JPH0665308B2 - 組換えプラスミドの構築方法 - Google Patents
組換えプラスミドの構築方法Info
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- JPH0665308B2 JPH0665308B2 JP61107431A JP10743186A JPH0665308B2 JP H0665308 B2 JPH0665308 B2 JP H0665308B2 JP 61107431 A JP61107431 A JP 61107431A JP 10743186 A JP10743186 A JP 10743186A JP H0665308 B2 JPH0665308 B2 JP H0665308B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は組換えプラスミドの構築方法、さらに詳しくは
酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制
性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域（以下、酸性ホ
スファターゼプロモーターまたは酸性ホスファターゼ遺
伝子という）を担い、該プロモーターの下流に発現させ
るべき外来遺伝子を組み込んでなる酵母と大腸菌の両方
で増殖しうる組換えプラスミドの構築方法に関する。
酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制
性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域（以下、酸性ホ
スファターゼプロモーターまたは酸性ホスファターゼ遺
伝子という）を担い、該プロモーターの下流に発現させ
るべき外来遺伝子を組み込んでなる酵母と大腸菌の両方
で増殖しうる組換えプラスミドの構築方法に関する。
最近、遺伝子工学の研究が活発に行なわれており、各種
の組換えＤＮＡ、さらにそれによる形質転換体の調製が
なされている。それら組換えＤＮＡの調製に際しては、
特定の遺伝子を組み込むためのベクターが用いられる
が、そのようなベクターとしては、ある種の微生物、例
えば大腸菌でのみ増殖しうるベクターのほか、２種以上
の微生物、例えば大腸菌と酵母、あるいは微生物（例え
ば大腸菌）と動物細胞との双方で増殖しうるいわゆるシ
ャトルベクターが用いられる。例えば、ごく最近におい
て、大腸菌と酵母の両方で増殖しうるシャトルベクター
として、インターフェロンの酵母による産生に使用され
ているアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）のプロ
モーターを利用したものが報告されており、これにＢ型
肝炎ウィルスの表面抗原（以下、HBs抗原、HBsAgもしく
は単にＳ抗原という）の蛋白をコードする遺伝子を接続
する方法が採用されている（Natrue，２９８巻、３４７
〜３５０頁（２２July，１９８２）を参照）。しかしな
がら、この方法で用いられるシャトルベクターはＡＤＨ
１プロモーターを担ったものであり、しかもそのHBs遺
伝子を組み込んで得られる組換えＤＮＡを用いた形質転
換体では産生されるHBs蛋白の量が低い。
の組換えＤＮＡ、さらにそれによる形質転換体の調製が
なされている。それら組換えＤＮＡの調製に際しては、
特定の遺伝子を組み込むためのベクターが用いられる
が、そのようなベクターとしては、ある種の微生物、例
えば大腸菌でのみ増殖しうるベクターのほか、２種以上
の微生物、例えば大腸菌と酵母、あるいは微生物（例え
ば大腸菌）と動物細胞との双方で増殖しうるいわゆるシ
ャトルベクターが用いられる。例えば、ごく最近におい
て、大腸菌と酵母の両方で増殖しうるシャトルベクター
として、インターフェロンの酵母による産生に使用され
ているアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）のプロ
モーターを利用したものが報告されており、これにＢ型
肝炎ウィルスの表面抗原（以下、HBs抗原、HBsAgもしく
は単にＳ抗原という）の蛋白をコードする遺伝子を接続
する方法が採用されている（Natrue，２９８巻、３４７
〜３５０頁（２２July，１９８２）を参照）。しかしな
がら、この方法で用いられるシャトルベクターはＡＤＨ
１プロモーターを担ったものであり、しかもそのHBs遺
伝子を組み込んで得られる組換えＤＮＡを用いた形質転
換体では産生されるHBs蛋白の量が低い。
本発明者らは、各種の遺伝子を組み込み、さらにそれを
発現させるための新しい大腸菌−酵母シャトルベクター
を得るべく種々研究を重ねた結果、大腸菌の遺伝子と酵
母の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプ
ロモーターを担ったシャトルベクターが所望の特性を示
し、そのホスファターゼプロモーターの制御下に各種の
遺伝子を組み込んで種々の組換えＤＮＡを調製し、さら
にその組換えＤＮＡを酵母に作用させることによって種
々の形質転換酵母が得られることを見出し、本発明を完
成するに至った。
発現させるための新しい大腸菌−酵母シャトルベクター
を得るべく種々研究を重ねた結果、大腸菌の遺伝子と酵
母の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプ
ロモーターを担ったシャトルベクターが所望の特性を示
し、そのホスファターゼプロモーターの制御下に各種の
遺伝子を組み込んで種々の組換えＤＮＡを調製し、さら
にその組換えＤＮＡを酵母に作用させることによって種
々の形質転換酵母が得られることを見出し、本発明を完
成するに至った。
すなわち、本発明は酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子を含
みかつ酵母の制御性酸性ホスファターゼプロモーターを
担ったシャトルベクターを用いた外来遺伝子発現用組換
えプラスミドの構築方法を提供するものである。
みかつ酵母の制御性酸性ホスファターゼプロモーターを
担ったシャトルベクターを用いた外来遺伝子発現用組換
えプラスミドの構築方法を提供するものである。
本発明に用いられるシャトルベクターは、酵母と大腸菌
の両方の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファター
ゼプラスミドを有することを特徴とし、このプラスミド
ベクターは酵母と大腸菌との両方で増殖することがで
き、これを用いて組換えＤＮＡ、さらに形質転換酵母を
調製する場合に、大腸菌を用いて組換えプラスミドを調
製し、これを酵母の形質転換に利用し、該形質転換酵母
の増殖によって所望の遺伝子産物の量産を図ることがで
きる。なお、この場合、酵母の形質転換を行なう段階で
は大腸菌の遺伝子は除去されてもかまわない。
の両方の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファター
ゼプラスミドを有することを特徴とし、このプラスミド
ベクターは酵母と大腸菌との両方で増殖することがで
き、これを用いて組換えＤＮＡ、さらに形質転換酵母を
調製する場合に、大腸菌を用いて組換えプラスミドを調
製し、これを酵母の形質転換に利用し、該形質転換酵母
の増殖によって所望の遺伝子産物の量産を図ることがで
きる。なお、この場合、酵母の形質転換を行なう段階で
は大腸菌の遺伝子は除去されてもかまわない。
本発明のシャトルベクターにおける酵母の遺伝子として
は、一般に、プラスミドが酵母中で染色体と独立して増
殖するのに必要なＤＮＡ配列、例えば、酵母の自律増殖
に必要なＤＮＡ配列（ars1）と２μｍＤＮＡの複製に必
要なＤＮＡ配列（２μori）があり、所望により、さら
に形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子が含まれ
る。この選択マーカーとしては、ロイシン産生遺伝子、
ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子、ウ
ラシル産生遺伝子、アデニン産生遺伝子などが含まれ、
これらの１種または２種以上が用いられる。
は、一般に、プラスミドが酵母中で染色体と独立して増
殖するのに必要なＤＮＡ配列、例えば、酵母の自律増殖
に必要なＤＮＡ配列（ars1）と２μｍＤＮＡの複製に必
要なＤＮＡ配列（２μori）があり、所望により、さら
