SU1387878A3 - Способ получени белка поверхностного антигена вируса гепатита В - Google Patents
Способ получени белка поверхностного антигена вируса гепатита В Download PDFInfo
- Publication number
- SU1387878A3 SU1387878A3 SU833635804A SU3635804A SU1387878A3 SU 1387878 A3 SU1387878 A3 SU 1387878A3 SU 833635804 A SU833635804 A SU 833635804A SU 3635804 A SU3635804 A SU 3635804A SU 1387878 A3 SU1387878 A3 SU 1387878A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- gene
- hepatitis
- xho
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title claims abstract description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 60
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 12
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 65
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 28
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 9
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 9
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 claims description 8
- 229920006172 Tetrafluoroethylene propylene Polymers 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 4
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 241001400590 Richia Species 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229940124872 Hepatitis B virus vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 101710167911 Repressible acid phosphatase Proteins 0.000 abstract 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 abstract 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 0.2 M Chemical compound 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100479039 Caenorhabditis elegans aars-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000000970 DNA cross-linking effect Effects 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 244000147568 Laurus nobilis Species 0.000 description 1
- 235000017858 Laurus nobilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001139947 Mida Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 235000005212 Terminalia tomentosa Nutrition 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- ZNEWHQLOPFWXOF-UHFFFAOYSA-N coenzyme M Chemical compound OS(=O)(=O)CCS ZNEWHQLOPFWXOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 1
- 210000000569 greater omentum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940057838 polyethylene glycol 4000 Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N ticarcillin Chemical compound C=1([C@@H](C(O)=O)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)C=CSC=1 OHKOGUYZJXTSFX-KZFFXBSXSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к области .биотехнологии и касаетс получени белка поверхностного антигена вируса гепатита В. Цель изобретени - по- вьшение выхода продукта. В предложенном способе повышение выхода HBsAg обеспечиваетс за счет использовани рекомбинантной плазмидной ДНК, которую получают в результате культивировани S.Cerevisial, трансформированных плазмидой, котора содержит мар- керньш ген дл E.coli и дрожжей и реплицируетс как в E.coli, так и в дрожжах, при этом ген антигена в HBsAg в данном плазмиде встроен вниз от промотора кислой фосфатазы. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.
Description
со
00
м
ч1
00
Изобретение относитс к области биотехнологии и касаетс получени белка поверхностного антигена вируса гепатита В.
Цель изобретени - повьшение выхода конечного продукта.
Повьппение выхода HBsAj обеспечиваетс за счет использовани рекомбимощью ДНК полимеразы однонитева область ДРШ достраиваетс до полностью двунитиевой, при этом получают материал, меченый (32Р). Этот матери ал добавл ют в верхнюю часть пробирки дл центрифугировани , в которой по сло м в указанном пор дке содержатс 30, 20 и 10%-ные растворы санантной плазмидной ДНК, которую полу- ю харозы, пробирку подвергают центричают .в результате культивировани Saccharorayces cerevisiae, трансформированной плазмидой, котора содержит маркерный ген дл Е,coli и дрожжей.
С тем, чтобы разрушить фермен протеины, прочно св занные в ,ДНК
и может реплицироватьс как в E.coli, 15 полученные осадки обрабатывают в
20
так и в дрожжах, при этом ген антигена HBsAg в данной плазмиде встроен вниз от промотора кислой фосфатазы, в котором часть или полньш структурный ген кислой фосфатазы -или некотора область вверх от структурного гена кислой фосфатазы удалена.
Пример 1. Собирают плазму крови (700 мл), вз тую у дес ти пациентов , с положительной реакцией на 25 HBsAg (подтипа adr) и на HBsAgj затем ее подвергшот центрифугированию со скоростью 5000 об/мин в течение , 20 мин с целью удалени нерастворенных материалов. Полученный в резуль- 30 тате раствор подвергают центрифугированию при 4°С со скоростью 18000 об/мин в течение 8ч, а полученный осадок вновь раствор ют в 10 мл буфера (рН 7,5) 10 ьй Tris-HCl, 0,1 М NaCl и 1 мМ ЭДТК. Полученньй раствор добавл ют в верхнюю часть пробирки дл центрифугировани , содержащей 30% сахарозы, которую центрифугируют при со скоростью 39000 об/мин в течение 4 ч. Полученный в результате осадок вновь раствор ют в том же буфере ,
С целью облегчени последующих операций буферньй раствор подвергают 45 реакции с ДНК полимеразой вируса гепатита В, при помощи его обработки в смеси (500 мкл) 67 мМ Tris-HCl (рН 7,5), ВО мМ , 25 мМ MgClg., 0,5% NP40 (тергитол, производимый фирмой Сигма Ко), 0,1% 2-меркапто- зтанола,330 мкмдДТФ (дезоксицитидин трифосфата),дГТФ (дезоксигуанозин трисЬосЛата) и дАТФ (дезоксиаденозин
35
40
50
смеси 1 мг/мл проназы Е, котора изводитс фирмой Какен Кагаку К. и 0,2%-ного водного раствора лаур : сульфата натри при З7 с в течени 2ч. Полученную в результате смес дважды экстрагируют фенолом (200 Э Полученньй в. результате экстрак содержащий ДНК, промывают простым эфиром с тем, чтобы удалить фенол после чего получают раствор ДНК в руса гепатита В. Полученна таким разом ДНК обладает удельной радио активностью 2,5x10 отсчетов/мин
. 1 МКС.
