JPH10225290A - トランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法 - Google Patents
トランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法Info
- Publication number
- JPH10225290A JPH10225290A JP9030507A JP3050797A JPH10225290A JP H10225290 A JPH10225290 A JP H10225290A JP 9030507 A JP9030507 A JP 9030507A JP 3050797 A JP3050797 A JP 3050797A JP H10225290 A JPH10225290 A JP H10225290A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- deletion
- vector
- nested
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで所望のＤＮＡ
に入れ子型欠失を作製する方法を提供することを目的と
する。 【解決手段】 本発明のＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法
は、 １）入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片および
トランスポゾンの末端繰り返し構造を含むベクターを用
意し； ２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複
製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし； ３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ
断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望によ
り ４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖
させ ５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記Ｄ
ＮＡ断片を有するベクターを回収することを含むことを
特徴とする。
に入れ子型欠失を作製する方法を提供することを目的と
する。 【解決手段】 本発明のＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法
は、 １）入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片および
トランスポゾンの末端繰り返し構造を含むベクターを用
意し； ２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複
製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし； ３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ
断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望によ
り ４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖
させ ５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記Ｄ
ＮＡ断片を有するベクターを回収することを含むことを
特徴とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
反応によるＤＮＡ入れ子型欠失作製方法に関する。
反応によるＤＮＡ入れ子型欠失作製方法に関する。
【０００２】本発明は、前記ＤＮＡ入れ子型欠失作製方
法に用いるためのキットに関する。
法に用いるためのキットに関する。
【０００３】
【従来の技術】遺伝子工学技術において、所望のＤＮＡ
断片をベクターに挿入して取り扱うことがしばしば行わ
れる。この場合、ＤＮＡ挿入断片の長さを取り扱いに適
当な長さに調製する必要がある場合がある。
断片をベクターに挿入して取り扱うことがしばしば行わ
れる。この場合、ＤＮＡ挿入断片の長さを取り扱いに適
当な長さに調製する必要がある場合がある。
【０００４】例えば、特にＤＮＡ塩基配列決定技術では
一度に決定できる配列の長さが限られているため、適切
な長さのＤＮＡ断片がベクター中に挿入されることが重
要である。詳細にはＤＮＡ塩基配列決定は、現在の方法
では長くても約１０００塩基、通常は３００〜４００塩
基程度しか、一度に配列決定できない。従って、より長
い断片に対しては１）サブクローニング法、２）プライ
マーウォーキング法、および３）入れ子型欠失法（ｎｅ
ｓｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）等を用いて配列決定を行
っている。このうち、入れ子型欠失法は、一定の部位か
ら入れ子型に多数の欠失を生じさせる方法であり、前二
者と比較して多種類の欠失体を簡便に得られる等の理由
から有力である。入れ子型欠失法としては、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ（試験管内）でエキソヌクレーゼ、例えばＥｘｏ
III、を用いる方法や、トランスポゾンの末端繰り返し
構造とトランスポゼースを用いてｉｎ ｖｉｖｏ（生体
内）で行う方法が知られている。
一度に決定できる配列の長さが限られているため、適切
な長さのＤＮＡ断片がベクター中に挿入されることが重
要である。詳細にはＤＮＡ塩基配列決定は、現在の方法
では長くても約１０００塩基、通常は３００〜４００塩
基程度しか、一度に配列決定できない。従って、より長
い断片に対しては１）サブクローニング法、２）プライ
マーウォーキング法、および３）入れ子型欠失法（ｎｅ
ｓｔｅｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）等を用いて配列決定を行
っている。このうち、入れ子型欠失法は、一定の部位か
ら入れ子型に多数の欠失を生じさせる方法であり、前二
者と比較して多種類の欠失体を簡便に得られる等の理由
から有力である。入れ子型欠失法としては、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ（試験管内）でエキソヌクレーゼ、例えばＥｘｏ
III、を用いる方法や、トランスポゾンの末端繰り返し
構造とトランスポゼースを用いてｉｎ ｖｉｖｏ（生体
内）で行う方法が知られている。
【０００５】トランスポゾンは転移性遺伝要素（ｍｏｖ
ａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ）の一種
で、ある染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡあるいはウイ
ルスＤＮＡから同一の又は他のＤＮＡへ移動（転移，ｔ
ｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）する遺伝子単位である。細
菌・酵母・トウモロコシ・ショウジョウバエなどに広く
分布している。転移する相手のＤＮＡ部位（ｔａｒｇｅ
ｔ：ターゲット）は一定ではなく、どのようなＤＮＡ部
位にでも転移すると考えられる。トランスポゾンの構造
上の特徴は、両端に逆向き（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐ
ｅａｔ＝ＩＲ）あるいは同じ向きの繰り返し構造があ
り、必ずこの末端部において組み換えが起こることで、
この繰り返し構造が転移において重要な役割を演じてい
ると考えられている。トランスポゾンは、一般に、転移
のために必要な機能やその機能の発現に関与する遺伝子
を含んでいる。
ａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔ）の一種
で、ある染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡあるいはウイ
ルスＤＮＡから同一の又は他のＤＮＡへ移動（転移，ｔ
ｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）する遺伝子単位である。細
菌・酵母・トウモロコシ・ショウジョウバエなどに広く
分布している。転移する相手のＤＮＡ部位（ｔａｒｇｅ
ｔ：ターゲット）は一定ではなく、どのようなＤＮＡ部
位にでも転移すると考えられる。トランスポゾンの構造
上の特徴は、両端に逆向き（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐ
ｅａｔ＝ＩＲ）あるいは同じ向きの繰り返し構造があ
り、必ずこの末端部において組み換えが起こることで、
この繰り返し構造が転移において重要な役割を演じてい
ると考えられている。トランスポゾンは、一般に、転移
のために必要な機能やその機能の発現に関与する遺伝子
を含んでいる。
【０００６】トランスポゾンは一般に遺伝子の転移を生
じさせる機能の他に、例えば、Ｔｎ３およびＴｎ１００
０のように近傍の遺伝子を欠失させる機能を有するもの
が知られている。さらに、トランポゾンに含まれる転移
を制御する遺伝子（ｔｎｐＲ）に変異を生じさせると、
転移反応と同様欠失を生じさせる頻度が高まることが見
いだされた（Ｙｏｓｈｉｎｏｂｕ ＳＵＧＩＮＯ ａｎ
ｄ ＨｉｔｏｓｈｉＫＡＷＡＳＨＩＭＡ，Ｊｐｎ．Ｊ．
Ｇｅｎｅｔ．（１９８３）５８，ｐｐ．７９−９３）。
また、ｉｎ ｖｉｖｏで欠失を生じさせる系が開発され
ている（Ｓｕｇｉｎｏ，Ｙ．ａｎｄ Ｍｏｒｉｔａ，
Ｍ．１９９４，Ｇｅｎｅ，１４８、１６９−１７０、お
よびＷａｎｇ，Ｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３） ９０，７８７
４−７８７８）。この系は、トランスポゾンの末端繰り
返し構造を有するベクターに所望のクローン化ＤＮＡ断
片を挿入し、該ベクターを用いてトランスポゼースを過
剰発現する大腸菌を形質転換し、大腸菌内でトランスポ
ゾンの末端繰り返し構造から欠失を作製させるものであ
