JPS6137099A - 蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、遺伝子工学的手法による蛋白質の製造方法に
関する。さらに具体的には、本発明は、シグナル・ペプ
チドをコードする遺伝子の直後に所望の外来性蛋白質を
コードする遺伝子の結合を可能としたＤＮＡ遺伝子な具
備するベクターな利用し、宿主菌体内で生産されたその
所望蛋白質な菌体外へ分泌させることによって効率的に
その蛋白質を回収すること、に特徴を有する遺伝子工学
的手法による蛋白質の製造方法に関する。

先行技術 組換えＤＮＡ技術を用いて所望の遺伝子産物を大量に産
生させる技術が確立されつつあることは、多数の報文や
公開特許公報等によって認められるところである。これ
らの技術の確立に伴なって遺仏学的解析も行なわれてお
り、シグナル・ペプチドという１５〜３０個のアミノ酸
残基かもなる一連のペプチドが発現蛋白の宿主細胞外へ
の分泌に関与しているという知見もその中から見出され
たものである。

発現タン・ぐり質の細胞外への分泌に関するこの知見は
［シグナル仮説Ｊ　（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、五
、８３５　（１９７５）　）といわれ、この説を支持す
る実験結果も蓄積されつつある（　５ｅｃｒｅｔｏｒｙ
　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　。

９　、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　
Ｐｒｅｓｓ　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（１９７９）、生化学
、ｙし１４１　（１９８０）等）。シグナル・ペプチド
の概要および機能についてはたとえば特開昭５８−６９
８９７号公報等に説明がなされており、シグナル・ペプ
チドは蛋白の膜通過に関与するものとして認識されてい
る。

現在、シグナル・ペプチドを利用した発明は、特許公開
または公告公報等で種々開示されている（特開昭５５−
１９０９２号、同５５−４５３９５号、同５６−１３７
８９６号、同５６−１４５２２１号、同５６−１５４９
９９号、同５７−１９２４００号、同５８−６９８９７
芳容公報等）。これら公報記載の方法では、いずれも、
宿主菌の分泌すべき蛋白をコードする構造遺伝子を適当
な制限酵素認識部位で切断し、そこへフレームを合わせ
るためのリンカ−を介して外来性遺伝子を接続している
。その結果、このような融合遺伝子から発現してくる外
来性蛋白のＮ末端側には余分なペプチドが付着している
ことになる。従って、この余分なペプチドが外来性蛋白
の分泌を阻害したり、外来性蛋白の生物活性に悪影響を
与えたりする可能性も考えられる。また、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７．
３９８８〜３９２２（１９８０）や３ｃｉｅｎｃｅ％２
１９．６２０〜６２５　（１９８３）Ｋよれば、これら
はいずれも発現させようとする蛋白質が本来からもって
いるシグナル・ペプチドを利用したものであるので、こ
のシグナル・ペプチドの利用は本来の蛋白質の分泌のと
きにのみ利用できることになる。

このように、シグナル・ペプチドを利用した従来の技術
は種々の問題点なかかえているとい５べく、従ってこれ
らの改善が望まれているところである。

ところで、従来は、遺伝子工学的手法によって比較的低
分子の蛋白質な産生させることは困難で公報昭５４−９
２６９６号〕、すなわち所望蛋白質な大腸菌蛋白質との
雑種蛋白質として生産するという方法、によって、低分
子蛋白質であっても産生可能となった。しかしながら、
雑種蛋白質法によれば、所望蛋白質を得るには、大腸菌
蛋白質なコードする遺伝子と所望蛋白質をコードする遺
伝子との融合点にメチオニンをコードする遺伝子な挿入
したのち、この遺伝子な所要の工程に従って発現させ、
ついでメチオニンに特異的な臭化シアンによって切断し
て所望蛋白質を得る方法（上記５ｃｉｅｎｃｅ）や、リ
ジンやアルギニンに特異的なトリプンン消化によって所
望蛋白質な得る方法［Ｎａｔｕｒｅ、　２８５．４５６
　（１９８０）　：］を利用しなければならず、いずれ
の方法によっても所望蛋白質のアミノ酸組成によっては
該方法の使用が制限な５げることになる。臭化シアン処
理の場合はメチオニンが、またトリプンン消化処理の場
合はリジンやアルギニンが所望蛋白質を構成するアミノ
酸中にあれば、そこで切断され完全な所望蛋白質を得る
ことができないからである。

一方、ある程度の分子量なもつ蛋白質では、いわゆる直
接発現法［Ｎａｔｕｒｅ、　２８１．５４４　（１９７
９）］によって大大腸由由のアミノ酸配列な含まない所
望蛋白質の生産な行わせることができる。この直接発現
法は、所望蛋白質をコードする遺伝子の直前に開始コド
ン（通常はメチオニンをコードするＡＵＧ　）をつけた
遺伝子を所要の工程な経て発現させるものであるが、蛋
白質の種類によってはＮ末端にメチオニンが付されたま
まになったものが産生され（例えば、ＳＶ４０を抗原［
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、旦、４０５７　
（１９８０）　）、β−グロビン［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７６．
５９９６　（１９７９）　）等）、天然のものが得られ
ないことになる。

従って、上記いずれの遺伝子工学的手法による蛋白質の
製造方法も、その所望蛋白質の種類によっては使用の制
限を受けるところから、上記したような制限を受けるこ
となく、如伺なる蛋白質なも製造可能な方法の提供が望
まれているところである。

発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決な与えることな目的とし、シグ
ナル・ペプチドをコードする遺伝子の直後に所望の外来
性蛋白質をコードする遺伝子の結合な可能としたＤＮＡ
遺伝子な含むベクターを利用し、遺伝子工学的手法によ
って所望蛋白質な宿主菌体内で産生させ、さらにこれを
菌体外に分泌させて、これな回収するという蛋白質の製
造方法を提供することによってこの目的な達成しようと
するものである。

従って、本発明による蛋白質の製造法は、下記の工程よ
りなること、を特徴とするものである。

（１）所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を含む遺伝子な
用意すること。

（２）　　シグナルペプチドなコードする遺伝子であっ
て、その遺伝子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白質
の構造遺伝子な結合させ得るもの、な含み、かつ予定し
た宿主細胞内で増殖可能なベクターを用意すること。

（３）所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を含む遺伝子と
上記ベクターとを用いて、予定した宿主細胞内で増殖可
能な組換体ＤＮＡ　＆調製すること。

（４）この組換体ＤＮＡを用いて宿主細胞の形質転換を
行なって、形質転換体を調製すること。

（５）この形質転換体を培養して、産生された所望の外
来性蛋白質を回収すること。

効果 このように、本発明は、シグナルペプチドによる外来性
遺伝子由来蛋白質の細胞外への分泌を行わせるべく、（
イ）シグナルペプチドをコードする遺伝子であって、そ
の遺伝子の下流側直後に所望の外来性蛋白質の構造遺伝
子を結合せしめ得るもの、な含み、かつ（ロ）予定した
宿主細胞内で増殖可能なベクター（以下、分泌機能を有
するベクターと記す）を利用するという点に特徴を有す
る、遺伝子工学的手法による蛋白質の製造方法に関する
ものである。

そして、本発明の好ましい態様によれば、シグナルペプ
チド遺伝子の下流側末端直後への所望蛋白質の構造遺伝
子の結合を容易にするためには、必要ならば、シグナル
ペプチド遺伝子の塩基対の少なくとも一つな構成員の少
なくとも一部として人工的に創出された制限酵素認識部
位な有するものを用いる。

