JPH0653073B2 - 酵母発現ベクター系 - Google Patents

酵母発現ベクター系

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JPH0653073B2
JPH0653073B2 JP58144542A JP14454283A JPH0653073B2 JP H0653073 B2 JPH0653073 B2 JP H0653073B2 JP 58144542 A JP58144542 A JP 58144542A JP 14454283 A JP14454283 A JP 14454283A JP H0653073 B2 JPH0653073 B2 JP H0653073B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （発明の分野） この発明は、サッカロミセス・セレビシエー(Saccharom
yces cerevisiae)の抑制性酸性ホスファターゼの遺伝子
PHO5のプロモーターにおいて、該酸性ホスファターゼの
構造遺伝子が除去されており、且つ少なくとも、該プロ
モーターと該構造遺伝子との間にあって該プロモーター
の下流に位置するATG翻訳開始コドンから始まる該酸性
ホスファターゼのシグナル配列コード領域が除去されて
いることを特徴とするPHO5プロモーター、該プロモータ
ーの製造方法、該プロモーターを含んで成る雑種ベクタ
ー、並びに該ベクターにより形質転換された酵母サッカ
ロミセス・セレビシエーに関する。
（発明の背景） 組み換えDNA技術の発達に伴って、有用なポリペプチ
ド、特に医薬として有利なポリペプチドの制御された微
生物的生産が可能となった。組み換えDNA技術を使用す
る最近の研究のほとんどは原核生物に関する。これらの
生物に真核性蛋白質をコードするDNAを導入する方法は
一層精巧になり、今や十分に確立されている。この新し
い技術によって変性された若干の生物種、特にエッセリ
ヒア・コリ（Escherichia coli）の菌株が入手可能であ
り、そしてこれによりインスリン、ヒト−白血球インタ
ーフェロン及びヒト線維芽細胞インターフェロン、並び
にヒト−生長ホルモンのごとき非常に重要なポリペプチ
ドの商業的生産が可能となった。しかしながら、今後多
くの目的のために、蛋白質、特に薬理学的に重要な蛋白
質の商業的生産において、真核系の使用が望ましく、又
は必要となろう。酵母は真核生物であるから、多くの生
物学的経路を、他の真核生物、特に重要な哺乳動物細胞
と共通にしている。薬理学的に重要な多くの蛋白質が哺
乳動物細胞により合成されるから、２つの系を関連させ
ることが特に有利である。例えば、酵母の分泌経路は高
等動物細胞のそれと類似しており、そして信号配列（蛋
白質の負荷されていない（uncharged）Ｎ−末端部分、
通常は分泌輸送中に切断される）を切断する機構を有す
ることが知られている（４７）。グリコシル化系が分泌
経路と関連する。グリコシル化蛋白質を導く基本的な段
階はすべての真核生物における場合と類似しており、そ
して酵母細胞は原核細胞と異り、十分にグリコシル化さ
れた蛋白質を生産することができる（この経路における
幾つかの最終段階は異るであろうが）と説明される。
さらに、酵母細胞は内性毒素（エンドトキシン）を含有
しない。Ｅ． コリからの蛋白質標品には内性毒素によ
り汚染がしばしば見出され、そして不経済な精製段階を
通じてこれを除去しなければならない。
酵母は微生物であるから、酵母細胞は培養が容易であ
る。酵母の場合、培養液の容積当りから得られる細胞の
量はＥ．コリの場合に比べて相当に多い。さらに、酵母
の発酵的挙動はよく理解されており、そして大規模発酵
の条件はすでに確立されている。
過去数年の間に、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ
ー(Saccharomyces cerevisiae)は、基礎及び応用研究分
野の分子生物学者の間でますます注目されるようになっ
てきた。この発展は、外来性DNAの導入及びクローニン
グのごとき遺伝子操作のために酵母を用いることを可能
にした形質転換系の確立〔ヒンネン（Hinnen）等(1)；
ベッグス（Beggs）(2)〕に大きく依存している。原核系
の場合と同様に、プラスミドは酵母細胞を形質転換する
ため、すなわち酵母細胞に組み換えDNAを導入するため
に使用するのに好ましいベクターである。
酵母細胞を形質転換するのに適するベクター、該ベクタ
ーにより形質転換された酵母、該形質転換された酵母に
より生産されたポリペプチド、及びその製造方法に関す
る多くの特許出願及びその他の発表が存在する。
一般的な酵母形質転換法はヒンネン等(1)、ベッグス
(2)、ヒックス（Hicks）等(3)及びストルール（Struh
l）等(4)に開示されている。
プラスミド中でサッカロミセス・セレビシエーのアルコ
ールデヒドロゲナーゼ１（ADH1）の５′−側配列（flan
king sequense）のDNA断片に連続され、そして酵母細胞
に導入されたヒト−インターフェロン遺伝子の発現につ
いてはヒッツェマン（Hitzeman）等(5)に記載されてい
る。
家兎の染色体性β−グロビン遺伝子を含有するプラスミ
ドによるサッカロミセス・セレビシエーの形質転換がベ
ッグス等(6)により報告されている。
この発表においては、遺伝子は不正確に転写され、そし
て一次β−グロビン転写のスプライシングは検出されて
いない。
ポリペプチドをコードしそして誘導し得るプロモーター
に連結されている外来性DNA、及び形質転換された細胞
の検出を可能にする連結されていないDNAにより形質転
換された真核細胞、例えば酵母及び特に哺乳動物細胞、
並びにその製造方法がPCT特許出願８１／０２４２５(7)
に記載されている。
真核性複製部位をコードするDNA配列、低複製数におい
て有糸分裂安定性を有しそして真核性複製部位を含有す
る真核性ベクター、及びこのベクターにより形質転換さ
れた酵母細胞がヨーロッパ特許出願第４８０８１号(8)
に開示されている。
特に真核性宿主自律複製断片を含んでなる雑種DNA、そ
の製造方法、及びこの雑種DNAによる高頻度形質転換真
核細胞、例えば酵母がヨーロッパ特許出願第４５５７３
年(9)に開示されている。エッシェリヒア・コリ のβ−1acＺ遺伝子のプロモータ
ーにより制御されそして酵母細胞中に導入され得る卵白
アルブミン遺伝子を含有するプラスミドが独国出願公開
第２９２３２９７号、及び仏国特許出願第２４５８５８
５号(11)に記載されている。
細菌プラスミドのDNA、酵母２μプラスミドのDNAの全部
又は一部分及び酵母URA3遺伝子を含んで成る雑種プラス
ミド、並びに該プラスミドにより形質転換された酵母が
ヨーロッパ特許出願第１１５６２号(12)に開示されてい
る。
（発明の目的） 近年、遺伝子工学の分野において大きな発展があり、そ
して遺伝的に操作された生物、特に腸内細菌エッセリシ
ア・コリを用いる系が現在機能している。しかしなが
ら、蛋白質の経済的且つ大規模な工業生産に適する前記
以外のそして改良された系、特に酵母のごとき真核系の
必要性が存在する。現在、遺伝子のクローニングのため
の種々の酵母ベクターが利用可能である。外来遺伝子の
効率的な発現のためには、構造コード配列を、遺伝子発
現の外的制御を可能にする制御特性を有利に示す強力な
酵母プロモーターと組合わせる必要がある。このような
要求に合致する酵母プロモーターを提供することがこの
発明の目的である。さらに、この発明は、前記のプロモ
ーター及び該プロモーターにより制御される外来性構造
遺伝子を含んで成る雑種ベクターを提供することを目的
とする。
（発明の詳細な記載） (1)酵母酸性ホスファターゼプロモーターを含有するDNA
断片及びその調製 この発明は、改良された発現性を有する新しく分離され
た酵母プロモーター及びその製造方法を提供する。
この発明の酵母プロモーターは、酵母、特にサッカロミ
セス・セレビシエーの遺伝子DNAから誘導される。
酵母における酸性ホスファターゼの発現には、少なくと
も２つの構造遺伝子（PHO3及びPHO5）、並びに数個の制
御遺伝子（PHO2、PHO4、PHO80、PHO81、PHO85）が関与
する〔例えば参考文献(13)を参照のこと〕。PHO5及びPH
O3は、それぞれ抑制的（repressible）及び構成的（con
stitutive）酵母酸性ホスファターゼをコードする。PHO
5遺伝子は高濃度の無機燐酸塩により抑制され、そして
無機燐酸塩飢餓の下で抑制が解除され（通常、適当な生
理的条件下で大はばに）、他方PHO3遺伝子は低いレベル
において構成的に発現する。抑制的酵素はグリコシル化
され、そして約４９０ｋダルトンの分子量を有する(1
4)。
従来技術の組み換えDNA技術においては酸性ホスファタ
ーゼを制御するプロモーターは分離されておらず、又は
使用されておらず、そのためそのヌクレオチド配列はま
だ解明されていない。最近の組み換えDNA技術において
使用される他の酵母プロモーターと異り、酵母酸性ホス
ファターゼプロモーターに直接続くDNA配列が、分泌過
程に関与すると考えられる信号ペプチドをコードする。
外来性蛋白質コード領域を、蛋白質の酵母細胞膜を通過
する生体内輸送を保証する酵母信号配列に連結するのが
有利であろう。こうすることにより、生成物の分解及び
宿主細胞成分による生成物の汚染が少なくなり、そして
生成物の回収が促進されるであろう。各遺伝子が構成的
に転与されるのが、組み換えDNA技術において従来使用
されてきたプロモーターの欠点である。発現されたポリ
ペプチドは酵母細胞にとって毒性である（殺カビ活性）
場合があり、又少なくとも細胞増殖を阻害する（静カビ
活性）場合があり、あるいは又ポリペプチドが細胞内
で、特に酵母プロテアーゼと長時間接触した場合に、分
解される場合がある。これらすべての場合において、目
的とするポリペプチドの収量が低下するであろう。PHO5
プロモーター及び該プロモーターを含有するベクターを
使用することによって前記の欠点を回避することができ
る。培地中の無機燐酸塩の濃度を単に上昇せしめ又は低
下せしめることによって、実験者の意のままに、PHO5を
抑制し、又は抑制を解除することができる。すなわち、
酵母の指数増殖期中プロモーターを抑制し、そして定常
期の初めにおいて抑制を解除することにより最高の細胞
濃度においてPHO5プロモーターにより制御された遺伝子
を発現せしめることができる。このような性質が高レベ
ルの転写とあいまって、PHO5プロモーターをしてこの発
明の好ましいプロモーターとしている。
この発明は特に、酵母酸性ホスファターゼプロモータ
ー、例えばPHO3プロモーター、又は好ましくはPHO5プロ
モーター、及び側配列を含んでなるDNA断片に関する。
場合によっては、酵母酸性ホスファターゼプロモーター
の次に、該プロモーターにはじめから連結されていた酵
母酸性ホスファターゼコード領域の信号配列の全部又は
一部分が続く。さらに、前記のDNA配列は、mRNAの効率
的な翻訳のために必要とされる配列を含有することがで
きる。さらに、前記DNA断片のプロモーター機能を保有
する変異体もこの発明に含まれる。
この発明のDNA断片は、例えば、 (A)酸性ホスファターゼ遺伝子の野性型コピーを含有す
るプラスミドDNA（酵母遺伝子試料集団から入手され
る）を用いて形質転換することにより酸性ホスファター
ゼ欠損酵母菌株を補完し、そして該遺伝子を分離するこ
とによって酸性ホスファターゼ遺伝子を調製し、 (B)得られた遺伝子のサブクローンを調製し、そして (C)前記サブクローンのプロモーターの領域の位置を同
定し、そして酸性ホスファターゼプロモーターを含んで
成るDNA断片を分離する、 ることができる。ことにより製造す さらに詳しくは、前記DNA断片の調製には次の段階が関
与する。
(1)細菌細胞及び酵母細胞のいずれにおいても発現可能
なマーカーを担持した細菌（特にエッセリヒア・コリ）
−酵母雑種プラスミド中にクローニングした野性型酵母
DNAを用いて酵母遺伝子試料集団を構成する（適切なマ
ーカーについては下記を参照のこと）。
(2)前記試料集団のプラスミド試料を用いて酸性ホスフ
ァターゼ欠損酵母菌株を形質転換することにより酵母酸
性ホスファターゼを含有するクローンを選択する。
(3)形質転換された酵母から酸性ホスファターゼ遺伝子
を含有するプラスミドを分離し、そしてこれをＥ．コリ
に逆形質転換し、細菌用マーカー（例えばアンピシリン
耐性）の表現形により選択することによって該プラスミ
ドを増幅する。
（２′）前記の方法に代えて、遺伝子試料群を亜試料群
に分割し、これを用いて酸性ホスファターゼ欠損酵母菌
株を形質転換し、そして有効な亜試料群を再度亜分割
し、そしてこれを用いて上記のように形質転換し、単一
のクローンが同定されるまでこれを反復する。
(4)同定されたクローンのプラスミドDNAを分離し、適当
な制限エンドヌクレアーゼにより分解し、そして断片を
適当な酵母ベクターに再クローニングする。
(5)酵母酸性ホスファターゼ遺伝子含有DNA断片は、前記
のベクターにより酸性ホスファターゼ欠損酵母菌株を形
質転換することにより同定することができる。上記の方
法により、約３００塩基対の精度をもって酸性ホスファ
ターゼ遺伝子の境界を決定することができる。
(6)同定された断片のDNA配列を決定することにより、プ
ロモーター領域、酸性ホスファターゼ蛋白質をコードす
る領域、そしてさらには、さらに処理するため、例えば
制限エンドヌクレアーゼによりプロモーター機能のため
に必要でないDNA配列を切断除去するために有用な制限
部位の位置を決定する。
制限エンドヌクレアーゼの選択に依存して、酸性ホスフ
ァターゼプロモーターを含有するDNA断片はさらに、プ
ロモーター機能を有しない３′及び５′末端にもとから
存在する側DNA配列をも含有する場合があり、この配列
は次に行うクローニング操作における連結配列として使
用される。所望により、これらの追加の配列は制限エン
ドヌクレアーゼ（もし可能であれば）、又は適当なエキ
ソヌクレアーゼ、例えばBal １３１、による切断によ
って短縮することができる。さらに、断片を、好ましく
は適当な制限エンドヌクレアーゼを認識する配列を含有
する化学合成したDNAリンカーに連結することができ
る。酵母酸性ホスファターゼプロモーター、及び酸性ホ
スファターゼ蛋白質コード領域からの隣接する信号配列
の一部又は全部を含有するDNA断片を分離しそして／又
は形成することもできる。適切に切断した外来性ポリペ
プチドコード領域に連結した場合、こうして得られた雑
種DNAは酵母で発現し、そして酸性ホスファターゼ信号
配列又は融合した信号配列を伴うポリペプチドを生成せ
しめるであろう。
この発明の酵母酸性ホスファターゼプロモーターは、酵
母雑種ベクター中の酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペ
プチドコード領域の発現を制御するために用いることが
できる。
(2)酵母酸性ホスファターゼプロモーターを含有する雑
種ベクター及びその調製 この発明はさらに、酵母酸性ホスファターゼプロモータ
ー、及び該プロモーターにより制御される酵母ポリペプ
チド又は非酵母ポリペプチドコード領域を含んで成る雑
種ベクターに関する。
この明細書において、「ベクター」、「雑種ベクタ
ー」、「DNA配列」等の語は特に二重鎖DNAに関して使用
する。
しかしながら単鎖DNAも含まれる。ベクター及び雑種ベ
クターは、線状又は環状の形で存在し得る。
酵母酸性ホスファターゼプロモーターは、特に第１章に
おいて記載したものであり、そして好ましくは抑制的酸
性ホスファターゼプロモーターPHO5である。
上記のプロモーターの１つによって制御される酵母ポリ
ペプチド又は非酵母ポリペプチドをコードする領域（遺
伝子）は、遺伝子DNAから、もしくはmRNA経路を介してc
DNAから誘導することができ、又は学的に合成すること
ができる。非酵母ポリペプチドをコードする領域（遺伝
子）は、ウイルス、原核細胞、又は高等真核細胞、特に
ヒトの細胞を含む真核細胞に由来する。宿主酵母細胞中
で発現する場合、これらの遺伝子により広範囲の種類の
ポリペプチドが生産され、グリコシル化されたポリペプ
チドを含むこれらのポリペプチドには、例えば、栄養素
を製造するため及び化学反応を酵素的に行うための酵
素、又は非酵素性ポリペプチド、例えばホルモン、免疫
調節性、抗ウイルス性及び抗癌性ポリペプチド、抗体、
ウイルス抗原、ワクチン、凝血因子、食料及びこれらに
類するものが含まれる。例えば前記の遺伝子は、アミラ
ーゼ、プロテアーゼ、リゾチーム、ウイルス性チミジン
キナーゼ、レンニン、β−ラクタマーゼ、グルコースイ
ソメラーゼ、セクレチン、チモシン、レラクシン、カル
シトニン、ソマトスタチン、ヒトもしくは牛の生長ホル
モン、インスリン、黄体形成ホルモン、小皮小体ホルモ
ン、アデノコルチコトロピン、β−エンドルフィン、黒
血球刺激ホルモン、β−リポトロピン、ウロガストロ
ン、インターフェロン、例えばヒト−インターフェロ
ン、例えばヒト−白血球、リンパ芽球細胞（lymphoblas
toid cell）もしくは繊維芽細胞から誘導されるヒト−
インターフェロン−αもしくは−βポリペプチド、又は
ヒト−インターフェロン−γ、リンポカイン、腫瘍壊死
因子、抗レンニン抗体、肝炎Ａウイルス抗原、肝炎Ｂウ
イルス（HBV）表面もしくは心抗原、肝炎非−Ａ非−Ｂ
ウイルス抗原、ヒト組織適合性抗原、食品及び口疾患ウ
イルス抗原、インフルエンザヘマグルチニン、鳥類ペス
トウイルスヘマグルチニン、血清アルブミン、卵アルブ
ミン、タウマチン、エグリンス（eglins）もしくはプラ
スミノーゲン活性化物質をコードする。
選択されたペプチドコード領域は、場合によっては信号
配列又はその一部を含有する。前記のように、この領域
により、外来性の熟成ポリペプチドと共に、PHO5信号配
列、又はPHO5信号配列の一部分と外来性ポリペプチドの
信号配列の一部分とを含んで成る雑種信号配列を含有す
る融合蛋白質が生成する。このいずれの場合にも、外来
性ポリペプチドの熟成に際して信号配列が切除される組
合わせが好ましい。
酸性ホスファターゼプロモーター、及び酵母ポリペプチ
ド又は非酵母ポリペプチドをコードする領域のほかに、
プロモーターの機能のため、すなわちポリペプチドコー
ド領域の発現のためには必要ではなく、又は重要ではな
いが、例えば前記雑種ベクターにより形質転換された酵
母細胞の増殖の際に重要な機能を果す追加のDNA配列を
含有することができる。追加のDNA配列は、原核細胞及
び／又は真核細胞から誘導され、そして染色体性及び／
又は染色体外DNA配列を含むことができる。例えば、追
加のDNA配列は、プラスミド、例えば細菌性もしくは真
該性プラスミドDNA、ウイルスDNA及び／又は染色体DN
A、例えば細菌性、酵母性もしくは高等真核性染色体DNA
により生じる（又は構成される）。好ましい雑種ベクタ
ーは、細菌プラスミド、特にエッセリヒア・コリプラス
ミドpBR322もしくは関連プラスミド、バクテリオファー
ジλ、酵母２μプラスミド、及び／又は酵母染色体DNA
を含有する。
追加のDNA配列は酵母複製開始点及び酵母用選択遺伝子
マーカーを含有することが好ましい。酵母複製開始点、
例えば染色体性自律複製部分（１個又は複数個）を含有
する雑種ベクターは、形質転換後、酵母細胞中で染色体
外で保持され、そして有糸分裂の際に自律的に複製され
る。酵母２μプラスミドDNAと相同の配列を含有する雑
種ベクターも又使用することができる。これらの雑種ベ
クターは、組み換えにより細胞内にすでに存在する２μ
プラスミド中に一体化され、又は自律的に複製するであ
ろう。２μ配列は高頻度形質転換プラスミドのために特
に適し、そして高コピー数を供することができる。
さらに、この発明の雑種ベクターは宿主酵母の染色体中
に存在する遺伝子のDNA配列（例えばPHO5）を含有する
ことができ、このプロモーターは酵母ポリペプチド又は
非酵母ポリペプチドをコードする領域に連結されていて
よい。配列が相同であるため、組み換えによりベクター
全体が宿主の染色体に安定に導入され得る。従って、増
殖の過程で、子孫細胞は選択圧が無くても導入された遺
伝物質を維持するであろう。
酵母用の選択遺伝子マーカーとして、マーカーの表現型
発現に基いて形質転換体の選択を促進する任意のマーカ
ーを使用することができる。酵母用の適当なマーカー
は、特に抗生物質耐性を発現するマーカー、又は栄養要
求性酵母変異株の場合には宿主の障害を補足する遺伝子
である。対応する遺伝子は、例えば抗生物質シクロヘキ
シミドに対する耐性を供し、又は栄養要求性酵母変異株
に原栄養性を供する遺伝子、例えばURA3、LEU2、HIS3又
はTRP1遺伝子である。形質転換される宿主がマーカーに
より発現される生成物を要求する場合には、自律複製部
分に関連する構造遺伝をマーカーとして使用することも
できる。
有利には、この発明の雑種ベクター中に存在する追加の
DNA配列にはさらに、複製開始点及び細菌宿主特にエッ
セリヒア・コリ用選択遺伝子マーカーを含めることがで
きる。酵母雑種ベクター中にはＥ．コリ複製開始点及び
Ｅ．コリマーカーの存在に関連する有用な特徴がある。
第１に、Ｅ．コリにおける増殖及び増幅によって多量の
雑種ベクターDNAが得られる。そして第２に、Ｅ．コリ
に基礎を置くクローニング技術の全知見を用いて雑種ベ
クターを便利に形成することができる。Ｅ．コリプラス
ミド、例えばpBR322等はＥ．コリ複製開始点、及び抗生
物質、例えばテトラサイクリン及びアンピシリンに対す
る耐性を供するＥ．コリ遺伝マーカーを含有し、そして
酵母雑種ベクターの一部として有利に用いられる。
例えば、酵母及び細菌宿主用複製開始点及び遺伝マーカ
ー（上記を参照）を含有する追加のDNA配列は、以後
「ベクターDNA」と称し、このものは酸性ホスファター
ゼプロモーター、及び酵母ポリペプチド又は非酵母ポリ
ペプチドをコードする領域と一緒になってこの発明の雑
種ベクターを構成する。
雑種ベクターは、当業界において知られている方法によ
り、例えば、酵母酸性ホスファターゼプロモーター、及
び該プロモーターにより制御される酵母ポリペプチド又
は非酵母ポリペプチドコード領域をベクターDNAに導入
することにより調製することができる。
少なくとも１個、好ましくは２個又はそれより多くの制
限部位を有する、すでに遺伝子地図が作られている線状
の、又は好ましくは環状のベクターDNA、例えば細菌プ
ラスミドDNA等を用いることができる。すでに複製開始
点並びに酵母宿主及び／又は細菌宿主用遺伝子マーカー
を含有しているベクターDNAを用いるのが便利である。
適当な制限エンドヌクレアーゼを用いてベクターDNAを
開裂する。制限酵素処理されたDNAを、酸性ホスファタ
ーゼプロモーターを含有するDNA断片、及び酵母ペプチ
ド又は非酵母ペプチドをコードするDNA断片に連結す
る。プロモーターとポリペプチドコード領域との連結に
先立って、又はその後で（あるいは又それと同様に）、
酵母宿主用もしくは細菌宿主用の複製開始点及び／又は
マーカーを導入することができる。いかなる場合にも、
制限処理及び連結処理（アニーリング）の条件は、ベク
ターDNA及びプロモーターの本質的機能が害されないよ
うに選択する。雑種ベクターは逐次的に、又は必要とす
るすべての配列を含む２つのDNA部分を連結することに
より形成することができる。
試験管内でDNA断片を連結するのに種々の技法が使用さ
れる。ある種のエンドヌクレアーゼによって形成される
平滑末端（ブラントエンド）（DNAが完全に対を成して
いる）は、Ｔ４DNAリガーゼを用いて直接連結すること
ができる。さらに一般的には、DNA断片をその単鎖接着
末端（コヘーシブエンド）を介してリンクせしめ、そし
てDNAリガーゼ、例えばＴ４DNAリガーゼにより共有結合
的に連結する。この単鎖「接着末端」は、DNAを、ずれ
のある末端（２本鎖DNAが数個のヌクレオチドだけはな
れた異る部位で切断されている）を形成する他の種類の
エンドヌクレアゼにより切断することにより形成され
る。単鎖は、平滑末端又はずれのある末端（staggerd e
nd）に末端トランスフェラーゼを用いてヌクレオチドを
付加することにより、又はλ−エキソヌクレアーゼのご
とき適当なエキソヌクレアーゼを用いて平滑末端の１つ
の鎖を切り取ることにより形成することができる。ずれ
のある末端を形成するための前記以外の方法には、平滑
末端DNA断片に、ずれのある末端を形成するエンドヌク
レアーゼに認識される部位を含有する化学合成リンカー
DNAを連結し、そしてこうして生成したDNAを対応するエ
ンドヌクレアーゼにより切断する方法がある。
効率的な発現のためには、酵母蛋白質又は非酵母蛋白質
をコードする遺伝子が、転写機能（酸性ホスファターゼ
プロモーター）及び翻訳機能（リボゾーム結合部位）を
含む配列に対して適当な位置に存在しなければならな
い。第１に、プロモーターを含んで成るDNA断片とポリ
ペプチドをコードする領域は適切な方向に連結しなけれ
ばならない。もし２種類の方向付けが可能である場合に
は、常用の制限解析により正しい方向を決定することが
できる。正しくない方向付けがされた挿入遺伝子を含有
する雑種ベクターは、適当な制限エンドヌクレアーゼに
より挿入遺伝子を切取り、そしてこの遺伝子を雑種ベク
ター断片に再連結することによって再方向付けを行うこ
とがてきる。ある場合には、それぞれ末端に異る制限部
位を有する２つのDNA断片を連続することにより間違っ
た方向付けを回避することができる。さらに、雑種ベク
ターの構成は、正しい転写の開始と停止が可能なように
行わなければならない。後者に関して、転写は、酵母染
色体DNA又は酵母２μプラスミドから誘導されたDNA配列
において終了するのが好ましい。酵母遺伝子、例えばPH
O5又はPHO3の転写停止信号を含有するDNA配列において
転写が終るのが好ましい。第２に、正しい読取わく（re
ading frame）を確立しなければならない。プロモータ
ー領域及びポリペプチドコード領域のいずれのヌクレオ
チド配列も連結に先立って知られており、又は容易に決
定することができる〔例えば(15)〕から、正しい読取わ
くを確立することについては問題がない。さらに、遺伝
子のより効率的な発現のためにはDNAの特定の二次構造
が必要かもしれない。
酸性ホスファターゼプロモーターが外来性コード配列に
連結するための好ましい部位は、大（major）酸性ホス
ファターゼmRNA開始点と酸性ホスファターゼコード領域
のＡＴＧとの間であり、例えばPHO5プロモーターを使用
する場合には、大PHO5mRNA開始点とPHO5酸性ホスファタ
ーゼコード領域のATGとの間の約４０bp（塩基対）の範
囲である。この領域において連結を行うために、外来性
コード配列は、翻訳開始のための自らのATGを有する必
要があり、あるいは、追加の合成オリゴヌクレオチドに
よりそれを与えられる必要がある。高等生物のポリペプ
チドの多くは、熟成ポリペプチドのＮ末端に付加された
信号ペプチドを含む前−ポリペプチドとして一次的に発
現されるので、挿入遺伝子中に信号配列を含有せしめる
のが有用である。信号配列としては、発現されるべきポ