る。この系は、例えば、ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧ
ＩＥＳ社より市販されているＤＥＬＥＴＩＯＮ ＦＡＣ
ＴＯＲＹ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ等を用いて行うこと
ができる。
じさせる機能の他に、例えば、Ｔｎ３およびＴｎ１００
０のように近傍の遺伝子を欠失させる機能を有するもの
が知られている。さらに、トランポゾンに含まれる転移
を制御する遺伝子（ｔｎｐＲ）に変異を生じさせると、
転移反応と同様欠失を生じさせる頻度が高まることが見
いだされた（Ｙｏｓｈｉｎｏｂｕ ＳＵＧＩＮＯ ａｎ
ｄ ＨｉｔｏｓｈｉＫＡＷＡＳＨＩＭＡ，Ｊｐｎ．Ｊ．
Ｇｅｎｅｔ．（１９８３）５８，ｐｐ．７９−９３）。
また、ｉｎ ｖｉｖｏで欠失を生じさせる系が開発され
ている（Ｓｕｇｉｎｏ，Ｙ．ａｎｄ Ｍｏｒｉｔａ，
Ｍ．１９９４，Ｇｅｎｅ，１４８、１６９−１７０、お
よびＷａｎｇ，Ｇ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３） ９０，７８７
４−７８７８）。この系は、トランスポゾンの末端繰り
返し構造を有するベクターに所望のクローン化ＤＮＡ断
片を挿入し、該ベクターを用いてトランスポゼースを過
剰発現する大腸菌を形質転換し、大腸菌内でトランスポ
ゾンの末端繰り返し構造から欠失を作製させるものであ
る。この系は、例えば、ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧ
ＩＥＳ社より市販されているＤＥＬＥＴＩＯＮ ＦＡＣ
ＴＯＲＹ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ等を用いて行うこと
ができる。
【０００７】このように従来の入れ子型欠失法は有用で
はあるが、生体内反応であるため、必然的に培養のため
の時間が必要である、目的の遺伝子が反応中に変化を起
こす可能性がある等の問題を伴う。一方、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでトランスポゾンをプラスミド中からλＤＮＡ内に
転移させることも成功している（Ｉｃｈｉｋａｗａ，
Ｈ．ａｎｄ Ｏｈｔｕｂｏ，Ｅ．１９９０， Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１８８２９−１８８３
２）。しかしながら、本発明前は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反
応での入れ子型欠失作製方法は、その必要性が高かった
にもかかわらず、知られていなかった。
はあるが、生体内反応であるため、必然的に培養のため
の時間が必要である、目的の遺伝子が反応中に変化を起
こす可能性がある等の問題を伴う。一方、ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでトランスポゾンをプラスミド中からλＤＮＡ内に
転移させることも成功している（Ｉｃｈｉｋａｗａ，
Ｈ．ａｎｄ Ｏｈｔｕｂｏ，Ｅ．１９９０， Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１８８２９−１８８３
２）。しかしながら、本発明前は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ反
応での入れ子型欠失作製方法は、その必要性が高かった
にもかかわらず、知られていなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、 １）入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片および
トランスポゾンの末端繰り返し構造を含むベクターを用
意し； ２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複
製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし； ３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ
断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望によ
り ４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖
させ ５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記Ｄ
ＮＡ断片を有するベクターを回収することを含む、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで所望のＤＮＡに入れ子型欠失を作製する
方法を提供することを目的とする。
トランスポゾンの末端繰り返し構造を含むベクターを用
意し； ２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複
製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし； ３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ
断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望によ
り ４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖
させ ５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記Ｄ
ＮＡ断片を有するベクターを回収することを含む、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで所望のＤＮＡに入れ子型欠失を作製する
方法を提供することを目的とする。
【０００９】本発明は、さらに、適切な容器に保存され
たトランスポゼースおよびＤＮＡ複製系を含む、前記Ｄ
ＮＡ入れ子型欠失の作製方法に用いるためのキットを提
供することを目的とする。
たトランスポゼースおよびＤＮＡ複製系を含む、前記Ｄ
ＮＡ入れ子型欠失の作製方法に用いるためのキットを提
供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
解決のため鋭意研究に努めた結果、トランポゼースを過
剰発現する宿主細胞から抽出したＤＮＡ複製活性成分を
含む画分を用い、ｉｎｖｉｔｒｏ反応でＤＮＡ入れ子型
欠失作製を行うことに初めて成功した。
解決のため鋭意研究に努めた結果、トランポゼースを過
剰発現する宿主細胞から抽出したＤＮＡ複製活性成分を
含む画分を用い、ｉｎｖｉｔｒｏ反応でＤＮＡ入れ子型
欠失作製を行うことに初めて成功した。
【００１１】本発明のＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法
は、 １）入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片および
トランスポゾンの末端繰り返し構造を含むベクターを用
意し； ２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複
製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし； ３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ
断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望によ
り ４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖
させ ５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記Ｄ
ＮＡ断片を有するベクターを回収することを含むことを
特徴とする。トランスポゼースの働きにより、トランス
ポゾンの末端繰り返し構造を起点とし多くの異なる不特
定の部位を終点とする多数のＤＮＡ欠失が生じる。反応
生成物で宿主細胞を形質転換することにより、欠失ＤＮ
Ａ断片を含むベクターを検出することができる。以下、
本発明の構成要素について詳述する。
は、 １）入れ子型欠失を作製しようとするＤＮＡ断片および
トランスポゾンの末端繰り返し構造を含むベクターを用
意し； ２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複
製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし； ３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ
断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望によ
り ４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖
させ ５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記Ｄ
ＮＡ断片を有するベクターを回収することを含むことを
特徴とする。トランスポゼースの働きにより、トランス
ポゾンの末端繰り返し構造を起点とし多くの異なる不特
定の部位を終点とする多数のＤＮＡ欠失が生じる。反応
生成物で宿主細胞を形質転換することにより、欠失ＤＮ
Ａ断片を含むベクターを検出することができる。以下、
本発明の構成要素について詳述する。
【００１２】１）ベクター 本発明に用いるベクターは、入れ子型欠失を作製しよう
とするＤＮＡ断片およびトランスポゾンの末端繰り返し
構造を含む。当該ベクターはさらに、宿主細胞内で複製
を行うための複製起点を含む。好ましいベクターは、例
えばプラスミドベクター、コスミドベクター等である。
とするＤＮＡ断片およびトランスポゾンの末端繰り返し
構造を含む。当該ベクターはさらに、宿主細胞内で複製
を行うための複製起点を含む。好ましいベクターは、例
えばプラスミドベクター、コスミドベクター等である。
【００１３】限定されるわけではないが、好ましいトラ
ンポゾンの末端繰り返し構造は、Ｔｎ３及びＴｎ１００
０（「γδ」とも呼ばれる）に由来する（Ｓｕｇｉｎｏ