Полученную двунитевую кольцеву ДНК вируса гепатита В (ВГВ)- клони с использованием ДНК А -фага Шаро 16А в качестве вектора, а затем вновь клонируют в плазмиду рАСУС1
ДНК ВГВ (20 нг) обрабатьшают э нуклеазой Xho 1 в смеси (20 мкл) 10 мМ Tris - НС1 (рН 7,4), 7 мМ M 100 мМ NaCl и 7 мМ 2-меркаптоэтан при 37 С в течение 2 ч. Полученну результате смесь экстрагируют фен ( 20 мкл) и затем простым эфиром, водньй слой добавл ют двойной объ охлажденного этанола с тем, чтобы ДНК вьшала в осадок. Смесь выдерж вают при -70°С в течение 1 ч, а з тем центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 5 мин, а о денную ДНК извлекают. Полученные ким образом осадки отдел ют и рас р ют в смеси (5 л) 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4) и 1 мМ ЭДТК. ДНК ВГВ и р номол рное количество ДНК Л-фага рон 16А (имеющей один сайт узнав дл Xho I), полученна в результа
трифосфата, О, 5 мкМ (Р) дТТФ (дазтс рассечени эндонуклеазой сечени
окситимидин трифосфата) при в течение 3 ч и в реакционную смесь добавл ют-тот же объем 100 i раствора ЭДТК. В результате упом нутой реакции с поXho I тем же методом, что использ валс выше, обрабатывают ДНК-лига зой Т4 смесь 50 мМ Tris-HCl (рН 7 10 f MgCl, 10 мМ дитиотрейтола.
мощью ДНК полимеразы однонитева область ДРШ достраиваетс до полностью двунитиевой, при этом получают материал, меченый (32Р). Этот материал добавл ют в верхнюю часть пробирки дл центрифугировани , в которой по сло м в указанном пор дке содержатс 30, 20 и 10%-ные растворы сахарозы , пробирку подвергают центрифугированю при 4 С со скоростью 39000 об/мин в течение 4,5 ч.
С тем, чтобы разрушить ферментом протеины, прочно св занные в ,ДНК,
полученные осадки обрабатывают в
0
5 0
5
5
0
0
смеси 1 мг/мл проназы Е, котора производитс фирмой Какен Кагаку К.К. и 0,2%-ного водного раствора лаурил : сульфата натри при З7 с в течение 2ч. Полученную в результате смесь дважды экстрагируют фенолом (200 л), Э Полученньй в. результате экстракт, содержащий ДНК, промывают простым эфиром с тем, чтобы удалить фенол, после чего получают раствор ДНК вируса гепатита В. Полученна таким образом ДНК обладает удельной радиоактивностью 2,5x10 отсчетов/мин на
. 1 МКС.
Полученную двунитевую кольцевую ДНК вируса гепатита В (ВГВ)- клонируют с использованием ДНК А -фага Шарон 16А в качестве вектора, а затем вновь клонируют в плазмиду рАСУС177.
ДНК ВГВ (20 нг) обрабатьшают эндо- нуклеазой Xho 1 в смеси (20 мкл) 10 мМ Tris - НС1 (рН 7,4), 7 мМ MgCl, 100 мМ NaCl и 7 мМ 2-меркаптоэтанола при 37 С в течение 2 ч. Полученную в результате смесь экстрагируют фенолом (20 мкл) и затем простым эфиром, а в водньй слой добавл ют двойной объем охлажденного этанола с тем, чтобы ДНК вьшала в осадок. Смесь выдерживают при -70°С в течение 1 ч, а затем центрифугируют со скоростью 10000 об/мин в течение 5 мин, а осажденную ДНК извлекают. Полученные таким образом осадки отдел ют и раствор ют в смеси (5 л) 10 мМ Tris-HCl (рН 7,4) и 1 мМ ЭДТК. ДНК ВГВ и рав- номол рное количество ДНК Л-фага Ша- рон 16А (имеющей один сайт узнавани дл Xho I), полученна в результате
с рассечени эндонуклеазой сечени
Xho I тем же методом, что использовалс выше, обрабатывают ДНК-лига- зой Т4 смесь 50 мМ Tris-HCl (рН 7,4), 10 f MgCl, 10 мМ дитиотрейтола.
10 мкг/мл альбумина сыворотки теленка , 0,5 мМ АТФ и 0,5 мкл лигазон ТА, производимой фирмой Тикара биомеди- калз, 1-5-10 единиц/мл при 4°С в те- чение 18 ч. Реакционную смесь экстрагируют фенолом и простьм эфиром, а затем подвергают осаждению фенолом. Полученные таким образом осадки раствор ют в смеси (10 мкл) 10 мМ TrisНС1 (рН 7,4) и 1 мМ ЭДТК.