リペプチド遺伝子又は酸性ホスファターゼプロモータに
もとから連結されていたものが好ましい。これに代え
て、酸性ホスファターゼ信号配列の一部分とポリペプチ
ド信号配列の一部分とを連結して融合信号配列を形成す
ることもできる。直接的に熟成ポリペプチドを発現せし
める必要がある場合には、場合によってはプロモーター
領域の次に存在する、又は場合によっては熟成ポリペプ
チドコード領域の前に存在する信号配列又はその一部分
を、例えば、エキソヌクレアーゼ、例えばBal ３１に
よる分解により除去しなければならない。
中間生成物、例えばなお１つ又は複数の本質的機能を欠
いているベクター、及びこの発明の最終的な雑種ベクタ
ーは、前記の理由（中間生成物及び雑種プラスミドの大
量調製）のため、細菌宿主、特にＥ．コリに形質転換す
ることができる。細菌ベクター、例えばＥ．コリプラス
ミドpBR322、並びに細菌用複製開始点及び遺伝子マーカ
ーを含有する前記プラスミドの断片は、そのために最も
好ましいベクターである。このような細菌ベクターを使
用する場合、酵母雑種ベクターの調製の最終段階に、酵
母用の遺伝子マーカー及び複製開始点の導入を含めるの
が好ましい。
この発明の雑種ベクターを調製するために細菌ベクター
に挿入されるDNA断片、例えば自律複製部分〔(4)を参照
のこと〕、酵母２μプラスミド配列(2)又は酵母マーカ
ーDNA(16)は、それぞれ酵母染色体DNA及び酵母２μプラ
スミドDNAから常法に従って分離することができる。酵
母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコードする遺
伝子は、常用の技法を用いてmRNA経路（前記）を介して
cDNAから誘導される染色体DNAもしくは染色体外DNAから
分離することができ、〔例えば(17)、(18)〕、又は化学
的に合成することもできる。
この発明の好ましい態様においては、雑種ベクターを調
製する方法は、 (1)野生型酵母DNAを用いて酵母遺伝子試料集団を構成
し、 (2)酸性ホスフェターゼ遺伝子、特にPHO5遺伝子を分離
し、そしてこれを、細菌プラスミド例えばpBR322又は生
物的に活性な、特にもとの複製開始点及び選択マーカー
を含有する該プラスミドの断片にクローニングし、 (3)前記プラスミド中に酵母用遺伝子マーカー、例えばT
RP1遺伝子、及び酵母複製開始点、例えば染色体性自律
複製断片又はこれの代りに酵母２μプラスミド配列を挿
入し、 (4)酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチド、例えば
ヒト−インターフェロン、HBV表面抗原をコードするDNA
断片を、前記酸性ホスファターゼプロモーターが前記ポ
リペプチドコード部分を制御するように導入し、そして (5)場合によっては、ポリペプチドコード領域より下流
に、酵母遺伝子、例えばPHO5の転写停止信号を含有する
DNA配列を挿入する、 ことから成る。
例えば、段階(2)の生成物として得られた組み換えプラ
スミド中に、まずポリペプチドをコードする部分を導入
し、次に酵母用遺伝子マーカー及び複製開始点を導入す
るというように、段階(3)〜(5)の順序を変えて行うこと
も可能である。
酵母用遺伝子マーカー、酵母複製開始点及びポリペプチ
ドコード部分を挿入するのに先立って、場合によって
は、必須でない機能部分、例えば酸性ホスファターゼ構
造遺伝子を、段階(2)において得られた組み換えプラス
ミドから除去することができる。
特に、酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコー
ドするDNA断片を、大酸性ホスファターゼmRNA開始点と
酸性ホスファターゼコード領域のATGとの間で、酸性ホ
スファターゼプロモーターに連結する（段階４）。場合
によっては、適当な制限部位を含有する合成リンカーを
導入することによって、前記DNA断片と酸性ホスファタ
ーゼプロモーターとの連結を可能にする。
酵母酸性ホスファターゼプロモーターを含んで成り、そ
してまだ酵母ペプチド又は非酵母ペプチドをコードする
配列を含有していない中間体雑種ベクターもこの発明の
対象であり、そして上記の逐次段階(1)，(2)，(3)及び
場合によっては(5)により調製され、この場合酸性ホス
ファターゼプロモーターの末端を大酸性ホスファターゼ
mRNA開始部位と酸性ホスファターゼ遺伝子のATGとの間
に位置せしめそして／又は場合によっては、適当な制限
部位を含有する合成リンカーを導入して酵母ポリペプチ
ド又は非酵母ポリペプチドをコードするDNA断片の挿入
を可能にする。
(3)酵母酸性ホスファターゼプロモーター含有雑種ベク
ターによる酵母の形質転換 他の観点において、この発明は、酵母ポリペプチド又は
非酵母ポリペプチドを生産することができる形質転換さ
れた酵母細胞の製造方法に関する。この方法は２章で記
載した任意の雑種ベクターにより酵母を形質転換するこ
とからなる。
有用な酵母には、サッカロミセス（Saccharomyces）
属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、
トルロプシス（Torulopsis）属及び類縁属に属する種、
特にサッカロミセス・セレビシエーの菌株が含まれる。
雑種ベクターによる酵母の形質転換は、文献により公知
の方法により、例えばヒンネン（Hinnen）等(1)に記載
されている方法により行うことができる。この方法は次
の３段階にわけることができる。すなわち、 (1)酵母細胞壁を除去し、 (2)PEG（ポリエチレングリコール）及びCa＋＋イオンの
存在下で、形質転換DNAにより「裸」の酵母細胞（スフ
ェロプラスト）を処理し、そして (3)寒天固形層中で細胞壁を再生せしめ、そして形質転
換された細胞を選択する。
好ましい方法においては、 （１′）浸透圧的に安定な溶液（例えば１Ｍソルビトー
ル）中で、グルコシダーゼの種々の標品、例えばカタツ
ムリ腸液（例えばグルスラーゼ 、もしくはヘリカーゼ
）又は微生物から得られた酵素の混合物（例えば、チ
モリアーゼ ）を用いて酵素的に酵母細胞壁を除去す
る。
（２′）PEGの存在下で酵母スフェロプラストを凝集せ
しめ、そして細胞質膜の局所的融合を誘導する。「融合
様（fusion like）」状態の発生は決定的であり、形質
転換の過程で多くの形質転換された酵母細胞は二倍体又
は三倍体にさえなる。形質転換体を濃縮するために融合
したスフェロプラストを選択する手法を用いることがで
きる。すなわち、形質転換された細胞は予備選択された
融合生成物の中から容易に選択することができる。
（３′）細胞壁を有しない酵母細胞は分裂することがで
きないから、細胞壁を再生しなければならない。この再
生は、スフェロプラストを寒天中に埋め込むことによっ
て便利に行うことができる。例えば、溶融した寒天（約
５０℃）をスフェロプラストと混合する。溶液を酵母の
増殖温度（約３０℃）に冷却することにより固相が得ら
れる。この寒天相により、必須の巨大分子がスフェロプ
ラストから急速に拡散し、そして失われることが防止さ
れ、これにより細胞壁の再生が促進される。しかしなが
ら（効率は低いが）スフェロプラストを、あらかじめ形
成した寒天層表面に置くことによっても細胞壁の再生を
行うことができる。
好ましくは、細胞壁再生用寒天は再生と形質転換された
細胞の選択とが同時に可能となるように調製する。一般
に、アミノ酸生合成経路の酵素をコードする遺伝子が選
択マーカーとして使用される（２章を参照のこと）か
ら、酵母最少培地寒天中で再生を行うのが好ましい。し
かしながら、非常に高い再生効率が必要な場合には、２
段階法、すなわち(1)豊富な複合培地中で細胞壁の再生
を行い、そして(2)レプリカ法により細胞層を選択寒天
プレートに移すことにより形質転換された細胞を選択す
る方法が有利である。
雑種ベクターがマーカー遺伝子を全く含有しない場合に
は、他の方法により形質転換された細胞を選択すること
ができる。これらの方法には、例えば、雑種ベクターの
配列と相同のラベルされたDNA断片とその場でハイブリ
ッドを形成せしめる方法〔ヒンネン等(1)参照〕、導入
された遺伝子の生産物の抗体が利用できる場合にはその
場で免疫測定する方法、又は形質転換プラスミドにより
コードされた遺伝子生成物を測定する他の選択方法が含
まれる。
前記の方法に代えて、酵母を、この発明の雑種ベクター
及び酵母用遺伝子マーカーを含有する第２のベクターを
用いて二重形質転換することができる。異なる２つのベ
クターが共通のDNA配列を有する場合（ベクター上に細
菌配列が存在し得る）、組み換えが生じて融合された選
択され得る雑種分子が誘導される場合がある。
この発明はさらに、酵母酸性ホスファターゼプロモータ
ー、及び酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチドをコ
ードする領域を含有する雑種ベクターにより形質転換さ
れた酵母宿主に関する。
(4)形質転換された酵母細胞の培養、及びポリペプチド
合成の誘導 自律複製プラスミド、例えば酵母２μプラスミドDNAを
含有するプラスミドにより形質転換された酵母細胞は、
導入された雑種プラスミドを喪失する傾向を種々の程度
に有する（１６参照）。このため、このような酵母は、
選択的条件下、すなわちプラスミドにコードされた遺伝
子の発現が増殖のために必須である条件下で増殖せしめ
なければならない。現在使用されているほとんどの選択
マーカーは、アミノ酸生合成又はプリン生合成酵素をコ
ードする遺伝子である。このため、対応するアミノ酸又
はプリン塩基を含有しない合成最少培地を使用する必要
がある。しかしながら、抗生物質耐性を供するある種の
遺伝子〔例えば、シクロヘキシミド耐性又はアミノグリ
コシドＧ４１８耐性を供する遺伝子（２１参照）〕を用
いることもできる。抗生物質耐性遺伝子を含有するベク
ターにより形質転換された酵母細胞は対応する抗生物質
を含有する複合培地で増殖することができ、従ってより
速い増殖速度及びより高い細胞濃度を達成することがで
きる。
染色体に一体化するDNAにより形質転換された酵母細胞
は選択的増殖条件を必要としない。これらの形質転換さ
れた細胞は、選択圧がなくても十分安定に増殖すること
ができる。従って、このような細胞は、複合培地中で有
利に増殖する。
構成的酸性ホスファターゼプロモーター（例えば、PHO
3）を有する雑種プラスミドを含有する酵母細胞は、誘
導を必要としないで、該プロモーターに付加された酵母
蛋白質又は非酵母蛋白質遺伝子を発現せしめる。しかし
ながら、酵母蛋白質又は非酵母蛋白質遺伝子が抑制され
る酸性ホスファターゼプロモーターPHO5の制御の下にあ
る場合には、最高レベルのmRNA転写が得られるように増
殖培地の組成を調整しなければならない。すなわち、PH
O5プロモーターの抑制を解除するため、増殖培地中の無
機燐酸塩含量は低濃度でなければならない。
5.発現されたポリペプチドの分離及び生成 この発明はさらに、酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペ
プチド、例えばヒト−インターフェロン又はHBV表面抗
原の製造方法に関し、この方法は、 (1)酵母酸性ホスファターゼプロモーター、及び酵母ポ
リペプチド又は非酵母ポリペプチドをコードする領域を
含有する雑種ベクターにより形質転換された酵母を、適
当な栄養条件の下で培養し、そして (2)前記のポリペプチドを分離し、そして精製する、段
階を含んで成る。
この発明の形質転換された酵母菌株は、資化性炭素源及
び窒素源並びに無機塩を含有する液体培地中で培養す
る。
種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭素源
の例として、資化性炭水化物、例えばグルコース、マル
トース、マンニトールもしくはラクトース、酢酸塩を挙
げることができ、これらは単独で又は適当に混合して使
用することができる。適当な窒素源には、例えばアミノ
酸、例えばカザミノ酸、ペプチド、並びに蛋白質及びそ
の分解生成物、例えばトリプトン、ペプトン、又は肉エ
キストラクト、さらには酵母エキストラクト、マルトエ
キストラクト、コーンスチープリカー、さらにアンモニ
ウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム又
は硝酸アンモニウムが含まれ、これらは単独で又は適当
に混合して使用することができる。使用することができ
る無機塩には、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネ
シウムの硫酸塩、塩化物、燐酸塩及び炭酸塩が含まれ
る。
さらに、栄養培地には、増殖促進物質及び／又は雑種プ
ラスミドの喪失を防止するための選択圧を供する物質を
含有せしめることもできる。増殖促進物質には、例え
ば、微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン及びこれらに
類するもの、又は個々のアミノ酸が含まれる。
雑種プラスミドが抗生物質耐性を供する遺伝子を含有す
る場合、このような雑種プラスミドを含有する細胞は抗
生物質を補給された培地中で生存し、他方この雑種プラ
スミドを喪失した細胞、及び抗生物質感受性の汚染微生
物は生存しないであろう。雑種プラスミドが栄養要求性
酵母変異株に原栄養性を与える遺伝子例えば、LEU2遺伝
子又はHIS3遺伝子を含有する場合には、栄養培地から遺
伝子生成物、例えばロイシン又はヒスチジンを除去する
ことにより選択圧を生じさせることができる。
培養される酵母菌株が抑制される酸性ホスファターゼプ
ロモーターPHO5を含有する雑種プラスミドにより形質転
換されている場合、最高レベルのmRNA転写を確保し、従
ってポリペプチドの最高収量を確保するために、前培養
期間の後、栄養培地中の無機燐酸塩含量を低下せしめな
ければならない。
培養は常法を用いて行う。培養条件例えば温度、培地の
pH及び発酵時間は、ポリペプチドが最高レベルで生産さ
れるように選択する。選択された酵母菌株は、約２５℃
〜３５℃の温度、好ましくは約３０℃、pH４〜８、例え
ば約pH７において、そして約４〜２０時間、好ましくは
ポリペプチドの収量が最高に達するまで、振とう又は攪
拌を行いながら、液体培地中好気的条件下で増殖せしめ
るのが好ましい。
形質転換された酵母細胞が十分な細胞濃度にまで増殖し
た後、発現されたポリペプチドを回収する第一段階とし
て細胞内からポリペプチドを遊離せしめる。ほとんどの
方法において、まず、グルコジダーゼを用いて酵素的分
解により細胞壁を除去する（３章を参照のこと）。次
に、得られたスフェロプラストを洗剤、例えばトリトン
（Triton）により処理する。この方法に代えて、細胞を
破壊するために機械的な力、例えば剪断力（例えばＸ−
プレス、又はフレンチプレス）、又はガラスビーズとの
振とうを用いることができる。得られたポリペプチド混
合物中の目的ポリペプチドを濃縮するために常用手段、
例えば硫酸アンモニウム又はトリクロロ酢酸による沈
澱、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、例えば
イオン交換クロマトグラフィー、サイズ−エクスクルー
ションクロマトグラフィー、HPLC又は逆相HPLC、及びこ
れらに類するものを用いることができる。予備精製され
た生成物の最終精製を、例えば抗原アフィニティークロ
マトグラフィーにより行うことができる。原則として、
精製段階（細胞の分解段階を除く）は、ヒト−白血球イ
ンターフェロンの精製のためにスターリン（Staeheli
n）等（２２）により開発された方法に従って実施する
ことができる。
例えば、目的とするポリペプチドの分離及び精製は次の
段階を用いて行うことができる。すなわち、 (1)グルコシダーゼを用いて酵母細胞を分解し、 (2)洗剤で処理し、 (3)ポリエチレンイミンで処理することにより非蛋白質
性物質の大部分を除去し、 (4)溶液を硫酸アンモニウムで飽和することによりポリ
ペプチドを沈澱せしめ、 (5)適当な緩衝混合物中で透析し、 (6)DEAE−セルロースを用いてカラムクロマトグラフを
処理し、 (7)モノクローン抗体カラムを用いてアフィニティーク
ロマトグラフを処理し、そして (8)適当なセファデックス カラムを用いて分子サイズ
を整える。
十分に純粋な生成物を得るために、必要により、追加の
精製段階、例えば陽イオン又は陰イオン交換クロマトグ
ラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着、逆相HPLC等を
行うことができる。他方、可能であれば、上記の段階の
１つ又は複数を省略することができ、又は段階の順序を
変えることができる。
目的ポリペプチドが酵母によりペリプラスム間隙に分泌
される場合には、単純化された方法を用いることができ
る。すなわち、細胞を溶解することなく、細胞壁の酵素
的除去により、又は細胞壁を破壊してポリペプチドの遊
離を可能にする薬剤、例えばチオール試薬又はEDTAによ
る処理によりポリペプチドを回収することができる。ポ
リペプチドが培養液中に分泌される場合には、培養液か
ら直接ポリペプチドを回収することができる。
この発明により得られるポリペプチドは有用であり、そ
してヒト又は動物の疾患の治療又は予防のために（例え
ば、インターフェロン、HBV表面抗原等）使用すること
ができ、又は食料、飼料、飼料添加物として、あるいは
酵素反応において使用することができる（上記２を参照
のこと）。これらのポリペプチドの天然に存在する誘導
体、例えば蛋白質分解により切断されたポリペプチド及
び／又はグリコシル化ポリペプチドも又この発明に含ま
れると理解すべきである。
この発明はさらに、ポリペプチド及びこの発明の方法に
より生産される限りにおいて天然に存在する前記ポリペ
プチドの誘導体に関する。
この発明はさらに、この発明の方法に従って生産される
新規なポリペプチドに関する。
この発明は特に、DNA断片、雑種ベクター、形質転換さ
れた酵母、ポリペプチド、及び例に記載されたこれらの
調製方法に関する。
次に例によりこの発明をさらに詳細に説明する。但しこ
れによりこの発明の範囲を限定するものではない。
実験の部 例において次の略号を使用する。
Et Br エチジウムブロミド BSA 牛血清アルブミン DTT １，４−ジチオスレイトール（１，４−ジメルカ
プト−２，３−ブタンジオール EDTA エチレンジアミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム TNE １００mM NaCl，１０mMTris・HCl（pH7.５）、及び
１mM EDTAを含有する溶液 Tris・HCl HClによりpHを調製したトリス−（ヒドロキシ
メチル）−アミノメタン PMSF フェニルメタンスルホニルフルオリド TE １０mM Tris・HCl（pH7.５）及び１mM EDTAを含有す
る溶液 例１．酵母遺伝子試料集団の形成 野性型サッカロミセス・セレビシエー菌株S288Cからの
全高分子酵母DNA（２３）３０μｇを、供給者の推奨に
従って２５０μｌのEcoRIメチレーション緩衝液中で、
３７℃にて３０分間、２Ｕ（ユニット）のEcoRIメチラ
ーゼ（ニューイングランド、バイオラブス）と共にイン
キユベートする。DNAをエタノールで沈澱せしめ、５０
０μｌの２５mM Tris・HCl（pH8.５）２mM MgCl2（EcoRI
＊緩衝液）(24)中に再懸濁し、そしてEcoRI（ベーリン
ガー）を用いてDNA断片の大きさの分布が３０〜５０kb
の範囲に最高値を有するまで分解する（λDNAのXhoI分
解により約３３kb及び１７kbのマーカーが得られる）。
EcoRI＊条件下で分解された酵母DNAを、SW40ローター
中、３8,０００rpmにて６時間、シュークロース勾配
〔１０mM Tris・HCl（pH7.５）、１mM EDTA中５〜２０％
シュークロース〕上でサイズ分画する。0.4mlずつの３
０個の分画を、勾配の頂部から集める。分画１６は３０
〜４０kbの大きさのDNA断片を含む。この分画のDNA（３
μｇ）をエタノールで沈澱せしめ、そして１５℃にて１
６時間、全容１５μｌにて１μｇのコスミドベクターpY
cl(25)に連結し、EcoRIにより線状にする。連結は供給
者により記載された緩衝液系を用いて３００ＵのT4DNA
リガーゼ（ニューイングランド、バイオラブス）により
行う。DNAを、試験管内でバクテリオファージλに詰め
込み、そして集めたファージをＥ・コリHB101株（ｒ
，ｍ，ｌｅｕ− ，ｒｅｃＡ− ）の形質導入に使用す
る。形質導入効率は、pYclベクターμｇ当り約５０００
個のアンピシリン耐性コロニーである。ampRコロニー３
０００個を取り上げ、そしてミクロタイター皿のウエル
に収容した、１００μｇ／mlのアンピシリンを含有する
LB培地〔１０ｇのバクト−トリプトン（ディフコ）、５
ｇのバクトイーストエキストラクト（ディフコ）、１０
ｇのNaCl〕中で増殖せしめる。
例２．抑制される酸性ホスファターゼ遺伝子PHO5の分離 遺伝子試料集団のレプリカを、１００μｇ／mlのアンピ
シリンを含有するLB寒天プレート（LB培地に１５ｇ／
の寒天を加えたもの）上で増殖せしめる。５００コロニ
ーの細胞材料をプレートから洗い取り、そして貯蔵す
る。次の方法により、各貯蔵試料からDNAを分離する。
細胞を遠心分離（ソルバル、GSAローター、6,０００rp
m，４℃にて１０分間）し、１００mlのTE（10mMTris・HC
l、1mM EDTA、pH8.0）中に再懸濁し、そして前記の条件
下で再度遠心分離する。細胞塊を3mlのTsuc〔50mMTris・
HCl、pH7.5、２５（Ｗ／Ｖ）％シュークロース〕に再懸
濁し、そしてSS−34ポリプロピレン製ソルバル（Sorval
l）チューブに移す。これ以後の段階はすべて氷上で行
う。0.3mlのリゾチウム溶液（１０mg／ml、ウォーシン
トン製、11,000U／mg）を加え、５分間後に1.2mlのEDTA
（500mM、pH8.０）を加え、さらに５分間後に4.8mlの洗
剤〔0.１％のトリトンＸ-100（メルク）、50mMEDTA、50
mMTris・HCl、pH8.0〕を加える。５分間後、分解物を、
プレコートしたSS−34ローター中で、４℃にて４０分間
遠心分離する。上澄液に注意深く団体のCsClを加える
（8.7mlの上澄液に8.３ｇのCsCl）。エッチジウムブロ
ミド（シグマ）を加えた後（最終濃度１mg／ml上澄
液）、溶液を１3.５mlのクイックシールポリアロマーチ
ューブ（ベックマン）に移し、そしてベックマンTi50ロ
ーター中で４0,０００rpmにて４０時間遠心分離する。
長波長UV(366nm）により螢光帯が観察される。下方の帯
にスーパーコイルプラスミドDNAが含まれており、これ
を、チューブの側面から２mlのシリンジ（18G針）で穴
をあけることにより取り出す。同容量のイソプロパノー
ル（CsClで飽和）で５回抽出することによりエチジウム
プロミドを除去し、生成物を３０mlのコーレックスチュ
ーブに移す。2.５容量のTEを加え、そしてエタノールに
よりDNAを沈澱せしめる。次に、溶液を１２〜１５時間
−２０℃に保持する。沈澱したDNAを、ソルベルHB-４ロ
ーター中で、０℃にて３０分間、１2.０００rpmで遠心
分離することにより集め、そして２００μｌのTEに溶解
する。１００mlの培養液から５０〜１００μｇの雑種プ
ラスミドDNAを回収する。
これらの貯蔵試料からのプラスミドDNAを用いて、ヒン
ネン等により記載された方法(1)に従ってＳ・セレビシ
エ−AH216（ａ，his3，leu3，ph03，ph05）を形質転換
する。酵母形質転換体を低燐酸塩最少培地〔２０ｇ／
のグルコースを補給した「アミノ酸を含まないディフコ
酵母最少培地」、ディフコの処方（ディフコマニュア
ル、ディフコポラトリーズ、デトロイト、米国）に従っ
て調製する。但し、１ｇ／のKH2PO4の代りに0.０３ｇ
／KH2PO4及び１ｇ／KClを使用する。〕上にレプリ
カし、そしてこの上に染色寒天〔１００mM酢酸緩衝液、
pH4.０，２mg／mlのファストブルーβ塩（セルバ）及び
0.２mg/mlのα−ナフトールホスフェート（セルバ）〕
を重層することにより酸性ホスファターゼ活性を見るた
めの染色を行う。機能的PHO5を有するコロニーは、低燐
酸塩培地上で遺伝子の抑制が解除され赤く染まる。遺伝
子試料集団３のサブプーリング(17)を反復することによ
り抑制される酸性ホスファターゼ活性を有する独立コロ
ニーを得る。
これらのクローンの１つ（pG７）をさらに分析する。雑
種プラスミドは４２khの大きさを有する。pG７のEcoRI
及びBamHI断片を、それぞれpBR322/HIS3(16)及びpJDB20
7(28)中にサブクローニングする。供給者（ニューイン
グランド、バイオラブス）が推奨する方法により制限分
解を行い、２０μｌ中に150UT4DNAリガーゼ（ニューイ
ングランド、バイオラブス）及び２０μｇ/mlのそれぞ
れの分解プラスミド（ニューイングランド、バイオラブ
スにより示唆された条件）を用いて連結する。８kbEcoR
I断片の一部である5.１khBamHI断片を、酵母ベクターpJ
DB207中にサブクローニングし、そして酵母AH216株の形
質転換に際して、この雑種プラスミド（pJDB207/PHO5，
PHO3、第１図参照のこと）は、抑制が解除された（燐酸
塩濃度が低い）条件下で高いホスファターゼ活性（PHO5
遺伝子）を供し、そして通常の酵母最少培地で（PHO3遺
伝子の発現により）低いレベルの活性を供する。
例３ PHO5遺伝子及びPHO3遺伝子の位置決定及びDNA配
列解析 (a)PHO5遺伝子 BamＨＩ断片中のPHO3及びPHO5の位置を決定するために
は、Sau3A制限部位及びIstＩ部位のハターンを用いるの
が有利である。制限エンドヌクレアーゼSau3A（ニュー
イングランド、バイオラブス）によるBauHI断片の分解
により６個の断片（Ａ〜Ｆ、第２図）が生ずる。Sau3A
部分分解物を、自律複製酵母ベクターpJDB207のBamHI部
位にサブクローニングすることによりSau3A断片の異る
組合わせを有するプラスミドが生成する。次に、これら
のプラスミドを、酵母S.セレビシエーAH216pho3，pho5
変異株を形質転換するのに用いる。形質転換体を低燐酸
塩培地プレート又は正常最少培地プレート上で増殖せし
めた後、酸性ホスファターゼ活性について検定する。少
なくともSau3A断片Ａ及びＢ（第２図、No.〜４）を含有
するクローンは完全な5.１kb Bam HI断片と同じレベル
で酸性ホスファターゼを発現する（例２に記載した酸性
ホスファターゼ染色寒天を重層した後定性的測定を行
う）。発現は培地中の無機燐酸塩の濃度により正常に制
御される。Sau3A断片Ａのみを有するクローン（第２図N
o.５及び６）は低いレベルの酸性ホスファターゼを発現
し、これは培地中の無機燐酸イオン濃度に影響されな
い。このことは、Sau3A断片Ａに担持されている情報が
構成的酸性ホスファターゼ（PHO3）の発現のために十分
であることを示している。Sau3A断片Ｂ（第２図、No.