ら，１９９４，Ｇｅｎｅ，１４８，上述、およびＷａｎ
ｇら，１９９３、上述）ものである。これらは腸内細菌
のプラスミド、ファージあるいは染色体上に所在し、互
いに極めてよく似たトランスポゾンである。Ｔｎ３及び
Ｔｎ１０００の末端繰り返し構造はそれぞれ３８および
３９塩基対からなり、その塩基配列もまた極めてよく似
ている。これらのトランスポゾンは一般に転移活性の他
に、その所在するＤＮＡ分子上で、自身の末端の隣の塩
基を起点とし、不特定の外部の点を終点とするＤＮＡ欠
失を形成する能力をもっている。さらに、Ｔｎ３中のト
ランスポゼースをコードする遺伝子（ｔｎｐＡ）及び制
御因子をコードする遺伝子（ｔｎｐＲ）に欠失変異を施
したもの（△Ｔｎ３）は、自身では欠失を生じさせない
ので、より好ましい（Ｙｏｓｈｉｎｏｂｕ ＳＵＧＩＮ
Ｏ ａｎｄ Ｈｉｔｏｓｈｉ ＫＡＷＡＳＨＩＭＡ，１
９８３、上記）。Ｔｎ３及びＴｎ１０００と同様に、Ｄ
ＮＡ欠失を生じさせる能力を有する他のトランスポゾン
も本発明で利用可能である。
ンポゾンの末端繰り返し構造は、Ｔｎ３及びＴｎ１００
０（「γδ」とも呼ばれる）に由来する（Ｓｕｇｉｎｏ
ら，１９９４，Ｇｅｎｅ，１４８，上述、およびＷａｎ
ｇら，１９９３、上述）ものである。これらは腸内細菌
のプラスミド、ファージあるいは染色体上に所在し、互
いに極めてよく似たトランスポゾンである。Ｔｎ３及び
Ｔｎ１０００の末端繰り返し構造はそれぞれ３８および
３９塩基対からなり、その塩基配列もまた極めてよく似
ている。これらのトランスポゾンは一般に転移活性の他
に、その所在するＤＮＡ分子上で、自身の末端の隣の塩
基を起点とし、不特定の外部の点を終点とするＤＮＡ欠
失を形成する能力をもっている。さらに、Ｔｎ３中のト
ランスポゼースをコードする遺伝子（ｔｎｐＡ）及び制
御因子をコードする遺伝子（ｔｎｐＲ）に欠失変異を施
したもの（△Ｔｎ３）は、自身では欠失を生じさせない
ので、より好ましい（Ｙｏｓｈｉｎｏｂｕ ＳＵＧＩＮ
Ｏ ａｎｄ Ｈｉｔｏｓｈｉ ＫＡＷＡＳＨＩＭＡ，１
９８３、上記）。Ｔｎ３及びＴｎ１０００と同様に、Ｄ
ＮＡ欠失を生じさせる能力を有する他のトランスポゾン
も本発明で利用可能である。
【００１４】ベクターへのトランスポゾンの末端繰り返
し構造の挿入は、公知の方法、例えば、適当な制限酵素
を用いてベクターの適当な部位を切断して線状化してか
ら、トランスポゾンの末端繰り返し構造を含むＤＮＡ断
片をＤＮＡリガーゼ等を用いて結合させることによって
行うことができる。あるいは、またトランスポゾンの末
端繰り返し構造を含む適切なベクターが、例えば、Ｓｕ
ｇｉｎｏら（１９９４、上述）、およびＷａｎｇら（１
９９３、上述）等の文献に開示されている。
し構造の挿入は、公知の方法、例えば、適当な制限酵素
を用いてベクターの適当な部位を切断して線状化してか
ら、トランスポゾンの末端繰り返し構造を含むＤＮＡ断
片をＤＮＡリガーゼ等を用いて結合させることによって
行うことができる。あるいは、またトランスポゾンの末
端繰り返し構造を含む適切なベクターが、例えば、Ｓｕ
ｇｉｎｏら（１９９４、上述）、およびＷａｎｇら（１
９９３、上述）等の文献に開示されている。
【００１５】ベクターに挿入される断片の長さは、約１
０００−数万塩基対であり、本発明においては特に数万
塩基対の長い断片を処理することが可能である。挿入さ
れるＤＮＡ断片の塩基配列に特に制限はなく、所望のＤ
ＮＡ断片を挿入することができる。ベクターはマルチク
ローニング部位を有するものが好ましく、所望のＤＮＡ
断片をこの部位に挿入することができる。当該ＤＮＡ断
片のベクターへの挿入も、トランスポゾンの挿入の場合
と同様に公知の方法に従って行うことができる。
０００−数万塩基対であり、本発明においては特に数万
塩基対の長い断片を処理することが可能である。挿入さ
れるＤＮＡ断片の塩基配列に特に制限はなく、所望のＤ
ＮＡ断片を挿入することができる。ベクターはマルチク
ローニング部位を有するものが好ましく、所望のＤＮＡ
断片をこの部位に挿入することができる。当該ＤＮＡ断
片のベクターへの挿入も、トランスポゾンの挿入の場合
と同様に公知の方法に従って行うことができる。
【００１６】本発明の方法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏイン
キュベーションによる欠失反応後、反応生成物を用いて
宿主細胞を形質転換し、そして増幅させた形質転換体か
ら欠失体を回収する。従って、ベクターはさらに、形質
転換された宿主細胞を選択的に検出するためのマーカー
遺伝子を含むことが好ましい。このようなマーカー遺伝
子は当業者によく知られており、例えば、アンピシリン
等の薬剤に対する耐性、栄養非要求性等を宿主細胞に付
与する遺伝子が利用できる。この場合、ベクターによっ
て形質転換された宿主細胞のみが特定の選択培地中で増
殖することができる。
キュベーションによる欠失反応後、反応生成物を用いて
宿主細胞を形質転換し、そして増幅させた形質転換体か
ら欠失体を回収する。従って、ベクターはさらに、形質
転換された宿主細胞を選択的に検出するためのマーカー
遺伝子を含むことが好ましい。このようなマーカー遺伝
子は当業者によく知られており、例えば、アンピシリン
等の薬剤に対する耐性、栄養非要求性等を宿主細胞に付
与する遺伝子が利用できる。この場合、ベクターによっ
て形質転換された宿主細胞のみが特定の選択培地中で増
殖することができる。
【００１７】ベクターは好ましくはさらに、所望の欠失
が生じてその一部または全部が欠失したベクターのみ
を、欠失の生じなかったものから選択的に検出するため
の指標となる遺伝子を含む。当該欠失体検出ための遺伝
子としては、例えば、特定条件下でその遺伝子が存在す
る場合宿主細胞が生存不可能であるような遺伝子が利用
できる。このような遺伝子は、トランスポゾンの末端繰
り返し構造と挿入ＤＮＡ断片の末端の間に配置される。
この場合、上記特定の条件下に置くことによって所望の
欠失が生じ、指標遺伝子が機能しなくなったベクターで
形質転換された宿主細胞のみが選択的に生存可能とな
る。あるいは、例えばファージＤＮＡのイムニティー領
域の一部を挿入し、後に適切なファージ突然変異体と交
差接種することにより、当該領域の欠失を確認すること
もできる。
が生じてその一部または全部が欠失したベクターのみ
を、欠失の生じなかったものから選択的に検出するため
の指標となる遺伝子を含む。当該欠失体検出ための遺伝
子としては、例えば、特定条件下でその遺伝子が存在す
る場合宿主細胞が生存不可能であるような遺伝子が利用
できる。このような遺伝子は、トランスポゾンの末端繰
り返し構造と挿入ＤＮＡ断片の末端の間に配置される。
この場合、上記特定の条件下に置くことによって所望の
欠失が生じ、指標遺伝子が機能しなくなったベクターで
形質転換された宿主細胞のみが選択的に生存可能とな
る。あるいは、例えばファージＤＮＡのイムニティー領
域の一部を挿入し、後に適切なファージ突然変異体と交
差接種することにより、当該領域の欠失を確認すること
もできる。
【００１８】当業者は本明細書の記載に基づいて、本発
明のＤＮＡ欠失作製法に使用できるトランスポゾン、マ
ーカー遺伝子、欠失体検出のための遺伝子等、並びにこ
れらを含ませるためのベクターを容易に選択できるであ
ろう。
明のＤＮＡ欠失作製法に使用できるトランスポゾン、マ
ーカー遺伝子、欠失体検出のための遺伝子等、並びにこ
れらを含ませるためのベクターを容易に選択できるであ
ろう。
【００１９】限定するわけではないが、本発明において
好ましいベクターの例は、前述したＳｕｇｉｎｏら（１
９９４）に記載されたｐＭＭ２５１である（図１）。ｐ
ＭＭ２５１は、△Ｔｎ３、並びに形質転換体のマーカー
遺伝子としてｂｌａ遺伝子、さらに欠失体検出のための
指標遺伝子としてλファージＤＮＡに由来するｋｉｌ遺
伝子とｃＩ８５７遺伝子との組み合わせ、およびＮ遺伝
子を含む。ｂｌａ遺伝子は宿主細胞にアンピシリン耐性
を付与する。また、ｐＭＭ２５１のＤＮＡが無変化であ
ると、形質転換しても宿主細胞は通常の培養温度より高
温の条件下（３２−４２℃、好ましくは約４２℃）でコ
ロニーを生じない。その理由は、通常の培養条件下では
ｃＩ遺伝子がｋｉｌ遺伝子を抑制しているが、高温条件
下でｃＩ遺伝子の抑制がとれることによってｋｉｌ遺伝
子の発現が宿主菌の死をもたらすからである。しかし、
△Ｔｎ３の末端繰り返し構造からｋｉｌ遺伝子を含む欠
失が生じると高温でも形質転換体が生じるようになる。
また、Ｎ遺伝子が欠失せずに存在する場合は、適当な遺
伝子型（例えば、λｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａｍ５３）を
有するファージをレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）できる
が、Ｎ遺伝子が欠失するとレスキューされない。また、
上記ｃＩ遺伝子についても同様に例えばλｃＩ６０等を
用いることにより欠失の有無を調べることが可能であ
る。
好ましいベクターの例は、前述したＳｕｇｉｎｏら（１
９９４）に記載されたｐＭＭ２５１である（図１）。ｐ
ＭＭ２５１は、△Ｔｎ３、並びに形質転換体のマーカー
遺伝子としてｂｌａ遺伝子、さらに欠失体検出のための
指標遺伝子としてλファージＤＮＡに由来するｋｉｌ遺
伝子とｃＩ８５７遺伝子との組み合わせ、およびＮ遺伝
子を含む。ｂｌａ遺伝子は宿主細胞にアンピシリン耐性
を付与する。また、ｐＭＭ２５１のＤＮＡが無変化であ
ると、形質転換しても宿主細胞は通常の培養温度より高
温の条件下（３２−４２℃、好ましくは約４２℃）でコ
ロニーを生じない。その理由は、通常の培養条件下では
ｃＩ遺伝子がｋｉｌ遺伝子を抑制しているが、高温条件
下でｃＩ遺伝子の抑制がとれることによってｋｉｌ遺伝
子の発現が宿主菌の死をもたらすからである。しかし、
△Ｔｎ３の末端繰り返し構造からｋｉｌ遺伝子を含む欠
失が生じると高温でも形質転換体が生じるようになる。
また、Ｎ遺伝子が欠失せずに存在する場合は、適当な遺
伝子型（例えば、λｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａｍ５３）を
有するファージをレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）できる
が、Ｎ遺伝子が欠失するとレスキューされない。また、
上記ｃＩ遺伝子についても同様に例えばλｃＩ６０等を
用いることにより欠失の有無を調べることが可能であ
る。
