲＩ　で消化し、そして上記と同じ方法（Ｇｅｎｅ
ｃｌｅａｎ　，前掲）を使って４７８ｂｐ　断片を単離
する。０．２　ピコモルの４７８ｂｐ　ＳａｌＩ−Ｅｃ
ｏＲＩ断片、全長ＫＥＸ１構造遺伝子を含む０．２　ピ
コモルのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　断片および０．
１　ピコモルのＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断酵母マル
チコピーベクター　ｐＤＰ３４（欧州特許出願第３４０
，１７０　号参照）を連結せしめ、そして形質転換され
た大腸菌ＪＭ１０１　細胞からプラスミドを調製する。 １つの正しいプラスミドをｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−Ｋ
ＥＸ１と命名する。 【００６９】実施例８：可溶性　ｙｓｃα活性をコード
する短縮ＫＥＸ１遺伝子の作製 ＫＥＸ１は、分泌組織、おそらく大部分はゴルジ装置内
に存在する膜結合カルボキシペプチダーゼ　ｙｓｃαを
コードする。　ｙｓｃαタンパク質は、アミノ末端触媒
領域、次に高Ａｓｐ−Ｇｌｕ　酸性領域、膜貫通領域お
よびＣ末端尾から成る。脱脂経路を介した培地中への分
泌に備えるために、Ｃ末端の切除が選択の方法である。 酸性領域の終わりのコードされるタンパク質の膜貫通領
域のすぐ上流に便利なユニークＸｈｏＩ部位が置かれる
。 【００７０】ＫＳ＋／ＫＥＸ１（ＥｃｏＲＩｎｅｗ）を
ＥｃｏＲＩ　とＸｈｏＩで消化し、そしてＣ末端が切除
されたＫＥＸ１遺伝子を含む１．７ｋｂ　の断片を単離
する。この１．７ｋｂ　のＫＥＸ１コード断片と４７８
ｂｐ　のＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ　ＧＡＰＦＬプロモータ
ー断片（実施例７）を、ｐＤＰ３４　のユニークＳａｌ
Ｉ部位中に連結せしめる。得られたプラスミドをｐＤＰ
３４／ＧＡＰＦＬ−ＫＥＸ１＊　と命名する。ＫＥＸ１
由来配列を有する可溶性　ｙｓｃα＊　をコードするＯ
ＲＦ　を配列表中の配列番号２のもとに記載する。 【００７１】実施例９：Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｒ１１７６株の形質転換 ａ．Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　
ｋｅｘ１変異株９６とＳ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）ＢＹＳ　株との接合並びにα因子分泌能
力およびカルボキシペプチダーゼｙｓｃα（ＫＥＸ１遺
伝子）活性に関する胞子の分析ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ，　Ｂｅｒｋ
ｅｌｅｙ，　ＵＳＡ　から得られたＳ．セレビシェー（
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ｋｅｘ１変異株９６　（
ａ，　ｋｅｘ１，　ａｄｅ２，　ｔｈｒ１）を、野性型
ＫＥＸ１対立遺伝子を担持しているＳ．セレビシェー（
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹＳ　２３２−３１−４
２　株（α，ｐｒｂ１−１，　ｐｒｃ１−１，　ｃｐｓ
１−３，　ｌｙｓ２，　ｌｅｕ２，　ｈｉｓ７　）　Ａ
ｃｈｓｔｅｔｔｅｒ，Ｔ．およびＷｏｌｆ，Ｄ．Ｈ．（
１９８５）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　４，　１７３−１７７　
；　Ｗｏｌｆ，Ｄ．Ｈ．およびＥｈｍａｎｎ，Ｃ．（１
９８１）　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４７，　４１８
−４２６　と接合せしめる。遺伝子型ｋｅｘ１／ＫＥＸ
１　の二倍体ヘテロ接合細胞をこの交雑から単離する。 二倍体細胞から誘導される四分子を標準的な遺伝学技術
Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ，Ｄ．Ｃ．　およびＭｏｒｔｉｍｅ
ｒ，Ｒ．Ｋ．（１９６０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ４５　，　
１０８５−１１１０　；　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅ
ａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１９８６　（Ｓｈｅｒｍａ
ｎ，Ｆ．　ら編）　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎ．Ｙ．　に従って切
り裂く。 【００７２】各四分子の４つの胞子をα因子分泌能力に
ついて試験する。ＫＥＸ１野性型コロニーとｋｅｘ１変
異型コロニーとを区別するために、フェロモン高感受性
テスター株Ｓ．セレビシェーＲＣ６２９　（ａ，　ｓｓ
ｔ−２，　ａｄｅ２−１，　ｕｒａ１，　ｈｉｓ６，　
ｍｅｔ１，　ｃａｎ１，　ｃｙｈ２　ｒｍｅ）を使用す
る　Ｃｈａｎ，Ｒ．Ｋ．およびＯｔｔｅ，Ｃ．Ｋ．（１
９８２）　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２，　１１
−２０　；Ｃｈａｎ，Ｒ．Ｋ．　およびＯｔｔｅ，Ｃ．
Ｋ．（１９８２）　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２
，　２１−２９　　　。分析した全ての四分子から、単
核遺伝子によりコードされる特性から予想されるように
、各四分子の２つの胞子がａ因子を分泌し、一方その他
の２つの胞子がα因子を分泌する。α接合型の野性型Ｋ
ＥＸ１コロニーは、α因子前駆体を完全にプロセシング
しそして１つの前駆体分子から４つの活性α因子分子を
生成することができるので、テスター株の増殖を大きく
阻害し、よってそれらの周囲に大きい阻止円を生成する
。対比して、ｋｅｘ１変異型コロニーは、１つの前駆体
分子から１つのみの成熟α因子分子を生成することがで
きるので、テスター株の増殖を小程度阻害し、それらの
周囲に小さい阻止円を生じる。 【００７３】上記のフェロモンアッセイによりｋｅｘ１
遺伝子に欠損があると同定された幾つかの完全な四分子
の胞子を、最後にカルボキシペプチダーゼｙｓｃα特異
的活性について試験する。細胞を増殖させ、その膜を調
製し、そして記載された通りに　Ｗａｇｎｅｒ，Ｊ．Ｃ
．およびＷｏｌｆ，Ｄ．Ｈ．（１９８７）　ＦＥＢＳ　
Ｌｅｔｔ．　２２１，　２，　４２３−４２６　　、基
質としてＣｂｚ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　を使ってカ
ルボキシペプチダーゼ　ｙｓｃα活性について試験する
。カルボキシペプチダーゼ　ｙｓｃα活性がｋｅｘ１変
異体細胞において欠けているという事実は、ＫＥＸ１が
この酵素の構造遺伝子であることを指摘する。これは、
カルボキシペプチダーゼ　ｙｓｃαが実際にα因子のカ
ルボキシ末端プロセシングに関与することを暗示する。 【００７４】ｂ．プロテアーゼ　ｙｓｃＢ，　ｙｓｃＹ
および　ｙｓｃＳの追加の欠損に関する確認されたｋｅ
ｘ１変異体の分類Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅ）ｋｅｘ１変異体を、他のプロテアーゼ（プロ
テイナーゼ　ｙｓｃＢ，カルボキシペプチダーゼ　ｙｓ
ｃＹおよびカルボキシペプチダーゼｙｓｃＳ）の欠損お
よび追加の増殖因子要求に関して分類する。 【００７５】ＹＰＤ（Ｄｉｆｃｏ）培地中の定常期から
調製されたｋｅｘ１変異体の細胞材料をエッペンドルフ
小遠心管中の２００　μｌ　の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ　緩衝液，　ｐＨ７．２　に懸濁させ、そしてガラ
スビーズ（直径０．４　ｍｍ）を体積の２／３　まで添
加する。懸濁液を氷上で断続的に冷却しながらボルテッ
クスミキサー上で１分間３回激しく振盪する。５分間の
遠心は、上清粗抽出物の回収を可能にする。プロテアー
ゼを活性化しそして抽出物から遊離アミノ酸を除去する
ために、０．１ｍＭ　ＺｎＣｌ２　を含む０．１Ｍイミ
ダゾール−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ５．２に対してそれらの抽
出物を透析する。 【００７６】Ａｚｏｃｏｌｌ試験　Ｒ．Ｅ．Ｕｌａｎｅ
ら（１９７６）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２５１，
　３３６７　；　Ｅ．Ｃａｂｉｂら（１９７３）　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
　　５０，　１８６　；　Ｔ．Ｓａｈｅｋｉら（１９７
４）　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　４２，　６２１
　に従って、プロテイナーゼ　ｙｓｃＢ活性を測定する
。タンパク質濃度の測定後、各試料のアリコートを０．
１Ｍリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）緩衝液　ｐＨ７．０
で１００　μｌ　まで増量し、要求される等タンパク質
量を調整する。このタンパク質溶液に、　５００μｌ　
のＡｚｏｃｏｌｌ　懸濁液（０．１Ｍ　ＮａＰｉ緩衝液
　ｐＨ７．０中２４０ｍｇ）を添加する。それらの混合
物を攪拌しながら３０℃にて１　時間インキュベートす
る。反応を止める５００　μｌ　の１０％トリクロロ酢
酸の添加後、混合物を２回遠心し、そして５２０ｎｍ　
において上清の吸収スペクトルを測定する。 【００７７】カルボキシペプチダーゼ　ｙｓｃＹおよび
　ｙｓｃＳの活性は、色素生産性基質Ｃｂｚ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ　　Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｆ　ら（１９７８）　ＦＥＢ
Ｓ　Ｌｅｔｔ．　９１，　５９　；　Ｄ．Ｈ．Ｗｏｌｆ
　ら（１９７７）　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　７
３，　５５３　参照　　を使って測定する。透析した抽
出物を３部分に分け、そのうちの２つに１　ｍＭの最終
濃度においてフェニルメチルスルホニルフルオリド（Ｐ
ＭＳＦ）または５　ｍＭの最終濃度においてＥＤＴＡを
それぞれ添加し、２つのプロテアーゼ活性を別々に阻害
する。すなわちＰＭＳＦがカルボキシペプチダーゼ　ｙ
ｓｃＹ活性を阻害し、そしてＥＤＴＡがカルボキシペプ
チダーゼ　ｙｓｃＳ活性を阻害する。阻害剤を含む混合
物を各々２５℃で１　時間インキュベートし、阻害を完
全にする。タンパク質濃度の測定後、等タンパク質量を
与えるために、各試料の阻害剤を含むアリコート２つと
対照として阻害剤を含まないアリコート１つを０．１Ｍ
ＮａＰｉ　緩衝液　ｐＨ７．０で５０μｌ　まで増量す
る。それらのタンパク質溶液に次のテスト溶液を添加す
る。 【００７８】 テスト溶液Ｉ　５００　μｌ　：　 　　　　　　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ　　　　　　　
　　　　　　　　０．２４　ｍｇ／ｍｌ　　　　　　　
西洋ワサビペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　０
．４０　ｍｇ／ｍｌ　　　　　　　０．０１ｍＭ　Ｍｎ
Ｃｌ２　　　　　　０．１Ｍ　ＮａＰｉ　緩衝液，　ｐ
Ｈ７．４　中テスト溶液ＩＩ　５０　μｌ　：　 　　　　　　ｏ−ジアニシジン　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２　ｍｇ／ｍｌ　　　　　　
水中 テスト溶液ＩＩＩ　５００　μｌ　：　　　　　　　２
０ｍＭ　Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　　　　　　０．２Ｍ
リン酸カリウム緩衝液，　ｐＨ７．４　中【００７９】
混合物を２８℃で１　時間インキュベートし、そして　
１００μｌ　の２０％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を添加
して反応を停止させた後、４０５ｎｍ　における吸光度
を測定する。次なる形質転換のために、アデニン、スレ
オニン、リジンおよびヒスチジンが補足されそしてロイ
シンが補足されているかまたは補足されていない最少プ
レート上でのレプリカ法を用いて、ロイシンについての
アミノ酸独立栄養マーカーを記録する。上記に記載のア
ッセイにより、四重のプロテアーゼ欠損（α，ｐｒｂ−
１，ｐｒｃ−１，　ｃｐｓ−３，　ｋｅｘ１　）および
追加のロイシン要求性を示すＳ．セレビシェー（Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＢＹＳｋｅｘ１　と称する変異
体が単離される。 【００８０】ｃ．　ｕｒａ３−欠損酵母株ＴＲ１１７６
の生産Ｔｒ１１７６は、上記　ＢＹＳｋｅｘ１株の　ｕ
ｒａ３−誘導体である。欧州特許出願第３４０，１７０
　号に記載されたようにしてＢＹＳｋｅｘ１　株のＵＲ
Ａ３遺伝子の破壊を行う。Ｔｒ１１７６は次のような遺
伝標識形質を有する：　ＭＡＴα，　ｐｒｂ−１，　ｐ
ｒｃ−１，ｃｐｓ−１，　ｋｅｘ−１，　ａｄｅ２，　
ｌｅｕ２，　ｕｒａ３。 【００８１】Ｄｏｈｍｅｎ（前掲）により記載された形
質転換プロトコルを使って、プラスミドｐＤＰ３４／Ｇ
ＡＰＦＬ−ＫＥＸ１およびｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−Ｋ
ＥＸ１＊　を用いてＳ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）　Ｔｒ１１７６を形質転換せしめる。形質
転換された酵母細胞を、ロイシンとアデニンが補足され
そしてウラシルが欠損している酵母最少培地プレート上
で選択する。単一の形質転換酵母コロニーを単離し、次
のように命名する： サッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｒ１１７６／ｐＤＰ
３４／ＧＡＰＦＬ−ＫＥＸ１　；およびサッカロミセス
・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｒ１１７６／ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦ
Ｌ−ＫＥＸ１＊　 【００８２】実施例１０：可溶性　ｙｓｃαの生物活性
サッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｒ１１７６／ｐＤＰ
３４／ＧＡＰＦＬ−ＫＥＸ１およびサッカロミセス・セ
レビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）Ｔｒ１１７６／ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−
ＫＥＸ１＊　の細胞を下記の成分から成る最少培地中で
３０℃および１８０ｒ．ｐ．ｍ．　において４８時間増
