SU1393317A3

SU1393317A3 - Способ получени челночного вектора

Info

Publication number: SU1393317A3
Application number: SU833635251A
Authority: SU
Inventors: Миянохара Ацуси; Тох-Е Акио; Мацубара Кениси
Original assignee: Джуридикал Фаундейшн Дзе Кемо-Серо Терапевтик Рисерч Институт (Фирма)
Priority date: 1982-08-20
Filing date: 1983-08-19
Publication date: 1988-04-30
Also published as: AU562633B2; AU1800383A; DK381483A; JPS62115289A; JPS5936699A; ES525065A0; JPH0665308B2; ES8602935A1; CA1270453A; KR840005740A; JPS6155951B2; DK381483D0; US5707862A

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии , к генетической инженерии, и касаетс челночного вектора, который содержит фрагмент ДНК и фрагмент ДНК Escherichia coli и может воспроизводитьс как в E.coli, так и в дрожжах. Цель изобретени - создание высококо- пийного вектора. Дл этого фрагмент Есо RI размером 8 кв, содержащий полипептидный РбО ген, молекул рной массой 60000 дальтон вводитс в точку Есо RI плазмиды pBR 322 E.coli, в результате чего образуетс плазмида, котора служит в качестве исходного продукта дл дальнейшего конструировани вектора рАТ 77. о

Description

со со со

см

Изобретение относитс к биогехнп- логии, а именно к генетической инженерии , и касаетс челночного вектора, который содержит дрожжевой фрагмент ДНК и фрагмент ДНК Escherichia coli - промотор кислой фосфатазь и может воспроизводитьс как в E.coli, так и в дрожжах.

Целью изобретени вл етс созда- ние высококопийного вектора.

Дл этого фрагмент Есо RI размером 8 КБ, содержащий полипептидкый РбО ген, молекул рной массой 60 000 даль- тон вводитс в точку Есо RI плазмиды pBR 322 E.coli, в результате чего образуетс плазмида, .котора служит в качестве исходного продукта дл дальнейшего конструировани вектора .рАТ 77. .

Изобретение иллюстрируетс следующими примерами.

Пример 1. Фрагмент Есо RI размером 8 кв, содержащий полипептидный ген РбО молекул рной массой 60000 дальтон, получают из банка генов S288 С, клонируют в Есо RI сайт плазмиды pBR 322 E.coli.

Эту плазмиду переваривают с эндо- нуклеазой Sal I и сшивают ДНК-лигазой Т , образу плазмиду рАТ 25, в которой удален из точки Sal I в фрагмент ген кислой фосфатазы 5,2 кв. Полученна плазмида рАТ 25 состоит из фраг- мента плазмиды pBR 322 (примерно ;3., 7 КБ) от точки Есо RI до точки .;Sal I, который содержит ген стойкости к ампициллину, и фрагмента (примерно 2,8 кв) от точки Есо RI до точки Sal I, содержащего дрожжевой, ген кислой фосфатазы.

В точку Есо RI указанной плазмиды рАТ 25 ввод т фрагмент Есо RI (1,4кв) содержащий ген ars I.-trp I, который выдел ют из плазмиды YR 7 посредством Есо RI, Б результате получают плазмиду рАТ 26. Указанный фрагмент ars I- trp I имеет одну точку распознавани ограничительного фермента Hind III в гене trp I.

В точку Hind III указанной плазмиды рАТ 26 ввод т Hind III фрагмент, содержащий Leu 2 и 2 ori, который получают путем обработки плазмиды pSLE I посредством Hind III эндонук- леазы, в результате .получают челночный вектор рАТ 77. Этот челночный вектор в штамма Saccharomyces cerevi- siae АН 22 был сдан на хранение в Научно-Исследовательский Институт Ферментации , Агентство по промьпиленным исследовани м и технологии, Япони , Budapest Treaty и ему присвоено официальное название FERM ВР-324.