【００２０】ベクターＤＮＡは、欠失反応において約
０.０４μｇ／μｌ以下の濃度で使用する。
０.０４μｇ／μｌ以下の濃度で使用する。
【００２１】２）トランスポゼース 欠失形成にはトランスポゼースが必要である。トランス
ポゼースは、精製又は部分精製されたトランスポゼース
を用いてもよく、あるいはトランスポゼースをコードす
る遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入し
て過剰発現させたものの培養液または抽出液を用いても
よい。当業者は公知の方法によって、トランスポゼース
の精製あるいは過剰発現を行うことができる。
ポゼースは、精製又は部分精製されたトランスポゼース
を用いてもよく、あるいはトランスポゼースをコードす
る遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入し
て過剰発現させたものの培養液または抽出液を用いても
よい。当業者は公知の方法によって、トランスポゼース
の精製あるいは過剰発現を行うことができる。
【００２２】例えば、Ｔｎ３トランスポゼースはｔｎｐ
Ａ遺伝子によってコードされており、これを過剰発現す
るプラスミドｐＭＭ２４０を例えば宿主大腸菌ＤＯＯに
導入して、Ｔｎ３トランスポゼースを大量に発現させる
ことができる（Ｍｏｒｉｔａ，Ｍ．，Ｔｓｕｎａｓａｗ
ａ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｕｇｉｎｏ，Ｙ．１９８７，Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１２５３−１２６４）。
Ａ遺伝子によってコードされており、これを過剰発現す
るプラスミドｐＭＭ２４０を例えば宿主大腸菌ＤＯＯに
導入して、Ｔｎ３トランスポゼースを大量に発現させる
ことができる（Ｍｏｒｉｔａ，Ｍ．，Ｔｓｕｎａｓａｗ
ａ，Ｓ．ａｎｄ Ｓｕｇｉｎｏ，Ｙ．１９８７，Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１２５３−１２６４）。
【００２３】３）ＤＮＡ複製系 トランスポゼースの転移反応において、ＤＮＡ合成に必
要なデオキシリボ核酸の代わりにダイデオキシリボ核酸
を用いたり、あるいはＤＮＡの超らせんの巻き戻しに必
要なＤＮＡジャイレースの抑制物質、例えばノボビオシ
ン、オキソリン酸等を加えるたりすると、反応が阻害さ
れる。従って、トランスポゼースの転移反応にはＤＮＡ
合成が必要であると考えられている（Ｉｃｈｉｋａｗａ
ら、１９９０、上述）。同様に欠失反応にも、ＤＮＡ合
成が必要であると考えられる。
要なデオキシリボ核酸の代わりにダイデオキシリボ核酸
を用いたり、あるいはＤＮＡの超らせんの巻き戻しに必
要なＤＮＡジャイレースの抑制物質、例えばノボビオシ
ン、オキソリン酸等を加えるたりすると、反応が阻害さ
れる。従って、トランスポゼースの転移反応にはＤＮＡ
合成が必要であると考えられている（Ｉｃｈｉｋａｗａ
ら、１９９０、上述）。同様に欠失反応にも、ＤＮＡ合
成が必要であると考えられる。
【００２４】従って、本発明の方法では欠失反応溶液に
トランスポゼースのみならず、ＤＮＡ複製系を含ませる
ことが必要である。ＤＮＡ複製は、主に塩基配列をコピ
ーする際に高い精度が要求され、また親分子の二本鎖を
物理的に切り離す必要があるため、複雑な反応過程であ
る。ＤＮＡの複製には約２０種類以上のタンパク質が必
要であると考えられている。
トランスポゼースのみならず、ＤＮＡ複製系を含ませる
ことが必要である。ＤＮＡ複製は、主に塩基配列をコピ
ーする際に高い精度が要求され、また親分子の二本鎖を
物理的に切り離す必要があるため、複雑な反応過程であ
る。ＤＮＡの複製には約２０種類以上のタンパク質が必
要であると考えられている。
【００２５】本明細書における「ＤＮＡ複製系」とは、
トランスポゼースの欠失反応に必要で、ＤＮＡ複製に関
わる少なくとも最小限の一群のタンパク質を意味し、例
えば、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ等が含ま
れる。現在、ＤＮＡ複製活性に必要な系は完全には解明
されておらず、一般に細胞抽出液が使用されている。し
かしながら、本発明はこれに限定されず、ＤＮＡ複製の
ための必要最小限の一群のタンパク質を含むものであれ
ば、本発明のＤＮＡ複製系として使用することができ
る。
トランスポゼースの欠失反応に必要で、ＤＮＡ複製に関
わる少なくとも最小限の一群のタンパク質を意味し、例
えば、ＤＮＡポリメラーゼ、トポイソメラーゼ等が含ま
れる。現在、ＤＮＡ複製活性に必要な系は完全には解明
されておらず、一般に細胞抽出液が使用されている。し
かしながら、本発明はこれに限定されず、ＤＮＡ複製の
ための必要最小限の一群のタンパク質を含むものであれ
ば、本発明のＤＮＡ複製系として使用することができ
る。
【００２６】当業者は公知の方法に従って、例えば、大
腸菌宿主細胞よりＤＮＡ複製活性を有する画分を抽出し
たものを使用することができる（Ｉｃｈｉｋａｗａら、
１９９０、上述）。その典型的な例は、Ｆｕｌｌｅｒら
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．７８，７３７０−７３７４）に記載された硫安画
分、即ち画分ＩＩである。
腸菌宿主細胞よりＤＮＡ複製活性を有する画分を抽出し
たものを使用することができる（Ｉｃｈｉｋａｗａら、
１９９０、上述）。その典型的な例は、Ｆｕｌｌｅｒら
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．７８，７３７０−７３７４）に記載された硫安画
分、即ち画分ＩＩである。
【００２７】トランスポゼースを過剰発現させた宿主細
胞から、ＤＮＡ複製系を含む画分を得るのが有利であ
る。
胞から、ＤＮＡ複製系を含む画分を得るのが有利であ
る。
【００２８】４）欠失反応 反応溶液は、ベクターＤＮＡ、トランスポゼース、ＤＮ
Ａ複製系、並びに必要によりＤＮＡ複製に必要なデオキ
シリボ核酸（ｄＮＴＰ）、適切なエネルギー供与体（例
えば、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼ及びＡＴ
Ｐ等）等を含む。反応は、約３０−３７℃、好ましくは
約３０℃で、約６０−１２０分、好ましくは約１２０分
行う。
Ａ複製系、並びに必要によりＤＮＡ複製に必要なデオキ
シリボ核酸（ｄＮＴＰ）、適切なエネルギー供与体（例
えば、クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼ及びＡＴ
Ｐ等）等を含む。反応は、約３０−３７℃、好ましくは
約３０℃で、約６０−１２０分、好ましくは約１２０分
行う。
【００２９】５）欠失体の検出 欠失反応物で宿主細胞を形質転換して所望の欠失体の検
出を行う。形質転換は、ベクターの種類に応じた適切な
宿主細胞を用い、公知の方法に従って行うことができ
る。好ましい宿主細胞は大腸菌である。ベクターが形質
転換のマーカー遺伝子を含む場合、形質転換された宿主
細胞のみを選択的に検出することができる。
出を行う。形質転換は、ベクターの種類に応じた適切な
宿主細胞を用い、公知の方法に従って行うことができ
る。好ましい宿主細胞は大腸菌である。ベクターが形質
転換のマーカー遺伝子を含む場合、形質転換された宿主
細胞のみを選択的に検出することができる。
【００３０】欠失体の検出は、例えば宿主細胞からベク
ターＤＮＡを抽出して、その電気泳動等によりその長さ
を調べることによって行うことができる。さらに、ベク
ターが欠失体検出ための遺伝子を含む場合、例えば、宿
主細胞を特定の条件下で培養して当該遺伝子の欠失した
ベクターのみを選択することができる。
ターＤＮＡを抽出して、その電気泳動等によりその長さ
を調べることによって行うことができる。さらに、ベク
ターが欠失体検出ための遺伝子を含む場合、例えば、宿
主細胞を特定の条件下で培養して当該遺伝子の欠失した
ベクターのみを選択することができる。
【００３１】しかしながら、反応物そのままでは副反応
によるバックグラウンドノイズがやや高く、所望の挿入
ＤＮＡ断片の欠失を含む好ましい欠失体が得にくい。そ
こでバックグラウンドノイズを減少させるために、欠失
反応後、形質転換を行う前に、トランスポゾンの末端繰
り返し構造と挿入断片との間にのみ切断部位のある制限
酵素処理を行なうことが好ましい。このステップによ
り、末端繰り返し構造と挿入断片との切断部位が欠失さ
れずに残っているベクターは切断され、宿主細胞に形質
転換されない。従って、トランスポゾンの末端繰り返し
構造からの欠失以外の機構によるノイズレベルが低下
し、目的の欠失産物の検出と単離が著しく促進される。
例えば、本明細書の実施例１の場合、クローン化された
断片と△Ｔｎ３右端の間のみを切断する制限酵素Ｘｈｏ
Ｉによって産物を消化した。これにより、バックグラウ
ンドノイズが制限酵素処理前の約１０-5から、処理後は
１０-6以下に減少した。
によるバックグラウンドノイズがやや高く、所望の挿入
ＤＮＡ断片の欠失を含む好ましい欠失体が得にくい。そ
こでバックグラウンドノイズを減少させるために、欠失
反応後、形質転換を行う前に、トランスポゾンの末端繰
り返し構造と挿入断片との間にのみ切断部位のある制限
酵素処理を行なうことが好ましい。このステップによ
り、末端繰り返し構造と挿入断片との切断部位が欠失さ
れずに残っているベクターは切断され、宿主細胞に形質
転換されない。従って、トランスポゾンの末端繰り返し
構造からの欠失以外の機構によるノイズレベルが低下
し、目的の欠失産物の検出と単離が著しく促進される。
例えば、本明細書の実施例１の場合、クローン化された
断片と△Ｔｎ３右端の間のみを切断する制限酵素Ｘｈｏ
Ｉによって産物を消化した。これにより、バックグラウ
ンドノイズが制限酵素処理前の約１０-5から、処理後は
１０-6以下に減少した。
【００３２】あるいは、所期の挿入ＤＮＡ断片の２つの
末端が異なる制限酵素で処理されている場合、それらの
酵素を同様の目的に利用できる。本明細書の実施例２で
は、挿入断片としてＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片を使用し、
欠失反応物をＫｐｎＩ制限酵素で消化した。
末端が異なる制限酵素で処理されている場合、それらの
酵素を同様の目的に利用できる。本明細書の実施例２で
は、挿入断片としてＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片を使用し、