この部位な創出するに当っては、ＤＮＡ塩基対からなる
コドンには縮重があるということを巧みに利用すること
ができる。すなわち、創出された制限酵素認識／切断部
位を該制限酵素で切断すれば、その切断部位がシグナル
ペプチド遺伝子ＤＮＡの下流側末端に接して存在する場
合は該制限酵素切断端と相補性の端部な上流側に形成さ
せた外来性遺伝子？用意してこれを上記切断端において
シグナルペプチド遺伝子と結合させることによってシグ
ナルペプチド遺伝子の下流側に外来性遺伝子な直結させ
ることができる。また、シグナルペプチド遺伝子の切断
部位が該遺伝子の下流側末端より上流側に存在する場合
は、該遺伝子の該切断部位より下流側の部分を合成して
外来性遺伝子の上流側に結合した断片を用意して上記と
同じに結合を行なえば、一旦切断されたシグナルペプチ
ド遺伝子がＤＮＡの画鋲について復元されると共にその
下流側に外来性遺伝子が直結された構造が実現される。

その結果、所望蛋白質はシグナルペプチド直後に結合し
ているので、前記したようなシグナルペプチドの働きに
よってその蛋白質は宿主菌体内で発現後、菌体外へ分泌
される。所望蛋白質が菌体外へ分泌されるに際してシグ
ナル・ペプチドは膜酵累（シグナル・ペプチダーゼ）に
よって水解され本発明はこのように、シグナル・ペプチ
ドによる菌体外への分泌機能を巧みに利用して所望蛋白
質を成熟蛋白質として得るようにしたものである。

なお、本発明において「菌体外への分泌」という表現は
、宿主函が大腸菌のようなダラム陰性菌においては所望
蛋白質が菌体内からペリプラズム（細胞質膜と外膜との
空間）に移行したことを意味し、枯草菌のようなグラム
陽性菌においては細胞膜外に移行したことを意味するも
のである。

本発明による蛋白質の製造方法は、所望遺伝子を分泌機
能を有するベクターに組み込み、ついでこのベクターを
用いて宿主の形質転換を行い、該宿主菌を培養したのち
、所望蛋白質な回収することからなるものである。

従って、本発明は、前記の問題点を回避するとともに下
記の利点を有するものである。

（イ）所望蛋白質の精製が簡単である。従来は、宿主菌
の生育を行い、適当な時期に宿主菌を破壊したのち、菌
が本来持っている雑多の物質の中から所望蛋白質を抽出
精製していたため、多大な労力が必要であるうえ、精製
困難な物質もあった。本発明の蛋白質の製造法によれば
、前記シグナル・ペプチドの働きにより産生される蛋白
質は菌体外に分泌され、菌の生育培地はその構成成分が
判っているのであるから、培地からの目的物質の確認、
回収が容易となる。

（ロ）産生物質がペプチダーゼによる分解から保護され
る。すなわち、菌体内には多くのペプチダーゼ（プロテ
アーゼ）が存在するので不必要な蛋白は速やかに水解さ
れてゆくが、本発明によって目的の有用蛋白質な菌体内
に留めることなく直ちに菌体外へ分泌させれば、この目
的蛋白は上記の水解酵素から保護される。

（ハ）如何なる外来性蛋白でも発現可能である。すなわ
ち、従来の雑種蛋白法では、目的とする蛋白を純粋に得
るためにたとえばメチオニンに特異的な臭化シアン処理
（前記５ｃｉｅｎｃｅ誌）によって余分な蛋白を切断し
たり、リジンやアルギニンに特異的なトリプシン消化（
前記Ｎａｔｕｒｅ誌）な行う場合には、目的とする蛋白
のアミノ酸組成中にこれらのアミノ酸が含まれていると
きはそこでも切゛断が生じるため完全な形で所望の蛋白
を得ることができず、一方直接発現法（前記Ｎａｔｕｒ
ｅ誌）によって蛋白を産生させる場合には、遺伝子Ｎ末
端には開始コドン（メチオニン）が必要であって産生蛋
白もＮ末端にメチオニンが付いたものとして得られるも
のもあり（前記文献、ならびにＩ特開昭５６−６８３９
９号公報参照）、このような末端のメチオニンは臭化シ
アン処理により分解除去することが技術的に難しいので
、結局産生させた蛋白は天然のものとは異質のものとな
る。これに対して、本発明によるＤＮＡ遺伝子をベクタ
ーとして外来性遺伝子な宿主菌内で発現させると、いっ
たんシグナル・ペプチドとの融合ないし雑種蛋白として
産生された蛋白は宿主菌内のシグナル・ペプチダーゼに
よって特異的にシグナル・ペプチダーゼ部分が切断され
て、所望組成の成熟蛋白となって宿主菌細胞外へ分泌さ
れる。

所望蛋白質をコードする遺伝子（構造遺伝子）としては
、インシュリン、血清アルブミン、ヒト成長ホルモン、
インターフェロン、上皮細胞成長因子等の真核性の細胞
蛋白質のものが考えられ、天然物（染色体ＤＮＡ　）よ
り調製したものでもよいし、あるいは合成したものを用
いてもよい。

なお、これら所望蛋白質なコードする遺伝子の調製方法
については種々の放置や文献および公開または公告公報
を参考することができ、主要なものに下記のものがある
。

（１）直接染色体ＤＮＡから所望遺伝子を調製する方法
（Ｐｒｏｃ、　Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ、、５５Ｂ、４６
４、（１９７９）、特開昭５７−１３０９９８号、同５
７−１６６９９２号、同５７−２０８９９４号、同５８
−１３５９９号公報等）（２）　　メツセンジャーＲＮ
Ａ　Ｃｙ下、ｍＲＮＡという）を調製したのち、これを
もとに公知の所要の工程を経て調製する方法（特開昭５
８−５６６８４号、同５６−２９９８号、同５６−３６
４９９号、同５６−６３９９６号、同５６−８５２９６
号、同５６−１０４８９７号、同５６−１３１５２２号
、同５６−１３１５９８号、同５６−１５０１００号、
同５６−１５４４９９号、同５６−１５８７９３号、同
５６−１５８７９９号、同５７−２４４００号、同５７
−１４１２８７号、同５７−１７１９９９号、同５７−
１７４０８５号、同５７−２０６７００号、同５８−９
６８７号、同５８−５６６８４芳容公報等）。

（３）所望遺伝子が作る蛋白質のアミノ酸配列をもとに
ＤＮＡな化学合成することによって、所望蛋白質をコー
ドする遺伝子を調製する方法（特開昭５７−１２２０９
６号、同５７−２００３４３号、同５７−２００４００
号、同５８−１０６００号各公報芳容。

上記のどの方法を参考にして行うかは、所望蛋白質をコ
ードする遺伝子の種類によって決定すればよい。なお、
以下の実施態様としては本発明においてはヒトウロガス
トロン（以下、ｈＵＧという）およびインターフェロン
（以下、ＩＦＮという）等の構造遺伝子な用いているが
、前者は化学的に合成したものであり、後者は直接染色
体ＤＮＡから構造遺伝子な調製したものである。その操
作の詳細については、各々特願昭５８−１７５７４２号
および５８−１２３５２０号の明細書な参照されたい。

分泌機能な有するベクター 遺伝子操作においてベクターとは、外来性遺伝子（所望
蛋白質をコードする遺伝子）を宿主細胞に移入し、この
細胞中で外来遺伝子な増殖させる役割をもつ運一体ＤＮ
Ａのことをいい、微生物細胞中では、染色体外に存在す
るプラスミドやファージが上記増殖機能な有する。

本発明では、上記の機能を具備しかつ分泌機能な有す、
るベクターとして、本発明者らが先に提案した分泌機能
を有するＤＮＡ遺伝子（特願昭間−１４０７４８号）な
上記プラスミドまたはファージに組込んだものな用いる
ことができる。

このようなベクターの一具体例としては、本発明で用い
たベクタープラスミドｐＴＡ１５２９がある。

ｐＴＡ１５２９は、ｐＴＡ５２９　（ｐＹＫ２８３　［
Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００（１）ＹＫ２８３　）
として寄託済み（微工研条寄第５５６号）〕から〕特願
昭５８−１４０７４８号明細に開示された方法に従って
つくったもの）とｐＨ８１（このプラスミドは、ｐＢＲ
３２２’に制限酵累、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
で消化し、このＥｃｏＲＩ　−Ｈ４ｎｄ　ｍ部分を下記
の合成リンカー で置換したものである。詳細は、特開昭５９−７１６９
２号公報参照）とから造成したものである（造成操作は
、後記実験例を参照されたい）。