７）のみでは、抑制条件又は抑制解除条件のいずれにお
いても酸性ホスファターゼを発現しない。しかしなが
ら、BamHI部位とPstＩ部位の間の完全配列を有するサブ
クローンは、酸性ホスファターゼの抑制的合成を行うが
構成的合成は行わない。従ってこのサブクローンは酵母
PHO5遺伝子(16)を含有していなければならない。PHO5 遺伝子の正確な位置は、マクソン(Maxon)及びジル
バート(Gilbert)(15)の方法を用いてDNA発令を決定する
ことにより決定される。前記の分解条件及び連結条件を
用いて（すべての酵素はニューイングランド、バイオラ
ブス製）、375位から６５０位（pBR322における番号）
にわたるBamHI-SalI断片に代えて６２３bpのBamHI-SalI
制限断片をプラスミドpBR322中にクローニングする（第
１図参照のこと）。BamHI-SalIDNA挿入部は、その５′
末端において次の部位で非対称的にラベルされる。すな
わちBamHI(-541)、Sau3A(-200)及びSalI(+82)（ナンバ
リングについては第３ａ図を参照のこと）である。６２
３bpのBamHI-SalIDNA挿入部のヌクレオチド配列を第３
ａ図に示す。挿入部がPHO5プロモーター領域及びPHO5ホ
スファターゼ蛋白質コード領域の一部を含有することが
明らかである。
(b)PHO3遺伝子PHO3 遺伝子の正確な位置は、ニューイングランド、バイ
オラブスにより発表された方法「M13cloning and DNA s
equencing system」によるDNA配列解析により決定され
る。４１６bpの(5′)PstI-RsaI(3′)断片を、ユニークP
stI及びSmaI制限部位を用いてベクターＭ１３mp８及び
Ｍ１３mp９（４９）にサブクローニングする。416bpのP
stI-RsaIDNA挿入部のヌクレオチド配列を第３ｂ図に示
す。この挿入部はPHO3プロモーター領域及びPHO3酸性ホ
スファターゼ蛋白コード配列の一部を含有することが明
らかである。
例４ プラスミドp30の形成（第４図参照のこと） (a)プラスミドpBR322中のBalI制限部位の除去 第４図に概略を示す方式においては、プラスミドpBR322
中のユニークBalI制限部位を除去する必要がある。３μ
ｇのpBR322を、供給者の推奨に従って、制限エンドヌク
レアーゼBalI(BRL)及びPvuII（バイオラブス）により完
全に分解する。pBR322をBalI/PvuII二重分解することに
より大きさが3738bp及び622bpの２つの制限断片が生ず
る。２つの断片を、TBE緩衝液（90mMTris・HCl、pH8.3、
2.5mMEDTA、９０mM硼酸）中、１％低融点アガロースゲ
ル（シグマ）上で分離する。DNAバンドをエチジウムブ
ロミドで染色し、そして366nmの長波長UV光の下で観察
する。3738bp断片を含有するアガロース片をゲルから切
り取り、６５℃にて液化し500mM NaClに調整し、そして
６５℃にて２０分間インキュベートする。１容量のフェ
ノール（１０mM Tris・HCl、pH7.5、１mMEDTA、500mMNaC
lで平衡化したもの）を加える。水相をフェノールで２
回、そしてクロロホルムで１回再抽出する。DNAを2.5容
量の冷無水エタノールで再沈澱せしめ、そして遠心分離
により集める。DNA塊を８０％冷エタノールで洗浄し、
そして次に真空乾燥する。DNAをTE中に、0.15mg／mlの
濃度に再懸濁する。
分離された3738bpDNA断片は、BalI及びPvuIIによる二重
分解により生じた２つの平滑末端を有する。DNAを平滑
末端連結により還化する。0.6μｇのDNAを、３０μｌの
６０mMTris・HCl、pH7.5、１０mMMgCl2、１０mMDTT、４m
MATP及び９００ＵのT4DNAリガーゼ（バイオラブス）を
含有する溶液中で、室温にて一夜インキュベートする。
連結反応混合物のアリコート５μｌを、カルシウム処理
した、マンデル（Mandel）等の方法（29）により調製し
た形質転換能を有するE.コリHB101細胞５０μｌに加え
る。混合物を５分間氷上に保持し、次に３７℃にて２分
間インキュベートし、そして室温に１０分間置き、１０
０μｇ／mlのアンピシリンを含有するLB寒天プレートに
接種する。６個のampRコロニーを取り上げ、それぞれ別
々に、１００μｇ／mlのアンピシリンを含有するLB（前
記の培地から寒天を除去したもの）中で増殖せしめる。
例２に記載した方法を用いて細胞からプラスミドDNAを
調製する。HaeIII（バイオラブス製、供給者が示唆する
分解条件を使用）、PvuII及びBalIによるプラスミドの
制限分解物を、TBE緩衝液中1.5％アガロースゲル上で分
析する。新しく形成された連結断片の制限パターン及び
予想される大きさから、プラスミドは同じであり、そし
てBalI-PvuII断片以外のすべてのpBR322配列を含有する
ことが示される。これらのプラスミドはBalI制限部位を
喪失しており、そしてpBR322ΔBalIと称する。
(b)PHO5及びPHO3を含有する酵母5.1kbBamHI制限断片のp
BR322ΔBalIへのクローニングpJDB207／PHO5，PHO3（第
１図参照）は抑制される酵母酸性ホスファターゼ（PHO
5）及び構成的酵母酸性ホスファターゼ（PHO3）の遺伝
子を含む酵母5.1BamHI装入部を含有する。pJDB207／PHO
5，PHO3、及びプラスミドpBR322ΔBalIを、制限エンド
ヌクレアーゼBamHIで分解する。完全に分解した後酵素
を６５℃にて２分間不活性化する。両DNAをエタノール
で沈澱せしめ、そして10mMTris・HCl、pH8.0にそれぞれ
0.2mg/mlの濃度で懸濁する。BamHIで分解したDNA（２種
類）のそれぞれ0.5μｇずつを混合し、そして300UのT4D
NAリガーゼを含有する２０μｌの連結緩衝液中で、１５
℃にて２０時間連結する。連結混合物の５μｌのアリコ
ートを５０μｌのカルシウム処理したE.コリHB101細胞
に加え、そして例４ａに記載したのと同様にして形質転
換を行う。形質転換されたE.コリ細胞を、そのアンピシ
リン耐性及びテトラサイクリン耐性について試験する。
８個のampR，tetSコロニーを分離し、そして１００μｇ
／mlのアンピシリンを含有するLB培地１００ml中で増殖
せしめる。細胞からプラスミドDNAを分離する（例２を
参照）。BamHIによる制限分解物は、４プラスミドが3.7
kbベタター断片（pBR322ΔBalI）のほかに5.1kb挿入部
を含有することを示す。SalI（ニューイングランド、バ
イオラブス）を用いる制限分解物により挿入された5.1k
b断片の方向を決定する。すなわち、２つのプラスミド
は第４図に示すような方向の挿入部を有する。これらの
１つをp30と称する。5.1kb挿入部中のPHO5，PHO3遺伝子
の転写の方向は第４図に示すごとく反時計方向である。
例５ 外来性DNAのp30への挿入（第４図参照） (a)p30の3.9kbEcoRI-BalI断片（断片Ａ）の分離 １０μｇのp30DNAを制限エンドヌクレアーゼBalIにより
分解する。フェノール／クロロホルムにより抽出した
後、DNAをエタノールで沈澱せしめる。DNAを１００μｌ
のTE緩衝液に再懸濁する。調製用0.8％低融点アガロー
スゲル（シグマ）上で制限断片を分離する。p30のベク
ター部分を含有する5.1kb断片を、例４ａに記載した方
法によりゲルから溶出する。低塩緩衝液（150mMNaCl、1
0mMTris・HCl、pH8.0、１mMEDTA）中DE52（ワットマン）
イオン変換カラムにDNAを吸着せしめ、そして高塩緩衝
液（1.5MNaCl、１０mMTris・HCl、pH8.0、１mM EDTA）に
よりこれを溶出することによりDNAを精製する。DNAをエ
タノールで沈澱せしめ、そしてさらにEcoRI（ベーリン
ガー）により分解する。3.9kbのEcoRI-BalI制限断片
を、調製用0.8％低融点アガロースゲル上で分離し、例
４ａに記載したようにして回収し、そしてエタノールで
沈澱せしめる。このDNA断片を断片Ａと称する。
(b)CG-pBR322/HLycIFN-8′1の 602bpHaeIII-EcoRI断片（断片Ｂ）の分離E.コリHB-101C
G-pBR322/HLycIFN-8′1株（例１０Ｅ参照）を、１０μ
ｇ/mlのテトラサイクリンを補給したLB培地１００ml中
で増殖せしめ、そして例２に記載したのと同様にしてプ
ラスミドDNAを分離する。９μｇのHLycIFN-8′1DNAを制
限エンドヌクレアセHaeIIIにより完全に分解する。制限
断片を調整用0.8％低融点アガロースゲル上で分離す
る。９４０bpHaeIII断片部分を切り取り、そして例４ａ
に記載した方法によりアガロースゲルから溶出する。DN
Aを、例５ａに記載したようにしてDE52により精製し、
そしてさらにEcoRIにより分解する。602bpEcoRI-HaeIII
断片を調製用0.8％低融点アガロースゲル上で分離し、
例４ａの場合と同様にして回収し、そしてエタノールで
沈澱せしめる。このDNA断片を断片Ｂと称する。
(c)断片Ａ及びＢの連結（第５図参照） ２つの制限断片を、EcoRIの接着末端、並びにBslI及びH
ae IIIの平滑末端のそれぞれを介して酵素的に連結す
る。こうしてユニークEcoRI部位、及びHaeIIIで切断さ
れ（但しBalIにより切断されない）BalI-HaeIII結合を
有する環分子が形成される。
連結は、６０mMTris・HCl、pH7.5、10mMMgCl2、１０mMDT
T、４mMATP、３００ＵのＴ４DNAリガーゼを含有する緩
衝液系で、全容量１０μｌ中断片ＡのDNA濃度を２０μ
ｇ/ml、断片Ｂのそれを３μｇ/mlとして、２３℃にて１
６時間にわたって行う。
(d)連結された断片によるE.コリHB101の形質転換 連結混合液（例５ｃ参照）のアリコート２μｌを、５０
μｌのカルシウム処理したE.コリHB101細胞（例４ａ）
に加える。次に、この混合物を、１００μｇ/mlのアン
ピシリンを補給したLB寒天プレートに接種する。プレー
トを３７℃にて１６時間インキュベートする。E.コリHB
101のアンピシリン耐性コロニー約３００個を得る。８
個のアンピシリン耐性コロニーからプラスミドDNAを分
離し、分析し、そしてEcoRI及びHaeIIIにより切断した
後に得られた制限断片の移動性を標準DNA〔HindIII（ニ
ューイングランド、バイオラブス）により分解したバク
テリアファージλDNA、HaeIII及びEcoRIにより分解した
p30プラスミドDNA〕のそれと比較することによりその構
造を決定する。連結の構造を確認した後、正しい構造を
有する５つのプラスミドを得る。８′1−インターフェ
ロンポリペプチドをコードする領域（第５図参照）に連
結されるPHO5を含有するこれらのプラスミドの１つをp3
0IFN1(8′1）と称する。
例６ 酵母用複製開始点及び選択マーカーの添加（第４
図参照） (a)プラスミドYrp7からの1.5kbEcoRI断片の分離、及び
この断片のプラスミドp30IFN1(8′1）への連結 連結反応を促進するため1.5kbEcoRI制限断片を精製す
る。プラスミドYrp7(4)をEcoRIで切断し、得られた２つ
の断片を0.8％アガロースゲル上で分離し、そして酵母
自律複製部分及び酵母TRP１遺伝子を含有する1.5kb断片
を精製し、そして例４ａに記載したようにして分離す
る。連結は、（ニューイングランド、バイオラブスによ
り示唆された方法に従って）２０μｇ/mlのEcoRI切断p3
0IFN(8′1）及び１０μｇ/mlのYrp7からのEcoRI制限断
片を用いて行う。この場合１００ＵのＴ４リガーゼを使
用する。
(b)連結された断片によるE.コリJA194の形質転換 TRP１酵母遺伝子を含有するプラスミドは、E.コリtrpC
変異株JA194（trpC，1euB，B1）の形質転換により直接
選択することができる。
E.コリtrpC遺伝子は、E.コリＮ−（５′−ホスホリボシ
ル）−アンスラニレートイソメラーゼをコードする。E.
コリtrpC変異株を酵母TRP1遺伝子(4)により促進するこ
とができる。E.コリJA194株の形質転換はE.コリHB101
（例４ａを参照のこと）について記載したのと同様にし
て行う。但し、次のように変更する。混合物を寒天プレ
ートに接種する前に１mlのLB培地中に３７℃にて６０分
間おき、細胞をE.コリM9最少培地(30)により１回洗浄
し、そしてビタミンＢ1（１μｇ/ml）及びＬ−ロイシン
（２０mg/ml）を補給したＭ９最少培地プレート上に接
種する。プレートを３７℃に２日間インキュベートす
る。約１０００個のトリプトファン原栄養性E.コリコロ
ニーを回収する。
(c)雑種プラスミドの分離及び特徴付け Trp+コロニーを、１００μｇ/mlのアンピシリンを補給
したLBプレート上で鈍化する。個々のコロニーを拾い上
げ、例２に記載した方法によりプラスミドを分離する。
EcoRI、HindIII、PstI及びBg1I（バイオラブス）により
切断した制限断片の大きさを測定することにより精製し
たプラスミドを分析する。２つの存在し得る方向の1.5k
bEcoRI制限断片を含有する２つの異るタイプのプラスミ
ドを得る。これらを、第４図に示すように、p30IFN2
(8′1)及びp30IFN2′(8′1)と称する。
例７ サッカロミセス・セレビシエーRH971の形質転換
及びインターフェロン生産の誘導 ヒンネン等(1)が記載したのと同様の方法で、プラスミ
ドp30IFN2(8′1)及びp30IFN2′(8′1)のそれぞれをサッ
カロミセス・セレビシエーRH971株（ａ，trp1，1eu2，h
is4）に導入する。１μｇのプラスミドDNAを１００μｌ
のスフェロプラスト懸濁液に加え、そして(1)に記載さ
れているのと同様にして混合物をポリエチレングリコー
ルで処理する。スフェロプラストを１０mlの再生寒天と
混合し、そしてロイシンを含まない酵母最少培地プレー
ト上に接種する。３０℃にて３日間インキュベートした
後、約１０００の形質転換細胞が得られる。
酵母形質転換プレートからの１つの単一コロニー〔それ
ぞれサッカロミセス・セレビシエーRH971／p30IFN2(8′
1)、及び／p30IFN2′(8′1)と称する〕を、１００mlの
エルレンマイアーフラスコに収容した１０mlの酵母最少
培地に拾い上げ、そして３０℃、２００rpmにて２４時
間、濃度が約２〜３×１０7細胞／mlになるまで増殖せ
しめる。細胞を２０mlの低燐酸塩最少培地により１回洗
浄する。３mlの再懸濁細胞を、１０００mlのエルレンマ
イアーフラスコに収容した３００mlの低燐酸塩最少培地
及び３００mlの通常最少培地に接種する。３０℃、１６
０rpmにて培養する。PHO5プロモーターの誘導の後、ト
−（Tohe）等（31）に記載された方法により全細胞中の
酸性ホスファターゼ活性を測定する。細胞は約１〜２×
１０7細胞／mlに増殖する（培養２６〜３０時間）。
例８ 酵母細胞抽出物の調製及びインターフェロン力価
の測定 濃度１〜２×１０7/mlの培養液３００ml（例７参照）を
ソルバルGSAローターで、４℃にて、8.０００rpmの回転
速度で５分間遠心分離することにより集菌する。細胞を
１００mlの水で１回洗浄し、６mlの氷冷した分解混液
〔0.１Ｍ燐酸カルシウム緩衝液、pH7.4、１(v/v)％トリ
トンＸ-100、0.0001MPMSF（メルク）〕に再懸濁し、そ
して３０mlのコーレックスチューブに移す。懸濁液を、
ソルバルSS-34ローター中、４℃、8.０００rpmにて５分
間再度遠心分離し、そして０℃にて３mlの分解混液に再
懸濁する。４ｇのガラスビーズ（直径0.４mm）を細胞に
加え、そして懸濁液を、ボルテックスミキサー（Vortex
Mixer）（サイエンティフィックインストルメンツ社、
米国）により、最高速度で３０秒間振とうし、そして氷
浴中で１分間冷却する。この振とう操作を、９０％より
多くの細胞が破壊されるまで（光学顕微鏡で調べる）５
〜１０回反復する。ソルバルHB−４ローター中、４℃、
8.０００rpmにて１０分間遠心分離することにより細胞
断片及びガラスビーズを除去する。上澄液をエッペンド
ルフ（Eppendorf）チューブに移し、液体窒素で凍結
し、そして−６０℃で貯蔵する。ヒトCCL-23細胞、及び
攻撃ウイルスとしての小水疱性口内炎ウイルス（VSV）
を用いるアームストロング（Armstorong）の方法に従っ
てインターフェロンの活性を測定する。結果を第１表に
要約する。
例９ 高複製数（high copy number）酵母２μベクター
pJOB207へのインターフェロン遺伝子の挿入（第６図参
照） 供給者（バイオラブス）の説明に従って制限エンドヌク
レアーゼHindIII及びBamHIを使用してプラスミドp30IFN
2′(8′1)を分解する。4.０kb及び2.０kbの大きさの２
種類の断片が生ずる。2.０kb制限断片を分離し、そして
段階４ａに記載したのと同様にして、低融点アガロース
ゲルを用いる電気泳動法により精製する。
プラスミドpJDB207(28)を制限エンドヌクレアーゼHindI
II及びBamHIを用いて分解する。３種類の断片が生ず
る。6.５kbの制限断片を上記のようにして分離する。
0.３μｇの2.０kb断片（インターフェロン蛋白質をコー
ドする領域に連結されたPHO5プロモーターを含有する）
を、全容２０μｌ中、300UT4DNAリガーゼを用いて供給
者（バイオラブス）により記載された条件下で１５時間
にわたり6.５kbベクター断片と連結する。E.コリHB101
細胞を形質転換し、そしてアンピシリン耐性コロニーを
選択する。プラスミドDNAを分離し、そして分離された
プラスミドDNAをHindIII及びBamHIを用いて分解し、そ
して同じ酵素で分解したp30IFN2′(8′1)及びpJDB207を
分子量標準として用いることにより、分離されたプラス
ミドDNAの正しい構造を確認する。この新しく得られた
プラスミドをpJDB207/IFN2′(8′2)と称する。
プラスミドpJDB207/IFN2′(8′1)を、(1)に記載されて
いる方法と同様にしてＳ・セレビシエーRH971株に形質
転換し、ロイシン原栄養性コロニーを選択する。１つの
単一ロイシン原栄養性酵母コロニー〔サッカロミセス・
セレビシエーRH971/pJDB207/IFN2′(8′1)と称する〕を
拾い上げ、そして例７に記載した方法により増殖せしめ
る。結果を第１表に示す。
例１０ヒト−リンパ芽球インターフェロンをコードする
領域を含有する組換プラスミドにより形質転換されたE.
コリ株の調製（第７図） Ａ．HuIFN mRNAが濃縮されたポリ(A)RNAの分離 (a)ナマルワ（Nama1wa）細胞の誘導 ナマルワ細胞を、牛胎児血清１０％を含有する培地RPMI
1640中に３７℃で増殖せしめる。細胞濃度が３×106細
胞／mlに達したとき、懸濁液を、室温にて、８００×ｇ
において１０分間遠心分離する。集めた細胞を、グルタ
ミン（0.０２７容量％）、ペニシリン２００Ｕ／ml）及
びストレプトマイシン（５０μｇ／ml）を含有する培地
200mlに再懸濁する。細胞を、190HAU/106細胞（HAU：ヘ
マグルチネーション単位）の比率のニューカッスル病ウ
イルス（NDV110）と共に、３７℃にて９０分間インキュ
ベートする。新しい培地を加えることにより細胞濃度を
1.3×106細胞／mlに調整し、そして細胞懸濁液を３４℃
にて100rpmで振とうする。１２時間後、６×109の細胞
を得、そして５００mlの燐酸緩衝化塩溶液（「PBS」；１
ｌ中８０ｇのNaCl，２ｇのKCl，１4.４ｇのNa2HPO4及び
２ｇのKH2PO4を含有する）に再懸濁する。細胞を集める
前に試料を採取し、そしてインターフェロン活性を、ヒ
トCCL−２３細胞、及び攻撃ウイルスとしての小水疱性
口内炎ウイルス（VSV）を用いるアームストロング（３
２）の方法に従って測定する。
(b)細胞の破壊及び蛋白質の除去 細胞懸濁液（５０mlのPBS中６×109細胞）を、室温にて
８００mlの分解緩衝液（0.05MTrisHCl(pH7.５）、0.１
ＭNaCl，0.５mMEDTA及び２％SDS（結晶、研究銘柄、セ
ルバ）を含んで成る〕に加える。この分解物を、0.２mg
／mlのプレインキュベート（３７℃にて２時間）したプ
ロテアーゼ（プロテアーゼＰ，タイプVI，シグマ）によ
り、室温にて１時間、液を攪拌しながら分解する。この
溶液をTNEで飽和したフェノール500mlで３回、そしてク
ロロホルム５００mlで５回抽出することにより蛋白質を
除去する。５００mg（２６０nmの吸光により測定）の核
酸を得る。
(c)汚染DNA及びRNAの除去 前記の（段階Ab）ようにして得たわずかに粘稠な水溶液
を0.3ＭNaCl濃度に調整し、そして１ｇのオリゴ（dT）
セルロース（タイプ７，Ｐ−Ｌバイオケミカルス）を加
える。室温にて３０分間攪拌した後、この懸濁液を、ソ
ルバルRC-3遠心分離機を用い、１ソルバルびん中4000
rpmにて１０分間、室温にて遠心分離し、そしてオリゴ
（dT）セルローススラリーを、0.5％のSDSを含有する２
×TNE４０mlで２回洗浄する。次に、2.５mlの水で５回
続けて洗浄することにより結合したポリ(A)RNAを溶出す
る。光学濃度の測定により測定する場合７２０μｇのポ
リ(A)RNAが得られる。第１図の吸着から得られた上澄RN
A溶液につき１ｇのオリゴ（dT）セルロースを用いて２
度目の吸着を行う。上記のようにして溶出することによ
り３２０μｇのポリ(A)RNAを得る。溶出液を一緒にし、
TNEに調整し、そして６７％エタノールを用いて−２０
℃にて１０分間ポリ(A)RNAを沈澱せしめる。ソルベルRC
-5B遠心分離機を用いて０℃にて１０分間１0,０００rpm
で遠心分離することによりRNAを集める。沈澱１mgを１m
lの１mM EDTAに再溶解する。
次のように、キセノプス・レービス（Xenopus laevis）
の卵母細胞に注射することによりHuIFNmRNA活性に関す
るRNAを測定する。
５０μｌのRNA溶液を、２０個の卵母細胞のそれぞれに
注射する。グードン(Gurdon)(33)、バース(Barth)(34)
及びコルマン(Colman)等(35)に従って、卵母細胞をバー
ス(Barth)培地（2mMTris，88mMNaCl，1mMKCl，0.33mM C
a(NO3)2・H2O，0.41mMCaCl2・2H2O，0.82mM MgSO4・7H2O，
2.4mMNaHCO3，0.01mg/mlのペリシリン，0.01mg/mlのス
トレプトマイシン；溶液をHClによりpH7.6に調整）中に
インキュベートする。注射された卵母細胞を４２〜４８
時間インキュベートし、そしてインキュベーション培地
を取り出し、エッペンドルフ遠心分離機で５分間遠心分
離し、そして上澄液を−２０℃又は−８０℃にて、測定
に使用するまで貯蔵する。IFN活性を本質上アームスト
ロング(32)の方法に従って測定する。但し、Hep−２−
細胞（フロウラボラトリーズ）上攻撃ウイルスとしてVS
Vを使用する。卵母細胞抽出物は、注射したRNA当り６０
０IUのインターフェロン比活性を有する。
(d)Hu IFN mRNAについてのポリ(A)RNAの濃縮 ポリ(A)RNAを、0.5mlのベッドボリウムのセファデック
ス−１００のカラム（２００〜４００メッシュ，バイオ
ラド）を通し、カラムを１mlの１mM EDTAで洗浄する。
溶出液（２mlのEDTA中１mgのポリ(A)RNA）を１００℃に
て２分間加熱し、そしてシュークロース濃度勾配〔50mM
Tris・HCl（pH7.5），0.2MNaCl及び1mM EDTAを含有し、
シュークロース濃度が５重量／容量％〜２３重量／容量
％に増加するシュークロース溶液１４ml〕を通して遠心
分離する。遠心操作は、TST41ローター（コントロンA
G）中、５℃にて１６時間、３5,０００rpmにおいて行
う。ISCO勾配コレクターを用いて0.3mlの分画を集め
る。各分画に２容量のエタノールを加え、そして−２０
℃にて１０時間放置する。沈澱したmRNAを遠心分離（ソ
ルバル，HB−４ローター、０℃，１0,０００rpm，１０
分間）により集める。各分画の沈澱を25μｌの1mMEDTA
に再溶解し、そして各分画のヒト−IFN mRNA活性を、上
記の方法（段階Ac）により、但しRNA試料ごとに２０個
ではなく１０個の卵母細胞を使用して測定する。結果を
第２表に示す。
分画２３〜２９を一緒にし、そしてポリ(A)RNAを次のよ
うにして精製する。
ポリ(A)RNA溶液を0.５％SDS中２×TNEに調整し、そして
２００μｌのオリゴ（dT）セルロースカラムに適用す
る。カラムを、0.５％SDS中２×TNE２mlで洗浄し、そし
て0.5mlの水で５回洗浄することによりポリ(A)RNAを溶
出する。溶出液をTNEに調整し、そして溶液を同量のフ
ェノール（TNEで飽和したもの）で２回、及び同量のク
ロロホルムで２回抽出する。ポリ(A)RNAを、２倍容量の
エタノールを用いて−２０℃にて１０時間沈殿せしめ、
そして前記のようにＨＢ−４ローターを用いる遠心分離
により集める。
ポリ(A)RNAを１００μｌの0.5mM EDTAに溶解する。光学
濃度の測定により測定した収量は４０μｇである。
ポリ(A)RNAをヒトIFN活性に関し、前記のようにして、
測定当たり２０個の卵母細胞を用いて測定する。ポリ
(A)RNA標品は、RNAμｇ当たり８１００IUインターフェ
ロンの比活性を有する。
Ｂ．二重鎖cDNAの調製（第７図） エスストラチアジス（Efstratiadis）等（36）により記
載された方法と実質上同様にして、HuIFN mRNA（段階A
d）について濃縮したポリ(A)RNAを鋳型として用いて２
重鎖cDNAを調製する。
(a)40mMTris・HCl(pH7.5)，30mMNaCl，5mM MgCl2，0.5mM
DTT〔カルビオチム（Calbiochem.）〕、1mMdGTP，dCT
P，dTTP（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）、及び1mM P-dATP
（アマーシャム（Amersham），比活性５0,０００cpm/n
モル〕，２０μｇ／mlのオリゴ（dT）12〜18（Ｐ−Ｌバ
イオケミカルス）、４０μｇ／mlポリ(A)RNA及び１００
Ｕのトリー骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素（rev
erse transcriptase）（ライフサイエンス社，ペテルブ
ルグ，フロリダ）を含む反応混合物250μｌを、３７℃
にて８０分間インキュベートする。溶液を10mM ECTA及
び0.１％SDSに調整することにより反応を停止する。混
合物を、１容量のフェノールにより１回抽出する。水相
を１容量のクロロホルムで再抽出し、そして３ｍｌのセ
フアテックスＧ−５０（ファルマシア、純品）カラムに
適用する。0.1mlの分画を集める。各分画の放射能を、
チェレンコフ（Cerenkov）放射線の測定により測定す
る。放射活性分画を一緒にし、そして２倍容量のエタノ
ールを用いて−２０℃にて１０時間核酸を沈殿せしめ
る。試料を、ＨＢ−４ローターにより２０分間、０℃，
１0,０００rpmで遠心分離する。沈殿を９５μｌの水に
溶解する。５μｌの１０ＮNaOHを加え、そして混合物を
２５℃にて４０分間インキュベートする。５Ｍ酢酸によ
り中和した後、５０μｌの水及び２容量のエタノールを
加え、そして試料を−２０℃にて１０時間貯蔵する。沈
殿を、上記のようにして遠心分離により集め、２００μ
ｌの0.1mM EDTAに溶解する。単鎖cDNAの収量は3.7μｇ
である。cDNAの大きさは、7M尿素を含有するTris−ボレ
ート−EDTA（１中１０ｇのTris，9.５ｇのEDTAナトリ
ウム、及び５０ｇの硼酸を含む、pH8.3）中６％ポリア
クリルアミドゲル中での電気泳動における移動度を既知
の長さのマーカーDNA(39)と比較して測定した場合、７
００〜１５００ヌクレオチドの長さである。
(b)第２鎖合成及びＳ1エンドヌクレアーゼ分解 得られたcDNA溶液を１００℃にて９０秒間加熱し、冷却
し、そして0.１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（pH6.9）、10mM
MgCL2，10mM DTT（カルビオケム）、1mM dATP，1mM dCT
P，1mM dTTP（Ｐ−Ｌ，ビオケミカルム）、1mM3H-dGTP
（アマーシャム、比活性９4,０００cpm／ｎモル）及び
１６５Ｕ／mlのE.コリDNAポリメラーゼＩ（バイオラブ
ス，ニューイングランド）を含んで成る反応混合物４０
０μｌ中で、１５℃にて８時間インキュベートする。ED
TA及びSDSを最終濃度がそれぞれ10mM及び0.１％になる
ように加えることにより反応を停止する。反応混合物を
フェノール及びクロロホルムで抽出し、セファデックス
Ｇ−５０（ファルマシア、微細、ベッドボリューム２m
l）によりクロマトグラフ処理し、そして前記（段階B
a）のごとくエタノールで沈殿せしめる。
得られたDNAを、0.２５ＭNaCl，５０mM酢酸ナトリウム
（pH4.５）及び1mM ZnSO4を含有するインキュベーショ
ン混合液５０μｌ中で６ＵのＳ１エンドヌクレアーゼ
（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）により、３７℃にて３０分
間処理する。
0.１％SDS及び１０mM EDTAにより反応を停止する。１容
量のフェノール（５０mM酢酸ナトリウムに飽和、pH4.