殖させる。 　　Ｄｉｆｃｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ
ｓｅ　ｗ／ｏ　アミノ酸　　　　　　　　８．４　ｇ／
ｌ　グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２０．０　ｇ／ｌ　Ｌ−アスパラギン　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０　ｇ／
ｌ　アデニン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０．１　ｇ／ｌ　【００８３】細胞を遠心によ
って培地から分離し、０．９％　ＮａＣｌ　中に再懸濁
し、そしてα因子高感受性ａ−細胞　Ｃｈａｎ，Ｒ．Ｋ
．およびＯｔｔｅ，Ｃ．Ｋ．　（１９８２）　Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　２，　１１−２０　　上での光
輪形成により、　ｙｓｃα活性についてテストする。プ
ラスミドを持たないＴｒ１１７６株は、　ｙｓｃα活性
が無いためにａ−細胞上に微小な光輪のみを示す。サッ
カロミセス・セレビシェー　Ｔｒ１１７６／ｐＤＰ３４
／ＧＡＰＦＬ−ＫＥＸ１およびサッカロミセス・セレビ
シェー　Ｔｒ１１７６／ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＫＥ
Ｘ１　＊は共に阻止円形成を示し、従って可溶性　ｙｓ
ｃαは正常な生体機能、即ちα因子成熟機能を保持して
いる。 【００８４】サッカロミセス・セレビシェー　Ｔｒ１１
７６／ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＫＥＸ１およびサッカ
ロミセス・セレビシェー　Ｔｒ１１７６／ｐＤＰ３４／
ＧＡＰＦＬ−ＫＥＸ１　＊醗酵物（前掲）の上清を、合
成ペプチド基質Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　およ
び記載されたアッセイ　Ｗｏｌｆ，Ｄ．Ｈ．およびＷｅ
ｉｓｅｒ，Ｕ．　（１９７７）　Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．　７３，　５５３−５５６　を使って培地中の
　ｙｓｃα活性の存在について分析する。サッカロミセ
ス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｒ１１７６／ｐＤＰ３４／ＧＡＰ
ＦＬ−ＫＥＸ１＊　の上清のみがこの基質のタンパク質
分解を示し、一方サッカロミセス・セレビシェー（Ｓａ
ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｒ
１１７６／ｐＤＰ３４／ＧＡＰＦＬ−ＫＥＸ１の上清は
Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　に対して全く活性を
持たない。従って、ＫＥＸ１＊　が培地中に放出される
生物活性　ｙｓｃαをコードすると結論づけることがで
きる。新規タンパク質を　ｙｓｃα＊　と命名する。 【００８５】実施例１１：　ｙｓｃα＊　の精製５　ｍ
ｌのイオン交換体Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　ＴＳＫ　ＤＥＡ
Ｅ　６５０（Ｍｅｒｃｋ　ＡＧ，　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ
，　ＦＲＧ）をカラムに充填し、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液，ｐＨ７．０で平衡化させる。サッカロミセ
ス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｒ１１７６／ｐＤＰ３４／ＧＡＰ
ＦＬ−ＫＥＸ１＊　（前掲）の培養ブロス８０ｍｌをｐ
Ｈ　７．０に調整し、そして一晩カラム上に負荷する。 それらの条件下で　ｙｓｃα＊　はカラムに結合する。 結合したタンパク質をｐＨ／塩の併用勾配（５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液　ｐＨ７．０　　４０ｍｌと　５
０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液　ｐＨ４．０＋１Ｍ　
ＮａＣｌ　４０ｍｌ）で溶出させる。約０．２Ｍ　Ｎａ
Ｃｌ　のところで、約６６ｋＤａ　の見かけ分子量（計
算分子量６５ｋＤａ　）を有する本質的に純粋な形態で
　ｙｓｃα＊　が溶出する。ブタ膵臓カルボキシペプチ
ダーゼＢ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，
　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，　ＦＲＧ）　と比較した時、同濃
度の　ｙｓｃα＊　は基質Ｃｂｚ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａ
ｒｇ　に対して　ｐＨ７．０では同等の活性を有しそし
てｐＨ４．０ではわずかに高い活性を有する。 【００８６】実施例１２：ヒルジンとヒトカルシトニン
を同時に発現する組換え融合ペプチドの作製ヒルジンと
ヒトカルシトニン前駆体の同時発現を考慮して融合ペプ
チドを作製する。２つのペプチドの間に、可溶性　ｙｓ
ｃＦおよび可溶性　ｙｓｃα＊　（前掲）による試験管
内プロセシングに備えてＫＥＸ２／ＫＥＸ１　認識部位
を導入する。詳しくは、プラスミドｐＪＤＢ２０７／Ｇ
ＡＰＦＬ−ＨＩＲ　（前掲、実施例７）をＳａｌＩとＢ
ａｍＨＩ　で消化し、そして０．７ｋｂ　断片を　ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋　のＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ部
位にサブクローニングする。ヒトカルシトニンのＣ末端
グリシン前駆体をコードする遺伝子を、ヒルジンについ
て記載されたようにして（欧州特許出願第１６８３４２
号参照）個々のオリゴヌクレオチドから構築し、ｐＵＣ
１９　のＰｓｔＩ部位中にサブクローニングする。試験
管内プロセシングに備えた５′−延長部を有するヒト前
駆体カルシトニンの配列を配列表の配列番号３のもとに
記載する（配列分析により確認）。 【００８７】１３２ｂｐ　のＰｓｔＩ断片を切り出し、
そしてヒルジン含有ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＰ
ｓｔＩ部位にクローニングする。形質転換体を挿入断片
の適切な方向について調べ、正しいプラスミドをＫＳ＋
／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−ＣＡＬＣと命名する。プラスミ
ドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ　をＳａｌＩと
ＨｉｎｄＩＩＩ　で消化し、そして７ｋｂ　の大きいベ
クター断片を単離する。 プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ　をＢ
ａｍＨＩ　とＨｉｎｄＩＩＩ　で消化し、３５０ｂｐ　
のＰＨ０５ターミネーター断片を得る。最後に、ｐＪＤ
Ｂ２０７　ベクター断片、ターミネーター断片およびＫ
Ｓ＋／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−ＣＡＬＣのＳａｌＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片を三元連結において連結せしめ、プラスミド
ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−ＣＡＬＣを得る
。 【００８８】実施例３に従って、プラスミドｐＪＤＢ２
０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−ＣＡＬＣを用いてサッカロ
ミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＴ２４６株（ＤＳＭ　４０８
４）を形質転換せしめる。形質転換された酵母細胞をロ
イシン欠損の酵母最少培地プレート上で選択する。単一
の形質転換酵母細胞を単離し、これをＳ．セレビシェー
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＨＴ２４６／ｐＪＤＢ
２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−ＣＡＬＣと命名する。 【００８９】融合タンパク質の発現および分泌のために
、Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｈ
Ｔ２４６／ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−ＣＡ
ＬＣを欧州特許出願第３４０１７０号（その明細書中の
実施例１０）に開示された通りに培養する。培養の４８
時間および７２時間後、試料を取り、遠心により細胞を
除去し、そして融合タンパク質を含む培養上清を更なる
処理のために取っておく。まず、ヒルジン−カルシトニ
ン融合タンパク質を含む上清を、実施例６に記載の先端
を切り取られた可溶性ｙｓｃＦタンパク質での消化によ
りタンパク質内分解的にスプライシングする。この開裂
は、全長の前駆体ヒトカルシトニンとまだＣ末端にリジ
ン−アルギニン延長部を含むヒルジン変種を生ぜしめる
。このリジン−アルギニン延長部を、精製酵素（実施例
１１を参照のこと）を使った　ｙｓｃα＊　での消化に
より除去する。リジン−アルギニン延長部の正確な除去
は、欧州特許出願第３４０１７０号において開示された
ような反応混合物の逆相ＨＰＬＣにより証明される。 【００９０】実施例１３：エグリンＣを発現する組換え
融合タンパク質の作製 式Ｐ−Ｌ−Ｔ 〔ここでＰはエグリンＣポリペプチド（Ｒｉｎｋ　Ｈ．
ら，　１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１
２，　６３６９−６３８７）であり、Ｌはリンカー配列
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔ
ｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ　であり、そしてＴはセルロモナ
ス・フィミ　（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉ）
　ｃｅｘ遺伝子においてコードされるセルロモナス・フ
ィミ　（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉ）　Ｅｘ
ｇタンパク質のセルロース結合性領域（Ｎｅｉｌｌ　Ｇ
．Ｏ．　ら，１９８６，　Ｇｅｎｅ　４４，　３２５−
３３０）である〕に従った融合タンパク質の発現を可能
にする融合ペプチドを作製する。 【００９１】詳しくは、プラスミドｐＥＣ−１（Ｎｅｉ
ｌｌ　Ｇ．Ｏ．ら，１９８６，　Ｇｅｎｅ　４４，　３
２５−３３０）をＳｍａＩとＳｔｕＩで完全に切断する
。セルロモナスｃｅｘ　遺伝子のセルロース結合性領域
をコードする４３３ｂｐ　断片を単離する。プラスミド
ｐ１８ｋｅｘｐ　（実施例１）をＡｓｐ７１８で切断し
、そしてクレノウポリメラーゼを使って粘着末端をフィ
ルインし、平滑末端にする。線状化されたプラスミドを
４３３ｂｐ　のＳｍａＩ−ＳｔｕＩ　ｃｅｘ　断片と連
結せしめ、これを用いて大腸菌ＨＢ１０１　を形質転換
させる。クローンを４３３ｂｐ　ｃｅｘ　断片の方向に
ついて調べる。ＫＥＸ２遺伝子の読み枠をｃｅｘ　遺伝
子の読み枠に結合する方向を有する１つのクローンをｐ
１８ｋｅｘｐｃｅｘと命名する。 【００９２】プラスミドｐＵＣ１９　をＳａｌＩとＢａ
ｍＨＩ　で消化し、ｐＢＲ３２２の２７６ｂｐ　Ｓａｌ
Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を挿入する。生じたプラスミドｐＵ
Ｃ１９ｐＢＲをＢａｍＨＩ　とＥｃｏＲＩ　で切断し、
そしてＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＩ　ＧＡＰＤＨプロモー
ター断片の存在下に連結せしめ、プラスミドｐＴＭ１を
得る。プラスミドｐＴＭ１をＥｃｏＲＩ　で切断し、そ
して次のリンカー： ５′−ＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡ　ＴＧＣＡＴＧＣＡＧＡ　
ＴＣＴ　−３′３　′−ＧＴＡＣＧＴ　ＡＣＧＴＡＣＧ
ＴＣＴ　ＡＧＡＴＴＡＡ　−５　′を、ＥｃｏＲＩ　部
位がプロモーター配列の近隣に再構成されるように挿入
する。生じたプラスミドをｐＴＭ２と命名する。 【００９３】プラスミドｐＭＬ１４７　（Ｒｉｎｋ　Ｈ
．　ら，　１９８４，　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ
．　１２，　６３６９−６３８７）を完全にＥｃｏＲＩ
　とＢａｍＨＩ　で切断する。ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ
　エグリンＣ断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ　切断ｐＢ
Ｒ３２２中にクローニングする。所望の配列を有する１
つのプラスミドをｐＭＬ１４１と命名する。次のオリゴ
ヌクレオチド： ５　′−ＣＣＧＧＴＡＣＣＣＡ　　ＡＧＣＴＴＣＧＧＣ
Ｔ　ＴＣＴＣＴＣＴＴＡＣ　ＣＡＡＣＡＴＧＣＧＧ　Ａ
ＡＣＡＴＧ−３′および ５　′−ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡ　ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡ
　ＣＴＧＡＡＴＴ−３′（上記に言及したリンカー配列
Ｌをコードする配列に下線が引かれている）を使って、
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−ＣｅｔｕｓからのＰＣＲ　
キットを用いてそして供給者の教示に厳密に従ってｐＭ
Ｌ１４１においてＰＣＲ　反応を行う。ＰＣＲ　反応は
、リンカー配列Ｌに連結したエグリンＣ遺伝子を含む２
５７ｂｐ　断片の増幅をもたらす。この断片をアガロー
スゲルから単離し、そしてＢａｍＨＩ　とＡｓｐ７１８
で完全に切断する。プラスミドｐ１８ｋｅｘｐｃｅｘ（
上記参照）をＢａｍＨＩ　とＡｓｐ７１８で完全に切断
し、３．１ｋｂ　断片を単離する。ｃｅｘ　遺伝子断片
を含む３．１ｋｂ　のＢａｍＨＩ−Ａｓｐ７１８　ｐ１
８ｋｅｘｐｃｅｘ　断片とｐＵＣ１９　配列を、ＰＣＲ
　生成ＢａｍＨＩ−Ａｓｐ７１８エグリンＣ断片と連結
せしめ、得られたプラスミドをｐ１８ｅｇｌｉｎｃｅｘ
　と命名する。このプラスミドは、エグリンＣの最初の
アミノ酸からＥｘｇ　タンパク質の最後のアミノ酸まで
に及ぶ転写解読枠を含む。２つの領域、すなわちエグリ
ンＣとＥｘｇ　の１３３　Ｃ末端アミノ酸（余分のプロ
リンを含む）は、上記に示したリンカー配列により隔て
られている。融合タンパク質をコードするヌクレオチド
配列（配列番号４を参照）をＤＮＡ配列決定により確認