Полученный таким образом рАТ 77 (1 мкг) расщепл ют Sal I эндонуклеазой и затем обрабатывают экзонуклеазой BAL 31 (0,1 и) в растворе (50 мкл) 20 мМ Трис-НС1 (рП 8,2), 12 мМ, СаСЦ 12 мМ MgCl;, 12 М NaCl и 1 мМ ЕДТА (этилендиамиптетрауксусна кислота) в течение от 30 с до 1 мин. Реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и осаждению. Полученные осажденные продукты обрабатывают эндонуклеазой Xho I (lum) и ДНК-лигазой Т. В течение 12 ч E.coli х 1776 обрабатывают указанной реакционной смесью таким образом, что происходит трансформаци E.coli X 1776 и образуютс стойкие к ампициллину трансформанты. Из колоний трансформантов получают плазмиды ДНК. Определ ют нуклеотидную последовательность полученных ДНК, и зону гена кислой фосфатазы, удал е- мую при обработке BAL 31. Нар ду с указанным ДНК отбирают и выдел ют плазмиды рАМ 81, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84, которые полностью лишены структурного гена фосфатазы.

Обознача А в кодоне АТС, кодирующем первую аминокислот.у (метиоНин) продукта РбО структурного гена фосфатазы как +1, отмечают, что в челночных векторах удалены следующие зоны: вектор. рАМ 8V до +2; вектор рАМ 82 до -33; вектор рАМ 83 до-50; и вектор рАМ 84 до-51. Векторы рАМ 81, рАм 82, рАМ 83 и рАМ 84 в Saccharomyces cerevisiae АН 22/рАМ81 АН 22/рАм 82, АН 22/рАМ 83, и АН 22/ /рАМ 84 соответственно были сданы на хранение в Научно-Исследовательский Институт Ферментации, Агентство по промьш1ленным исследовани м и технологии , Япони , Budapest Treaty, и им присвоены официальные названи , соответственно FERM ВР-325, FERM ВР- 313, FERM ВР-327 и FERM ВР-326.

П р и м е р 2. Получают кров ную плазму, собранную от дес ти-пациентов (в количестве 700 мл), которые имеют положительную реакцию на HBsAg (небольшое отклонение от типа adr) и на HBeAg, и эту плазму центрифугируют при скорости вращени центрифуги 5000 об/мин в течение 20 мин с целью

удалени нерастворенных веществ. Полученный раствор центрифугируют при температуре , при скорости вращени центрифуги 18 000 об/мин в течение 8 ч, и образующиес осажденные продукты снова раствор ют в 10 мл буферного раствора (рН 7,5) 10 мМ, Трис-НС1, 0,1 М NaCl и 1 М ЕДТА. Этот раствор ввод т в верхнюю часть пробирки центрифуги, содержащей 30% сахарозы, и центрифугирование осуществл ют при при скорости вращени центрифуги 39 000 об/мин в течение 4 ч. Полученные осажденные продукты повторно раствор ют в таком же буфер- ном растворе, что указан выше.

Дл того, чтобы облегчить описанную операцию, буферный раствор хими- чески взаимодействует с HBY ДНК поли- меразой при обработке его в смеси (500 мкл) 67 мМ. Трис-НСГ(рН 7,5), 80 мМ Ш,С1, 25 мм KgCl,, 0,5% NP40 (тергитол, выпускаемый фирмой Сигма Ко), 0,1% 2-меркаптозтанола, 330 мкл dCTP (дезоксицитидинтрифосфат), dGTP (дезоксигуанозинтрифосфат) и dATP (деоксиаденозинтрифосфат),0,5 мкм

. d - f32 j dTTP (дезокситимидинтрифосфат ) при температуре в течение 3ч, ив эту реакционную смесь ввод т такой же объем 100 мМ раствора ЕДТА. В результате одноцепочечна ДНК удва . иваетс до двуцепочечной ДНК, образу меченый С32р1 продукт. Этот продукт ввод т в пробирку центрифуги (свер- ху), в которой наход тс слои 30, 20 и 10%-ного водных растворов сахарозы в указанном пор дке, и осуществл ют центрифугирование при температуре 4°С при скорости вращени центрифуги 39 000 об/мин в течение 4,5 ч.