５）及びクロロホルムにより反応混合物の脱蛋白質を行
う。水相を、TNE中２mlのセファデックスＧ−５０（フ
ァルマシア、微細）カラムでクロマトグラフ処理する。
１００μｌの分画を集め、そして各分画のチェレンコフ
放射線を測定する。排出された区分を集め、そして前記
のごとく２容量のエタノールを用いて−２０℃にて１０
時間DNAを沈殿せしめる。沈殿物をＨＢ−４ローター
（前記）により遠心分離し、そして集めた沈殿を、１０
mM Tris・HCl（pH7.５）及び0.5mM EDTAを含有する溶液
１００μｌに溶解する。４μｇのDNAを得る。
TST−６０ローター〔コントロン(Kontron)AG〕を用い
て、５０mM Tris-HCl（pH7.５）及び1mMEDTAを含有する
シュークロース密度勾配（５〜２３％）により、DNAを
分画する。遠心分離は、１５℃にて５時間、５5,０００
rpmにおいて行う。平行して行う勾配試験において８０
０塩基対のマーカーDNAより速く沈降するDNAを集め、TN
Eに調整し、そして６７％エタノールにより−２０℃に
て１０時間沈殿せしめる。0.４μｇの二重鎖cDNAを得
る。
Ｃ．pBK322に連結されたcDNAの調製（第７図） (a)dCMP−延長cDNAの調製 １００mMカコジル酸ナトリウム（pH7.２）、2.５mM CoC
l2，５０μｇ／mlのBSA（カルビオケム）、1mM dCTP及
び１０Ｕの末端ヌクレオチドトランスフェラーゼ／μｇ
のdscDNAを含有する反応混合物１０μｌ中で、得られた
dscDNA0.１μｇの３′末端にポリ（dC）尾部を加える。
インキュベーション（２７℃にて２０分間）後１０mMと
なるようにEDTAを加え、そして試料を使用するまで−２
０℃にて貯蔵する。
(b)PstＩで切断され、dGMPで延長されたpBR322の調製 １０μｇのpBR 322プラスミドDNAを、50mMNaCl，6mMTri
s・HCl（pH7.５），6mM MgCl2，6mM２−メルカプトエタ
ノール及び１００μｇ／mlのゼラチンを含有する１００
μｌの溶液中で、１０ＵのPstＩエンドヌクレアーゼ
（バイオラブス）を用いて、３７℃にて１時間分解す
る。溶液を１容量のフェノール及びクロロホルムで抽出
する。溶液をTNEに調整し、そして線状になったDNAを、
２容量のエタノールにより−２０℃にて５時間沈殿せし
める。
線状にされたプラスミドDNAを、１００mMカコジル酸ナ
トリウム（pH7.５）、5mM MgCL2，20mM NaH2PO4，５０
μｇ／mlのＢＳＡ，1m MdGTP及び１００Ｕの末端デオキ
シヌクレオチドトランスフェラーゼ（terminal deoxynu
cleotidyl trdnsferase）（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）
を含有する反応液２００μｌ中で、dGMPにより延長す
る。３７℃にて２０分間インキュベートした後、EDTAを
１０mM濃度に加え、そして反応混合物を使用するまで−
２０℃に凍結する。
(c)dGMP延長pBR322のdCMP延長dccDNAへのアニーリング ５００μｌのTNE緩衝液中dCMP延長二重鎖cDNA（0.１μ
ｇ）及びdGMP尾部付加線状pBR322（0.５μｇ）の混合物
を、６５℃にて１時間、４６℃にて１時間、３７℃にて
１時間及び２０℃にて１時間インキュベートする。pBR3
22連結cDNAを含有する溶液を氷上におき、そしてただち
に形質転換に使用する。
(d)アニールされた雑種プラスミドによるE.コリ１０１
の形質転換 マンデル（Mandel）等（29）の方法により形質転換のた
めにカルシウム処理されたE.コリＨＢ１０１を調製す
る。
上記（段階Cc）のようにして調製したアニールされたpB
R322雑種プラスミドDNAを含有する反応混合物１０μｌ
を、１０mM MgCl2，１０mM CaCl2及び１０mM Tris・HCl
（pH7.５）中カルシウム処理E.コリＨＢ１０１を含有す
る混合物に加えることにより、全量を２００μｌとす
る。
混合物を氷中で２０分間冷却し、４２℃に１分間加熱
し、そして２０℃にて１０分間インキュベートする。１
mlのトリプトン培地〔１の蒸留水中に１０ｇのバクト
−トリプトン（ディフコ）、１ｇの酵母エキストラクト
（ディフコ）、１ｇのグルコース、８ｇのNaCl及び２９
４mgのCaCl2・2H2Oを含む〕を加え、そして混合物を、３
７℃にて３０分間３００rpmにて振とうすることにより
インキュベートする。混合物を、１０μｇ／mlのテトラ
サイクリン（シグマ）を補給した２つの寒天プレート
〔マッコンキー（Mc Conkey）寒天、ディフコ、プレー
ト当り0.６ml〕接種する。プレートを３７℃にて１２〜
１７時間インキュベートする。形質転換されたE.コリＨ
Ｂ１０１のテトラサイクリン耐性コロニー約５６００個
を得る。
Ｅ．HuIFN cDNAを含有するコロニーの同定 (a)１３連オリゴヌクレオチドプライマーの合成（第８
図） HuIFn−α及びHuIFN−βmRNAの両者に共通に存在する１
３ヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを、ホス
ホトリエステル法〔イタクラ等（40）、ドゥロイ（de R
ooij）等（41）〕により化学的に合成する。
個々の合成段階を第８図に要約する。第８図の１行目に
示す出発物質（保護基を有するモノデオキシヌクレオチ
ド及びジデオキシヌクレオチド）は文献から知られてい
る。保護基はイタクラ等により記載された方法により除
去する。すなわち、５′−モノメトキシトリチル(M)又
はジメトキシトリチル(D)で置換されたヒドロキシル基
の脱保護は室温にて酢酸（８０％）により行う、そして
β−シアノエチルホスフェート基は、ジオキサン−水
（４：１）中０．１Ｎ水酸化ナトリウムにより室温にお
いて脱離する。構成部分の縮合は、活性化剤としてトリ
イソプロピルベンゼンスルホニルクロリドを使用して行
い、第８図の７行目に示す十分に保護された１３連プラ
イマーまでのオリゴデオキシヌクレオチドを得る。最終
段階（すべての保護基の完全な除去）は次のようにして
行う。
３mlのジオキサン及び１mlのアセトニトリル中に十分に
保護された１３連オリゴデオキシヌクレオチド６4.６mg
を含有する溶液を、２００mgのsyn-p-ニトロベンズアル
ドキシム及び１２４mgのＮ1，Ｎ1，Ｎ3，Ｎ3−テトラメ
チルグアニジンで処理し、そして２７時間置く。１０ml
のアンモニア（２５％）を加え、溶液を５０℃にて２４
時間貯蔵する。溶剤を真空蒸発せしめた後、残渣を水に
溶解し、酢酸によりpHを４に調製し、そして溶液をクロ
ロホルムにより２０回抽出する。水溶液を蒸発乾燥せし
め、そして残渣を１mlの酢酸（80%）に溶解する。溶液
を１時間放置し、６mlの水で希釈し、クロロホルムで３
回抽出し、そして凍結乾燥する。得られた粗生成物の３
分の１を、DEAE−セファデックスＡ２５（カラムの大き
さ１０×1.３cm）上0.１〜1.２Ｍトリエチルアンモニウ
ムビカルボネート勾配２００mlを用いるクロマトグラフ
ィーにより精製する。勾配濃度中0.８７Ｍにおいて主分
画が溶出する。HPLC試験における純生成物を含有する主
分画を水と共に３回蒸発せしめ、１０mlのダウエックス
５０Ｗ（NH4塩）を通して過し、して凍結乾燥する。H
PLC〔パーマファーゼ（permaphase)AAX、カラム大９０
×0.３cm、６０℃、２ml／分；勾配：Ａ＝0.005MKH2P
O4，Ｂ＝0.5KH2PO4，0.5M KCl，pH4.5；３０分間に２０
％Ａ→１００％Ｂとする〕：tR１1.８分。
(b)32Ｐ−ラベルされたヒトIFN−α及びIFN−β特異的c
DNAプローブの調製（第９図） ４０ｐモルの合成１３連オリゴデオキシヌクレオチドプ
ライマー（段階Ea）及び４０ｐモルの〔γ−32Ｐ〕−AT
P（５７００Ci・mmol-1，アマーシャム）を、５０mM Tr
is・HCl（pH9.５），10mM MgCl2及び５mM DTTを含有する
溶液１００μｌ中で一緒にする。５０ＵのＴ4ポリヌク
レオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）を加え、
そして３７℃にて３０分間置いた後追加の酵素２０Ｕを
加え、そして３７℃にて１５分間さらにインキュベート
を続ける。32Ｐ−ラベルされたプライマーを含有する溶
液をフェノール抽出により精製する。１mM Tris・HCl（p
H8.０）中４mlのセファデックスＧ−５０（ファルマシ
ア、微細）カラムによるクロマトグラフィーによりさら
に精製する。0.１mlの分画を集める。各分画の放射能
を、チェレンコフ放射線を測定することにより測定す
る。オリゴデオキシヌクレオチドｐモル当り４×１０6
チェレンコフcpmの比活性が得られる。32Ｐ−ラベルプ
ライマー（４０ｐモル）を凍結乾燥し、１４μｇのポリ
(A)RNA（ナマルワ細胞から誘導され、段階Ａに記載した
方法により調製したもの）を含有する水９１μｌに再懸
濁し、そして100℃にて６０秒間加熱する。９μｌの４M
KClを加え、そして混合物を２５℃にて６０分間インキ
ュベートする。４５０μｌの逆転写酵母混合物を加え、
反応混合物が４０mM Tris・HCl（pH８）、４mM MgCl2，
１mM DTT（カルビオケム社）、７４mM KCl、１mMずつの
dATP，dGTP，dCTP，dTTP（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）及
び９０Ｕのトリー骨髄芽球症ウイルス(AMV)逆転写酵素
を含有するようにする。３７℃にて１時間インキュベー
ションを続ける。溶液を１容量のフェノール（TNEに飽
和）により抽出し、そして核酸を２容量のエタノールに
より−２０℃にて１０時間沈殿せしめる。沈殿物を遠心
分離（ＨＢ−４ローター、２０分間、10,000rpm、０
℃）により集め、そして９０（v/v）％のホルムアミド
（メルク、分析用）、１mM EDTA、0.０５％ブロムフエ
ノールブルー及び0.０５％のキシレンシアノールブルー
を含有する色素混液２０μｌに溶解する。試料を９０℃
にて２分間加熱し、そしてTris−ボレート−EDTA〔ピー
コック（Deacock）等（39）〕中５％ポリアクリルアミ
ドゲルに適用する。プラスミドpBR322のHeaIIIによる分
解により得られた２６７bp及び４３５bpの32Ｐ−ラベル
マーカーDNA断片の間を泳動する単一のバンドがオート
ラジオグラム上に見られる。32Ｐ−ラベルcDNA断片を、
ミュラー(Mueller)等の方法（42）によりゲルから抽出
し、そして精製する。２0,０００チェレンコフcpmの32
Ｐ−ラベルヒト−IFN−α及びIFN−β特異性cDNAプロー
ブが得られる。
(c)Hu IFN cDNAを含有するコロニーの選択（第９図） 前記の方法（段階Ｄ）により得られた１６５０個の形質
転換されたコロニーを、ニトロセロース紙ＢＡ８５
〔シュライケル＆シュエル(Schleicher & schuell)、直
径８cm〕に移す。細胞を分解し、そのDNAを変性し、そ
してグルンスタイン(Grunstein)及びホグネス(Hogness)
の方法（20）に従ってその場で紙に固定する。コロニ
ーを担持した紙を、４×SET〔0.１５M NaCl、３０mM
Tris・HCl（pH8.０）、１mM EDTA、0.１(w/v)％のフィコ
ール(Ficoll)４００（ファルマシア）、0.１(w/v)％の
ポリビニルピロリドン（PVP−３６０，シグマ）、0.１
(v/v)％のBSA，0.５％のSDS，５０μｇ／mlの変性子牛
胸腺DNA（製法：５mgの子牛胸腺DNA（タイプＩ、シグ
マ）を0.５N NaOH中で１０分間煮沸することによりDNA
を分離し、５Ｍ酢酸により中和し、そして２容量のエタ
ノールにより２０℃にて沈殿せしめ、この沈殿をＨＢ−
４ローターを用いて０℃にて１０分間遠心分離し、そし
て５００μｌの0.５M EDTAに再溶解する）を含有する溶
液〕中で、紙当たり２０mlを用いて、６５℃で４時間
予備ハイブリッド形成し、そして、５×SET〔0.０２(w/
v)％のフィコール、0.０１％のポリビニルピロリドン、
0.０２(v/v)％のBSA、0.２％のSDS及び５０μｇ／mlの
変性子牛胸腺DNA〕中ニトロセルロース紙当たり103チ
ェレンコフcpmの32Ｐ−ラベルプローブを用いてハイブ
リッド形成を行う。このハイブリッド形成は６５℃にて
３６時間行う。
紙を、クロロホルム中で１回、SEP、0.５％SDS中で２
回室温においてすすぎ、そしてSET、0.５％SDS中で２回
６０℃にて１時間すすぎ、そして３mMトリズマ(Trizma)
塩基により１回室温にて１時間すすぐ。この紙を、３
MM−紙（ワットマン）上で吸取ることにより乾燥し、そ
してスクリーン〔イルホルド(Ilfovd)強化スクリーン〕
を用いてＸ線フィルム（フジ）を前記の紙に露光す
る。
オートラジオグラム上で９個の陽性コロニーを同定し、
そしてその後の実験に使用する。
形質転換された細胞の一次コロニーは場合によっては１
種類より多くのDNA分子を含有するので、ハイブリッド
形成陽性の９個のコロニーから雑種プラスミドDNAを分
離し、そして前記のごとくE.コリＨＢ１０１を形質転換
するのに使用する。
雑種プラスミドDNAを次のようにして分離する。２５ml
のエルレンマイヤーフラスコ中、１０μｇ／mlのテトラ
サイクリンを補給したトリプトン培地１０mlに１コロニ
ーを接種する。培養物を３７℃，３００rpmにて１５〜
１８時間振とうする。遠心分離（ソルバル、ＨＳ−４ロ
ーター、4,０００rpmにて１０分間、４℃）により集菌
する。約0.１ｇの細胞を得、１mlの５０mM Tris・HCl（p
H8.０）に再懸濁する。0.２５mlのリゾチーム溶液〔50m
M Tris・HCl（pH8.０）中１０mg／ml、リゾチームはシグ
マ製〕を加え、そして０℃にて１０分間インキュベート
した後０．１５mlの0.５ＭEDTA（pH7.５）を加える。０
℃にてさらに１０分間置いた後、６０μｌの２％トリト
ンＸ−１００（メルク）を加える。０℃にて３０分置い
た後、試料を、ソルバルＳＡ−６００ローターを用いて
１5,０００rpm、４℃にて３０分間遠心分離する。１容
量のフェノール（TNE飽和）を用いて上澄液の除蛋白質
を行う。5,０００rpm，４℃にて１０分間遠心分離（ソ
ルバルＨＢ−４ローター）することにより相分離を行
う。上相を１容量のクロロホルムで２回抽出する。膵臓
RNAアーゼＡ（シグマ、TNE中１０mg／ml、８５℃にて１
０分間前加熱）を加え最終濃度を２５μｇ／mlとし、そ
して混合物を３７℃にて４０分間インキュベートする。
次に、溶液を１ＭNaCl及び１０％ポリエチレングリコー
ル６０００〔フルカ(Fluka)、１２０℃にて２０分間オ
ートクレーブしたもの〕に調整し、そして−１０℃にて
２時間インキュベートする。ソルバルＨＢ−４ローター
（１0,０００rpm、０℃にて２０分間）により沈澱を集
め、そして１００μｌのTNEに溶解する。DNA溶液を１容
量のフェノールで抽出し、そして２容量のエタノールを
用いて−８０℃にて１０分間DNAを沈澱せしめる。エッ
ペンドルフ遠心分離機中で遠心分離することにより沈澱
を集め、そして２０μｌの１０mM Tris・HCl（pH7.５）
及び0.５mM EDTA含有溶液中にDNAを再溶解する。１０ml
の培養物から８〜１０μｇの雑種プラスミドDNAを得
る。
９種類の分離された雑種DNAのそれぞれによりE.コリＨ
Ｂ１０１を形質転換し、そして前記（段階Ｄ）のごと
く、形質転換された細胞をテトラサイクリンを含有する
寒天プレート上に接種する。各形質転換体から３個のテ
トラサイクリン耐性コロニーを拾い上げ、１０mlの培養
物を調製し、そして前記の方法により雑種DNAを分離す
る。
再形質転換の前後におけるすべてのDNA試料を、PstIエ
ンドヌクレアーゼによる切断、及び５０mM Tris−アセ
テート（pH7.８）及び１mM EDTA中１％アガロースゲル
による電気泳動により分析する。すべての試料は再形質
転換の前後において同じ切断パターンを示す。
再クローニングした組換DNA分子の１つから２つのバン
ドが生じ、１つはPst−切断pBR322の移動度を有し、他
方は約１０００bpに対応する移動度を有する。これをCG
-pBR322／HLycIFN−１′ｂと称する。
他の１つの組換DNAから３つのバンドが生じ、１つはPst
I−切断pBR322の移動度を有し、他の１つは６００bpの
移動度を有し、そして他の１つは約１５０bpの移動度を
有する。このクローン中の組換DNA分子をCG-pBR322/HLy
cIFN-β１と称する。
(d)クローンCG-pBR322/HLycIFN-1′ｂ、及びCG-pBR322/
HLycIFN-β1の特徴付け クローンCG-pBR322/HLycIFN-1′ｂ、及びCG-pBR322/HLy
cIFN-β1の組換プラスミドDNAを前記の方法（段階Ec）
により培養物から分離し、そしてマクサム（Maxam）及
びジルバート（Gilbert）により記載された方法（15）
を用いてcDNAのヌクレオチド配列を決定することにより
特徴付ける。基本的には次の方法を用いる。
分離された組換プラスミドDNAを種々の制限エンドヌク
レオチドにより分解する。酵素は本質上供給者（ニュー
イングランド、バイオラブス）により記載された方法に
より用いる。但し、酵素緩衝液中のBSAの代りにゼラチ
ンを用いる。制限分解されたDNAを含有する溶液をフェ
ノール（TNEで飽和）を用いて脱蛋白質する。DNAをエタ
ノールにより沈澱せしめ、５０μｇ／mlのDNA濃度にお
いて５０mM Tris-HCl（pH8.０）に再溶解し、そしてDNA
５′末端ｐモル当り0.１Ｕの子牛腸アルカリホスファタ
ーゼ（ベーリンガー）と共に３７℃にて３０分間インキ
ュベートする。溶液を６０℃にて６０分間加熱すること
により酵素を不活性化する。ミュラー等の記載（42）に
従ってDEAE−セルロースクロマトグラフィーによりDNA
を精製し、そしてエタノールで沈澱せしめる。DNAの
５′末端を〔γ−32Ｐ〕−ATP（＞５０００Ci／ミリモ
ル、アマーシャム）及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ
（Ｐ−Ｌバイオケミカルス）を用いてラベルする。この
方法は本質上マクサム及びジルバートの記載（15）に従
って行うが、但し、キナーゼ反応の前にDNAの変性を行
わない。一般に、比活性は１〜３×１０6cpm／ｐモル
５′末端である。
ラベルされたDNA断片を第２の制限エンドヌクレアーゼ
によって切断し、そしてTris−ボレート−EDTA緩衝液中
６％、８％又は１０％ポリアクリルアミドゲルを用いる
電気泳動により生成物を分離する。DNA断片をゲルから
抽出し、そしてミュラー等の方法（42）に従って精製す
る。ヌクレオチド配列の決定のため、DNA断片を科学的
に分解し、そして生成物を、マクソン及びジルバートの
方法（15）に従ってポタアクリルアミドゲル電気泳動に
より分離する。
特に、クローンCG−pBR322／HLycIFN-1′ｂの分離され
たプラスミドDNAは次のように処理する。一方におい
て、５μｇのプラスミドDNAをBglIIにより分解し、５′
末端をラベルし、そしてPvuIIにより切断する。PvuII-B
glII＊DNA断片（＊はラベルの位置を示す）及びBglII-P
vuII*DNA断片を６％ポリアクリルアミドゲル上で分離す
る。他方において、５μｇのプラスミドをAluIにより分
解し、５′末端をラベルし、そしてPstIにより切断す
る。PstI-AluI*DNA断片を８％ポリアクリルアミドゲル
上で分離する。次に、各断片をマクサム及びジルバート
の方法に従って分解し、そして配列する。得られたヌク
レオチド配列を第１０図に示す。約２５〜３５のデオキ
シグアノシン残基の区間がcDNA挿入部の５′末端に先行
する。示されたヌクレオチド配列はゲデル（Goeddel)等
〔（43）、及びワイズマン(Weissmann)（44）を参照の
こと〕により記載されたIFN−α（タイプＦ）cDNAのそ
れと幾分類似するが、多くの明らかな相違（点変異）が
存在し、これらの幾つかは生成するアミノ酸に影響を与
える。
クローンCR-pBR322／HLycIFN-β1の分離されたプラスミ
ドDNAを同様に処理する。５μｇのプラスミドをPvuIIで
分解し、そして５′末端ラベルする。混合物の半分をPs
tIにより切断し、そして他方をBglIIで切断する。PstI-
PvuII*断片及びBglII-PvuII*断片を、上記の方法と同様
にして６％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によ
り分離し、そして分解する。ヌクレオチド配列（Ｎ−末
端配列）を第１１図に示す。この結果は、タニグチ等
（45）により記載されているように、cDNA挿入部がIFN
−β１cDNAのNo.１０２ヌクレオチドから出発している
ことを示している。従って、cDNA挿入部はＮ−末端にお
いて１１個のアミノ酸が欠落したヒトIEN−β１をコー
ドする能力を有する。cDNA挿入部の５′末端には約２０
〜２５のデオキシグアノシン残基の区間が配置されてお
り、１５３位に点変異が存在し、ここではＣがＴに変わ
っているが生ずるアミノ配には影響しない。
(e)CG-pBR322／HLycIFN−１′ｂ及びCG-pBR322／HLycIF
N−β１の挿入部に交差ハイブリド形成する組換DNA分子
を含有するクローンの同定 クローンCG-pBR322／HLycIFN−１′ｂ及びCG-pBR322／H
LycIFN−β１の組換プラスミドDNAを、前記（段階Ec）
のようにして培養物から分離する。CG-pBR322／HLycIFN
−１′ｂプラスミドDNA（５μｇ）をBglIIにより分解
し、５′末端をラベルし、PvuIIにより切断する。他
方、分離されたCG-pBR322／HLycIFN−β１プラスミドDN
A（５μｇ）をPvuIIにより分解し、５′末端をラベル
し、そしてBglIIにより切断する。PvuII-BgII*（３５１
bp）DNA断片（プローブＡ）及びPvuII＊−BgiII（３６
８bp）DNA断片（プローブＢ）を、上記（段階Ed）のよ
うにして８％ポリアクリルアミドゲルから分離し、そし
てその場でコロニーハイブリッド形成するのに使用する
（下記）。プラスミドDNAの制限、ラベル及び精製は、
前記（段階Ed）の場合と同様にして行う。
上記（段階Ｄ）のようにして得られた４０００の形質転
換体コロニーをニトロセルロース紙ＢＡ８５（シュラ
イケル＆シュエル、直径８cm）に移す。細胞を分解し、
そしてそれらのDNAを、グルンスタイン及びホグネス（2
0）の方法に従ってその場で変性し、そして紙に固定
する。プローブＡ及びＢ（両プローブは混合されてい
る）へのハイブリド形成は、上記（段階Ec）のようにし
て行う。６個の陽性コロニーをオートラジオグラフィー
により同定し、その内の３つを次の様に称する。
E.coliHB101CG-pBR322／HLycIFN-41、E.coliHB101CG-pB
R322／HLycIFN-51、及びE.coliHB101CG-pBR322／HLycIF
N-8′1。
これらをこの後の実験に使用する。上記（段階Ed）のよ
うにして、これらのクローンのプラスミドDNAを分解
し、再形質転換し、そして再分離する。
組換DNAの挿入部の性質を確定するために、cDNA挿入部
（部分的又は全体的）のヌクレオチド配列を上記（段階
Ed）の一般的方法を用いて確定する。
特に、５μｇの分離されたプラスミドDNACG-pBR322／HL
ycIFN-41及びCG-pBR322／HLycIFN-8′１のそれぞれをPv
uIIにより分解し、５′末端をラベルし、そしてPstIに
より切断する。DNA断片を、８％ポリアクリルアミドゲ
ル上で分画し、そして８′1DNAからのPstI-PvuII*（〜
１２０bp）、及び４1DNAからのPstI-PvuII*（８２bp）
を通常の方法で分離する。
分離されたプラスミドDNACG-pBR322／HLycIFN-51を次の
ように処理する。一方において、５μｇのプラスミドDN
AをHaeIIにより分解し、５′末端をラベルし、そしてPs
tIにより切断する。PstI-HaeII*（５７bp）DNA断片を１
０％ポリアクリルアミドゲル上で分離する。他方におい
て、５μｇのプラスミドをEcoRIにより分解し、５′末
端をラベルし、そしてPstIにより切断する。PstI-EcoRI
*（２３５bp）及びEcoRI*-PstI（〜７００bp）DNA断片
を、８％ポリアクリルアミドゲル上で分離する。種々の
DNA断片の配列を、マクサム及びジルバートの方法（1
5）により決定する。
cDNA挿入部のヌクレオチド配列を第１２〜１４図に示
す。第１２図にはCG-pBR322／HLycIFN-41のcDNA挿入部
の部分的ヌクレオチド配列が示されている。挿入部の
５′末端には２３のデオキシグアノシン残基の区間が配
置されており、そしてストレイリ（Streuli）等（46）
より記載されたIFN-α2(Le)cDNAの一部を含んでいる。
３′−シストロン外領域（extra-cistronic region）に
は若干の小変化（点変異）及び追加の３１８ヌクレオチ
ド区間が存在する。CG-pBR322／HLycIFN-8′1のcDNA挿
入部のヌクレオチド配列を第１３図に示す。挿入部の
５′末端には２０〜２３デオキシグアノシン残基の区間
が配置されており、そしてゴーデル（Goeddel）等（4
3）、マンテニ（Mantei）等（27）により記載されてい
るNFN−α（タイプＤ）cDNAに類似しているが同一では
ない。IFNをコードする配列の前後のcDNA領域における
相違とは別に、NFN遺伝子は２８〜３０位にGCCトリプレ
ットを、そして４０９〜４１１位にGCGトリプレット
（いずれもアラニンをコードする）を含み、GTC及びGTG
（バリンをコードする）ではない。最後に、CG-pBR322
／HLycIFN-51（第１４図）のcDNA挿入部のヌクレオチド
配列には、５′末端に１７デオキシグアノシン残基の区
間が存在する。ヌクレオ配列は、ゴーデル等（43）によ
り記載されたIFN−α（タイプＢ）cDNAのそれと関連す
る。しかしながら、HLycIFN-51のcDNA挿入部の５′に追
加のヌクレオチドが存在し、シストロン外領域及びIFN
コード領域に点変異、欠落及び挿入が存在し、特に２２
位及び３６１〜３７２において明らかである。
Ｆ．ヒト−IFN特異的組換DNA分子を含有するE.コリによ
るヒト−インターフェロンの合成 ヒト−IFN特異的組換DNA分子を含有することが示された
５個のクローン、すなわち、 E.コリHB101CG-pBR322／HLycIFN-1′ｂ，E.コリHB101CG
-pBR322／HLycIFN-41，E.コリHB101CG-pBR322／HLycIFN
-51，E.コリHB101CG-pBR322／HLycIFN-8′1及びE.コリH
B101CG-pBR322／HLycIFN-β１につき、それぞれ次のよ
うにしてIFN活性を試験した。
対応するE.コリのクローン（３０ml懸濁液）を、トリプ
トン培地において、光学濃度（OD650）が約１になるま
で増殖せしめる。細胞を集め、そして0.５mlの水溶液
〔30mMNaCl及び50mMTris・HCl（pH8.０）を含有〕に再懸
濁する。リゾチーム（シグマ）を１mg／mlとなるように
加える。０℃にて３０分間置いた後、懸濁液を凍結（液
体窒素）し、そして５分間解凍（３７℃）し、そしてSS
３４ソルバルローターを用いて、２0,０００rpm、４℃に
て２０分間遠心分離する。上澄液のIFN活性を、段階Ac
において記載したアームストロングの方法（３２）に従
って、細胞病理的（cytho pathic）生物測定法を用いて
測定する。その結果次の活性が認められる。
おそらく、測定し得るIFN活性を示さらいクローンは、H
oLy IFN-cDNA挿入部が転写の方向に関して不適当な方向
を有する組換DNAを含有しているであろう。従って、十
分な長さのcDNA挿入部を含有するこのようなクローンの
１つ（CG-pBR322／HLycIFN-1′ｈ）の組換DNAを次のよ
うにして再配向する。
クローンE.コリＨＢ１０１ＣＧ−ｐＢＰ３２２／HLycIF
N-1′ｂのプラスミドDNAを前記（段階Ec）のようにして
分離し、そしてPatIにより切断する。20mMTris・HCl（pH
7.８）、10mMMgCl2、10mMDTT、25mMNaCl及び50μｇ／ml
のゼラチンを含有する緩衝液２０μｌ中0.５μｇの切断
DNAを、0.２ＵのT4DNAリガーゼ（バイオラブス）及び0.