Рекомбинатную ДИК упаковывают и получают Д-фаги, которые затем на плоском L-arape (23x23 см) образуют бл шки (10) с использованием SupF ДР50 Е. coli в качестве индикатора. Такие бл ищи подвергают гибридизации с использованием в качестве зонда
ДНК ВГВ, меченой
32 ,
С тем, чтобы
можно было выделить бл пп :и,образован- ные фагом, содержащим ДНК ВГВ. ДНК фага получают с использованием ДР50- SupF E.i-.oli в качестве инфецируемой бактерии. Полученную таким образом ДНК обрабатывают ферментом Xho I при тех же услови х, что описаны, в течение 2 ч и полученную в результате реакционную смесь подвергают электрофорезу с использованием 0,75% агарового гел с целью выделени ДНК ВГВ (3,2 Кб). ДНК ВГБ абсорбируют на ДЭАЭ (диэтиламиноэтил целлюлоза - бумагу, производимую фирмой Тойо Роши, Япони ) с тем, чтобы отделить ДНК носител , а затем элюируют 1 М водным раствором NaCl с тем чтобы получить ДНК ВГВ, имеющую Xho 1 сайты с обеих сторон.
Отдельно плазмиду рАСУС17-7, содержащую единственньм сайт сечени Xho 1 внутри ее гена стойкости к канамицину, обрабатывают Xho 1, а продукт подвергают очистке при помо щи экстракции фенолом, обработки простым эфиром и осаждению этанолом. Полученную таким образом плазмиду рАСУС177, рассеченную ферментом Xho 1 ДНК ВГВ в мол рном отнощении 1:5, а смесь сшивают ДНК Т4-лигазой в течение 1Й ч.
Выделение ДНК (10 мкл) осуществл ют следую1 шм образом: обрабатывают культуральный бульон штамма Е . со.1 i v1776, эту смесь тщательно перемешивают и выдерживают при в течение
55
25 мин. Смесь помещают на L-агаровую пластину, содержащую ампициллин (20 мкг/мл), о(-биотин (1 мкг/мл), диаминопимелиновую кислоту (100 мкг/мл)
o
5
0 5
0
5
0
5
0
5
и тимин (20 мкг/мл), и инкуюируют при 37 С в течение ночи. Полученные в результате колонии помещают на агаровую пластинку, содержащую канами- цин (20 мкг/мл), на агаровую пластинку , содержащую ампициллин (20 мкг/мл) причем колонии, которые растут только на агаровой пластинке, содержащей ампициллин, отбирают рАСУС177 содержит ген стойкости к ампициллину и ген стойкости к канамицину, но когда ДНК-ВГВ встраиваетс в сайт Xho 1 гена стойкости к канамицину, он тер ет свойство стойкости к канамицину . В соответствии с этим выбранные колонии содержат рекомбинант- ную ДНК РАСУС177-ДНК ВГВ. Из выбранных таким образом колоний получают плазмиду, т.е. рекомбинантную ДНК рАСУС177 - ДНК ВГВ (которую обозначают через рНВУ), обрабатывают ферментом Xho 1, в результате получают весь фрагмент ДНК ВГВ (3,2 к Ь) . Когда плазмиду обрабатывают ферментом Xho 1 и ферментом ВамН1, то получают фрагмент (примерно 1,3 кЬ), содержащий ген HBsAg.
Фрагмент EcoRI в примерно 8000 нук- леотидных пао (8 кЬ), содержащий ген полипептида (РбО) в 60000 дальтон, которьй составл ет репрессируемый ген кислой фосфатазы, получают из банка генов S288C дрожжей и вставл ют в сайт EcoRI плазмиды pBR322 E.coli, в результате чего получают исходную плазмиду. .
Исходную плазмиду обрабатывают эндонуклеазой Sail и сшивают ДНК - лигазой Т4, при этом получают плазмиду рАТ25, котора имеет пробел от сайта Sal 1 до фрагмента гена кислой фосфатазы 5,2 кЬ. Плазмида рАТ 25 вл етс плазмидой, coдepжaп eй фрагмент (примерно 3,7 кЬ) от сайта EcoRI до сайта Sal I в pBR322, который содержит ген стойкости к ампициллину и фрагмент (примерно 2,8 кЬ) от сайта EcoRI до сайта Sal 1 гена дрожжей кислой фосфатазы.
В EcoRI сайт рAT 25 вставл ют фрагмент EcoRI (1,4 кЬ), содержащий ars 1 и ген Тгр 1, который получают в результате обработки плазмиды yRP 7 ферментом EcoRI, при этом получают плазмид рАТ 26. Фрагмент ars 1-Тг р 1 содержит единственный сайт указыва- ни дл фермента сечени Hind III -внутри гена Тгр 1.
В сайт Hind III плазмиды рАТ 26 вставл ют Hind III - фрагмент, содержащий Len 2 и 2 jU ori, который получают в результате обработки плазмиды pSLE 1 ферментом Hind III с тем, чтобы получить челночньш вектор рАТ,77. рАТ 77, содержащийс в S.ce- revisiae (т.е. Saccharorayces cerevi- siae АН 22 (pAT 77) сдан на хранение в Исследовательский Институт Ферментации , Агенство по промыпшенной науке и технологии, Япони , в соответст- .вий с Будапештским соглашением FEPM ВР-324)..