に形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子が含まれ
る。この選択マーカーとしては、ロイシン産生遺伝子、
ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子、ウ
ラシル産生遺伝子、アデニン産生遺伝子などが含まれ、
これらの１種または２種以上が用いられる。
大腸菌側の遺伝子としては大腸菌体内においてプラスミ
ドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、例えばCol EI系
のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、好ましく
はさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺伝子を
含む。こり選択マーカーの遺伝子としてはアンピシリン
耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリ
ン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが
挙げられ、これらの遺伝子の１種または２種以上が用い
られる。このような大腸菌ＤＮＡとしてアンピシリン耐
性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するpBR３
２２が一般に汎用されている。
ドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、例えばCol EI系
のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、好ましく
はさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺伝子を
含む。こり選択マーカーの遺伝子としてはアンピシリン
耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリ
ン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが
挙げられ、これらの遺伝子の１種または２種以上が用い
られる。このような大腸菌ＤＮＡとしてアンピシリン耐
性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を有するpBR３
２２が一般に汎用されている。
本発明で用いるシャトルベクターは酵母の抑制性酸性ホ
スファターゼプロモーターを担っていることが特徴であ
り、この酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスフ
ァターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリペプチ
ド(p６０)のプロモーターである。
スファターゼプロモーターを担っていることが特徴であ
り、この酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスフ
ァターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリペプチ
ド(p６０)のプロモーターである。
このようなシャトルベクターの代表的な例は、酵母側の
遺伝子としてars1,2μoriおよびロイシン産生遺伝子(Le
u2)を有する酵母ＤＮＡと大腸菌プラスミドpBR３２２と
を組み合わせたシャトルベクターpAT７７であり、これ
はつぎのようにして構築される。
遺伝子としてars1,2μoriおよびロイシン産生遺伝子(Le
u2)を有する酵母ＤＮＡと大腸菌プラスミドpBR３２２と
を組み合わせたシャトルベクターpAT７７であり、これ
はつぎのようにして構築される。
酵母Ｓ２８８ＣＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性ホ
スファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリペ
プチド(p６０)遺伝子を含む約８０００ヌクレオチド対
（８Kb）の制限酵素EcoＲＩ断片（ＰＮＡＳ、７７巻、
６５４１〜６５４５頁、１９８０およびＰＮＡＳ、７９
巻、２１５７〜２１６１頁、１９８２を参照）を公知の
大腸菌プラスミドpBR３２２（Sutcliffc,J.G.,Cold Spr
ing Harbor Symposium、４３巻、７７〜９０頁、１９７
９を参照）のEcoＲＩ部位に挿入して得られるプラスミ
ドを出発材料とする。なおこの８KbＤＮＡ断片は制限酵
素SalＩの認識部位を約2.8Kbと約5.2Kbに分ける位置に
１箇所有し、2.8Kb側がpBR３２２のアンピシリン耐性遺
伝子側になるように挿入されている。
スファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリペ
プチド(p６０)遺伝子を含む約８０００ヌクレオチド対
（８Kb）の制限酵素EcoＲＩ断片（ＰＮＡＳ、７７巻、
６５４１〜６５４５頁、１９８０およびＰＮＡＳ、７９
巻、２１５７〜２１６１頁、１９８２を参照）を公知の
大腸菌プラスミドpBR３２２（Sutcliffc,J.G.,Cold Spr
ing Harbor Symposium、４３巻、７７〜９０頁、１９７
９を参照）のEcoＲＩ部位に挿入して得られるプラスミ
ドを出発材料とする。なおこの８KbＤＮＡ断片は制限酵
素SalＩの認識部位を約2.8Kbと約5.2Kbに分ける位置に
１箇所有し、2.8Kb側がpBR３２２のアンピシリン耐性遺
伝子側になるように挿入されている。
このプラスミドを制限酵素SalＩで切断し、さらにＴ４
ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせてpBR３２２のSal
Ｉ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の5.2Kb側を
失ったプラスミドを得、これをpAT２５と称する。このp
AT２５はpBR３２２のアンピシリン耐性遺伝子を含むEco
RＩ部位からSalＩ部位までの約3.7Kbの断片と酵母の酸
性ホスファターゼ遺伝子のEcoRＩ部位からSalＩ部位ま
での約2.8Kbの断片がそれぞれ対応する末端同士で結合
したプラスミドである。
ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせてpBR３２２のSal
Ｉ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の5.2Kb側を
失ったプラスミドを得、これをpAT２５と称する。このp
AT２５はpBR３２２のアンピシリン耐性遺伝子を含むEco
RＩ部位からSalＩ部位までの約3.7Kbの断片と酵母の酸
性ホスファターゼ遺伝子のEcoRＩ部位からSalＩ部位ま
での約2.8Kbの断片がそれぞれ対応する末端同士で結合
したプラスミドである。
つぎに、上記pAT２５のEcoRＩ部位に、酵母の自律増殖
に必要なＤＮＡ配列（ars1）および酵母のTrp1遺伝子を
含む1.4KbのEcoRＩ断片（ＰＮＡＳ、７６巻、１０３５
〜１０３９頁、１９７９を参照）を挿入する。得られた
プラスミドをpAT２６と称するなお、このars1−Trp1を
含む断片は、そのTrp1遺伝子内に制限酵素HindIIIの認
識部位を１箇所有する。
に必要なＤＮＡ配列（ars1）および酵母のTrp1遺伝子を
含む1.4KbのEcoRＩ断片（ＰＮＡＳ、７６巻、１０３５
〜１０３９頁、１９７９を参照）を挿入する。得られた
プラスミドをpAT２６と称するなお、このars1−Trp1を
含む断片は、そのTrp1遺伝子内に制限酵素HindIIIの認
識部位を１箇所有する。
上記pAT２６のHindIII部位に酵母のロイシン産生遺伝子
（Leu2）と２μｍＤＮＡの複製に必要なＤＮＡ配列（２
μori）を含むHindIII断片（Tohe,A.,Guerry,P.,Wichen
er,R.B.；J.Bacteriol,１４１，４１３〜４１６、１９
８０を参照）を挿入する。このようにして得られるプラ
スミドがシャトルベクターpAT７７である。
（Leu2）と２μｍＤＮＡの複製に必要なＤＮＡ配列（２
μori）を含むHindIII断片（Tohe,A.,Guerry,P.,Wichen