５mMATPにより、１５℃にて２時間処理する。上記（段
階Ｄ）のようにしてcDNA混合物によりE.コリHB101を形
質転換する。形質転換されたコロニーを、テトラサイク
リンを補給したマッコンキー（Mc Conkey）寒天プレー
ト上で選択し、そしてニトロセルロース紙上にレプリ
カする。組換DNACG-pBR322／HLycIFN-1′ｂ（段階Ee参
照）の32Ｐ−ラベルされたPvuII−BglII*断片（３５１b
p）とハイプリド形成する４つの細菌コロニーを、E.コ
リHB101CG-pBR322／HLycIFN-1′ｂ1〜１′ｂ4と称す
る。４種類のクローンの抽出物を調製し、そして前記の
ようにしてIFN活性を測定する。次の活性が得られる。
従って、プラスミドCG-pBR322／HLycIFN-1′ｂ4はIFN活
性を有するポリペプチドの合成を指令することができる
cDNA挿入部を含有する。
Ｇ．IFN活性を有するポリペプチドを高レベルで生産し
得る組換DNAの形成 (1)CG-pBR(AP)/LyIFN−α−１組換プラスミドの形成 クローンE.コリHB101CG-pBR322／HLycIFN-1′ｂのIFN特
異的蛋白質収量を改良するため、第１５図に概略を示し
た方法により次のような方法を行う。
(a)cDNA挿入部の調製 クローンE.コリHB101CG-pBR322／HLycIFN-1′ｂの組換
プラスミドDMA （150μｇ）を、標準法（段階Ed）を用
いてPstI（バイオラブス）により切断する。フェノール
抽出及びエタノール沈澱の後、50mMTris-HCl（pH8.０）
及び1mMEDTA中シュークロース密度勾配遠心分離（５〜
２３％）により切取られた挿入部を分離する。遠心分離
は、TST41ローター（コントロンAG）中、１５℃にて１
６時間行う。ISCO勾配コレクターを用いて0.３mlずつの
分画を１ml／分の速度で集める。小断片（すなわち挿入
部）を含有する分画を一緒にする。常法に従ってDNAを
エタノールにより沈澱せしめ、HB-4ローター（ソルバ
ル）を用いて１0,０００rpm、０℃にて１０分間遠心分離
することにより沈澱を集める。沈澱を６０μｌの10mMTr
is・HCl（pH7.５）及び0.０５mMEDTA含有溶液中に溶解す
る。光学濃度の測定による場合３０μｇのDNAを回収す
る。
挿入DNA（１０μｇ）をHaeIII（バイオラブス）により
分解し、そして断片を、50mMTris、50mM硼酸、1mMEDTA
及び0.5μｇ／mlのエチジウムブロミドを含有する溶液
中２％アガローズゲル上で分画する。最も大きなDNA断
片、すなわちHaeIII-PstI（８６９bp）及びHaeIII-HaeI
II（８２bp）（第１５図、それぞれ断片３及び４を参
照）をそれぞれゲルから切取り、小さい針の注射器を通
して、0.１５MNaCl、50mMTris・HCl（pH8.０）、1mMEDTA
を含有する溶液５ml中に注入し、そして一夜振とうす
る。溶出液を１００μｌのＤＥ−５２（ワットマン）パ
スツールーピペットカラムを通すことによりDNAを吸着
せしめる。カラムを２mlの同じ緩衝液で洗浄し、そして
1.５MNaCl、50mMTris（pH8.０）及びmMEDTAを含有する
溶液４００μｌでDNAを溶出する。２容量のエタノール
により−２０℃にて一夜DNAを沈澱せしめる。エッペン
ドルフ遠心分離機により遠心分離することにより沈澱を
集める。HaeIII-HaeIIIDNA断片（８２bp）を再溶解し、
そしてSau3A（バイオラブス）により分解する。６５℃
にて３０分加熱することにより酵素を不活性化する。１
μｇのHaeIII-PatIDNA断片（８６９bp）を加え、溶液を
10mMMgCl2、10mMDTT及び0.５mMATPに調製し、そしてT4D
NAリガーゼ（バイオラブス）を３０Ｕ／μｌとなるよう
に反応混合物に加える。溶液を１５℃にて１０時間イン
キュベートする。フェノール及びクロロホルムにより抽
出した後、溶合物を、エチジウムブロミドの存在下で、
Tris−ボレート−EDTA中２％アガロースゲルにより分画
する。前記のようにしてSau3A-PatIDNA断片（第１５
図、断片５を参照）を抽出し、エタノールにより沈澱せ
しめ、そして10mMTris・HCl（pH7.５）及び0.０５mMEDTA
を含有する溶液１０μｌに再溶解する。
(b)pBR322のβ−ラクタマーゼ制御領域（ApPr）を含有
するDNA断片の調製 プラスミドpBR322をPstIにより切断し（段階Cbを参
照）、そして３０℃において４〜１０分間、４Ｕ／mlの
エキソヌクレアーゼBal31〔ベセスダ リザーチ ラブ
（Bethesda Research Lab.〕により処理することにより
β−ラクタマーゼコード部分を除去する。
式、 ５′-ATGTGTGATCACACAT-3′ で示される化学的DNAリンカーを、前記（段階Ea）の方
法を用いて合成する。常法により、リンカーをBal31で
処理したpBR322DNAに加える。これにより生成した雑種
分子を制限エンドヌクレアーゼBclI（バイオラブス）及
びEcoRIにより切断する。反応生成物を、前記（段階B
a）のようにしてTris−ボレート−EDTA中８％ポリアク
リルアミドゲルにより分画する。１８４bp及び２３４bp
マーカーDNAの間を泳動するDNA断片（ApPrDNA断片）を
上記（段階Ia）のようにして分離し、そして常法に従っ
てエタノールにより沈澱せしめる。沈澱を10mMTris・HCl
（pH7.５）及び0.０５mMEDTAを含有する溶液に溶解す
る。
(c)ApPrDNA断片のcDNA挿入部への連結 ApPrDNA断片を含有する溶液及びcDNA挿入部を含有する
溶液を一緒にする。混合物を10mMMgCl2、10mMDTT及び0.
５mMATPに調整し、そして１５℃にて１２時間、３０Ｕ
／μｌのT4DNAリガーゼ（バイオラブス）と共にインキ
ュベートする。フェノール及びクロロホルムにより抽出
した後、混合物を１％低融点アガロースゲル（バイオラ
ド）により分画する。得られたApPar-cDNA断片を、次の
ようにして、PstI（バイオラブス）及びEcoRI（バイオ
ラブス）の両者により切断したpBR322の大断片に連結す
る。ApPr-cDNA断片を含有するゲル片をpBR322のPstI-Ec
oRI断片を混合し、６５℃にて２分間溶融せしめ、３７
℃に冷却し、0.５mMATP、10mMDTT及び10mMMgCl2に調整
し、そして３０Ｕ／μｌのT4DNAリガーゼ（バイオラブ
ス）と共に１５℃にて１２時間インキュベートする。１
０分の１容量の100mMTris・HCl（pH7.５）、100mgCaCl2
及び100mMMgCl2を含有する溶液を加え、溶液を６５℃に
て１０分間加熱することによりリガーゼを不活性化し、
そして３７℃に冷却する。次に、上記（段階Ｄ）のよう
にして、溶液を加えてCa 処理したE.コリHB101を形質
転換し、そして１０μｇ／mlのテトラサイクリンを補給
したマッコンキー寒天プレートに接種する。形質転換し
たコロニーをIFN活性に関して選択する。（段階Ｆ参
照）。最高レベルのIFN活性を供するクローンを選択
し、これをE.コリHB101CG-pBR(AP)/LyIFN-α−１と称す
る。４0,０００（IU／ml）の活性が見出され、もとのク
ローンであるE.コリHB101CG-pBR322／HLycIFN-1′ｂに
比べて１３００倍強化されている。
クローンCG-pBR(AP)/LyIFN−α−１の組換プラスミドDN
Aを、前記（段階3c）と同様にして培養物から分離し、
そしてcDNA挿入部（IFN遺伝子）及びβ−ラクタマーゼ
制御領域のヌクレオチド配列を確定することにより特徴
付ける。結果を第１６図に要約する。
(III)組換プラスミドCG-pBR(AP)/LyIFN-α−３の形成 E.コリHB101CG-pBR322/HLycIFN-8′1のIFN特異的蛋白質
の収量を次のようにして改良する（第１７図参照）。
(a)β−ラクタマーゼ制御領域を含有するDNA断片のCG-p
BR(AP)/LyIFN-α−１からの調製 CG-pBR(AP)/LyIFN-α−１DNA（１００μｇ）をHindIII
（バイオラブス）及びBalII（バイオラブス）により切
断する。フェノール抽出及びエタノール沈澱の後、50mM
Tris・HCl（pH8.０）及び1mMEDTA中シュークロース密度
勾配遠心分離（５〜２３％）により切り取ったDNA断片
を分離する。遠心分離はTST６０ローター（コントロンA
G）を用い、１５℃、５8,０００rpmにおいて４時間行
う。0.２mlの分画を上記のようにして集める。小断片
（HindIII-BglII）を含有する分画を一緒にし、そして
常法に従ってDNAをエタノールにより沈澱せしめる。沈
澱を、10mMTris・HCl（pH7.５）及び0.０５mMEDTAを含有
する液80μｌに溶解する。光学濃度の測定により測定し
た場合１６μｇのDNAが回収される。
DNA断片（HindIII-BglII）（４μｇ）をSau３Ａ（バイ
オラブス）により切断し、そして分解生成物を、Tris−
ボレート−EDTA中６％ポリアクリルアミドゲル上で前記
のようにして分画する。DNA断片をEtBr（0.５μｇ／m
l）中で染色し、HindIII-Sau3ADNA断片（２３９bp）を
抽出し、そして前記のようにして分離する。常法に従っ
てDNAをエタノールにより沈澱せしめる。沈澱を、10mMT
ris・HCl（pH7.５）及び0.０５mMEDTAを含有する溶液を
２０μｌに溶解する。
(b)cDNA挿入部の調製 上記（段階Ia）のようにして組換プラスミドＣＧ−pBR3
22／HLycIFN-8′1からcDNA挿入部を切り取る。
cDNA挿入部（２μｇ）を１０μｇ／mlのEtBr中2.5ＵのS
au３Ａ（バイオラブス）により分解し、そして３７℃に
て６０分間インキュベートする。分解物をフェノール抽
出し、そして前記のようにしてDNAをエタノールにより
沈澱せしめる。DNA断片を、50mMTris、50mM硼酸、1mMED
TA及び0.5μｇ／mlのエチジウムブロミドを含有する溶
液中1.２％アガロースゲルにより分画する。
２番目に大きなDNA断片（Sau3A-PstI:693bp）をゲルか
ら抽出し、そして段階Iaに記載した方法により精製す
る。DNAを10mMTris-HCl（pH7.５）及び0.０５mMEDTAを
含有する液２０μｌに溶解する。
(c)HindIII-Sau3ADNA断片のcDNA挿入部（Sau3A-PatI）
への連結 等量の両DNA断片（〜５０ng）を、10mMMgCl2、10mMDT
T、0.5mMATP及び３０Ｕ／μｌのT4DNAリガーゼ（バイオ
ラブス）を含有する溶液中で１５℃にて３時間インキュ
ベートする。混合物を８０℃にて１５分間インキュベー
トし、そして50mMNaClに調整する。DNA混合物を、0.５
ＵのPstI（バイオラブス）及び１ＵのHindIII（バイオ
ラブス）により３７℃にて２０分間分解する。DNAをフ
ェノール抽出及びエタノール沈澱し、そして10mMTris・H
Cl（pH7.５）及び0.05mMEDTAを含有する溶液２０μｌに
溶解する。
得られた混合物の半分を、10mMMgCl2、10mMDTT、0.5mMA
TP、及び３０Ｕ／μｌのT4DNAリガーゼ（バイオラブ
ス）を含有する溶液中で、１５℃にて２時間、プラスミ
ドpBR322のHindIII-PstIDNA大断片に連続する。
溶液の１０分の１容量を用いて前記（段階Ｄ）のように
してE.コリHB101を形質転換する。形質転換されたコロ
ニーを用いて前記（段階Ｆ参照）のごとくIFN活性を試
験する。
最高レベルのIFN活性を供するクローンを選択し、これ
をE.コリHB101CG-pBR(AP)/LyIFN-α-3と称する IFN活性は、上記（段階Ｆ）の方法により測定する。７
0,０００（IU／ml）の活性が認められ、もとのクローン
であるE.コリHB101CG-pBR322/HlyeIFN-8′１と比べて７
００倍強化されている。
前記（段階Cc）のようにして、培養物からクローンCG-p
BR(AP)/LyIFN-α-3の組換プラスミドDNAを分離し、そし
てcDNA挿入部（IFN遺伝子）及びβ−ラクタマーゼ制御
領域のヌクレオチド配列を確定することにより特徴づけ
る。結果を第１８図に要約する。
プラスミドCG-pBR(AP)/LyIFN-α-3の形成方法は、すべ
てのα-IFNcDNA遺伝子、又は適切に切り出された染色体
α-IFN遺伝子の場合にも一般的に使用することができ
る。
例えば、プラスミドCG-pBR(AP)/LyIFN-α-3について記
載したのと同様にして、プラスミドCG-pBR322/HLycIFN-
51から出発してプラスミドCG-pBR(AP)/LyIFN-α-2が得
られる。この新しいプラスミドは、CG-pBR322/HLycIFN-
51のDNA挿入部及びCG-pBR(AP)/LyIFN-α-1からのβ−ラ
クタマーゼ制御部位を含有する。このようにしてE.コリ
HB101CG-pBR(AP)/LyIFN-α-2と称するクローンが得られ
る。５0,０００（IU／ml）のIFN活性が認められ、もと
のE.コリHB101CG-pBR322/HLycIFN-51に比べて５倍強化
されている。プラスミドCG-pBR(AP)/LyIFN-α-2のcDNA
挿入部及びβ−ラクタマーゼ制御部位のヌクレオチド配
列を前記の方法によって確定し、第１９図に示す。
(III)調製した微生物の寄託 例１０において前記のようにして調製した微生物及び組
換DNA分子は、１９８１年９月１４日にNRRL(Agricultur
al Research Culture Collection）に寄託され、次の受
け入れ番号が付されている。
E.コリHB101CG-pBR322/HLycIFN-β1：NRRLB-12528 E.コリHB101CG-pBR322/HLycIFN-41：NRRLB-12529 E.コリHB101CG-pBR322/HLycIFN-1′b：NRRLB-12530 E.コリHB101CG-pBR322/HLycIFN-51：NRRLB-12531 E.コリHB101CG-pBR322/HLycIFN-8′1：NRRLB-12532 例１１． E.コリ プラスミドCG-pBR322/HLycIFN-1′ｂ及び-51の
リンパ芽球性IFN-1′ｂ及びIFN-51をコードする配列
は、例５及び６においてIFN-8′1について記載したのと
同様にしてプラスミドp30（例４参照）にサブクローニ
ングすることができる。制限エンドヌクレアーゼHaeIII
を用いて部分分解する必要がある。こうして得られた酵
母雑種プラスミドがp30IFN2(1′b)、p30IFN2′(1′b)、p3
0IFN2(51)、及びp30IFN2′(51)である。
こうして得られた雑種プラスミドを使用して、例７に記
載したのと同様にして、サッカロミセス・セレビシエー
RH971を形質転換することができる。リンパ芽球IFNcDNA
挿入部を有する雑種プラスミドを含有する次のコロニー
を選択することができる。
S.セレビシエーRH971/p30IFN2(1′b) S.セレビシエーRH971/p30IFN2′(1′b) S.セレビシエーRH971/p30IFN2(51) S.セレビシエーRH971/p30IFN2′(51) 例１２ 例９に記載したのと同様にして、プラスミドp30IFN2
(1′b)、-51)、-(8′1)、及びp30IFN2′(1′b)、-51)から
出発して、それぞれ酵母雑種プラスミドpJDB207/IFN2
(1′b)、pJDB207/IFN2′(1′b)、pJDB207/IFN2(51)、pJDB2
07/IFN2′(51)、及びpJDB207/IFN2(8′1)が得られる。
これらのプラスミドは、ロイシン原栄養性コロニーを選
択することによりS.セレビシエRH971に形質転換するこ
とができる。リンパ芽球IFNcDNA挿入部を有する雑種プ
ラスミドを含有する次のコロニーが得られる。
S.セレビシエーRH971/pJDB207/IFN2(1′b) S.セレビシエーRH971/pJDB207/IFN2′(1′b) S.セレビシエーRH971/pJDB207/IFN2(51) S.セレビシエーRH971/pJDB207/IFN2′(51) S.セレビシエーRH971/pJDB207/IFN2(8′1) 例１３． PHO5プロモーター及びPHO5転写停止信号を含
有する発現プラスミドの形成 (a)プラスミドp30中のEcoRI制限部位の除去第２０〜２
２図に概略を示す方法においては、プラスミドp30中の
ユニークEcoRI制限部位を除去する必要がある。５μｇ
のp30DNA（例４参照）を制限エンドヌクレアーゼEcoRI
（ベーリンガー）より完全に分解する。生成した接着末
端を満たすために、50mMNaCl、10mMTris・HCl(pH7.5)、10m
MMgCl2、1mMDTT、0.25mMdATP及び0.25mMdTTPを含有する溶
液50μｌ中１μｇのEcoRI分解p30を、１ＵのDNAポリメ
ラーゼ〔クレノウ（Klenow）大断片、BRL〕と共に、３
７℃にて３０分間インキュベートする。エタノール沈澱
により回収したDNAを常法に従って連結し、そして、例
４に記載したのと同様にして受容能力を有するE.コリHB
101の形質転換に使用する。EcoRI分解に耐性を有するコ
ロニーをp30/EcoRIRと称する。
(b)0.37kbSau3A-PstIPHO5転写停止断片の分離 PHO5転写はSIヌークレアーゼマッピングによりすでにマ
ップされている（48）。転写停止信号はPHO5遺伝子の0.
37kbSau3A-PstI断片に位置することがすでに示されてい
る。Sau3A-PstI断片のヌクレオチド断片を第２１図に示
す。
５μｇのpJDB207/PHO5,PHO3DNA（例２参照）を制限エン
ドヌクレアーゼSau3A及びPstIにより完全に分解する。
制限断片を、TRE緩衝液中垂直の1.５％底融アガロース
ゲルにより分離する。0.37kbSau3A-PstI断片の位置をエ
チジウムブロミドにより決定し、そしてこのDNA断片を
含有するできるだけ小さい片を切り取る。
(c)Sau3A-PstIPHO5断片のM13mp9へのクローニング M13mp9フアージDNAは、１群のユニーク制限部位を有す
る有用なクローニングベクターである(49)。５μｇのM1
3mp9DNAを、制限エンドヌクレアーゼBamHI及びPstIを用
いて完全に分解する。7.2kbDNA断片を、0.８％低融アガ
ロースゲル上で非常に小さい断片（８bp）から分離す
る。大DNA断片を含有するゲル片をゲルから切り取る。p
JDB207/PHO5,PHO3の0.37kbSau3A-PstI断片（例１３ｂ参
照）を有するゲル片、及びM13mp9の7.2kbBamHI-PatI断
片を有するゲル片を６５℃にて液化し、およそ同量ずつ
混合し、そして水で稀釈することによりアガロースの濃
度を0.３％に低下せしめる。60mMTris・HCl(pH7.5)、10mM
MgCl2、10mMDTT、1mMATP及び６００ＵのＴ４DNAリガーゼ
（バイオラブス）を含有する溶液200μｌ中で連結を行
う。ニューイングランド、バイオ・ラブスにより発表さ
れた「M13 cloning and DNA sequencing systan」の方法
に行って、E.コリJM101(Ca）の受容能力を有する細胞
の形質導入を行う。多数の白色プラグからのファージを
増殖せしめ、そして制限エンドヌクレアーゼEcoRI及びP
stIを用いて切断することにより、これらのDNA挿入部の
大きさを分析する。
Sau3A-PstIPHO5転写停止断片を含有するM13mp9誘導クロ
ーンを分離し、そしてこれをM13mp9/PHO5(Sau3A-PstI)
と称する。
(d)PHO5転写停止断片のp30/EcoRIRへのクローニング ファージM13mp9にクローニングされたもとのPHO5転写停
止断片〔M13mp9/PHO5(Sau3A-pstI)〕を、HaeIII-HindII
I断片として、BalI及びHindIIIにより切断されたプラス
ミドp30/EcoRIRに再クローニングする。M13mp9/PHO5(Sa
u3A-PstI)DNAを制限エンドヌクレアーゼHaeIII及びHind
IIIにより完全に切断する。生成する２つのDNA断片を、
TBE緩衝液中垂直の1.５％低融アガロースゲルにより分
離する。0.39kbの断片をゲルから切り取ったゲル片中に
分離する。p30/EcoRIRDNAをBalI及びHindIIIを用いて分
離する。大きな3.98kb断片を、TBE緩衝液中0.８％低融
アガロースゲルにより分離し、そしてDNA断片を含有す
るゲル片を切り取ることにより分離する。
0.39kbHaeIII-HindIIIPHO5転写停止断片を有するゲル
片、及びp30/EcoRIRの3.98kbBalI-HindIII断片を有する
ゲル片を６５℃にて溶融し、そしておよそ同量ずつ混合
する。例４に記載したようにして、連結及び受容能力を
有するE.コリHB101細胞の形質転換を行う。形質転換さ
れた細胞のDNAをBalI及びHaeIIIにより切断する。PHO5
転写停止断片を含有するクローンをさらに分析し、そし
てp31と称する（第２０図参照）。
発現プラスミドp31はPHO5プロモーター領域、PHO5信号
配列の一部分及びこれに隣接するPHO5転写停止信号伴う
DNA断片を含有する。このベクター中で発現すべき外来
性コード配列は、プロモーターと転写停止信号配列との
間に便利に挿入することができる。
例１４．リンパ芽球インターフェロン−51DNAのプラス
ミドp31への挿入（第２２図） (a)プラスミドCG-pBR322/HLycIFN-51のHseIII-HpaI断片
の分離 E.コリHB101CG-pBR322/HLycIFN-51株（例10E参照）を、
１０μｇ／mlのテトラサイクリンを保給したLB培地１０
０mlに増殖せしめ、そして例２に記載した方法によりプ
ラスミドDNAを分離する。１０μｇのCG-pBR322/HLycIFN
-51、DNAを制限エンドヌクレアーゼPstI及びHpaIにより
完全に分解する。制限断片を調製用0.８％低融アガロー
スゲルにより分離する。IFN-51をコードする配列を含有
する約860bpのPstI-HpaI断片をゲルから切取り、そして
例４ａに記載した方法によりアガロースゲルから溶出
し、そして例５ａに記載した方法によりDE52イオン交換
クロマトグラフィーにより精製する。
PstI-HpaI断片は、IFN-51コード配列中のATGから４１、
６５及び１４６位に３個のHaeIII部位を有する。HaeIII
による部分分解により699bp、780bp及び804bpの３個のH
aeIII-HpaI断片が生ずる。３つの断片のすべてがおよそ
等量ずつ生ずるように注意深くHaeIII分解を行う。断片
の混合物をフェノール抽出し、エタノール沈澱し、そし
て10mMTris(pH8)溶液に0.1mg/mlの濃度で再懸濁する。
(b)BalIで切断され脱燐酸されたプラスミドp31の調製 ６μｇのp31DNA（例１３ｄ参照）を制限エンドヌクレア
ーゼBalI(BRL)により完全に分解する。フェノール抽出
及びエタノール沈澱を行った後、DNAを１００μｌの50m
MTris緩衝液（pH8.0)に再溶解し、そしてシリコンパス
ツールピペット中50μｌのベッドの平衡化ケレックス
（Chelex)100（ビオラド）に通す。流過液及びその後の
450μｌの洗浄液を一緒にする。0.4Ｕの子牛腸アルカリ
ホスファターゼを加える。３７℃にて１時間インキュベ
ートした後、６５℃にて1.5時間酵素を不活性化する。
インキュベーション混合物中のNaCl濃度を150mMに調整
する。線状化され脱燐酸化されたp31DNAをDE52イオン交
換クロマトグラフィー（例５ａ参照）により精製する。
エタノール沈澱の後、DNAを10mMTris緩衝液（pH８）中
に0.3mg/mlの濃度で再懸濁する。
(c)線状化され脱燐酸化されたp31DNAのIFN-51DNAのHaeI
II-HpaI断片への連結 BalIにより切断された脱燐酸化p31ベクターDNA0.6μｇ
をIFN-51DNAのHaeIII-HpaI部分分解断片（例１４ａ参
照）0.5μｇに連結する。連結は、60mMTris(pH7.5)、10
mgMgCl2、10mMDTT、4mMATP及び300ＵのT4DNAアーゼ（バ
イオラブス）を含有する溶液１０μｌ中で室温にて一夜
行う。連結混合物の１μｌのアリコートをカルシウム処
理された形質転換能を有するE.コリHB101細胞５０μｌ
に加える。形質転換は例４ａに記載した方法に従って行
う。
形質転換されたampRコロニーを、それぞれ別別に、100
μｇ／mlのアンピシリンを含有するLB培地で増殖せしめ
る。ホルメス(Holmes)等の方法(50)に従ってプラスミド
DNAを調製し、そして制限エンドヌクレアーゼBstII(PHO
5プロモーター中に１個のユニーク部位を有する）を用
いて分解することにより分析する。
IFN-51挿入部を含有するクローン２０個を、BstII-EcoR
Iによる二重分解によりさらに分析することにより挿入
部の方向及び大きさを決定する。正しい方向の挿入部を
有する８個のクローンにおいて、３種類すべての期待さ
れる大きさの挿入部が見出される。この大きさは、IFN-
51遺伝子（例１４ａ参照）のHaeIIIによる部分分解によ
り生ずる３種のHaeIII1 〜 3-HpeI断片に相当する。これ
らのクローンをp31/IFI(51)、p31/IF2(51)及びp31/IF3
(51)と称し、それぞれIFN-51挿入部の804bp(HaeIII1-Hp
aI挿入部）、780bp(HaeIII2-HpaI)及び699bp(HaeIII3-H
paI)を有する。
例１５．リンパ芽球性インターフェロン１′bDNAのプラ
スミドp31への挿入（第２２図参照） (a)プラスミドCG-pBR322/HLycIFN-1′ｂのHaeIII-RsaI
断片の分離 １０μｇのCG-pBR322/HLycINF-1′bDNA（例１０Ｅ参
照）を制限エンドヌクレアーゼPatI及びRsaIにより分解
する。制限断片を0.８％低融アガロースゲルにより分離
する。約870bpのPstI-RsaI断片をゲルから分離、そして
前記の方法（例１４ａ）により精製する。
PstI-RsaI断片は、IFN-1′ｂコード配列のATGから１
３、３７及び１１８位に３つのHaeIII部位を含有する。
HaeIIIによる部分分解によりそれぞれ735bp、816bp及び8
40bpのHaeIII-RsaI断片が生ずる。断片の混合物をフェ
ノール抽出及びエタノール沈澱し、そして0.1mg/mlの濃
度で10mMTris緩衝液（pH8.０）に懸濁する。
(b)線状化され脱燐酸されたp31DNAの、IFN-1′bDNAのHa
eIII-RsaI断片への連結 BalIにより切断され脱燐酸されたp31ベクターDNA（例１
４ｂ参照）0.6μｇを、IFN-1′bDNAのHaeIII-RsaI部分
分解断片0.5μｇに連結する。連結操作、連結混合物に
よる受容能力を有するE.コリHB101細胞の形質転換、及
び形質転換されたampRコロニーの選択を、例１４ｃに記
載した方法により行う。プラスミドDNAを、ホルメス等
（50）の方法に従って調製し、そして制限エンドヌクレ
アーゼBstEIIによる分解によって分析する。
IFN-1′ｂ挿入部を含有する７つのクローンをBstII-Pvu
IIを用いる二重分解により分析する。２つのクローンが
正しい方向のHaeIII2-RsaI断片（816bp）を含有するこ
とが示される。この構成をp31/IF2(1′b)と称する。
例１６．リンパ芽球性インターフェロン−８′1DNAのプ
ラスミドp31への挿入（第２３図参照） (a)プラスミドp31IFN1(8′1)の1.46kbのSalI-EcolI断片
の分離 ５μｇのp31IFN1(8′1)DNA（例５ｄ参照）を、制限エン
ドヌクレアーゼSalI及びEcoRIにより分解する。IFN-8′
1の蛋白質コード領域に連結されているPHO5プロモータ
ーを含有する1.46kbSalI-EcoRI断片を、0.８％低融アガ
ロースゲルにより分離する。エチジウムプロミド染色に
よりDNAバンドの位置を決定し、そしてゲルを切り取
る。
(b)プラスミドp31の3.5kbSalI-EcoRI断片の分離 ５μｇのp31DNA（例１３ｄ参照）を、制限エンドヌクレ
アーゼSalI及びEcoRIを用いて完全分解する。PHO5転写
停止配列を含有する3.5kbベクター断片を、0.８％低融
カガロースゲルにより分離し、そしてDNAバンドを切り
取る。
(c)p31の3.5kbSalI-EcoRI断片へのp30IFNl(8′1)の1.46
kbSalI-EcoRI断片の連結 p31の3.5kbSalI-EcoRI断片0.67μｇを含むゲル片、及び
p30IFNl(8′1)の1.46kbSalI-EcoRI断片0.5μｇを含むゲ
ル片を使用して、２４０μｌ中で、例４ａの方法により
１５℃にて一夜連結する１０μｌの連結混合物を用いて
受容能力を有するE.コリHB101細胞を形質転換する。
形質転換されたampRコロニーをそれぞれ別々に、１００
μｇ／mlのアンピシリンを含有するLB培地に増殖せしめ
る。ホルメス等(50)の方法によりプラスミドDNAを調製
し、そして制限エンドヌクレアーゼBstEII（PHO5プロモ
ーター中に１個のユニーク部位を有する）を用いて分解
することにより分析する。
IFN-8′1挿入部を含有する多くのコロニーを、BstEII-P
vuIIを用いる二重分解により分析する。これらはすべて
1.46kbSalI-EcoRI断片を含有する。これらの同一コロニ
ーをp31/IF(8′1)と称する。
例１７．遺伝子構成物の高コピー数酵母ベクターpJDB20
7へのサブクローニング 例１４〜１６に記載した構成物（construction）はPHO5
プロモーター、種々のインターフェロンコード領域及び
PHO5転写停止信号を縦列的（tandemarray）に含有し、
すべてpBR322誘導ベクターに挿入されている。酵母にお
いて発現せしめるために、全挿入部を、ロイシン原栄養
性コロニーを選択しながら（例９及び第６図参照）酵母
ベクターpJDB207(28)にサブクローニングする。
p31/IF(8′1)DNA、p31/IF1(51)DNA、p31/IF2(51)DNA、p31/
IF3(51)DNA、及びp31/IF2(1′b)DNAのそれぞれ２μｇを
制限エンドヌクレアーゼSalI及びHindIIIにより分解す
る。制限断片を調製用0.８％低融アガロースゲルにより
分離する。各分解物の小断片（〜２kbの大きさ）を含む
ゲルを切取る。１０μｇのpJDB207DNAを制限エンドヌク
レアーゼSalI及びHindIIIにより分解する。大きな6.2kb
断片を調製用0.８％低融アガロースゲルにより分離す
る。DNA断片を含有するゲル片を６５℃にて液化し、そ
して水によりアガロースの濃度が約0.３％になるまで稀
釈する。
プラスミドp31/IF(8′1)、p31/IF1(51)、p31/IF2(51)、p31
/IF3(51)、及びp31/IF2(1′b)の各２kbSalI-HindIII断
片を等モル量のpJDB207の6.2kbHindIII-SalI断片と混合
する。１００μｌ中１５℃にて４時間連結を行う。１０
μｌずつの各連結混合物を用いて、例４ａに記載した方
法に従って、受容能力を有するE.コリHB101細胞形質転
換する。各実験からの複数個ずつのampRコロニーを、そ
れぞれ別々に、１００μｇ／mlのアンピシリンを含有す
るLB培地に増殖せしめる。プラスミドDNAの挿入部の大
きさを、制限エンドヌクレアーゼHindIII及びSalIを用
いて切断することにより分析する。正しい挿入部を有す
るコロニーをpJDB207/IF(8′1)、pJDB207/IF1(51)、pJDB2
07/IF2(51)（第２７図参照）、及びpJDB207/IF2(1′b)
と称する。
例１８．サッカロミセス・セレビシエーAH220の形質転
換及びインターフェロン生産の誘導 プラスミドpJDB207/IF(8′1)、pJDB207/IF1(51)、pJDB207
/IF2(51)、pJDB207/IF3(51)及びpJDB207/IF2(1′b)のそ
れぞれを、サッサロミセス・セレビシエーAH220株
（ａ，trp1，leu2-3，leu2-112，his3，pho5，pho3）に
導入する。この場合、ヒンネン等(1)に記載されている
形質転換法を用いる。形質転換された酵母細胞を、ロイ
シンを含まない酵母最小培地プレート上で選択する。単
離された形質転換酵母コロニーを拾い上げ、例７に記載
した方法により増殖せしめる。それぞれの酵母コロニー
を次のように称する。
サッカロミセス・セレビシエーAH220/pJDB207/IF(8′1) サッカロミセス・セレビシエーAH220/pJDB207/IF1(51) サッカロミセス・セレビシエーAH220/pJDB207/IF2(51) サッカロミセス・セレビシエーAH220/pJDB207/IF3(51) サッカロミセス・セレビシエーAH220/pJDB207/IF2(1′
b) 例１９ 酵母細胞抽出物の調製及びインターフェロン力
価の測定 例８に記載した方法に従って細胞抽出物を調製し、そし
てインターフェロン力価を測定する。結果を第３表に示
す。
例２0. 酵母PHO5プロモーターの制御下における肝炎Ｂ
ウイスル表面(HBVS)抗原の発現 (a)PHO5プロモータとHVBS蛋白質コード領域との間の融
合の形成 プラスミドpHBV 130(51)のDNA５μｇを、供給者（ニュ
ーイングランド、バイオラブス）の推奨する方法に従っ
て、制限エンドヌクレアーゼAvaIにより分解する。HVBS
の完全な蛋白質コド領域（２７塩基対のポテンシャルプ
レHBVS配列を含む）を含む１３３６塩基対(bp)の断片を
得る〔参考文献(51)の第２図を参照のこと：AvaI断片は
Xho部位から、表面コード領域とバコード領域の間に位
置するBamHI部位を６２塩基対越えてAvaI部位までのDNA
部分にわたる〕。
１３３６bp断片を、例4aに記載する方法に従って、軟ア
ガロース電気泳動（0.8％アガロースゲル）により精製
する。
５μｇのプラスミドpBR 322/PHO5 Bam-Sal（第１図参
照）を制限エンドヌクレアーゼSal I及びAva I(pBR 322
の１４２４位)により切断し、そしてこうして生成し
た、PHO5 Bam-Sal部分と共にpBR 322配列を含有する3.9
kbのベクター断片を、前記の軟アガロース電気泳動によ
り精製する。
１μｇの１３３６bp断片を、６０mM Tris-HCl(ph 7.