すなわち上記一実施態様におけるシグナルペプチドをコ
ードする遺伝子は、アルカリ性フォスファターゼ由来の
ものであるが、その他にも、後記実施例に述べるβ−ラ
クタマーぜ由来のものなど任意のもの（リポプロティン
など）がありつる。

またこの遺伝子は天然から取得しても合成して取得して
もよいことは言うまでもなく、合成して取得する場合は
必要ならばアミノ酸に対応するコドンを適宜選択して遺
伝子な設計、合成することができる。

組換体ＤＮＡ １）造成 外来性（所望蛋白質）遺伝子が発現しかつ分泌するよう
にしくまれたベクターの適当な位置に所望蛋白質なコー
ドする遺伝子を組込むことにより組換体ＤＮＡが造成さ
れる。組込操作そのものは、分子生物学の分野で公知の
常法に従って行うことができる。具体的な方法について
は、後記実験例な参照されたい。

２）リンカ− 所望蛋白質の構造遺伝子をベクターに組込むにあたり、
フレームを合わせたり、所望の制限酵素切断片やリポソ
ーム結合部位などを導入するため、合成した種々のリン
カ−を用いることは組換えＤＮＡ技術上有力な手段であ
る。

本発明の一実施態様においてもリンカ−を利用している
が、それはフレームを合わせるため、すなわちシグナル
・ペプチドの分泌機能を利用することができかつ所望蛋
白質に余分なアミノ酸が付着することなく得られること
を目的として、合成リンカ−な利用するものである（実
際の利用例は、後記実施例を参照されたい）。

リンカ−の合成は、十−鎖のそれぞれについて、これナ
イ＜つかのフラグメントに分けたものを化学的に合成し
、ついで各フラグメントを結合する任意の方法によって
達成される。フラグメントの合成法としては、ジエステ
ル法（５ｃｉｅｎｃｅ　、　２０３．６１４　（１９７
６）　）、トリエステル法（５ｃｉｅｎｃｅ、１９８．
１０５６　（１９７７）　）、固相法（Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

旦、５４９１　（１９８０）　）、液相法、あるいは酵
素な用いる方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｍ、　、　２
４１．２０１４　（１９６６））等があるが、合成時間
、収束、精製などの点から、固相法でトリエステル法に
よるものが好ましい。

３）方向性の判定 ベクターに組込まれた所望蛋白質をコードする遺伝子の
方向性の判定は、構造遺伝子内に含まれる特定の部位な
認識する酵素でその部位を切断し、構造遺伝子外の特定
の位置に別の酵素で切断を入れ、得られた断片の大きさ
？分析することにより行うことができる。

形質転換株の調製 １）宿主菌 宿主菌は、上記造成りＮＡ組換体がその菌体中で増殖で
きるものであり、かつその微生物の遺伝的性質が詳細に
解明されてＶするものであることが好ましい。

形質転換させる宿主菌の一具体例としては、エシェリキ
ア・コリに属する大腸菌株に１２Ｃ６００がある。この
に１２Ｃ６００は、ダラム陰性桿菌で、胞子な作らず１
通性嫌気性等の大腸菌属の一般搗性を有する他、Ｆ因子
を含まず、サプレッサー遺伝子Ｅの機能な欠き、遺伝子
組換えに関与するヌクレアーゼをコードするｒｅｃＢＣ
遺伝子に欠陥な有する。栄養要求性としては、アミノ酸
のトレオニンとロイシンをその最小培地上での増殖に必
要とするものである。なお、Ｋ１２Ｃ６００株の詳細に
ついては、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ％３９　、４４０　（１９
５４）およびＮａｔｕｒｅ、　２１７．１１１０　（１
９６８）を参照されたい。

また、宿主菌のもう一つの例としては枯草菌（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）が考えられる。枯草菌は
ダラム陽性菌であり、胞子形成能を有し、菌体外酵素の
生産菌として工業的にも利用されているものである。宿
主として適当な株の例を挙げれば、Ｍａｒｂｕｒｇ　１
６８を変異させたＲＭ１２５　（Ｍｏｌｅｃ、　Ｇｅｎ
。

Ｑｅｎｅｔ、　１５２．６５　（１９７７）、同胞子形
成能の欠損した株（ＮＩＨガイドライン、フエデラルレ
ジスター、４５．６７２４　（１９８０）　’）、およ
び組換能欠損株（ｒｅｃＥ）　（Ｍｏｌｅｃ、　Ｇｅｎ
、　Ｇｅｎｅｔ、　１６５，２６９　（１９７８））が
ある。なお、枯草菌の利用については種々の文献〔例え
ば、蛋白質・核酸・酵素、臨時増刊、「遺伝子操作」、
耶、４６４〜４７５　（１９８１）、国、１４６８〜１
４７９　（１９８３）、同、臨時増刊、「遺伝子操作・
組換え遺伝子の細胞への導入と発現）〕す参照すること
ができる。

２）形質転換 形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法〔例えば大腸菌を形質転換する場合はクンユナー法［
Ｇｅｎｅｎｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　１９７８
．１７（１９７８）があり、枯草菌を形質転換する場合
は大腸菌の形質転換の一般的手法を適用でき、具体的に
は底置「遺伝子組換え実用化技術３」サイエンスフォー
ラム社刊１）３３１（１９８２）底置「Ｍｏｌｅｃｖｌ
ａｒｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａ
ｎｕａｌ　Ｊ　ｐ　２４７〜２６８、ＣｏｌｄＳｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（１９８
２））等に従って行うことができる。なお、大腸菌につ
いての具体的な形質転換法については、後記実験例な参
照されたい。

３）形質転換体 形質転換操作によって形質転換された株は、組換え体プ
ラスミドの移入によって作り出された組換え体ＤＮＡの
マーカー（薬剤耐性、栄養要求性等）を指標にして選択
でき兎。形質転換体の一具体例としては、大腸菌に１２
Ｃ６００な［）ＴＡ１５２４　（詳細後記）によって形
質転換させて得た形質転換体に１２Ｃ６００（ｐＴＡ１
５２４）がある。この形質転換体は、宿主菌に１２Ｃ６
００と下記の性質において異なる菌株である。

Ｎ♂、Ｔ　Ｃ５ 従って、この性質を指標として形質転換体を選択するこ
とができる。

所望蛋白質の産生および回収 所望蛋白質は、宿主菌（すなわち上記形質転換体）を常
法に従って培養することによって産生される。具体的な
方法については、後記実１験例を参照されたい。

菌体かもの所望蛋白質の回収は、宿主菌が大腸菌のよう
にダラム陰性菌の場合は所望蛋白質はノグナル・ペプチ
ドの分泌機能によってペリプラズムに分泌される。従っ
て、浸透圧ショック法（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、■、３６８５　（１９６５）
　）によってペリプラズムから細胞壁外（培地中）に放
出させたのち培地から容易に所望蛋白質を回収すること
ができろ。また、宿主菌が枯草菌のようなダラム陽性菌
であれば、シグナル・ペプチドの分泌作用で所望蛋白質
は菌体外へ放出されるし枯草菌な用いて所望蛋白質を産
生させる方法としては、例えばＱｅｎｅｌ、廻、２２９
〜２３５　（１９８３）がある〕ので培地から容易に回
収することができる。なお、宿主菌が大腸菌の場合の培
養および所望蛋白質な浸透圧ショック法な行ったのち回
収する方法についての詳細は、後記実、験例を参照され
たい。