欠失反応物をＫｐｎＩ制限酵素で消化した。
【００３３】本発明のトランスポゼースを用いるｉｎ
ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法
は、従来の欠失作製方法と比較して様々な利点を有する
優れた方法である。
ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法
は、従来の欠失作製方法と比較して様々な利点を有する
優れた方法である。
【００３４】先ず、エキソヌクレアーゼＩＩＩ等を用い
る従来のｉｎ ｖｉｔｒｏ反応法に比べて操作が簡単で
ある。即ち、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いる系は異
なるサイズの欠失を充分得るために様々な時間間隔の複
数の反応を行なう必要があり、また平滑端を作るための
繊細な酵素処理を行なわなくてはならない。これに対
し、本発明の系では、たった一回の反応により極めて多
様なサイズの欠失が得られる。従って、例えば核酸配列
決定に使用する場合、所期のＤＮＡ断片全長を網羅する
ために充分多様なサイズを得るには、無作意に充分な数
のクローンを取るだけでよい。
る従来のｉｎ ｖｉｔｒｏ反応法に比べて操作が簡単で
ある。即ち、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いる系は異
なるサイズの欠失を充分得るために様々な時間間隔の複
数の反応を行なう必要があり、また平滑端を作るための
繊細な酵素処理を行なわなくてはならない。これに対
し、本発明の系では、たった一回の反応により極めて多
様なサイズの欠失が得られる。従って、例えば核酸配列
決定に使用する場合、所期のＤＮＡ断片全長を網羅する
ために充分多様なサイズを得るには、無作意に充分な数
のクローンを取るだけでよい。
【００３５】又、本発明はトランスポゾンによるｉｎ
ｖｉｖｏ欠失作製方法と比較してもいくつもの利点を有
する。第一に、所要時間が短かく時間が著しく節約でき
る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応系を用いた場合、トランスポ
ゼースを含む活性標品が数カ月間冷凍保存できるので、
ｉｎ ｖｉｖｏ系に比べ欠失を作製し、回収するために
必要な時間が少なくとも２日間節約される。第二に、本
発明は、生きた細胞内ではＤＮＡに変化を起こす可能性
のある遺伝子にも適用可能である。第三に欠失産物を得
るまでの操作がより簡便で、またバックグラウンドノイ
ズを低く抑えることが可能である。第四に、ＤＮＡに働
かせるトランスポゼースの量などを制御できるので、よ
り均一な欠失パターンを得ることができる。
ｖｉｖｏ欠失作製方法と比較してもいくつもの利点を有
する。第一に、所要時間が短かく時間が著しく節約でき
る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ反応系を用いた場合、トランスポ
ゼースを含む活性標品が数カ月間冷凍保存できるので、
ｉｎ ｖｉｖｏ系に比べ欠失を作製し、回収するために
必要な時間が少なくとも２日間節約される。第二に、本
発明は、生きた細胞内ではＤＮＡに変化を起こす可能性
のある遺伝子にも適用可能である。第三に欠失産物を得
るまでの操作がより簡便で、またバックグラウンドノイ
ズを低く抑えることが可能である。第四に、ＤＮＡに働
かせるトランスポゼースの量などを制御できるので、よ
り均一な欠失パターンを得ることができる。
【００３６】本発明によって得られた欠失体は、遺伝子
工学技術において、ＤＮＡ配列決定を始め、ＤＮＡ挿入
断片を適当な長さに調製する必要がある場合に広く有用
である。
工学技術において、ＤＮＡ配列決定を始め、ＤＮＡ挿入
断片を適当な長さに調製する必要がある場合に広く有用
である。
【００３７】以下、実施例によって本発明を具体的に説
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修正、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。
明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するため
のものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容
易に本発明に修正、変更を加えることができ、それらは
本発明の技術的範囲に含まれる。
【００３８】
【実施例】実施例１ １） ベクターＤＮＡ ベクターとして、△Ｔｎ３、並びにλファージのｋｉｌ
遺伝子、Ｎ遺伝子およびｃＩ８５７遺伝子を有するプラ
スミドベクターｐＭＭ２５１を用いた（Ｓｕｇｉｎｏ
ら、１９９４、上述）。ｐＭＭ２５１には、トランスポ
ゾンＴｎ３内部のｔｎｐＡ遺伝子及びｔｎｐＲ遺伝子に
欠失を含むΔＴｎ３（Ｍｏｒｉｔａら、１９８７、上
述）の右側のＩＲとｐＵＣ１８由来のＭＣＳ（マルチク
ローニングサイト）の間にλファージのＰLプロモータ
ーとｋｉｌ遺伝子が含まれている。ＰLプロモーターか
らの転写はｃＩ８５７遺伝子によってコードされる温度
感受性λリプレッサーにより抑制されている。ＰL−ｋ
ｉｌ領域とｃＩ８５７遺伝子はＴｎ３トランスポゼース
によって触媒される欠失を選択するための機構を構成す
る。４２℃では、ｋｉｌ遺伝子機能を失ったベクターを
持つ細胞のみが生き残ることが出来る。
遺伝子、Ｎ遺伝子およびｃＩ８５７遺伝子を有するプラ
スミドベクターｐＭＭ２５１を用いた（Ｓｕｇｉｎｏ
ら、１９９４、上述）。ｐＭＭ２５１には、トランスポ
ゾンＴｎ３内部のｔｎｐＡ遺伝子及びｔｎｐＲ遺伝子に
欠失を含むΔＴｎ３（Ｍｏｒｉｔａら、１９８７、上
述）の右側のＩＲとｐＵＣ１８由来のＭＣＳ（マルチク
ローニングサイト）の間にλファージのＰLプロモータ
ーとｋｉｌ遺伝子が含まれている。ＰLプロモーターか
らの転写はｃＩ８５７遺伝子によってコードされる温度
感受性λリプレッサーにより抑制されている。ＰL−ｋ
ｉｌ領域とｃＩ８５７遺伝子はＴｎ３トランスポゼース
によって触媒される欠失を選択するための機構を構成す
る。４２℃では、ｋｉｌ遺伝子機能を失ったベクターを
持つ細胞のみが生き残ることが出来る。
【００３９】λファージＤＮＡのＳｔｕＩ制限酵素消化
断片（１５１９ｂｐ）を前記ベクターのＭＣＳのＳｍａ
Ｉ部位に挿入し、これをベクターＤＮＡとして使用し
た。
断片（１５１９ｂｐ）を前記ベクターのＭＣＳのＳｍａ
Ｉ部位に挿入し、これをベクターＤＮＡとして使用し
た。
【００４０】ｐＭＭ２５１の模式図を図１に示す。図１
では△Ｔｎ３の両端の２つの逆方向反復配列を黒四角で
示した。ｂｌａはアンピシリン耐性遺伝子であり、ｏｒ
ｉは複製開始点である。ｐＵＣ１８由来のＭＣＳは斜線
を施した四角で示した。欠失反応後に切断するＸｈｏＩ
部位を矢印で示してある。
では△Ｔｎ３の両端の２つの逆方向反復配列を黒四角で
示した。ｂｌａはアンピシリン耐性遺伝子であり、ｏｒ
ｉは複製開始点である。ｐＵＣ１８由来のＭＣＳは斜線
を施した四角で示した。欠失反応後に切断するＸｈｏＩ
部位を矢印で示してある。
【００４１】２） トランスポゼース活性成分およびＤ
ＮＡ複製活性画分 Ｔｎ３トランスポゼースを過剰発現するプラスミドｐＭ
Ｍ２４０（Ｍｏｒｉｔａら、１９８７、上述）を宿主大
腸菌Ｄ１１０ ｐｏｌＡ＋株に導入し、この菌よりＤＮ
Ａ複製活性をもつ硫安分画を調製した。調製は、Ｉｃｈ
ｉｋａｗａら（１９９０ 、上述)に記載された方法に従
って行った。
ＮＡ複製活性画分 Ｔｎ３トランスポゼースを過剰発現するプラスミドｐＭ
Ｍ２４０（Ｍｏｒｉｔａら、１９８７、上述）を宿主大
腸菌Ｄ１１０ ｐｏｌＡ＋株に導入し、この菌よりＤＮ
Ａ複製活性をもつ硫安分画を調製した。調製は、Ｉｃｈ
ｉｋａｗａら（１９９０ 、上述)に記載された方法に従
って行った。
【００４２】この標品は約１００ｍｇタンパク質／ｍｌ
及び１００μｇ／ｍｌのＴｎ３トランスポゼースを含ん
でいた。トランスポゼース含量は、Ｍｏｒｉｔａら（１
９８７、上述）の記載に従って、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及び銀染色によって測定した。
及び１００μｇ／ｍｌのＴｎ３トランスポゼースを含ん
でいた。トランスポゼース含量は、Ｍｏｒｉｔａら（１
９８７、上述）の記載に従って、ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動及び銀染色によって測定した。
【００４３】３）反応条件 下記の表１の成分を試験管（エッペンドルフチューブ）
中で、３０℃で１２０分反応させた。
中で、３０℃で１２０分反応させた。
【００４４】
【表１】 トランスポゼース活性成分および ＤＮＡ複製活性を含む大腸菌由来の抽出物 ５μｌ ベクターＤＮＡ ２μｇ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６） ２５ｍＭ 酢酸マグネシウム １２ｍＭ ＤＴＴ ５ｍＭ ＫＣｌ ６０ｍＭ ＡＴＰ ２ｍＭ ｄＡＴＰ ２００μＭ ｄＧＴＰ ２００μＭ ｄＣＴＰ ２００μＭ ｄＴＴＰ ２００μＭ ＮＡＤ ４０μＭ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） ５０μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ １００μｇ／ｍｌ ポリビニールアルコール ２％ クレアチンリン酸 ２０ｍＭ クレアチンキナーゼ １００μｇ／ｍｌ 全体積 ５０μｌ
【００４５】１２０分反応後、２００μｌの１０ｍＭ
ＥＤＴＡを加えて反応を停止した。この混合液に対し、
２５μｌの０．５５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
８）と２．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添
加し、それをＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で飽和したフェノールで処
理した。水層のＤＮＡをエタノールで沈澱させ，精製Ｄ
ＮＡを得た。
ＥＤＴＡを加えて反応を停止した。この混合液に対し、
２５μｌの０．５５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.