する。 【００９４】プラスミドｐＴＭ２（前掲）をＥｃｏＲＩ
　で切断し、そして５′末端を脱リン酸する。プラスミ
ドｐ１８ｅｇｌｉｎｃｅｘ　をＥｃｏＲＩ　で切断し、
６８６ｂｐ　のエグリン−ｃｅｘ断片を単離する。この
６８６ｂｐ　断片を、ＥｃｏＲＩ　で切断され脱リン酸
されたベクターｐＴＭ２に連結せしめる。この得られた
クローンをエグリン−ｃｅｘ断片の方向性について調べ
る。次の配列の順序　：　ＧＡＰＤＨ−エグリン−ｃｅ
ｘ　を与える所望の方向を有する１つのクローンをｐ１
９／ＧＡＰＤＨ−ＥＧＬＩＮ−ＣＥＸ　と命名する。 【００９５】プラスミドｐ１９／ＧＡＰＤＨ−ＥＧＬＩ
Ｎ−ＣＥＸ　をＢａｍＨＩ　とＢｇｌＩＩ　で消化し、
そしてＧＡＰＤＨ　−エグリン−ｃｅｘ　配列をコード
する１．１ｋｂ　断片を単離する。プラスミドｐＤＰ３
４　をＢａｍＨＩ　で切断し、５′末端を脱リン酸し、
そして生じた断片を１．１ｋｂ　ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩ
Ｉ　断片と連結せしめる。クローンを１．１ｋｂ　Ｂａ
ｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ　断片の方向性について調べ、ｐＤ
Ｐ３４ＧＡＰＤＨ−ｅｇｌｉｎｃｅｘ−１　およびｐＤ
Ｐ３４ＧＡＰＤＨ−ｅｇｌｉｎｃｅｘ−２　と命名する
。ここで表示１は挿入断片　ＧＡＰＤＨ−エグリン−ｃ
ｅｘ　がプラスミドｐＤＰ３４　中時計方向を向いてい
ることを示し、一方表示２は挿入断片　ＧＡＰＤＨ−エ
グリン−ｃｅｘ　がプラスミドｐＤＰ３４　中反時計方
向を向いていることを示す。 【００９６】実施例３に従って、プラスミドｐＤＰ３４
ＧＡＰＤＨ−ｅｇｌｉｎｃｅｘ−１　を用いてサッカロ
ミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１１０株（ＡＴＣＣ　２０
７９６）を形質転換せしめる。ＡＢ１１０／ｐＤＰ３４
ＧＡＰＤＨ−ｅｇｌｉｎｃｅｘ−１　の細胞を１０ｍｌ
の最少培地（Ｄｉｆｃｏ　ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎ
　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　６．７
ｇ／ｌ，　　グルコース　４０ｇ／ｌ，　実施例３に記
載のアミノ酸／ヌクレオチド混合物　ｗ／ｏ　　ロイシ
ン）　中で増殖させる。主要培養物２５０ｍｌ　の最少
培地を予備培養物に接種し、１８０ｒｐｍにおいて３０
℃にて２４時間増殖させる。 生産培養物を次のように用意する。主要培養物の細胞を
遠心により培養ブロスから分離し、２５０ｍｌ　の二倍
最少培地（Ｄｉｆｃｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
　Ｂａｓｅ　ｗ／ｏＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ　１３．４ｇ
／ｌ，　グルコース　４０ｇ／ｌ，２×実施例３に記載
のアミノ酸／ヌクレオチド混合物　ｗ／ｏ　　ロイシン
）　中に再懸濁し、そして１８０ｒｐｍにおいて３０℃
にて２４時間醗酵させる。 【００９７】生産培養物の細胞を遠心により培地から分
離し、最初は２００　ｍｌ次に４０ｍｌの緩衝液Ａ（緩
衝液Ａ：５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．０，　１
００ｍＭ　ＮａＣｌ　）で洗浄する。各段階が約１０ｍ
ｌの緩衝液Ａと全容量４０ｍｌの粗抽出物を遠心（２５
０００　×ｇ，　１５　分，　４　℃）により清澄化す
る繰り返し段階において、細胞をガラスビーズで破壊す
る。５ｇ（乾燥重量）のセルロース（Ａｖｉｃｅｌまた
はセルロース繊維）を粗抽出物に添加し、回転振盪器上
で４　℃にて１．５　時間インキュベートする。 【００９８】セルロースに結合した融合タンパク質を水
により融合タンパク質として溶出させ、その後　ｙｓｃ
Ｆで消化し、Ｃ末端延長部　Ｌｙｓ−Ａｒｇを有するエ
グリンＣを生ぜしめる。それらの２つのＣ末端アミノ酸
は、　ｙｓｃαでの消化により除去される。詳しくは、
粗抽出物中でのインキュベーション後、セルロースをク
ロマトグラフィーカラム（１．６×２０ｃｍ）　に充填
し、そして３カラムベット体積の緩衝液Ａで洗浄する。 次いで緩衝液Ａと水の勾配を適用する。勾配は直線勾配
であり、そして１００％緩衝液Ａ，　０％水から０％緩
衝液Ａ，１００％水まで３カラムベット体積で行う。画
分を分取し、実施例５に記載の免疫学的方法により融合
タンパク質についてテストする。融合タンパク質を含む
画分を実施例６に記載の可溶性プロテアーゼ　ｙｓｃＦ
での処理にかけ、開裂生成物エグリンＣ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ　を得、その後これを可溶性　ｙｓｃα＊　で消化し
て　Ｌｙｓ−Ａｒｇ尾を除去する。 【００９９】あるいは、セルロースに結合した融合タン
パク質をセルロースに結合したままｙｓｃＦで消化し、
そしてＣ末端延長部　Ｌｙｓ−Ａｒｇを有するエグリン
Ｃから成るタンパク質を遊離させる。その後、このタン
パク質を　ｙｓｃα＊　で消化してそれらの２つのＣ末
端アミノ酸を除去する。詳しくは、粗抽出物とインキュ
ベートした後の様々な量（１０　ｍｇ〜５００ｍｇ）の
セルロースを、実施例６に記載のようにして可溶性プロ
テアーゼ　ｙｓｃＦと共にインキュベートし、それによ
りエグリンＣ−　Ｌｙｓ−Ａｒｇを遊離にする。エグリ
ンＣ−　Ｌｙｓ−Ａｒｇを更に可溶性　ｙｓｃα＊　で
消化して　Ｌｙｓ−Ａｒｇ尾を除去する。得られたエグ
リンＣは、ＨＰＬＣにより評価すると天然のエグリンＣ
と同一である。 【０１００】微生物の寄託 次の微生物株をＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　
ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　（ＤＳＭ）
，　ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ　１ｂ，　Ｄ−３３
００　Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ　　に寄託した（寄託
日と与えられた登録番号）。 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＤ
Ｐ３４　：　１９８８　年　３月１４日，　ＤＳＭ　４
４７３。 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　
ＢＹＳ２３２−３１−４２　：　１９８８年　５月　６
日，　ＤＳＭ　４５８３。 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０１／ｐＫ
Ｓ３０１ｂ　：　１９９０　年　６月２５日，　ＤＳＭ
　６０２８。 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１／ＫＥ
Ｘ１　：　１９９０年　６月２５日，　ＤＳＭ　６０２
７。 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０１／ｐ１
９／ＧＡＰＤＨ−ＥＧＬＩＮ−ＣＥＸ　：　１９９１　
年　６月　３日，　ＤＳＭ　６５４６。 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１８６６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：酵母 直接の起源 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１／ｐＫＳ３０１ｂ（
ＤＳＭ６０２８）配列の特徴 １‥１８６６　　可溶性　ｙｓｃＦコード領域　　配列 　　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＧＴＧ　ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＴＡＴ
　ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＴＴＡ　ＴＧＣ　ＴＴＴ　ＴＧＧ　
ＴＧＧ　ＧＣＣ　ＴＴＴ　　　　　　　４５　　Ｍｅｔ
　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　
Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ａ
ｌａ　Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１５　　　ＴＣＡ　
ＡＣＡ　ＴＣＣ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＧＴＡ　ＴＣＡ　Ｔ
ＣＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＴＴＧ　ＡＡ
Ｇ　ＧＡＣ　　　　　　　９０　　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓ
ｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
ｎ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　
　　　　　　　　　　３０　　　ＣＡＴ　ＡＣＧ　ＴＣ
Ａ　ＣＧＡ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＡ
　ＧＡＡ　ＡＧＣ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＴＴＡ　
　　　　　１３５　　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ
　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　
Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　３５　　　　　　　　　
　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　
　　　　４５　　　ＴＣＣ　ＣＧＣ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　
ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＣＣＡ　ＡＡＴ　ＴＧＧ　Ａ
ＡＡ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＣＡＴ　ＧＡＴ　　　　　　１
８０　　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍ
ｅｔ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｔｙ
ｒ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５０　　　　　　　　　　　　　　　
　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０
　　　ＧＴＴ　ＣＧＡ　ＧＧＧ　ＣＴＡ　ＣＣＡ　ＡＡ
Ｃ　ＣＡＴ　ＴＡＴ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＡＡＡ
　ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＣＴＡ　　　　　　２２５　　Ｖａ
ｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ
　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　
Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　ＡＡＡ
　ＴＴＧ　ＧＧＣ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＴＣＡ　
ＴＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＴＴＡ　ＣＡＧ　ＧＧＧ　Ｇ
ＡＴ　ＡＡＣ　　　　　　２７０　　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓ
ｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０　　
　　　　　　　　　　　　　　　　８５　　　　　　　
　　　　　　　　　　　９０　　　ＡＡＣ　ＧＡＣ　Ｃ
ＡＣ　ＡＴＡ　ＴＴＡ　ＴＣＴ　ＧＴＣ　ＣＡＴ　ＧＡ
Ｔ　ＴＴＡ　ＴＴＣ　ＣＣＧ　ＣＧＴ　ＡＡＣ　ＧＡＣ
　　　　　　３１５　　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｉｌ
ｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ
　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　９５　　　　　　　　
　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　　　　
　　　　１０５　　　ＣＴＡ　ＴＴＴ　ＡＡＧ　ＡＧＡ
　ＣＴＡ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　
ＣＣＡ　ＡＴＧ　ＧＡＣ　ＴＣＡ　ＡＧＣ　　　　　　
３６０　　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　
Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｍ
ｅｔ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１１０　　　　　　　　　　　　　　
　　　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２
０　　　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＣＣＧ　ＧＴＡ　ＡＡＡ　Ｇ
ＡＡ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＣＴＣ　ＡＧ
Ｃ　ＡＴＡ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　　　　　　４０５　　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌ
ａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ
　Ａｓｎ　Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１２５　　　　　　　　　　　　　　　　　１３０
　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　ＣＣ