Дл разрушени белков, прочно св занных с ДНК, полученные осамсденные продукты обрабатывают в смеси (200 мкл) 1 мг/мл проназы Е (изготавливаетс фирмой Kakeu Kadaku К.К) и 0,2%-ным водным раствором натрийлаурилсульфата при температуре 31°С в течение 2 ч. Полученную смесь дважды экстрагируют фенолом (200 мкл) и образующийс содержащий ДНК экстракт промывают простым эфиром с целью удалени феноль- ного растворител , в результате чего получают раствор HBV ДНК. Образующа с таким путем ДНК имеет удельную радиоактивность 2,5 х 10 отсч. (мин)

c

0 5

п

0

5

0

5

мкг и может использоватьс дл вываривани ограничительными ферментами..

Двухцепочечную кольцевую HBV ДНК, полученную как описано выше, клонируют с использованием ДНК Д-фага Шарон 16А в качестве вектора, и затем снова клонируют с использованием известной плазмиды рА СУС 177 в качестве вектора следующим образом.

HBV ДНК (20 нг) обрабатывают эндо- нуклеазой Xho I в смеси (20 мкл) 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), 7 мМ MgCli, 100 М NaCl и 7 мМ 2-меркаптоэтанола при температуре 37 С в течение 2 ч. Полученную смесь экстрагируют фенолом (20 мкл) и затем простым эфиром и к водному слою добавл ют двойной обьем охлажденного этанола с целью осаждени ДНК. Смесь выдерживают при температуре в течение 1 ч и затем . центрифугируют при скорости вращени центрифуги 10 000 об/мин в течение 5 мин и осажденную ДНК извлекают. Отделенные таким образом осажденные продукты раствор ют в смеси (5 мкл) 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,4), и 1 мМ ЕДТА HBV ДНК с равномол рным количеством ДНК А-фага Шарон 16 А, полученным путем расщеплени эндонуклеазой Xho 1 и с ДНК-лигазой 14 смесь 50 мм Трис- НС1 (рН 7,4), 10 М MgClt, 10 мМ ди- тиотреитола, 100 мкг/мл альбумина тел чей сыворотки, 0,5 мМ АТР и 0,5 мкл ферментного препарата лигазы Т, полученного фирмой Такага bio- raedicals I - 5хШ ед/мл 7 при температуре в течение 18 ч. Реакционную смесь экстрагируют фенолом и простым эфиром и затем подвергают осаждению этанолом таким же образом, как описано вьщ1е.

Полученные таким образом осажденные продукты раствор ют в смеси (10 мкл) 10 мМ Трис-НС (рН 7,4) и 1 мМ ЭДТА.

Обработанную таким образом ДНК подвергают операции упаковки с образованием Л-фага и затем из него образуют колонии (10) на чашках (23х х23 см) с L-arapoM с использованием E.coli ДР50 SupF в качестве индикатора . Эти колонии подвергают гибридизации с использованием меченой 32р HBV ДНК с тем, чтобы отобрать образующиес колонии из фага, имеющего HBV ДНК, в результате чего отдел ют множество желаемых фагов.

Из фага, включающего HBV ДНК, полученного как указано выше в разделе, приготавл ют фаговую ДНК с использованием Е. coli ДР 50 - Sup F в качестве заражаемых бактерий. Полученную таким образом ДНК переваривают Xho I в тех же услови х, что описаны выше, в течение 2 ч, и полученную реакционную смесь подвергают электрофорезу с 0,75%-ным агарозным гелем, в результате чего извлекают HBV ДНК (3,2кв). HBV ДНК адсорбируют на ДЕАЕ (дизтил- аминоэтилцеллюлоза) бумаге (изготавливаемой фирмой Тоуо Roshi, Япони ) с целью отделени ее от вектора ДНК и затем элюируют 1 М водным раствором , в результате чего получают HBV ДНК, имеющую с обоих концов группы Xho I,

Плазмиду рАСУС 177 с единственным сайтом Xho I в пределах гена стойкости к канамицину переваривают Xho I, и полученный продукт очищают путем экстракции фенолом и обработки прос- тым эфиром и осаждают этанолом.