er,R.B.；J.Bacteriol,１４１，４１３〜４１６、１９
８０を参照）を挿入する。このようにして得られるプラ
スミドがシャトルベクターpAT７７である。
このpAT７７およびのちに説明するようにそれから誘導
されるpAM８２の構造は第１図に示すとおりである。す
なわち、このpAT７７は、大腸菌の遺伝子としてpBR３２
２のアンピシリン耐性遺伝子（Apr）を含むEcoRＩ部位
からSalＩ部位までを有し、一方酵母の遺伝子として、
ｐＢＲ３２２と結合したEcoRＩ部位よりars1、２μori,
Leu２遺伝子の順に位置し、さらにそのつぎに酸性ホス
ファターゼ遺伝子の上流からSalＩ部位までを有する。
そしてそのEcoRＩおよびSalＩ部位でこれら大腸菌遺伝
子と酵母遺伝子が結合した構造となっている。このpAT
７７は大腸菌内においてはpBR３２２により増殖し、ま
た酵母内においてはars1および２μoriにより増殖可能
となる。さらにこのプラスミドによる形質転換体の選択
マーカーとして大腸菌側にアンピシリン耐性遺伝子（Ap
r）を、酵母菌側にはロイシン産生遺伝子（Leu2）を有
しており、シャトルベクターとしての条件を充分に満た
している。
されるpAM８２の構造は第１図に示すとおりである。す
なわち、このpAT７７は、大腸菌の遺伝子としてpBR３２
２のアンピシリン耐性遺伝子（Apr）を含むEcoRＩ部位
からSalＩ部位までを有し、一方酵母の遺伝子として、
ｐＢＲ３２２と結合したEcoRＩ部位よりars1、２μori,
Leu２遺伝子の順に位置し、さらにそのつぎに酸性ホス
ファターゼ遺伝子の上流からSalＩ部位までを有する。
そしてそのEcoRＩおよびSalＩ部位でこれら大腸菌遺伝
子と酵母遺伝子が結合した構造となっている。このpAT
７７は大腸菌内においてはpBR３２２により増殖し、ま
た酵母内においてはars1および２μoriにより増殖可能
となる。さらにこのプラスミドによる形質転換体の選択
マーカーとして大腸菌側にアンピシリン耐性遺伝子（Ap
r）を、酵母菌側にはロイシン産生遺伝子（Leu2）を有
しており、シャトルベクターとしての条件を充分に満た
している。
このシャトルベクターpAT７７の酸性ホスファターゼプ
ロモーター付近の遺伝子地図は第２図に示すとおりであ
り、ここに示されるBstEII−Sal Ｉ領域の塩基配列は本
発明者らにより決定されており、第３図に示すような配
列である。第２図および第３図に示されるＡＴＧコドン
（メチオニン）が酸性ホスファターゼの開始コドンであ
る。つまり、このベクターの抑制性酸性ホスファターゼ
遺伝子断片（約2.8Kb）には、構造遺伝子の約2.7Kb上流
から構造遺伝子８２ヌクレオチド対（８２bp）までが含
まれる。
ロモーター付近の遺伝子地図は第２図に示すとおりであ
り、ここに示されるBstEII−Sal Ｉ領域の塩基配列は本
発明者らにより決定されており、第３図に示すような配
列である。第２図および第３図に示されるＡＴＧコドン
（メチオニン）が酸性ホスファターゼの開始コドンであ
る。つまり、このベクターの抑制性酸性ホスファターゼ
遺伝子断片（約2.8Kb）には、構造遺伝子の約2.7Kb上流
から構造遺伝子８２ヌクレオチド対（８２bp）までが含
まれる。
このようなシャトルベクターpAT７７を公知の制限酵素S
alＩで処理して開裂させ、ついでこれをエキソヌクレア
ーゼＢＡＬ３１で処理することにより第２図および第３
図に示す酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部または全
部と所望によりさらにそのそ上流の種々の部分まで除去
する。この除去は酸性ホスファターゼプロモーター領域
と思われるＴＡＴＡＴＡＡ（Hogness box）、すなわち
−１００bpの前までの適当な部位まで行なわれ、エキソ
ヌクレアーゼ処理条件により適宜調節されるが、通常＋
１〜−１００bp、好ましくは＋１〜−５０bpまでであ
る。この際、除去が上流まで行きすぎると酸性ホスファ
ターゼプロモーターの制御が困難となり、形質転換酵母
菌の培養の際、所望の蛋白質などの収量が低下する。一
方、除去が不充分で酸性ホスファターゼ構造遺伝子が一
部残存すると産生される蛋白質などがホスファターゼペ
プチドと合いの子となるため好ましくない。
alＩで処理して開裂させ、ついでこれをエキソヌクレア
ーゼＢＡＬ３１で処理することにより第２図および第３
図に示す酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部または全
部と所望によりさらにそのそ上流の種々の部分まで除去
する。この除去は酸性ホスファターゼプロモーター領域
と思われるＴＡＴＡＴＡＡ（Hogness box）、すなわち
−１００bpの前までの適当な部位まで行なわれ、エキソ
ヌクレアーゼ処理条件により適宜調節されるが、通常＋
１〜−１００bp、好ましくは＋１〜−５０bpまでであ
る。この際、除去が上流まで行きすぎると酸性ホスファ
ターゼプロモーターの制御が困難となり、形質転換酵母
菌の培養の際、所望の蛋白質などの収量が低下する。一
方、除去が不充分で酸性ホスファターゼ構造遺伝子が一
部残存すると産生される蛋白質などがホスファターゼペ
プチドと合いの子となるため好ましくない。
上記のようにして酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部
または全部もしくはさらにその上流部分を除去したの
ち、この部位に合成または天然のリンカー、例えばSal
ＩリンカーまたはXhoＩリンカーを組み込み再び環状プ
ラスミドに戻すことにより、酸性ホスファターゼプロモ
ーターの制御下に外来性遺伝子を純粋な形で発現させ得
るシャトルベクターが得られる。このシャトルベクター
は、通常の制限酵素SalＩまたはXhoＩで処理することに
より容易にその組み込み部位を開裂させることができる
ため、所望の遺伝子を組み込むのに好適である。
または全部もしくはさらにその上流部分を除去したの
ち、この部位に合成または天然のリンカー、例えばSal
ＩリンカーまたはXhoＩリンカーを組み込み再び環状プ
ラスミドに戻すことにより、酸性ホスファターゼプロモ
ーターの制御下に外来性遺伝子を純粋な形で発現させ得
るシャトルベクターが得られる。このシャトルベクター
は、通常の制限酵素SalＩまたはXhoＩで処理することに
より容易にその組み込み部位を開裂させることができる
ため、所望の遺伝子を組み込むのに好適である。
上述のとおり、本発明に用いられるシャトルベクターは
その酸性ホスファターゼプロモーターの下流に種々の遺
伝子を組み込むことにより各種の組換えプラスミドを調
製することができ、それをさらに酵母に作用させて種々
の形質転換酵母が得られるため遺伝子工学の分野におい
て広範囲の利用が図れるものであって産業上の利用価値
が極めて高い。例えば、本発明のシャトルベクターにHB
s遺伝子を組み込んで得られる組換えプラスミドを酵母
に作用させて調製される形質転換酵母は、培養によって
大量のHBs抗原を産生することができ、しかもかかるHBs
抗原は免疫学的にヒト血清から得られるものと全く同一
であるため、Ｂ型肝炎ウィルスワクチンとして有用であ
る。
その酸性ホスファターゼプロモーターの下流に種々の遺
伝子を組み込むことにより各種の組換えプラスミドを調
製することができ、それをさらに酵母に作用させて種々
の形質転換酵母が得られるため遺伝子工学の分野におい
て広範囲の利用が図れるものであって産業上の利用価値
が極めて高い。例えば、本発明のシャトルベクターにHB
s遺伝子を組み込んで得られる組換えプラスミドを酵母
に作用させて調製される形質転換酵母は、培養によって
大量のHBs抗原を産生することができ、しかもかかるHBs
抗原は免疫学的にヒト血清から得られるものと全く同一
であるため、Ｂ型肝炎ウィルスワクチンとして有用であ
る。
つぎに実施例およびけ参考例を挙げて本発明をさらに具
体的に説明する。
体的に説明する。
実施例 シャトルベクターpAM８１、８２、８３および８４の調
製 酵母Ｓ２８８ＣＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性ホ
スファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリペ
プチド(p６０)の遺伝子を含む約８０００ヌクレオチド
対（８Kb）の制限酵素EcoRＩ断片を大腸菌プラスミドpB
R３２２のEcoRＩ部位に挿入して得られるプラスミドを