Ｇ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＣＡＧ　ＴＧＧ
　ＣＡＣ　ＴＴＧ　ＧＴＣ　ＡＡＴ　ＣＣＡ　ＡＧＴ　
ＴＴＴ　ＣＣＴ　　　　　　４５０　　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ
　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｈｉｓ　
Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐ
ｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　
　　　　　　　　　　　　　　　１４５　　　　　　　
　　　　　　　　　　１５０　　ＧＧＣ　ＡＧＴ　ＧＡ
Ｔ　ＡＴＡ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＧ
　ＴＧＧ　ＴＡＣ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＡＴＴ　ＡＣＡ　
　　　　　４９５　　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ
　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　
Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　　
　　　　　　　　１６０　　　　　　　　　　　　　　
　　　１６５　　　ＧＧＣ　ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＧＴＣ　
ＧＴＧ　ＧＣＴ　ＧＣＣ　ＡＴＴ　ＧＴＴ　ＧＡＴ　Ｇ
ＡＴ　ＧＧＣ　ＣＴＴ　ＧＡＣ　ＴＡＣ　　　　　　５
４０　　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａ
ｌａ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌ
ｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　
　　１７５　　　　　　　　　　　　　　　　　１８０
　　　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡＣ　ＴＴＧ　ＡＡ
Ｇ　ＧＡＴ　ＡＡＴ　ＴＴＴ　ＴＧＣ　ＧＣＴ　ＧＡＡ
　ＧＧＴ　ＴＣＴ　ＴＧＧ　　　　　　５８５　　Ｇｌ
ｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ
　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　
Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１９０　
　　　　　　　　　　　　　　　　１９５　　　ＧＡＴ
　ＴＴＣ　ＡＡＣ　ＧＡＣ　ＡＡＴ　ＡＣＣ　ＡＡＴ　
ＴＴＡ　ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＣＣＡ　ＡＧＡ　ＴＴＡ　Ｔ
ＣＴ　ＧＡＴ　　　　　　６３０　　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　
Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐ
ｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓ
ｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２００　　
　　　　　　　　　　　　　　　２０５　　　　　　　
　　　　　　　　　　２１０　　　 　　 　　ＧＡＣ　ＴＡＣ　ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＡＣＧ　ＡＧＡ
　ＴＧＴ　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＡＴＡ　ＧＣＴ　
ＧＣＣ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　　　　　　６７５　　Ａｓｐ
　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　
Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌ
ｙｓ　Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２１５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０　　
　　　　　　　　　　　　　　　２２５　　　ＧＧＴ　
ＡＡＣ　ＡＡＴ　ＴＴＴ　ＴＧＣ　ＧＧＴ　ＧＴＣ　Ｇ
ＧＧ　ＧＴＡ　ＧＧＴ　ＴＡＣ　ＡＡＣ　ＧＣＴ　ＡＡ
Ａ　ＡＴＣ　　　　　　７２０　　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａ
ｓｎ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａ
ｌ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２３０　　　
　　　　　　　　　　　　　　２３５　　　　　　　　
　　　　　　　　　２４０　　　ＴＣＡ　ＧＧＣ　ＡＴ
Ａ　ＡＧＡ　ＡＴＣ　ＴＴＡ　ＴＣＣ　ＧＧＴ　ＧＡＴ
　ＡＴＣ　ＡＣＴ　ＡＣＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　
　　　　　７６５　　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ
　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　
Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２４５　　　　　　　　　
　　　　　　　　２５０　　　　　　　　　　　　　　
　　　２５５　　　ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＴＣＣ　ＴＴＧ　
ＡＴＴ　ＴＡＴ　ＧＧＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣ　ＧＴＡ　Ａ
ＡＣ　ＧＡＴ　ＡＴＡ　ＴＡＴ　ＴＣＡ　　　　　　８
１０　　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔ
ｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓ
ｐ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２６０　　　　　　　　　　　　　　　
　　２６５　　　　　　　　　　　　　　　　　２７０
　　　ＴＧＣ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＧＧＴ　ＣＣＣ　ＧＣ
Ｔ　ＧＡＴ　ＧＡＣ　ＧＧＡ　ＡＧＡ　ＣＡＴ　ＴＴＡ
　ＣＡＡ　ＧＧＣ　ＣＣＴ　　　　　　８５５　　Ｃｙ
ｓ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ
　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　
Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２７５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０　
　　　　　　　　　　　　　　　　２８５　　　ＡＧＴ
　ＧＡＣ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　
ＴＴＡ　ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　Ｇ
ＡＧ　ＧＧＡ　　　　　　９００　　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　
Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖ
ａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌ
ｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２９０　　
　　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　　　　　
　　　　　　　　　　３００　　　ＡＧＡ　ＧＡＴ　Ｔ
ＣＣ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＧＣＧ　ＡＴＴ　ＴＡＣ　ＧＴ
Ｔ　ＴＴＴ　ＧＣＣ　ＡＧＴ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＧＧＴ
　　　　　　９４５　　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙ
ｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ
　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　３０５　　　　　　　　
　　　　　　　　　３１０　　　　　　　　　　　　　
　　　　３１５　　　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＣＧＴ　ＧＧＴ
　ＧＡＴ　ＡＡＴ　ＴＧＣ　ＡＡＴ　ＴＡＣ　ＧＡＣ　
ＧＧＣ　ＴＡＴ　ＡＣＴ　ＡＡＴ　ＴＣＣ　　　　　　
９９０　　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔ
ｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　３２０　　　　
　　　　　　　　　　　　　３２５　　　　　　　　　
　　　　　　　　３３０　　　ＡＴＡ　ＴＡＴ　ＴＣＴ
　ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＡＴＴ　ＧＧＧ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　
ＧＡＴ　ＣＡＣ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＣＡＴ　　
　　　１０３５　　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　
Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｈ
ｉｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　３３５　　　　　　　　　　
　　　　　　　３４０　　　　　　　　　　　　　　　
　　３４５　　　 　　 　　ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＴＡＴ　ＴＣＣ　ＧＡＡ　ＧＧＴ
　ＴＧＴ　ＴＣＣ　ＧＣＣ　ＧＴＣ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　
ＧＴＣ　ＡＣＧ　ＴＡＴ　　　　　１０８０　　Ｐｒｏ
　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　
Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔ
ｈｒ　Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
３５０　　　　　　　　　　　　　　　　　３５５　　
　　　　　　　　　　　　　　　３６０　　　ＴＣＴ　
ＴＣＡ　ＧＧＴ　ＴＣＡ　ＧＧＣ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　Ａ
ＴＴ　ＣＡＴ　ＴＣＧ　ＡＧＴ　ＧＡＴ　ＡＴＣ　ＡＡ
Ｃ　ＧＧＣ　　　　　１１２５　　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｈｉ
ｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３６５　　　
　　　　　　　　　　　　　　３７０　　　　　　　　
　　　　　　　　　３７５　　　ＡＧＡ　ＴＧＣ　ＡＧ
Ｔ　ＡＡＴ　ＡＧＣ　ＣＡＣ　ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＡＣＧ
　ＴＣＴ　ＧＣＧ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＴＴＡ　
　　　　１１７０　　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ
　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　
Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　３８０　　　　　　　　　
　　　　　　　　３８５　　　　　　　　　　　　　　
　　　３９０　　　ＧＣＴ　ＧＣＣ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　
ＴＡＣ　ＡＣＴ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＧＡＡ　Ｇ
ＣＣ　ＡＡＣ　ＣＣＡ　ＡＡＣ　ＣＴＡ　　　　　１２
１５　　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓ
ｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　３９５　　　　　　　　　　　　　　　
　　４００　　　　　　　　　　　　　　　　　４０５
　　　ＡＣＴ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＧＡＣ　ＧＴＡ　ＣＡ
Ｇ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＡＴＣ　ＴＴＧ　ＴＣＴ
　ＧＣＧ　ＧＴＡ　ＧＧＧ　　　　　１２６０　　Ｔｈ
ｒ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ
　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　
Ｖａｌ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　４１０　　　　　　　　　　　　　　　　　４１５　
　　　　　　　　　　　　　　　　４２０　　　ＴＴＡ
　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＡＡＣ　ＧＣＴ　ＧＡＣ　ＧＧＡ　