Полученную таким образом ДНК рАСУС 177, расщепл ют Xho I и смеши вают с HBV ДНК с концом Xho I, в мо- л рном отношении 1. 5, и смесь сшиваю

,ДНК-лигазой Т в течение 18 ч.

ДНК (10 мкл), полученную как опи- |Сано выше, ввод т в жидкость, содер- ;жащую E.coli (0,1 мл), которую приго- :тавливают путем обработки бульона выращивани E.coli к 1776, смесь тщательно перемешивают и выдерживают при О ,С в течение 25 мин. Эту смесь нано- с т на чашку с L-агаром, содержащим ампициллин (20 мкг/мл), о -биотин

(1 мкг/мл), диаминопимелиновую кисло- ту (100 мкг/мл) и тимин (20 мкг/мл) и термостатируют в течение ночи. По- лученные колонии нанос т на чашку с агаром, содержащую канамицин (20 мкг/мл), и отбирЗ .ют колонии, которые лишь на чашке с агаром, содержащей ампициллин рАСУС 177 содержит стойкий к ампициллину ген и стойкий к канамицину ген, но ког;да вводитс HBV ДНК в сайт гена Xho I стойкости к канамицину, то он тер ет стойкость к канамицину. В св зи с этим отобранные колонии включают соответственно рекомбинантную ДНК. Из отобранных таким путем колоний приготавливают гшазмиду.

5

Q

е;

0

Полученную плазмиду, т.е. рекомби- натную pACyC177-HBV (которую обозначают pHBV) обрабатывают Xho 1 при тех же услови х, что описаны выше , в результате чего получают общий фрагмент HBV ДНК (3,2 кв). Кроме того , когда эту плазмиду обрабатывают Xho I и Ват Н,, то получают фрагмент (примерно 1,3 кв), содержащий ген HBs Ag.

HBV ДНК, полученную путем обработки плазмиды pHBV (рАСУС 177-HBV ДНК) посредством Xho I, рекомбинируют с расщепленным Xho I челночным вектором , рАМ 82, в мол рном отношении 5:1 путем термообработки с ДНК-лигазой Т-} при тех же услови х, что описаны выше.

E.coli X 1776 трансформируют данной реакционной смесью и плазмидную ДНК выдел ют из стойких к ампициллину трансформантов таким же образом,- как описано выше. Полученные таким путем ДНК анализируют различными ограничительными ферментами, такими как Xho I и Hind III, и в результате определ ют ввод HBV ДНК в векторы,и их направление .

Полученные плазмиды, выражающие ген HBs Ag, включают ген HBs и ген НВс, идущие от гена кислой фосфотазы.

Фрагмент гена HBs Ag (3 мкг), полученный путем расщеплени плазмиды pHBV посредством Ват Hi, обрабатывают ДНК полимеразой Т (0,2 U) в растворе (100 мкл) 67 мМ Трис-НС1 (рН 8,6), 6,7 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 6,7 мМ ЕДТА и 16,7 мМ (NH4)2S04, который содержит 200 мМ с/АТР, at СТР, о/ ТТР и C/GTP, в течение 30 мин с тем, чтобы заполнить расщепленный Ват HI конец. Реакционную смесь подвергают экстракции фенолом и осаждению этанолом. Полученные осажденные продукты подверган т реакции св зывани со св зующим звеном Xho I в мол рном отношении 1:10 с ДНК-лигазой Т в тех же услови х, что описаны выше. После экстракции фенолом и осаждени этанолом полученную плазмиду обрабатывают Xho I, в результате чего получают фрагмент гена HBs Ag (примерно 1,3 KB), имеющий по обоим концам Xho I. Полученный фрагмент сшивают с челночным вектором рАМ 82, который расщепл ют посредством Xho в мол рном отношении 5:1 с использованием ДНК-лигазы Т, и E.coli х X 1776 трансформируют полученной реакционной смесью.