出発材料とし、これを制限酵素SalＩで切断し、さらに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせてpBR３２２
のSalＩ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の5.2Kb
側を失ったプラスミドpAT２５（これはpBR３２２のアン
ピシリン耐性遺伝子を含むEcoRＩ部位からSalＩ部位ま
での約3.7Kbの断片と酵母菌の酸性ホスファターゼ遺伝
子のEcoRＩ部位からSalＩまでの約2.8Kbの断片がそれぞ
れ対応する末端同士で結合したプラスミドである）を得
る。
製 酵母Ｓ２８８ＣＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性ホ
スファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリペ
プチド(p６０)の遺伝子を含む約８０００ヌクレオチド
対（８Kb）の制限酵素EcoRＩ断片を大腸菌プラスミドpB
R３２２のEcoRＩ部位に挿入して得られるプラスミドを
出発材料とし、これを制限酵素SalＩで切断し、さらに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせてpBR３２２
のSalＩ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の5.2Kb
側を失ったプラスミドpAT２５（これはpBR３２２のアン
ピシリン耐性遺伝子を含むEcoRＩ部位からSalＩ部位ま
での約3.7Kbの断片と酵母菌の酸性ホスファターゼ遺伝
子のEcoRＩ部位からSalＩまでの約2.8Kbの断片がそれぞ
れ対応する末端同士で結合したプラスミドである）を得
る。
つぎに、このpAT２５のEcoRＩ部位に、プラスミドＹＲ
Ｐ７をEcoRＩ処理することによって得られるars1および
Trp1遺伝子を含む1.4KbのEcoRＩ断片を挿入してプラス
ミドpAT２６を得る（このars1−Trp1を含む断片は、そ
のTrp1遺伝子内に制限酵素HindIIIの認識部位を１個有
する）。
Ｐ７をEcoRＩ処理することによって得られるars1および
Trp1遺伝子を含む1.4KbのEcoRＩ断片を挿入してプラス
ミドpAT２６を得る（このars1−Trp1を含む断片は、そ
のTrp1遺伝子内に制限酵素HindIIIの認識部位を１個有
する）。
上記pAT２６のHindIII部位に、プラスミドpSＬＥ１をHi
ndIIIで処理して得られる酵母のLeu2および２μoriを含
むHindIII断片を挿入してシャトルベクターpAT７７を得
る。
ndIIIで処理して得られる酵母のLeu2および２μoriを含
むHindIII断片を挿入してシャトルベクターpAT７７を得
る。
上記の方法で得られたpAT７７（１μｇ）をSalＩで開裂
したのち、２０mMトリス−HCl(pH8.2)、１２mM CACl2、
１２mM MgCl2、0.2M NaCl、１mM ＥＤＴＡ溶液５０μ
ｌ中で0.1ＵのエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を３０秒
〜１分間作用させる。ついでフェノール抽出、エタノー
ル沈澱を行ったのち、XhoＩリンカー１pmolとＴ４ＤＮ
Ａリガーゼの反応条件下で１２時間結合を行なう。この
反応溶液で大腸菌x1７７６を形質転換し、得られたアン
ピシリン耐性の形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製
し、各ＤＮＡについてマキサム−ギルバートの方法（Ma
xam,A.& Gilbert,W.；pro.N.A.S.,７４，５６０〜５６
４を参照）に従い、塩基配列を調べ、ＢＡＬ３１処理に
より除去された酸性ホスファターゼ遺伝子領域を決定す
る。これら中からホスファターゼ構造遺伝子領域が完全
に除去されたプラスミドpAM８１、pAM８２、pAM８３お
よびpAM８４を得る。
したのち、２０mMトリス−HCl(pH8.2)、１２mM CACl2、
１２mM MgCl2、0.2M NaCl、１mM ＥＤＴＡ溶液５０μ
ｌ中で0.1ＵのエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を３０秒
〜１分間作用させる。ついでフェノール抽出、エタノー
ル沈澱を行ったのち、XhoＩリンカー１pmolとＴ４ＤＮ
Ａリガーゼの反応条件下で１２時間結合を行なう。この
反応溶液で大腸菌x1７７６を形質転換し、得られたアン
ピシリン耐性の形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製
し、各ＤＮＡについてマキサム−ギルバートの方法（Ma
xam,A.& Gilbert,W.；pro.N.A.S.,７４，５６０〜５６
４を参照）に従い、塩基配列を調べ、ＢＡＬ３１処理に
より除去された酸性ホスファターゼ遺伝子領域を決定す
る。これら中からホスファターゼ構造遺伝子領域が完全
に除去されたプラスミドpAM８１、pAM８２、pAM８３お
よびpAM８４を得る。
ホスファターゼ構造遺伝子の産物ｐ６０の最初のアミノ
酸であるメチオニンをコードするコドンＡＴＧのＡを＋
１として、pAM８１は＋２まで、pAM８２は−３３まで、
pAM８３は−５０まで、pAM８４は−５１まで、それぞれ
除去されたものである。
酸であるメチオニンをコードするコドンＡＴＧのＡを＋
１として、pAM８１は＋２まで、pAM８２は−３３まで、
pAM８３は−５０まで、pAM８４は−５１まで、それぞれ
除去されたものである。
なお、このpAM８２をサッカロミセス・セレビシエＡＨ
２２に組み込んだものは、サッカロミセス・セレビシエ
ＡＨ２２／pAM８２（微工研菌寄第６６６８号：微工研
条寄第３１３号）として寄託している。
２２に組み込んだものは、サッカロミセス・セレビシエ
ＡＨ２２／pAM８２（微工研菌寄第６６６８号：微工研
条寄第３１３号）として寄託している。
つぎに、上記の方法で得られたシャトルベクターpAM８
２を用い、これにHBVDNAを組み込む場合を参考例として
示す。
２を用い、これにHBVDNAを組み込む場合を参考例として
示す。
参考例 (1)ＨＢＶＤＮＡの調製 (i)ウィルスＤＮＡの調製 HBsAg陽性かつHBeAg陽性の供血者（血清型adr）からの
ヒト血漿１０人分のプール７００mlを５，０００rpmで
２０分間遠心分離し、不溶物を除去する。これを４℃に
て１８，０００rpmで８時間遠心分離し、得られた沈澱
を緩衝液（１０mMトリス−HCl、0.1M NaCl、1mM ＥＤ
ＴＡ；pH7.5）１０mlに再溶解させ、３０％の庶糖を含
有する遠沈管の頂部に重層させる。これを４℃にて３
９，０００rpmで４時間遠心分離し、得られた沈査を上
記と同じ緩衝液に再溶解させる。
ヒト血漿１０人分のプール７００mlを５，０００rpmで
２０分間遠心分離し、不溶物を除去する。これを４℃に
て１８，０００rpmで８時間遠心分離し、得られた沈澱
を緩衝液（１０mMトリス−HCl、0.1M NaCl、1mM ＥＤ
ＴＡ；pH7.5）１０mlに再溶解させ、３０％の庶糖を含
有する遠沈管の頂部に重層させる。これを４℃にて３
９，０００rpmで４時間遠心分離し、得られた沈査を上
記と同じ緩衝液に再溶解させる。
ついで、のちの操作を容易にするために、ＨＢＶのもつ
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を、６７mMトリス−HCl
(pH7.5)、８０mM NH4Cl、２５mM MgCl2、0.5％（w/v
％、以下同じ）タージトールＮＰ−４０、0.1％２−メ
ルカプトエタノール、３３０μＭのdcTP（デオキシシチ
ジントリホスフェート）、dGTP（デオキシグアノシント
リホスフェート）、dATP（デオキシアデノシントリホス
フェート）、0.5μＭα−［32Ｐ］dTTP（デオキシチア
ミントリホスフェートの混合液５００μｌ中で３７℃に
て３０分間行なう。これにさらにdTTPを最終濃度３３０
μＭになるように加え、３７℃で３時間反応させ、これ
に同容量の１００mM ＥＤＴＡ溶液を加える。このＤＮ
Ａポリメラーゼ反応により、ＤＮＡ中の一本鎖部分が修
複され、［32Ｐ］ラベル化された材料をえ、これを庶糖
の３０％、２０％および１０％水溶液を段階的に重層し
た遠心管の頂部に重層し、４℃にて３９，０００rpmで