ＧＡＴ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＡＧＣ　ＧＣＣ　Ａ
ＴＧ　ＧＧＧ　　　　　１３０５　　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　
Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔ
ｒｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｇｌ
ｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４２５　　
　　　　　　　　　　　　　　　４３０　　　　　　　
　　　　　　　　　　４３５　　　ＡＡＧ　ＡＡＡ　Ｔ
ＡＣ　ＴＣＴ　ＣＡＴ　ＣＧＣ　ＴＡＴ　ＧＧＣ　ＴＴ
Ｔ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣ　ＧＡＴ　ＧＣＣ　ＣＡＴ
　　　　　１３５０　　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ
　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　４４０　　　　　　　　
　　　　　　　　　４４５　　　　　　　　　　　　　
　　　　４５０　　　ＡＡＧ　ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＧＡＡ
　ＡＴＧ　ＴＣＣ　ＡＡＧ　ＡＣＣ　ＴＧＧ　ＧＡＧ　
ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＡＡＣ　ＧＣＡ　ＣＡＡ　　　　　１
３９５　　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　
Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖ
ａｌ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　４５５　　　　　　　　　　　　　　
　　　４６０　　　　　　　　　　　　　　　　　４６
５　　　ＡＣＣ　ＴＧＧ　ＴＴＴ　ＴＡＣ　ＣＴＧ　Ｃ
ＣＡ　ＡＣＡ　ＴＴＧ　ＴＡＴ　ＧＴＴ　ＴＣＣ　ＣＡ
Ｇ　ＴＣＣ　ＡＣＡ　ＡＡＣ　　　　　１４４０　　Ｔ
ｈｒ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈ
ｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ
　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４７０　　　　　　　　　　　　　　　　　４７５
　　　　　　　　　　　　　　　　　４８０　　　 　　 　　ＴＣＣ　ＡＣＧ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＴＴＡ
　ＧＡＡ　ＴＣＣ　ＧＴＣ　ＡＴＡ　ＡＣＣ　ＡＴＡ　
ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　　　　　１４８５　　Ｓｅｒ
　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　
Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｕ　Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
４８５　　　　　　　　　　　　　　　　　４９０　　
　　　　　　　　　　　　　　　４９５　　　ＡＧＴ　
ＣＴＴ　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＡＡＣ　ＴＴＣ　Ａ
ＡＧ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＣＡＣ　ＧＴＣ　ＡＣ
Ｇ　ＧＴＡ　　　　　１５３０　　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｎ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｒ
ｇ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５００　　　
　　　　　　　　　　　　　　５０５　　　　　　　　
　　　　　　　　　５１０　　　ＡＣＴ　ＧＴＡ　ＧＡ
Ｔ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＡＧＧ
　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＡＣＧ　ＡＣＴ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　
　　　　１５７５　　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ
　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　
Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　５１５　　　　　　　　　
　　　　　　　　５２０　　　　　　　　　　　　　　
　　　５２５　　　ＴＴＡ　ＡＴＡ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　
ＧＣＧ　ＧＧＧ　ＡＴＡ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＡＡＣ　Ｃ
ＴＴ　ＧＧＣ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＡＧＡ　　　　　１６
２０　　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　５３０　　　　　　　　　　　　　　　
　　５３５　　　　　　　　　　　　　　　　　５４０
　　　ＣＣＡ　ＡＧＡ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　ＴＣ
Ａ　ＧＡＧ　ＧＧＡ　ＴＴＣ　ＡＡＡ　ＧＡＣ　ＴＧＧ
　ＡＣＡ　ＴＴＣ　ＡＴＧ　　　　　１６６５　　Ｐｒ
ｏ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ
　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　
Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　５４５　　　　　　　　　　　　　　　　　５５０　
　　　　　　　　　　　　　　　　５５５　　　ＴＣＴ
　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＴＧＧ　ＧＧＴ　ＧＡＧ　
ＡＡＣ　ＧＧＣ　ＧＴＡ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＴＧＧ　Ａ
ＡＡ　ＡＴＣ　　　　　１７１０　　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　
Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｉｌ
ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５６０　　
　　　　　　　　　　　　　　　５６５　　　　　　　
　　　　　　　　　　５７０　　　ＡＡＧ　ＧＴＴ　Ａ
ＡＧ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　ＣＡ
Ｃ　ＡＧＧ　ＡＴＴ　ＧＡＣ　ＴＴＣ　ＣＡＣ　ＡＧＴ
　　　　　１７５５　　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈ
ｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ
　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　５７５　　　　　　　　
　　　　　　　　　５８０　　　　　　　　　　　　　
　　　　５８５　　　ＴＧＧ　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ
　ＣＴＣ　ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＧＡＡ　ＴＣＣ　ＡＴＴ　
ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　　　　　１
８００　　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　
Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｓ
ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５９０　　　　　　　　　　　　　　
　　　５９５　　　　　　　　　　　　　　　　　６０
０　　　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＴＴＣ　ＧＴＣ　ＴＴＴ　Ｇ
ＧＡ　ＡＡＣ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴ
Ｔ　ＧＡＡ　ＣＣＡ　ＧＧＧ　　　　　１８４５　　Ｇ
ｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓ
ｎ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ
　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　６０５　　　　　　　　　　　　　　　　　６１０
　　　　　　　　　　　　　　　　　６１５　　　 　　 　　ＧＴＡ　ＣＣＧ　ＡＧＣ　ＴＣＧ　ＡＡＴ　ＴＣＧ
　ＴＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１８６６　　Ｖａｌ
　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　６２０　配列番号：２ 配列の長さ：１７９７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：酵母 直接の起源 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１／ＫＥＸ１（ＤＳＭ
６０２７）　配列の特徴 １‥１７９７　　可溶性　ｙｓｃα＊　コード領域　　
配列 　　ＡＴＧ　ＴＴＴ　ＴＡＣ　ＡＡＴ　ＡＧＧ　ＴＧＧ
　ＣＴＣ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　ＴＧＧ　ＣＴＡ　ＧＣＣ　
ＡＴＧ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　　　　　　　４５　　Ｍｅｔ
　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｓ
ｅｒ　Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１５　　　ＴＴＡ　
ＡＴＡ　ＡＧＧ　ＡＴＣ　ＴＣＡ　ＧＴＡ　ＴＣＣ　Ｃ
ＴＴ　ＣＣＧ　ＴＣＡ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＴＡ
Ｃ　ＡＡＡ　　　　　　　９０　　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａ
ｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒ
ｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０　　　
　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　
　　　　　　　　　　３０　　　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＴＡ
Ｔ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＧＧＧ　ＴＴＡ
　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＧＡＣ　ＣＣＴ　
　　　　　１３５　　　　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇ
ｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　３５　　　　　　　
　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　
　　　　　　４５　　　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＡＴＴ　ＣＣ
Ａ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＧＣＴ　ＧＧＣ　ＣＡＴ
　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＴＴＡ　ＣＧＴ　ＴＣＣ　　　　　
　１８０　　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ
　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　
Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　５０　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
６０　　　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＣＧ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　
ＣＡＧ　ＧＡＴ　ＡＧＣ　ＴＣＴ　ＧＡＣ　ＴＴＧ　Ｇ
ＡＧ　ＴＡＣ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　　　　　　２２５　　
Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ａ
ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙ
ｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　Ｔ
ＧＧ　ＡＡＧ　ＴＴＴ　ＡＣＣ　ＡＡＴ　ＡＡＣ　ＧＡ
Ｃ　ＴＣＴ　ＡＡＴ　ＧＧＣ　ＡＡＴ　ＧＴＣ　ＧＡＣ
　ＣＧＴ　ＣＣＣ　　　　　　２７０　　Ｔｒｐ　Ｌｙ