８）と２．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添
加し、それをＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ
８.０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で飽和したフェノールで処
理した。水層のＤＮＡをエタノールで沈澱させ，精製Ｄ
ＮＡを得た。
【００４６】４）バックグラウンドを減らすための制限
酵素処理 ＤＮＡが無変化のままであると、形質転換しても４２℃
でコロニーを生じない。その理由は、１）の図のｋｉｌ
遺伝子が、ｃＩ遺伝子の抑制がとれることによって宿主
菌を殺すからである。図の右側のＩＲからｋｉｌ遺伝子
を含む欠失が生じると４２℃で形質転換体が生じるよう
になる。これが、欠失を含むベクターの検出方法の原理
である。
酵素処理 ＤＮＡが無変化のままであると、形質転換しても４２℃
でコロニーを生じない。その理由は、１）の図のｋｉｌ
遺伝子が、ｃＩ遺伝子の抑制がとれることによって宿主
菌を殺すからである。図の右側のＩＲからｋｉｌ遺伝子
を含む欠失が生じると４２℃で形質転換体が生じるよう
になる。これが、欠失を含むベクターの検出方法の原理
である。
【００４７】しかしながら、このままでは副反応による
バックグラウンドノイズがやや高く、所望の挿入ＤＮＡ
断片の欠失を含む好ましい欠失体が得にくい。そこでバ
ックグラウンドノイズを減少させるために、欠失反応
後、ＩＲと挿入断片との間にのみ切断部位のある制限酵
素で処理を行なう。本実施例のベクターの場合、クロー
ン化された断片とＴｎ３右端の間のみを切断する制限酵
素ＸｈｏＩによって産物を消化した。
バックグラウンドノイズがやや高く、所望の挿入ＤＮＡ
断片の欠失を含む好ましい欠失体が得にくい。そこでバ
ックグラウンドノイズを減少させるために、欠失反応
後、ＩＲと挿入断片との間にのみ切断部位のある制限酵
素で処理を行なう。本実施例のベクターの場合、クロー
ン化された断片とＴｎ３右端の間のみを切断する制限酵
素ＸｈｏＩによって産物を消化した。
【００４８】後述の６）で述べるように、この制限酵素
処理によりＴｎ３末端からの欠失以外の機構によって生
ずる、温度抵抗性クローンのバックグラウンドノイズ
が、全分子数の約１０-6以下まで低下した。
処理によりＴｎ３末端からの欠失以外の機構によって生
ずる、温度抵抗性クローンのバックグラウンドノイズ
が、全分子数の約１０-6以下まで低下した。
【００４９】５）形質転換 制限酵素処理の後、反応生成物を精製し、再びエタノー
ルで沈澱させ１０μｌの水に溶解した。それぞれのＤＮ
Ａ溶液のうち２μｌ（約０.１２μｇ ＤＮＡ）を８０
μｌグリセロール中の大腸菌株ＤＯＯ細胞（Ｍｏｒｉｔ
ａら．１９８７、上述)と混合し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓ
ｅｒ（登録商標）（バイオ・ラッド）でエレクトロポレ
ーションした。エレクトロポレーションの方法はＤｏｗ
ｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６、
６１２７−６１４５、１９８８）の記載に従った。１ｍ
ｌのＳＯＣ（２％バクトトリプトン、０．５％バクト酵
母抽出物、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２０ｍＭ
グルコース）をこの混合液に混合し、３０℃で６０分間
振とうした。次いで、１０μｌの培養液を、３０℃で保
温した１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む寒天プレー
トに広げ、残りの培養液は遠心して同様に４２℃に保温
したプレートに広げた。３０℃の培養は形質転換効率、
および欠失反応産物の制限酵素処理の効果を確認するた
めに行った。
ルで沈澱させ１０μｌの水に溶解した。それぞれのＤＮ
Ａ溶液のうち２μｌ（約０.１２μｇ ＤＮＡ）を８０
μｌグリセロール中の大腸菌株ＤＯＯ細胞（Ｍｏｒｉｔ
ａら．１９８７、上述)と混合し、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓ
ｅｒ（登録商標）（バイオ・ラッド）でエレクトロポレ
ーションした。エレクトロポレーションの方法はＤｏｗ
ｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６、
６１２７−６１４５、１９８８）の記載に従った。１ｍ
ｌのＳＯＣ（２％バクトトリプトン、０．５％バクト酵
母抽出物、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、
１０ｍＭ ＭｇＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、２０ｍＭ
グルコース）をこの混合液に混合し、３０℃で６０分間
振とうした。次いで、１０μｌの培養液を、３０℃で保
温した１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む寒天プレー
トに広げ、残りの培養液は遠心して同様に４２℃に保温
したプレートに広げた。３０℃の培養は形質転換効率、
および欠失反応産物の制限酵素処理の効果を確認するた
めに行った。
【００５０】６）ベクターＤＮＡの電気泳動、並びにＮ
遺伝子及びｃＩ８５７遺伝子の活性試験 ４２℃に保温したプレートから総量０．５６μｇのＤＮ
Ａ当り、合計７２個のコロニーが得られた。３０℃で
は、ＤＮＡ１μｇ当り１．３ｘ１０4個のコロニーが得
られた。これはＸｈｏＩ処理していない試料ＤＮＡ１μ
ｇ当り３０℃で得られるコロニー数の４．２ｘ１０-4に
相当する。
遺伝子及びｃＩ８５７遺伝子の活性試験 ４２℃に保温したプレートから総量０．５６μｇのＤＮ
Ａ当り、合計７２個のコロニーが得られた。３０℃で
は、ＤＮＡ１μｇ当り１．３ｘ１０4個のコロニーが得
られた。これはＸｈｏＩ処理していない試料ＤＮＡ１μ
ｇ当り３０℃で得られるコロニー数の４．２ｘ１０-4に
相当する。
【００５１】各コロニーよりプラスミドＤＮＡを精製
し、電気泳動でプラスミドのサイズを測定した。電気泳
動は、約５０ｎｇのプラスミドＤＮＡをＴＢＥ緩衝液
（９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の
０．７％アガロースゲルで５０Ｖ、１２時間泳動するこ
とによって行った。
し、電気泳動でプラスミドのサイズを測定した。電気泳
動は、約５０ｎｇのプラスミドＤＮＡをＴＢＥ緩衝液
（９０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、２ｍＭ ＥＤＴＡ）の
０．７％アガロースゲルで５０Ｖ、１２時間泳動するこ
とによって行った。
【００５２】一方ベクター由来のλファージのＮ遺伝子
及びｃＩ８５７遺伝子の活性を調べた。具体的には４２
℃における形質転換体について、３０℃でλｃＩ６０
と、４２℃でλｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａｍ５３に対して
それぞれ交互接種することによって、ｃＩ８５７とＮ遺
伝子の状態について検討した。λｃＩ６０に感受性であ
る場合、ｃＩ８５７遺伝子の一部または全部が失われて
いることを意味する。同様にλｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａ
ｍ５３に感受性でない場合、Ｎ遺伝子の一部または全部
が失われていることを意味する。
及びｃＩ８５７遺伝子の活性を調べた。具体的には４２
℃における形質転換体について、３０℃でλｃＩ６０
と、４２℃でλｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａｍ５３に対して
それぞれ交互接種することによって、ｃＩ８５７とＮ遺
伝子の状態について検討した。λｃＩ６０に感受性であ
る場合、ｃＩ８５７遺伝子の一部または全部が失われて
いることを意味する。同様にλｉｍｍ４３４Ｎａｍ７ａ
ｍ５３に感受性でない場合、Ｎ遺伝子の一部または全部
が失われていることを意味する。
【００５３】７）結果 電気泳動の結果とｃＩ遺伝子、Ｎ遺伝子活性試験の結果
とを比較検討した。
とを比較検討した。
【００５４】７２個のプラスミドのうち１０個は７．９
ｋｂよりも大きかったが、ｃＩ＋活性を失っていた。即
ち、これらのプラスミドがＴｎ３の右端のＩＲからの欠
失によるものではないことを意味する。またこれらのう
ち一つはＮ遺伝子の活性も失っていた。よって、これら
１０個のクローンについては以後の研究を行わなかっ
た。
ｋｂよりも大きかったが、ｃＩ＋活性を失っていた。即
ち、これらのプラスミドがＴｎ３の右端のＩＲからの欠
失によるものではないことを意味する。またこれらのう
ち一つはＮ遺伝子の活性も失っていた。よって、これら
１０個のクローンについては以後の研究を行わなかっ
た。
【００５５】残りの６２個のプラスミドについて、△Ｔ
ｎ３の「右」末端からの欠失の終点分布を、第２図（中
央）に示した。
ｎ３の「右」末端からの欠失の終点分布を、第２図（中
央）に示した。
【００５６】図２では、上段にｐＭＭ２５１の直線状マ
ップが示されている。Ｓは内部欠失産物の配列決定を行
なうための合成プライマー（５’−ＧＡＣＣＡＡＡＡＴ
ＣＣＣＴＴＡＡＣＧ）を示す。Ｕ及びＲは挿入断片の両
端から配列決定するためのユニバーサル及びリバースプ
ライマーである。Ｔｎ３の「右」端から始まる欠失終点
の位置と、得られたクローンの数を中段に示した。黒と
白の棒は、各々クローンがλｃＩ６０に免疫性である、
または感受性であることを示している。
ップが示されている。Ｓは内部欠失産物の配列決定を行
なうための合成プライマー（５’−ＧＡＣＣＡＡＡＡＴ
ＣＣＣＴＴＡＡＣＧ）を示す。Ｕ及びＲは挿入断片の両
端から配列決定するためのユニバーサル及びリバースプ
ライマーである。Ｔｎ３の「右」端から始まる欠失終点
の位置と、得られたクローンの数を中段に示した。黒と
白の棒は、各々クローンがλｃＩ６０に免疫性である、
または感受性であることを示している。
【００５７】Ｔｎ３末端から挿入断片内への欠失を含む
プラスミドは、７．９３７ｋｂから９．４５６ｋｂの長
さのはずであり、またＮ遺伝子を欠くがｃＩ８５７遺伝