5)、１０mM MgCl2、１０mM DTT、１mM ATP及び６００Ｕ
のＴ４ DNAリガーゼ（バイオラブス）を含有する溶液
５０μｌ中で、１５℃にて４時間、３μｇの3.9kbベク
ター断片に連結する。Ｅ．コリＨＢ１０１のアンピシリ
ン耐性への形質転換及びプラスミドの分離を、例４ａに
記載した方法に従って行う。
プラスミドの正しい構造を制限分析により確認する。こ
うして形成した新規なプラスミドをpBR322/PHO5/HBVSと
称する（第２４図参照）。
(b)PHO5プロモーターの正確なHBVS蛋白質コード領域へ
の調整 前記の融合により第２５図に示すDNA配列が生ずる。配
列データは第３図(PHO5)及びパセク(Pasek)等(52;HBVS)
から得られる。mRNA開始部位は、pBR 322/PHO5 Bam-Sal
（第１図）を用いて常用のＳ１マッピング(48)により決
定する。pBR 322/PHO5/HBVS中に存在するPHO5蛋白質コ
ード領域を除去するために、５μｇのプラスミドを制限
エンドヌクレアーゼKpnIにより分解し（供給者、ニュー
イングランド、バイオラブスにより特定された条件にお
いて）、線状プラスミドを生成せしめる。
４μｇの線状化プラスミドを、１Ｕのエキソヌクレアー
ゼBa131（ベセスダ リザーチ ラボラトリー）を用い
て、12mM CaCl2,12mM MgCl2,300mM NaCl,20mM Tris,1mM
EDTA(pH8.1)を含有する全量１００μｌの溶液中で、３
０℃にて４５秒間分解する。前記の方法によるフェノー
ル抽出により反応を停止せしめる。エタノール沈澱の
後、DNAを５０μｌのTEに再懸濁する。
１μｇのDNAを、２０μｌの容積中で、T4DNAリガーゼを
用いて再環化する（条件については例４ａを参照）。
Ｅ．コリＨＢ１０１をアンピシリン耐性に形質転換した
後（例４ａ参照）、プラスミドDNAを前記のようにして
分離し、そして各プラスミド標品につきHaeIII，Pat
I，BstEII及びHha Iを用いて制限分析を行う。この分析
に続き、Hha I部位の存在（HBVS蛋白質コード領域の出
発点の前６bp）を決定し、そして除去された大きさを測
定する。連結領域のDNA配列を、マクサム及びジルバー
ト(15)の方法（部位−３７４のBstE II部位における放
射能ラベルによる、第３図参照）を用いて決定する。プ
ラスミドの１つに生じた除去部の終点を第２４図に示
す。このプラスミドをpBR 322/PHO5/HBVSΔ14と称す
る。
(c)PHO5-HBVS融合物の酵母プラスミドpJDB207への導入
（第２６図） プラスミドpBR 322/PHO5/HBVSΔ１４のDNA５μｇを、制
限エンドヌクレアーゼBamH I（ニューイングランド、バ
イオラブス、供給者が記載した条件による）により分解
する。例４ａに記載した方法により軟アガロースゲル電
気泳動法（0.8％アガロース）を用いて1.8kb BamH I断
片を調製する。２μｇの酵母ベクターpJDB 207を同じ酵
素により分解する。１μｇの分解されたpJDB 207と１μ
ｇの1.8 kb BamH I制限断片を、全容２０μｌにおいて
例２０ａに記載した条件を用いて連結する。Ｅ．コリＨ
Ｂ１０１のアンピシリン耐性への形質転換を、前記（例
４ａ）の方法に従って行う。各プラスミドをBamH I制限
分析により分析し、そして挿入されたBamH I断片の方向
をHind III/BstE II二重分解により決定する。第２６図
に形成方法を示す。第２６図に示した方法により得られ
たプラスミドをpJDB 207/PHO5/HBVSΔ１４と称する。
例７に記載した方法によりプラスミドを酵母AH 220株に
形質転換する。例７に記載した方法に従って、形質転換
された酵母細胞を選択し、液体培地にインキュベート
レ、そして抑制解除条件下で増殖せしめる。１つの形質
転換酵母コロニーをサッカロミセス・セレビシェーAH 2
20/pJDB 207/HBVSΔ１４と称する。
例８の方法に従って細胞抽出物を調製し、アボット(Abb
ott)の放射免疫測定法(51)を用いて、生産されたHBVS蛋
白質の量を測定する。酵母により生産されたHBVS抗原が
ヒト−血清中の抗原と同様に反応すると仮定して、抑制
解除条件下で酵母抽出液ｍ当り約２μｇのHBVS抗原が
見出される。抑制条件下では力価が0.００１μｇ／ｍ
より低い。
(d)PHO5転写停止配列を含有する酵母プラスミドへのPHO
5-HBVS融合物の導入 プラスミドpJDB207/IF(8′1)（例１７）のDNA５μｇ
を、前記のようにしてBamH Iにより分解し、そして例４
ａに記載した方法により軟アガロース電気泳動法（0.8
％アガロース）を用いて6.9kbベクター部分を分離す
る。５μｇのpBR 322/PHO5/HBVSΔ１４を前記のように
してBamH Iにより分解し、そして軟アガロースゲル電気
泳動法により1.8kb BamH I断片を分離する。１μｇの6.
9kbベクター断片を、全容２０μｌにおいて例２０ａに
記載した条件を用いて、１μｇの1.8kb BamH I断片と連
結する。例４ａに記載した方法に従って、Ｅ．コリＨＢ
１０１のアンピシリン耐性への形質転換、及びプラスミ
ドの分離を行う。制限エンドヌクレアーゼ分解によりプ
ラスミドの分析を行う。第２６図に示す方法により得ら
れたプラスミドをpJDB 207/PHO5/HBVSΔ１４ｔと称す
る。例７に記載した方法に従って、酵母AH 220の形質転
換、及び形質転換された細胞の選択を行う。単一の形質
転換酵母コロニーをサッカロミセス・セレビシエーAH 2
20/pJDB207/HBVSΔ１４ｔと称する。
例２1. ヨーロッパ特許出願第１３８２８号に記載されている次
のプラスミド、 pBR 322-PstI dG：HBV-KpnI dC； pBR322-PstI dG：HBV-BamHI dC； pBR322-PstI dG：HBV-Bg1II dC； pBR322-PstI dG：HBV-EcoRI dC； pBR322-BamHI：HBV-BamHI； pBR322-EcoRI：HBV-EcoRI； pBR322-PstI dG：HBV-KpnI dC， pBR322-PstI′ dG：pHBV114-PstI dC， ((pBR322-EcoRI HindIII：Lacプロモーター配列)-HindI
II：HBV114-HhaI HindIII linkers)-BamHI, pUR2-EcoRI：HBV114-HhaI EcoRI linkers, pUR2-EcoRI：HBV114-HhaI EcoRI linkers； pBR322-PstI dG：pHBV114-AvaI dC,and pBR322-PstI d
G：pHBV114-Taq dC, から切り出された肝炎Ｂウイルス(HBV)DNA配列を、例
５，１４又は１５に記載した方法に従ってプラスミドp3
0又はp31に挿入し、そして次に例１７に記載した方法に
従ってプラスミドpJDB２０７に挿入することができる。
Ｓ． セレビシエーの形質転換は例１８の方法に従って
行う。HBV抗原性を有するポリペプチドの発現を例２０
ｃの方法に従って行う。
例２２ プラスミドpJDB207/IF2(51)及びpJDB207/IF2
(1′b)中の３′非翻訳DNA配列の除去（第２７及び２８
図） プラスミドpJDB207/IF2(51)及びpJDB207/IF2(1′b)（例
１７参照）の形成において、それぞれ約４４０bp及び４
８０bpの比較的長い３′非翻訳領域が生ずる。構成物の
この領域を短縮するために、エキソヌクレアーゼBal131
を用いて、この領域の中央に存在するユニークSmaI部位
からDNAを分解する。Xhoリンカーを導入し、そして連結
によりDNAを環化する。
(a)Smalで切断されたプラスミドpJDB207/IF2(51)及びpJ
DB207/IF2(1′b)Ba131分解 ２０μｇずつのプラスミドDNAを制限エンドヌクレアー
ゼSmaIにより分解する。フエノール／クロロホルムによ
り抽出した後、エタノールによりDNAを沈澱せしめる。D
NAを、１０mMTris緩衝液（pH8.０）中に0.5mg/mの濃
度に再懸濁する。
１０μｇずつのSmaIにより切断されたDNAを、20mMTris
(pH8.0)、100mMNaCl、12mMMgCl2、12mMCaCl2、及び１mM
EDTAを含有する溶液100μ中で、２Ｕのエンドヌクレ
アーゼBa131(BRL)を用いて分解する。３０℃にてインキ
ュベーション中の９０秒、１２０秒、１５０秒及び１５
０秒後に３μｇのDNAのアリコートを取り出し、そして
ただちに50μのフエノール及び６０μのTNEと混合
する。フエノール／クロロホルムによる抽出及びエタノ
ール沈澱の後、DNAを10mMTris（pH8.0）に１００μｇ／
ｍの濃度に再懸濁する。
Ba131のエキソヌクレオチド分解物を分析するため、各
時点におけるDNAのアリコート0.7μｇを、pJDB207/IF2
(51)誘導試料についてはHindIII/EcoRIにより、又はpJD
B207/IF2(1′b)誘導試料についてはPvuII/HindIIIによ
り分解する。以後の実験のために９０秒時点でのDNAを
使用する。
(b)Ba131処理DNAへのXhoIリンカーの付加 それぞれ2.2μｇずつのプラスミドDNApJDB207/IF2(51)
及びpJB207/IF2(1′b)を９０秒間Ba131分解（例２２ａ
参照）した後、６０mMTrispH7.5、１０mMMgCl2、及び0.
1mMdNTP′を含有する溶液３５μ中で、３７℃にて１
時間2.８Ｕのクレノウ（Klenow）DNAポリメラーゼ（ポ
リメラーゼＩの大断片、BBL）と共にインキュベートす
る。
３μｇのXhoIリンカー（５′-CCTCGAGG-3′、コラボラ
ティブリサーチ）を、６mMTris(pH7.5)、１０mMMgCl2、4
mMDTT、0.5mMATP及び35ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ（ベーリンガー）を含有する溶液５０μ中で、３
７℃にて３０分間キナーゼ処理する。
キナーゼ処理した0.６７μｇのXhoIリンカーと、プラス
ミドpJDB207/IF2(51)又はpJDB207/IF2(1′b)のBa131処
理された平滑末端を有するDNA0.4μｇとを、60mMTris p
H7.5、１０ｍＭＭｇＣｌ２、５mMDTT、3.5mMATP及び４
５０ＵのＴ４DNAリガーゼを含有する溶液２５μｌ中
で、室温にて一夜連結処理する。連結されたDNAを、10m
MEDTA、0.3Ｍ酢酸ナトリウム（pH6.0）及び0.５４容量
のイソプロパノールの存在下でイソプロパノール沈澱す
ることにより過剰のリンカーから分離する。室温で３５
分間インキュベートした後、DNAを遠心沈降せしめる。
ペレットを空気乾燥し、そして6mMTris(pH7.9)、150mMN
aCl、6mMMgCl2及び６mMメルカプトエタノールを含有す
る溶液１７μ中に再懸濁する。DNAに連結されたXhoI
リンカーをXhoIで切断し、前記のようにしてDNAをイソ
プロパノールで沈澱せしめ、そして連結により環化す
る。６０mMTris（pH7.5）、１０mMMgCl 2、１０mMDTT、
１mMATP及び６００ＵのT4-DNAリガーゼを含有する溶液
５０μ中で１５℃にて６時間連結した後、各連結混合
物を１００μのカルシウム処理され形質転換可能な
Ｅ．コリHB101細胞に加える。
IFN-51挿入部を有するプラスミドを含有する形質転換さ
れたampRコロニー７２個を、それぞれ別々に、１００mg
／のアンピシリンを含有するＬＢ培地に増殖せしめ
る。プラスミドDNAをHaeIII分解により分析する。制限
パターンによりBa131により行われた除去のおよその大
きさを判断することができる。２つのクローンをさらに
分析し、そしてインターフエロン活性を測定する。これ
らをpJDB207/IF2(51)Δ７２、及びpJDB207/IF2(51)Δ８
２と称する。
IFN-51遺伝子の３′非翻訳領域とＰＨＯ５転写停止領域
の間の新しい連結（XhoIリンカー）の両側のヌクレオチ
ド配列を第２８図に示す。
同様にして、IFN-1′ｂ挿入部を有するプラスミドを含
有するampRコロニー６０個を、それぞれ別々に、１００
mg／のアンピシリンを含有するLB培地に増殖せしめ
る。１つのクローンを選びそしてIFN活性について測定
する。これをpJDB207/IF2(1′b)Δと称する。
例２３ 成熟リンパ芽球性IFNを直接発現するために使
用することができるポータブルIFN-51，-8′１及び-1′
bcDNAを含有する組換プラスミドの形成（第２９及び３
０図） (a)cDNA挿入部の調製 組換プラスミドCG-pBR322/HLycIFN-8′１、CG-pBR322/H
LycIFN-1′ｂ、CG-pBR322/HLycIFN-51のプラスミドDNA
１５０μｇずつを、PstI（バイオラブス）を用いて供給
者により示唆された条件下で分解することによりcDNA挿
入部を切り出す。フエノール抽出及びエタノール沈澱の
後、切り出した挿入部を、５０mMTris-HCl(pH8.0)及び
１ｍＭＥＤＴＡ中シュークロース密度勾配遠心（５〜２
３％）により分離する。遠心分離はTST41ローター（コ
ントロンＡＧ）を用いて１５℃、35,000rpmにて１６時
間行う。ISCO勾配コレクターを用いて、１ｍ／分にお
いて0.3mずつの分画を集める。小断片（すなわち挿入
部）を含有する分画を一緒にする。常法に従ってエタノ
ールによりDNAを沈澱せしめ、そしてHB-4ローター（ソ
ルバル）を用いて０℃、10,000rpmにて１０分間遠心分
離することにより沈澱を集める。沈澱を１０mMTris-HCl
(pH7.5)及び0.05mMEDTAを含有する溶液６０μに再溶
解する。光学濃度の測定により測定したDNAの回収量は
３０μｇである。
各cDNA挿入部２μｇずつを、１０μｇ／ｍEtBr中2.5
ＵのSau3A（バイオラブス）により分解し、そして３７
℃にて６０分間インキュベートする。前記のようにして
分解物をフエノール抽出し、DNAをエタノールで沈澱せ
しめる。DNA断片を、５０mMTris、５０mM硼酸、１mMEDT
A及び0.5μｇ／ｍのエチジウムプロミドを含有する溶
液中1.2％アガロースゲルにより分画する。
３つの各分解物からの２番目に大きいDNA断片（Sau3A-P
stI）をゲルから切り出し、注射器の小針を通して、0.1
5MNaCl、５０mMTris・HCl(pH8.0)、１mMEDTAを含有する
溶液５ｍに注入し、そして一夜振とうすることにより
溶出する。溶出液を、１００μのDE-52（ワットマ
ン）パスツール−ピペットカラムに通してDNAを吸着せ
しめる。カラムを同じ緩衝液２ｍで洗浄し、そして1.
5mMNaCl、50mMTris(pH8.0)及び１mMEDTAを含有する溶液
４００μにより溶出する。DNAを、２容量のエタノー
ルを用いて−２０℃にて一夜沈澱せしめる。エッペンド
ルフ遠心分離機により遠心分離することにより沈澱を集
め、そして１０mMTris・HCl(pH7.8)、0.05mMEDTAを含有
する１０μの溶液中に再溶解する。
(b)受容プラスミドDNA断片の調製 (1)EcoRI及びＳ１によるプラスミドpBR322の分解 １０μｇのプラスミドDNApBR322を１５ＵのEcoRI（パイ
オラブス）を用いて３７℃にて６０分間、供給者により
記載された条件の下で分解する。フエノール抽出及びエ
タノール沈澱の後、DNAを２５μの水に再溶解し、そ
してDNAを、２５０mMNaCl、３０mM酢酸ナトリウム（pH
4.5）、１mMZnSO4を含有する溶液３５０μ中３０℃に
て３０分間２０ＵのエンドヌクレアーゼＳ１（Ｐ−Ｌバ
イオケミカルス）により処理することによりずれのある
末端を除去する。EDTA(pH7.5)を加えて１０mMにするこ
とにより反応を停止する。フエノールで抽出し、そして
エタノール沈澱によりDNAを濃縮し、そして１０mMTris・
HCl(pH7.8)、0.05mMEDTAを含有する溶液５０μ再溶解
する。
(2)EcoRI及びＳ１により分解されたpBR322への化学合成
DNAリンカーの連絡 次の式、 ５′-AATTCTATGTGT-3′ 及び ５′-GATCACACATAGAATT-3′ で示されるオリゴデオキシヌクレオチドを例１０Eaに記
載した方法により調製する。
８０ｐモルの各オリゴヌクレオチドを、0.1mMrATP（シ
グマ）、５０mMTris・HCl(pH9.5)、１０mMMgCl2、５mMDT
T及び２０ＵのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバ
イオケミカルス）を含有する８０μの反応溶液中で、
３７℃にて３０分間２０μCi〔γ-32p〕−ATP（６７０
０Ci・m mol-1、アマーシヤム）と共にインキュベートす
ることにより、剛性オリゴデオキシヌクレオチドの５′
末端を燐酸化する。
次の式、 〔32P〕−AATTCTATGTGT TTAAGATACACACTAG−〔32P〕 で示される生成した放射性燐酸化リンカーを、次に0.5m
MrATP（シグマ）、0.1mMDTT（カルビオケム）、２０mMT
ris・HCl(pH7.8)、１０mMMgCl2及び４×103UのT4DNAリガ
ーゼ（バイオラグス）を含有する反応液２００μ中
で、１５℃において２時間、EcoRIにより切断されたpBR
322６μｇとインキュベートする。
フエノール抽出により溶液を脱蛋白し、エタノール沈澱
によりDNAを濃縮する。DNAを、１０mMTris・HCl(pH7.
5)、0.05mMEDTAを含有する１００μの溶液に溶解し、
そして５０mMTris・HCl(pH8.0)、１mMEDTAを含有する溶
液中シュークロース勾配（５〜２３％）遠心分離を行
う。遠心分離は、TST60ローター（コントロンAG）を使
用して１５℃、60,000rpmにおいて2.5時間行う。ISCO勾
配コレンターを用いて１ｍ／分において0.2mずつの
分画を集める。〔32P〕−ラベルプラスミドDNAを含有す
る分画（２２分画中１１〜１４分画）を一緒にし、DNA
をスタノールで沈澱せしめ、そして１２ＵのBclI（バイ
オラブス）を用い、供給者により推奨される方法に従っ
て分解する。フエノール抽出及びエタノール沈澱の後、
分解されたDNAを１０ＵのPstI（バイオラブス）を用
い、供給者により推奨される方法に従って処理する。次
に、フエノール抽出及びエタノール沈澱をした分解物
を、TST41ローターを用いて１５℃、35,000rpmにて１５
時間、シュークロース密度勾配（５〜２３％）遠心分離
する。0.3mずつの分画を（前記のようにして）集め、
〔32P〕−ラベルされた大BclI-PstIDNA断片（４２分画
中２７〜３１分画）を含有する分画を一緒にし、そして
エタノール沈澱により濃縮する。DNAをTris・HCl(pH7.
8)、0.05mMEDTAを含有する溶液２０μに再溶解する。
(c)cDNA挿入部への受容プラスミド断片の連結 ２μの受容プラミスドDNA断片（〜１００ng）（上
記）を、２０mMTris・HCl(pH7.8)、１０mMMgCl2、0.1mMr
ATP、0.1mMDTT及び４００ＵのT4DNAリガーゼを含有する
反応液１０μ中で、５μのcDNA挿入部（〜２０ng）
と共に１５℃にて３時間インキュベートする。
次に、５μの反応混合物を、１０mMMgCl2、１０mMCaC
l2及び１０mMTris・HCl(pH7.5)を含む溶液中に１５０μ
のカルシウム処理されたＥ．コリHB101を含む合計２
００μの混合物に加える。
混合物を氷中で２０分間冷却し、そして４２℃にて１分
間加熱し、そして２０℃にて１０分間インキュベートす
る。１ｍのトリプトン培地〔トリプトン培地は、１
の蒸留水中に１０ｇのバクト−トリプトン（ディフ
コ）、１ｇの酵母エキストラクト（ディフコ）、１ｇの
グルコース、８ｇのNaCl及び２９４mgのCaCl2・2H2Oを含
有する〕を加え、そして混合物を３００rpm振とうしな
がら３７℃にて３０分間インキュベートする。混合物
を、１０μｇ／ｍのテトラサイクリン（シグマ）を補
給した２枚の寒天プレーテ（マッコンキー寒天、ディフ
コ、0.6m／プレート）上に接種する。プレートを３７
℃にて１２〜１７時間インキュベートする。形質転換混
合物当たり約１０００コロニーを得る。各形質転換混合
物から４コロニーを取り上げさらに分析する。
(d)雑種プラスミドの制限分析 能力のある雑種プラスミドをさらに分析するために、１
２コロニー（３種類の連結混合物から４個ずつ）からプ
ラスミドDNAを分離する。
雑種プラスミドDNAを次のようにして分離する。２５ｍ
のエルレンマイヤーフラスコ中、１０μｇ／ｍのテ
トラサイクリンを補給したトリプトン培地１０ｍに１
コロニーを接種する。培養物を３７℃、３００rpmにて
１５〜１８時間振とうする。細胞を遠心分離（ソルバ
ル、HS-4ローター、１０分間、4000rpm、４℃）により
集める。約0.1gの細胞を得、そして１ｍの５０mMTris
・HCl(pH8.0)に再懸濁する。0.２５ｍのリゾチーム溶
液〔５０mMTris・HCl(pH8.0)中１０mg／ｍ、シグマ
製〕を加え、０℃にて１０分間インキュベートした後0.