ｓ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ
　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　
Ｐｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　８５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　９０　　　ＴＴＡ　ＡＴＴ
　ＡＴＡ　ＴＧＧ　ＴＴＡ　　ＡＡ　ＧＧＴ　ＧＧＡ　
ＣＣＣ　ＧＧＴ　ＴＧＣ　ＴＣＴ　ＴＣＣ　ＡＴＧ　Ｇ
ＡＴ　　　　　　３１５　　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　
Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｌｙ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　　　　　　
　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　　
　　　　　　１０５　　　ＧＧＴ　ＧＣＣ　ＴＴＧ　Ｇ
ＴＣ　ＧＡＡ　ＴＣＣ　ＧＧＣ　ＣＣＴ　ＴＴＴ　ＡＧ
Ｇ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＧＡＣ　ＧＧＴ　　　　
　　３６０　　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌ
ｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｖａｌ
　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１１０　　　　　　　　　　　　
　　　　　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　
１２０　　　ＡＡＡ　ＣＴＴ　ＴＡＴ　ＣＴＡ　ＡＡＴ
　ＧＡＡ　ＧＧＧ　ＴＣＣ　ＴＧＧ　ＡＴＡ　ＴＣＣ　
ＡＡＡ　ＧＧＣ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　　　　　　４０５　
　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　
Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１２５　　　　　　　　　　　　　　　　　１
３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　
ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＡＴＣ　ＧＡＣ　ＣＡＡ　ＣＣＴ　Ａ
ＣＴ　ＧＧＴ　ＡＣＴ　ＧＧＧ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＧＴ
Ｃ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　　　　　　４５０　　Ｌｅｕ　Ｐ
ｈｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ
　Ｇｌｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４
０　　　　　　　　　　　　　　　　　１４５　　　　
　　　　　　　　　　　　　１５０　　　ＡＡＴ　ＡＡ
Ａ　ＧＡＣ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＡＴＣ　ＧＡＣ
　ＡＡＡ　ＡＡＣ　ＡＡＡ　ＴＴＴ　ＧＡＣ　ＧＡＡ　
ＧＡＣ　　　　　　４９５　　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ
　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　
Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　　　　
　　　　　　　　　　　　１６０　　　　　　　　　　
　　　　　　　１６５　　　ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　
ＧＴＧ　ＡＣＣ　ＡＡＧ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　ＡＴＧ　Ｇ
ＡＴ　ＴＴＴ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＣ　ＴＡＴ　　　
　　　５４０　　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔ
ｈｒ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｐｈ
ｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　
　　　　　　１７５　　　　　　　　　　　　　　　　
　１８０　　　ＴＴＣ　ＡＡＧ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　ＣＣ
Ａ　ＧＡＡ　ＧＡＣ　ＣＴＣ　ＡＣＴ　ＡＧＧ　ＡＡＡ
　ＡＴＣ　ＡＴＡ　ＣＴＡ　ＴＣＧ　　　　　　５８５
　　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ
　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　
Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　
１９０　　　　　　　　　　　　　　　　　１９５　　
　 　　 　　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＡＧＴ　ＴＡＣ　ＧＣＴ　ＧＧＣ
　ＣＡＡ　ＴＡＣ　ＡＴＡ　ＣＣＡ　ＴＴＣ　ＴＴＴ　
ＧＣＣ　ＡＡＴ　ＧＣＡ　　　　　　６３０　　Ｇｌｙ
　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　
Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａ
ｓｎ　Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２００　　　　　　　　　　　　　　　　　２０５　　
　　　　　　　　　　　　　　　２１０　　　ＡＴＴ　
ＴＴＧ　ＡＡＣ　ＣＡＴ　ＡＡＣ　ＡＡＡ　ＴＴＴ　Ｔ
ＣＡ　ＡＡＧ　ＡＴＣ　ＧＡＣ　ＧＧＧ　ＧＡＴ　ＡＣ
Ａ　ＴＡＣ　　　　　　６７５　　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａ
ｓｎ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙ
ｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２１５　　　
　　　　　　　　　　　　　　２２０　　　　　　　　
　　　　　　　　　２２５　　　ＧＡＣ　ＴＴＧ　ＡＡ
Ｇ　ＧＣＧ　ＣＴＡ　ＴＴＧ　ＡＴＴ　ＧＧＴ　ＡＡＣ
　ＧＧＴ　ＴＧＧ　ＡＴＴ　ＧＡＣ　ＣＣＣ　ＡＡＴ　
　　　　　７２０　　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ
　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　
Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２３０　　　　　　　　　
　　　　　　　　２３５　　　　　　　　　　　　　　
　　　２４０　　　ＡＣＡ　ＣＡＧ　ＴＣＣ　ＣＴＡ　
ＴＣＧ　ＴＡＣ　ＣＴＴ　ＣＣＧ　ＴＴＴ　ＧＣＴ　Ａ
ＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　　　　　　７
６５　　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｇｌ
ｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２４５　　　　　　　　　　　　　　　
　　２５０　　　　　　　　　　　　　　　　　２５５
　　　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＡＧＣ　ＡＡＣ　ＣＣ
Ｃ　ＡＡＴ　ＴＴＣ　ＡＡＡ　ＣＡＣ　ＴＴＡ　ＡＣＧ
　ＡＡＣ　ＧＣＡ　ＣＡＣ　　　　　　８１０　　Ｉｌ
ｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ
　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
Ａｌａ　Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　　２６５　
　　　　　　　　　　　　　　　　２７０　　　ＧＡＧ
　ＡＡＴ　ＴＧＣ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＡ　
ＡＡＣ　ＴＣＴ　ＧＣＣ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　ＧＡＴ　Ｇ
ＡＧ　ＧＣＡ　　　　　　８５５　　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　
Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｓ
ｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌ
ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２７５　　
　　　　　　　　　　　　　　　２８０　　　　　　　
　　　　　　　　　　２８５　　　ＧＣＣ　ＣＡＴ　Ｔ
ＴＴ　ＴＣＧ　ＴＡＴ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＴＧＴ　ＧＡ
Ｇ　ＡＡＴ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＡＡＣ　ＣＴＴ　ＣＴＡ
　　　　　　９００　　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅ
ｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ
　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２９０　　　　　　　　
　　　　　　　　　２９５　　　　　　　　　　　　　
　　　　３００　　　ＴＴＧ　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＡＣＣ
　ＡＧＧ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＴＣＧ　ＣＡＡ　ＡＡＧ　
ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＧＣＧ　ＧＡＴ　ＴＧＣ　　　　　　
９４５　　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　
Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔ
ｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　３０５　　　　　　　　　　　　　　
　　　３１０　　　　　　　　　　　　　　　　　３１
５　　　ＴＴＧ　ＡＡＣ　ＡＴＧ　ＴＡＴ　ＡＡＣ　Ｔ
ＴＣ　ＡＡＴ　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＡＧＴ　ＴＡ
Ｔ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＴＧＴ　　　　　　９９０　　Ｌ
ｅｕ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｓ
ｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ
　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　３２０　　　　　　　　　　　　　　　　　３２５
　　　　　　　　　　　　　　　　　３３０　　　 　　 　　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＡＡＴ　ＴＧＧ　ＣＣＧ　ＡＡＡ
　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＴＣＣ　ＴＴＴ　ＧＴＣ　ＡＧＴ　
ＡＡＡ　ＴＴＣ　ＴＴＣ　　　　　１０３５　　Ｇｌｙ
　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　
Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐ
ｈｅ　Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
３３５　　　　　　　　　　　　　　　　　３４０　　
　　　　　　　　　　　　　　　３４５　　　ＡＧＣ　
ＡＣＡ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＡＴＴ　ＧＡＴ　Ｔ
ＣＧ　ＴＴＧ　ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＧＡ
Ｔ　ＡＡＡ　　　　　１０８０　　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐ
ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３５０　　　
　　　　　　　　　　　　　　３５５　　　　　　　　
　　　　　　　　　３６０　　　ＡＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡ
Ｔ　ＴＧＧ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＴＧＣ　ＡＣＴ　ＡＡＴ
　ＡＧＣ　ＧＴＴ　ＧＧＡ　ＡＣＴ　ＡＡＡ　ＴＴＧ　
　　　　１１２５　　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ
　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　
Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　３６５　　　　　　　　　
　　　　　　　　３７０　　　　　　　　　　　　　　
　　　３７５　　　ＴＣＴ　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＡＴＴ　
ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＡＴＣ　ＣＡＴ　Ｔ