Исходные дрожжи представл ют собой Saccharomyces cerevisiae АН22 (а. Leu 2, his 4, canl ), которые были сданы на хранение в Научно-Исследова-, тельский Институт Ферментации, Агентство промышленных, исследований и нологии, Япони , Budapest treaty, где им присвоено официальное название FERM ВР-312. Эти исходные дрожжи инокулируют в среде УРД (100 мл), содержащей 2% полипептона, 1% дрожжево- го экстракта и 2% глюкозы и смесь термостатируют при температуре 30 С в течение ночи и после этого клетки извлекают пУтем центрифугировани . Извлеченные клетки промывают стерили- 20 зованной водой (20 мл) и суспензируют в растворе (5 мл) 1,2 м сорбита и 100 мкг/мл зимолиазы - 60 000 (поставл етс фирмой Seikagaku -Kagyo К.К., Япони ), и суспензию выстаивают 25 при 30°С в течение 30 мин и в результате получают сферопласт. Приготовленный таким образом сферопласт промывают 1,2 М раствором сорбита три раза и затем суспендируют в растворе (0,6 мл) 2 М сорбита, 10 мМ CaCl7 и 10 мК Трис-НС1 (рН 7,5). Полученную суспензию раздел ют на небольшие пробирки объемом 60 мкл. К суспензии добавл ют раствор рекомбинантной плазмиды рАН 203 (30 мкл). После тщательного перемешивани к нему добавл ют 0,1 М CaCli (3 мкл) до конечной концентрации СаС Ю мМ и смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 5-10 мин. В каждую полученную смесь ввод т 1 мл раствора 20%-ного полиэтиленгликол 4000, 10 мМ CaClj и 10 мМ Трис-НС1 (рН

30

40

ра 2, и оставл ют на этом -слое. Чашк термостатируют при температуре 30°С, в результате чего получают Колонию не требующих лейцин дрожжей. Эту колонию термостатируют в минимальной питательной среде Burkholder с добав лением гистидина (20 мкг/мл), в результате чего получают трансформированные дрожжи: Saccharomyces cerevisiae рАН 203.

Каждую колонию трансформированных дрожжей нанос т на чашку с агаром с содержанием минимальной питательной среды Burkholder, с введенным гисти- дином (20 мкг/мл) и термостатируют при температуре ЗО С, в результате чего образуетс колони . Полученные клетки отдел ют от данной колонии, инокулируют в минимальной питательно среде Burkholder, в которую введен гистидин (20 мкг/мл),и термостатирую при температуре 30°С. По прошествии примерно 24 ч клетки в фазе логарифмического роста извлекают путем центрифугировани , суспендируют в ми нимальной питательной среде (10 мл), не содержащей фосфорную кислоту, .ко торую приготавливают путем замены КН2Р04 в минимальной питательной среде Burkholder хлористым калием , с последующим вводом гистидина в количестве (20 мкг/мл) с концентра цией клеток примерно 4x10 клеток/мл После термостатировани при температуре в течение примерно 24 ч пи тательный бульон культуры центрифугируют при скорости вращени центрифуги 4000 об/мин в течение 10 мин, собира указанные клетки. Отделенные таким образом клетки суспендируют в растворе (3 мл) 1,2 М сорбита, 30 мМ буферного раствора фосфата (рН 7,2), 14 мМ 2-меркаптоэ танола и 100 мкг/мл

7,5) и смесь отстаивают при комнатной .с зимолиазы 60000 (поставл етс фирмой

50

температуре в течение 20 мин. Полученную смесь (каждую по 0,2 мл) ввод т в среду (10 мл), содержащую, %: сорбита 22, глюкоза 2, аминокислота 0,7 на основе дрожжевого азота, УРД 2, 20 мкг/мл гистидина и агара 3, который поддерживаетс при температуре 45°С. После осторожного перемешивани смесь нанос т на слой с минимальной питательной средой, содержащей 1,2 М сорбита, котора была получена пред- варительно и содержит, %: аминокислоты 0,7 на основе дрожжевого азота, глюкозы 2, 20 мкг/мл гистидина и атаSeikagaku Kagyo К.К., Япони ), и смесь осторожно взбалтывают при тем- пературе в течение 30 мин, в результате чего получаетс сферопласт .

Этот сферопласт извлекают путем центрифугировани и тщательно суспендируют в растворе (1 мл) 0,1%-ного тритона Х-100 и 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), интенсивно перемешивают и затем центрифугируют при скорости вращени центрифуги 7000 об/мин в течение 10 мин и полученный поверх 5

0

ра 2, и оставл ют на этом -слое. Чашку термостатируют при температуре 30°С, в результате чего получают Колонию не требующих лейцин дрожжей. Эту колонию термостатируют в минимальной питательной среде Burkholder с добавлением гистидина (20 мкг/мл), в результате чего получают трансформированные дрожжи: Saccharomyces cerevisiae рАН 203.

Каждую колонию трансформированных дрожжей нанос т на чашку с агаром с содержанием минимальной питательной среды Burkholder, с введенным гисти- дином (20 мкг/мл) и термостатируют при температуре ЗО С, в результате чего образуетс колони . Полученные клетки отдел ют от данной колонии, инокулируют в минимальной питательной среде Burkholder, в которую введен гистидин (20 мкг/мл),и термостатируют при температуре 30°С. По прошествии примерно 24 ч клетки в фазе логарифмического роста извлекают путем центрифугировани , суспендируют в минимальной питательной среде (10 мл), не содержащей фосфорную кислоту, .которую приготавливают путем замены КН2Р04 в минимальной питательной среде Burkholder хлористым калием , с последующим вводом гистидина в количестве (20 мкг/мл) с концентрацией клеток примерно 4x10 клеток/мл. После термостатировани при температуре в течение примерно 24 ч питательный бульон культуры центрифугируют при скорости вращени центрифуги 4000 об/мин в течение 10 мин, собира указанные клетки. Отделенные таким образом клетки суспендируют в растворе (3 мл) 1,2 М сорбита, 30 мМ буферного раствора фосфата (рН 7,2), 14 мМ 2-меркаптоэ танола и 100 мкг/мл

0

Seikagaku Kagyo К.К., Япони ), и смесь осторожно взбалтывают при тем- пературе в течение 30 мин, в результате чего получаетс сферопласт .

Этот сферопласт извлекают путем центрифугировани и тщательно суспендируют в растворе (1 мл) 0,1%-ного тритона Х-100 и 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), интенсивно перемешивают и затем центрифугируют при скорости вращени центрифуги 7000 об/мин в течение 10 мин и полученный поверх Иостный слой извлекают как лиэировар Ный дрожжевой раствор,

Этот лизированный раствор,подвергают испытанию с HBs антигеном F.IA kit (полученным Abbott; США) на активность к антигену HBs. Результаты не--. г|ытаний представлены в та6л.1.

Таблица 1

S.Cerevisiae рАН 203 13 008

АН2 2 (FERMBP312 )

рА 101. рАМ 82

1 200

320

Данный вектор не имеет гена HBV

или HBs и используетс как негатив ) НЫЙ эталон.

((Негативный контроль RIA kit имеет активность 310 отсч./мин и его позитивный контроль имеет активность 17 500 отсч./мин)о30

Фрагмент rerta HBcAg приготавливают следующим образом.

Плазмиду pHBV (3 мкг) переваривают 1C ограничительной эндонуклеазой Rsa I ;обычным образом. Реакционную смесь 5 подвергают экстракции фенолом и осаждению этанолом. Полученные осажденные продукты подвергают реакции св зыва25

Исходные дрожжи представл ют собой Saccharomyces cerevisiae АН 22 (а Leu 2 his 4 canl , которые были сданы на хранение в Научно-Исследовательс- кий институт Ферментации, Агентство по промышленным исследовани м и технологии , Япони , Budapest treaty, где им присвоено официальное название РЕЮЧ ВР-312. Исходные дрожжи инокулируют в среде УРД (100 мл), содержащей, %: полипептид 2, дрожжевой экстракт 1 и глюкоза 2,и смесь термостатируют при температуре в течение ночи, а после этого клетки извлекают путем центрифугировани . Собранные таким образом клетки промывают стерилизованной водой (20 мл), суспендируют в растворе (5 мл) 1,2 М, сорбита и 100 мкг/мл зимолиазы - 60 000 (поставл емой фирмой Seikagaku Kogyo К.К., Япони ) и суспензию.выстаивают при 30 С в течение 30 , в результате чего получают сферо- 25 пласт. Полученный таким путем сферо- пласт промывают 1,2 М раствором сорбита три раза, а затем суспендируют в растворе (0,6 мл) 2 М сорбита, 10 мМ CaCli и 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5). Эту суспензию распредел ют по небольшим пробиркам объемом по 60 мл. К суспензии добавл ют раствор реком- бинантной плазмиды 301 (30 мкл). После тщательного перемешивани к раствору добавл ют 0,1 М CaCli (3 мкл) до конечной концентрации СаС, равной 10 мМ, и смесь выстаивают при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин. В полученную смесь добавл ют

НИН -с линером Xho I в мол рном отношении 1:10 ДНК-лигазой Т,. После эк- 40 1 : J21LL 1 1 лппп ° п S стракции фенолом и оса удени этанолом полученные осадки подвергают переваго полиэтиленг ликол 4000, 10 мМ CaCl и 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), и

эту смесь выстаивают при комнатной температуре в течение примерно 20 мин.

риванию Xho I, в результате чего образуетс фрагмент гена ИБс (примерно 0,7 KB), по обоим концам которого имеетс концевое расщепление Xho I.

Полученный таким образом фрагмент переваривают с челночным вектором рАМ 82,, который расщепл етс посредством Xho I в молекул рном отношении 5:1 с использованием ДНК-лигазы Т. Данную реакционную смесь используют дл трансформации E.coli, в результате чего получаетс плазмидна ДНК. В полученную плазмиду ввод т ген НВсА ниже фосфатазного стимул тора вектора рАМ 82 и эту плазмиду обозначают рНС 301.

0

5

Исходные дрожжи представл ют собой Saccharomyces cerevisiae АН 22 (а Leu 2 his 4 canl , которые были сданы на хранение в Научно-Исследовательс- кий институт Ферментации, Агентство по промышленным исследовани м и технологии , Япони , Budapest treaty, где им присвоено официальное название РЕЮЧ ВР-312. Исходные дрожжи инокулируют в среде УРД (100 мл), содержащей, %: полипептид 2, дрожжевой экстракт 1 и глюкоза 2,и смесь термостатируют при температуре в течение ночи, а после этого клетки извлекают путем центрифугировани . Собранные таким образом клетки промывают стерилизованной водой (20 мл), суспендируют в растворе (5 мл) 1,2 М, сорбита и 100 мкг/мл зимолиазы - 60 000 (поставл емой фирмой Seikagaku Kogyo К.К., Япони ) и суспензию.выстаивают при 30 С в течение 30 , в результате чего получают сферо- 5 пласт. Полученный таким путем сферо- пласт промывают 1,2 М раствором сорбита три раза, а затем суспендируют в растворе (0,6 мл) 2 М сорбита, 10 мМ CaCli и 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5). Эту суспензию распредел ют по небольшим пробиркам объемом по 60 мл. К суспензии добавл ют раствор реком- бинантной плазмиды 301 (30 мкл). После тщательного перемешивани к раствору добавл ют 0,1 М CaCli (3 мкл) до конечной концентрации СаС, равной 10 мМ, и смесь выстаивают при комнатной температуре в течение 5 - 10 мин. В полученную смесь добавл ют

1 : J21LL 1 1 лппп ° п S

го полиэтиленг ликол 4000, 10 мМ CaCl и 10 мМ Трис-НС1 (рН 7,5), и

1 : J21LL 1 1 лппп ° п S

Полученную смесь (кажда по 0,2 мл) добавл ют к среде (10 мл), состо щей из 22% сорбита, 2% глюкозы, 0,7% ами-. нокислоты на основе дрожжевого азота 2% УРД, 20 мкг/мл гистидина и 3% агара , котора поддерживаетс при посто нной температуре 45 С. После слабого перемешивани смесь ввод т в слой на чашке с минимальной питательной средой , содержащей 1,2 м сорбита, котора была предварительно приготовлена

и состоит из 0,7% аминокислоты на основе дрожжевого,азота, 2% глюкозы, 20 мкг/мл гистидина и 2% агара и оставл ют на этой среде. Данную смесь .

