JP3851059B2 - 遺伝子の機能の制御方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
関連出願
本出願は、オオシマ ( Ohshima )等によって１９９３年３月１日に出願された「一本鎖ステム−ループＤＮＡの合成方法、その生成物、ならびにその使用」という名称の係属中の米国特許出願第０８／０２４６７６号の一部継続出願であり、この米国特許出願第０８／０２４６７６号はさらに、「一本鎖ステム−ループＤＮＡの合成方法、その生成物、ならびにその使用」という名称の係属中の米国特許出願第０７／７５３１１１号の一部継続出願である。本明細書は、これらの２件の特許出願（親出願）の双方の一言一句を、それらの各件が以下に全編にわたって再度記載されているかのごとく、明確に包含するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は組換え体ＤＮＡの分野に関する。さらに詳しくは、本発明はステム−ループ配列（ｓｓ−ｓｌＤＮＡ）を有する新規で有用な一重鎖ＤＮＡの合成方法に関する。本発明はインビトロ及びインビボ合成方法に関する。さらに本発明はこれらのｓｓ−ｓｌＤＮＡを製造する複製ビークル ( replicating vehicle )に関する。さらに、本発明はこれらの新規な構造物に関し、これらの新規な構造物の使用を開示する。さらに、標的タンパク質をコードする遺伝子を用いた、または用いないｓｓ−ｓｌＤＮＡ増幅方法をも開示する。さらにはまたｓｓ−ｓｌＤＮＡを用いた遺伝子制御方法を開示する。
【０００３】
背 景
逆転写酵素によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと逆転写されるRNA 中間体を介して、ゲノムの一部の重複が生ずることが判明している。この点については、ワイナー（Weiner）等のアニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー (Ann. Rev. Biochem. )５５、６３１（１９８６）を参照されたい。結果として遺伝情報が逆流することは真核ゲノムの進化の多様化に重要な役割を果すと考えられる。細菌由来の逆転写酵素が最近発見されたことを考慮すると、同様な機構が原核生物におけるゲノム進化の原因であるとみなされるのも非常にもっともなことだと思われる。この点についてはイノウエ（Inouye）等のＴＩＢＳ、１６、１８（１９９１ａ）とイノウエ等による、アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオロジー（Ann. Rev. Microbiol.）４５、１６３（１９９１ｂ）を参照されたい。逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成の結果生ずる遺伝子重複は進化中のゲノムの多様化に重要な役割を果していると考えられる。
【０００４】
本発明はゲノム進化に関連する基礎研究に伴って生じたものである。プラスミドＤＮＡの複製に特有のｓｓ−ｓｌＤＮＡの合成が実証された。ｓｌＤＮＡの形成は原核ならびに真核生物の染色体ＤＮＡ複製時に広く行われる。ＩＲ構造を伴う染色体遺伝子要素は、ＩＲ構造の安定性とポリメラーゼの性質によっては常にｓｌＤＮＡへと複製しやすいと考えられる。
【０００５】
反復遺伝子外パリンドローム塩基配列に対してはＲＥＰとして知られ、パリンドローム単位に対してはＰＵとして知られる多くの逆方向反復（ＩＲ）構造が存在する（大腸菌（E. coli.）中には約１０００コピー）ことが判明している〔ヒギンス（Higgins ）等のネイチャー（Nature）２９８、７６０（１９８２）、ギルソン（ Gilson ）等、エンボ・ジャーナル（EMBO. J.）３、１４１７（１９８４）及びギルソン等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl. Acids. Res. )１９、１３７５（１９９１）〕。これらの構造はＤＮＡポリメラーゼＩを含む特定の細胞成分と会合して、染色体組織に重要な役割を果すと考えられる〔ギルソン等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ１８、３９４１（１９９０）とギルソン等、エンボ・ジャーナル３、１４１７（１９８４）参照〕。ヒトゲノムの約６％がＡｌｕと呼ばれる要素によって占められ、Ａｌｕの転写生成物は実質的な第二構造を含むことが判明している〔シメット（Simmett ）等のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２６６、８６７５（１９９１）参照〕。
【０００６】
ｓｌＤＮＡ合成はｃＤＮＡ合成とは対照的にRNA 中間体も逆転写酵素活性も必要としないので、ｓｌＤＮＡはｃＤＮＡよりも頻繁に形成される。従って、ｓｌＤＮＡはゲノム内に分散または再配置された遺伝子要素を重複させることによって、原核生物を真核生物の両方のゲノム進化においてｃＤＮＡと同様な、重要な役割を果すと考えられる。
【０００７】
親出願は、双方とも、新規な一本鎖ＤＮＡ構造物であるｓｌＤＮＡのインビボならびにインビトロでの合成方法、ｓｌＤＮＡ構造物、ならびに他の各種の遺伝的構造物に関するものである。これらの親出願は、一本鎖部分にアンチ遺伝子を保持しているｓｌＤＮＡにも関するものであり、このアンチジーンは、標的ｍＲＮＡと結合してｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害したり、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡと結合して三重らせんを形成し、標的ＤＮＡの発現を阻害したりするアンチセンスとなることができる。
【０００８】
本発明は、一本鎖ＤＮＡ分子、特に、ｓｌＤＮＡ分子をこれまで達成しえなかった高収率で過剰発現させることに関わるものであり、こうした製造を行う方法、ならびにこうした目的を達成するための遺伝的構築物に関するものである。
【０００９】
（上述の）ｓｌＤＮＡ構造物は、一本鎖のループと、二重となった一本鎖の相補的な塩基からなる尾部から構成されている。この尾部は、単一の５′末端と、単一の３′末端で終端しており、一方の末端がもう一方の末端からさらに延びて一本鎖のオーバーハング部となっていてもよい。
【００１０】
一本鎖の分子は不安定なことで有名であるという事実からしても、本発明で一本鎖の構造物がこのような高収率で生成しえたことは予期せざることであった。
【００１１】
本発明の概要
本発明によって、基本的な発見がなされた。ゲノムの一部はゲノムから直接複製されることが判明した。判明したこの遺伝子複製はＲＮＡ中間体も逆転写酵素も必要とせず、ＤＮＡ複製中に生ずる。
【００１２】
簡単に説明すると、本発明は新規で有用な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子の合成方法（又はプロセス）を提供する。この方法は一重鎖構造の合成を開始するために、ＤＮＡ逆方向反復（ＩＲ）と必要な成分との使用を含む。本発明はまた、ＤＮＡ逆方向反復を含む必要な成分からのこのようなｓｓＤＮＡの合成系をも提供する。本発明はさらに、新規なｓｓＤＮＡ分子の合成のための必要な成分の全てを含む適切な複製ビークルを提供する。本発明はまた特有の構造を形成する新規で有用なｓｓＤＮＡ分子をも提供する。この構造は相補的塩基の二重鎖ＤＮＡからなるステムを含み、ステムはその端部の一つにおいて２個の末端、それぞれ３′と５′末端を有し、他方の端部ではループ形成ｓｓＤＮＡを有する。
【００１３】
本発明はインビトロまたはインビボでの方法及び系の実施を含む。
【００１４】
本発明はまた改良された又は新規な生物学的性質を有するタンパク質を形成する目的で遺伝子にランダムな突然変異を起こさせる方法を含めて、新しい分子の種々な使用を開示する。他の重要な考えられる使用法は、本発明ｓｓＤＮＡ分子をＤＮＡに加えて、安定性の高い三重鎖ＤＮＡを形成することである。また本発明ｓｓＤＮＡ分子のアンチセンスＤＮＡとしての使用である。他の使用法は単一プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用である。
【００１５】
本発明とその幾つかの実施態様を下記でさらに詳述する。
【００１６】
本発明の方法によるとｓｓＤＮＡ内のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡのステム部分を含む構造を有するｓｓＤＮＡ分子が製造される。このステムはその端部の一つにおいてｓｓＤＮＡ分子の５′と３′末端を形成し、他端部において２本のステム一重鎖を結合する非アニール塩基の一重鎖からなるループを形成する。特定の実施態様では、３′末端を端部に有する鎖は他方の鎖よりも長い。ｓｌＤＮＡはタンパク質をコードしうるＤＮＡセグメント、特に遺伝子を含みうる。遺伝子はループと末端との間に配置される。遺伝子は突然変異を有する遺伝子でありうる。
【００１７】
ｓｌＤＮＡ合成に対して仮定される機構を図６のＡと図６のＢに示す。この合成は概略的に下記の過程を含むと考えられる：ＤＮＡの合成は複製開始部位にて始まり、第１鎖（または“特定”もしくは“不特定”鎖）の複製は２本鎖ＤＮＡの鎖の一方を鋳型として進行する（染色体ＤＮＡの複製と同じ機構によって）〔トミザワ ( Tomizawa ) 等、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、７４、１８６５（１９７７）参照〕、そしてプラスミドを用いる場合には、ＩＲ構造を通しての進行は全プラスミドの複製を生ずる。しかし、以下で詳述するように、第１鎖合成が中断するまたはＩＲ内で終了した場合に、第１鎖の一部はループ構造を形成する（図６、工程２〜３）。このループは連続ＤＮＡ合成のプライミング部位として機能する短い二重鎖部分を形成する。ＤＮＡ鎖伸長は新たに形成された３′端部から再開し、テンプレートとして発生期の第１鎖を用いて第２鎖（または“他方の”鎖）を形成する。代替えの（または同時発生の）考えられる合成過程は以下で説明する。このようにして、テンプレート切換えによってＤＮＡ合成方向は逆になり、ＤＮＡフラグメントを二重にする（図６、工程１〜４）。新しく合成されたｓｌＤＮＡ分子は親テンプレート鎖から解離され、親テンプレート鎖は他の複製ラウンドを受けて他のｓｌＤＮＡを形成する。ｓｌＤＮＡを必要に応じて単離して精製する。
【００１８】
本発明の他の実施態様では、ＤＮＡ自己複製ビークル（self - replicating vehicle）、例えば逆方向反復（ＩＲ）構造を含むＤＮＡフラグメントを挿入されたプラスミドを提供する。このＤＮＡフラグメントはｓｓＤＮＡ合成のテンプレートとして、及び適当なプライミング部位、例えば大腸菌におけるＣｏｌＥ１の複製始点として働く。ＩＲはＯＲの下流に存在する。自己複製ビークルは適当なホスト（例えば大腸菌）中で複製される。ホストは少なくとも１種のポリメラーゼを含んでテンプレートからｓｓＤＮＡを合成する。この特定の実施態様では、２種のポリメラーゼ、ＯＲからＩＲまでのｓｓＤＮＡ部分、第１鎖の伸長に寄与する第１ＤＮＡポリメラーゼと、ｓｓＤＮＡ鎖の残部もしくは第２鎖を合成する第２ＤＮＡポリメラーゼが存在すると推定される。第１鎖の合成が終了すると、相補的塩基がアニールされて一重鎖非アニールループを形成する。その後に第２鎖の合成が行われる。二重鎖ＤＮＡステムと反対端部の一重鎖ループ構造とからなる、新しいＤＮＡ構造が合成される。この新しいＤＮＡ構造に対して“ステム−ループ”または“ｓｌＤＮＡ”なる名称が設けられている。
【００１９】
他の特定の実施態様はプロモーター、特にｌａｃプロモーター−オペレーターが欠如した複製ビークルを提供する。それでもなお、以下で詳述するように、提案した合成モデルを支持してｓｌＤＮＡが製造された。
【００２０】
プライミング部位とＩＲとの間のタンパク質をコードしうる特定のＤＮＡ配列を含むようにプラスミドを構成することができ、合成されたｓｌＤＮＡはＤＮＡ塩基配列またはその突然変異を含むと考えられる。
【００２１】
また、本発明はｓｌＤＮＡを用いた遺伝子制御方法を提供する。前記方法はＤＮＡポリメラーゼ合成に必要な要素を含有し、そして
（ａ）そのストランドの片方が、プライミング部位および前記プライミング部位の下流に逆方向反復配列（ＩＲ）を含有する鋳型ＤＮＡである二重鎖ＤＮＡであって、前記鋳型ＤＮＡ中に、その転写物が遺伝子の機能を調節するＤＮＡ配列が挿入されている二重鎖ＤＮＡ、
（ｂ）前記鋳型にＤＮＡの重合を開始させるプライマー、および