１５ｍの0.5MEDTA(pH7.5)を加える。０℃にてさらに
１０分間おいた後、６０μの２％トリトンＸ−１００
を加える。０℃にて３０分置いた後、試料を、ソルバル
SA-600ローターを用いて15,000rpm、４℃にて３０分間
遠心分離する。上澄液を１容量のフエノール（TNEより
飽和）により脱蛋白する。5000rpm、４℃にて１０分間
遠心分離（ソルバルHB-4ローター）することにより相分
離を行う。上相を１容量のクロロホルムで２回抽出す
る。膵臓RNAアーゼＡ（シグマ、TNE中１０mg／ｍ、８
５℃にて１０分間前加熱）を最終濃度が２５μｇ／ｍ
となるように加え、そして混合物を３７℃にて４０分間
インキュベートする。次に溶液を１MNaCl、及び１０％
ポリエチレングリコール６００（フルカ、１２０℃にて
２０分間オートクレーブしたもの）に調整し、そして−
１０℃にて２時間インキュベートする。ソルベルHB-4ロ
ーター（２０分間、10,000rpm、０℃）により沈澱を集
め、そして１００μのTNEに再溶解する。DNA溶液を１
容量のフエノールで抽出し、DNAを２容量のエタノール
により−８０℃にて１０分間沈澱せしめる。エッペンド
ルフ遠心分離機により沈澱を集め、そしてDNAを、１０m
MTris・HCl(pH7.5)及び0.5mMEDTAを含有する溶液２０μ
に再溶解する。１０ｍの培養物から８〜１０μｇの
雑種プラスミドDNAを得る。
プラスミドDNAのすべてを次の二重分解により分析す
る。0.5μｇずつの各DNAを、標準法に従って、HindIII
（バイオラブス）とPvuII（バイオラブス）、HindIIIと
PstI（バイオラブス）、HindIIIとBamH1（バイオラブ
ス）、EcoRI（バイオラブス）とPstIを用いて分解し、
そして４０mMTris・酢酸(pH7.8)、１mMEDTA及び0.5μｇ
／ｍのEtBrを含む溶液中、1.５％アガロースゲルによ
り、大きさに従って分画する。所望の制限酵素パターン
を有する雑種プラスミドを選択する。結果を第２９及び
第３０図に示す。pBR322/HLycIFN-8′1、pBR322/HLycIF
N-51及びpBR322/HLycIFN-1′ｂから誘導された挿入部を
含むプラスミドDNAをそれぞれGC-pBR322/HLycIFN(α-3)
-252、CG-pBR322/HLycIFN(α-2)-261、及びCG-pBR322/H
LycIFN(α-1)-258と称する。
リンカーとIFNcDNAのコード配列の出発部との間の連結
点における構造をさらに確認するために、この領域にお
けるヌクレオチド配列を決定する。具体的には、２μｇ
の分離されたプラスミドDNA CG-pBR322/HLyc INF(α-1)
-258をEcoRIで分解し、５′末端をラベルし、そしてPst
Iにより切断する。DNA断片を６％ポリアクリルアミドゲ
ル上で分画し、そして前記の方法によりEcoRI-PstI(9.4
bp)DNA断片を抽出する。このDNA断片をマクソン及びジ
ルバート(15)に方法に従って配列分析にかける。
同様にして、プラスミドCG-pBR322/HLycIFN(α-2)-261
及びCG-pBR322/HLycIFN(α-3)-252中のリンカーとIFNcD
NAのコード配列の出発部との間の連結点における構造を
確認する。
プラスミドCG-pBR322/HLycINF(α-1)-258、(α-2)-26
1、及び(α-3)-252においてIFNコード配列の前にEcoRI
制限部位を含有する次のヌクレオチド部分が存在する。
例２４ 発現プラスミドp31中のPHO5信号配列の除去
（第３１図参照） 発現プラスミドp31は、mRNA出発部位を含むPHO5プロモ
ーター配列、酸性ホスファターゼの翻訳出発コードンAT
G、及び作成ホスファターゼ信号配列の一部分をコード
する追加の４０ヌクレオチドを含む。この構造におい
て、信号配列のヌクレオチド及びATGはBa131分解により
除去される。PHO5プロモーターと適当な成熟コード配列
（例えばインターフェロン遺伝子）との連結を可能にす
るためにEcoRIリンカーを導入する。
(a)BalIで切断されたプラスミドp30のBa131分解 ２０μｇのp30DNA（例４ｂ参照）を制限エンドヌクレア
ーゼBalIにより分解して3.7kb及び5.1kbの２つの断片を
得る。フエノール／クロロホルムで抽出した後、エタノ
ールによりDNAを沈澱せしめる。DNAを１０mMTris(pH8.
5)中に0.5μｇ／ｍの濃度に再懸濁する。BalIで切断
されたp30DNA9μｇを、２０mMTris(pH8.0)、１００mMNa
Cl、１２mMMgCl2、１２mMCaCl2及び１mMEDTAを含有する
溶液１００μ中で、２ＵのエキソヌクレアーゼBa131
(BRL)により分解する。３０℃でインキュベートしなが
ら、２μｇDNAのアリコートを１５秒、３０秒、４５秒
及び６０秒後に拌取する。フエノール／クロロホルムに
より抽出及びエタノール沈澱の後、DNAを１０mMTris(pH
8.0)中に１００μｇ／ｍの濃度に再懸濁する。Ba131
によるエキソヌクレアーゼ分解の程度を分析するため
に、各時点における0.5μｇのDNAをエキドヌクレアーゼ
BamHIにより分解し、そしてTris-硼酸緩衝液（pH8.3）
中1.５％アガロースゲル上で分析する。Ba131分解の４
５秒間に断片の各末端から平均７０bpが除去される。そ
の後の実験には４５秒の時間でのBNAを使用する。
(b)Ba131処理されたDNAへのEcoRIリンカーの付加 2A260UのEcoRIリンカー（５′-GGAATTCC-3′、BRL）
を、１０mMTris(pH8)、１mMEDTAを含有する溶液２５０
μに懸濁する。２μｇのEcoRIリンカーを、６０mMTri
s(pH7.5)、１０mMMgCl2、１５mMDDT、１０μMATP及び３
３ＵのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー）を
含有する溶液７５μ中でキナーゼ処理する。３７℃に
１時間おいた後、混合物を室温に放冷し、そして−２０
℃に貯蔵する。
アニールした二重鎖EcoRIリンカーを、その平滑末端に
より、Ba131処理されたDNA断片に連結する。0.5μｇのB
a131処理DNA（例２４ａ参照）を、６０mMTris(pH7.5)、
１０mMMgCl2、１０mMDTT、４mMATP及び６００ＵのT4DNA
リガーゼ（バイオラブス）を含有する溶液２０μ中
で、５０倍過剰量のキナーゼ処理EcoRIリンカーと共に
室温において１６時間インキュベートする。T4DNAリガ
ーゼを不活性化（６５℃にて１０分）した後、過剰のEc
oRIランカーを５０μにおいて５０ＵのEcoRIにより切
断する。DNAをフエノール／クロロホルムにより抽出
し、エタノールで沈澱せしめ、そして１０mMTris及び１
mMEDTAを含有する溶液に懸濁する。
制限エンドヌクレアーゼは両BalI断片（3.7kb及び5.1k
b）の末端に付加されたEcoRIリンカーのみならず、5.1k
b断片の内部のEcoRI部位をも切断し、3.9kg及び1.2kbの
断片を生成せしめる。3.7kb及び3.9kbの断片を、９０mM
Tris-HCl(pH8.3)、９０mM硼酸、及び2.5mMEDTA中0.８％
低融アガロースゲル（シグマ）により1.2kb断片から分
離する。DNAバンドをエチジウムクロリドにより染色
し、そして長波長UV光線により３６６nmにおいて観察す
る。3.7kb及び3.9kbの２つの大DNA断片は分離しない。
これらを１つのゲル片に含まれた状態で切り取り、例４
ａに記載した方法により抽出する。
EcoRI接着末端を有する線状断片を連結により環化す
る。約0.２５μｇの断片を、６０mMTris(pH7.5)１０mMM
gCl2、１０mMDTT、１mMATP、及び６００ＵのT4DNAリガ
ーゼを含有する溶液１００μ中で１５℃にて４時間連
結する。
連結混合物の１０μのアリコートを１００μのカル
シウム処理された形質転換受容能力を有するＥ．コリHB
101細胞（例４ａ参照）に加える。形質転換されたampR
コロニーを、それぞれ別々に、１００μｇ／ｍのアン
ピシリンを含有するLB培地中で増殖せしめる。プラスミ
ドDNAをホルメス等(50)の方法に従って調製し、そしてE
coRI/BamHI二重分解により分析する。
(c)EcoRIリンカー付加部位を決定するためのヌクレオチ
ド配列分析 ３５コロニーのほとんどは、各DNA分子のBa131分解の程
度に応じて、PHO5プロモーター領域におけるEcoRIリン
カーの付加位置が相互に異る。ヌクレオチド配列分析の
ために、プラスミドDNAをEcoRIにより分解する。フエノ
ール／クロロホルムにより抽出した後、制限処理された
DNAをエタノールにより沈澱せしめる。例１０Edに記載
した方法によりDNAを脱燐酸し、そして５′末端をラベ
ルする。ラベルされたDNA断片を第２の制限エンドヌク
レアーゼBamIにより切断する。生成物を0.８％低融アガ
ロースにより分離する。0.5〜0.6kbの５′ラベルEcoRI-
BamHI断片を例４ａに記載した方法により低融アゴロー
スから分離する。EcoRIランカーに隣接しているヌクレ
オ配列を決定するために種々のDNA断片を化学的に分解
し、そして生成物をマクサム及びジルバートの方法(15)
に従ってポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離す
る。
種々のクローン及びPHO5配列の対応する最後のヌクレオ
チドの部位（この後にEcoRIリンカーが続く）を第４表
に示す）さらに第３２図を参照のこと）。
(b)PHO5/Rプロモーターを含有する0.53kbBamHI-EcoRI断
片の分離 プラスミドpRは５３４bpBamHI-EcoRI断片上にPHO5/Rプ
ロモーターを含有する。第３ａ図のナンバリングによれ
ば、断片はヌクレオチド−541(BamHI部位)からヌクレオ
チド−１０までのPHO5プロモーター配列をカバーする。
ヌクレオチド−１０（例２４ｂ）に連結されたEcoRIリ
ンカーはEcoRI切断において２つのＧ残基に寄与する。
プラミドpRを制限エンドヌクレアーゼBamHI及びEcoRIに
より分解する。例４ａの方法に従って0.53kbBamHI-EcoR
I断片を0.８％低融アガロースゲルにより分離する。ヌ
クレオチド配列を第３３図に示す。
同様にして、プラスミドpYを分解し、PHO5/Yプロモータ
ーを含有する0.53kbBamHI-EcoRI断片を分離する。ヌク
レオチド配列を第３４図に示す。
(e)新しい構成のSalI-EcoRI断片によるプラスミドp31中
のSalI-EcoRI断片の置換 ５μｇのプラスミドp31（例１３ｄ参照）を制限エンド
ヌクレアーゼSalIにより分解する。制限分解されたDNA
をエタノールで沈澱せしめ、そして１００mMTris(pH7.
5)、５０mMNaCl2、５mMMgCl2を含有する溶液５０μに
再懸濁する。DNAをEcoRIにより完全分解する。制限断片
を、トリス−ボレート-EDTA緩衝液（pH8.2）中0.８％低
融アガロースゲルにより分離する。DNAバンドを含有す
るゲル小片中に3.5kbDNA断片を分離する。
５μｇずつのクローンpR及びpY（第４表及び第３２表参
照）を前記と同様にしてSalI及びEcoRIにより分解す
る。低融アガロースゲル小片中に0.8kbDNA断片を分離す
る。
ベクターp31の3.5kbSalI-EcoRI断片0.67μｇを、プラス
ミドpR又はpYの0.8kbSalI-EcoRI断片0.34μｇのそれぞ
れに連結する。DNA断片を含有する適当なゲル片を混合
し、そして６５℃において溶融する。液化したゲルを３
倍に稀釈する。６０mMTrispH7.5、１０mMMgCl2、１０mM
DTT、１mMATD及び７５００のＴ４DNAリガーゼ（バイオ
ラブス）を含有する全容２４０μの溶液中で、１５℃
にて一夜連結を行う。各連結における２μのアリコー
トを、カルシウム処理された形質転換受容能を有する
Ｅ．コリHB101細胞（例４ａ参照）１００μに加え
る。
８個の形質転換されたampRコロニーを、それぞれ別々
に、１００μｇ／ｍのアンピシリンを含有するLB培地
に増殖せしめる。プラスミドDNAを制限分析により分析
する。各群のクローンは同じである。各１クローンをさ
らに使用する。これらをそれぞれp31/R又はp31/Yと称す
る（第３１図）。
例２５ プラスミドp31/R又はp31/Yへのリンパ芽球性イ
ンターフェロンα−3DNAの挿入（第３５図） この形成法においては、PHO5プロモーター領域を成熟イ
ンターフェロン−α−３をコードする遺伝子に連結す
る。PHO5又はインターフェロンの信号配列は存在しない
が、連続部位に導入されたEcoRIリンカーが存在する。
プラスミドp31/R（例２４ｅ参照）はPHO5プロモーター
配列を含有し、この配列は酸性ホスファターゼ遺伝子の
ATGの前９ヌクレオチドにおいてEcoRIリンカー５′−GG
AATTCC-3′により終る。プラスミドCG-pBR322/HLycIFN
(α-3)-252（例２３参照）中のリンパ芽球性インターフ
ェロン−α-3遺伝子を、PHO5プロモーター中のEcoRIリ
ンカーに連結するために特に整える。成熟インターフェ
ロンα-3コード配列の５′末端に追加のヌクレチオドに
よって、EcoRI制限部位、及びインターフェロン遺伝子
の翻訳に必要なATGを得る（第２９図参照）。本質上同
じ方法によりプラスミドp31/Y（例２４ｅ参照）を用い
る形成を行うことができる。
(a)EcoRI切断脱燐酸プラスミドp31/Rの調製 ５μｇのプラスミドp31/Rを制限エンドヌクレアーゼEco
RI（ベーリンガー）により完全に分解する。フェノール
／クロロホルムを用いて抽出した後、エタノールにより
DNAを沈澱せしめ、そして１００μの５０mMTris(pH8.
0）に再懸濁する。DNAをセレックス１００（ビオラド）
を通過せしめた後、子牛腸アルカリホスファターゼ（ベ
ーリンガー）により脱燐酸し、そして脱燐酸したDNAをD
E52イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。こ
れらは第１４ｂに記載した方法により行う。DNAを１０m
MTris・HCl(pH7.5)、１mMEDTAを含有する溶液に0.2mg/m
の濃度に再懸濁する。
(b)プラスミドCG-pBR322/HLycIFN(α-3)-252のIFN-α-3
コード配列を含有する0.6kbEcoRI断片の分離 １０μｇのプラスミドCG-pBR322/HLycIFN(α-3)-252を
制限エンドヌクレアーゼEcoRIにより分解する。分解に
より3.8kb及び0.6kbの２つの断片が生ずる。0.6kb断片
はインターフェロン−α-3コード領域を含有する。断片
を、Tirs-ボレート-EDTA緩衝液中0.6%低融アガロースゲ
ルにより分離する0.6kbDNA断片を含有するゲル片をゲル
から切り取り、そして連結に使用する。
(c)線状化脱燐酸化p31/RDNAとIFN-α-3DNAの0.6kbEcoRI
断片との連結 EcoRIで切断され脱燐酸化p31/YベクターDNA1.5μｇを、
IFN-α-3の0.6kbEcoRI断片0.19μｇと連結する。後者の
断片は低融アガロースゲルの小片に含まれており、この
小片は６５℃で溶融する。液化ゲルを２倍に稀釈する。
連結は、６０mMTris(pH7.5)、１０mMMgCl2、１０mMDT
T、１mMATPを含有する全容２２０μの溶液中で、８０
０ＵのＴ４DNAリガーゼ（バイオラブス）を用いて１５
℃にて一夜行う。連結混合物の１０μのアリコート
を、カルシウム処理した、形質転換受容能力を有する
Ｅ．コリHB101細胞（例４ａ参照）１００μに加え
る。
６個の形質転換されたampRコロニーを、それぞれ別々
に、１００μｇ／ｍのアンピシリンを含有するLB培地
に増殖せしめる。プラスミドDNAをホルメス等(50)に方
法に従って調製し、そしてBg1II/BstEIIより二重分解す
ることにより挿入部の方向及び大きさを決定する。これ
らのコロニーの１つをp31R/IF(α-3)と称する。
p31/y（例２４ｅ参照）を用いて同様の形成を行う。６
個の形質転換されたampRコロニーからのプラスミドを分
析す。２つのクローンが正しい方向の挿入部を有する。
その１つをp31Y/IF(α-3)と称する。
例２６ プラスミドp31/Rへのリンパ芽球性インターフ
ェロンα-2DNAの挿入（第３６図参照） この形成においては、PHO5プロモーターを成熟インフー
フェロン−α-2コード領域に連結する。
(a)ベクターp31/Rの3.9kbHindIII-EcoRI断片の分離 １０μｇのベクターp31/RをHindIIIにより完全分解す
る。0.1容量の1MTris(pH7.5)を用いて緩衝調整する。次
に、HindIIIで切断したp31/RDNAをEcoRIにより分解す
る。3.9kbHindIII-EcoRI断片を、0.8％低融アガロース
ゲルからゲル片として分離する。
(b)pJDB207/IF2(51)の0.9kbXbaI-HindIII断片の分離 ５μｇのプラスミドpJDB207/IF2(51)（例１７参照）
を、HindIIIにより完全分解する。0.1容量の1MTris(pH
7.9)により緩衝調整する。次に、HindIII切断プラスミ
ドをXbaIにより分解する。0.9kbXbaI-HindIII断片はイ
ンターフェロン−α-2コード配列の一部分及び下流のPH
O5転写停止信号を含有する。0.9kb段弁を0.8％低融アガ
ロースゲルにより分離し、そしてゲルを切り取る。
(c)プラスミドCG-pBR322/HLycIFN(α-2)-261のIFN-α-2
コードの配列の一部分を含有する２５２bpEcoRI-XbaI断
片の分離 １０μｇのプラスミドCG-pBR322/HLycIFN(α-2)-261
（例２３参照）を、６mMTris(pH7.9)、１５０mMNaCl、
６mMMgCl2及び６mMメルカプトエタノールを含有する１
００μの溶液中で、XbaIにより分解する。XbaIによる
完全分解の後、線状化プラスミドDNAを３ＵのEcoRI（ベ
ーリンガー）により部分分解する。３７℃にて２０分間
置いた後−７０℃に凍結することにより分解を停止す
る。DNA断片を、TRIS-ボレート-EDTA緩衝液(pH8.3)中1.
5％アガロースゲルにより分析する。２５２bpEcoRI-Xba
I断片は、成熟インフーフェロン−α-2コード配列の
５′部分（XbaI部位まで）をPHO5プロモーターと連結す
るための特異リンカーと共に含有する。２５２bp断片
は、0.8％低融アガロースゲルからゲル小片中に分離す
る。
(d)DNA断片の連結 例２６ａ〜ｃに記載した、適当な接着末端を有する３種
のDNA断片を１反応によって連結する。
ベクターp31/Rの3.9kbHindIII-EcoRI断片0.67μｇ、pJD
B207/IF2(51)の0.9kbXbaI-HindIII断片0.16μｇ、及びC
G-pBR322/HLycIFN(α-2)261の250bpEcoRI-XbaI断片約70
ngを連結する。これら３つのDNA断片はいずれも低融ア
ガロースのゲル小片中に含まれている。３片のアガロー
スゲルを一緒にし、６５℃にて溶融し、そして３倍に稀
釈する。連結は、６０mMTris(pH7.5)、１０mMMgCl2、１
０mMDTT、１mMATDを含有する全容４５０μの溶液中
で、１２００ＵのT4DNAリガーゼを用いて１５℃にて１
６時間行う。連結混合物のアリコート１０μをカルシ
ウム処理された形質転換受容能を有するＥ．コリHB101
細胞（例４ａ参照）１００μに加える。
１２個の形質転換されたampRコロニーを、それぞれ別々
に、１００μｇ／ｍのアンピシリンを含有するLB媒地
に増殖せしめる。ホルメス等の方法(50)によってプラス
ミドDNAを調製し、BamHI/HindIIIによって二重分解する
ことにより分析する。すべてのコロニーは同一の分解パ
ターンを示す。これらの１つをp31R/IF(α-2)と称す
る。
pJDB207/IF2(51)の0.9kbXbaI-HindIII断片の代りに、プ
ラスミドpJDB207/IF2(51)Δ72又はpJDB207/IF2(51)Δ82
（例２２参照）の0.5kbXBaI-HindIII断片を使用して連
結を行うこともできる。又、ベクターp31/Rの3.9kbHind
III-EcoRI断片の代りに、ベクターp31/Yの3.9kbHindIII
-EcoRI断片を用いて連結を行うこともできる。
DNA断片の連結及びＥ．コリHB101の形質転換の条件は前
記の通りである。
各連結の形質転換されたampRコロニー１２個ずつを、そ
れぞれ別々に、１００μｇ／ｍのアンピシリンを含有
するLB培地中に増殖せしめる。プラスミドDNAをBamHI/H
indIII二重分析により分析する。こうして得られたクロ
ーンをp31R/IF(α-2)Δ72、p31R/IF(α-2)Δ82、p31Y/I
F(α-2)、p31Y/IF(α-2)Δ72、及びp31Y/IF(α-2)Δ82
と称する。
例２７ プラスミドp31/Rへのリンパ芽球性インターフ
ェロンα-1の挿入（第３７図参照） (a)ベクターp31/Rの3.9kbHindIII-EcoRI断片の分離 例２６ａに記載した方法に従って、１０μｇのベクター
p31/RをHindIII及びEcoRIを用いて分解する。生成した
0.4kb及び3.9kbの断片を調製用0.8％低融アガロースゲ
ルにより分離する。例４ａに記載した方法に従ってゲル
から3.9kbHindIII-EcoRI断片を溶出する。DNAをDE50
（ワットマン）イオン交換クロマトグラフィー（例５ａ
参照）により精製し、エタノールで沈澱せしめ、そして
0.1mMTris(pH8.1)及び１mMEDTAを含有する溶液中に0.1m
g/mの濃度に再懸濁する。
(b)pJDB207/IF2(1′b)の0.9kbPyuII-HindIII断片の分離 ５μｇのプラスミドpJDB207/IF2(1′b)（例１７参照）
をPvuII及びHindIIIにより分解する。生成する断片0.9k
b及び7.3kbを0.8％調製用低融アガロースゲルにより分
離する。0.9kbの断片をゲルから溶出し、そして例２７
ａに記載した方法に従って精製する。DNAを１０mMTris
(pH8.0)及び１mMEDTAを含有する溶液中に0.05mg/mの
濃度で再懸濁する。
(c)プラスミドCG-pBR322/HLycIFN(α-1)-258のIFN-α-1
コード配列の一部を含有する286bpEcoRI-PvuII断片の分
離 １０μｇのプラスミドCG-pBR322/HLycIFN(α-1)-258
（例２３参照）をPvuII及びEcoRIにより分解する。286b
p制限断片を、調製用0.8％低融アガロースゲルにより4.
2kb断片から分離する。286bpEcoRI-PvuIIを例２７ａに
記載した方法に従ってゲルから溶出しそして精製する。
DNAを１０mMTris(pH8.0)及び１mMEDTAを含有する溶液に
0.03mg/m濃度で再懸濁する。
(d)DNA断片の連結 ベクターp31/Rの3.9kbHindIII-EcoRI断片0.5μｇ、pJDB
207/IF2(1′b)の0.9kbPvuII-HinbIII断片の0.25μｇ、
及びプラスミドCG-pBR322/HLycIFN(α-1)-258の286bpEc
oRI-PvuII断片0.1μｇを、６０mMTris(pH7.5)、１０mMM
gCl2、１０mMDTT、４mMATP及び６００ＵのDNAリガーゼ
を含有する溶液２０μ中で、１５℃にて１６時間連結
する。連結反応混合物のアリコート３μを、カルシウ
ム処理された形質転換受容能力を有するＥ．コリHB101
細胞（例４ａ参照）１００μに加える。
形質転換されたampRコローー１２個を、それぞれ別々
に、１００μｇ／ｍのアンピシリンを含有するLB培地
に増殖せしめる。プラスミドBamHI/HindIII二重分解に
より分析する。1.4kbのBamHI断片及び390bpBamHI-HindI
II断片を生ずる１クローンをさらに分析し、そしてp31R
/IF(α-1)と称する。
ベクターp31/Rの3.9kbHindIII-EcoRI断片の代りにベク
ターp31/YのHindIII-EcoRI断片を用いることもできる。
又、pJDB207/IF2(1′b)の0.9kbPvuII-HindIII断片の代
りにpJDB207/IF2(1′b)Δの0.45kbPvuII-HindIII断片を
使用して連結を行うこともできる。生成したクローンを
前記のように分析する。これらのクローンをp31R/IF(α
-1)Δ、p31Y/IF(α-1)及びp31Y/IF(α-1)Δと称する。
例２８ 高コピー数酵母ベクターpJDB207への遺伝子構
成物のサブクローニング（第３８図参照） 例２５〜２７に記載した構成物はPHO5プロモーター、種
々のインターフェロンコードを領域及びPHO5転写停止信
号を縦列的に含み、すべてpBR322誘導ベクターに挿入さ
れている。上記一連の配列をすべて含有するSalI-HindI
II断片を、例１７に記載したようにしてpJDB207の6.2kb
SalI-HindIII断片に連結する。
２μｇのプラスミドp31R/IF(α-3)を制限エンドヌクレ
アーゼSa1I及びHindIIIにより分解する。制限断片を調
製用0.8％低融アガロースゲルにより分離する。小断片
（1.8kbの大きさ）を含むゲルを切り取る。
プラスミドpJDB207を制限エンドヌクレアーゼSa1I及びH
indIIIにより分解し、そして例１７に記載した方法に従
って6.2kbの大断片を分離する。
例１７に記載した方法に従ってDNA断片の連結及び受容
能力を有するＥ．コリHB101細胞の形質転換を行う。８
個のampRコロニーを、それぞれ別々に、１００μｇ／ｍ
のアンピシリンを含有するLB培地に増殖せしめる。プ
ラスミドDNAの挿入部の大きさを、制限エンドヌクレア
ーゼHindIII及びSa1Iを用いる切断により分析する。正
しい挿入部を有する１つのクローンを選択し、そしてpJ
DB207R/IF(α-3)と称する。
同様にして、プラスミドp31Y/IF(α-3)、p31Y/IF(α-
2)、p31R/IF(α-2)Δ72、p31R/IF(α-2)Δ82、p31Y/IF
(α-2)、p31Y/IF(α-2)Δ72、p31Y/IF(α-2)Δ82、p31R
/IF(α-1)、p31R/IF(α-1)Δ、p31Y/IF(α-1)及びp31Y/
IF(α-1)Δから出発して、次のプラスミド、すなわち、 pJDB207Y/IF(α-3)、 pJDB207R/IF(α-2)、 pJDB207R/IF(α-2)Δ72、 pJDB207R/IF(α-2)Δ82、 pJDB207Y/IF(α-2)、 pJDB207Y/IF(α-2)Δ72、 pJDB207Y/IF(α-2)Δ82、 pJDB207R/IF(α-1)、 pJDB207R/IF(α-1)Δ、 pJDB207Y/IF(α-1)、及び pJDB207Y/IF(α-1)Δ を得る。
例２９ サッカロミセス・セレビシエーAHA220の形質転
換及びインターフェロン生産の誘導 プラスミド、pJDB207/IF2(51)Δ72、pJDB207/IF2(51)Δ
82、pJDB207/IF2(1′b)Δ、pJDB207R/IF(α-3)、pJDB20
7Y/IF(α-3)、pJDB207R/IF(α-2)、pJDB207R/IF(α-2)
Δ72、pJDB207R/IF(α-2)Δ82、pJDB207Y/IF(α-2)、pJ
DB207Y/IF(α-2)Δ72、pJDB207Y/IF(α-2)Δ82、pJDB20
7R/IF(α-1)、pJDB207R/IF(α-1)Δ、pJDB207〔/IF(α-
1)及びpJDB207〔/IF(α-1)Δのそれぞれを、サッカロミ
セス・セレビシエーAH220株（a,trpl,leu2-3,leu2-112,
his3 、pho5,pho3）に、ヒンネン等(1)の方法に従って形
質転換する。形質転換された酵母細胞をロイシンを含有
しない酵母最少培地プレート上で選択する。単一の酵母
コロニーを拾い上げ、そして例７に記載した方法に従っ
て増殖せしめる。これらの酵母コロニーを、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207/IF2(51)
Δ72、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207/IF2(51)
Δ82、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207/IF2(1′
b)Δ、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207R/IF(α-
3)、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207Y/IF(α-
3)、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207R/IF(α-
2)、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207R/IF(α-
2)Δ72、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207R/IF(α-
2)Δ82、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207Y/IF(α-
2)、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207Y/IF(α-
2)Δ72、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207Y/IF(α-
2)Δ82、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207R/IF(α-
1)、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207R/IF(α-
1)Δ、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207Y/IF(α-
1)、サッカロミセス・セレビシエー AH220/pJDB207Y/IF(α-
1)Δ と称する。
例３０ サッカロミセス・セレビシエーGRF18株の形質
転換及びインターフェロン生産の誘導 例２９に記載した方法と同様にして、例２９に列挙した
プラスミドによりサッカロミセス・セレビシエーGRF18
株、（α、his3-11,his3-15,leu2-3,Leu2-112,canR ）を
形質転換する。これらの酵母を、 サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207/IF2(51)
Δ72、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207/IF2(51)
Δ82、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207/IF2(1′
b)Δ、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207R/IF(α-
3)、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207Y/IF(α-
3)、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207R/IF(α-
2)、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207R/IF(α-
2)Δ72、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207R/IF(α-
2)Δ82、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207Y/IF(α-
2)、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207Y/IF(α-
2)Δ72、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207Y/IF(α-
2)Δ82、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207R/IF(α-
1)、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207R/IF(α-
1)Δ、サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207Y/IF(α-
1)、及びサッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207Y
/IF(α-1)Δ と称する。
例３１ 酵母細胞抽出液の調製及びインターフェロン力
価の測定 細胞濃度１〜２×１０７／ｍの培養液５０ｍ中の細
胞を、ソルバルGSAローターを用いて3000rpmにて１０分
間遠心分離することにより集める。細胞を２ｍの0.1M
KH2PO4(pH7.4)に再懸濁し、そして湿温にて５分間3000r
pmにおいて遠心分離する。沈澱した細胞を氷冷した1.2m
の分解混液〔0.1Ｍ燐酸緩衝液（pH7.4）、１（Ｖ／
Ｖ）％のトリトンＸ−１００、0.1mMPMSF（メルク）〕
に再懸濁し、そして３０ｍのコレックスチューブに移
す。1.6gのガラスビーズ（直径0.4mm）を細胞に加え、
そして懸濁液をボルテックスミキサー（Vortex Mixer）
（サイエンティフィック インストルメンツ、米国上
で、最高速度で３０秒間振とうし、そして氷浴中で１分
間冷却する。この振とう操作を、９０％より多くの細胞
が破壊されるまで（光学顕微鏡により監視する）５〜１
０回反復する。
ソルバルHB-4ローターを用いて、8000rpm、４℃にて１
０分間遠心分離することにより細胞の破片及びガラスビ
ーズを除去する。上澄液をエッペンドルフチューブに移
し、液体窒素により冷結し、そして、−６０℃にて貯蔵
する。ヒト−CCL-23細胞及び攻撃ウイルスとして小水疱
性口内炎ウイルス（VSV）を用い、アームストロングの
方法(32)に従って、インターフェロン活性を測定する。
結果を第５表に示す。
組換プラスミドにより形質転換された後にS.セレビシエ
ーAH220株及びGRH18株におけるインターフェロン活性は
一般に同じである。第６表は、表に記載したプラスミド
により形質転換した後の両株のインターフェロン活性の
比較を示す。
例３２ 酵母サッカロミセス・セレビシエーの組換株に
よる３００規模でのインターフェロン−α−２株の生
産サッカロミセス・セレビシエー GRF18/pJDB207R/IF(α-
2)Δ82株は、宿生生物中におけるプラスミドの選択的保
持を可能にするロイシンマーカー、ヒト−インフータェ
ロン−α−２の構造遺伝子、及び限定された量の無機燐
酸塩を含有する培地中でIFN-α-2遺伝子を発現せしめる
ことができる酸性ホスファターゼPHO5プロモーターを含
有するプラスミドを担持している。
ロイシンを含有しない限定培地により調製した寒天スラ
ント上に菌株を維持することによりプラスミドの保持を
確保する。新しく接種したスラントを３０℃にて２４時
間インキュベートする。スラント上の表面培養物を３ｍ
の前培養培地に懸濁し、次にこれを第１前培養振とう
フラスコに移す。５００ｍのフラスコは、１個のバッ
フルを有し、次の組成を有する１００ｍの前培養培地
を収容する。培地組成（ｇ／）：酵母エキストラクト
（ディフコ）＝１０．０、Ｌ−アスパラギン＝6.6、KH2
PO4＝1.0、MgSO4・7H2O＝1.0、Ｌ−ヒスチジン−0.０
２、及びＤ−グルコース（−水和物）＝33.0。脱イオン
水を用いて調製された培地のpHは約6.0である。グルコ
ースは別途雑菌する。第１前培養物を、５cmの工程と２
５０rpmの速度を有する回転振とう機上で３０℃にて２
４時間インキュベートする。
第１前培養フラスコから第２前培養フラスコ用の種母を
得る。第２前培養フラスコには１（Ｖ／Ｖ）％の種母を
加える。培地及び培養条件は第１前培養のそれと同一に
する。３６本のフラスコからの培養液を一緒にし、主生
産発酵槽用の１（Ｖ／Ｖ）％の種母に用いる。
生産発酵槽は全容５００であり、４枚の邪魔板と直径
２３０mmの６枚羽根ディスクターピン攪拌機１本を有す
る。攪拌速度は４５０rpm、0.3バール加圧とし、通気速
度を１Ｖ／Ｖ／分とする。発酵槽には次の組成の培地を
３００収容する。培地組成（ｇ／ｌ）：Ｌ−アスパ
ラギン＝2.0、Ｌ−ヒスチジン＝0.０２、KH2PO4＝0.０
３、MgSO4・7H2O＝0.０５、NaCl＝0.1、CaCl2・2H2O＝0.