実験例 参考例 分泌機能を有するベクターの作製を、下記の通りに行な
った。

本発明の方法に使用するベクターとして、本発明者らが
先に提案したプラスミドｐＴＡ５２９　Ｃ特願昭５８−
１４０７４８参照。プラスミドｐＹＫ２８３（Ｅ−ｃｏ
ｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＹＫ２８３　）として微工研
に寄託（微工研条寄第５５６号））のシグナルペプチド
をコードする遺伝子に対応するＤＮＡ部分の下流側末端
コドンおよびその下流側に直結したＤＮＡ部分の最初の
コドンが第１図に示した通りのもの〕な改良して、さら
に自己複製能力の強いベクター１）ＴＡ１５２９な作製
した。

なお、第１図は、二本鎖ＤＮＡからなるＤＮＡ遺伝子の
一部を示すものであって、Ａ、　Ｇ、　ＣおよびＴはそ
れぞれアデニン、グアニン、ントンンおよびチミンを示
し、Ｌｙｓ％Ａ１ａおよびＴｒｐはそれぞれリジン、ア
ラニンおよびトリプトファンを示す。

この二本鎖ＤＮＡの区域（１）はシグナルペプチド遺伝
子ＤＮＡ部分であり、区域（３）は制限酵素Ｈｉｎｄｍ
の認識部位であり、破線はＨｉ　ｎｄ　ｍ切断部位であ
る。

区域（２）は、シグナルペプチド遺伝子ＤＮＡの下流側
の直後に結合されたＤＮＡ部分である。

ｐＴＡ　１５２９の作製は、以下の手順に従って行った
。

ｐＴＡ５２９　（第２図中■）５μｇを、５０　μＬ　
（７）反応液（５０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（以下、Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩと記す）（ｐＨ８，０）、１０　ｍＭ塩
化マグネシウム（以下ＭｇＣ＋□と記す）〕中で１０単
位の制限酵素Ｔｈａ　Ｉ　［ＢＲＬ社］（以下’Ｉ’ｈ
ａ　Ｉと記す）を用いて６０℃で１時間加水分解した。

ついで、エタノール沈殿を行ない、得られた沈殿画分を
、５０μｔの反応液Ｃ１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（
ｐＨ８，０）、７　ｍＭ　ＭｇＣ１２、ＩＱＱｍＭ塩化
ナトリウム（以下Ｎａｃｌと記す）〕中で４単位の制限
酵’Ｘ　Ｂａｍ　ＨＩ　Ｃタカラ〕（以下、ル・ペプチ
ド領域な含むＤＮＡ　＠Ａ　２０塩基対（以下、ｂｐと
記す）（第２図中−１で表示）■′　を得た。

一方、プラスミドｐＨ８１（％開閉５９−７１６９２号
公報参照）　１０　ｐＨを５０μｔの反応液［１０ｍＭ
　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０　ｒｎＭ
　Ｍｇ　Ｃ１２，１００ｍＭ　ＮａＣ１：）中で４単位
の制限酵素ｐｓｆＩ［：タカラ〕（以下、ＰＳｔ■と記
す）を用いて３７℃で１時間加水分解した。ついで、エ
タノール沈殿を行い、得られた沈殿を二つに分け、一方
を５０μｔの反応液〔上記〕（第２図中口で表示）■−
８を得た。また、他方のエタノール沈殿物も同様に５０
μｔの反応液［６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨｓ、
ｏ　）％２０ｍＭ塩化カリウム（し下ＫＣＩ）、６ｍＭ
ＭｇＣＩ２］中で４単位の制限酵素Ｓｍａ　Ｉ　［タカ
ラ〕（以下、Ｓｍａ　Ｉ　）　ｋ用いて３７℃で１時間
加水分解したのち、アガロースゲル電気泳動によって７
００　ｂｐのＤＮＡ断片（第２図中こで表示）■−Ｌを
得た。

以上の操作で得られた３本のＤＮＡ断片（■′、■−８
および■−Ｌ）を、３０μｔの反応液〔加ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、１０　ｍＭ　ＭｇＣ１２
，１０ｍＭジチオスレイトール（以下、ＤＴＴ　）、０
．５ｍＭアデノ７ントリリン酸（以下、ＡＴＰ）Ｅ中で
凹単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ〔タカラ〕を用いて１４
℃、１６時間反応させた。反応終了後、反応混合物で大
腸菌Ｋ１２Ｃ６００ｋ形質転換させて（Ｅ、　ｃｏｌｉ
　Ｋ１２Ｃ６００として寄託済み（微工研条寄第１１５
号））目的とするプラスミド（＋）ＴＡ１５２９　）を
含む形質転換株な得た。なお、ここで得られた株からシ
ラスミドを調製しく調製法の詳細は特願昭５８−１４０
７４８号明細書を参照されたい）、各ＤＮＡ断片の接続
部の塩基配列なマキサムｅギルノ々−）　法［Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　７４　、５６０　（１
９７７）　：）によって確認した。

実施例１ ヒトウロガストロン（ｈＵＧ／ＥＧＦ）および２１番目
がメチオニンの代わりにロイジノにおきかわった２１−
ロインンーヒトウロガストロン（２１−ｉ、ｅｕ−ｈＵ
Ｇ　）　Ｑ本発明の方法に従って産生させて、その回収
な行った。なお、以下の実施例１の操作については、ｈ
ＵＧと２１−　Ｌｅｕ　ｈＵＧとは同様なので、ｈＵＧ
を主体にして記述する。

ｈＵＧ　（および２１−　Ｌｅｕ　−ＥＧＦ　）構造遺
伝子の合成ｈＵＧ　（および２１−　Ｌｅｕ　−ＥＧＦ
　）構造遺伝子の合成は、特願昭５８−１２３５２０号
明細書に開示してある方法に従って行った。すなわち、
鎖長１０〜１７の７ラグメン）ｋ予め合成しておき、つ
いでこれら合成フラグメントをブロックごとに分けて結
合反応を行い、最後にこれらブロックな結合させて、完
全なｈＵＧ構造遺伝子を合成した。合成したｈＵＧ構造
遺伝子の塩基配列は、第３図に示す通りである。図中、
８はｈＵＧ構造遺伝子の開始点を示し、★は終止点な示
す。また、同図中Ｍｅｔ等はいうまでもなく、メチオニ
ン等のアミノ酸を示すものであり、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ
は塩基を示すものであって谷々アデニン、チミン、ント
ンンおよびグアニンの略号として当業界で承認されてい
るものである。さらに、図中の数字はフラグメントの塩
基数を示し、ＥＣＯＲＩ　等は制限酵素認識部位を示す
ものである。なお、２１−　Ｌｅｕ　ｈＵＧの塩基配列
は２１番目がＭｅｔのかわりに’ｉ、ｅｕＱコードする
ものに改変されているが、同図中Ｍｅｔの上に（Ｌｅｕ
）と記しており、他はｈＵＧと同一である。

ｈＵＧ　（２１−Ｌｅｕ　−ｈＵＧ　）遺伝子すき有す
るプラスミドの作Ｍ（第４図参照） ｐＴＡ１５２９５　ｔｔ９　ｋ、５０　ｕｔの緩衝液［
１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、１．０　
ｍＭ　ＭｇＣｌ２，５０　ｍＭ　ＮａＣ１］中で４単位
の制限酵素Ｈｉ　ｎｄ　ＩＩＩ　［タカラ〕（以下ｎｉ
ｄｍ）を用いて３７℃で１時間加水分解した。ついで、
エタノール沈殿を行い、得られた沈殿物を、３０１１ｔ
の反応液［６７ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，８
）、１６．６ｍＭ硫酸アンモニウム（以下）（ＮＨ４）
２Ｓ０４）、６．７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール、６．７μＭエチレンジアミン四酢
酸塩（以下ＥＤＴＡ）、０．６６ｍＭずつのｄＡＴＰ、
　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ＴＴＰ　）　：）中で１単
位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（上記）な用い３７°Ｃで
１５分間処理した。ついで、エタノール沈殿を行ったの
ち、得られた沈殿物な、５０μｔの反応液Ｃ６ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐｌ（８，Ｑ　）　、　６ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ□、１５０ｍＭ　ＮａＣ１］中で４単位の制限酵
素Ｓａｌ　Ｉ　Ｃタカラ〕（以下、Ｓａｔ　Ｉと記す）
な用いて３７℃で１時間加水分解した。反応終了後、ア
ガロースゲル電気泳動によって、３９００ｂｐのＤＮＡ
断片（第４図中■）を得た。