子は持っているはずである。図２から、８．２ｋｂから
９．５ｋｂの範囲のサイズの、０．１ｋｂから０．４ｋ
ｂ隔てられた欠失の終点を持つ１５個のプラスミドがこ
の条件を満たしていることがわかる。それらは１５１９
ｋｂ挿入断片全体の配列決定のための鋳型を供給するた
めに充分であると考えられる。
プラスミドは、７．９３７ｋｂから９．４５６ｋｂの長
さのはずであり、またＮ遺伝子を欠くがｃＩ８５７遺伝
子は持っているはずである。図２から、８．２ｋｂから
９．５ｋｂの範囲のサイズの、０．１ｋｂから０．４ｋ
ｂ隔てられた欠失の終点を持つ１５個のプラスミドがこ
の条件を満たしていることがわかる。それらは１５１９
ｋｂ挿入断片全体の配列決定のための鋳型を供給するた
めに充分であると考えられる。
【００５８】別の５つのプラスミドは１０ｋｂよりも大
きく、かつｃＩ８５７遺伝子を維持している。それらは
欠失の終点が挿入断片まで達していない欠失体である。
また他の４２個のプラスミドは規定のサイズより短く、
これはこれらのクローンでは挿入断片全体が欠失してい
ることを意味する。そのうち４０個はｃＩ８５７遺伝子
を失い、６．６ｋｂよりも小さく、一方２つの比較的大
きな（７．０ｋｂと７．２ｋｂ）プラスミドはｃＩ８５
７遺伝子を維持しており、これはそれらの終点が挿入断
片の３’末端とｃＩ８５７遺伝子の間にあることを示す
（第２図）。
きく、かつｃＩ８５７遺伝子を維持している。それらは
欠失の終点が挿入断片まで達していない欠失体である。
また他の４２個のプラスミドは規定のサイズより短く、
これはこれらのクローンでは挿入断片全体が欠失してい
ることを意味する。そのうち４０個はｃＩ８５７遺伝子
を失い、６．６ｋｂよりも小さく、一方２つの比較的大
きな（７．０ｋｂと７．２ｋｂ）プラスミドはｃＩ８５
７遺伝子を維持しており、これはそれらの終点が挿入断
片の３’末端とｃＩ８５７遺伝子の間にあることを示す
（第２図）。
【００５９】本実施例においてλ感受性クローン、即ち
挿入断片全体およびｃＩ８５７遺伝子が欠失しているプ
ラスミドは、配列決定には有用でない。しかしながら、
図２（中段）から、欠失終点は挿入断片の内部だけでは
なく両端に、即ちＸｈｏＩ部位とｏｒｉ（複製開始点）
の間の８．５ｋｂ領域ほぼ全体に渡って、ほぼ一線かつ
ランダムに分布することがわかる。このデータは，より
大きな挿入断片についても配列決定に適した同様な欠失
体が得られることを示している。これは、Ｔｎ３が標的
部位特異性または領域特異性を殆ど示さないというｉｎ
ｖｉｖｏのデータとも一致する。
挿入断片全体およびｃＩ８５７遺伝子が欠失しているプ
ラスミドは、配列決定には有用でない。しかしながら、
図２（中段）から、欠失終点は挿入断片の内部だけでは
なく両端に、即ちＸｈｏＩ部位とｏｒｉ（複製開始点）
の間の８．５ｋｂ領域ほぼ全体に渡って、ほぼ一線かつ
ランダムに分布することがわかる。このデータは，より
大きな挿入断片についても配列決定に適した同様な欠失
体が得られることを示している。これは、Ｔｎ３が標的
部位特異性または領域特異性を殆ど示さないというｉｎ
ｖｉｖｏのデータとも一致する。
【００６０】実施例２ 挿入ＤＮＡ断片として大腸菌のｃｒｐ−遺伝子に由来す
る１.２ｋｂのＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片を用い、実施例
１と同様に実験を行った。本実施例においては、Ｘｈｏ
ＩでなくＫｐｎＩ制限酵素で反応産物を消化して、形質
転換に用いた。ＫｐｎＩは、反応産物を挿入ＤＮＡの
「左」端で切断する。
る１.２ｋｂのＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片を用い、実施例
１と同様に実験を行った。本実施例においては、Ｘｈｏ
ＩでなくＫｐｎＩ制限酵素で反応産物を消化して、形質
転換に用いた。ＫｐｎＩは、反応産物を挿入ＤＮＡの
「左」端で切断する。
【００６１】電気泳動とｃＩ遺伝子、Ｎ遺伝子活性試験
をまとめた結果を第２図下段に示した。アンピシリンを
含む４２℃に置いた寒天プレートから、０.２８μｇの
ＤＮＡ当り５つのλ耐性クローンが得られた。それらの
うちの一つは、そのサイズとＫｐｎＩ切断によりＴｎ３
末端からの欠失を含まないことが示された。Ｔｎ３の
「右」端に始まり挿入断片内で終る欠失を含む、各々
８．９ｋｂ、８．７ｋｂ、８．６ｋｂ及び８．４ｋｂの
４つのプラスミドが得られた。この挿入断片の全塩基配
列を決定するためには、挿入断片を両端からシーケンス
出来るもとのプラスミドを含め、３つの欠失クローンで
充分である。
をまとめた結果を第２図下段に示した。アンピシリンを
含む４２℃に置いた寒天プレートから、０.２８μｇの
ＤＮＡ当り５つのλ耐性クローンが得られた。それらの
うちの一つは、そのサイズとＫｐｎＩ切断によりＴｎ３
末端からの欠失を含まないことが示された。Ｔｎ３の
「右」端に始まり挿入断片内で終る欠失を含む、各々
８．９ｋｂ、８．７ｋｂ、８．６ｋｂ及び８．４ｋｂの
４つのプラスミドが得られた。この挿入断片の全塩基配
列を決定するためには、挿入断片を両端からシーケンス
出来るもとのプラスミドを含め、３つの欠失クローンで
充分である。
【００６２】
【効果】実施例１および２の結果から明らかなように、
本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ欠失作製方法により、所期の
挿入ＤＮＡ断片をランダムに欠失させることができた。
これにより単一のステップで配列決定出来ない大きなＤ
ＮＡを効果的に配列決定するために十分な欠失体を得る
ことができた。さらに、図２の中段に示されたように、
本発明の方法は挿入ＤＮＡ断片がより長い場合にも有効
である。
本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ欠失作製方法により、所期の
挿入ＤＮＡ断片をランダムに欠失させることができた。
これにより単一のステップで配列決定出来ない大きなＤ
ＮＡを効果的に配列決定するために十分な欠失体を得る
ことができた。さらに、図２の中段に示されたように、
本発明の方法は挿入ＤＮＡ断片がより長い場合にも有効
である。
【図１】図１は、ｐＭＭ２５１の構造の模式図を示す。
【図２】図２は、△Ｔｎ３の「右」端から始まる欠失終
点の分布を示す。
点の分布を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 内田 浩二 滋賀県彦根市外町186−１ バサージュ彦 根
Claims (11)
- 【請求項１】１）入れ子型欠失を作製しようとするＤＮ
Ａ断片およびトランスポゾンの末端繰り返し構造を含む
ベクターを用意し； ２）前記ベクターを、トランスポゼースおよびＤＮＡ複
製系と共にｉｎ ｖｉｔｒｏでインキュベートし； ３）反応産物として、入れ子型欠失を生じた上記ＤＮＡ
断片を有する上記ベクターを生じさせ；そして所望によ
り ４）上記反応産物を用いて宿主細胞を形質転換して増殖
させ ５）増殖した宿主細胞から入れ子型欠失を生じた上記Ｄ
ＮＡ断片を有するベクターを回収することを含む、ｉｎ
ｖｉｔｒｏで所望のＤＮＡに入れ子型欠失を作製する
方法。 - 【請求項２】トランスポゾンの末端繰り返し構造が、Ｔ
ｎ３トランスポゾンまたはＴｎ１０００トランスポゾン
に由来する、請求項１に記載のＤＮＡ入れ子型欠失の作
製方法。 - 【請求項３】トランスポゼース活性成分が、トランスポ
ゼースを産生する発現ベクターを保有する宿主細胞から
調製されたものである、請求項１または２に記載のＤＮ
Ａ入れ子型欠失の作製方法。 - 【請求項４】トランスポゼース活性成分が、精製トラン
スポゼースである、請求項１ないし３のいずれか１項に
記載のＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法。 - 【請求項５】工程２）のインキュベーション後、トラン
スポゾンの末端繰り返し構造およびＤＮＡ挿入断片を含
むベクターを、トランポゾンの末端繰り返し構造と挿入
ＤＮＡ断片の間だけで切断する制限酵素を用い、反応産
物を消化することをさらに含む、請求項１ないし４のい
ずれか１項に記載のＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法。 - 【請求項６】ベクターが欠失検出ための指標となる遺伝
子をさらに含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記
載のＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法。 - 【請求項７】指標となる遺伝子が、λファージのｋｉｌ
遺伝子とｃＩ８５７遺伝子の組み合わせである、請求項
６に記載のＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法。 - 【請求項８】工程２）のインキュベートを、３０−３７
℃で、６０−１２０分間行う、請求項１ないし７のいず
れか１項に記載のＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法。 - 【請求項９】工程２）の反応溶液が、０.００２μｇ／
μｌ−０.０４μｇ／μｌの前記ベクターを含む、請求
項１ないし８のいずれか１項に記載のＤＮＡ入れ子型欠
失の作製方法。 - 【請求項１０】工程２）の反応溶液が、ＤＮＡ合成に必
要なデオキシリボ核酸、エネルギー供与体をさらに含
む、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のＤＮＡ入
れ子型欠失の作製方法。 - 【請求項１１】 適切な容器に保存されたトランスポゼ
ース活性成分およびＤＮＡ複製系を含み、さらに必要に
応じてＤＮＡ合成に必要なデオキシリボ核酸、トランス
ポゾンの末端繰り返し構造を含むベクター、緩衝液を各
々別個のまたは同一の容器中に含む、請求項１ないし１
０に記載したＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法に用いるた
めのキット。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03050797A JP3910248B2 (ja) | 1997-02-14 | 1997-02-14 | トランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法 |