（ｃ）前記鋳型からｓｌＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼ、
からなる系において、
ステムが、ＩＲを含有し、ｓｓＤＮＡ内のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡで構成され、そして一方の端部でｓｓＤＮＡ分子の５′と３′の末端を形成し他方の端部で前記二重鎖ＤＮＡの反対側の両末端を結合するＤＮＡの一本鎖ループを形成する構造内に、遺伝子の機能を制御するＤＮＡ配列を含有する新規な安定した人工のｓｌＤＮＡを用い、そして
（１）前記鋳型にＤＮＡの重合を開始させ、
（２）前記ＤＮＡの二本鎖のうち一方を鋳型として用いてプライマーからｓｓＤＮＡを合成し、ＤＮＡ合成をＩＲ配列中に続け次いで合成をＩＲ配列内で停止し、
（３）ＩＲ配列において新しく合成されたストランド内の相補的塩基をアニールして、非二重鎖領域のループおよびそのループのネック部分に二重鎖領域を形成させ、その二重鎖領域がＤＮＡの合成を続けるためのプライミング部位として機能し、
（４）前記ＤＮＡの新しく合成されたストランドおよび／または他方のストランドを鋳型として用いてＤＮＡ合成を再開し、次いで
（５）ｓｌＤＮＡを生成する、
ステップからなることを特徴とする。
【００２２】
本発明のｓｌＤＮＡは自己複製ビークルによって合成される必要はなく、ＩＲと、ｓｓＤＮＡ合成に必要な要素とを含む、線状もしくは非線状のＤＮＡセグメントから構成される適当なインビトロ系で合成されることができる。このような系を以下で説明する。
【００２３】
【実施例】
下記実施例は説明のためのものであり、本発明の如何なる限定もを意図しないものである。これらの実施例では、全ての％は固体では重量％であり、液体では容量％であり、全ての温度は、他の注釈しないかぎり、摂氏度によるものである。なお、下記実施例において用いられるプラスミドｐＵＣＫ１０６はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受け入れ番号No.６８６７９として寄託されており、プラスミドｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯはＡＴＣＣによって受け入れ番号No.６８６８０として寄託されている。
【００２４】
便利さと簡潔さのために、実施例は図面に関連し、図面の詳細な説明を提供する。
【００２５】
実施例 １
図１はｐＵＣＫ１０６（円形マップ）、以下に示すように製造した特定のプラスミドを説明する。円形マップ中の白抜きバー（open bar ）はカナマイシン耐性遺伝子（Ｔｎ５から）を表す。上部右側に示す直線白抜きバーはＸｂａＩ部位に挿入した２１５−ｂｐＤＮＡフラグメントを表し、これは３５−ｂｐ逆方向反復（ＩＲ）塩基配列を含有している。中実矢印（solid arrow )はＩＲ構造を示す。中実円設定は複製の始点（Ori ）である。長い白抜き矢印ＯＲからのＤＮＡ複製の方向を示す。小さい白抜き矢印はｌａｃプロモーター−オペレーター（ｌａｃＰＯ）の位置を示す。
【００２６】
図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａＩ部位に挿入された、配列表の配列番号１及び配列番号２でそれぞれ表されるＤＮＡより構成される２１５−ｂｐＤＮＡフラグメントの塩基配列を示す。このプラスミドはここではｐＵＣＫ１０６と名づける。白抜き矢印はＩＲ塩基配列を示す。ＨｉｎｄIII （ＡＡＧＣＴＴ）部位はＩＲの中心を示す。
【００２７】
ＩＲ中の不適正位置はスペース内に挿入された不適正塩基ＣとＴを含む矢印内の２個の白抜きスペースによって示す。
【００２８】
上記ＤＮＡフラグメント（ＩＲを含む）は図２に示された配列を有する。
【００２９】
実施例 ２
この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成とその特徴とを説明する。
【００３０】
（Ａ） 大腸菌ＣＬ８３をｐＵＣＫ１９，ｐＵＣＫ１０６のいずれかとｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯとによって形質転換し、プラスミドＤＮＡ画分を形成した。ＤＮＡ標本（リボヌクレアーゼＡ処理後）を電気泳動のために５％アクリルアミドゲルに塗布した。ゲルを臭化エチジウムによって染色した。図３のＡにおいて、レーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体を示す。レーン２はｐＵＣＫ１９を収容する細胞からのＤＮＡ標本；レーン３はｐＵＣＫ１０６；レーン４はｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯを示す。ｐＵＣＫ１９はｐＵＣ１９のカナマイシン変異体である。
【００３１】
（Ｂ） ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、次に種々の制限酵素消化を行った。消化体をポリアクリルアミド（５％）ゲル電気泳動によって分析し、ゲルを臭化エチジウムによって染色した。図３のＢにおいて、レーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体；レーン２は消化されないｓｌＤＮＡ；レーン３はＸｂａＩによって消化されたｓｌＤＮＡ；レーン４はＨｉｎｄIII によって消化されたｓｌＤＮＡ；レーン５はＰｖｕIIによって消化されたｓｌＤＮＡを示す。
【００３２】
（Ｃ） ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの熱変性。精製ｓｌＤＮＡ（上記のような）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。このｓｌＤＮＡ溶液を沸とう水浴中で３分間インキュベートし、氷浴中で急冷した。サンプルをＡに述べたように分析した。図３のＣにおいて、レーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体；レーン２は熱処理なしのｓｌＤＮＡ；レーン３は熱変性後に急冷したｓｌＤＮＡを示す。
【００３３】
このｓｌＤＮＡは、塩基５３個のループ、塩基約４４０個のステム、ならびに塩基１５〜１８個のオーバーハングした３′尾部を有している。
【００３４】
実施例 ３
この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのダイマー形成を説明する。
【００３５】
（Ａ） 実施例２について述べたようなｐＵＣＫ１０６からの精製ｓｌＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 中に溶解した。このｓｌＤＮＡ溶液を沸とう水浴中で３分間インキュベートしてから、徐々に冷却する。再結合 ( renatured )ＤＮＡをＸｂａＩによって消化させ、このようにして生じたＤＮＡフラグメントをそれらの末端において〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって標識した。これらの生成物を５％ポリアクリルアミドゲルに塗布した。電気泳動後に、ゲルを乾燥させ、このゲルにオートラジオグラフィーを実施した。
【００３６】
図４のＡにおいて、レーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体；レーン２はサイズマーカーとしてのλＤＮＡのＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII 消化体；レーン３は処理なしのｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡ；レーン４は非処理ｓｌＤＮＡのＸｂａＩ消化体；レーン５は熱変性後に徐冷したｓｌＤＮＡ；レーン６はレーン５からのｓｌＤＮＡのＸｂａＩ消化体を示す。帯を右手側において“ａ”から“ｅ”までマークを付した。
【００３７】
（Ｂ） 図４のＡ中のフラグメント“ｄ”の特性化（図４のＢ）。フラグメント“ｄ”はゲルから精製した。レーン３は精製フラグメント“ｄ”のＨｉｎｄIII 消化体；レーン４では精製フラグメント“ｄ”は図３に関して述べたように熱変性し、急冷した。
【００３８】
（Ｃ） （Ａ）と（Ｂ）に示した“ａ”〜“ｂ”帯の概略図（図４のＣ）。ＸとＨはそれぞれＸｂａＩとＨｉｎｄIII を示す。ＸｂａＩ部位に非常に近接したバンド“ａ”中に２個の他のＨｉｎｄIII 部位があり、これはバンド“ｃ”中にある。これらのＨｉｎｄIII 部位は図示せず。
【００３９】
実施例 ４
この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのＤＮＡ塩基配列の決定を説明する。
【００４０】
（Ａ） ｓｌＤＮＡの５′端部のＤＮＡ塩基配列の決定。単離、精製したｓｌＤＮＡ０．２μｇを鎖停止方法 (chain termination method )による塩基配列決定に用いた。始点（図５のＢ左側参照）から下流の配列９６−ｂｐに相当する配列表の配列番号３で表されるプライマー“ａ”（５′ＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧ３′）をプライマーとして用いた。
【００４１】
（Ｂ） ｓｌＤＮＡのループ部分の５′端部塩基配列の決定。ｓｌＤＮＡ０．５μｇをＳａｃIIによって消化させ、このようにして生じたＤＮＡフラグメントを５′端部において〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって標識した。約４０−ｂｐ移動したＤＮＡフラグメントを単離し、マキサム−ギルバート（Maxam − Gilbert）法によって塩基配列を決定した。
【００４２】
（Ｃ） ｓｌＤＮＡのループ部分の３′端部塩基配列の決定。ＳａｃII消化体ｓｌＤＮＡを末端デオキシヌクレオチジル転移酵素を用いて３′端部において〔γ−３２Ｐ〕ジデオキシＡＴＰによって標識した。ループ部分を含むＤＮＡフラグメントを単離し、マキサム−ギルバート法によって塩基配列を決定した。
【００４３】
（Ｄ） ｓｌＤＮＡの３′端部のＤＮＡ塩基配列。ｓｌＤＮＡをＡｆｌIII によって消化させた（図５のＤ参照）、５′端部を〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって標識した。標識生成物を塩基配列決定用ゲルによって分離した。７６塩基移動した一重鎖ＤＮＡを単離し、マキサム−ギルバート法によって塩基配列決定した。図５のＣを参照すると、数字はｐＵＣＫ１９の始点からの残基数を表す。
【００４４】
（Ｅ） ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの構造。このｓｌＤＮＡは１１３７〜１１３９塩基の一重鎖ＤＮＡからなる。ｓｌＤＮＡの５′端部は不均一であるように見える；一部は＋１から開始し、他の部分は−１，＋２，＋３から開始する。＋１位置はＣｏｌＥｌ ＤＮＡ複製の始点に相当する。従って、種々のｓｌＤＮＡは異なる長さの５′末端鎖を有する。３′端部では１６塩基の配列が５′末端の＋１位置を越えて伸長する。このループはＨｉｎｄIII 部位（ＡＡＧＣＴＴ）が配置されるように設定されたＩＲ構造の中心の配列に相当する４塩基配列（ＡＧＣＴ）によって形成されると考えられる。ｐＵＣＫ１０６中のＩＲ構造中の不適正に相当する塩基対はＣ・Ｔ（ｐＵＣＫ １０６）からＣ・Ｇ（ｓｌＤＮＡ中）に変えられＳａｃII部位とＰｓｔＩ部位との間に示される。図５のＡのＤＮＡ塩基配列決定に用いられるプライマー“ａ”の位置は矢印によって示す。
【００４５】
このｓｌＤＮＡは、３００〜４０００個以上の塩基からなるステムを有するよう構築することができる。オーバーハング部は、たとえば、塩基１０〜８０個程度の任意所望の長さ、たとえば塩基約５０個の長さに調整することができる。この部分の長さは、安定性が損なわれることのないよう選ぶ必要がある。ｓｌＤＮＡは、所望の長さのループを有するよう構築することができる。
【００４６】
ｓｌＤＮＡの分離と精製は、モレキュラー クローニング；ア ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning；A Laboratory Manual ）、サムブルック（Sambrook）等、第２版（セクション１．１２１〜１．４０）（“サムブルック”）に述べられている方法に従って標準方法によって実施した。
【００４７】
実施例 ５
この実施例は二つの可能なｓｌＤＮＡ合成方法を説明する（図６参照）。ＣｏｌＥｌ ＤＮＡ複製の始点を中心とする二重鎖ＤＮＡを上部に示す。斜線入り円は始点からＤＮＡ複製を開始するＤＮＡ複製複合体を表す。ＤＮＡ鎖上の白抜き矢印はＤＮＡ塩基配列中の３５−ｂｐ逆方向反復（ＩＲ）構造（図２参照）の位置を示す。ＩＲ構造中の不適正塩基対（Ｃ・Ｔ）も矢印中に示す。
【００４８】
工程１において、ＤＮＡ複製フォークは始点（＋１位置）から斜線入り円によって示される位置にまで進行する。新たに合成された第１鎖が始点（中実円）から複製フォークまで伸長するのが示される。ＤＮＡ複製複合体は中実矢印によって示されるＩＲ構造中の不適正Ｔ残基の直前に達する。工程２では、この新たに合成された第１鎖の３′末端がＤＮＡ複製複合体から剥離して、２次構造がＩＲ構造によって形成される。工程３では、ＤＮＡ合成がこの新たに合成された第１鎖（モデルＡ）または上部の親鎖（モデルＢ）をテンプレートとして用いてステーム−ループ構造の３′末端から再開する。工程４では、ＤＮＡ合成が始点を越えて１６塩基だけ進行する。
【００４９】
モデルＡでは、ＤＮＡの５′末端に結合して残留するプライマーＲＮＡがテンプレートＲＮＡとして用いられる。続いて、ＲＮＡが除去されて、ｓｌＤＮＡが形成される。モデルＢでは、ＤＮＡ合成が第２鎖ＤＮＡ合成の停止のために知られた機構と同様な機構によってｔｅｒＨ部位において停止する。
【００５０】
モデルＡとＢが合成を説明することができ、合成が両ルートによって、少なくとも一部の時間では、同時に進行しうることが考えられる。従って、第１鎖のテンプレートであった鎖以外の第２鎖に対しては適当なテンプレートが用いられる。
【００５１】
実施例 ６
ｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯの構成
ｌａｃプロモーター−オペレーターを含む１９９−ｂｐ ＰｖｕII−ＨｉｎｃIIフラグメントがｐＵＣＫ１０６（図１参照）から欠失すると、結果として生ずるｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯは図３のＡ、レーン４の位置（ｂ）に示すような、ｐＵＣＫ１０６からｓｌＤＮＡよりも迅速に移動する新しいｓｌＤＮＡを形成した。この新しいｓｌＤＮＡのサイズは３６０−ｂｐ長さであり、ｐＵＣＫ１０６ｓｌＤＮＡよりも、ｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯ中の欠失サイズに殆ど等しい長さだけ短い。
【００５２】
図３のＡでは、レーン３はｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯを収容する細胞からのＤＮＡ形成のｓｌＤＮＡを示す。
【００５３】
この実験は上記で提案したｓｌＤＮＡ合成モデルを支持し、ｌａｃプロモーター−オペレーターがｓｌＤＮＡ合成にとって本質的でないことをも実証する。この解釈はｌａｃ誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加がｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成に影響しないという事実によってさらに支持された。しかし、ｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯからのｓｌＤＮＡ合成減少の理由は現在まだ不明である。
【００５４】
実施例 ７
ｓｌＤＮＡの合成はｐＵＣＫ１０６に用いられるＩＲ構造の一次塩基配列に依存しなかった。興味あることには、ポリリンカー部位にＩＲ構造を有するｐＵＣ７ベクター自体も、始点からポリリンカー中心までのＤＮＡフラグメントに対応するｓｌＤＮＡを形成することができる。
【００５５】
ｐＵＣ７から形成された単離精製されたｓｌＤＮＡは２５２ｂｐ長さであった。プラスミド画分を実施例２と同様に形成し、処理し、電気泳動のためにアクリルアミドゲルに塗布し染色した。
【００５６】
図７では、レーン１と３はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体を示す。レーン２はｐＵＣ７から形成されたｓｌＤＮＡを示す。
【００５７】
実施例 ８
ｓｌＤＮＡ構造の確認
上記ｓｌＤＮＡ構造と機構（図６に説明）は次のように確認した：
【００５８】
合成によって構築したＤＮＡフラグメントに不適正塩基ＣＴをＣＧの代りに故意に加えた。図２のＩＲの開放スペースを参照のこと。ｓｌＤＮＡ合成（第１鎖上にスナップ−バックした第２鎖を含む）後に、不適正は修正された。なぜなら図５のＤでは、ＣＧが出現している。もし構造がスナップ−バック構造でなかったとしたら、ポリメラーゼがＩＲ領域を正しく読み、Ｔを鋳型として読みＡが挿入されるはずである。すなわち；新しい鎖はまだ不適正を含むと思われる。不適正Ｔを置換するために、ＩＲ部分は第１鎖に必然的にスナップ−バックして、ポリメラーゼにテンプレートとして第１合成鎖を使わせて、第２鎖を合成させ、第２鎖が合成されるときに、不適正Ｔの代りに相補的Ｇを挿入させる。これは本発明のｓｌＤＮＡの合成機構と構造を決定的に確立する。
【００５９】
実施例 ９
この実施例はアンチセンス配列を有するｓｌＤＮＡ（以下、アンチセンスｓｌＤＮＡと称する）による遺伝子制御を説明する。
【００６０】
（１）ｓｌＤＮＡ生産プラスミドの構築
ｐＵＣＫ１０６のＰｖｕII−ＨｉｎｃII領域（１９９ｂｐ）を削除し、ｌａｃＺのプロモーター／オペレーター領域を欠失させたｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．を構築した（図９）。次に、配列表の配列番号４に示される配列（アンチセンス配列）を有するオリゴヌクレオチド及び配列表の配列番号５に示される配列（センス配列）を有するオリゴヌクレオチドを合成し、５′末端をリン酸化したのちアニーリングさせ、ｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．のＨｉｎｄIIIサイトに挿入した。センス配列を有するｓｌＤＮＡ（以下、センスｓｌＤＮＡと称する）を生産するプラスミドをｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−Ｉ，アンチセンスｓｌＤＮＡを生産するプラスミドをｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−IIと命名した（図９）。
【００６１】
このｓｌＤＮＡは、塩基４２個のループ、塩基３６０個が二重らせん状となったステム、ならびに塩基１５〜１８個の尾部、すなわちオーバーハング部を有していた。
【００６２】
（２）β−ラクタマーゼ遺伝子を有する宿主大腸菌の創製
ｐＢＲ３２２（寳酒造社）をＥｃｏＲＩとＨａｅIIで切断し、β−ラクタマーゼ遺伝子を含む約１．６ｋｂの断片を得、該断片を末端平滑後ｐＨＳＧ３９９（寳酒造社）のＳｍａＩサイトに挿入してｐＸＸ５５５を構築した。次に、ミニＦ（ｍｉｎｉＦ）由来のプラスミドｐＸＸ３２５〔プロシーディングズ オブ ザナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８０巻、第４７８４−４７８８頁、（１９８３）に記載〕のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIサイトにβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むｐＸＸ５５５のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ断片を挿入し、プラスミドｐＸＸ５６６を構築した（図１０）。ｐＸＸ５６６で大腸菌ＭＣ４１００を形質転換し、β−ラクタマーゼ遺伝子を有する大腸菌ＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６を得た。
【００６３】
（３）アンチセンスｓｌＤＮＡによるβ−ラクタマーゼ遺伝子の発現抑制
ｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−Ｉ、ｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−IIをそれぞれ大腸菌ＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６に導入し、それぞれＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／Ｉ、ＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIと命名した。それぞれの形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロスで３７℃一昼夜培養し、その培養液を１００００倍希釈して、その５０μｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌとアンピシリンを５０〜１５０μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロスプレートにまいて３７℃で一昼夜培養した。各プレートのコロニー数を計算した。表１にアンピシリン濃度５０μｌ／ｍｌの時のコロニー数を１００としたときの相対％を、図１１に縦軸にコロニー数（相対％）、横軸にアンピシリン濃度をとったグラフを示す。その結果、ＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIではアンチセンスｓｌＤＮＡによってβ−ラクタマーゼ遺伝子の発現が抑制されアンピシリンに対する耐性が低下し、死滅率が上昇した。
【００６４】
【表１】
【００６５】
（４）ウエスタンブロッティングによるβ−ラクタマーゼ発現量の測定
実施例９−（３）で得られたＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／Ｉ及びＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIの単一コロニーを無作為に選び、それぞれ５ｍｌのＬ−ブロス（２０μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む）に植菌し、３７℃で一昼夜培養した後、その培養液１００μｌを同じ培地５ｍｌに植菌した。ＯＤ６００ ＝１．２付近で集菌し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）で洗浄した後、同緩衝液１ｍｌに懸濁しＯＤ６００ 数を測定した。各々０．７５ＯＤ６００ 分の菌体を破砕し、その細胞抽出液を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ＰＶＤＦ膜（イモビロン、ミリポア社）にブロッティングした後、抗β−ラクタマーゼ抗体（５′プライム→３′プライム社）を用いてウエスタンブロッティングを行った。検出にはイムノステインキット（コニカ社）を使用した。その結果、アンチセンスｓｌＤＮＡを生産しているＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIではセンスｓｌＤＮＡを生産しているＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／Ｉに比べて約３０％のβ−ラクタマーゼの発現量の低下が認められた。
【００６６】
さらに、センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡの遺伝子コピーが同一であり、いずれの分子も欠失あるいは組換えを生じていないことが例証された。センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡを含むゲルの写真には、生成したｓｌＤＮＡが予想通りのサイズを有することが示されており、これらの構築物中で遺伝子組換えが生じていないことが示唆された。また、センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡのバンドは似通った強度を有しており、センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡのコピー数が似通ったものであることが示された。
【００６７】