Долученньш таким образом рАТ 77 (1 мкг) рассекают ферментом Sal 1, а затем обрабатывают эксонуклеазой BAL 31 (0,1 и) в растворе (50 мкл) 20 мМ Tris-HCl (рН 8,2), 12 мМ CaCl, 12 мМ MgCl, 0,2 М, NaCl и 1 мМ ЭДТК в течение от 30 с до 1 мин. Реакционную смесь подвергают .экстракции фенолом и осаждению этанолом. Полученные в результате осадки обрабатывают линкером Xho 1 (1 нмоль) и ДНК - лигазой Т 4 при тех же услоБИ х что описаны, в течение 12 ч.
Трансформирзтот E.coli Х.1776 полученной плазмидой и получают трансформированную культуру, стойкую к ампициллину , -Из колоний выдел ют ДНК плаз МИДЫ, определ ют нуклеотидную последовательность ДНК, а затем определ ют область гена кислой фосфатазы, удаленную при помощи BAL 31. Среди этих ДНК отбирают и вьщел ют искомые плазмиды рАМ 81, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84, в которых полностью отсутствует струк турньш ген фосфатазы.
Обозначают А в кодоне ATG,. кодирующем первую аминоки.слоту (метионин) продукта РбО структурного гена фосфатазы , через челночных носител х удал ют следующие области, рАМ 81: до +2, рАМ 82: до - 33., рАМ 83: до -50 и рАМ 84: до -51. рАМ 8l, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84, содержащиес в Saceharorayces serevisiae- (т.е.Засе- haromyces cerevisiae АН 22 (рАМ 81, АН 22) рАМ 82, АН 22 (рАМ 83 и АН 22) рАМ 84,- сданы на хранение в Исследовательский Институт ферментации,.Агенство по промышленной науке и техно
логин. Япони , в соответствии с Буда пештским соглашением FEPM ВР-325, FEPN ВР-313, FEPM ВР-327 и FEPM ВР-326.
10
15
20
25
.,. 30
35
40
55
Полз енную ДНК ВГВ в результате обработки плазмиды рНВУ (рАСУС 177- ДНК ВГВ) ферментом Xho 1 подвергают, рекомбинации с челночным вектором, рассеченным Xho 1, рАМ 81, рАМ 82, рАМ 83 и рАМ 84 в мол рном отношении 5:1 при помощи сшивки ДНК лигазой Т4. .
E.coli X 1776 трансформируют данной ДНК плазмидой, получают из трансформированной культуры стойкие к ампициллину колонии. Выдел ют из них ДНК и .анализируют с использова нием разлртчных ферментов сечени таких, как Xho 1, Xha 1 и Hind III, при этом идентифицируетс вставка ДНК БГВ в носители и ее направление.
. Фрагмент гена HBsAg (3 мкг), по.лу- ченньй в результате рассечени плазмиды рНВУ ферментом ВамН1, обрабатывают ДНК - полимеразой Т4 (0,2U) в растворе (100 мкл) 67 i Tris-HCl (рН 8,6), 6,7 мМ MgCl2, 10 мМ 2-мер- каптоэтанола, 6,7 мкМ ЭДТК и 16,7 мМ (Ш4)з804, которьй содержит 200 мкМ о.АТФ,аС.ЦТФ, ХТТФ иЛГТФ в течение 30 мин с тем, чтобы заполнить конец сечени ферментом ВамН1.- Реакционную смесь подвергают экстрагированию фенолом и осаждению этанолом,Осадки подвергают реакции сшивани с линкером Xho,1 в мол рном отношении 1:10 при помощи ДНК- лигазы Т4. После экстрагировани фенолом и осаждени этанолом ДНК плазмиды обрабатьшают Xho 1, при этом получают фрагмент гена HBsAg-(примерно 1,3 кб), содержащий терминал сечени Xho 1 на обоих концах. Этот фрагмент сшивают с челночным вектором рАМ 82, которьй рассекают-ферментом Xho .1, в мол рном отношении 5:1 с использованием ДНК - лигазы Т4, трансформируют кишечную палочку E.coli X 1776 полученной рекомбинантной ДНК„ , .