| US08/998,712 US6265159B1 (en) | 1997-02-14 | 1997-12-29 | Method for producing DNA nested deletions by an in vitro reaction using transposase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03050797A JP3910248B2 (ja) | 1997-02-14 | 1997-02-14 | トランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10225290A true JPH10225290A (ja) | 1998-08-25 |
| JP3910248B2 JP3910248B2 (ja) | 2007-04-25 |
Family
ID=12305738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03050797A Expired - Fee Related JP3910248B2 (ja) | 1997-02-14 | 1997-02-14 | トランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6265159B1 (ja) |
| JP (1) | JP3910248B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014068650A (ja) * | 2012-10-01 | 2014-04-21 | Agilent Technologies Inc | Ｄｎａ断片化および標的化のための固定化されたトランスポザーゼ複合体 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7727744B2 (en) * | 2004-03-30 | 2010-06-01 | Epicentre Technologies Corporation | Methods for obtaining directionally truncated polypeptides |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5645991A (en) * | 1993-05-04 | 1997-07-08 | Univ. Of Connecticut | Transposon-containing DNA cloning vector and uses thereof |
| US5677170A (en) * | 1994-03-02 | 1997-10-14 | The Johns Hopkins University | In vitro transposition of artificial transposons |
-
1997
- 1997-02-14 JP JP03050797A patent/JP3910248B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-12-29 US US08/998,712 patent/US6265159B1/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014068650A (ja) * | 2012-10-01 | 2014-04-21 | Agilent Technologies Inc | Ｄｎａ断片化および標的化のための固定化されたトランスポザーゼ複合体 |
| US10100348B2 (en) | 2012-10-01 | 2018-10-16 | Agilent Technologies, Inc. | Immobilized transposase complexes for DNA fragmentation and tagging |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6265159B1 (en) | 2001-07-24 |
| JP3910248B2 (ja) | 2007-04-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2497949C2 (ru) | Векторные плазмиды для клонирования модулей днк и способы их применения | |
| JP4264703B2 (ja) | 合成遺伝子、およびＣｐＧを欠く細菌プラスミド | |
| US7723103B2 (en) | Vectors, kits and methods for cloning DNA | |
| JP2004089200A (ja) | 一定の細胞系又は微生物の内因性遺伝子の発現特徴の変性のための方法 | |
| JPH08510388A (ja) | 人工トランスポゾンのｉｎｖｉｔｒｏにおける転位 | |
| Merritt et al. | Transgenic solutions for the germline | |
| JP2000515011A (ja) | 形質転換関連組換えクローニング | |
| CN114667344A (zh) | 具有增强的dna产生的经修饰的细菌逆转录元件 | |
| CN114981409A (zh) | 用于基因组整合的方法和组合物 | |
| Aagaard et al. | Intercellular mobility and homing of an archaeal rDNA intron confers a selective advantage over intron-cells of Sulfolobus acidocaldarius. | |
| JP2023542976A (ja) | カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法 | |
| JP2003502015A (ja) | 生物中における遺伝子ノックアウトライブラリの迅速かつ大量産生のための方法類および素材類 | |
| US20230141052A1 (en) | Methods and compositions for genomic integration | |
| JP2006526985A (ja) | ｄｓＲＮＡを大量産生するための方法およびキット | |
| JP3851059B2 (ja) | 遺伝子の機能の制御方法 | |
| JPH10225290A (ja) | トランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法 | |
| BR112020005166A2 (pt) | métodos para integração genômica para células hospedeiras de kluyveromyces | |
| JP2023539237A (ja) | カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法 | |
| WO2001098453A2 (fr) | Vecteurs d'expression comprenant un fragment modifie de l'operon tryptophane | |
| WO2005003389A2 (en) | In vitro amplification of dna | |
| JP4049364B2 (ja) | 多コピー型・ゲノム挿入型の選択両用ベクター | |
| Kim et al. | Directed evolution and identification of control regions of ColE1 plasmid replication origins using only nucleotide deletions | |
| EP1196613A1 (en) | Novel vectors for improving cloning and expression in low copy number plasmids | |
| Chetverin | Recombination in Bacteriophage Qβ and Its Satellite RNAs: Thein Vivoandin VitroStudies | |
| Ladendorf et al. | Heterologous transposition in Ustilago maydis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040113 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050210 |
|
| A072 | Dismissal of procedure [no reply to invitation to correct request for examination] |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A072 Effective date: 20050517 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060602 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060801 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060825 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061024 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20061226 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070124 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |