JP3910248B2 - トランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法 - Google Patents
トランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失作製方法に関する。
【０００２】
本発明は、前記ＤＮＡ入れ子型欠失作製方法に用いるためのキットに関する。
【０００３】
【従来の技術】
遺伝子工学技術において、所望のＤＮＡ断片をベクターに挿入して取り扱うことがしばしば行われる。この場合、ＤＮＡ挿入断片の長さを取り扱いに適当な長さに調製する必要がある場合がある。
【０００４】
例えば、特にＤＮＡ塩基配列決定技術では一度に決定できる配列の長さが限られているため、適切な長さのＤＮＡ断片がベクター中に挿入されることが重要である。詳細にはＤＮＡ塩基配列決定は、現在の方法では長くても約１０００塩基、通常は３００〜４００塩基程度しか、一度に配列決定できない。従って、より長い断片に対しては１）サブクローニング法、２）プライマーウォーキング法、および３）入れ子型欠失法（ｎｅｓｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）等を用いて配列決定を行っている。このうち、入れ子型欠失法は、一定の部位から入れ子型に多数の欠失を生じさせる方法であり、前二者と比較して多種類の欠失体を簡便に得られる等の理由から有力である。入れ子型欠失法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）でエキソヌクレーゼ、例えばＥｘｏIII、を用いる方法や、トランスポゾンの末端繰り返し構造とトランスポゼースを用いてｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）で行う方法が知られている。
【０００５】
トランスポゾンは転移性遺伝要素（ｍｏｖａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ）の一種で、ある染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡあるいはウイルスＤＮＡから同一の又は他のＤＮＡへ移動（転移，ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）する遺伝子単位である。細菌・酵母・トウモロコシ・ショウジョウバエなどに広く分布している。転移する相手のＤＮＡ部位（ｔａｒｇｅｔ：ターゲット）は一定ではなく、どのようなＤＮＡ部位にでも転移すると考えられる。トランスポゾンの構造上の特徴は、両端に逆向き（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ＝ＩＲ）あるいは同じ向きの繰り返し構造があり、必ずこの末端部において組み換えが起こることで、この繰り返し構造が転移において重要な役割を演じていると考えられている。トランスポゾンは、一般に、転移のために必要な機能やその機能の発現に関与する遺伝子を含んでいる。
【０００６】
トランスポゾンは一般に遺伝子の転移を生じさせる機能の他に、例えば、Ｔｎ３およびＴｎ１０００のように近傍の遺伝子を欠失させる機能を有するものが知られている。さらに、トランポゾンに含まれる転移を制御する遺伝子（ｔｎｐＲ）に変異を生じさせると、転移反応と同様欠失を生じさせる頻度が高まることが見いだされた（Ｙｏｓｈｉｎｏｂｕ ＳＵＧＩＮＯ ａｎｄ Ｈｉｔｏｓｈｉ ＫＡＷＡＳＨＩＭＡ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８３）５８，ｐｐ．７９−９３）。また、ｉｎ ｖｉｖｏで欠失を生じさせる系が開発されている（Ｓｕｇｉｎｏ，Ｙ．ａｎｄ Ｍｏｒｉｔａ，Ｍ．１９９４，Ｇｅｎｅ，１４８、１６９−１７０、およびＷａｎｇ，Ｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３） ９０，７８７４−７８７８）。この系は、トランスポゾンの末端繰り返し構造を有するベクターに所望のクローン化ＤＮＡ断片を挿入し、該ベクターを用いてトランスポゼースを過剰発現する大腸菌を形質転換し、大腸菌内でトランスポゾンの末端繰り返し構造から欠失を作製させるものである。この系は、例えば、ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社より市販されているＤＥＬＥＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＹ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ等を用いて行うことができる。
【０００７】
このように従来の入れ子型欠失法は有用ではあるが、生体内反応であるため、必然的に培養のための時間が必要である、目的の遺伝子が反応中に変化を起こす可能性がある等の問題を伴う。一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスポゾンをプラスミド中からλＤＮＡ内に転移させることも成功している（Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｈｔｕｂｏ，Ｅ．１９９０， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１８８２９−１８８３２）。しかしながら、本発明前は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応での入れ子型欠失作製方法は、その必要性が高かったにもかかわらず、知られていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、
１）入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片およびトランスポゾンの末端繰り返し構造を含むベクターを用意し；
２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし；
３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望により
４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖させ
５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ断片を有するベクターを回収する
ことを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで所望のＤＮＡに入れ子型欠失を作製する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明は、さらに、適切な容器に保存されたトランスポゼースおよびＤＮＡ複製系を含む、前記ＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法に用いるためのキットを提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題解決のため鋭意研究に努めた結果、トランポゼースを過剰発現する宿主細胞から抽出したＤＮＡ複製活性成分を含む画分を用い、ｉｎｖｉｔｒｏ反応でＤＮＡ入れ子型欠失作製を行うことに初めて成功した。
【００１１】
本発明のＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法は、
１）入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片およびトランスポゾンの末端繰り返し構造を含むベクターを用意し；
２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし；
３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望により
４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖させ
５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ断片を有するベクターを回収する
ことを含むことを特徴とする。トランスポゼースの働きにより、トランスポゾンの末端繰り返し構造を起点とし多くの異なる不特定の部位を終点とする多数のＤＮＡ欠失が生じる。反応生成物で宿主細胞を形質転換することにより、欠失ＤＮＡ断片を含むベクターを検出することができる。以下、本発明の構成要素について詳述する。
【００１２】
１）ベクター
本発明に用いるベクターは、入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片およびトランスポゾンの末端繰り返し構造を含む。当該ベクターはさらに、宿主細胞内で複製を行うための複製起点を含む。好ましいベクターは、例えばプラスミドベクター、コスミドベクター等である。
【００１３】
限定されるわけではないが、好ましいトランポゾンの末端繰り返し構造は、Ｔｎ３及びＴｎ１０００（「γδ」とも呼ばれる）に由来する（Ｓｕｇｉｎｏら，１９９４，Ｇｅｎｅ，１４８，上述、およびＷａｎｇら，１９９３、上述）ものである。これらは腸内細菌のプラスミド、ファージあるいは染色体上に所在し、互いに極めてよく似たトランスポゾンである。Ｔｎ３及びＴｎ１０００の末端繰り返し構造はそれぞれ３８および３９塩基対からなり、その塩基配列もまた極めてよく似ている。これらのトランスポゾンは一般に転移活性の他に、その所在するＤＮＡ分子上で、自身の末端の隣の塩基を起点とし、不特定の外部の点を終点とするＤＮＡ欠失を形成する能力をもっている。さらに、Ｔｎ３中のトランスポゼースをコードする遺伝子（ｔｎｐＡ）及び制御因子をコードする遺伝子（ｔｎｐＲ）に欠失変異を施したもの（△Ｔｎ３）は、自身では欠失を生じさせないので、より好ましい（Ｙｏｓｈｉｎｏｂｕ ＳＵＧＩＮＯ ａｎｄ Ｈｉｔｏｓｈｉ ＫＡＷＡＳＨＩＭＡ，１９８３、上記）。Ｔｎ３及びＴｎ１０００と同様に、ＤＮＡ欠失を生じさせる能力を有する他のトランスポゾンも本発明で利用可能である。
【００１４】
ベクターへのトランスポゾンの末端繰り返し構造の挿入は、公知の方法、例えば、適当な制限酵素を用いてベクターの適当な部位を切断して線状化してから、トランスポゾンの末端繰り返し構造を含むＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼ等を用いて結合させることによって行うことができる。あるいは、またトランスポゾンの末端繰り返し構造を含む適切なベクターが、例えば、Ｓｕｇｉｎｏら（１９９４、上述）、およびＷａｎｇら（１９９３、上述）等の文献に開示されている。
【００１５】
ベクターに挿入される断片の長さは、約１０００−数万塩基対であり、本発明においては特に数万塩基対の長い断片を処理することが可能である。挿入されるＤＮＡ断片の塩基配列に特に制限はなく、所望のＤＮＡ断片を挿入することができる。ベクターはマルチクローニング部位を有するものが好ましく、所望のＤＮＡ断片をこの部位に挿入することができる。当該ＤＮＡ断片のベクターへの挿入も、トランスポゾンの挿入の場合と同様に公知の方法に従って行うことができる。
【００１６】
本発明の方法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーションによる欠失反応後、反応生成物を用いて宿主細胞を形質転換し、そして増幅させた形質転換体から欠失体を回収する。従って、ベクターはさらに、形質転換された宿主細胞を選択的に検出するためのマーカー遺伝子を含むことが好ましい。このようなマーカー遺伝子は当業者によく知られており、例えば、アンピシリン等の薬剤に対する耐性、栄養非要求性等を宿主細胞に付与する遺伝子が利用できる。この場合、ベクターによって形質転換された宿主細胞のみが特定の選択培地中で増殖することができる。
【００１７】
ベクターは好ましくはさらに、所望の欠失が生じてその一部または全部が欠失したベクターのみを、欠失の生じなかったものから選択的に検出するための指標となる遺伝子を含む。当該欠失体検出ための遺伝子としては、例えば、特定条件下でその遺伝子が存在する場合宿主細胞が生存不可能であるような遺伝子が利用できる。このような遺伝子は、トランスポゾンの末端繰り返し構造と挿入ＤＮＡ断片の末端の間に配置される。この場合、上記特定の条件下に置くことによって所望の欠失が生じ、指標遺伝子が機能しなくなったベクターで形質転換された宿主細胞のみが選択的に生存可能となる。あるいは、例えばファージＤＮＡのイムニティー領域の一部を挿入し、後に適切なファージ突然変異体と交差接種することにより、当該領域の欠失を確認することもできる。
【００１８】
当業者は本明細書の記載に基づいて、本発明のＤＮＡ欠失作製法に使用できるトランスポゾン、マーカー遺伝子、欠失体検出のための遺伝子等、並びにこれらを含ませるためのベクターを容易に選択できるであろう。
【００１９】
限定するわけではないが、本発明において好ましいベクターの例は、前述したＳｕｇｉｎｏら（１９９４）に記載されたｐＭＭ２５１である（図１）。ｐＭＭ２５１は、△Ｔｎ３、並びに形質転換体のマーカー遺伝子としてｂｌａ遺伝子、さらに欠失体検出のための指標遺伝子としてλファージＤＮＡに由来するｋｉｌ遺伝子とｃＩ８５７遺伝子との組み合わせ、およびＮ遺伝子を含む。ｂｌａ遺伝子は宿主細胞にアンピシリン耐性を付与する。また、ｐＭＭ２５１のＤＮＡが無変化であると、形質転換しても宿主細胞は通常の培養温度より高温の条件下（３２−４２℃、好ましくは約４２℃）でコロニーを生じない。その理由は、通常の培養条件下ではｃＩ遺伝子がｋｉｌ遺伝子を抑制しているが、高温条件下でｃＩ遺伝子の抑制がとれることによってｋｉｌ遺伝子の発現が宿主菌の死をもたらすからである。しかし、△Ｔｎ３の末端繰り返し構造からｋｉｌ遺伝子を含む欠失が生じると高温でも形質転換体が生じるようになる。また、Ｎ遺伝子が欠失せずに存在する場合は、適当な遺伝子型（例えば、λｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａｍ５３）を有するファージをレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）できるが、Ｎ遺伝子が欠失するとレスキューされない。また、上記ｃＩ遺伝子についても同様に例えばλｃＩ６０等を用いることにより欠失の有無を調べることが可能である。
【００２０】
ベクターＤＮＡは、欠失反応において約０.０４μｇ／μｌ以下の濃度で使用する。
【００２１】
２）トランスポゼース
欠失形成にはトランスポゼースが必要である。トランスポゼースは、精製又は部分精製されたトランスポゼースを用いてもよく、あるいはトランスポゼースをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入して過剰発現させたものの培養液または抽出液を用いてもよい。当業者は公知の方法によって、トランスポゼースの精製あるいは過剰発現を行うことができる。
【００２２】
例えば、Ｔｎ３トランスポゼースはｔｎｐＡ遺伝子によってコードされており、これを過剰発現するプラスミドｐＭＭ２４０を例えば宿主大腸菌ＤＯＯに導入して、Ｔｎ３トランスポゼースを大量に発現させることができる（Ｍｏｒｉｔａ，Ｍ．，Ｔｓｕｎａｓａｗａ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｕｇｉｎｏ，Ｙ．１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１２５３−１２６４）。
【００２３】
３）ＤＮＡ複製系
トランスポゼースの転移反応において、ＤＮＡ合成に必要なデオキシリボ核酸の代わりにダイデオキシリボ核酸を用いたり、あるいはＤＮＡの超らせんの巻き戻しに必要なＤＮＡジャイレースの抑制物質、例えばノボビオシン、オキソリン酸等を加えるたりすると、反応が阻害される。従って、トランスポゼースの転移反応にはＤＮＡ合成が必要であると考えられている（Ｉｃｈｉｋａｗａら、１９９０、上述）。同様に欠失反応にも、ＤＮＡ合成が必要であると考えられる。
【００２４】
従って、本発明の方法では欠失反応溶液にトランスポゼースのみならず、ＤＮＡ複製系を含ませることが必要である。ＤＮＡ複製は、主に塩基配列をコピーする際に高い精度が要求され、また親分子の二本鎖を物理的に切り離す必要があるため、複雑な反応過程である。ＤＮＡの複製には約２０種類以上のタンパク質が必要であると考えられている。
【００２５】
本明細書における「ＤＮＡ複製系」とは、トランスポゼースの欠失反応に必要で、ＤＮＡ複製に関わる少なくとも最小限の一群のタンパク質を意味し、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ等が含まれる。現在、ＤＮＡ複製活性に必要な系は完全には解明されておらず、一般に細胞抽出液が使用されている。しかしながら、本発明はこれに限定されず、ＤＮＡ複製のための必要最小限の一群のタンパク質を含むものであれば、本発明のＤＮＡ複製系として使用することができる。
【００２６】
当業者は公知の方法に従って、例えば、大腸菌宿主細胞よりＤＮＡ複製活性を有する画分を抽出したものを使用することができる（Ｉｃｈｉｋａｗａら、１９９０、上述）。その典型的な例は、Ｆｕｌｌｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８，７３７０−７３７４）に記載された硫安画分、即ち画分ＩＩである。
【００２７】
トランスポゼースを過剰発現させた宿主細胞から、ＤＮＡ複製系を含む画分を得るのが有利である。
【００２８】
４）欠失反応
反応溶液は、ベクターＤＮＡ、トランスポゼース、ＤＮＡ複製系、並びに必要によりＤＮＡ複製に必要なデオキシリボ核酸（ｄＮＴＰ）、適切なエネルギー供与体（例えば、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼ及びＡＴＰ等）等を含む。反応は、約３０−３７℃、好ましくは約３０℃で、約６０−１２０分、好ましくは約１２０分行う。
【００２９】
５）欠失体の検出
欠失反応物で宿主細胞を形質転換して所望の欠失体の検出を行う。形質転換は、ベクターの種類に応じた適切な宿主細胞を用い、公知の方法に従って行うことができる。好ましい宿主細胞は大腸菌である。ベクターが形質転換のマーカー遺伝子を含む場合、形質転換された宿主細胞のみを選択的に検出することができる。
【００３０】
欠失体の検出は、例えば宿主細胞からベクターＤＮＡを抽出して、その電気泳動等によりその長さを調べることによって行うことができる。さらに、ベクターが欠失体検出ための遺伝子を含む場合、例えば、宿主細胞を特定の条件下で培養して当該遺伝子の欠失したベクターのみを選択することができる。
【００３１】
しかしながら、反応物そのままでは副反応によるバックグラウンドノイズがやや高く、所望の挿入ＤＮＡ断片の欠失を含む好ましい欠失体が得にくい。そこでバックグラウンドノイズを減少させるために、欠失反応後、形質転換を行う前に、トランスポゾンの末端繰り返し構造と挿入断片との間にのみ切断部位のある制限酵素処理を行なうことが好ましい。このステップにより、末端繰り返し構造と挿入断片との切断部位が欠失されずに残っているベクターは切断され、宿主細胞に形質転換されない。従って、トランスポゾンの末端繰り返し構造からの欠失以外の機構によるノイズレベルが低下し、目的の欠失産物の検出と単離が著しく促進される。例えば、本明細書の実施例１の場合、クローン化された断片と△Ｔｎ３右端の間のみを切断する制限酵素ＸｈｏＩによって産物を消化した。これにより、バックグラウンドノイズが制限酵素処理前の約１０-5から、処理後は１０-6以下に減少した。
【００３２】
あるいは、所期の挿入ＤＮＡ断片の２つの末端が異なる制限酵素で処理されている場合、それらの酵素を同様の目的に利用できる。本明細書の実施例２では、挿入断片としてＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片を使用し、欠失反応物をＫｐｎＩ制限酵素で消化した。
【００３３】
本発明のトランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法は、従来の欠失作製方法と比較して様々な利点を有する優れた方法である。
【００３４】
先ず、エキソヌクレアーゼＩＩＩ等を用いる従来のｉｎ ｖｉｔｒｏ反応法に比べて操作が簡単である。即ち、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いる系は異なるサイズの欠失を充分得るために様々な時間間隔の複数の反応を行なう必要があり、また平滑端を作るための繊細な酵素処理を行なわなくてはならない。これに対し、本発明の系では、たった一回の反応により極めて多様なサイズの欠失が得られる。従って、例えば核酸配列決定に使用する場合、所期のＤＮＡ断片全長を網羅するために充分多様なサイズを得るには、無作意に充分な数のクローンを取るだけでよい。
【００３５】
又、本発明はトランスポゾンによるｉｎ ｖｉｖｏ欠失作製方法と比較してもいくつもの利点を有する。第一に、所要時間が短かく時間が著しく節約できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応系を用いた場合、トランスポゼースを含む活性標品が数カ月間冷凍保存できるので、ｉｎ ｖｉｖｏ系に比べ欠失を作製し、回収するために必要な時間が少なくとも２日間節約される。第二に、本発明は、生きた細胞内ではＤＮＡに変化を起こす可能性のある遺伝子にも適用可能である。第三に欠失産物を得るまでの操作がより簡便で、またバックグラウンドノイズを低く抑えることが可能である。第四に、ＤＮＡに働かせるトランスポゼースの量などを制御できるので、より均一な欠失パターンを得ることができる。
【００３６】
本発明によって得られた欠失体は、遺伝子工学技術において、ＤＮＡ配列決定を始め、ＤＮＡ挿入断片を適当な長さに調製する必要がある場合に広く有用である。
【００３７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修正、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３８】
【実施例】
実施例１
１） ベクターＤＮＡ
ベクターとして、△Ｔｎ３、並びにλファージのｋｉｌ遺伝子、Ｎ遺伝子およびｃＩ８５７遺伝子を有するプラスミドベクターｐＭＭ２５１を用いた（Ｓｕｇｉｎｏら、１９９４、上述）。ｐＭＭ２５１には、トランスポゾンＴｎ３内部のｔｎｐＡ遺伝子及びｔｎｐＲ遺伝子に欠失を含むΔＴｎ３（Ｍｏｒｉｔａら、１９８７、上述）の右側のＩＲとｐＵＣ１８由来のＭＣＳ（マルチクローニングサイト）の間にλファージのＰLプロモーターとｋｉｌ遺伝子が含まれている。ＰLプロモーターからの転写はｃＩ８５７遺伝子によってコードされる温度感受性λリプレッサーにより抑制されている。ＰL−ｋｉｌ領域とｃＩ８５７遺伝子はＴｎ３トランスポゼースによって触媒される欠失を選択するための機構を構成する。４２℃では、ｋｉｌ遺伝子機能を失ったベクターを持つ細胞のみが生き残ることが出来る。
【００３９】
λファージＤＮＡのＳｔｕＩ制限酵素消化断片（１５１９ｂｐ）を前記ベクターのＭＣＳのＳｍａＩ部位に挿入し、これをベクターＤＮＡとして使用した。
【００４０】
ｐＭＭ２５１の模式図を図１に示す。図１では△Ｔｎ３の両端の２つの逆方向反復配列を黒四角で示した。ｂｌａはアンピシリン耐性遺伝子であり、ｏｒｉは複製開始点である。ｐＵＣ１８由来のＭＣＳは斜線を施した四角で示した。欠失反応後に切断するＸｈｏＩ部位を矢印で示してある。
【００４１】
２） トランスポゼース活性成分およびＤＮＡ複製活性画分
Ｔｎ３トランスポゼースを過剰発現するプラスミドｐＭＭ２４０（Ｍｏｒｉｔａら、１９８７、上述）を宿主大腸菌Ｄ１１０ ｐｏｌＡ＋株に導入し、この菌よりＤＮＡ複製活性をもつ硫安分画を調製した。調製は、Ｉｃｈｉｋａｗａら（１９９０ 、上述)に記載された方法に従って行った。
【００４２】
この標品は約１００ｍｇタンパク質／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのＴｎ３トランスポゼースを含んでいた。トランスポゼース含量は、Ｍｏｒｉｔａら（１９８７、上述）の記載に従って、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色によって測定した。
【００４３】
３）反応条件
下記の表１の成分を試験管（エッペンドルフチューブ）中で、３０℃で１２０分反応させた。
【００４４】
【表１】
【００４５】
１２０分反応後、２００μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えて反応を停止した。この混合液に対し、２５μｌの０．５５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）と２．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加し、それをＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で飽和したフェノールで処理した。水層のＤＮＡをエタノールで沈澱させ，精製ＤＮＡを得た。
【００４６】
４）バックグラウンドを減らすための制限酵素処理
ＤＮＡが無変化のままであると、形質転換しても４２℃でコロニーを生じない。その理由は、１）の図のｋｉｌ遺伝子が、ｃＩ遺伝子の抑制がとれることによって宿主菌を殺すからである。図の右側のＩＲからｋｉｌ遺伝子を含む欠失が生じると４２℃で形質転換体が生じるようになる。これが、欠失を含むベクターの検出方法の原理である。
【００４７】
しかしながら、このままでは副反応によるバックグラウンドノイズがやや高く、所望の挿入ＤＮＡ断片の欠失を含む好ましい欠失体が得にくい。そこでバックグラウンドノイズを減少させるために、欠失反応後、ＩＲと挿入断片との間にのみ切断部位のある制限酵素で処理を行なう。本実施例のベクターの場合、クローン化された断片とＴｎ３右端の間のみを切断する制限酵素ＸｈｏＩによって産物を消化した。
【００４８】
後述の６）で述べるように、この制限酵素処理によりＴｎ３末端からの欠失以外の機構によって生ずる、温度抵抗性クローンのバックグラウンドノイズが、全分子数の約１０-6以下まで低下した。
【００４９】
５）形質転換
制限酵素処理の後、反応生成物を精製し、再びエタノールで沈澱させ１０μｌの水に溶解した。それぞれのＤＮＡ溶液のうち２μｌ（約０.１２μｇ ＤＮＡ）を８０μｌグリセロール中の大腸菌株ＤＯＯ細胞（Ｍｏｒｉｔａら．１９８７、上述)と混合し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）（バイオ・ラッド）でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの方法はＤｏｗｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６、６１２７−６１４５、１９８８）の記載に従った。１ｍｌのＳＯＣ（２％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母抽出物、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２０ｍＭグルコース）をこの混合液に混合し、３０℃で６０分間振とうした。次いで、１０μｌの培養液を、３０℃で保温した１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む寒天プレートに広げ、残りの培養液は遠心して同様に４２℃に保温したプレートに広げた。３０℃の培養は形質転換効率、および欠失反応産物の制限酵素処理の効果を確認するために行った。
【００５０】
６）ベクターＤＮＡの電気泳動、並びにＮ遺伝子及びｃＩ８５７遺伝子の活性試験
４２℃に保温したプレートから総量０．５６μｇのＤＮＡ当り、合計７２個のコロニーが得られた。３０℃では、ＤＮＡ１μｇ当り１．３ｘ１０4個のコロニーが得られた。これはＸｈｏＩ処理していない試料ＤＮＡ１μｇ当り３０℃で得られるコロニー数の４．２ｘ１０-4に相当する。
【００５１】
各コロニーよりプラスミドＤＮＡを精製し、電気泳動でプラスミドのサイズを測定した。電気泳動は、約５０ｎｇのプラスミドＤＮＡをＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の０．７％アガロースゲルで５０Ｖ、１２時間泳動することによって行った。
【００５２】
一方ベクター由来のλファージのＮ遺伝子及びｃＩ８５７遺伝子の活性を調べた。具体的には４２℃における形質転換体について、３０℃でλｃＩ６０と、４２℃でλｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａｍ５３に対してそれぞれ交互接種することによって、ｃＩ８５７とＮ遺伝子の状態について検討した。λｃＩ６０に感受性である場合、ｃＩ８５７遺伝子の一部または全部が失われていることを意味する。同様にλｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａｍ５３に感受性でない場合、Ｎ遺伝子の一部または全部が失われていることを意味する。
【００５３】
７）結果
電気泳動の結果とｃＩ遺伝子、Ｎ遺伝子活性試験の結果とを比較検討した。
【００５４】
７２個のプラスミドのうち１０個は７．９ｋｂよりも大きかったが、ｃＩ＋活性を失っていた。即ち、これらのプラスミドがＴｎ３の右端のＩＲからの欠失によるものではないことを意味する。またこれらのうち一つはＮ遺伝子の活性も失っていた。よって、これら１０個のクローンについては以後の研究を行わなかった。
【００５５】
残りの６２個のプラスミドについて、△Ｔｎ３の「右」末端からの欠失の終点分布を、第２図（中央）に示した。
【００５６】
図２では、上段にｐＭＭ２５１の直線状マップが示されている。Ｓは内部欠失産物の配列決定を行なうための合成プライマー（５’−ＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧ）を示す。Ｕ及びＲは挿入断片の両端から配列決定するためのユニバーサル及びリバースプライマーである。Ｔｎ３の「右」端から始まる欠失終点の位置と、得られたクローンの数を中段に示した。黒と白の棒は、各々クローンがλｃＩ６０に免疫性である、または感受性であることを示している。
【００５７】
Ｔｎ３末端から挿入断片内への欠失を含むプラスミドは、７．９３７ｋｂから９．４５６ｋｂの長さのはずであり、またＮ遺伝子を欠くがｃＩ８５７遺伝子は持っているはずである。図２から、８．２ｋｂから９．５ｋｂの範囲のサイズの、０．１ｋｂから０．４ｋｂ隔てられた欠失の終点を持つ１５個のプラスミドがこの条件を満たしていることがわかる。それらは１５１９ｋｂ挿入断片全体の配列決定のための鋳型を供給するために充分であると考えられる。
【００５８】
別の５つのプラスミドは１０ｋｂよりも大きく、かつｃＩ８５７遺伝子を維持している。それらは欠失の終点が挿入断片まで達していない欠失体である。また他の４２個のプラスミドは規定のサイズより短く、これはこれらのクローンでは挿入断片全体が欠失していることを意味する。そのうち４０個はｃＩ８５７遺伝子を失い、６．６ｋｂよりも小さく、一方２つの比較的大きな（７．０ｋｂと７．２ｋｂ）プラスミドはｃＩ８５７遺伝子を維持しており、これはそれらの終点が挿入断片の３’末端とｃＩ８５７遺伝子の間にあることを示す（第２図）。
【００５９】
本実施例においてλ感受性クローン、即ち挿入断片全体およびｃＩ８５７遺伝子が欠失しているプラスミドは、配列決定には有用でない。しかしながら、図２（中段）から、欠失終点は挿入断片の内部だけではなく両端に、即ちＸｈｏＩ部位とｏｒｉ（複製開始点）の間の８．５ｋｂ領域ほぼ全体に渡って、ほぼ一線かつランダムに分布することがわかる。このデータは，より大きな挿入断片についても配列決定に適した同様な欠失体が得られることを示している。これは、Ｔｎ３が標的部位特異性または領域特異性を殆ど示さないというｉｎ ｖｉｖｏのデータとも一致する。
【００６０】
実施例２
挿入ＤＮＡ断片として大腸菌のｃｒｐ−遺伝子に由来する１.２ｋｂのＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片を用い、実施例１と同様に実験を行った。本実施例においては、ＸｈｏＩでなくＫｐｎＩ制限酵素で反応産物を消化して、形質転換に用いた。ＫｐｎＩは、反応産物を挿入ＤＮＡの「左」端で切断する。
【００６１】
電気泳動とｃＩ遺伝子、Ｎ遺伝子活性試験をまとめた結果を第２図下段に示した。アンピシリンを含む４２℃に置いた寒天プレートから、０.２８μｇのＤＮＡ当り５つのλ耐性クローンが得られた。それらのうちの一つは、そのサイズとＫｐｎＩ切断によりＴｎ３末端からの欠失を含まないことが示された。Ｔｎ３の「右」端に始まり挿入断片内で終る欠失を含む、各々８．９ｋｂ、８．７ｋｂ、８．６ｋｂ及び８．４ｋｂの４つのプラスミドが得られた。この挿入断片の全塩基配列を決定するためには、挿入断片を両端からシーケンス出来るもとのプラスミドを含め、３つの欠失クローンで充分である。
【００６２】
【効果】
実施例１および２の結果から明らかなように、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ欠失作製方法により、所期の挿入ＤＮＡ断片をランダムに欠失させることができた。これにより単一のステップで配列決定出来ない大きなＤＮＡを効果的に配列決定するために十分な欠失体を得ることができた。さらに、図２の中段に示されたように、本発明の方法は挿入ＤＮＡ断片がより長い場合にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＭＭ２５１の構造の模式図を示す。
【図２】図２は、△Ｔｎ３の「右」端から始まる欠失終点の分布を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失作製方法に関する。
【０００２】
本発明は、前記ＤＮＡ入れ子型欠失作製方法に用いるためのキットに関する。
【０００３】
【従来の技術】
遺伝子工学技術において、所望のＤＮＡ断片をベクターに挿入して取り扱うことがしばしば行われる。この場合、ＤＮＡ挿入断片の長さを取り扱いに適当な長さに調製する必要がある場合がある。
【０００４】
例えば、特にＤＮＡ塩基配列決定技術では一度に決定できる配列の長さが限られているため、適切な長さのＤＮＡ断片がベクター中に挿入されることが重要である。詳細にはＤＮＡ塩基配列決定は、現在の方法では長くても約１０００塩基、通常は３００〜４００塩基程度しか、一度に配列決定できない。従って、より長い断片に対しては１）サブクローニング法、２）プライマーウォーキング法、および３）入れ子型欠失法（ｎｅｓｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）等を用いて配列決定を行っている。このうち、入れ子型欠失法は、一定の部位から入れ子型に多数の欠失を生じさせる方法であり、前二者と比較して多種類の欠失体を簡便に得られる等の理由から有力である。入れ子型欠失法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（試験管内）でエキソヌクレーゼ、例えばＥｘｏIII、を用いる方法や、トランスポゾンの末端繰り返し構造とトランスポゼースを用いてｉｎ ｖｉｖｏ（生体内）で行う方法が知られている。
【０００５】
トランスポゾンは転移性遺伝要素（ｍｏｖａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ）の一種で、ある染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡあるいはウイルスＤＮＡから同一の又は他のＤＮＡへ移動（転移，ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）する遺伝子単位である。細菌・酵母・トウモロコシ・ショウジョウバエなどに広く分布している。転移する相手のＤＮＡ部位（ｔａｒｇｅｔ：ターゲット）は一定ではなく、どのようなＤＮＡ部位にでも転移すると考えられる。トランスポゾンの構造上の特徴は、両端に逆向き（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ＝ＩＲ）あるいは同じ向きの繰り返し構造があり、必ずこの末端部において組み換えが起こることで、この繰り返し構造が転移において重要な役割を演じていると考えられている。トランスポゾンは、一般に、転移のために必要な機能やその機能の発現に関与する遺伝子を含んでいる。
【０００６】
トランスポゾンは一般に遺伝子の転移を生じさせる機能の他に、例えば、Ｔｎ３およびＴｎ１０００のように近傍の遺伝子を欠失させる機能を有するものが知られている。さらに、トランポゾンに含まれる転移を制御する遺伝子（ｔｎｐＲ）に変異を生じさせると、転移反応と同様欠失を生じさせる頻度が高まることが見いだされた（Ｙｏｓｈｉｎｏｂｕ ＳＵＧＩＮＯ ａｎｄ Ｈｉｔｏｓｈｉ ＫＡＷＡＳＨＩＭＡ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８３）５８，ｐｐ．７９−９３）。また、ｉｎ ｖｉｖｏで欠失を生じさせる系が開発されている（Ｓｕｇｉｎｏ，Ｙ．ａｎｄ Ｍｏｒｉｔａ，Ｍ．１９９４，Ｇｅｎｅ，１４８、１６９−１７０、およびＷａｎｇ，Ｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３） ９０，７８７４−７８７８）。この系は、トランスポゾンの末端繰り返し構造を有するベクターに所望のクローン化ＤＮＡ断片を挿入し、該ベクターを用いてトランスポゼースを過剰発現する大腸菌を形質転換し、大腸菌内でトランスポゾンの末端繰り返し構造から欠失を作製させるものである。この系は、例えば、ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社より市販されているＤＥＬＥＴＩＯＮ ＦＡＣＴＯＲＹ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ等を用いて行うことができる。
【０００７】
このように従来の入れ子型欠失法は有用ではあるが、生体内反応であるため、必然的に培養のための時間が必要である、目的の遺伝子が反応中に変化を起こす可能性がある等の問題を伴う。一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスポゾンをプラスミド中からλＤＮＡ内に転移させることも成功している（Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｈ．ａｎｄ Ｏｈｔｕｂｏ，Ｅ．１９９０， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１８８２９−１８８３２）。しかしながら、本発明前は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応での入れ子型欠失作製方法は、その必要性が高かったにもかかわらず、知られていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、
１）入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片およびトランスポゾンの末端繰り返し構造を含むベクターを用意し；
２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし；
３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望により
４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖させ
５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ断片を有するベクターを回収する
ことを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで所望のＤＮＡに入れ子型欠失を作製する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明は、さらに、適切な容器に保存されたトランスポゼースおよびＤＮＡ複製系を含む、前記ＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法に用いるためのキットを提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題解決のため鋭意研究に努めた結果、トランポゼースを過剰発現する宿主細胞から抽出したＤＮＡ複製活性成分を含む画分を用い、ｉｎｖｉｔｒｏ反応でＤＮＡ入れ子型欠失作製を行うことに初めて成功した。
【００１１】
本発明のＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法は、
１）入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片およびトランスポゾンの末端繰り返し構造を含むベクターを用意し；
２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし；
３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望により
４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖させ
５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ断片を有するベクターを回収する
ことを含むことを特徴とする。トランスポゼースの働きにより、トランスポゾンの末端繰り返し構造を起点とし多くの異なる不特定の部位を終点とする多数のＤＮＡ欠失が生じる。反応生成物で宿主細胞を形質転換することにより、欠失ＤＮＡ断片を含むベクターを検出することができる。以下、本発明の構成要素について詳述する。
【００１２】
１）ベクター
本発明に用いるベクターは、入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片およびトランスポゾンの末端繰り返し構造を含む。当該ベクターはさらに、宿主細胞内で複製を行うための複製起点を含む。好ましいベクターは、例えばプラスミドベクター、コスミドベクター等である。
【００１３】
限定されるわけではないが、好ましいトランポゾンの末端繰り返し構造は、Ｔｎ３及びＴｎ１０００（「γδ」とも呼ばれる）に由来する（Ｓｕｇｉｎｏら，１９９４，Ｇｅｎｅ，１４８，上述、およびＷａｎｇら，１９９３、上述）ものである。これらは腸内細菌のプラスミド、ファージあるいは染色体上に所在し、互いに極めてよく似たトランスポゾンである。Ｔｎ３及びＴｎ１０００の末端繰り返し構造はそれぞれ３８および３９塩基対からなり、その塩基配列もまた極めてよく似ている。これらのトランスポゾンは一般に転移活性の他に、その所在するＤＮＡ分子上で、自身の末端の隣の塩基を起点とし、不特定の外部の点を終点とするＤＮＡ欠失を形成する能力をもっている。さらに、Ｔｎ３中のトランスポゼースをコードする遺伝子（ｔｎｐＡ）及び制御因子をコードする遺伝子（ｔｎｐＲ）に欠失変異を施したもの（△Ｔｎ３）は、自身では欠失を生じさせないので、より好ましい（Ｙｏｓｈｉｎｏｂｕ ＳＵＧＩＮＯ ａｎｄ Ｈｉｔｏｓｈｉ ＫＡＷＡＳＨＩＭＡ，１９８３、上記）。Ｔｎ３及びＴｎ１０００と同様に、ＤＮＡ欠失を生じさせる能力を有する他のトランスポゾンも本発明で利用可能である。
【００１４】
ベクターへのトランスポゾンの末端繰り返し構造の挿入は、公知の方法、例えば、適当な制限酵素を用いてベクターの適当な部位を切断して線状化してから、トランスポゾンの末端繰り返し構造を含むＤＮＡ断片をＤＮＡリガーゼ等を用いて結合させることによって行うことができる。あるいは、またトランスポゾンの末端繰り返し構造を含む適切なベクターが、例えば、Ｓｕｇｉｎｏら（１９９４、上述）、およびＷａｎｇら（１９９３、上述）等の文献に開示されている。
【００１５】
ベクターに挿入される断片の長さは、約１０００−数万塩基対であり、本発明においては特に数万塩基対の長い断片を処理することが可能である。挿入されるＤＮＡ断片の塩基配列に特に制限はなく、所望のＤＮＡ断片を挿入することができる。ベクターはマルチクローニング部位を有するものが好ましく、所望のＤＮＡ断片をこの部位に挿入することができる。当該ＤＮＡ断片のベクターへの挿入も、トランスポゾンの挿入の場合と同様に公知の方法に従って行うことができる。
【００１６】
本発明の方法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーションによる欠失反応後、反応生成物を用いて宿主細胞を形質転換し、そして増幅させた形質転換体から欠失体を回収する。従って、ベクターはさらに、形質転換された宿主細胞を選択的に検出するためのマーカー遺伝子を含むことが好ましい。このようなマーカー遺伝子は当業者によく知られており、例えば、アンピシリン等の薬剤に対する耐性、栄養非要求性等を宿主細胞に付与する遺伝子が利用できる。この場合、ベクターによって形質転換された宿主細胞のみが特定の選択培地中で増殖することができる。
【００１７】
ベクターは好ましくはさらに、所望の欠失が生じてその一部または全部が欠失したベクターのみを、欠失の生じなかったものから選択的に検出するための指標となる遺伝子を含む。当該欠失体検出ための遺伝子としては、例えば、特定条件下でその遺伝子が存在する場合宿主細胞が生存不可能であるような遺伝子が利用できる。このような遺伝子は、トランスポゾンの末端繰り返し構造と挿入ＤＮＡ断片の末端の間に配置される。この場合、上記特定の条件下に置くことによって所望の欠失が生じ、指標遺伝子が機能しなくなったベクターで形質転換された宿主細胞のみが選択的に生存可能となる。あるいは、例えばファージＤＮＡのイムニティー領域の一部を挿入し、後に適切なファージ突然変異体と交差接種することにより、当該領域の欠失を確認することもできる。
【００１８】
当業者は本明細書の記載に基づいて、本発明のＤＮＡ欠失作製法に使用できるトランスポゾン、マーカー遺伝子、欠失体検出のための遺伝子等、並びにこれらを含ませるためのベクターを容易に選択できるであろう。
【００１９】
限定するわけではないが、本発明において好ましいベクターの例は、前述したＳｕｇｉｎｏら（１９９４）に記載されたｐＭＭ２５１である（図１）。ｐＭＭ２５１は、△Ｔｎ３、並びに形質転換体のマーカー遺伝子としてｂｌａ遺伝子、さらに欠失体検出のための指標遺伝子としてλファージＤＮＡに由来するｋｉｌ遺伝子とｃＩ８５７遺伝子との組み合わせ、およびＮ遺伝子を含む。ｂｌａ遺伝子は宿主細胞にアンピシリン耐性を付与する。また、ｐＭＭ２５１のＤＮＡが無変化であると、形質転換しても宿主細胞は通常の培養温度より高温の条件下（３２−４２℃、好ましくは約４２℃）でコロニーを生じない。その理由は、通常の培養条件下ではｃＩ遺伝子がｋｉｌ遺伝子を抑制しているが、高温条件下でｃＩ遺伝子の抑制がとれることによってｋｉｌ遺伝子の発現が宿主菌の死をもたらすからである。しかし、△Ｔｎ３の末端繰り返し構造からｋｉｌ遺伝子を含む欠失が生じると高温でも形質転換体が生じるようになる。また、Ｎ遺伝子が欠失せずに存在する場合は、適当な遺伝子型（例えば、λｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａｍ５３）を有するファージをレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）できるが、Ｎ遺伝子が欠失するとレスキューされない。また、上記ｃＩ遺伝子についても同様に例えばλｃＩ６０等を用いることにより欠失の有無を調べることが可能である。
【００２０】
ベクターＤＮＡは、欠失反応において約０.０４μｇ／μｌ以下の濃度で使用する。
【００２１】
２）トランスポゼース
欠失形成にはトランスポゼースが必要である。トランスポゼースは、精製又は部分精製されたトランスポゼースを用いてもよく、あるいはトランスポゼースをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入して過剰発現させたものの培養液または抽出液を用いてもよい。当業者は公知の方法によって、トランスポゼースの精製あるいは過剰発現を行うことができる。
【００２２】
例えば、Ｔｎ３トランスポゼースはｔｎｐＡ遺伝子によってコードされており、これを過剰発現するプラスミドｐＭＭ２４０を例えば宿主大腸菌ＤＯＯに導入して、Ｔｎ３トランスポゼースを大量に発現させることができる（Ｍｏｒｉｔａ，Ｍ．，Ｔｓｕｎａｓａｗａ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｕｇｉｎｏ，Ｙ．１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１２５３−１２６４）。
【００２３】
３）ＤＮＡ複製系
トランスポゼースの転移反応において、ＤＮＡ合成に必要なデオキシリボ核酸の代わりにダイデオキシリボ核酸を用いたり、あるいはＤＮＡの超らせんの巻き戻しに必要なＤＮＡジャイレースの抑制物質、例えばノボビオシン、オキソリン酸等を加えるたりすると、反応が阻害される。従って、トランスポゼースの転移反応にはＤＮＡ合成が必要であると考えられている（Ｉｃｈｉｋａｗａら、１９９０、上述）。同様に欠失反応にも、ＤＮＡ合成が必要であると考えられる。
【００２４】
従って、本発明の方法では欠失反応溶液にトランスポゼースのみならず、ＤＮＡ複製系を含ませることが必要である。ＤＮＡ複製は、主に塩基配列をコピーする際に高い精度が要求され、また親分子の二本鎖を物理的に切り離す必要があるため、複雑な反応過程である。ＤＮＡの複製には約２０種類以上のタンパク質が必要であると考えられている。
【００２５】
本明細書における「ＤＮＡ複製系」とは、トランスポゼースの欠失反応に必要で、ＤＮＡ複製に関わる少なくとも最小限の一群のタンパク質を意味し、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ等が含まれる。現在、ＤＮＡ複製活性に必要な系は完全には解明されておらず、一般に細胞抽出液が使用されている。しかしながら、本発明はこれに限定されず、ＤＮＡ複製のための必要最小限の一群のタンパク質を含むものであれば、本発明のＤＮＡ複製系として使用することができる。
【００２６】
当業者は公知の方法に従って、例えば、大腸菌宿主細胞よりＤＮＡ複製活性を有する画分を抽出したものを使用することができる（Ｉｃｈｉｋａｗａら、１９９０、上述）。その典型的な例は、Ｆｕｌｌｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８，７３７０−７３７４）に記載された硫安画分、即ち画分ＩＩである。
【００２７】
トランスポゼースを過剰発現させた宿主細胞から、ＤＮＡ複製系を含む画分を得るのが有利である。
【００２８】
４）欠失反応
反応溶液は、ベクターＤＮＡ、トランスポゼース、ＤＮＡ複製系、並びに必要によりＤＮＡ複製に必要なデオキシリボ核酸（ｄＮＴＰ）、適切なエネルギー供与体（例えば、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼ及びＡＴＰ等）等を含む。反応は、約３０−３７℃、好ましくは約３０℃で、約６０−１２０分、好ましくは約１２０分行う。
【００２９】
５）欠失体の検出
欠失反応物で宿主細胞を形質転換して所望の欠失体の検出を行う。形質転換は、ベクターの種類に応じた適切な宿主細胞を用い、公知の方法に従って行うことができる。好ましい宿主細胞は大腸菌である。ベクターが形質転換のマーカー遺伝子を含む場合、形質転換された宿主細胞のみを選択的に検出することができる。
【００３０】
欠失体の検出は、例えば宿主細胞からベクターＤＮＡを抽出して、その電気泳動等によりその長さを調べることによって行うことができる。さらに、ベクターが欠失体検出ための遺伝子を含む場合、例えば、宿主細胞を特定の条件下で培養して当該遺伝子の欠失したベクターのみを選択することができる。
【００３１】
しかしながら、反応物そのままでは副反応によるバックグラウンドノイズがやや高く、所望の挿入ＤＮＡ断片の欠失を含む好ましい欠失体が得にくい。そこでバックグラウンドノイズを減少させるために、欠失反応後、形質転換を行う前に、トランスポゾンの末端繰り返し構造と挿入断片との間にのみ切断部位のある制限酵素処理を行なうことが好ましい。このステップにより、末端繰り返し構造と挿入断片との切断部位が欠失されずに残っているベクターは切断され、宿主細胞に形質転換されない。従って、トランスポゾンの末端繰り返し構造からの欠失以外の機構によるノイズレベルが低下し、目的の欠失産物の検出と単離が著しく促進される。例えば、本明細書の実施例１の場合、クローン化された断片と△Ｔｎ３右端の間のみを切断する制限酵素ＸｈｏＩによって産物を消化した。これにより、バックグラウンドノイズが制限酵素処理前の約１０-5から、処理後は１０-6以下に減少した。
【００３２】
あるいは、所期の挿入ＤＮＡ断片の２つの末端が異なる制限酵素で処理されている場合、それらの酵素を同様の目的に利用できる。本明細書の実施例２では、挿入断片としてＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片を使用し、欠失反応物をＫｐｎＩ制限酵素で消化した。
【００３３】
本発明のトランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法は、従来の欠失作製方法と比較して様々な利点を有する優れた方法である。
【００３４】
先ず、エキソヌクレアーゼＩＩＩ等を用いる従来のｉｎ ｖｉｔｒｏ反応法に比べて操作が簡単である。即ち、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いる系は異なるサイズの欠失を充分得るために様々な時間間隔の複数の反応を行なう必要があり、また平滑端を作るための繊細な酵素処理を行なわなくてはならない。これに対し、本発明の系では、たった一回の反応により極めて多様なサイズの欠失が得られる。従って、例えば核酸配列決定に使用する場合、所期のＤＮＡ断片全長を網羅するために充分多様なサイズを得るには、無作意に充分な数のクローンを取るだけでよい。
【００３５】
又、本発明はトランスポゾンによるｉｎ ｖｉｖｏ欠失作製方法と比較してもいくつもの利点を有する。第一に、所要時間が短かく時間が著しく節約できる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応系を用いた場合、トランスポゼースを含む活性標品が数カ月間冷凍保存できるので、ｉｎ ｖｉｖｏ系に比べ欠失を作製し、回収するために必要な時間が少なくとも２日間節約される。第二に、本発明は、生きた細胞内ではＤＮＡに変化を起こす可能性のある遺伝子にも適用可能である。第三に欠失産物を得るまでの操作がより簡便で、またバックグラウンドノイズを低く抑えることが可能である。第四に、ＤＮＡに働かせるトランスポゼースの量などを制御できるので、より均一な欠失パターンを得ることができる。
【００３６】
本発明によって得られた欠失体は、遺伝子工学技術において、ＤＮＡ配列決定を始め、ＤＮＡ挿入断片を適当な長さに調製する必要がある場合に広く有用である。
【００３７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修正、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３８】
【実施例】
実施例１
１） ベクターＤＮＡ
ベクターとして、△Ｔｎ３、並びにλファージのｋｉｌ遺伝子、Ｎ遺伝子およびｃＩ８５７遺伝子を有するプラスミドベクターｐＭＭ２５１を用いた（Ｓｕｇｉｎｏら、１９９４、上述）。ｐＭＭ２５１には、トランスポゾンＴｎ３内部のｔｎｐＡ遺伝子及びｔｎｐＲ遺伝子に欠失を含むΔＴｎ３（Ｍｏｒｉｔａら、１９８７、上述）の右側のＩＲとｐＵＣ１８由来のＭＣＳ（マルチクローニングサイト）の間にλファージのＰLプロモーターとｋｉｌ遺伝子が含まれている。ＰLプロモーターからの転写はｃＩ８５７遺伝子によってコードされる温度感受性λリプレッサーにより抑制されている。ＰL−ｋｉｌ領域とｃＩ８５７遺伝子はＴｎ３トランスポゼースによって触媒される欠失を選択するための機構を構成する。４２℃では、ｋｉｌ遺伝子機能を失ったベクターを持つ細胞のみが生き残ることが出来る。
【００３９】
λファージＤＮＡのＳｔｕＩ制限酵素消化断片（１５１９ｂｐ）を前記ベクターのＭＣＳのＳｍａＩ部位に挿入し、これをベクターＤＮＡとして使用した。
【００４０】
ｐＭＭ２５１の模式図を図１に示す。図１では△Ｔｎ３の両端の２つの逆方向反復配列を黒四角で示した。ｂｌａはアンピシリン耐性遺伝子であり、ｏｒｉは複製開始点である。ｐＵＣ１８由来のＭＣＳは斜線を施した四角で示した。欠失反応後に切断するＸｈｏＩ部位を矢印で示してある。
【００４１】
２） トランスポゼース活性成分およびＤＮＡ複製活性画分
Ｔｎ３トランスポゼースを過剰発現するプラスミドｐＭＭ２４０（Ｍｏｒｉｔａら、１９８７、上述）を宿主大腸菌Ｄ１１０ ｐｏｌＡ＋株に導入し、この菌よりＤＮＡ複製活性をもつ硫安分画を調製した。調製は、Ｉｃｈｉｋａｗａら（１９９０ 、上述)に記載された方法に従って行った。
【００４２】
この標品は約１００ｍｇタンパク質／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのＴｎ３トランスポゼースを含んでいた。トランスポゼース含量は、Ｍｏｒｉｔａら（１９８７、上述）の記載に従って、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び銀染色によって測定した。
【００４３】
３）反応条件
下記の表１の成分を試験管（エッペンドルフチューブ）中で、３０℃で１２０分反応させた。
【００４４】
【表１】
１２０分反応後、２００μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡを加えて反応を停止した。この混合液に対し、２５μｌの０．５５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.８）と２．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加し、それをＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で飽和したフェノールで処理した。水層のＤＮＡをエタノールで沈澱させ，精製ＤＮＡを得た。
【００４６】
４）バックグラウンドを減らすための制限酵素処理
ＤＮＡが無変化のままであると、形質転換しても４２℃でコロニーを生じない。その理由は、１）の図のｋｉｌ遺伝子が、ｃＩ遺伝子の抑制がとれることによって宿主菌を殺すからである。図の右側のＩＲからｋｉｌ遺伝子を含む欠失が生じると４２℃で形質転換体が生じるようになる。これが、欠失を含むベクターの検出方法の原理である。
【００４７】
しかしながら、このままでは副反応によるバックグラウンドノイズがやや高く、所望の挿入ＤＮＡ断片の欠失を含む好ましい欠失体が得にくい。そこでバックグラウンドノイズを減少させるために、欠失反応後、ＩＲと挿入断片との間にのみ切断部位のある制限酵素で処理を行なう。本実施例のベクターの場合、クローン化された断片とＴｎ３右端の間のみを切断する制限酵素ＸｈｏＩによって産物を消化した。
【００４８】
後述の６）で述べるように、この制限酵素処理によりＴｎ３末端からの欠失以外の機構によって生ずる、温度抵抗性クローンのバックグラウンドノイズが、全分子数の約１０-6以下まで低下した。
【００４９】
５）形質転換
制限酵素処理の後、反応生成物を精製し、再びエタノールで沈澱させ１０μｌの水に溶解した。それぞれのＤＮＡ溶液のうち２μｌ（約０.１２μｇ ＤＮＡ）を８０μｌグリセロール中の大腸菌株ＤＯＯ細胞（Ｍｏｒｉｔａら．１９８７、上述)と混合し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）（バイオ・ラッド）でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの方法はＤｏｗｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６、６１２７−６１４５、１９８８）の記載に従った。１ｍｌのＳＯＣ（２％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母抽出物、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２０ｍＭグルコース）をこの混合液に混合し、３０℃で６０分間振とうした。次いで、１０μｌの培養液を、３０℃で保温した１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む寒天プレートに広げ、残りの培養液は遠心して同様に４２℃に保温したプレートに広げた。３０℃の培養は形質転換効率、および欠失反応産物の制限酵素処理の効果を確認するために行った。
【００５０】
６）ベクターＤＮＡの電気泳動、並びにＮ遺伝子及びｃＩ８５７遺伝子の活性試験
４２℃に保温したプレートから総量０．５６μｇのＤＮＡ当り、合計７２個のコロニーが得られた。３０℃では、ＤＮＡ１μｇ当り１．３ｘ１０4個のコロニーが得られた。これはＸｈｏＩ処理していない試料ＤＮＡ１μｇ当り３０℃で得られるコロニー数の４．２ｘ１０-4に相当する。
【００５１】
各コロニーよりプラスミドＤＮＡを精製し、電気泳動でプラスミドのサイズを測定した。電気泳動は、約５０ｎｇのプラスミドＤＮＡをＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の０．７％アガロースゲルで５０Ｖ、１２時間泳動することによって行った。
【００５２】
一方ベクター由来のλファージのＮ遺伝子及びｃＩ８５７遺伝子の活性を調べた。具体的には４２℃における形質転換体について、３０℃でλｃＩ６０と、４２℃でλｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａｍ５３に対してそれぞれ交互接種することによって、ｃＩ８５７とＮ遺伝子の状態について検討した。λｃＩ６０に感受性である場合、ｃＩ８５７遺伝子の一部または全部が失われていることを意味する。同様にλｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａｍ５３に感受性でない場合、Ｎ遺伝子の一部または全部が失われていることを意味する。
【００５３】
７）結果
電気泳動の結果とｃＩ遺伝子、Ｎ遺伝子活性試験の結果とを比較検討した。
【００５４】
７２個のプラスミドのうち１０個は７．９ｋｂよりも大きかったが、ｃＩ＋活性を失っていた。即ち、これらのプラスミドがＴｎ３の右端のＩＲからの欠失によるものではないことを意味する。またこれらのうち一つはＮ遺伝子の活性も失っていた。よって、これら１０個のクローンについては以後の研究を行わなかった。
【００５５】
残りの６２個のプラスミドについて、△Ｔｎ３の「右」末端からの欠失の終点分布を、第２図（中央）に示した。
【００５６】
図２では、上段にｐＭＭ２５１の直線状マップが示されている。Ｓは内部欠失産物の配列決定を行なうための合成プライマー（５’−ＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡＡＣＧ）を示す。Ｕ及びＲは挿入断片の両端から配列決定するためのユニバーサル及びリバースプライマーである。Ｔｎ３の「右」端から始まる欠失終点の位置と、得られたクローンの数を中段に示した。黒と白の棒は、各々クローンがλｃＩ６０に免疫性である、または感受性であることを示している。
【００５７】
Ｔｎ３末端から挿入断片内への欠失を含むプラスミドは、７．９３７ｋｂから９．４５６ｋｂの長さのはずであり、またＮ遺伝子を欠くがｃＩ８５７遺伝子は持っているはずである。図２から、８．２ｋｂから９．５ｋｂの範囲のサイズの、０．１ｋｂから０．４ｋｂ隔てられた欠失の終点を持つ１５個のプラスミドがこの条件を満たしていることがわかる。それらは１５１９ｋｂ挿入断片全体の配列決定のための鋳型を供給するために充分であると考えられる。
【００５８】
別の５つのプラスミドは１０ｋｂよりも大きく、かつｃＩ８５７遺伝子を維持している。それらは欠失の終点が挿入断片まで達していない欠失体である。また他の４２個のプラスミドは規定のサイズより短く、これはこれらのクローンでは挿入断片全体が欠失していることを意味する。そのうち４０個はｃＩ８５７遺伝子を失い、６．６ｋｂよりも小さく、一方２つの比較的大きな（７．０ｋｂと７．２ｋｂ）プラスミドはｃＩ８５７遺伝子を維持しており、これはそれらの終点が挿入断片の３’末端とｃＩ８５７遺伝子の間にあることを示す（第２図）。
【００５９】
本実施例においてλ感受性クローン、即ち挿入断片全体およびｃＩ８５７遺伝子が欠失しているプラスミドは、配列決定には有用でない。しかしながら、図２（中段）から、欠失終点は挿入断片の内部だけではなく両端に、即ちＸｈｏＩ部位とｏｒｉ（複製開始点）の間の８．５ｋｂ領域ほぼ全体に渡って、ほぼ一線かつランダムに分布することがわかる。このデータは，より大きな挿入断片についても配列決定に適した同様な欠失体が得られることを示している。これは、Ｔｎ３が標的部位特異性または領域特異性を殆ど示さないというｉｎ ｖｉｖｏのデータとも一致する。
【００６０】
実施例２
挿入ＤＮＡ断片として大腸菌のｃｒｐ−遺伝子に由来する１.２ｋｂのＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片を用い、実施例１と同様に実験を行った。本実施例においては、ＸｈｏＩでなくＫｐｎＩ制限酵素で反応産物を消化して、形質転換に用いた。ＫｐｎＩは、反応産物を挿入ＤＮＡの「左」端で切断する。
【００６１】
電気泳動とｃＩ遺伝子、Ｎ遺伝子活性試験をまとめた結果を第２図下段に示した。アンピシリンを含む４２℃に置いた寒天プレートから、０.２８μｇのＤＮＡ当り５つのλ耐性クローンが得られた。それらのうちの一つは、そのサイズとＫｐｎＩ切断によりＴｎ３末端からの欠失を含まないことが示された。Ｔｎ３の「右」端に始まり挿入断片内で終る欠失を含む、各々８．９ｋｂ、８．７ｋｂ、８．６ｋｂ及び８．４ｋｂの４つのプラスミドが得られた。この挿入断片の全塩基配列を決定するためには、挿入断片を両端からシーケンス出来るもとのプラスミドを含め、３つの欠失クローンで充分である。
【００６２】
【効果】
実施例１および２の結果から明らかなように、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ欠失作製方法により、所期の挿入ＤＮＡ断片をランダムに欠失させることができた。これにより単一のステップで配列決定出来ない大きなＤＮＡを効果的に配列決定するために十分な欠失体を得ることができた。さらに、図２の中段に示されたように、本発明の方法は挿入ＤＮＡ断片がより長い場合にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＭＭ２５１の構造の模式図を示す。
【図２】図２は、△Ｔｎ３の「右」端から始まる欠失終点の分布を示す。
Claims (9)
- １）入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片およびトランスポゾンの末端繰り返し構造を含むベクターを用意し；
２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし；
２’）工程２）のインキュベーション後、トランスポゾンの末端繰り返し構造およびＤＮＡ挿入断片を含むベクターを、トランポゾンの末端繰り返し構造と挿入ＤＮＡ断片の間だけで切断する制限酵素を用いて、反応産物を消化し、
３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望により
４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖させ；
５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ断片を有するベクターを回収する
ことを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで所望のＤＮＡに入れ子型欠失を作製する方法。 - トランスポゾンの末端繰り返し構造が、Ｔｎ３トランスポゾンまたはＴｎ１０００トランスポゾンに由来する、請求項１に記載の入れ子型欠失の作製方法。
- トランスポゼース活性成分が、トランスポゼースを産生する発現ベクターを保有する宿主細胞から調製されたものである、請求項１または２のいずれかに記載の入れ子型欠失の作製方法。
- トランスポゼース活性成分が、精製トランスポゼースである、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の入れ子型欠失の作製方法。
- ベクターが欠失検出ための指標となる遺伝子をさらに含む、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の入れ子型欠失の作製方法。
- 指標となる遺伝子が、λファージのｋｉｌ遺伝子とｃＩ８５７遺伝子の組み合わせである、請求項５に記載の入れ子型欠失の作製方法。
- 工程２）のインキュベートを、３０−３７℃で、６０−１２０分間行う、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の入れ子型欠失の作製方法。
- 工程２）の反応溶液が、０.００２μｇ／μｌ−０.０４μｇ／μｌの前記ベクターを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の入れ子型欠失の作製方法。
- 工程２）の反応溶液が、ＤＮＡ合成に必要なデオキシリボ核酸、エネルギー供与体をさらに含む、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の入れ子型欠失の作製方法。
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