4.5時間遠心分離する。
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を、６７mMトリス−HCl
(pH7.5)、８０mM NH4Cl、２５mM MgCl2、0.5％（w/v
％、以下同じ）タージトールＮＰ−４０、0.1％２−メ
ルカプトエタノール、３３０μＭのdcTP（デオキシシチ
ジントリホスフェート）、dGTP（デオキシグアノシント
リホスフェート）、dATP（デオキシアデノシントリホス
フェート）、0.5μＭα−［32Ｐ］dTTP（デオキシチア
ミントリホスフェートの混合液５００μｌ中で３７℃に
て３０分間行なう。これにさらにdTTPを最終濃度３３０
μＭになるように加え、３７℃で３時間反応させ、これ
に同容量の１００mM ＥＤＴＡ溶液を加える。このＤＮ
Ａポリメラーゼ反応により、ＤＮＡ中の一本鎖部分が修
複され、［32Ｐ］ラベル化された材料をえ、これを庶糖
の３０％、２０％および１０％水溶液を段階的に重層し
た遠心管の頂部に重層し、４℃にて３９，０００rpmで
4.5時間遠心分離する。
ついでＤＮＡに強く結合している蛋白質を消化するため
に、上記で得られた沈査を１mg／mlプロナーゼＥおよび
0.2％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液２００μｌ中で
３７℃にて２時間処理したのち、ＤＮＡをフェノール２
００μｌで２回抽出し、ついでエーテルを振ってフェノ
ール溶媒を除去するとＨＢＶＤＮＡ溶液を得る。このＤ
ＮＡは2.5×１０６cpm／μｇの比放射活性を示し、制限
酵素消化に充分使用し得る。
に、上記で得られた沈査を１mg／mlプロナーゼＥおよび
0.2％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液２００μｌ中で
３７℃にて２時間処理したのち、ＤＮＡをフェノール２
００μｌで２回抽出し、ついでエーテルを振ってフェノ
ール溶媒を除去するとＨＢＶＤＮＡ溶液を得る。このＤ
ＮＡは2.5×１０６cpm／μｇの比放射活性を示し、制限
酵素消化に充分使用し得る。
(ii)ＨＢＶＤＮＡのクローン化 前記の方法で調製された環状二本鎖のＨＢＶＤＮＡを、
下記のようにしてまずλファージシャロン１６ＡＤＮＡ
をベクターとしてクローン化し、さらに公知のプラスミ
ドpACYC１７７をベクターとして再クローン化を行な
う。
下記のようにしてまずλファージシャロン１６ＡＤＮＡ
をベクターとしてクローン化し、さらに公知のプラスミ
ドpACYC１７７をベクターとして再クローン化を行な
う。
(A)λファージシャロン１６Ａ宿主−ベクター系による
クローン化： ＨＢＶＤＮＡ２０ngを１０mMトリスHCl(pH7.4)、７mM M
gCl2、１００mM NaCl、７mM２−メルカプトエタノール
の混液２０μｌ中にて制限エンドヌクレアーゼXhoＩに
より３７℃にて２時間処理したのち、フェノール２０μ
ｌにて抽出し、抽出液をエーテルで洗浄し、その水層に
２倍容量の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させる。
この混液を−７０℃で１時間保持したのち１０，０００
rpmにて５分間遠心分離して沈澱するＤＮＡを回収す
る。分離した沈査を１０mMトリス−HCl(pH7.4)および１
mM ＥＤＴＡの混液５μｌに溶解させる。ついで、この
ＨＢＶＤＮＡと等モル量の前記と同様にして制限酵素Xh
oＩにより開裂されたλファージシャロン１６ＡＤＮＡ
（XhoＩ認識部位を１個所有する）とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（５０mMトリス−HCl(pH7.4)１０mM MgCl2、１０mM
ジチオスレイトール、１００μｇ／ml牛血清アルブミ
ン、0.5mM ＡＴＰおよび0.5μｌ酵素調製物との混液）
１０μｌを用いて４℃で１８時間反応させ、この反応混
合液を前記と同様にしてフェノール抽出、エーテル処理
およびエタノール沈澱に付し、得られた沈査を１０mMト
リス−HCl(pH7.4)および１mM ＥＤＴＡ混液１０μｌ中
に溶解させる。
クローン化： ＨＢＶＤＮＡ２０ngを１０mMトリスHCl(pH7.4)、７mM M
gCl2、１００mM NaCl、７mM２−メルカプトエタノール
の混液２０μｌ中にて制限エンドヌクレアーゼXhoＩに
より３７℃にて２時間処理したのち、フェノール２０μ
ｌにて抽出し、抽出液をエーテルで洗浄し、その水層に
２倍容量の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させる。
この混液を−７０℃で１時間保持したのち１０，０００
rpmにて５分間遠心分離して沈澱するＤＮＡを回収す
る。分離した沈査を１０mMトリス−HCl(pH7.4)および１
mM ＥＤＴＡの混液５μｌに溶解させる。ついで、この
ＨＢＶＤＮＡと等モル量の前記と同様にして制限酵素Xh
oＩにより開裂されたλファージシャロン１６ＡＤＮＡ
（XhoＩ認識部位を１個所有する）とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（５０mMトリス−HCl(pH7.4)１０mM MgCl2、１０mM
ジチオスレイトール、１００μｇ／ml牛血清アルブミ
ン、0.5mM ＡＴＰおよび0.5μｌ酵素調製物との混液）
１０μｌを用いて４℃で１８時間反応させ、この反応混
合液を前記と同様にしてフェノール抽出、エーテル処理
およびエタノール沈澱に付し、得られた沈査を１０mMト
リス−HCl(pH7.4)および１mM ＥＤＴＡ混液１０μｌ中
に溶解させる。
上記のようにしてアニールさせたＤＮＡより、in vitro
パッケージング操作（Methods in Enzy mology、６８
巻、２９９〜３０９を参照）によりλファージを形成さ
せ、さらに大腸菌ＤＰ５０−SupF指示菌としてＬ−寒天
平板（２３cm×２３cm）上に〜１０４個のプラークを形
成させる。これらのプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを
維持しているファージにより形成されたプラークを選び
出すために、前記で調製した32Ｐ−ラベルされたＨＢＶ
ＤＮＡをプローブとしてプラークハイブリダイゼーショ
ンを行ない（Science、１９６巻、１８０頁、１９７７
を参照）、目的とするフアージを複数分離する。
パッケージング操作（Methods in Enzy mology、６８
巻、２９９〜３０９を参照）によりλファージを形成さ
せ、さらに大腸菌ＤＰ５０−SupF指示菌としてＬ−寒天
平板（２３cm×２３cm）上に〜１０４個のプラークを形
成させる。これらのプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを
維持しているファージにより形成されたプラークを選び
出すために、前記で調製した32Ｐ−ラベルされたＨＢＶ
ＤＮＡをプローブとしてプラークハイブリダイゼーショ
ンを行ない（Science、１９６巻、１８０頁、１９７７
を参照）、目的とするフアージを複数分離する。
(B)プラスミドpACYC１７７をベクターとした再クローン
化： 上記(A)で得られたＨＢＶＤＮＡを保持するファージに
ついて「生化学実験講座、核酸の化学Ｉ」５４〜６５頁
に記載される方法に従い、大腸菌ＤＰ５０−SupFを感染
菌としてファージＤＮＡを調製する。得られたＤＮＡを
前記の制限酵素XhoＩの反応条件下で２時間消化したの
ち、この反応液を0.75％アガロースゲル電気泳動にか
け、分離した3.2KbのＨＢＶＤＮＡをＤＥＡＥ紙（東洋
紙製）に吸着させてベクターＤＮＡと分離し、ついで
１Ｍ NaCl溶液にて溶出し、両端がXhoＩ末端となった
ＨＢＶＤＮＡを得る。
化： 上記(A)で得られたＨＢＶＤＮＡを保持するファージに
ついて「生化学実験講座、核酸の化学Ｉ」５４〜６５頁
に記載される方法に従い、大腸菌ＤＰ５０−SupFを感染
菌としてファージＤＮＡを調製する。得られたＤＮＡを
前記の制限酵素XhoＩの反応条件下で２時間消化したの
ち、この反応液を0.75％アガロースゲル電気泳動にか
け、分離した3.2KbのＨＢＶＤＮＡをＤＥＡＥ紙（東洋
紙製）に吸着させてベクターＤＮＡと分離し、ついで
１Ｍ NaCl溶液にて溶出し、両端がXhoＩ末端となった
ＨＢＶＤＮＡを得る。
つぎにプラスミドpACYC１７７［Chang,A.C.Y.,Cohen,S.
N.,J.Bacteriol.,１３４，１１４１〜１１５６（１９７
８）］（このものはXhoＩ切断部位を１個所有し、それ
はカナマイシン耐性遺伝子の中に存在する）を同様にXh
oＩにて消化し、その生成物をフェノール抽出、エーテ
ル処理およびエタノール沈澱により精製する。ついで、
XhoＩ開裂されたpACYC１７７とXhoＩ末端−ＨＢＶＤＮ
Ａとを分子比１：５で混合し、前記Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
の反応条件下に１８時間アニールさせる。
N.,J.Bacteriol.,１３４，１１４１〜１１５６（１９７
８）］（このものはXhoＩ切断部位を１個所有し、それ
はカナマイシン耐性遺伝子の中に存在する）を同様にXh
oＩにて消化し、その生成物をフェノール抽出、エーテ
ル処理およびエタノール沈澱により精製する。ついで、
XhoＩ開裂されたpACYC１７７とXhoＩ末端−ＨＢＶＤＮ
Ａとを分子比１：５で混合し、前記Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
の反応条件下に１８時間アニールさせる。
大腸菌ｘ１７７６の培養液を高木康敬編著「遺伝子操作
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液0.1m
lに、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０μｌを加え
てよく混合させ、０℃で２５分間放置したのち、アンピ
シリン（２０μｇ／ml）、α−ビオチン（１μｇ／m
l）、ジアミノピメリン酸（１００μｇ／ml）、チシン
（２０μｇ／ml）を含有するＬ−寒天プレート上に塗沫
して３７℃で一夜培養する。出現したコロニーについ
て、のカナマイシン（２０μｇ／ml）を含む寒天プレー
トとアンピシリン（２０μｇ／ml）を含む寒天プレート
にそれぞれ対応させて塗沫し、アンピシリンを含むプレ
ートでのみ増殖したコロニーを選択する。ｐＡＣＹＣ１
７７はアンピシリン耐性遺伝子とカナマイシン耐性遺伝
子を有するが、カナマイシン耐性遺伝子中にあるXhoＩ
部位にＨＢＶＤＮＡが挿入されることによりカナマイシ
ン耐性が消失される。すなわち選択されたコロニーはpA
CYC１７７−ＨＢＶＤＮＡの組換えＤＮＡを保持してい
る。得られたコロニー数個について、「代謝」第１７
巻、第４「リパーゼ」第８１〜８９頁（１９８０）に記
載される方法に従いプラスミドを調製する。得られたプ
ラスミドをpHBVと称す。このpHBVを制限酵素XhoＩで処
理すると3.2Kbの全ＨＢＶＤＮＡフラグメントが得ら
れ、またXhoＩとBamHＩで処理するとHBsAg遺伝子を含む
約1.3Kbのフラグメントが得られる。
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液0.1m
lに、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０μｌを加え
てよく混合させ、０℃で２５分間放置したのち、アンピ
シリン（２０μｇ／ml）、α−ビオチン（１μｇ／m
l）、ジアミノピメリン酸（１００μｇ／ml）、チシン
（２０μｇ／ml）を含有するＬ−寒天プレート上に塗沫
して３７℃で一夜培養する。出現したコロニーについ
て、のカナマイシン（２０μｇ／ml）を含む寒天プレー
トとアンピシリン（２０μｇ／ml）を含む寒天プレート
にそれぞれ対応させて塗沫し、アンピシリンを含むプレ
ートでのみ増殖したコロニーを選択する。ｐＡＣＹＣ１
７７はアンピシリン耐性遺伝子とカナマイシン耐性遺伝
子を有するが、カナマイシン耐性遺伝子中にあるXhoＩ
部位にＨＢＶＤＮＡが挿入されることによりカナマイシ
ン耐性が消失される。すなわち選択されたコロニーはpA
CYC１７７−ＨＢＶＤＮＡの組換えＤＮＡを保持してい
る。得られたコロニー数個について、「代謝」第１７
巻、第４「リパーゼ」第８１〜８９頁（１９８０）に記
載される方法に従いプラスミドを調製する。得られたプ
ラスミドをpHBVと称す。このpHBVを制限酵素XhoＩで処
理すると3.2Kbの全ＨＢＶＤＮＡフラグメントが得ら
れ、またXhoＩとBamHＩで処理するとHBsAg遺伝子を含む
約1.3Kbのフラグメントが得られる。
(2)HBsAg遺伝子発現プラスミドの調製 (i)HBs遺伝子全体が組み込まれたプラスミドの調製 プラスミドpHBVをXhoＩで処理して得られるＨＢＶＤＮ
Ａと、XhoＩで開裂されたシャトルベクターpAM８２を分
子比５：１にてＴ４ＤＮＡリガーゼによりアニールさせ
たのち、この反応溶液で大腸菌ｘ１７７６を形質転換す
る。得られたアンピシリン耐性の形質転換体よりプラス
ミドＤＮＡを調製し、これらについて制限酵素XhoＩ、X
baＩ、HindIIIで分析することにより、ベクターへのＨ
ＢＶＤＮＡの組み込みおよびその方向を確認する。
Ａと、XhoＩで開裂されたシャトルベクターpAM８２を分
子比５：１にてＴ４ＤＮＡリガーゼによりアニールさせ
たのち、この反応溶液で大腸菌ｘ１７７６を形質転換す
る。得られたアンピシリン耐性の形質転換体よりプラス
ミドＤＮＡを調製し、これらについて制限酵素XhoＩ、X
baＩ、HindIIIで分析することにより、ベクターへのＨ
ＢＶＤＮＡの組み込みおよびその方向を確認する。
選び出されたプラスミドはベクターのホスファターゼプ
ロモーターの下流にＨＢＶＤＮＡがHBs遺伝子、HBc遺伝
子の順に並ぶ向きに挿入されたものであり、これらがHB
sAg遺伝子発現プラスミドであって、このものをpAH２０
３と称する。
ロモーターの下流にＨＢＶＤＮＡがHBs遺伝子、HBc遺伝
子の順に並ぶ向きに挿入されたものであり、これらがHB
sAg遺伝子発現プラスミドであって、このものをpAH２０
３と称する。
(ii)HBsAg遺伝子フラグメントが組み込まれたプラスミ
ドの調製 プラスミドpHBVをBamHＩで処理して切断し、そのHBsAg
遺伝子フラグメント３μｇに対し、２００μＭのαＡＴ
Ｐ、αＣＴＰ、αＴＴＰおよびαＧＴＰを含む６７mMト
リス−HCl(pH8.6)、6.7ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０mM２−
メルカプトエタノール、6.7μＭ ＥＤＴＡ、16.7mM Am
SO4溶液１００μｌ中で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ0.2Ｕ
を３０分間作用させ、BamHＩ切断末端を埋める。ついで
フェノール抽出、エタノール沈澱を行なったのち、これ
とXhoＩリンカーとを１：１０の分子比でＴ４ＤＮＡリ
ガーゼによる結合反応を行なう。フェノール抽出、エタ
ノール沈澱ののち、これをさらにXhoＩで処理すると両
端がXhoＩ切断末端となった約1.3KbのHBsAg遺伝子フラ
グメントが得られる。このフラグメントとXhoＩで開裂
されたシャトルベクターpAM８２とを分子比５：１にて
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりアニールさせたのち、前記
(i)と同様にして大腸菌ｘ１７７６を形質転換してプラ
スミドＤＮＡを調製する。得られたプラスミドは、ベク
ターpAM８２のホスファターゼプロモーターの下流にHBs
Ag遺伝子が正しい向きに挿入されたものであり、これを
pAS１０１と称する。
ドの調製 プラスミドpHBVをBamHＩで処理して切断し、そのHBsAg
遺伝子フラグメント３μｇに対し、２００μＭのαＡＴ
Ｐ、αＣＴＰ、αＴＴＰおよびαＧＴＰを含む６７mMト
リス−HCl(pH8.6)、6.7ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０mM２−
メルカプトエタノール、6.7μＭ ＥＤＴＡ、16.7mM Am
SO4溶液１００μｌ中で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ0.2Ｕ
を３０分間作用させ、BamHＩ切断末端を埋める。ついで
フェノール抽出、エタノール沈澱を行なったのち、これ
とXhoＩリンカーとを１：１０の分子比でＴ４ＤＮＡリ
ガーゼによる結合反応を行なう。フェノール抽出、エタ
ノール沈澱ののち、これをさらにXhoＩで処理すると両
端がXhoＩ切断末端となった約1.3KbのHBsAg遺伝子フラ
グメントが得られる。このフラグメントとXhoＩで開裂
されたシャトルベクターpAM８２とを分子比５：１にて
Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりアニールさせたのち、前記
(i)と同様にして大腸菌ｘ１７７６を形質転換してプラ
スミドＤＮＡを調製する。得られたプラスミドは、ベク
ターpAM８２のホスファターゼプロモーターの下流にHBs
Ag遺伝子が正しい向きに挿入されたものであり、これを
pAS１０１と称する。
(3)形質転換酵母の調製 酵母としてサッカロミセス・セレビシエＡＨ２２［a le
u2 his4 can1(Cir+)］（微工研菌寄第６６６７号：微工
研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（２％ポ
リペプトン、１％イーストエキス、２％グルコース）１
００mlに接種し、３０℃で一晩培養したのち、遠心して
集菌する。滅菌水２０mlにて菌体を洗浄し、ついで1.2
Ｍソルビトールおよび１００μｇ／mlチリモリアーゼ６
０，０００（生化学工業製）の溶液５mlに懸濁させ、３
０℃で約３０分間保ち、スフェロプラスト化する。つい
で、スフェロプラストを1.2Ｍソルビトール溶液で３回
洗浄したのち、２Ｍソルビトール、１０mM CaCl2および
１０mMトリス−HCl(pH7.5)の溶液0.6mlに懸濁させ、そ
の６０μｌずつを小試験管に分注する。これに前記(3)
で調製した組換えプラスミドpAH２０３溶液３０μｌを
加え、充分混合し、さらに0.1Ｍ CaCl2（３μｌ）を加
えて最終濃度１０mM CaCl2とし、室温に５〜１０分間放
置する。ついでこれに、２０％ポリエチレングリコール
４０００、１０mM CaCl2および１０mMトリス−HCl(pH7.
5)溶液１mlずつを加えて混合し、室温に約２０分間放置
する。この混合液0.2mlずつを４５℃に保温された再生
培地（２２％ソルビトール、２％グルコース、0.7％イ
ーストニトロゲンベースアミノ酸、２％ＹＰＤ、２０μ
ｇ／mlヒスチジン、３％寒天）１０mlに加え、軽く混合
させ、予め準備された1.2Ｍソルビトール含有最小培地
（0.7％イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％グル
コース、２０μｇ／mlヒスチジン、２％寒天）プレート
に重層し、固化させたのち、３０℃で培養してロイシン
非要求性酵母のコロニーを得る。このコロニーを２０μ
ｇ／mlヒスチジンを含むバルクホルダーミニマルメディ
ウム（Tohe,A.et al；J.Bacteriol.,１１３，７２７〜
７３８（１９７３）を参照］にて培養して形質転換酵母
サッカロミセス・セレビシエpAH２０３を得る。
u2 his4 can1(Cir+)］（微工研菌寄第６６６７号：微工
研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（２％ポ
リペプトン、１％イーストエキス、２％グルコース）１
００mlに接種し、３０℃で一晩培養したのち、遠心して
集菌する。滅菌水２０mlにて菌体を洗浄し、ついで1.2
Ｍソルビトールおよび１００μｇ／mlチリモリアーゼ６
０，０００（生化学工業製）の溶液５mlに懸濁させ、３
０℃で約３０分間保ち、スフェロプラスト化する。つい
で、スフェロプラストを1.2Ｍソルビトール溶液で３回
洗浄したのち、２Ｍソルビトール、１０mM CaCl2および
１０mMトリス−HCl(pH7.5)の溶液0.6mlに懸濁させ、そ
の６０μｌずつを小試験管に分注する。これに前記(3)
で調製した組換えプラスミドpAH２０３溶液３０μｌを
加え、充分混合し、さらに0.1Ｍ CaCl2（３μｌ）を加
えて最終濃度１０mM CaCl2とし、室温に５〜１０分間放
置する。ついでこれに、２０％ポリエチレングリコール
４０００、１０mM CaCl2および１０mMトリス−HCl(pH7.
5)溶液１mlずつを加えて混合し、室温に約２０分間放置
する。この混合液0.2mlずつを４５℃に保温された再生
培地（２２％ソルビトール、２％グルコース、0.7％イ
ーストニトロゲンベースアミノ酸、２％ＹＰＤ、２０μ
ｇ／mlヒスチジン、３％寒天）１０mlに加え、軽く混合
させ、予め準備された1.2Ｍソルビトール含有最小培地
（0.7％イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％グル
コース、２０μｇ／mlヒスチジン、２％寒天）プレート
に重層し、固化させたのち、３０℃で培養してロイシン
非要求性酵母のコロニーを得る。このコロニーを２０μ
ｇ／mlヒスチジンを含むバルクホルダーミニマルメディ
ウム（Tohe,A.et al；J.Bacteriol.,１１３，７２７〜
７３８（１９７３）を参照］にて培養して形質転換酵母
サッカロミセス・セレビシエpAH２０３を得る。
上記の方法において、組換えプラスミドpAH２０３の代
わりにpAS１０１を用いてサッカロミセス・セレビシエp
AS１０１を得る。
わりにpAS１０１を用いてサッカロミセス・セレビシエp
AS１０１を得る。
(4)形質転換酵母によるHBsAgの製法 前記(3)で得られた形質転換酵母の各コロニーをさらに
２０μｇ／mlヒスチジンを含むバルクホルダーミニマル
メディウムの寒天プレート上に塗布し、３０℃にて培養
してコロニーを形成させる（ロイシン非要求性となった
形質転換体の再確認のため）。ついでこのコロニーから
菌体を分離し、２０μｇ／mlヒスチジンを含むバルクホ
ルダーミニマルメディウム１０mlに接種し、３０℃にて
培養を行なう。約２４時間後、対数増殖期による菌体を
遠心して集菌し、これをリン酸を含まない最小培地（バ
ルクホルダーミニマルメディウムに含まれるKH2PO4をKC
lで置換し、さらに２０μｇ／mlヒスチジンを加えたも
の）１０mlに菌数約４×１０６cells／mlになるように
懸濁し、３０℃にて約２４時間培養を続けたのち、４，
０００回転、１０分間の遠心により菌体を集める。この
菌体を1.2Ｍソルビトール、５０mMリン酸緩衝液（pH7.