термостатируют при температуре 30 С, в результате чего получают колонии независимых от лейцина дрожжей. Данную колонию термостатируют в мини- мальной питательной среде Burkholder в которую введен гистидин (20 мкг/ /мл) , в результате чего получают же- лаемые трансформированные дрожжи Sac- t:haromyces cerevi-siae рНС 301. .

Каждую колонию трансформированных дрожжей нанос т на чашку с агаром минимальной питательной среды Burk- . holder с введ енным гистидином (20 мкг/мл)5 и термостатируют при температуре 30°С, в результате чего образуетс колони . Полученные клетки отдел ют от данной колонии, инокули- руют в мини мальную питательную среду Burkhol der с введенным в нее гистиди- ном (20 мкг/мл), и термостатируют при температуре . По прошествии 24 ч клетки в фазе логарифмического роста, собирают и извлекают путем центрифугировани , суспендируют в минимальной питательной среде (10мл) не содержащей фосфорную кислоту (котора получаетс путем вытеснени в минимальной питательной среде Burkholder) КС1, с последующим вводом 20 мкг/мл гистидина при концентрации клеток примерно 4x10 клеток/мл . После термостатировани при температуре в течение примерно 24 ч питательный бульон выращенной культуры центрифугируют при скорости вращени центрифуги 4000 об/мин в течение 10 мин, в результате чего клетки извлекаютс . Отделенные таким образом клетки суспендируют в раство- ре (3 мл) 1,2 М сорбита, 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), 14 мМ 2- меркаптоэтанола и 100 мкг/мл зимолиа- зы-60 000 (поставл емой фирмой Seika- gaku Kogyo К.К., Япони ) и смесь ос- торожнр взбалтывают при температуре в течение 30 мин, .в результате чего получаетс сферопласт.. Этот сфе- ропласт извлекают путем центрифугировани и тщательно суспендиру ют в растворе (1 мл) 0,1% Тритона Х-100 и 50 мМ фосфатного буфера .(рН 7,2), тщательно перемешивают и затем центрифугируют при скорости вращени центрифуги 7000 об/мин в течение 10 мин и полученный всплывший слой

ВНИ11ПИ Заказ 1894/58

извлекают как дрожжевой лизированный раствор.

Этот лизированный раствор (20 мкл) подвергают испытанию с НВС антигеном RIA kit (поставл етс фирмой Abbott, США) на активность антигену НВс.

Результаты представлены ниже в табл.2.

Таблица2

S.Cerevisiae

АН22 (FERM ВР-ЗТ2)

рНС 301 4 989

рАМ 82 16 913

Данный вектор не имеет ни гена HEV, ни гена HBs и используетс как негативный эталон. (Негативный контроль RIA kit имеет активность 17 740 отсч./мин и позитивный контроль его имеет активность 446 отсч./мин.

Claims

Формула изобретен и

Способ получени челночного вектора путем объединени фрагмента ДНК Saccharomyces cerevisiae, содержащего ars 1 ,2 (uori и селективный маркерный ген дл отбора трансформированных S.cerevisiae с фрагментом ДНК Eschef- richia coli, содержащим ген репликации плазмиды, а также селективный маркерный ген дл отбора трансформиг рованньпс плазмидой E.coli, отличающийс тем, что, с целью создани высококопийного вектора, в Есо RI сайт-плазмиды fiBR 322 ввод т ген кислой фосфатазы РбО, выделенный из банка генов.S 288 С дрожжей, далее обрабатывают эндонуклеазой Sal I и ДНК-лигазой Т4 и получают плазмиду рАТ25, в Sal I сайт рАТ25 включают фрагмент ars I-trp I, выделенный из плазмиды YP7, полученную плазмиду рАТ26 обрабатывают эндонуклеазой Hind III и ввод т фрагмент Leu 2 и 2 f4ori плазмиды pSLEI, после чего отбирают вектор рАТ77.

Тираж 520 Подписное