1、KCl＝1.0、Ｄ−グルコース（−水和物）＝２０．
０、ビタミン溶液＝５ｍ／、及び微量元素溶液＝５
ｍ／。培地のpHはNaOHにより雑菌前に7.2に調製す
る。グルコース、ビタミン及び微量元素は別々に雑菌
し、そして培地に加える。ビタミン及び微量元素のスト
ック溶液は次の組成を有する。ビタミン（ｇ／）：ビ
オチン＝0.0002、Ｄ−パントテン酸カルシウム＝0.００
４、葉酸＝0.0002、ニコチン酸＝0.０４、ｐ−アミノ安
息香酸＝0.02、塩酸ピリドキシン＝0.０４、リポフラビ
ン＝0.02、塩酸チアミン＝0.０４、及びイノシトール＝
0.2（脱イオン水使用）。微量元素（ｇ／）：硼酸＝
0.０５、CuSO4・5H2O＝0.００４、KI＝0.０１、FeCl3・6H
2O＝0.０２、MnSO4・4H2O＝0.０４、Na2MoO4・2H2O＝0.０
２、及びZnSO4・7H2O＝0.０４（脱イオン水使用）。発酵
温度は３０℃とする。pHは約4.0〜4.2に低下するが、必
要があれば水酸化ナトリウムにより中性に調整すること
ができる。約１８時間の発酵の後、インターフェロンの
収量が最高に達する〔アームストロングの方法(32)に従
って測定〕。光学濃度（約2.0に達する）及び酸性ホス
ファターゼ活性は発酵の進行の有用な標識となる。必要
があれば、酵母細胞をを集める前に発酵液を１０℃に冷
却することができる。
例３３ HLyIFN−α−２の分離及び精製 (a)モノクローン抗体カラムに適用するポリペブチド溶
液の調製 全容６００のpH4.1の培養液を１０℃に冷却する。ア
ルファーラバル（AIfa-Laval）BRPX-２０７スラッジ除
去用遠心分離機を用いて細胞を分離する。透明な上澄液
はIFN活性を有しない。細胞に担持された残留液は、２
０の分解緩衡液Ａ〔１００mMKH2PO4，５００mMNaCl、
0.1（Ｖ／Ｖ）％トリトンＸ−１００ 、及び0.1mMPMSF
（KOHによりpH7.5に調整）〕で洗浄することにより除去
する。遠心分離機ボウルの内容物を十分に排出し、そし
てスラッジ除去器を５の分解緩衡液Ａにより１回洗浄
する。得られた細胞を６０の緩衝液Ａにより稀釈す
る。7.3のpH値を有する。懸濁液を５〜１０℃に冷却
し、そして１００／時の供給速度でDYNO −Mi11(KD5
型)を通す。粉砕機にはポリウレタン攪拌ディスク及び
４２００ｍのガラスビーズ（直径0.5〜0.75mm）を入
れ、１６２５rpmで運転する。破砕された細胞懸濁液（p
H〜7.3）を前記のようにして遠心分離する。上液７５
を限外過により３に濃縮する。このポリペプチド溶
液のアリコート（300m）を、アミコン（Amicon）DC-2
ホローフィブルシステム（Hollow Fibre System）を用
いてHIP１００ホロー（Hollow）過遠心機を通過せし
める。さらに２の緩衡液系Ｂ〔３０mMTris-HCl、５０
０mMNaCl、pH8.5に調整）を過機に適用する。一緒に
した液及び洗浄液（２）を、HIP１０ホロー過遠
心機により１００ｍに濃縮する。濃縮液をDEAE-Trisa
cryl MDEAE(LKB社)のカラムに吸着せしめる。カラムを
洗浄し、そして緩衡液Ｃ〔２００mMNaCl、２５mMTris・H
Cl(pH8.5)〕により溶出する。溶出液は、アームストロ
ングの方法(32)により測定した場合1.4×106／mgポリペ
プチドのインターフェロン測定を有する。
(b)モノクローン抗体カラムによるヒト−LyIFN−α−２
の精製 モノクローン抗体カラム〔セルテク（CELLTCE）英国〕
（ベッドボリウム２０ｍ）を、２０mMNa-ホスフェー
ト、１５４mMNaCl(pH 7.4)により平衡化し、そして上記
ポリペプチド溶液を５０ｍ／時の速度で室温において
カラムに適用する。非吸着ポリペプチドを含有する第１
分画及び１００ｍのPBS洗浄液を廃棄する。さらに非
特異的結合ポリペプチドを、追加の0.5MNaCl及び0.2％T
ritonX100 を含有するPBS１００ｍにより溶出する。
カラムを、２０mMNa−ホスフェート、0.3MNaCl(pH7.4)
を含有する溶液２００ｍで洗浄し、この後特異的に吸
着したポリペプチドを５０ｍの緩衡液Ｄ〔0.1Ｍクエ
ン酸、0.3MNaCl(pH2.0)〕により溶出する。この溶液のp
Hを2NNaOHにより6.3に調整し、そして４℃にてイマージ
ブルーCXTM分子分離器（ミリポア ）により濃縮する。
濃縮物を、0.025Mヒスチジン・HCl(pH6.3)で平衡にした
セファデックスＧ−２５ 微細カラム（2.6×34cm、２
００ｍベッドボリウム）に適用する。カラムを、同じ
ヒスチジン・HCl緩衡液を用いて４℃にて４２ｍ／時
の流速で溶出する。１０．５ｍずつの２０分画を集め
る。ポリペプチド含有分画を２８０nmにおける光吸着に
より検知する。分画７及び８に、IFN活性を有するポリ
ペプチドが含まれる〔アームストロング(32)の方法によ
り測定〕。LyIFN-α−２を含有する活性区分を−２０℃
にて次に使用するまで貯蔵する。分画のIFN活性は1.8×
１０８IU/mgポリペプチドである(32)。
上記の分画を凍結乾燥することにより１ｍの溶液から
２０〜４０μｇのポリペプチドが得られる。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により〔(53)参
照〕得られたLyIFN−α−２の分子量は約１８Ｋダルト
ンであることが示される。
例３４ 形質転換された酵母細胞による培地へのインタ
ーフェロンの分泌 蛋白質分泌にするＮ−末端蛋白質信号配列の効果を測定
するために、酵母Ｓ・セレビシエーGRF18/pJDB207/IF(8
1′)株（雑種信号配列を含有する、例１７参照）、及び
酵母Ｓ・セレビシエーGRF18/pJDB207R/IF(α-3)、（信
号配列を有しない）を、例２８に記載した方法に従って
増殖せしめる。培地に存在する生産されたインターフェ
ロンの量及び細胞抽出液（例３１に記載した方法に従っ
て調製）中に存在するインターフェロンの量を測定し、
そして結果第７表に示す。
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ication segment”，ヨーロッパ特許出願45573(The boa
rd of trustees of Leland Stanford Junior Universit
y) 10.“Plasmidvektoren,Hybridplasmide und ihre Verwe
ndung zur Herstellung von Proteinen”，独国出願公
開2923297(Institut Pasteur) 11.“Procede de production de proteines par expres
sion des genes correspondants dans des microorgani
smeset vecteurs susceptibles detre misen oeuvre da
ns de tels precedes”，フラン国特許出願2458585(Ins
titut Pasteur) 12.M.Aigle等，“Nouveaux plasmides hybrides et mic
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は次の意味を有する。
それぞれの図面に示されている記号は、例１０に記載さ
れている最も密接な従来技術の文献と比較されている。
他の図面において使用されている記号は次の意味を有す
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、PHO5遺伝子の分離源として、又はDNA配列決
定のために使用したプラスミドpJDB207/PHO5，PHO3、及
びpBR322/PHO5/Bam-Salの部分的な制限エンドヌクレア
ーゼ地図であり、 第２図は、酵母遺伝子試料集団から分離された5.1Kb Ba
mHI断片中の（抑制的）PHO5及び（構成的）PHO3酸性ホ
スファターゼ遺伝子の位置付けを示し、 第３ａ図及び３ｂ図は、それぞれ、PHO5プロモーター領
域を含むPHO5のBamHI-Sa1I制限断片のヌクレオチド配
列、及びPHO3プロモーター領域を含むPHO3のPstI-RsaI
制限断片のヌクレオチド配列を示し、 第４図は、雑種プラスミドp30IFN2(81′)、及びp30IFN
2′（８１′）の形成を示す略図であり、 第５図は、プラスミドp30IFNI(81′)の形成におけるPHO
5プロモーターDNAとIFF-81′cDNAとの連結（PHOHプロモ
ーターDNAとCG-pBR322/HLycIFN-81′のcDNA挿入部との
連結）を示し、図中、(a)はPHO5プロモーター、及び隣
接する蛋白質コード領域を含むDNA部分であり、(b)はイ
ンターフェロンプロモーター、及び隣接する蛋白質コー
ド領域を含むDNA部分であり、そして(c)はｐ３０IFNI(8
1′)中(a)及び(b)の融合生成物のDNA部分、並びにこれ
により生成するインターフェロンポリペプチドのＮ−末
端配列であり、 第６図はプラスミドpJDB207/IFN2′(81′)の形成の概略
を示し、 第７図は、ナマルワ（Namalwa)cDNAを含む組み換えDNA
分子の形成の概略を示し、 第８図は、α１及びβIFNmRNAに相補的なDNAプライマー
（１３連）の合成に使用される技法を示し、 第９図は、Hu1IFN-β及びHuIFN-αに特異なプローブの
合成、並びにヒト−リンパ芽球性IFNcDNA含有クローン
の同定のための該プローブの使用の概略を示し、 第１０図〜第１４図は、それぞれ組み換えプラスミドDN
AであるCG-pBR322/HLycIFN-1′ｂ、CG-pBR322/HLycIFN-
β１、CG-pBR322/HLycITF-41、CG-pBR322/HLycIFN-
81′、及びCG-pBR322/HLycIFN-51のcDNA挿入部のDNA配
列、並びに対応するアミノ酸配列を示し、 第１５図はプラスミドCG-pBR(AP)/LyIFN-α−１の形成
を示し、 第１６図は、第１５図に示すCG-pBR(AP)/LyIFN-α-1のc
DNA挿入部のDNA配列、及びアミノ酸配列を示し、 第１７図は、プラスミドCG-pBR(AP)/LyIFN-α-3の形成
を示し、 第１８図は、第１７図に示すプラスミドのcDNA挿入部の
DNA配列及びアミノ酸配列を示し、 第１９図は、プラスミドCG-pBR(AP)/LyIFN-α-2のcDNA
挿入部のDNA配列及びアミノ酸配列を示し、 第２０図は、PHO5停止断片を含有する発現プラスミドp3
1の形成の概略を示し、 第２１図は、Sau3A-PstI PHO5転写停止断片のヌクレオ
チド配列を示し、 第２２図は、プラスミドp31/IF1(51)、p31/IF2(51)、p3
1/IF3(51)、及びp31/IF2(1′b)の形成（IFN-51及びIFN
1′ｂをコードする配列のプラスミドp31への挿入）の概
略を示し、 第２３図は、発現プラスミドp31/IF(81′)の形成の概略
を示し、 第２４図は、プラスミドpBR322/PHO5/HBVsΔ14における
正しいPHO5-HBVs連結の形成の概略を示し、 第２５図は、プラスミドpBR322/PHO5/HBVsにおけるPHO5
プロモーターとHBVs蛋白質をコードする領域との融合点
の付近DNA配列を示し、 第２６図は、酵母発現プラスミドpJDB207/PHO5/HBVsΔ1
4、及びpJDB207/PHO5/HBVsΔ14tの形成を示す概略であ
り、 第２７図は、酵母発現プラスミドpJDB207/IF2(1′b)
Δ、及びpJDB207/IF2(51)Δ72の形成を示す略図であ
り、 第２８図は、IFN-51の３′非翻訳領域とPHO5転写停止領
域との間のXhoI連結の付近におけるプラスミドpJDB207/
IF2(51)Δ72及びpJDB207/IF2(51)Δ82のヌクレオ配列を
示し、 第２９図は、ポータブルなヒト−リンパ芽球IFN-α-3cD
NA挿入部を含有する雑種プラスミドCG-pBR322/HLycIFN
(α-3)-252の形成を示す略図であり、 第３０図は、雑種プラスミドCG-pBR322/HLycIFN(α-2)-
261、及びCG-pBR322/HLycIFN(α-1)-258の構造を示し、 第３１図は、発現プラスミドp31中のPHO5信号配列の除
去方法の概略を示し、そして特にプラスミドp31/Rの形
成を示し、 第３２図は、第３１図に示した方法における、EcoRIリ
ンカーを有するPHO5領域におけるBa131除去集まりを示
し、 第３３図及び第３４図は、それぞれ、PHO5/Rプロモータ
ー領域及びPHO5/Yプロモーター領域を含有するBamHI-Ec
oRI制限断片のヌクレオチド配列を示し、 第３５図〜第３７図は、それぞれ、プラスミドp31/Rへ
のIFN-α-3DNA、IFN-α-2DNA及びIFN-α-1DNAの挿入方
法の概略を示し、そして、 第３８図は、発現プラスミドpJDB207R/IF(α-3)の形成
を示す略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (56)参考文献 Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ，Ｓｃ ｉ，ＵＳＡ，79，Ｐ．2157−2161（４. 1982) Ｎａｔｕｒｏ 293，Ｐ．717−722（29. 10．1981) Ｎａｔｕｒｏ 298，Ｐ．347−350（22. ７．1982)

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】サッカロミセス・セレビシエー(Saccharom
    yces cerevisiae)の抑制性酸性ホスファターゼの遺伝子
    PHO5のプロモーターにおいて、該酸性ホスファターゼの
    構造遺伝子が除去されており、且つ少なくとも、該プロ
    モーターと該構造遺伝子との間にあって該プロモーター
    の下流に位置するATG翻訳開始コドンから始まる該酸性
    ホスファターゼのシグナル配列コード領域が除去されて
    いることを特徴とするPHO5プロモーター。
  2. 【請求項２】次のヌクレオチド配列、 を有する特許請求の範囲第１項記載のプロモーター。
  3. 【請求項３】次のヌクレオチド配列、 を有するプロモーター、及び次のヌクレオチド配列、 を有するプロモーターから成る群から選ばれた特許請求
    の範囲第１項記載のプロモーター。
  4. 【請求項４】サッカロミセス・セレビシエー(Saccharom
    yces cerevisiae)の抑制性酸性ホスファターゼの遺伝子
    PHO5のプロモーターにおいて、該酸性ホスファターゼの
    構造遺伝子が除去されており、且つ少なくとも、該プロ
    モーターと該構造遺伝子との間にあって該プロモーター
    の下流に位置するATG翻訳開始コドンから始まる該酸性
    ホスファターゼのシグナル配列コード領域が除去されて
    いることを特徴とするPHO5プロモーターの製造方法にお
    いて、 （Ａ）サッカロミセス・セレビシエーPHO5遺伝子の野性
    型コピーを含有するサッカロミセス・セレビシエー遺伝
    子試料集団に由来するプラスミドDNAを用いて形質転換
    することにより酸性ホスファターゼPHO5欠損サッカロミ
    セス・セレビシエーの菌株を補完し、そして該遺伝子を
    分離することによりサッカロミセス・セレビシエーPHO5
    遺伝子を調製し、 （Ｂ）得られた遺伝子のサブクローンを調製し、そし
    て、 （Ｃ）前記サブクローンのプロモーターの領域の位置を
    同定し、そしてホモロガス構造遺伝子を伴わない酸性ホ
    スファターゼプロモーターを含んで成るDNA断片を分離
    する、 ことを含んで成る方法。
  5. 【請求項５】（１）サッカロミセス・セレビシエー(Sac
    charomyces cerevisiae)の抑制性酸性ホスファターゼの
    遺伝子PHO5のプロモーターにおいて、該酸性ホスファタ
    ーゼの構造遺伝子が除去されており、且つ少なくとも、
    該プロモーターと該構造遺伝子との間にあって該プロモ
    ーターの下流に位置するATG翻訳開始コドンから始まる
    該酸性ホスファターゼのシグナル配列コード領域が除去
    されていることを特徴とするPHO5プロモーター、並びに
    （２）該プロモーターにより制御される非酵母ポリペプ
    チドコード領域又は該サッカロミセス・セレビシエーPH
    O5プロモーターに対してヘテロロガスの酵母ポリペプチ
    ドコード領域を含んで成る雑種ベクター。
  6. 【請求項６】前記酵母ペプチドコード領域又は非酵母ペ
    プチドコード領域が、酵素、ホルモン、免疫調節性、抗
    ウイルス性もしくは抗癌性ポリペプチド、抗体、ウイル
    ス性抗原、ワクチン、又は凝血因子をコードする特許請
    求の範囲第５項記載の雑種ベクター。
  7. 【請求項７】前記非酵母ペプチドコード領域がヒト−イ
    ンターフェロンをコードする特許請求の範囲第６項記載
    の雑種ベクター。
  8. 【請求項８】前記非酵母ペプチドコード領域が肝炎Ｂウ
    イルス抗原をコードしており、そして大腸菌由来のDNA
    を含有しない特許請求の範囲第６項記載の雑種ベクタ
    ー。
  9. 【請求項９】細菌プラスミド、バクテリオファージλ、
    酵母２μプラスミド及び／又は酵母染色体DNAから誘導
    された追加のDNA配列を含有する特許請求の範囲第５項
    記載の雑種ベクター。
  10. 【請求項１０】酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチ
    ドをコードする転写物が、酵母遺伝子の転写停止シグナ
    ルを含有するDNA配列において停止する特許請求の範囲
    第５項記載の雑種ベクター。
  11. 【請求項１１】PHO5遺伝子の転写停止シグナルを含有す
    る特許請求の範囲第10項記載の雑種ベクター。
  12. 【請求項１２】酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチ
    ドをコードする領域の前方にシグナル配列が存在する特
    許請求の範囲第５項記載の雑種ベクター。
  13. 【請求項１３】酵母ポリペプチド又は非酵母ポリペプチ
    ドをコードする領域が、大酸性ホスファターゼmRNA出発
    点及び酸性ホスファターゼコード領域のATGの間で酸性
    ホスファターゼプロモーター領域に連結されている特許
    請求の範囲第５項記載の雑種ベクター。
  14. 【請求項１４】次のプラスミド、すなわち、p31R/IF
    （α−２）Δ82，p31R/IF（α−３），p31Y/IF（α−
    ３），p31R/IF（α−２），p31R/IF（α−２）Δ72，p3
    1Y/IF（α−２），p31Y/IF（α−２）Δ72，p31Y/IF
    （α−２）Δ82，p31R/IF（α−１），p31R/IF（α−
    １）Δ，p31Y/IF（α−１），p31Y/IF（α−１）Δ，pJ
    DB207Y/IF（α−３），pJDB207R/IF（α−２），pJDB20
    7R/IF（α−２）Δ72，pJDB207Y/IF（α−２），pJDB20
    7Y/IF（α−２）Δ72，pJDB207Y/IF（α−２）Δ82，pJ
    DB207R/IF（α−１），pJDB207R/IF（α−１）Δ，pJDB
    207Y/IF（α−１）及びpJDB207Y/IF（α−１）Δから成
    る群から選ばれた特許請求の範囲第５項記載の雑種ベク
    ター。
  15. 【請求項１５】pJDB207R/IF（α−３）である特許請求
    の範囲第５項記載の雑種ベクター。
  16. 【請求項１６】pJDB207R/IF（α−２）Δ82である特許
    請求の範囲第５項記載の雑種ベクター。
  17. 【請求項１７】（１）サッカロミセス・セレビシエー(S
    accharomyces cerevisiae)の抑制性酸性ホスファターゼ
    の遺伝子PHO5のプロモーターにおいて、該酸性ホスファ
    ターゼの構造遺伝子が除去されており、且つ少なくと
    も、該プロモーターと該構造遺伝子との間にあって該プ
    ロモーターの下流に位置するATG翻訳開始コドンから始
    まる該酸性ホスファターゼのシグナル配列コード領域が
    除去されていることを特徴とするPHO5プロモーター、
    （２）並びに該プロモーターにより制御される非酵母ポ
    リペプチドコード領域又は該サッカロミセス・セレビシ
    エーPHO5プロモーターに対してヘテロロガスの酵母ポリ
    ペプチドコード領域を含んで成る雑種ベクターにより形
    質転換されたサッカロミセス・セレビシエー。
  18. 【請求項１８】サッカロミセス・セレビシエーAH220/pJ
    DB207Y/IF（α−３）、サッカロミセス・セレビシエーA
    H220/pJDB207R/IF（α−２）、サッカロミセス・セレビ
    シエーAH220/pJDB207R/IF（α−２）Δ72、サッカロミ
    セス・セレビシエーAH220/pJDB207Y/IF（α−２）、サ
    ッカロミセス・セレビシエーAH220/pJDB207Y/IF（α−
    ２）Δ72、サッカロミセス・セレビシエーAH220/pJDB20
    7Y/IF（α−２）Δ82、サッカロミセス・セレビシエーA
    H220/pJDB207R/IF（α−１）、サッカロミセス・セレビ
    シエーAH220/pJDB207R/IF（α−１）Δ、サッカロミセ
    ス・セレビシエーAH220/pJDB207Y/IF（α−１）、サッ
    カロミセス・セレビシエーAH220/pJDB207Y/IF（α−
    １）Δ、サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207Y
    /IF（α−３）、サッカロミセス・セレビシエーGRF18/p
    JDB207R/IF（α−２）、サッカロミセス・セレビシエー
    GRF18/pJDB207R/IF（α−２）Δ72、サッカロミセス・
    セレビシエーGRF18/pJDB207Y/IF（α−２）、サッカロ
    ミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207Y/IF（α−２）Δ7
    2、サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207Y/IF
    （α−２）Δ82、サッカロミセス・セレビシエーGRF18/
    pJDB207R/IF（α−１）、サッカロミセス・セレビシエ
    ーGRF18/pJDB207R/IF（α−１）Δ、サッカロミセス・
    セレビシエーGRF18/pJDB207Y/IF（α−１）、及びサッ
    カロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207Y/IF（α−
    １）Δから成る群から選ばれた特許請求の範囲第17項記
    載の形質転換されたサッカロミセス・セレビシエー。
  19. 【請求項１９】サッカロミセス・セレビシエーAH220/pJ
    DB207R/IF（α−３）である特許請求の範囲第17項記載
    の形質転換されたサッカロミセス・セレビシエー。
  20. 【請求項２０】サッカロミセス・セレビシエーAH220/pJ
    DB207R/IF（α−２）Δ82である特許請求の範囲第17項
    記載の形質転換されたサッカロミセス・セレビシエー。
  21. 【請求項２１】サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJ
    DB207R/IF（α−３）である特許請求の範囲第17項記載
    の形質転換されたサッカロミセス・セレビシエー。
  22. 【請求項２２】サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJ
    DB207R/IF（α−２）Δ82である特許請求の範囲第17項
    記載の形質転換されたサッカロミセス・セレビシエー。
  23. 【請求項２３】前記酵母ペプチドコード領域又は非酵母
    ペプチドコード領域が肝炎Ｂウイルス抗原をコードして
    おり、そして前記雑種ベクターが大腸菌由来のDNAを含
    有していない、特許請求の範囲第17項に記載の形質転換
    されたサッカロミセス・セレビシエー。
  24. 【請求項２４】（１）サッカロミセス・セレビシエー(S
    accharomyces cerevisiae)の抑制性酸性ホスファターゼ
    の遺伝子PHO5のプロモーターにおいて、該酸性ホスファ
    ターゼの構造遺伝子が除去されており、且つ少なくと
    も、該プロモーターと該構造遺伝子との間にあって該プ
    ロモーターの下流に位置するATG翻訳開始コドンから始
    まる該酸性ホスファターゼのシグナル配列コード領域が
    除去されていることを特徴とするPHO5プロモーター、並
    びに（２）細菌プラスミド、及びPHO5ターミネーターを
    含んで成り、該PHO5プロモーターとPHO5ターミネーター
    との間にクローニング部位を有する雑種ベクター。
  25. 【請求項２５】プラスミドｐ31／Ｒ、及びｐ31／Ｙから
    成る群から選ばれた特許請求の範囲第24項記載の雑種ベ
    クター。
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