2）、１４mM−メルカプトエタノール、１００μｇ／ml
ザイモリエース６０，０００の溶液３mlに懸濁させ、３
０℃にて３０分間ゆるやかに振盪してスフェロプラスト
化し、遠心分離によりこれを集める。このスフェロプラ
ストを0.1％トリトンＸ−１００、５０mMリン酸緩衝液
（pH7.2）１mlに充分懸濁し、数回激しく攪拌し、７０
００回転にて１０分間遠心して得られる上清液を酵母溶
菌液としてとる。
２０μｇ／mlヒスチジンを含むバルクホルダーミニマル
メディウムの寒天プレート上に塗布し、３０℃にて培養
してコロニーを形成させる（ロイシン非要求性となった
形質転換体の再確認のため）。ついでこのコロニーから
菌体を分離し、２０μｇ／mlヒスチジンを含むバルクホ
ルダーミニマルメディウム１０mlに接種し、３０℃にて
培養を行なう。約２４時間後、対数増殖期による菌体を
遠心して集菌し、これをリン酸を含まない最小培地（バ
ルクホルダーミニマルメディウムに含まれるKH2PO4をKC
lで置換し、さらに２０μｇ／mlヒスチジンを加えたも
の）１０mlに菌数約４×１０６cells／mlになるように
懸濁し、３０℃にて約２４時間培養を続けたのち、４，
０００回転、１０分間の遠心により菌体を集める。この
菌体を1.2Ｍソルビトール、５０mMリン酸緩衝液（pH7.
2）、１４mM−メルカプトエタノール、１００μｇ／ml
ザイモリエース６０，０００の溶液３mlに懸濁させ、３
０℃にて３０分間ゆるやかに振盪してスフェロプラスト
化し、遠心分離によりこれを集める。このスフェロプラ
ストを0.1％トリトンＸ−１００、５０mMリン酸緩衝液
（pH7.2）１mlに充分懸濁し、数回激しく攪拌し、７０
００回転にて１０分間遠心して得られる上清液を酵母溶
菌液としてとる。
この溶菌液２０μｌをHBs抗原ＲＩＡキット（アボット
社製）によりHBs抗原活性を測定した。その結果を第１
表に示す。
社製）によりHBs抗原活性を測定した。その結果を第１
表に示す。
第１図は本発明に用いられるシャトルベクターの具体
例、pAT７７およびpAM８２の構造、第２図は該シャトル
ベクターの酸性ホスファターゼプロモーター付近の遺伝
子地図、第３図はそのBstE II−SalＩ領域の塩基配列を
示す。
例、pAT７７およびpAM８２の構造、第２図は該シャトル
ベクターの酸性ホスファターゼプロモーター付近の遺伝
子地図、第３図はそのBstE II−SalＩ領域の塩基配列を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−48082（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．1293 Ｐ．717 〜722（1981) Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖ ｏｌ．１ Ｎｏ．６ Ｐ．675〜680 （1982)
Claims (3)
- 【請求項１】酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みか
つ酵母の抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域を
担ったシャトルベクターであって、該酵母の遺伝子がar
s1、２μoriならびに形質転換酵母の選択マーカーとな
る遺伝子を含み、該大腸菌の遺伝子が大腸菌プラスミド
pBR322に由来し、大腸菌体内において増殖するために必
要なＤＮＡ配列並びに形質転換大腸菌の選択マーカーと
なる遺伝子を含み、さらに該抑制性酸性ホスファターゼ
形質発現調節領域がホスファターゼを構成する６０，０
００ダルトンのポリペプチドの遺伝子であり、該形質発
現調節領域下流に本来存在する酸性ホスファターゼの構
造遺伝子が除去され、更に該構造遺伝子の上流の＋１〜
−３３bpの範囲の適当な部位までがエキソヌクレアーゼ
によって除去されているシャトルベクターの該形質発現
調節領域の制御下に発現させるべき外来遺伝子を組み込
むことを特徴とする組換えプラスミドの構築方法。 - 【請求項２】該形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝
子がロイシン産生遺伝子、ヒスチジン産生遺伝子、トリ
プトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝子およびアデ
ニン産生遺伝子から選ばれる１種または２種以上である
前記第(1)項記載のプラスミドの構築方法。 - 【請求項３】該形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺
伝子が、アンピシリン耐性遺伝子および／またはテトラ
サイクリン耐性遺伝子である前記第(1)項記載の組換え
プラスミドの構築方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57145093A JPS5936699A (ja) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | シヤトルベクタ− |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57145093A Division JPS5936699A (ja) | 1982-08-16 | 1982-08-20 | シヤトルベクタ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62115289A JPS62115289A (ja) | 1987-05-26 |
| JPH0665308B2 true JPH0665308B2 (ja) | 1994-08-24 |
Family
ID=15377210
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57145093A Granted JPS5936699A (ja) | 1982-08-16 | 1982-08-20 | シヤトルベクタ− |
| JP61107431A Expired - Lifetime JPH0665308B2 (ja) | 1982-08-20 | 1986-05-10 | 組換えプラスミドの構築方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57145093A Granted JPS5936699A (ja) | 1982-08-16 | 1982-08-20 | シヤトルベクタ− |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5707862A (ja) |
| JP (2) | JPS5936699A (ja) |
| KR (1) | KR840005740A (ja) |
| AU (1) | AU562633B2 (ja) |
| CA (1) | CA1270453A (ja) |
| DK (1) | DK381483A (ja) |
| ES (1) | ES8602935A1 (ja) |
| SU (1) | SU1393317A3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0811074B2 (ja) * | 1987-10-30 | 1996-02-07 | 財団法人化学及血清療法研究所 | プレアルブミンをコードする遺伝子を組込んだ組換えプラスミドおよびこれを用いたプレアルブミンの製法 |
| JPH0291660U (ja) * | 1988-12-28 | 1990-07-20 | ||
| EP1560919A2 (en) * | 2001-03-29 | 2005-08-10 | Genetic Technologies, L.P. | Improved hybrid gene libraries and uses thereof |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2441659A1 (fr) * | 1978-11-14 | 1980-06-13 | Anvar | Nouveaux plasmides hybrides et microorganismes les contenant |
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| JPS5931799A (ja) * | 1982-08-16 | 1984-02-20 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド |
| AU584580B2 (en) * | 1982-09-08 | 1989-06-01 | Smith Kline - Rit | Hepatitis B virus vaccine |
| CA1341302C (en) * | 1983-02-22 | 2001-10-09 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis of foreign protein |
| JPH0655146B2 (ja) * | 1985-12-27 | 1994-07-27 | 財団法人化学及血清療法研究所 | シヤトルベクタ− |
-
1982
- 1982-08-20 JP JP57145093A patent/JPS5936699A/ja active Granted
-
1983
- 1983-08-15 AU AU18003/83A patent/AU562633B2/en not_active Expired
- 1983-08-18 KR KR1019830003854A patent/KR840005740A/ko not_active Application Discontinuation
- 1983-08-19 DK DK381483A patent/DK381483A/da not_active Application Discontinuation
- 1983-08-19 CA CA000435007A patent/CA1270453A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-08-19 ES ES525065A patent/ES8602935A1/es not_active Expired
- 1983-08-19 SU SU833635251A patent/SU1393317A3/ru active
-
1986
- 1986-05-10 JP JP61107431A patent/JPH0665308B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-11-29 US US07/622,344 patent/US5707862A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．１２９３Ｐ．７１７〜７２２（１９８１） |
| ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌｖｏｌ．１Ｎｏ．６Ｐ．６７５〜６８０（１９８２） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES525065A0 (es) | 1985-12-01 |
| JPS6155951B2 (ja) | 1986-11-29 |
| ES8602935A1 (es) | 1985-12-01 |
| JPS5936699A (ja) | 1984-02-28 |
| KR840005740A (ko) | 1984-11-16 |
| AU1800383A (en) | 1984-02-23 |
| DK381483A (da) | 1984-02-21 |
| US5707862A (en) | 1998-01-13 |
| CA1270453A (en) | 1990-06-19 |
| JPS62115289A (ja) | 1987-05-26 |
| AU562633B2 (en) | 1987-06-18 |
| DK381483D0 (da) | 1983-08-19 |
| SU1393317A3 (ru) | 1988-04-30 |
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