プラスミドｐＢＲ３２２−ｈＵＧ　（ｐＢＲ３２２（Ｅ
、　ｃｏｌｉＫ１２Ｃ６０（ｐＢＲ３２２）として寄託
済み（微工研条寄第２３５号）　）　ｋ　ＥＣＯＲＩお
よびＳａｌ　Ｉで消化したものに上記で合成したｈＵＧ
構造遺伝子をＥＣ０ＲＩおよび５ａｌＩで消化した断片
な組み込んだもの）５μｇを、関μｔの反応液［１００
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、５０　ｍＭ
　ＮａＣ１、５０ｍＭ　ＭｇＣＩ。］中で４単位の制限
酵素ＥｃｏＲＩ　［タカラ〕を用いて３７℃で１時間加
水分解したのち、上記と同様にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
反応を行い、さらにＳａｌ　Ｉ処理な行ったのち、アガ
ロースゲル電気泳動によって１６０　ｈｐのＤＮＡ断片
（第４図中■）な得た。２１−　Ｌｅｕ　−ｈＵＧのと
きは、ｐＬＥ６５２７　（特願昭５８−１２３５２０号
、ＥｃｏｌｉＸＡ３５　（＋）ＬＥ６５２７　）として
寄託済み（微工研条寄第５１４号））から同様に構造遺
伝子な切り出してきた。

上記で調製した二つのＤＮＡ断片（第４図中■および■
）ｋ、３０μｔの反応液［２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣＩ２．１０ｍＭ　ＤＴ
Ｔ、　０．５ｍＭＡＴＰ　］中で３００単位のＴ４ＤＮ
Ａリガーゼしタカラ〕な用いて１４℃で１６時間反応さ
せた。反応終了後、これで大腸菌Ｋ１２Ｃ６００を形質
転換させ、目的のプラスミドし以下、Ｉ）ＴＡ１５２２
　〕（第４図中■）を含有する形質転換株（Ｅ、　ｃｏ
ｌ　ｉ　Ｋ１２Ｃ６００（ｐ’ｒＡ１５２２　））を得
た。また、２１−　Ｌｅｕ　−ｈＵＧのこのようなプラ
スミドはＩ）ＴＡ１５２３であり、（＋）ＴＡ１５２２
のときと同様な操作な経て、形質転換株Ｅ、ｃｏｌｉＫ
１２Ｃ６００（［）ＴＡ１５２３　）な得た。なお、上
記実験例と同様にここで得られた株からプラスミドを調
製（特願昭５８−１４０７４８号明細書参照）して、各
ＤＮＡ断片の接続部の塩基配列をマキサム・ギルノ々−
ト法〔文献上記〕によって確認した。

ｈＵＧ　（２１−Ｌｅｕ　−ｈＵＧ　）の産生および回
収１）形質転換株の培養 形質転換株Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ６００（１）ＴＡ
１５２２　）な、２０μ９７１のアンビンリンを含むＬ
−培地〔１％バクトドリプトン、０．５％イーストエキ
ストラクト、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルーｙ−ス
〕８０１１ＬＬテ前培養した。ついで、前培養したもの
を０．６４ｍＭのリン酸二水素カリウム（以下、ＫＨ２
ＰＯ４）を含む合成培地［Ｂｊｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｓ、　Ａｃｔａ　３８．４７０　（１９６０）　）２
．４リツトルに移し、３７°Ｃで一夜振とう培ｉｔ行っ
た。培養終了後、集菌したのち菌体す３２μＭのＫＨ２
ＰＯ４を含む上記合成培地に懸濁させて、さらに３７°
Ｃで５時間振どう培養を行った。また、２ｌ−Ｌｅｕ　
−ｈＵＧについても同様に培養な行った。

培地組成は、下記の通りである。

０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，２）、８０
　ｍＭ　ＮａＣ１、２ｍＭＫＣｌ　、　２０ｍＭ　ＮＨ
４Ｃｌ　、　３ｍＭ　Ｍａ２Ｓｏ４．１ｍＭＭｇＣ’２
．０．２ｍＭ　ＣａＣｌ２．２μＭ　ＦｅＣｌ３．２１
’　Ｍ　Ｚ　ｎ　Ｃ１２，０，２％グルコース、加μＢ
　／ｒｎｔ　７ンビシリン、４０μｇ／ｌロイノン、４
０μ９／ｒｎｔスレオニン、１０μ９／ｍ！チアミン ２）浸透圧衝撃法（オスモティック・ノコツク法）によ
るｈＵＧ　（２１−Ｌｅｕ　−ｈＵＧ　）の回収宿主菌
のペリプラズムに分泌されたｈＵＧ　（ｉたは２ｌ−Ｌ
ｅｕ−ｈＵＧ）　ｋ、オスモティック・ショック法［Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４０．３６８５、（１
９６５）］によって菌体外に放出させて、回収した。す
なわち、集菌した菌体な反応液［２０％ツユ−クロース
、３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，Ｑ　）、１
ｍＭ　ＥＤＴＡ：）　１２０　ｍに懸濁させ、室温で１
０分間放置した。ついで、集菌し、これを冷水８０喘に
懸濁させて水浴中で１０分間放置したのち、遠心な行な
って上清を回収した。

３）　　ｈＵＧ　（２１−Ｌｅｕ−ｈＵＧ）の定量オス
モティック・ショックで得た上清の一部を３倍に希釈し
、これを用いてラジオリセプターアツセイ（ＲＲＡ）法
によってｈＵＧおよび２ｌ−Ｌｅｕ−ｈＵＧの定量［Ａ
、キング（Ｋｉｎｇ）もの方法（Ｊ、Ｂ。

Ｃ１，μ罫、３０５３　（１９８２）］な行った。すな
わち、ヒト鼻咽腔上皮癌細胞由来のＫＢ細胞（ＡＴＣＣ
Ｎｏ。

ＣＣＬ１７）を８０にのフラスコ中でダルベツコ変法イ
ーグル（ＤＭＥ）培地（日永）中で単層培養する。

培地を除き、０．０５％のＥＤＴＡを含むリン酸平衡化
塩溶液（ＰＢＳ）を用いて細胞をはがして、細胞懸濁液
なつくる。その後、２０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７
、４）を含むＨａｎｋｓ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２
回細胞を洗浄する。細胞をＢｉｎｄｉｎｇ　５ｏｌｕｔ
ｉｏｎ　（ＤＭＥ培地・２０ｍＭ　ＨｅｐｅＳ　（ｐＴ
（７−４）　−０，３５９／ｌ　ＮａＨＣＯ３−１００
μ９／ｍｔストレプトマイクン）に懸濁後、細胞数な計
算して３０万〜４０万／　０　、２　ｒｒｔｔ　Ｂ　ｉ
ｎｄｉｎｇ　５ｏｌｕｔ　ｉｏｎとなる様調整し、チュ
ーブにＱ　＋　２ｍＡずつ分注する。

種々の濃度のｈＵＧ　（−Ｅたは２１−　Ｌｅｕ　−ｈ
ＵＧ　）および１２５Ｉ　−ｍＥＧＦ　（マウスＥＧＦ
　）を含む試料液０　、２　ｍｊをチューブに加えて、
３７℃で１時間インキユヘートする。細胞を氷冷したＨ
ＢＳＳで３回洗浄後、１０％のトリクロロ酢酸〔以下、
ＴＣＡ：ｌに懸濁させ、グラスフィルターな用いて細胞
を固定する。アセトンでＴＣＡを除いた後、液体シンチ
レーンヨンカウンターな用いて計数する。