ＴＡ　ＴＴＡ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＣＴＡ　　　　　１１
７０　　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌ
ｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅ
ｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　３８０　　　　　　　　　　　　　　　
　　３８５　　　　　　　　　　　　　　　　　３９０
　　　ＣＴＴ　ＧＡＡ　ＡＧＴ　ＧＧＡ　ＡＴＡ　ＧＡ
Ｇ　ＡＴＴ　ＧＴＣ　ＴＴＧ　ＴＴＣ　ＡＡＴ　ＧＧＴ
　ＧＡＣ　ＡＡＡ　ＧＡＣ　　　　　１２１５　　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ
　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　
Ｌｙｓ　Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　３９５　　　　　　　　　　　　　　　　　４００　
　　　　　　　　　　　　　　　　４０５　　　ＴＴＧ
　ＡＴＴ　ＴＧＴ　ＡＡＴ　ＡＡＣ　ＡＡＧ　ＧＧＣ　
ＧＴＡ　ＴＴＡ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＡ　ＧＡＣ　Ａ
ＡＴ　ＣＴＡ　　　　　１２６０　　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　
Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌ
ｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｅ
ｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４１０　　
　　　　　　　　　　　　　　　４１５　　　　　　　
　　　　　　　　　　４２０　　　ＡＡＡ　ＴＧＧ　Ｇ
ＧＴ　ＧＧＡ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＡＧ
Ｃ　ＧＡＣ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＴＣＧ　ＴＴＣ
　　　　　１３０５　　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌ
ｙ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ
　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　４２５　　　　　　　　
　　　　　　　　　４３０　　　　　　　　　　　　　
　　　　４３５　　　ＧＡＴ　ＴＧＧ　ＡＴＣ　ＣＡＴ
　ＡＡＡ　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＡＧＴ　ＡＣＡ　ＧＡＣ　
ＧＡＣ　ＡＧＣ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　　　　　１
３５０　　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　
Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　４４０　　　　　　　　　　　　　　
　　　４４５　　　　　　　　　　　　　　　　　４５
０　　　ＡＧＣ　ＧＧＡ　ＴＡＣ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　Ｔ
ＡＴ　ＧＡＴ　ＡＧＡ　ＡＡＴ　ＴＴＧ　ＡＣＧ　ＴＴ
Ｔ　ＧＴＴ　ＡＧＣ　ＧＴＴ　　　　　１３９５　　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓ
ｐ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ
　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４５５　　　　　　　　　　　　　　　　　４６０
　　　　　　　　　　　　　　　　　４６５　　　 　　 　　ＴＡＴ　ＡＡＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＣ　ＡＴＧ
　ＧＴＡ　ＣＣＣ　ＴＴＣ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＴ　
ＴＴＡ　ＧＴＧ　ＡＧＴ　　　　　１４４０　　Ｔｙｒ
　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　
Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖ
ａｌ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
４７０　　　　　　　　　　　　　　　　　４７５　　
　　　　　　　　　　　　　　　４８０　　　ＡＧＡ　
ＧＧＣ　ＡＴＴ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＴＡＣ　Ｔ
ＣＧ　ＡＡＣ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＡＴＣ　ＡＴ
Ｔ　ＧＡＣ　　　　　１４８５　　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｉ
ｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｓ
ｎ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４８５　　　
　　　　　　　　　　　　　　４９０　　　　　　　　
　　　　　　　　　４９５　　　ＡＡＣ　ＡＡＴ　ＧＧ
Ｇ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＴ
　ＡＣＴ　ＧＡＣ　ＧＡＣ　ＧＡＴ　ＡＧＴ　ＧＡＴ　
　　　　１５３０　　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ
　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　
Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　５００　　　　　　　　　
　　　　　　　　５０５　　　　　　　　　　　　　　
　　　５１０　　　ＣＡＡ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　
ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＡＧＣ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＡＡＧ　Ｃ
ＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＣ　ＣＴＣ　　　　　１５
７５　　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇ
ｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙ
ｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　５１５　　　　　　　　　　　　　　　
　　５２０　　　　　　　　　　　　　　　　　５２５
　　　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＣＡＧ　ＧＡ
Ａ　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＧＡ
　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　　　　　１６２０　　Ｇｌ
ｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ
　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　
Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　５３０　　　　　　　　　　　　　　　　　５３５　
　　　　　　　　　　　　　　　　５４０　　　ＧＡＡ
　ＧＧＣ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　
ＧＧＣ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＡＡＣ　ＧＡＣ　Ａ
ＡＴ　ＧＡＴ　　　　　１６６５　　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　
Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓ
ｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５４５　　
　　　　　　　　　　　　　　　５５０　　　　　　　
　　　　　　　　　　５５５　　　ＧＡＣ　ＧＡＣ　Ｇ
ＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡＣ　ＧＡＴ　ＣＡＣ　ＡＡＣ　ＴＣ
Ｃ　ＧＡＧ　ＧＧＣ　ＧＡＣ　ＧＡＣ　ＧＡＴ　ＧＡＴ
　　　　　１７１０　　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌ
ｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ
　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　５６０　　　　　　　　
　　　　　　　　　５６５　　　　　　　　　　　　　
　　　　５７０　　　ＧＡＣ　ＧＡＴ　ＧＡＣ　ＧＡＴ
　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡＣ　ＧＡＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　
ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＡＧＴ　ＡＡＴ　　　　　１
７５５　　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　
Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌ
ｙｓ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５７５　　　　　　　　　　　　　　
　　　５８０　　　　　　　　　　　　　　　　　５８
５　　　ＣＡＡ　ＧＧＣ　ＣＴＣ　ＧＡＣ　ＴＡＣ　Ｇ
ＴＣ　ＧＴＡ　ＡＧＧ　ＣＣＧ　ＴＴＴ　ＣＴＧ　ＡＣ
Ａ　ＧＡＧ　ＴＡＡ　　　　　　　　　１７９７　　Ｇ
ｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｖａ
ｌ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５９０　　　
　　　　　　　　　　　　　　５９５　配列番号：３ 配列の長さ：１３２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 直接の起源 Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＴ２
４６／ｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ−ＣＡＬ
Ｃ 配列の特徴 １‥７　　　ｙｓｃＦと　ｙｓｃα＊　により開裂され
得るコード領域と　ＰｓｔＩ制限部位を含むリンカー配
列８‥１２７　　ヒトカルシトニンのＣ末端グリシン前
駆体コード領域 １２５‥１３２　　　ＰｓｔＩ制限部位を含む配列　　
配列 　　Ｇ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＧＴＡ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　Ｇ
ＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＴＧＴ　ＧＧＴ　ＡＡＣ　ＴＴ
Ｇ　ＴＣＴ　ＡＣＣ　ＴＧＴ　　　　　４６　　　　Ｌ
ｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙ
ｓ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ
　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　　　
ＡＴＧ　ＴＴＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣ　ＴＡＣ　ＡＣＣ　Ｃ
ＡＡ　ＧＡＣ　ＴＴＣ　ＡＡＣ　ＡＡＧ　ＴＴＣ　ＣＡ
Ｃ　ＡＣＣ　ＴＴＣ　　　　　　　９１　　Ｍｅｔ　Ｌ
ｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ａｓ
ｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ
　Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　　
　　　　　　　　　　　　　　３０　　　ＣＣＡ　ＣＡ
Ａ　ＡＣＣ　ＧＣＴ　ＡＴＣ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＧＧＴ
　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＴＧＡ　ＣＴＧＣＡ　　　
　　　　　　　　　１３２　　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ
　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　
Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　
配列番号：４ 配列の長さ：２１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 直接の起源 Ｓ．セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＢ１
１０／ｐＤＰ３４ＧＡＰＤＨ−ｅｇｌｉｎｃｅｘ−１　 配列の特徴 １‥７１　　エグリンＣのアミノ酸配列７２‥７９　　
リンカー配列 ８０‥２１２　　Ｃ．フィミ（Ｃ．ｆｉｍｉ）Ｅｘｇタ
ンパク質のセルロース結合性領域のアミノ酸配列 　　配列 　　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ
　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　
Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　　
　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　
Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｅｕ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　　　
Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐ
ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒ
ｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　　　Ｌ
ｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｒ
ｇ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ
　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　　　Ｔｈ
ｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ
　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　
Ｇｌｕ　Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　Ｇｌｕ
　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　
Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　８５　　
　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　Ｔｈｒ　
Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈ
ｒ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
９５　　　　　　　　　　　　　　　　　１００　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　Ｇｌｙ　Ｐ
ｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｌｅ
ｕ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ
　Ａｓｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１１
０　　　　　　　　　　　　　　　　　１１５　　　　
　　　　　　　　　　　　　１２０　　　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ
　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　
Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２５
　　　　　　　　　　　　　　　　　１３０　　　　　
　　　　　　　　　　　　１３５　　　Ｐｒｏ　Ｖａｌ
　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　
Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇ
ｌｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　
　　　　　　　　　　　　　　　　１４５　　　　　　
　　　　　　　　　　　１５０　　　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　
Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅ
ｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５５　　
　　　　　　　　　　　　　　　１６０　　　　　　　
　　　　　　　　　　１６５　　　 　　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｓｎ
　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　
Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　　　
１７５　　　　　　　　　　　　　　　　　１８０　　
　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　
Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１
９０　　　　　　　　　　　　　　　　　１９５　　　
Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｐ
ｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒ
ｏ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　２００　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
５　　　　　　　　　　　　　　　　　２１０　　　Ｖ
ａｌ　Ｇｌｙ　

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　生物活性タンパク質の製造方法であっ
    て、 （１）　前記生物活性タンパク質から各々成る１または
    複数の連続タンパク質セグメントであって、それのＣ末
    端アミノ酸がリンカーポリペプチド配列Ｌに連結してお
    り、Ｎ末端の１番目および２番目、そして複数の連続タ
    ンパク質セグメントの場合には更に前記リンカーポリペ
    プチド配列ＬのＣ末端の最後から２番目および最後のア
    ミノ酸残基が　Ｌｙｓおよび　Ａｒｇから選択された塩
    基性アミノ酸である、１または複数の連続タンパク質セ
    グメント、および （２）　前記連続タンパク質セグメントのＣ末端アミノ
    酸に連結しているポリペプチド　ｔａｇ、または（１）
    　Ｎ末端アミノ酸に連結しているポリペプチド　ｔａｇ
    、および （２）　リンカーポリペプチド配列Ｌから各々成る複数
    の連続タンパク質セグメントであって、前記リンカーポ
    リペプチド配列ＬのＮ末端の１番目および２番目並びに
    Ｃ末端の最後から２番目および最後のアミノ酸残基が　
    Ｌｙｓおよび　Ａｒｇから選択された塩基性アミノ酸で
    あり、そして前記リンカーポリペプチド配列Ｌの最後の
    塩基性アミノ酸が前記生物活性なタンパク質に連結して
    いる、複数の連続タンパク質セグメント、から成る融合
    タンパク質を、可溶性酵母エンドプロテアーゼ　ｙｓｃ
    Ｆおよび可溶性酵母カルボキシペプチダーゼ　ｙｓｃα
    で処理し、そして前記生物活性タンパク質を単離するこ
    とを含んで成る方法。
  2. 【請求項２】　　前記融合タンパク質が下式：（Ｐ−Ｌ
    ）ｍ　−Ｔ　　　　　　（Ｉ）　またはＴ−（Ｌ−Ｐ）
    ｎ　　　　　（ＩＩ） （上式中、Ｐは生物活性タンパク質であり、Ｌは請求項
    １において与えられた意味を有し、Ｔはポリペプチド　
    ｔａｇであり、ｍは１〜１０の整数であり、そしてｎは
    ２〜１０の整数である）を有する、請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】　　前記融合タンパク質が下式（Ｐ−Ｌ）
    ｍ　−Ｔ　　　　　　（Ｉ）　（上式中、Ｐ，Ｌおよび
    Ｔは上記において与えられた意味を有し、そしてｍは１
    である）を有する、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】　　前記生物活性タンパク質が原核生物ま
    たは真核生物起源のものである、請求項１に記載の方法
    。
  5. 【請求項５】　　前記生物活性タンパク質が哺乳動物起
    源のものである、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】　　前記生物活性タンパク質が、ホルモン
    、免疫活性調節性、抗ウイルス性および抗腫瘍性を有す
    るポリペプチド、抗体、ウイルス抗原、血液凝固因子、
    繊維素溶解剤または成長調節因子である、請求項１に記
    載の方法。
  7. 【請求項７】　　前記生物活性タンパク質が、ヒトαイ
    ンターフェロン、ハイブリッドインターフェロン、ヒト
    組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒト一本鎖ウロキナ
    ーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、ハイブリッドプラ
    スミノーゲン活性化因子、形質転換増殖因子β、ヒトカ
    ルシトニン、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩ並びに
    デスルフェートヒルジンから成る群から選択される、請
    求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】　　前記リンカーポリペプチド配列Ｌが２
    〜約２０個のアミノ酸残基を含んで成りそして１または
    複数の塩基性アミノ酸ペアを含み、ただしＮ末端の１番
    目および２番目並びにＣ末端の最後から２番目および最
    後のアミノ酸残基がそのような塩基性アミノ酸ペアを表
    す、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】　　前記リンカーポリペプチド配列ＬがＡ
    ｒｇ−Ａｒｇ，　Ｌｙｓ−Ａｒｇ，　Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　
    およびＡｒｇ−Ｌｙｓ　から選択されたジペプチド残基
    である、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】　　前記ポリペプチドｔａｇ　Ｔが約１
    ０〜約１０００アミノ酸残基から成る、請求項１に記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】　　ｍが１〜５の整数である、請求項１
    に記載の方法。
  12. 【請求項１２】　　ｎが２〜５の整数である、請求項１
    に記載の方法。
  13. 【請求項１３】　　前記可溶性　ｙｓｃＦが、疎水性膜
    結合部位が除去されている酵母エンドプロテアーゼ　ｙ
    ｓｃＦの変異体である、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】　　前記可溶性　ｙｓｃαが、疎水性膜
    結合部位が除去されている酵母カルボキシペプチダーゼ
    　ｙｓｃαの変異体である、請求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】　　約６．０　〜約７．５　のｐＨの緩
    衝液中で約２５℃〜約３７℃の温度範囲内で行われる、
    請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】　　可溶性　ｙｓｃＦでの消化がＣａ２
    ＋イオンの存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】　　前記融合タンパク質が可溶性　ｙｓ
    ｃＦと可溶性　ｙｓｃαの両者を含む消化混合物で処理
    される、請求項１に記載の方法。
  18. 【請求項１８】　　前記融合タンパク質がまず可溶性　
    ｙｓｃＦで処理され、そして消化が十分進行したかまた
    は完了した時、直ちに可溶性　ｙｓｃαで処理される、
    請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】　　融合タンパク質であって、（１）　
    前記生物活性タンパク質から各々成る１または複数の連
    続タンパク質セグメントであって、それのＣ末端アミノ
    酸がリンカーポリペプチド配列Ｌに連結しており、Ｎ末
    端の１番目および２番目、そして複数の連続タンパク質
    セグメントの場合には更に前記リンカーポリペプチド配
    列ＬのＣ末端の最後から２番目および最後のアミノ酸残
    基が　Ｌｙｓおよび　Ａｒｇから選択された塩基性アミ
    ノ酸である、１または複数の連続タンパク質セグメント
    、および （２）　前記連続タンパク質セグメントのＣ末端アミノ
    酸に連結しているポリペプチド　ｔａｇ、または（１）
    　Ｎ末端アミノ酸に連結しているポリペプチド　ｔａｇ
    、および （２）　リンカーポリペプチド配列Ｌから各々成る複数
    の連続タンパク質セグメントであって、前記リンカーポ
    リペプチド配列ＬのＮ末端の１番目および２番目並びに
    Ｃ末端の最後から２番目および最後のアミノ酸残基が　
    Ｌｙｓおよび　Ａｒｇから選択された塩基性アミノ酸で
    あり、そして前記リンカーポリペプチド配列Ｌの最後の
    塩基性アミノ酸が前記生物活性なタンパク質に連結して
    いる、複数の連続タンパク質セグメント、から成る融合
    タンパク質。
  20. 【請求項２０】　　下式： （Ｐ−Ｌ）ｍ　−Ｔ　　　　　　（Ｉ）　またはＴ−（
    Ｌ−Ｐ）ｎ　　　　　（ＩＩ） （上式中、Ｐは生物活性タンパク質であり、Ｌは請求項
    １９において与えられた意味を有し、Ｔはポリペプチド
    　ｔａｇであり、ｍは１〜１０の整数であり、そしてｎ
    は２〜１０の整数である）により表される、請求項１９
    に記載の融合タンパク質。
  21. 【請求項２１】　　請求項１９に記載の融合タンパク質
    をコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットを含んで成
    る発現ベクター。
  22. 【請求項２２】　　請求項２１に記載の発現ベクターに
    より形質転換された宿主細胞。
  23. 【請求項２３】　　請求項１９に記載の融合タンパク質
    の製造方法であって、請求項２２に記載の形質転換され
    た宿主細胞を適当な栄養条件下で培養し、そして前記融
    合タンパク質を単離することを含んで成る方法。
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