こうした結果は、カナマイシン耐性遺伝子について調べた結果によって、さらに裏づけられるものである。カナマイシン遺伝子の発現は、アンチセンス系とは独立しており、したがって、内部コントロールの役目をはたす。センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡを発現する細胞から誘導した抽出物のポリアクリルアミドゲルからは、Ｋｍ耐性タンパク質を表すバンドの強度が同一であることが示される。さらに、これらの２種の抽出物のβ−ラクタマーゼ以外のタンパク質の総量は同一である。こうした結果から、観察データに示す影響が、アンチセンスの影響であることがわかる。このように、観察されるβ−ラクタマーゼの発現の変化は、細胞での転写ならびに翻訳に対する全体的影響の結果として生じるのではなく、アンチセンスｓｌＤＮＡの発現に直接起因するものなのである。
【００６８】
実施例 １０
この実施例は三重鎖形成能を有するｓｌＤＮＡ（以下、三重鎖形成ｓｌＤＮＡと称する）を説明する。
（１）ｐＵＣＫ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．の構築
ｐＵＣＫ１９のＮｄｅＩサイトに配列表の配列番号６および７で示される配列で構成される１０６ＮｄｅＩ配列を挿入してｐＵＣＫ１０６Ａを構築した。次に、ｌａｃプロモーター／オペレーター領域を含むＨｉｎｃII−ＶｓｐＩ領域（２０６ｂｐ）を欠失させてｐＵＣＫ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．を構築した。
【００６９】
（２）三重鎖形成ｓｌＤＮＡの調製
配列表の配列番号８に示すオリゴヌクレオチド（ＧＴ３７配列）及び配列表の配列番号９で示されるオリゴヌクレオチド（ＣＡ３７配列）を合成し５′末端をリン酸化したのちアニーリングさせ、ｐＵＣＫ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．の１０６ＮｄｅＩ配列中のＨｉｎｄIIIサイトに挿入した。ＧＴ３７配列を含むｓｌＤＮＡが生産される方向に断片が挿入されているプラスミドをｐＵＣＫＡＧＴ３７、ＣＡ３７配列を含むｓｌＤＮＡが生産される方向に断片が挿入されているプラスミドをｐＵＣＫＡＣＡ３７と命名した（図１２）。これらのプラスミドで大腸菌ＭＣ４１００を形質転換し、これらの形質転換体をそれぞれＭＣ４１００／ｐＵＣＫＡＧＴ３７、ＭＣ４１００／ｐＵＣＫＡＣＡ３７と命名した。これらの形質転換体及び実施例９−（２）で作製したＭＣ４１００／ｐＵＣＫ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．をＬ−ブロス（７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む）にて培養後アルカリ−ＳＤＳ法にてＤＮＡを抽出し、次にＲＮａｓｅＡで処理した。この抽出液をポリアクリルアミド電気泳動に供し、各々の精製ｓｌＤＮＡを得た。
【００７０】
（３）標的ＤＮＡの調製
配列表の配列番号１０及び１１に示されるオリゴヌクレオチドを合成し、５′末端をリン酸化した後アニーリングさせ、ｐＭＳ４３４〔ジーン（Gene）、第５７巻、第８９〜９９頁、（１９８７）に記載〕のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIIIサイトに挿入し、ｐＭＳＴＲ３７を構築した。３７をテンプレートとし、配列表の配列番号１２で示されるプライマーＭＳ１と配列表の配列番号１３で示されるプライマーＭ４でＰＣＲを行い、挿入断片を増幅し、該増幅断片を標的ＤＮＡとした（図１３）。
【００７１】
（４）三重鎖形成の確認
実施例１０−（２）で調製した各ｓｌＤＮＡの５′末端を３２Ｐで放射性標識した。次に、各々の３２Ｐ標識ｓｌＤＮＡと実施例１０−（２）で調製した過剰量の標的ＤＮＡを１０ｍｌの三重鎖形成用緩衝液（５ｍＭトリス−酢酸 ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ）中で３７℃で一昼夜処理した。
【００７２】
該処理液を、５０ｍＭトリス−ホウ酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、ｐＨ８．５の泳動用緩衝液を用いる１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、三重鎖形成をゲルシフトアッセイにより検出した。その結果、ＧＴ３７配列を含むｓｌＤＮＡは三重鎖を形成してゲルシフトした。一方、ＣＡ３７配列を含むｓｌＤＮＡ及び挿入配列のないｓｌＤＮＡはゲルシフトしなかった。
【００７３】
実施例 １１
この実施例は酵母におけるｓｌＤＮＡ生産を説明する。
（１）プラスミドｐＹＥＳ２−８−１０６及びｐＹＥＳ２−９−１０６の構築
ＣｏｌＥｌと２μの複製開始点を持つシャトルベクターｐＹＥＳ２（インビトロジョン社）を用い、酵母でのｓｌＤＮＡ生産を調べた。
【００７４】
ｐＹＥＳ２をＭｕｌＩ及びＳｓｐＩで切断した後、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い平滑化し環状化することによりＭＣＳ及びＧａｌＩプロモーター領域を除いた（ステップ１）。次に、このプラスミドをＡｖａＩで切断し、末端を平滑化した後、配列表の配列番号１４，１５でそれぞれ示されるＤＮＡ断片Ａ又はＢを挿入した（ステップ２）。次に、これらのプラスミドをＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、そこにｐＵＣＫ１０６のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片（２２７ｂｐ）を挿入した（ステップ３）。構築されたプラスミドをそれぞれｐＹＥＳ２−８−１０６（図１４、左側）、ｐＹＥＳ２−９−１０６（図１４、右側）と命名した。
【００７５】
（２）形質転換体からのプラスミドＤＮＡとｓｌＤＮＡの回収
酢酸リチウム法（ジャーナル オブ バクテリオロジー( Journal of Bacteriology ) 、第１５３巻、第１６３〜１６８頁、（１９８３））によってサッカロミセス セレビシエ ( Saccharomyces cerevisiae )ＹＰＨ４９９（ストラタジーン社）をプラスミドｐＹＥＳ２−８−１０６又はｐＹＥＳ２−９−１０６で形質転換した。各々の形質転換体を１００ｍｌのＹＰＤ培地（１％バクトイーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％デキストロース）にてＯＤ６００がおよそ１．５になるまで培養した後、集菌した。該菌体を１０ｍｌのＳＣＥ液（１８２ｇ／ｌ ソルビトール、２９．４ｇ／ｌ クエン酸２ナトリウム、２２．３ｇ／ｌ ＥＤＴＡ２ナトリウム）で１回洗浄し、次に４ｍｌの溶液Ｉ（ＳＣＥ１０ｍｌ中に１０μｌのβ−メルカプトエタノールと５ｍｇのザイモリアーゼ１００Ｔを含む溶液）に懸濁し３７℃で２時間ゆっくり振とうしスフェロプラスト化した。次に、８ｍｌの溶液II（０．２Ｎ水酸化ナトリウム、１％ラウリル硫酸ナトリウム）を加え５分間氷中に静置し、次に、６ｍｌの溶液III（６０ｍＭ酢酸カリウム、氷酢酸１１．５ｍｌ、水２８．５ｍｌ）を加え５分間氷中に静置した後、遠心して上清を回収した。該上清にイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈澱として回収し、該沈澱を７０％エタノールで洗浄後ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）に溶解した。フェノール／クロロホルム混合液により除蛋白操作を行った後、エタノールで沈澱化し、更に、キアーゲンチップ５（Qiagen tip ５、キアーゲン社）でＤＮＡを精製し、回収したＤＮＡ画分を２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００７６】
（３）プラスミドＤＮＡとｓｌＤＮＡの分離
実施例１１−（２）で得られた試料のうち１０μｌ分をＳａｌＩにて処理した。これによりプラスミドＤＮＡは線状化して５０２４ｂｐの２本鎖線状ＤＮＡになり、ｓｌＤＮＡは１２７ｂｐのｓｌＤＮＡと長さ不明の２本鎖線状ＤＮＡ断片に分離される（図１５）。これに、２μｌのＣｏｌＥｌのＡｆａＩ分解物（２９，４６，６０，６２，６９，９９，１２０，１２６，１３０，２４３，２５２，３２３，４１３，４１５，５６４，７７８，９５０，９７６，９９１ｂｐの各断片を含む）を混合して、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルの下半分をエチジウムブロマイドで染色し、１２０〜１３０ｂｐの間のゲルを切り出し細かく切断後、回収し、滅菌水を加えて６０℃で３０分間処理した。遠心後、その上清からグラスウールカラムにより不溶物を取り除き、凍結乾燥してＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００７７】
（４）ＰＣＲによるｓｌＤＮＡの検出
図１６に示すように、配列表の配列番号１６に示されるプライマー１８７１と配列表の配列番号１７に示されるプライマー２０２６１を用いてＰＣＲを行い、ｓｌＤＮＡの存在を目的のDNA 断片が増幅されるか否かで判定した。このとき、プラスミドＤＮＡの混入の可能性を否定するため、同時に配列表の配列番号１８で示されるプライマー１８７０とプライマー１８７１を用いてＰＣＲを行った。なお、両プライマーの組合せによるＰＣＲ反応の効率をみるためプラスミドＤＮＡを段階的に希釈して検出限界の濃度を調べ、どちらも約２．５×１０−２０ モル分子であり差がないことを確認した。
【００７８】
まず、実施例１１−（３）で得られた試料をＰｓｔＩで処理し、その反応液の１００分の１を用いて５０μｌのスケールでＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分で２５サイクル行いプライマーの濃度は５００ｎＭで行った。反応後、反応液の５μｌを６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色後ＦＭＢＩＯ−１００（寳酒造社）により生成物を検出した。その結果、ｐＹＥＳ２−８−１０６、ｐＹＥＳ２−９−１０６のいずれで形質転換した形質転換体もプライマー１８７１とプライマー２０２６１の組合せの場合のみ９３ｂｐの増幅物が確認され、ｓｌＤＮＡの生産が確認できた。また、いずれもプライマー１８７０とプライマー１８７１の組合せでは増幅物は検出されずプラスミドの混入は否定された。
【００７９】
ｓｌＤＮＡは、後述する他の真核生物から発現させることもできる。
【００８０】
以上より、酵母のような真核細胞でもｓｌＤＮＡが生産できることが明らかになった。またｐＹＥＳ２−９−１０６でもｓｌＤＮＡが生産されることより、リーディング鎖だけでなくラギング鎖合成においてもｓｌＤＮＡが合成されることが示唆された。
【００８１】
実施例 １２
プラスミドの複製に依存しないｓｌ−ＤＮＡの生産
（１）ｐＨＳ２８７０の構築
配列表の配列番号６と７で表される配列からなる１０６−ＮｄｅＩリンカーをｐＵＣ１９のＮｄｅＩサイトに挿入し、当該プラスミドをｐＵＣ１０６Ａと命名した。ｐＵＣ１０６Ａからｌａｃプロモーター−オペレーター領域を含むＰｖｕII断片を欠失させてプラスミドｐＵＣ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．を構築した。次に、配列表の配列番号１９で表されるＲＮＡIIＡプライマーと配列表の配列番号２０で表される１８７０プライマーとテンプレートにｐＵＣ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．を用いてＰＣＲを行い、ＲＮＡ１８７０断片を調製した。なお、ＲＮＡIIＡプライマーは複製プライマーＲＮＡII領域の５′末端にアニールし、１８７０プライマーは１０６−ＮｄｅＩリンカーの３′末端にアニールする。さらに、これら二つのプライマーはそれぞれ５′末端にＸｂａＩサイトを含んでおり、その結果、ＲＮＡ１８７０断片は両側にＸｂａＩサイトをもつ。次に、ＲＮＡ１８７０をＸｂａＩで消化してｐＳＴＶ２８（寳酒造社）のｌａｃプロモーター−オペレーター下流のＸｂａＩサイトに挿入し、ｐＨＳ２８７０を構築した。図１７にｐＨＳ２８７０の構築方法を示す。
【００８２】
図１８にｐＨＳ２８７０の構造を示す。図１８が示すように、ｐＨＳ２８７０ではプライマーＲＮＡはｌａｃプロモーターの下流におかれており、逆方向反復配列はプラスミド自身の複製をするｐ１５Ａのオリジンの上流に置かれている。
【００８３】
（２）ｐＨＳ２８７０をもつ細胞でのｓｌ−ＤＮＡの生産量の解析