В эту плазмиду вставл ют HBsAg ген в правильном направлении вниз от.промотора фосфатазы вектора рАМ 82,
Исходными дрожжами вл ютс Sace- haromyces cerevisiae АН22 (а, len 2, his 4, caul (Cir)), которые сданы.на хранение в Исследовательский институт ферментации, Агенство по промышленной науке и технологии, Япони , в соответствии с Будапештским соглашением под наименованием FEPM ВР-312. Исходные дрожжи помещают на среду УРВ (-100 мл), содержащ-ую 2% полипептона, 1% экстрак- fa дрожжей и 2% глюкозы, затем смесь
инкубируют при 30°С в течение ночи и далее клетки собирают при помощи центрифугировани . Собранные таким образом клетки промывают стерилизованной водой (20 мл), суспендируют в раствор 1,2 М сорбита и 100 мкг/мл зимо- лиазы -60000 (котора производитс фирмой Сейкагаку Когио К,К., Япони ), суспензию вьщерживают при в течение 30 мин, в результате чего получают сферопласт. Полученньй таким образом сферопласт промьшают 1,2 М раствором сорбита три раза, а затем суспендируют в раствор (0,6 мл) 2 М сорбита, 10 мМ CaCl и 10 мМ Tris - HCl (рН 7,5). Суспензию реализзпот в маленькие пробирки в объеме 60 мкл. В суспензию добавл ют раствор рекомби- нантной плазмиды рАН 203 (30 мкл). После тщательного перемешивани в смесь добавл ют 0,1 М СаС1(3 мкл) до комнатной концентрации СаС в 10 мМ, затем смесь вьщерживают при комнатной температуре в течение 5- 10 мин. Б полученную в результате смесь 1 мл раствора 20% полиэтилен- гликол 4000, 10 мМ CaCl и 10 мМ Tris - HCl (рН 7,5), затем смесь выдерживают при комнатной температуре в течение примерно 20 мин. Смесь (каждую объемом 0,2 мл) добавл ют в среду (10 мл), состо щую на 22% из сорбита , на 2% из глюкоЗы, на 0,7% из- аминокислоты на основе азота дрожжей, на 2% из yPD, на 20 мг/мп из гистиди- на и на 3% из агара и выдерживают при посто нной температуре в 45 С.После энергичного перемешивани смесь помещают слоем на пластинку с мини- мальной средой, содержащей 1,2 М сорбита ,, которую приготавливают заранее она содержит 0,7% аминокислоты на базе азота дрожжей, 2% глюкозы, 20 мкг/мл гистидина и 2% агара Пластинку инкубирзтот при , в результате чего получают колонию дрожжей,не завис щих от леудина.Колонию инкубируют в минимальной среде Берк Холь- дера с добавкой гистидина (20 мкг/мл; в результате чего получают искомые трансформированные дрожжи:Saceharomy .ces cerevisiae рАН 203.
: Тем же способом, однако вместо ре- комбинантного рАН 203 используют ре- комбинантные плазмиды, PAS 101, рАН 201 и рАН 205; получают следующие трансформированные дрожжи:Saceharomy
ces cerevisiae pAS 101, S.Cerevisiae pAH 201, S.Cerevisiae pAH 205,
Каждую колонию трансформированных рожжей нанос т на агаровую пластинку с минимальной средой Берк Хольдера, ополненной гистидином (20 мкг/мл) и осуществл ют инкубирование при до образовани колонии. Полученные в результате клетки отдел ют от колонии, прививают на минимальную среду Берк Хольдера, дополнительную гистидином (20 мкг/мл) и инкубируют при 30°С. Спуст примерно 24 ч клетки в стадии логарифмического роста собирают центрифугированием, суспендируют в минимальнзт) среду (.10 мл), но содержащую фосфорную кислоту (котора приготавливаетс заменой KHjP04 в минимальной среде Берк Хольдера на КС1 и последующим добавлением 20 мкг/мл гистидина), с кон /
центрацией клеток примерно 4x10 клеток/мл . После инкубировани при 30°С в течение примерно 24 ч культураль- ньй бульон подвергают центрифугированию со скоростью 4000 об/мин в течение 10 мин с целью сбора клеток. Собранные таким образом клетки суспендируют в. раствор (3 мл) 1,2м сорбита , 50 мМ буфера фосфата (рН 7,2), 14 1 2-меркаптоэтанола и 100 г/мл Зимолиазы - 60000 (производимой фирмой Сейкагаку Когио К.К, Япони ), а затем смесь энергично встр хивают при в течение 30 мин с тем, чтобы получить сферопласт. Сферопласт собирают при помощи центрифугировани и тщательно суспендируют в раствор (1 мл) 0,1% тритона Х-100 и 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), суспензию энергично перемешивают, а затем центрифугируют со скоростью 7000 об/мин в течение 10 мин, при этом верхний слой образует раствор лизированных дрожжей.
Полученный раствор (20 мкл) ис-. пытывают с использованием устройства дл РИА на HBS антиген (производимо- го фирмой Эбботт, США) по HBS антигенной активности. Результаты приведены втаблице,
Что касаетс раствора лизированных дрожжей, полученного из S.cerevisiae АН 22/рАН 203, то предполагаетс , что активность и количество антигена наход тс в соответствии статической параллельной подмой при использовании устройства дл обнаружени HBaAg, причем в качестве контрольного антигена используетс очищенный HBsAg, полученньй из сыворотки крови человека.