比較のため、ｍＥＧＦ（東洋紡）およびβ−ガラクトシ
ダーゼを臭化シアン処理して得られたペプチド画分につ
いても同様な実験な行なった。第５図は、その結果な示
すものである７（同図中・はｍＥ１ＧＦ’＆、ＯはｈＵ
Ｇを示す）。図から明らかなようにｈＵＧを含むペプチ
ド画分は１２５Ｉ−ｍＥＧＦとＫＢ細胞ＥＧＦＩＪセプ
ターとの結合な拮抗的に阻害し、その用量−反応曲線は
ｍＥＧＦのそれとよく一致している。

その結果、ｈＵＧはｍＥＧＦに換算して６．２４０．９
／μｔの、ＥＧＦ活性な持つペプチドが含有されてぃる
ことか確認された。これは、カルチャー１リツトルあた
り２０８μ９（以下、μｇ／リットル・カルチャーと記
す）のペプチドが分泌生産されていたことになる。２１
−　Ｌｅｕ　−ｈＵＧについても同様に定量を行った結
果、１８５μ９／リツトル・カルチャーのペプチドが分
泌されたことになった。

ｈＵＧ　（２１−Ｌｅｕ　−ｈＵＧ　）の精製オスモテ
ィック・ショック法によって得た上清な凍結乾燥して粉
末とし、これな水６ｍｔに溶解したのち、２５ｍＭ酢酸
アンモニウム〔以下、ＡＣ０ＮＨ４］（ｐＨ５，８）で
平衡化したセファデックス■Ｇ　−５０カラム（直径７
．５ｃｒｎＸ長さ９０α）にかけた。溶出は９．５’ｎ
ｔ／画分／１４分の流速で行い、活性のあった画分のう
ち３４〜３９本な集めた。セファデックス［Ｆ］Ｇ−５
０にかけたときの溶出パターンおよび活性（前記ＲＲＡ
法）の測定結果は、第６図に示す通りであった。同図中
針−１は活性？示すものである。

ついで、この画分（３４〜３９本画分）を２５ｍＭＡＣ
ＯＮＨ４（ｐＨ５，８）で平衡化したＤＥＡＥセファロ
ースＤＥ−５２（ワットマン社）〔直径１．２函×長さ
１２α〕にかけた。溶出に際してＡＣＯＮＨ４の緩衝液
２５　ｍＭ　〜３００ｍＭまテノ濃度公配（３００ｍＡ
）’＆行い、溶出は３．１２／画分／７．６分の速度で
行い、活性のあった両分のうち３９〜４５本な集めた。

このときの溶出・ぐターンおよび活性（前記ＲＲＡ法）
の測定結果は、第７図に示す通りであった。同図中←−
１は活性を示す。

ついで、ここで得た活性のある画分な高速液体クロマト
グラフィー（以下ＨＰＬＣ）　［μＢｏｎｄａｐａｋＣ
−１８、カラム；直径０４６ｃｍ×長す３ｏｃｒｎ、溶
出＝０．１％ＴＦＡ　、アセトニトリルの加％〜５０％
までの濃度分配、流速：１ｍｔ／分〕にかけて精製な行
った。そのときの溶出パターンは、第８図に示す通りで
あった。図中、保持時間冴分にｈＵＧのものと思われる
単一のピークが得られた。また、２ｌ−Ｌｅｕ　−ｈＵ
Ｇについても同様に精製な行った。

ｈｔｒｃ　（２１−Ｌｅｕ　−ｈＵＧ　）の確認ｈＵＧ
　（２１−Ｌｅｕ　−ｈＵＧ　）の確認は、アミノ酸組
成分析、Ｎ末端分析およびＣ１末端分析によって行った
。

アミノ酸組成分析は、上記ＨＰＬＣで精製した画分’に
６Ｎ）ＩＣＩで加水分解し、ついで乾燥したのち０−０
２ＮＨＣ１に溶解し、これをアミノ酸分析器［ＨＬＣ−
８０３Ｄ　ＯＰＡシステム（東洋曹達）〕にかげること
によって行った。そのときの結果は、表１に示す通りで
あった。

また、Ｎ端分析はエドマン法（生化学実験講座ｌ、タン
パク質の化学■、ｐ１３２、日本生化学会編、東京化学
同人刊）によって行なって、Ｎ端から加番目までのアミ
ノ酸配列を確認した。

さらに、Ｃ端分析はカルボキンペプチダーゼＹを用いて
行なって、Ｃ端より４番目までのアミノ酸配列な確認し
た。

こわ、もの結果より、分泌されたものはｈＵＧであるこ
とが確認された。

また、本発明者らが先に提案した２１−　Ｌｅｕ　−ｈ
ＵＧについても、上記と同様に一連の操作を行って確認
した。

表１ 上表中、Ａｓｈ）等は、いう寸でもなく、アスパラギン
酸等のアミノ酸を示す当業界で承認されている記号であ
る 比較例１ 実施例１はシグナル・ペプチドを有するプラスミドな用
いてｈＵＧ　（２１−Ｌｅｕ−ｈＵＧ）　ｋ産生させた
ものであるが、シグナル・ペプチドの分泌機能を調べる
ための比較実験としてシグナル・ペプチドな具備しない
シラスミドｐＴＡ１５０２　（下記）を作製して同様に
ｈＵＧの産生な試みた。

なお以下は制限酵素、リガーゼ反応、ＤＮＡ断片の調製
等は上記実施例１と同様に行ったので詳細な条件につい
ては記述しないものとする。また、制限酵素は人す■の
ような記述をする。

ｐＴＡ１５０２の作製（第９図参照） ｐＴＡ１５２２　［上記〕なＡす■および担Ｉで消化し
たのち、小さい断片を得た（蕾同図中ト■）。

同様に、ｐＴＡ１５２２をＢｇｌＩ［およびＡａｔＩＩ
で処理し。

たのち、大きな断片を得た（同図中■）。

一方、　ｐＢＲ３２２−ｈＵＧな旦四ＲＩおよび且ｇｌ
Ｉ［処理することによって、ｈＵＧの構造遺伝子（一部
を欠いたもの）を得た（同図中■）。また、上記■〜■
のＤＮＡ断片な結合するためのり７カー（同図中■）を
合成した。ついで、これら■〜■について所要の方法に
従って結合な行なって、シグナル・ペプチドのないプラ
スミドであって、ｈＵＧの構造遺伝子な含有するＩ）Ｔ
Ａ１５０２　（同図中■）な得た。

ｈＵＧの産生、回収、精製等は、すべて上記実施例１と
同様に行なった。

そして、ｐＴＡ１５２２およびｐＴＡ１５０２を用いて
蛋白質の製造な行った場合のｈＵＧの定量を以下の三つ
の画分について行った。その結果は、下表にまとめた通
りであった。

、（イ）所望蛋白質を発現させたのち、宿主菌な破壊し
て調製した画分 （ロ）所望蛋白質を発現させたのち、宿主菌なオスモテ
ィックショック法に付すことによって得られた上清画分 （ハ）オスモティックショック法後菌体破壊を行って得
た画分 実施的２ 本発明の方法に従ってインターフェロン（以下ＩＦＮ）
の製造な行った。このＩＦ’Ｎはα型で、本発明者らが
先に提案した（特願昭５８−１７５７４２号）新規ＩＦ
Ｎである。また、分泌機能を有するプラスミドベクター
としては前記ｐＴＡ１５２９を用いた。

１）ＴＡ１５２９　（前記）５μｇを夕凹工およびが丁
■で消化したのち、アガロースゲル電気泳動で大きな断
片を得た（第１１図参照）。一方、ＩＦＮ構造遺伝子な
有するｐＩＦ２０２　（特願昭５８−１７５７４２号明
細書参照。微工研菌寄第７１８８号）５μ９な斗ｎａ　
Ｉ、１）ｄｅ　Ｉで消化したのち、アガロースゲル電気
泳動によってＩＦＮ構造遺伝子（先端の一部が欠けてい
る）　ＤＮＡ断片な得た（第１１図参照）。ついで、Ｄ
ＮＡ断片■および■なつなぐ為（すなわち本発明の目的
に従ってシグナル−ペプチド直後に完全なＩＦＮ構造遺
伝子が続くように）、下記の配列な有するリンカ−を合
成した。

これら三つのＤＮＡ断片（■、■および■）の結合（操
作は前記実施例１と同じ）を行ない、これで大腸菌に１
２Ｃ６００を形質転換させて、目的とするプラスミドｐ
ＴＡ１５２４　（第１１図参照）を得た。このｐＴＡ１
５２４についても前記ｈＵＧのときと同様にマキサム・
ギルノ々−ト法（前記Ｒｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ。

Ｓｃｉ　ＵＳＡ　）に従って、塩基配列の確認を行った
。

ところで、１）ＴＡ１５２４との比較のため、上記のシ
グナルペプチドを持たず、かつＩ）ＴｉＩ４２４と同一
のドライブユニットを有していて■ＦＮ構造遺伝子なそ
の制御下においたプラスミドｐＴＡ１５０４を以下のよ
うにして調製した（第１１図参照）。

ｐＴＡ１５２９　（前記）を旦ａｅＩＩおよび１（ｓａ
Ｉで消化したのち、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
１８０　ｂｐのＤＮＡ断片を得た（第１１図−■）。つ
いで、これをバクチルアル・アルカライン・ホスファタ
ーゼ処理して、５′−末端リン酸基を除去した（第１１
図−■′）。

一方、１）ＩＦ２０２　（前記）なＸす■および足囲Ｉ
で消化し、ＩＦＮの構造遺伝子を回収しく第１０図−■
）、ついでＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理を行って、ｙｂ
ａＩ切断部分の粘着基端な鈍感末端に変換した（第１０
図−■′）。ついで、上記で調製した二つ（■′、■′
）のＤＮＡ断片の結合を行い（第１０図−■）、生成結
合体をＴｈａ　Ｉ消化して、ＤＮＡ断片を上記と同様に
して得た（第１０図−■′）。

ｐＨ８１（前記。なお詳細は特開昭５９−７１６９２号
公報参照）　ｆ　Ｓｍａ　Ｉ消化したものに上記ＤＮＡ
断片（■′）を挿入したのち、プロモーターＳＤ配列お
よびＩＦＮ構造遺伝子が同一方向に正しく挿入されたプ
ラスミドｐＴＡ１５０４な得た。なお、塩基配列はマキ
サム・ギルノ々−ト法によって確認した。

ＩＦＮの産生および回収 上記で調製したｐＴＡ１５２４を含む菌（大腸菌に１２
Ｃ６００）を常法に従って培養することによりＩＦＮの
発現を行い、発現の確認は抗ウィルス活性を測定するこ
とによって行った。

（１）菌の培養 菌の培養は、プラスミド組換体ｐＴＡ　１５２４を含む
大腸菌に１２Ｃ６００を上記実施例１と同様にして行っ
た。

（２）抗ウィルス活性の測定 培養終了後、集菌を行い、オスモティック・ショック〔
前記〕処理によって上清を得て、この上清の抗ウィルス
活性を測定した〔蛋白質・核酸・酵素、別冊、扁δ、３
６０．　　（１９８０））。すなわち、ＰＬ細胞（ヒト
羊膜由来の株化細胞）をプレードに培養し、培養液を捨
てたのち、適当に希釈した上清〔上記オスモティック・
ショック処理で得たもの〕をこのＦＬ細胞のプレートに
加えて一夜培蓋〔培養条件は３７℃、５％ＣＯ２以下同
じ〕した。

培地な捨てたのち、適量の水泡性口内炎ウィルス（５ｉ
ｎｄｂｉｓ　ｖｉｒｕｓ）をプレートに接種し、ついで
４８時間培養す行った。培地な捨てたのち、ａＩ胞変性
効果（ｃｐＥ）を測定した。なお、ｐＴＡｘ５２４との
比較例として調製したシグナル・ペプチドな有さないｐ
ＴＡ１５０４についても上記と同様に培養を行ない、上
清を調製して、この抗ウィルス活性を測定した。以上の
２種のプラスミドｐＴＡ１５２４およびｐＴＡ１５０４
　’＆用いてＩＦＮｋ培養したときの抗ウィルス活性は
、下表に示す通りであった。

実施例３ 本発明の方法に従ってヒト成長ホルモン（以下、ｈＧＨ
）？製造した。なお、ｈＧＨの構造遺伝子は化学合成し
たものである。すなわち、本発明者らは、ｈＧＩ（構造
遺伝子を含むプラスミドｐｈＧＨ１（ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ、１２．
７９−８２（１９８３）に従って作製したもの）から構
造遺伝子？切り出し、これを合成リンカ−とともにｐＴ
Ａ１５２９に組込んだｐＴＡ１５２６を作製し、本発明
の方法に従ってｈＧＨを製造した。

１）ＴＡ１５２６の作製（第１２図参照）［）ＴＡ１５
２９　（前記）５μｇをＳａｌ　ＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化したのち、アガロースゲル電気泳動で大きなり
ＮＡ断片な得た（第１２図−■）。

ｈＧＨの構造遺伝子を含むｐｈＧＨｌ　（上記）５μ９
ｉｃｌａＩおよびＳａｌ　Ｉで消化したのち、アガロー
スゲル電気泳動で約６００　ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

ついで、これ７１　ｇｉｎｆ　１消化したのち、大きい
断片（先端の一部が欠けたｈＧＨの構造遺伝子）を得た
（第１２図−■）。

一方、上記二つのＤＮＡ断片な、シグナル・ペプチド直
後に完全なｈＧＨの構造遺伝子が接続されるようにつな
ぐため、下記のリンカ−（第１２図−■）を合成した（
合成法は、前記のリンカ−と同じ固相合成法で行った）
（第１２図参照）。

上記で調製した三つのＤＮＡ断片な結合して、目的とす
るプラスミドｐＴＡ１５２６　ｋ得た。なお、ｐＴＡ１
５２６の、塩基配列は前記実施例と同様にマキサム・ギ
ルバート法（文献上記）によって確認した。

ｈＧＨの産生および回収 上記実施例と同様に宿主菌を通常の方法に従って培養し
たのち、オスモティック・クコツク法によってｈＧＩ（
を回収した。なお、　ｈＧＨ活性の測定はファデパス■
ＨＧＨプリスト（塩野義）のキットによって測定した◇ その結果、オスモティック・ショック法によって得られ
た上清画分にはカルチャー１リツトルあたり４５μＰの
ｈＧＨが含有されていた。

実施例４ 以上実施例３まではｐＴＡ１５２９な用いて本発明の方
法を行ったものであるが、今度は１）ＴＡ１５２９と同
様に分泌機能な有しく＋）ＴＡ１５２９のシグナルペプ
チドはアルカリ性フォスファターゼのもの）カつｈＵＧ
の構造遺伝子を含むプラスミドｐＴＡ　１６３２な造成
して（ｐＴＡｌ　６３２のシグナルペプチトハβ−ラク
タマーゼのものである）、上記と同様にしてｈＵＧ？製
造した。

ｐＴＡ１６３２の造成 ｌ）β−ラクタマーゼのシグナルペプチド（以下、ｂｌ
ａシグナル）の合成 β−ラクタマーゼをコードするＤＮＡ遺伝子として、下
記の配列のものな通常のオリザヌクレオチドの合成法に
従って合成した。なお、ｂａａのアミノ酸配列はＰｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、７５３７３
７〜３７４１　（２９７８）に従った。

ＥｃｏＲＩ　　　　　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　Ｇ
ｌｎ　Ｈｉｓ　　Ｐｈｅ’ＡＡＴＴＣＡＴＧ　ＴＣＴ　
　ＡＴＣＣＡＧ　　ＣＡＴ　　ＴＴＣＥ−一一一一。