大腸菌ＪＭ１０９株をｐＨＳ２８７０で形質転換し、ＪＭ１０９／ｐＨＳ２８７０を得た。この形質転換体を１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ−ブロスで２ｍＭのＩＰＴＧ存在下、非存在下の両条件で培養した。アルカリＳＤＳ法にてＤＮＡを調製し、ＲＮａｓｅ処理した。これらのＤＮＡサンプルを６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。その結果、ＩＰＴＧ存在下では非存在下に比べて、１００倍以上のｓｌＤＮＡの生産が確認された。
【００８４】
このｓｌＤＮＡは４塩基のループと１５〜１８塩基のオーバーハングと４４０塩基のステムをもっている。
【００８５】
以上より、このｓｌＤＮＡ生産はプラスミドの複製に依存せず、プライマーＲＮＡをコントロールすることによりコントロールされている。
【００８６】
プライマーＲＮＡの合成にプライマーゼを利用する場合は、プライマーゼの生産をコントロールすることにより、ｓｌＤＮＡの生産がプラスミドの複製とは関係なくコントロールされる。プライマーゼを利用する系としては、Ｔ７ファージの遺伝子４やＴ４ファージの遺伝子４１，６１がある。コーンベルグ（Kornberg）著、「ＤＮＡレプリケション（DNA Replication）」の第１１−１０章を参照。
【００８７】
実施例 １３
大腸菌における三重鎖形成ｓｌＤＮＡによる遺伝子発現阻害
（１）ｐＨＳ２８７０ＧＴの構築
配列番号８および９に示されたオリゴヌクレオチドからなる実施例１２に示された二本鎖オリゴヌクレオチドを ｐＨＳ２８７０のＨｉｎｄIII サイトに導入した（図１９）。ＨｉｎｄIII フラグメントの方向をＤＮＡシークエンスにより確認し、ＧＴ３７配列を含むｓｌＤＮＡが生産される方向に断片が挿入されているプラスミドをｐＨＳ２８７０ＧＴと命名した（図１９）。
【００８８】
（２）ＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalactoside )によるｓｌＤＮＡ発現の誘導
ｐＨＳ２８７０またはｐＨＳ２８７０ＧＴで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２ｍｌのＬ−ブロス（５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む）中３７℃で一晩培養した。この培養液をＬ−ブロス（５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む）で１０２ 倍希釈し、培養液のＯＤ６００ が約０．７に到達した時点でＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を加え３７℃でさらに２時間培養した。この培養液からアルカリ−ＳＤＳ法でｓｌＤＮＡを調製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した（図２０）。ＩＰＴＧを加えた場合のｓｌＤＮＡ（〜４８０ｂｐ：ｐＨＳ２８７０，〜５００ｂｐ：ｐＨＳ２８７０ＧＴ）の発現量はＩＰＴＧを加えない場合より約２０倍増加した。
【００８９】
ｓｌＤＮＡは５３塩基のループ、約４４０塩基対のステム及び１５〜１８塩基のオーバーハングを有する。
【００９０】
（３）大腸菌ＭＣ４１００ｌｐＦＴＲｌＦ′の創製
大腸菌ＭＣ４１００をラムダファージλｐＦ１３（ジーン、第５７巻、第８９〜９９頁（１９８７）に記載）で溶原化した大腸菌ＭＣ４１００λｐＦ１３を、プラスミドｐＭＳＴＲ３７（ＡＴＣＣ No.３５６９５）で形質転換した。λｐＦ１３は京都大学ウイルス研究所（京都市左京区）から入手可能である。ｉｎ ｖｉｖｏ組換えによりβガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領域に三重鎖形成ｓｌＤＮＡのターゲット配列を有するラムダファージλｐＦＴＲ１を得た。このλｐＦＴＲ１を用いて大腸菌ＭＣ４１００を溶原化し、さらに大腸菌 Nova Blue ( Novagen 社）との接合によりＦ′を導入することによりＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′を創製した（図２１）。
【００９１】
（４）パルスラベルと免疫沈澱法によるβガラクトシダーゼ発現量の検出
大腸菌ＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′をｐＨＳ２８７０またはｐＨＳ２８７０ＧＴで形質転換し、２ｍｌのＬ−ブロス（５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む）中３７℃で一晩培養した。この終夜培養液をＭ９改変培地（ｌｘＭ９塩、０．２％グリセロール、１ｍＭ ＭｇＳＯ４ 、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２ 、０．００１％塩酸チアミン、４０μｇ／ｍｌアルギニン、５μｇ／ｍｌ各種アミノ酸（メチオニン、システインを除く））で５０倍希釈し３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００ が約０．２に達した時点でＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を加え、さらに３７℃で３時間培養した。この培養液０．５ｍｌに４０７ｋＢｑの３５Ｓ−Ｍｅｔ，Ｃｙｓ（４３．５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、エキスプレス〔３５Ｓ〕プロテインラベリングミックス（ Express〔３５Ｓ〕Protein Labeling Mix）、ＮＥＮ社）を加え３７℃で３０秒標識後、０．５ｍｌの２０％ＴＣＡを加え反応を停止した。沈澱を遠心により回収し、０．５ｍｌのアセトンで洗浄後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡに溶解した。標識されたタンパク質の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し、１×１０６ ｃｐｍ相当の試料を１μｌの抗βガラクトシダーゼ抗体（コスモバイオ社、ＡＢ−９８６）と０．５ｍｌのＴＢＳ−０．１％ Triton Ｘ−１００溶液中、４℃で一晩反応させた。抗原−抗体複合体を回収するために、この反応液に２０μｌの IgG Sorb（ジエンザイムセンター（ The Enzyme Center）社、ＩＧＳＬ１０）を加え、４℃で１時間激しく振盪した。沈澱を遠心で回収し、ＴＢＳ−０．１％ Triton Ｘ−１００で３回、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０で１回洗浄した。最終沈澱を２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料液に懸濁し９５℃で１分間加熱した。この免疫沈澱した試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（フジ写真フィルム社）で解析した（図２２）。ｐＨＳ２８７０ＧＴで形質転換したＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′をＩＰＴＧで処理した場合のβガラクトシダーゼのバンドの放射活性はｐＨＳ２８７０で形質転換した場合よりも約５０％減少していた。
【００９２】
当業者であれば以上に開示した教示内容からわかるように、本発明を実施するにあたっては、本発明の精神あるいは範囲から逸脱することなく、おおくの改変、変更、および／または置換をたやすく行うことができる。本発明の精神および範囲には、方法論として実質的に同等な手段、ならびに、プラスミドの複製とは独立にｓｌＤＮＡを過剰生成するという、本発明と同一の目的を達成する遺伝的構築物、あるいは他の適当なビークルも含まれるものである。
【００９３】
本発明の種々の実施態様の詳細な説明
本発明者は、ゲノムの一部が直接ゲノムから複製されるという基本的な発見をした。開示する機構は周知のような、ＲＮＡ中間体も逆転写酵素（ＲＴ）も必要としない。ワイナー等、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー５５、６３１（１９８６）；コーンベルグ（Kornberg）、ＤＮＡレプリケーション（ DNA Replication ）〔ダブリュ・エッチ・フリーマン・アンド・カンパニー（ W. H. Freeman and Company）、カルフォルニア州サンフランシスコ、１９８０〕、１０１〜１６６頁参照。ステム−ループＤＮＡ（ｓｌＤＮＡ）と呼ばれる新しい、有用なＤＮＡ構造が発見された。
【００９４】
はじめに、本発明は幾つかの実施態様を提供する。一実施態様は新規で有用なｓｓＤＮＡ分子の合成方法（又はプロセス）である。他の実施態様は適当なプライミング部位と、逆方向反復（ＩＲ）と、ｓｌＤＮＡ合成の他の必要な成分とを有するＤＮＡフラグメントを含む、このような分子を合成するためのインビボ及びインビトロ系である。
【００９５】
このような分子を合成するためのインビボ系はコンピテント自己複製ビークルと系の他の成分とを用いる。この実施態様の他の面は逆方向反復、ｓｌＤＮＡの第１鎖の複製のためのテンプレートとして役立つＤＮＡ、逆配向のＤＮＡ合成をテンプレートに開始させるための適当なプライミング部位、及び必要な場合の親ＤＮＡの第２鎖と以下で述べる他の成分を含む自己複製ビークルである。
【００９６】
もう一つの実施態様は新規なｓｓ−ｓｌＤＮＡ分子である。
【００９７】
本発明は新規な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子の合成方法を提供する。この分子は、ステムがｓｓＤＮＡ中のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡからなり、一端においてｓｓＤＮＡ分子の５′と３′末端を形成し、他端において二重鎖 DNAの反対端部を結合するＤＮＡの一重鎖ループを形成するステム−ループ構造（ｓｌＤＮＡ）を含む。この方法はＤＮＡ合成の通常の成分と下記成分：
（ａ）適当なプライミング部位と、前記プライミング部位の下流の逆方向反復（ＩＲ）とを含むテンプレートＤＮＡ；
（ｂ）テンプレートにＤＮＡ重合を開始させるためのプライマー；及び
（ｃ）テンプレートからｓｌＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼ
を含む系において実施される。
【００９８】
この方法は次の工程：
（１）ＤＮＡ重合を開始させるためのＤＮＡテンプレートのプライミング工程；
（２）テンプレートとしてＤＮＡの二重鎖の一つを用いてプライマーからｓｓＤＮＡを合成し、一つの鎖を形成し、ＩＲ塩基配列に入るまで鎖のＤＮＡ合成を続け、ＩＲ塩基配列内で合成を停止させる工程；
（３）新しく合成された鎖内のＩＲ塩基配列における相補的塩基がその端において非重複部分を重複部分とからなるループを形作するために、アニールし、重複部分を連続ＤＮＡ合成のプライミング部位として機能させる工程；
（４）テンプレートとしてＤＮＡの新たに合成された鎖及び／又は他の鎖を用いてＤＮＡ合成を再開する工程；
（５）ｓｌＤＮＡを形成する工程；及び
（６）必要に応じてｓｌＤＮＡを分離し、単離する工程
を含む。
【００９９】
この方法はＤＮＡ合成のために必要な通常の成分の全てを含む系で実施される。これらの成分はインビボでこの方法が実施されるときに本質的に存在し；この方法をインビトロで実施するときに通常、系に導入される。
【０１００】
この方法は、適当なプライミング部分と、このプライミング部位から下流の逆方向反復とを有するＤＮＡの存在を必要とする。ＤＮＡはＤＮＡ複製を導くためのテンプレートとして機能する。プライマーは、ＤＮＡ鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物の合成を開始させるように作用しうるオリゴヌクレオチド（天然に生成又は合成的の製造）でありうる。ＤＮＡ複製の開始方法は当然周知である。ワトソン（Watson）、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン（Molecular Biology of the Gene ）、第３版、ダブリュ・エイ・ベンジャミン社（W. A. Benjamin. Inc.）；ＤＮＡシンセシス：プレゼント・アンド・フューチャー（DNA Synthesis : Present and Future ）、モリノイクス（ Molineux ）とコイヤマ（ Kohiyama ）編集、（１９７７）第Ｖ部、“Ｇ４アンドＳＴ−１ＤＮＡシンセシス・イン・ビトロ（Ｇ４ and ST− 1DNA Synthesis in Vitro）”ワーカー著；第VII 部、“ＤＮＡ・シンセシス・イン・パーミアブル・セル・シンセシス・フロム・サッカロマイセス・セレヴィジュ（DNA Synthesis in Permeable Cell Systems from Saccharomyces cerevisiae ）オエルテル（Oertel）とゴーリアン（Goulian ）著を参照のこと。第１鎖の合成に寄与するポリメラーゼに対して、第２鎖の合成には異なるポリメラーゼが寄与する。プライマーはＤＮＡ又はＲＮＡプライマーのいずれでも良い。合成はヌクレオチドと、例えばＤＮＡポリメラーゼのような重合剤との存在下、適当な温度及びｐＨにおいて誘導される。
【０１０１】
本発明の方法は、テンプレートに沿った鎖の合成を触媒する酵素のような重合剤を用いる。このための適当な酵素には、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩもしくはIII 、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Klenow）フラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）；ウイルスポリメラーゼがあり、熱安定性酵素をも含まれる。そのＤＮＡ複製開始部位を認識するポリメラーゼが適当である。一般に、このプロセスをインビボで実施する場合に、これらの遺伝要素が存在すると考えられ；インビボで実施しない場合又はインビトロで実施する場合には、これらを系に加えることになる。
【０１０２】
開始部位を認識するポリメラーゼは重合を惹起させる又は重合に寄与する。発明者はこの場合に特定の理論にしばられるのを望むわけではないが、第１ＤＮＡ鎖の合成に寄与するポリメラーゼが他方のすなわち第２ＤＮＡ鎖の合成にも寄与することを除外することはできない。従って、この方法は第２鎖が第１合成鎖の５′末端を越えて３′末端において停止するまで、第２鎖の合成を続けることを含む。このように、ｓｌＤＮＡの重複ステムが形成される。
【０１０３】
ＤＮＡポリメラーゼについての情報は入手可能である。例えば、コーンベルグによるＤＮＡレプリケーション（DNA Replication）（ダブリュ・エッチ・フリーマン・アンド・カンパニー、カリフォルニア州、サンフランシスコ）、１０１〜１６０頁、第４章、ＤＮＡポリメラーゼ・オブ・イー・コリ（DNA Polymerase I of E. Coli ）、第５章、アザー・プロカリオティック・ポリメラーゼズ（Other Procaryotic Polymerases ）、第６章、ユーカリオティック・ＤＮＡ・ポリメラーゼズ（ Eucaryotic DNA Polymerases ）及び第７章を参照のこと。
【０１０４】
ｃＤＮＡ中の第２鎖合成に有用であるポリメラーゼのような、他のポリメラーゼも考えられる。
【０１０５】
上記の特定の説明では、ポリメラーゼが２種類：ＤＮＡポリメラーゼIII とポリメラーゼＩであることが考えられる。
【０１０６】
もし蛋白質をコードしうる好ましいもしくは標的となる核酸塩基配列を例えば合成されたｓｌＤＮＡ部分遺伝子として複製することが望ましい場合にはこの塩基配列をＩＲの上流に配置する。例えば、複製始点（ＯＲ）を有する、例えばｐＵＣＫ１０６等のベクターのような、複製ビークル中で複製が行われる場合には、標的核酸配列はＩＲとＯＲとの間に位置する。
【０１０７】
本発明の方法は、上述したように、プライミング部位と逆方向反復（ＩＲ）すなわち逆配向で存在する二つの同じ塩基配列を含む二重鎖ＤＮＡフラグメントを用いる。ＩＲは塩基配列又は“パリンドローム”として存在しうる。
【０１０８】
後に述べるように、核酸配列へのランダム点突然変異の導入を容易にすることが好ましい場合には、例えばＲＴのような、ある特定の酵素が特に好ましい。
【０１０９】
第１鎖の合成がｄｓＤＮＡテンプレートに沿って接触しながら、ＩＲを通って進行して、全プラスミドゲノムの複製を生ずる。一定の周期で、ＤＮＡ鎖の合成はＩＲ内で停止して、それ自体に相補的である塩基配列の短い部分を形成し、ループを形成し、ＩＲ塩基配列においてそれ自体にアニールする。新たに合成された鎖内のこの二重鎖部分は第２鎖又は他のＤＮＡ鎖のプライミング部位として認識される。第２鎖の合成はＤＮＡの最初に形成された鎖及び／又は他の親鎖をテンプレートとして用いて出発する。従って、テンプレート切換えが生ずると考えられる。
【０１１０】
ヌクレオチドを含むポリメラーゼによって第２鎖が合成されるので、アニールされた相補的塩基からステムが形成され、内部相補性を有する二重構造が生ずる。
【０１１１】
第２鎖の合成は第１合成鎖の第１ヌクレオチドをはるかに過ぎて、この第１鎖のＲＮＡプライマーを通って進行する。第１鎖は結局は減成して、３′−オーバーハングを形成する。一つの特定の説明では、ＤＮＡ合成はダスグプタ（Dasgupta）等、セル（ Call ）５１、１１１３（１９８７）に述べられている方法と同様な方法によってｔｅｒＨ部位において停止すると考えられる。
【０１１２】
適当な処置によって、３′末端オーバーハングの長さは、例えば延ばすように、ｔｅｒＨ部位をプライミング位置から下流へ動かすことによって制御することができる。
【０１１３】
さらに、３′末端オーバーハングを有するステムの代りに、適当な停止部位、例えばｔｅｒＨをプライミング部位の上流に配置することによって、第１鎖の端部の前で第２鎖の合成をブロックすることが可能であると考えられる。従って、いずれかの鎖が他方に比べてかなりの長さで長くなると考えられる。
【０１１４】
第２鎖合成が停止したときに、テンプレートと形成されたｓｌＤＮＡが分離する。
【０１１５】
本発明の方法は望ましい頻度のサイクルでくり返すことができる。必要な成分のいずれかが欠乏すると、必要に応じて補充することができる。
【０１１６】
この方法をインビボで実施する場合には、プライミング部位とこのプライミング部位の下流のＩＲとを含む、適当なコンピテント複製ビークルが形成される。ＩＲを有するＤＮＡフラグメントは通常、ポリリンカー塩基配列中に特有の制限部位に挿入される。ポリリンカーがＩＲ（及び対称的制限部位）を有するプラスミドが用いられている。本質的に存在しない場合には、ＤＮＡフラグメントにＤＮＡ塩基配列へのプライマーが供給される；ポリメラーゼはビークルに固有であっても固有でなくても良い。ビークルは複製とｓｌＤＮＡ形成とに必要な、他の全ての成分を含む。
【０１１７】
上述したことから、テンプレートとして役立つＤＮＡフラグメント、ＩＲ塩基配列、ｓｌＤＮＡを形成する鎖の複製をプライムし、続けるために必要な要素を含む自己複製ビークルがｓｌＤＮＡの合成に適することが理解されるであろう。
【０１１８】
本発明の他の主要な実施態様は新しいｓｌＤＮＡを形成する。これらの構造はすでに上述した、以下では補足の説明を述べる。
【０１１９】
“ステム−ループ”又は“ｓｌＤＮＡ ”と名づけられた新しい構造は一重鎖である。ｓｌＤＮＡの説明は図５のＥ（ｐＵＣＫ１０６から）と図７（ｐＵＣ７から）に示す。
【０１２０】
典型的なｓｌＤＮＡはアニールされた相補的塩基の重複二重鎖ステムとステムの２鎖を結合する一重鎖ヌクレオチドのループとを含む。ループの一重鎖性は本発明のｓｌＤＮＡのもう一つの興味ある特徴である。ｓｌＤＮＡはヌクレオチドの非常に短い配列またはかなり長い配列のループを含むことができる。ｓｌＤＮＡはループを形成するために充分な長さのヌクレオチド配列と短い重複二重鎖を形成する塩基対合を含むことができる。最小サイズは第２鎖の合成開始のためのプライミング部位を形成するために充分な塩基対合を与えるものであるべきである。ループの最小サイズは安定構造になるための塩基対合を阻止する塩基上の歪み（strain）によって限定される。最大サイズはｓｌＤＮＡに予定された用途によって影響される。図５のＢに図示したループは４塩基からなるが；１０塩基、２０塩基又はそれ以上の塩基のループも考えられる。ｓｌＤＮＡループの一重鎖性はｓｌＤＮＡに提案される用途に非常に有用である特徴である。
【０１２１】
ｓｌＤＮＡに考えられる他の興味ある構造は二重体ｓｌＤＮＡである。この構造では、二つのｓｌＤＮＡの一重鎖の自由端部が結合する。この構造は非常に安定であると期待される。通常ＤＮＡを変性させるような条件に暴露されると、これらのｓｓＤＮＡはそれらのオリジナル構造に“スナップ−バック”しがちである。鎖の結合はＤＮＡ及び／又はＲＮＡリガーゼによる通常の方法によって実施される。このような構造は蛋白質をコードするための特定の遺伝子をも有し、それによって興味ある新しい実用的可能性を提供する。
【０１２２】
ｓｌＤＮＡの重要な性質である安定性は重複端部（tail）が長くなると共に増加する傾向があると考えられる；従って、このような構造はこのことが強調されるべき特性である場合に好ましい。同一の複製ビークルから形成されるｓｌＤＮＡの全てが必ずしも同じサイズでないことに注目すべきである。上記説明では、ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡにおいて、第１鎖の５′末端は不均一であるように思われ、一部の鎖は＋１位置（ＣｏｌＥｌ複製の始点に相当）から出発するが〔トミザワ等、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザイ・ＵＳＡ、７４、１８８５（１９７７）を参照のこと〕、他の鎖は、−１，＋２，＋３から出発する。従って、ＤＮＡは類似したｓｌＤＮＡの類と見なすことができる。
【０１２３】
ＤＮＡフラグメント内にＩＲを越えて一つ以上の不適正が存在することがｓｌＤＮＡの合成にも構造にも不利な影響を与えないことが認められる。このことはこの場合にパリンドロームの中心から２５ヌクレオチド離れたＧに対する不適正Ｔによって説明される（図２参照）。この不適正はｓｌＤＮＡの合成において修復された。
【０１２４】
端部の１未満の他方の末端をこえたｓｓＤＮＡオーバーハングを利用した、本発明のｓｌＤＮＡの幾つかの用途が提案される。それ故、このことが本発明の新しい構造の重要な特徴であることは理解されよう。
【０１２５】
図示したプラスミド内のｓｌＤＮＡの合成は本発明の最も良い形式（mode）を説明する。
【０１２６】
しかし、ＩＲとここに述べる他の成分とを含むベクターはｓｌＤＮＡの合成に適切である。
【０１２７】
ＩＲは原核生物と真核生物にしばしば出現する構造である。このようなＩＲは本発明に使用可能である。ＩＲ塩基配列は合成的に製造することもできる。１例は図２に示す合成ＩＲである。
【０１２８】
ＩＲの塩基配列又はパリンドローム塩基配列は大腸菌から得られている〔ギルソン（Gilson）等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ１８、３９４１（１９９０）〕；ギルソン等のヌクレイック・アシッズ・リサーチ１９、１３７５（１９９１）は大腸菌とサルモネラエンテリチカ（Salmonella enteritica）からのパリンドローム塩基配列を報告している（パリンドローム単位配列４０ヌクレオチド長さ）。チャルカー（Chalher ）等のジーン（Gene）７１、（１）：２０１−５（１９８８）は大腸菌における５７１−ｂｐパリンドロームの増殖を報告している；逆方向反復はルイス（ Lewis）等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol）（イングランド）２１５、（１）：７３〜８４（１９９０）によって枯草菌（Bacillus subtilis）において報告されている（２６−塩基対反復）、サウリン（Saurin）のコンピュータ・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシーズ（Comput. Appl. Biosci. ）３、（２）：１２１−７（１９８７）は大腸菌における反復パリンドローム構造を系統的に研究するための新しいコンピュータプログラムの使用を考察している。下記米国特許はポリドンローム塩基配列を開示する：第４９７５３７６号；第４８６３８５８号；第４８４０９０１号；第４７４６６０９号；第４７１９１７９号；第４６９３９８０号及び第４６９３９７９号。
【０１２９】
ｓｌＤＮＡは、その当該使用目的に即して、様々な長さのループならびにステムを、尾部（すなわち３′末端あるいは５′末端のオーバーハング部）とともに有するよう構築することができる。ステムは、塩基１００個、好ましくは３００個から５０００個以上、好ましくは約４０００個の鎖長となるよう構築することができる。一方の末端からもう一方の末端がさらに延びているオーバーハング部は、ヌクレオチド１５〜１８個、あるいは１５〜３０個といった比較的短い鎖長から、塩基約５０〜１００個、あるいはそれ以上の比較的長い鎖長までの範囲とすることができる。一本鎖のオーバーハング部は、ＤＮＡアンチジーン断片を含んでいる可能性があるので、３′あるいは５′末端の尾部のオーバーハング部は、ＤＮＡアンチジーン断片の鎖長に対して合理的な鎖長となるようにして、アンチジーン断片が必要に応じてアンチセンスあるいは三重らせんとして機能しうるようにするのが一般に好ましい。ｓｌＤＮＡのループの鎖長を決定する際にも、同様のことを考慮するのが好ましい。塩基４個から８０個の鎖長のループを想定しうるものの、実施するうえでは、他の条件も勘案して、塩基４０個から６０個のループが好ましい。
【０１３０】
パリンドロームは殆ど同じ（必ずしも同一ではない）塩基配列が逆方向にランする逆方向反復を含むと定義されている。一部は短いが（一方向に３〜１０塩基）、他の配列は数百の塩基対を含めて、非常に長い。ワトソン（Watson）、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン第３版、２２４〜２２５頁。
【０１３１】
ＤＮＡフラグメント中のＩＲはサイズがかなり変化しうる。限定するわけではなく、１０から３０以上のヌクレオチドの逆方向反復を含むｓｌＤＮＡが考えられる。逆方向反復は３００を越えるｂｐを含むと報告されている。カレント プロトコール（Current Protocols）、セクション１．４．１０．
【０１３２】
ｓｌＤＮＡは原核生物又は真核生物のホスト発現（例えば細菌、酵母及び哺乳動物細胞）の合成生成物であり得る。
【０１３３】
プラスミドのような適当なベクターの例とこれによって形質転換されるホスト細胞は、当業者に周知である。必要な成分を有するプラスミドの適当なホストには、原核生物と真核生物とが存在する。原核生物は、例えばエシエリキア（Escherichia ）属、特に大腸菌；バチルス（Bacillus）属；特に枯草菌のような微細物を含む。真核生物は、例えば酵母、動物、植物等であり、動物細胞、植物細胞等のような微細物を含む。
【０１３４】
大腸菌を形質転換することのできるプラスミドは、例えばｐＵＣ型とＣｏｌＥｌ型プラスミドがある。米国特許第４９１０１４１号参照、大腸菌を形質転換することができるプラスミドは例えば、一般にＣｏｌＥｌ型プラスミドを含む。大腸菌の形質転換に適当な、他のプラスミドを下記に挙げる：ｐＳＣ１０１、ｐＳＦ２１２４、ｐＭＢ８、ｐＭＢ９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＣＫ１、Ｒ６Ｋ、ｐＢＲ３１２、ｐＢＲ３１３、ｐＭＬ２、ｐＭＬ２１、ＣｏｌＥｌＡＰ、ＲＳＦ１０１０、ｐＶＨ５１、ｐＶＨ１５３。
【０１３５】
枯草菌を形質転換することのできるプラスミドを下記に挙げる：ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２２３、ｐＵＢ１１２、ｐＴ１２７、ｐＥ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＳＡ０５０１、ｐＳＡ２１００、ｐＴＰ４、ｐＴＰ５及びこれらの誘導体。
【０１３６】
枯草菌と大腸菌の両方を形質転換することのできるプラスミドは、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）１４５、４２２〜４２８（１９８２）；プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、７５、１４３３〜１４３６（１９７８）及びプリンシプルズ・オブ・ジーン・マニピュレーション（Principles of Gene Manipulation）第２版、カル（ Carr ）等編集、カリフォルニア大学出版局（バークレイ）、１９８１、４８頁に述べられている。
【０１３７】
真核生物においてｓｌＤＮＡ合成を実施するために特に重要であるのは、サッカロマイセス・セレヴィジェを形質転換することのできるプラスミド：ｐＭＰ７８、ＹＥｐ１３、ｐＢＴＩ１、ｐＬＣ５４４、ＹＥｐ２、ＹＲｐ１７、ｐＲＢ８（ＹＩｐ３０）、ｐＢＴ１７、ｐＢＴ１９、ｐＢＴ１１０、ｐＡＣ１、ｐＳＬｅ１、ｐＪＤＢ２１９、ｐＤＢ２４８及びＹＲｐ７である。ＹＩｐ５、ｐＵＣ−ＵＲＡ３、ｐＵＣ−ＬＵＥ２及びｐＵＣ−ＨＩＳ３も考えられる。メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology ）１９４巻、２８５、３７３〜３７８頁「ガイド・トゥ・イースト・ジェネティクス・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology ）」、グスリー（Guthrie ）とフィンク（Fenk）編集（１９９１）、アカデミック プレス社（Academic Press. Inc.）を参照のこと。他の酵母ベクターはエクスペリメンタル・マニピュレーション・オブ・ジーン・イクスプレッション（Experimental Manipulationof Gene Expression）イノウエ マサヨリ（Masayori Inouye）編集、アカデミック プレス社（１９８３）、１００〜１０４頁に述べられている。
【０１３８】
さらに、大腸菌ならびに例えばエス・セレヴィジェのような酵母の形質転換に用いることができるシャトルベクターが特に重要である。このようなベクターはｐｋｂ４２とｐＹＣ１を含む。他の例はア・プラクティカル・ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング（A Practical Guide to Molecular Cloning ）ベルナード ペルバル（Bernard Perbal ）による第２版（ウイリーアンドサンズ）中の“コスミド・ベクター・フォー・ロー・アンド・ハイカー・ユーカリオーツ（ Cosmid Vector for Low and Hiher Eucaryotes）”に関するセクションに挙げられている。他の適当なベクターはカレント プロトコール、２巻、セクション１３．４．１、１３．４．２（１９８９）に述べられる。他の適当なビークルはＹＥｐ２４〔ボトシュタイン（Botstein）等、ジーン、８、１７（１８７９）〕とｐＪＤＢ２０７〔ベッグ（Beggs ）、ゲネチック エンジニヤリング（Genetic Engineering）（ウィリアムソン（Williamson）編集）２巻、１７５頁、アカデミック プレス（１９８２）のような、一般のマルチコピーベクターを含む。選択可能な、他のベクターは、ＹＥｐ５１、ＹＥｐ５２、ｐＹＥＳ２のようなＹＥｐクラスのプラスミドを含む。
【０１３９】
本発明の実施するための商業的に入手可能な真核ベクターの例は、例えばＣＯＳ、ＣＨＯ及びＨｅＬａ細胞におけるｐＳＶＬとｐＫＳＶ−１０である。他の例はア・プラクティカル・ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニングに挙げられている。
【０１４０】
こうした複製可能な遺伝的ビークルは、ビークルの複製に適した遺伝的要素、たとえばビークルの複製起点、プロモーターなどを含んでいるので、本明細書に記載する逆方向反復配列をはじめとする要素が挿入されると、ｓｌＤＮＡが発現されることとなる。しかし、本明細書に記載する本発明の改善策、すなわちｓｌＤＮＡの過剰発現においては、ｓｌＤＮＡの合成ならびに生成は、ビークルの複製を支配している要素とは異なった、すなわち、ビークルの複製を支配している要素とは異なる要素に対して応答あるいは作動する独立に誘導可能なプロモーターおよび遺伝的要素によって、ビークル、たとえばベクターの複製とは独立に制御するのが好適である。
【０１４１】
形質転換ホストの培養と発酵は技術上公知の標準的な一般方法によって実施される。例えば、メソッズ イン エンザイモロジー、１８５巻、ジーン・エクスプレッション・テクノロジー（Gene Expression Technology）〔編集者ゴッデル（Goeddel ）〕１９９０（特に、グロス・オブ・セル・ラインズ（Groth of Cell Lines））を参照、酵母に関しては、メソッズ イン エンザイモロジー、１９４巻、ガイド・トゥ・イースト・ジェネティクス・アンド・モレキュラー・バイオロジーを参照；大腸菌の増殖条件は、カレント プロトコール インモレキュラー バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）、１巻、１．１．１、１．１．２、１．１．３、１．１．４、１．３．１頁及びモレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Moloecular Cloning ：A Laboratory Manual ）第２版、１．２１頁に述べられており、プラスミドＤＮＡの精製は、１．２３頁に述べられており、哺乳動物細胞に適した培養増殖条件がカレント プロトコール、１巻と２巻、９．０．４〜９．０．６、９．１、９．１．２、９．１．３、９．２．５、９．４．３、１１．５．２、１１．６．２及び１１．７．３頁に述べられている。
【０１４２】
要約すると、一重第１鎖の複製開始と合成のために必要な成分、すなわち開始部位を含むＤＮＡテンプレートフラグメントとＩＲ（及びポリメラーゼ）を複製ビークル中に供給すると、ｓｌＤＮＡが形成されると期待される。
【０１４３】
本発明のｓｌＤＮＡの合成をインビトロで実施する場合に、合成はテンプレートとしてＤＮＡフラグメントを用いるヌクレオチド鎖の合成のための通常の成分を含む培質中で実施する。一般に、合成は好ましくはｐＨ７〜９の緩衝化水溶液中で行われる。ＤＮＡテンプレート鎖上にモル過剰量のオリゴヌクレオチドが存在することが好ましい、デオキシリボヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰも合成混合物の成分である。溶液を加熱し、次に冷却する。次にポリメラーゼを加えると、合成が進行する。これらの成分はここに述べる本発明のための「通常成分」と呼ばれる。
【０１４４】
オリゴヌクレオチド合成は、米国特許第４４１５７３４号と、マットイシ（Matteuci）等ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc. ）１０３（１１）：３１８５〜３１９１頁（１９８１）；アダムス（Adams ）等、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー１０ ５（３）：６６１〜６６３頁（１９８３）；及びベムケージ（Bemcage ）等、テトラヘドロン レタース（Tetrahedron Letters）２２（２０）：１８５９〜１８６７（１９８１）に述べられている。
【０１４５】
本発明の方法は遺伝子工学の技術と分子クローニングを利用する。遺伝子工学の一般的技術と分子クローニングは下記文献に含まれる：サムブロック（Sambrook）等、モノキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル、第２版、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９９０、ア・プラクティカル・ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング（A Practical Guide to Molecular Cloning ）、第２版、バーナード ペルバル（１９８８）；メソッズ イン エンザイモロジー、６８巻、リコンビナントＤＮＡ（Recombinant DNA）〔ウー（Wu）編集者〕、アカデミック プレス、N. Y. 、１９７９；メソッズ イン エンザイモロジー、１８５巻、ジーン・エクスプレッション・テクノロジー（Gene Expression Technology）〔ゴエデル（Goeddel ）編集者〕１９９０、カレント プロトコールス イン
モレキュラー バイオロジー、１，２及び３巻。
【０１４６】
本発明のｓｌＤＮＡは幾つかの重要な用途を有する。本発明の方法は特定の遺伝子にランダム突然変異を導入するために利用することができる。このような系は形質転換ベクター中のβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を示す図７に説明される。
【０１４７】