Дозированный раствор (кажда пор- ци 0,4 мл) подкожным способ ом ввод т гвинейским свинкам (самки, 300-380 г, 10 животных) один раз в неделю в течение трех недель,а антитела в плазме ™ крови определ ют при помощи устройства дл обнаружени анти-HBS антител (АУСАБ, производимого фирмой Эбботт, США). В результате у всех животных обнаружены айти-НВЗ антиге нао .Формула изобретени 1. Способ получени белка поверхностного антигена вируса гепатита В, включающий конструирование челночно- 20 го вектора путем объединени фрагмента ДНК Saceharomyces cerevisiae, содержащего ars 1,2pori и селективный маркер дл отбора трансформированных . S.cerevisiat; с фрагментом ДНК Esche- 25 richia coli, содержащим ген репликации плазмиды, а также селективньй маркерньй ген дл отбора трансформированных плазмидой E.coli, введение в него участка ДНК, кодирующего ген , поверхностного антигена гепатита В (HBsAg), которьй находитс под контролем дрожжевого промотора, с последующим культивированием трансформированных плазмидой SoCerevisiae, выделением и очисткой целевого продукта, отличающийс тем, что, с целью повыщени выхода конечного продукта, конструирование вектора осуществл ют введением в E.coRI сайт „
4U
плазмиды pBR322 гена кислой фосфата- зы Р60, вьщеленного из банка генов S 288С дрожжей, далее обрабатывают зндонуклеазой Sal I и ДНК-лигазой
S. cerevisiae
АН 22 (FEPM ) рАН 201 10.597 2- -рАН 203 13,.008
-
Т4 и получают плазмиду рАТ25, включают в Sal I плазмиды рАТ25 фрагмент arsl-trpi, вьщеленньй из плазкиды 4Р7, полученную плазмиду рАТ 26 обрабатывают зндонуклеазой Hind III и ввод т фрагмент Len 2 и 2//ori плазмиды pS2F, после чего получен- ньй вектор рАТ77 и фрагмент, содержащий ген НВзАр; подтипа , выделенный из плазмиды pHBV с помощью фрагмента Ват HI, обрабатывают эндо- нуклеазой Xho I, сшивают полученные фрагменты ДНК-лигазой Т4 и отбирают рекомбинантные плазмидные ДНК , в которых ген HBsAg расположен ниже области промотора
2,Способ по п. 1, отлича ю- щ и и с тем, что вектор рАТ77 рассекают эндонуклеазами Sail и Bgl 31, добавл ют Xho I линкер и полученную смесь обрабатывают ДНК-лигазой Т4, у полученных плазмид определ ют нукле- отидную последовательность и выбираю плазмиды рАИ до +2, рАМ от 82 до -33, рАМ 83 до -50 и рАМ 83 до -51, из которых удалена часть гена РбО.
3,Способ по п. 1, отличающийс тем, ЧТО плазмы крови больных гепатитом В выдел ют ДНК вирса , однонитьевую ДНК удваивают с помощью ДНК-полимеразы 1,полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазой Xho 1 и клонируют в Xho 1 сайт ДНК / -фага Шарон 15А, выделенные гибридтиза цией с меченной ДНК вируса гепатита В, ДНК фагов и пл-азми- ду рАСУС/77 обрабатывают Xho 1 эндонуклеазой , полученньш фрагменты сшивают ДНК-лигазой Т4, далее трансформруют полученным рекомбинантными ДНК клетки E.coli и отбирают рекомбинаит ную плазмиду рНР4, содержащую ген HBsAg
рАН 205 5.548
ч138787812
Продолжение таблицы
Этот носитель не содержит ни гена Bt B, ни гена HBS и используетс в качестве отрицательного контрольного клона (отрицательный контрольный клон с использованием устройства РИА имеет активность в 310 отсчетов/ мин, а положительный контрольный клон имеет тот же показатель в 17500 отсчетов/мин.
рА 101 П.200
Claims (3)
- Формула изобретения1. Способ получения белка поверхностного антигена вируса гепатита В, * включающий конструирование челночно- 20 го вектора путем объединения фрагмента ДНК Saceharomyces cerevisiae, содержащего ars 1,2pori и селективный маркер для отбора трансформированных.S.cerevisiae с фрагментом ДНК Esche- 25 richia coli, содержащим ген репликации плазмиды, а также селективный маркерный ген для отбора трансформированных плазмидой E.coli, введение в него участка ДНК, кодирующего ген поверхностного антигена гепатита В (HBsAg), который находится под контролем дрожжевого промотора, с последующим культивированием трансформированных плазмидой Socerevisiae, выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода конечного продукта, конструирование вектора осуществляют введением в E.coRI сайт4и плазмиды pBR.322 гена кислой фосфатазы Р60, выделенного из банка генов S 288С дрожжей, далее обрабатывают эндонуклеазой Sal I и ДНК-лигазойТ4 и получают плазмиду рАТ25, включают в Sal I плазмиды рАТ25 фрагмент arsl-trpl, выделенный из плазмиды t 4Р7, полученную плазмиду рАТ 26 обрабатывают эндонуклеазой Hind III и вводят фрагмент Len 2 и 2 уori плазмиды pS2F, после чего полученный вектор рАТ77 и фрагмент, содержащий ген HBsAg подтипа ad*г, выделенный из плазмиды pHBV с помощью фрагмента Bam HI, обрабатывают эндонуклеазой Xho I, сшивают полученные фрагменты ДНК-лигазой Т4 и отбирают рекомбинантные плазмидные ДНК, в которых ген HBsAg расположен ниже области промотора»
- 2. Способ поп. 1, отличающийся тем, что вектор рАТ77 рассекают эндонуклеазами Sall и Bgl 31, добавляют Xho I линкер и полученную смесь обрабатывают ДНК-лигазой Т4, у полученных плазмид определяют нуклеотидную последовательность и выбирают плазмиды рАМ до +2, рАМ от 82 до -33, рАМ 83 до -50 и рАМ 83 до -51, из которых удалена часть гена Р60,
- 3, Способ поп. 1, отличающийся тем, что· плазмы крови больных гепатитом В выделяют ДНК вируса, однонитьевую ДНК удваивают с помощью ДНК-полимеразы 1,полученную ДНК обрабатывают эндонуклеазой Xho 1 и клонируют в Xho 1 сайт ДНК Λ -фага Шарон 15А, выделенные гибридиза* цией с меченной РДНК вируса гепатита В, ДНК фагов и плазмиду рКСУС/П обрабатывают Xho 1 эндонуклеазой, полученные фрагменты сшивают ДНК-лигазой Т4, далее трансформируют полученным рекомбинантными ДНК клетки E.coli и отбирают рекомбинантную плазмиду рНР4, содержащую ген HBsAgо
Клон Хозяин Плазмид HBsAg активность. 1 я Ί Ъ 4 S. cerevisiaeАН 22 (FEPM ВР-312) рАН 201 10.5972 -- рАН 203 13,008 рАН 205 5.5481387878 12Продолжение таблицы1 I1 2 S 4 4 — — рА 101 11.200 Контрольный рАМ 82* 320 * Этот носитель не содержит ни гена вЬв, ни гена HBS и используется в качестве отрицательного контрольного клона (отрицательный контрольный клон с использованием устройства РИА имеет активность в 310 отсчетов/ мин, а положительный контрольный клон имеет тот же показатель в 17500 отсчетов/мин.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57142460A JPS5931799A (ja) | 1982-08-16 | 1982-08-16 | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1387878A3 true SU1387878A3 (ru) | 1988-04-07 |
Family
ID=15315829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU833635804A SU1387878A3 (ru) | 1982-08-16 | 1983-08-15 | Способ получени белка поверхностного антигена вируса гепатита В |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4778761A (ru) |
| JP (1) | JPS5931799A (ru) |
| KR (1) | KR890000096B1 (ru) |
| CA (1) | CA1270217A (ru) |
| DK (1) | DK169953B1 (ru) |
| ES (2) | ES8600059A1 (ru) |
| IL (1) | IL69423A0 (ru) |
| SU (1) | SU1387878A3 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| LT3988B (en) | 1992-02-17 | 1996-06-25 | Fermentas Biotech Inst | Recombinant plasmides pfs19, pfps2-48 and pjlfds1 codingsynthesis of human hepatite b of surfice virus antigenes, methods fof producing thereof |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| JPS5936699A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | シヤトルベクタ− |
| JPS5974985A (ja) * | 1982-10-19 | 1984-04-27 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規ｄｎａ |
| JPS61139391A (ja) * | 1984-12-11 | 1986-06-26 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 単純ヘルペスウィルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミドおよび形質転換酵母 |
| US4816564A (en) * | 1986-01-31 | 1989-03-28 | Merck & Co., Inc. | Method for producing hepatitis B virus proteins in yeast |
| US5190877A (en) * | 1987-09-03 | 1993-03-02 | Gist-Brocades N.V. | Saccharomyces strains for maltose fermentation |
| US4883865A (en) * | 1987-09-30 | 1989-11-28 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+s antigen |
| AP129A (en) * | 1988-06-03 | 1991-04-17 | Smithkline Biologicals S A | Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells |
| US6319501B1 (en) * | 1990-07-19 | 2001-11-20 | Health Research, Inc. | Method of immunizing against hepatitis B virus |
| US5531990A (en) * | 1993-12-15 | 1996-07-02 | Health Research, Inc. | Method of raising an immune response with an anti-idiotypic antibody having correspondence with human hepatitis B surface antigen |
| IL118626A0 (en) * | 1996-06-11 | 1996-10-16 | Xtl Biopharmaceuticals Limited | Anti HBV antibody |
| US6451572B1 (en) * | 1998-06-25 | 2002-09-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Overexpression of phytase genes in yeast systems |
| CN100347303C (zh) * | 1999-03-31 | 2007-11-07 | 康乃尔研究基金会有限公司 | 具有改良的肌醇六磷酸酶活性的磷酸酶 |
| US6841370B1 (en) * | 1999-11-18 | 2005-01-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase |
| EP1450627B1 (en) | 2001-10-31 | 2012-09-05 | Phytex, Llc | Use of phytase containing animal food |
| US7309505B2 (en) * | 2002-09-13 | 2007-12-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve Aspergillus phytases |
| US7919297B2 (en) | 2006-02-21 | 2011-04-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase |
| EP2069486A2 (en) * | 2006-08-03 | 2009-06-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Phytases with improved thermal stability |
| JP2010525812A (ja) | 2007-05-02 | 2010-07-29 | メリアル リミテッド | 発現及び安定性が改善されたｄｎａプラスミド |
| US8192734B2 (en) | 2007-07-09 | 2012-06-05 | Cornell University | Compositions and methods for bone strengthening |
| CN112680464B (zh) * | 2020-12-10 | 2022-04-26 | 南京农业大学 | 一种单甲基砷和三价锑氧化酶基因arsV及其编码的蛋白和应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2444713A1 (fr) * | 1978-12-18 | 1980-07-18 | Pasteur Institut | Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant |
| FR2480779B2 (fr) * | 1979-08-30 | 1986-07-18 | Anvar | Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur |
| DK368882A (da) * | 1981-08-25 | 1983-02-26 | Alan John Kingsman | Expessions vektorer |
| US4446235A (en) * | 1982-03-22 | 1984-05-01 | Genentech, Inc. | Method for cloning human growth hormone varient genes |
| US4546082A (en) * | 1982-06-17 | 1985-10-08 | Regents Of The Univ. Of California | E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins |
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| AU584580B2 (en) * | 1982-09-08 | 1989-06-01 | Smith Kline - Rit | Hepatitis B virus vaccine |
| CA1341116C (en) * | 1983-02-22 | 2000-10-17 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein |
-
1982
- 1982-08-16 JP JP57142460A patent/JPS5931799A/ja active Granted
-
1983
- 1983-08-03 IL IL69423A patent/IL69423A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-08-12 ES ES83524942A patent/ES8600059A1/es not_active Expired
- 1983-08-13 KR KR1019830003794A patent/KR890000096B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1983-08-15 SU SU833635804A patent/SU1387878A3/ru active
- 1983-08-15 DK DK372183A patent/DK169953B1/da not_active IP Right Cessation
- 1983-08-16 CA CA000434726A patent/CA1270217A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-03-01 ES ES540895A patent/ES8802162A1/es not_active Expired
-
1987
- 1987-01-20 US US07/004,424 patent/US4778761A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| РаЫо Valeuraela at. al. Synthesis and assem oly of lapatitis В virus. - Surface anfiger particles in yast. Nature, vol.298, July 1982, p. 347-350. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| LT3988B (en) | 1992-02-17 | 1996-06-25 | Fermentas Biotech Inst | Recombinant plasmides pfs19, pfps2-48 and pjlfds1 codingsynthesis of human hepatite b of surfice virus antigenes, methods fof producing thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK372183A (da) | 1984-02-17 |
| ES540895A0 (es) | 1988-04-01 |
| KR890000096B1 (ko) | 1989-03-07 |
| ES8802162A1 (es) | 1988-04-01 |
| CA1270217A (en) | 1990-06-12 |
| DK169953B1 (da) | 1995-04-10 |
| JPS6155950B2 (ru) | 1986-11-29 |
| US4778761A (en) | 1988-10-18 |
| ES524942A0 (es) | 1985-10-01 |
| ES8600059A1 (es) | 1985-10-01 |
| IL69423A0 (en) | 1983-11-30 |
| DK372183D0 (da) | 1983-08-15 |
| JPS5931799A (ja) | 1984-02-20 |
| KR840005745A (ko) | 1984-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU1387878A3 (ru) | Способ получени белка поверхностного антигена вируса гепатита В | |
| Wilkie et al. | Hybrid plasmids containing an active thymidine kinase gene of Herpes simplex virus 1 | |
| Burke et al. | [17] Preparation of clone libraries in yeast artificial-chromosome vectors | |
| EP0013828B1 (en) | Recombinant DNA, hosts transformed with it and processes for the preparation of polypeptides | |
| US5024938A (en) | Recombinant DNA inserted with hepatitis B virus gene, mammalian cells transformed with cloned viral DNA, and production of hepatitis B virus proteins | |
| NO176025B (no) | DNA-fragment, plasmid, kultur og fremgangsmåte til fremstilling av et hepatitt-B-overflateantigen | |
| EP0341746A2 (en) | Expression of hepatitis B S and preS2 proteins in methylotrophic yeasts | |
| EP0103201B1 (en) | Shuttle vector | |
| EP0155007B1 (en) | Method for purification of hbs antigen | |
| Wilczynska et al. | Analysis of a complex plasmid insertion in a phototaxis-deficient transformant of Dictyostelium discoideum selected on a Micrococcus luteus lawn | |
| EP0068719A2 (en) | Deoxyribonucleic acids, their production and use | |
| Barkan et al. | DNA sequence analysis of simian virus 40 mutants with deletions mapping in the leader region of the late viral mRNA's: mutants with deletions similar in size and position exhibit varied phenotypes | |
| CA1338380C (en) | Shuttle vector | |
| CA1277264C (en) | Method for culturing transformed yeast | |
| EP0225887A1 (en) | METHOD AND HYBRID PROMOTOR FOR CONTROLLING EXOGENIC GENTRAL TRANSCRIPTION. | |
| JPH0543352B2 (ru) | ||
| JPH0789930B2 (ja) | ウイルス性転写促進配列 | |
| SU1393317A3 (ru) | Способ получени челночного вектора | |
| KR940010866B1 (ko) | 변형된 b형 간염 비루스 표면항원 단백질의 제조방법 | |
| US4912200A (en) | Extraction of granulocyte macrophage colony stimulating factor from bacteria | |
| US4757021A (en) | Recombinant plasmid and microbial strain transformed by said plasmid | |
| CN106434749A (zh) | 抑癌丝氨酸－苏氨酸激酶11真核表达载体及其构建方法 | |
| JP3910248B2 (ja) | トランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法 | |
| KR920000848B1 (ko) | 개선된 돌연변이 종두 비루스와 그 제조방법 | |
| JPS6332491A (ja) | 酵母におけるＢ型肝炎ウイルスコア抗原（ＨＢｃＡｇ）生産の方法 |