ＴＴＡべＧ　ＴＡＣＡＧＡ　ＴＡＧ　ＧＴＣＧＴＡ　Ａ
ＡＧＡｒｇ　Ｖｏｌ　　Ａｌａ　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　Ｐ
ｒｏ　Ｐｈｅ　　ＰｈｅＣＧＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＣＴ
Ｇ　ＡＴＣＣＣＧ　ＴＴＣＴＴＣＧＣＡ　　ＣＡＡ　　
ＣＧＡ　　ＧＡＣＴＡＧ　　ＧＧＣＡＡＧ　ＡＡＧＡｌ
ａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖｏｌ
　　ＰｈｅＧＣＴ　ＧＣＴ　　ＴＴＣＴＧＣＣＴＧ　Ｃ
ＣＧ　ＧＴＴ　ＴＴＣＣＧＡ　　ＣＧＡ　ＡＡＧ　ＡＣ
Ｇ　ＧＡＣＧＧＣＣＡＡ　ＡＡＧＡｌａ↑ なお←−−−ユは制限酵累切断部位を示す。

２）　　ｐＢＲ３２２へのｂｌａｌダンルのクローニン
グ（第１３図参照） 上記で合成したｂｌａシグナルの遺伝子な、以下の手順
に従って造成した。ｐＢＲ３２２（前記）をＨｉｎｃｌ
ｍおよびＲｓｔＩで消化したのち、大きなりＮＡ断片を
回収した（図中■）。また、別にｐＢＲ３２２をＲｓｔ
ＩおよびＥＣ０ＲＩで消化したのち、小さなりＮＡ断片
を回収した（図中■）。これら二つのＤＮＡ断片とｂｌ
ａシグナルＤＮＡ断片とを結合して、プラスミドｐ１３
Ｒｂｌａ　’に得た（図中■）。

３）　　ｈＵＧ遺伝子の連結（第１４図）以下の手順に
従って、上記プラスミド（ｐＢＲ−ｂｌａ）にｈＵＧ構
造遺伝子を挿入した。

ｐＢＲ３２２ｋ　Ｓａｌ　ＩおよびＥＣＯＲＩ消化した
のち、大きいＤＮＡ断片な回収した（■）。上記ｐＢＲ
−ｂｌａをＥＣＯＲＩおよびΣａｅＩ消化したのち、約
７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。一方、ｐＢＲ３２２
−ｈＵＧ（前記）をＥＣＯＲＩ消化し、ついでＴ４　Ｄ
ＮＡポリメラーゼ処理を行ない、さらにＳａｌ　Ｉ消化
して約１６０　ｂｐのＤＮＡ断片を得た（■）。最後に
上記ＤＮＡ断片（■、■および■）を結合して、ｂｌａ
シグナルの直後にｈＵＧの構造遺伝子が結合しているプ
ラスミドｐＢＲ−ｂｌａ−ｈＵＧを得た。

４）トリプトファンプロモーター（Ｔｒｐ）への連結（
第１５図） 以下の手順に従って、ｈＵＧをトリプトファンプロモー
ターの制御下においたプラスミドｐＴＡ１６３２を造成
した。

ｐＴＳＯＯＩ　（ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ認識部位に
、　Ｔｒｐプロモーターなテトラ寸イクリン耐性遺伝子
向きに挿入したのち、アテニュエータ一部分を除去した
もの）を（Ｈｌａ　Ｉ消化したのち、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ処理な行い、さらにヱ１■消化したのち、小さな
りＮＡ断片を回収した（■）。また、上記ｐＢＲ−ｂｌ
ａ　−ｈＵＧをＥｃｏＲＩ消化したのち、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼ処理を行い、さらにＰｓｔＩ消化したのち、
大きいＤＮＡ断片を回収した（■）。最後に上記二つ（
■および■）のＤＮＡ断片の結合を行って、ｐＴＡ　１
６３２を得た。なお、ｐＴＡ　１６３２の取得方法およ
び塩基配列の決定は、前記実施例と同様に行った。

ｈＵＧの産生および回収 ｈＵＧの産生および回収は上記実施例１と同様に行った
。その結果、カルチャー１リツトルあたり１８０μ９の
ｂＵＧが生産されていた。

【図面の簡単な説明】

断部位（破線）およびシグナルペプチド切断点（４）？
示す◇ 第２図は、ｐＴＡ　１５２９製造のフローチャートであ
る。 第３図は、合成したｈＵＧ　（および２ｌ−Ｌｅｕ−ｈ
ＵＧ　）の構造遺伝子の塩基配列を示！であるＯ 第４図は、　ｈＵＧ（２１−Ｌｅｕ−ｈＵＧ）の構造遺
伝子な含むｐＴＡ１５２２　（２１−Ｌｅｕ−ｈＵＧを
含む場合は第６図は、セファデックス■Ｇ−５０カラム
クロマトダラムである。 第７図は；　ＤＥＡＥセファロースＤＥ−５２カラムク
ロマトグラムである。 第９図は、ｐＴＡ　１５０２製造の７０−チャートであ
る０ 第１０図は、ｐＴＡ　ｌ　５２４製造のフローチャート
である。 第１１図は、Ｉ）ＴＡ　１５０４製造のフローチャート
である。 第１２図は、ｐＴＡ　１５２６製造のフローチャートで
ある。 第１３〜１５図はｐＴＡ　１６３２製造のフローチャー
トである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程からなることを特徴とする、蛋白質の製
   造法 （１）所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を含む遺伝子を
   用意すること。 （２）シグナルペプチドをコードする遺伝子であつて、
   その遺伝子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白質の構
   造遺伝子を結合させ得るもの、を含み、かつ予定した宿
   主細胞内で増殖可能なベクターを用意すること。 （３）所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を含む遺伝子と
   上記ベクターとを用いて、予定した宿主細胞内で増殖可
   能な組換体ＤＮＡを調製すること。 （４）この組換体ＤＮＡを用いて宿主細胞の形質転換を
   行なつて、形質転換体を調製すること。 （５）この形質転換体を培養して、産生された所望の外
   来性蛋白質を回収すること。 ２、シグナルペプチドをコードする遺伝子が、その塩基
   対の少なくとも一つを構成員の少なくとも一部として人
   工的に創出された制限酵素認識部位を有するものである
   特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３、制限酵素認識部位内の制限酵素切断部位が、シグナ
   ルペプチドをコードする遺伝子とその下流側末端直後に
   結合されていることあるべき所望の外来性蛋白質の構造
   遺伝子との境界より下流側にはない、特許請求の範囲第
   ２項記載の製造法。 ４、制限酵素切断部位が、シグナルペプチドをコードす
   る遺伝子とその直後に結合されていることあるべき構造
   遺伝子との境界に存在する、特許請求の範囲第３項記載
   の製造法。 ５、シグナルペプチドをコードする遺伝子が天然物由来
   のものである、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１
   項に記載の製造法。 ６、シグナルペプチドをコードする遺伝子が、人工的に
   創出された制限酵素認識部位内の制限酵素切断部位より
   上流側の部分は天然物由来のものであり、この制限酵素
   切断部位より下流側にあるべき部分は合成されたもので
   ある、特許請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載
   の製造法。 ７、シグナルペプチドをコードする遺伝子がアルカリ性
   フォスファターゼ由来のものであり、制限酵素認識部位
   がＨｉｎｄIII認識部位であり、制限酵素切断部位がシ
   グナルペプチドをコードする遺伝子とその下流側末端直
   後に結合されていることあるべき構造遺伝子との境界に
   ある、特許請求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載
   の製造法。 ８、シグナルペプチドをコードする遺伝子がβ−ラクタ
   マーゼ由来のものであり、制限酵素認識部位がＮａｅ
   I 認識部位であり、制限酵素切断部位がシグナルペプチ
   ドをコードする遺伝子とその下流側末端直後に結合され
   ていることあるべき構造遺伝子との境界にある、特許請
   求の範囲第１〜６項のいずれか１項に記載の製造法。