この方法は、ステム中の配置された重要な遺伝子を含むｓｌＤＮＡの合成、ｓｌＤＮＡの単離、ｓｌＤＮＡから遺伝子の切断、適当な複製ビークルへのそれのクローニング及びその遺伝子によってコードされる蛋白質の表現を含む。蛋白質は目的の活性に関して試験することができる。標準方法によって、コロニーを検査して、突然変異遺伝子を有するコロニーを確認することができる。
【０１４８】
突然変異の発生と確認の説明は次のように進める。ｌａｃＺ遺伝子を収容するｐＵＣＫ１９（実施例１参照）中に、ＤＮＡフラグメントとＯＲ（実施例１に示す）との間に３５ｂｐＩＲ（実施例に説明）を含む前出の配列表の配列番号１及び２で構成され、図２で示す２１５ｂｐＤＮＡフラグメントを結合させる。このプラスミドを標準条件下で増殖するコンピテント大腸菌ＣＬ８３に形質転換させる。その後、ｓｌＤＮＡを単離し、ｌａｃＺ遺伝子を切断して、ｐＵＣ１９中（ＩＲ含有フラグメントをもっていない）に挿入する。次いでこのプラスミドを大腸菌ＣＬ８３に形質転換させる。突然変異の頻度をβ−ｇａｌ、無色基質を用いて公知のインビボ試験によって評価する、前記無色基質は加水分解されると暗青色生成物を生ずる。コロニーが無色である場合には、このことがβ−ガラクトシダーゼが製造されないことを示唆する。
【０１４９】
ｌａｃ遺伝子類の他の遺伝子、例えばｌａｃＹもしくはｌａｃＡ又は他の適当な遺伝子をこのスクリーニング試験に用いることができる。重要な蛋白質（又はポリペプチド）をコードする遺伝子も、突然変異の頻度決定と、誘導蛋白質（又はポリペプチド）をコードする適当な遺伝子の選択とに用いることができる。
【０１５０】
スクリーニング方法は標的遺伝子に突然変異を導入し、突然変異率を増加させやすい、ポリメラーゼの選択を可能にする。従って、例えばｌａｃＺ遺伝子のような適当な遺伝子をスクリーニング遺伝子として用いることができる。複製確実度（replication fidelity ）の低いことが知られる逆転写酵素は目的蛋白質をコードする標的遺伝子に突然変異を導入するために選択すべき酵素であるように思われる。
【０１５１】
好ましい標的蛋白質は、好ましい生物学的性質のために選択された、突然変異遺伝子を有する、特定のコンピテント形質転換ホストによって表現される。
【０１５２】
突然変異の頻度は、複製における確実度の低いことが知られる適当な酵素を選択することによって影響されやすいと考えられる。従って、標的ＤＮＡフラグメント又は遺伝子を増幅する場合に、系は複製確実度又は不確実度すなわち挿入ＤＮＡフラグメント又は遺伝子の複製におけるＤＮＡポリメラーゼによってなされるエラー（error ）頻度に依存する。このようにして、各複製エラーに対してランダム突然変異が遺伝子に導入される。ＤＮＡポリメラーゼの不確実度が高ければ高いほど、突然変異遺伝子類は大きくなる（この逆もいえる）。
【０１５３】
ＰｏｌIII とＰｏｌＩとが有効であると考えられる本発明の上記実施態様の一つでは、ＰｏｌＩが自己修正機能を有することが知られているので、ＰｏｌIIが低い確実性を有すると考えられる。このようにして、系の複製確実度はＤＮＡポリメラーゼの適当な選択によって調節することができる。一般に、ランダム突然変異は第２鎖を合成するポリメラーゼによって導入されやすいと考えられる。興味ある候補ポリメラーゼはＲＴである。
【０１５４】
好ましい突然変異を有する遺伝子は染色体交差（chromosomal crossover）に有用である。この方法によって、重要な遺伝子又は突然変異遺伝子を有するｓｌＤＮＡを用いて、同種の一つの分子からもう一つの分子への遺伝情報を融和させ、交換することができる。突然変異遺伝子はゲノム内にベクター塩基配列に類似した塩基配列を配置し、相同な遺伝子が突然変異遺伝子によって複製される。
【０１５５】
このようにして、突然変異遺伝子を含み、好ましい蛋白質を表現する微生物の新しい系統が発生することができる。突然変異遺伝子を有するｓｌＤＮＡはインビトロ又はインビボで製造することができる。
【０１５６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＤＮＡの特定セグメントをインビトロ酵素増幅するための迅速手段である。標準ＰＣＲ方法は増幅すべき二重鎖ＤＮＡセグメント、セグメントと側面を接する常に二つの一重鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、適当なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、バッファー及び塩を必要とする。カレント プロトコール セクション１５参照のこと。
【０１５７】
本発明のｓｓ−ｓｌＤＮＡは単一プライマーによって増幅することができる。この特徴は増幅をかなり簡単化し、プライマーがその適当な複製開始部位を見出す問題の解決を助け、これをさらに経済的にし、従来のＰＣＲ方法に付随する問題の解決を助ける。
【０１５８】
ｓｌＤＮＡの増幅はｓｌＤＮＡを変性して、一重鎖ＤＮＡ（３′から５′末端まで）を形成することを含む。この反応は通常の順序：３′末端からのプライミング、ポリメラーゼ反応、変性とアニーリングに従って行われる。これが２５サイクル実施されると、ｓｌＤＮＡの１００万倍増幅が生ずる。ｓｌＤＮＡは標的蛋白質をコードする遺伝子を有することができる。
【０１５９】
エルリッヒ（Erlich）等による“リーセント・アドバンシーズ・イン・ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Recent Advances in Polymerase Chain Reaction ）”なるタイトルのサイエンス（Science ）２５２、１６４３〜１６５０（１９９１年６月２１日）内の最近の報告はプライマーに関連する問題と、ＰＣＲ方法に提案されている改良とを考察している。
【０１６０】
従って、本発明のｓｓ−ｓｌＤＮＡ構造を１プライマーを用いる方法によって増幅する方法は非常に重要である。ｓｌＤＮＡは例えば改良された生物学的特性を有する突然変異遺伝子のような、重要な遺伝子を有することができる。
【０１６１】
本発明のｓｌＤＮＡのインビボ製造は目的の塩基配列を形成するように操作されることができる。このようにして製造されたｓｌＤＮＡを次に、アンチセンス（antisense ）ＤＮＡとして用いることができる。
【０１６２】
現在考えられている魅力的な用途は、本発明のｓｌＤＮＡが三重鎖らせんＤＮＡ、すなわち三重鎖ＤＮＡを形成し、結果としての新しい三重鎖ｓｌＤＮＡの形成に果たす役割である。サイエンス、２５２、１３７４〜１３７５（１９９１年６月２７日）における最近の報告、“トリプレックス・ＤＮＡ・ファイナリー・カムズ・オブ・エイジ（Triplex DNA Finally Comes of Age ）”は本発明の適時性を強調している。三重鎖ＤＮＡは第３鎖を染色体ＤＮＡ上の特定認識部位に結合させることによって製造することができる。好ましくは塩基の完全量（full complement）（例えば１１〜１５以上）を含むサイズの合成鎖を検討している。長い３′（又は５′）末端（及び非重複塩基のループ）を有する本発明のｓｌＤＮＡは良好な候補であるように思われる。結果として生ずる三重鎖ＤＮＡは大きな安定性と有用性とを有するように思われる。ＡＩＤＳ療法、選択的遺伝子阻害等を含めた三重鎖らせん形成に基づく新しい療法がこの報告に提案されている。
【０１６３】
本発明の重要な実施態様の一つでは、ｓｌＤＮＡは、その一本鎖部分に、アンチセンス断片あるいは三重らせん形成能をもつ配列として遺伝子機能を調節するＤＮＡ配列であるアンチジーンを有している。
【０１６４】
アンチセンス配列、三重鎖形成配列等の遺伝子制御配列（以下、アンチジーンと称す）を有するｓｌＤＮＡはインビボの系において遺伝子制御ＤＮＡとして生成、利用できる。
【０１６５】
生命現象はその根元をたどると遺伝子に組み込まれた情報によってつかさどられているので、その遺伝子に何らかの方法で直接働きかけることは特定の遺伝子の発現制御をするうえで最も効果的な手法である。遺伝子工学的手法で遺伝子の発現制御する方法としてアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、それに三重鎖形成能をもつ核酸等を使用する方法が知られている。アンチセンスＲＮＡ及びアンチセンスＤＮＡに関しては、ターゲット遺伝子から生産されるメッセンジャーＲＮＡと相補的な配列を持つＲＮＡ又はＤＮＡを細胞内に供給することによりメッセンジャーＲＮＡとアニーリングし、部分的に二重鎖の核酸を形成し、メッセンジャーＲＮＡから蛋白へと翻訳されるのを阻害する。このアンチセンスＲＮＡは適当なプロモーターによって細胞内で生産させることができるが、アンチセンスＤＮＡは一重鎖ＤＮＡであるがゆえにインビボでの生産は難しく、合成したＤＮＡをアンチセンスＤＮＡとして細胞の外から供給し、遺伝子制御効果を見るにとどまっている。
【０１６６】
次に三重鎖ＤＮＡ形成能を持つ核酸に関して述べると、例えばプリン塩基（ＧあるいはＡ）、他方に相補的なピリミジン塩基（ＣあるいはＴ）が並んだ二重鎖のポリプリン、ポリピリミジン配列に対してはHoogsteen 型の結合を介して三本目の鎖が形成し、部分的に三重鎖になることが知られている。この三本目の鎖が三重鎖形成能を持つ核酸であり、遺伝子の制御ばかりではなく遺伝子工学的にも様々な応用例が提唱されている。しかし、実際に遺伝子の発現の調節という観点から治療法へと結びつけるにあたり、この三重鎖形成能を持つ核酸を細胞内で生産させることはアンチセンスＤＮＡ同様難しく、合成ＤＮＡを細胞の外から供給し遺伝子制御の効果を見るにとどまっている。
【０１６７】
インビトロの系においてアンチセンスＤＮＡ、三重鎖形成能を持つＤＮＡを生成させることは、最近のＤＮＡ合成機の進歩によってもはや簡単に作ることができるようになった。しかし、インビボの系においてこのような一重鎖ＤＮＡを人為的に生産させることはｍｓＤＮＡを除いて知られていない。しかし、ｍｓＤＮＡは細胞内でmRNAを生成させ逆転写酵素によって一重鎖ｃＤＮＡを合成するもので、その生成過程の複雑さから応用面に至ることが非常に難しい。
【０１６８】
一方、アンチジーンを有するｓｌＤＮＡはインビボで生成させるにあたりｍＲＮＡの中間体を介さずに直接二重鎖のＤＮＡから一重鎖ＤＮＡを生成させ、それを遺伝子制御に応用させ得る。
【０１６９】
遺伝子が複製する際にその複製方向の途中に逆方向反復配列（ＩＲ配列）が存在すると、第一鎖ＤＮＡ合成がそのＩＲ配列内でそれまで鋳型としていたＤＮＡとは別の同じＩＲ配列を持つ鋳型ＤＮＡとアニーリングし、そこから第二鎖のＤＮＡ合成が始まり複製開始点に向かって合成が進む。そして適当な転写終結部位においてＤＮＡ合成が終わり、第一鎖ＤＮＡ合成の際に鋳型とした遺伝子からｓｌＤＮＡとして遊離する。ｓｌＤＮＡはループを形成している部分及び３′末端または５′末端が一重鎖構造を有していて、アンチセンスＤＮＡまたは三重鎖形成能を持つＤＮＡはこれらの部位にその塩基配列を入れることができる。すると遺伝子が複製する過程においてこれらアンチジーンの配列を持つｓｌＤＮＡが生成され、インビボの系においてもアンチセンスＤＮＡ、または三重鎖形成能を持つ一重鎖ＤＮＡを生成させることができる。
【０１７０】
アンチセンスＤＮＡ配列を持つｓｌＤＮＡはターゲットのＲＮＡとアニーリングし、その遺伝子機能を阻害するばかりでなく、アンチセンスＤＮＡを持つｓｌＤＮＡとアニーリングしたターゲットＲＮＡは通常細胞内に内在するＲＮａｓｅＨによって分解されていく。
【０１７１】
三重鎖形成能を持つＤＮＡを含むｓｌＤＮＡも遺伝子が複製する際ｓｌＤＮＡとして生産されるのでインビボで常時三重鎖形成能を持つ一重鎖ＤＮＡが生産され、該ＤＮＡによるターゲット遺伝子の二重鎖ＤＮＡの制御が可能となる。
【０１７２】
次に、実際にアンチセンスＤＮＡまたは三重鎖形成能を持つＤＮＡといったアンチジーンをｓｌＤＮＡ内に組み込み、発現させる方法について詳細に説明する。
【０１７３】
まずｓｌＤＮＡのループ内にアンチジーンを入れるには、例えばプラスミドを用いてｓｌＤＮＡを生成させる場合にはプラスミドの複製方向の途中にＩＲ配列を挿入し、アンチジーン配列は二つの反復配列の間にクローニングすればよい。そしてこのプラスミドで細胞を形質転換することによって、このプラスミドを持つ細胞はプラスミドが複製する際にアンチジーンを持つｓｌＤＮＡを生産し続ける。
【０１７４】
またｓｌＤＮＡはその生産過程において、５′末端のプライミング位置と転写終結部位とが異なる場合が多く、５′末端または３′末端が突出した構造をとっている。そこでこの突出した部分にアンチジーンを挿入することができる。ｓｌＤＮＡの３′末端または５′末端の突出した部分にアンチジーンの入ったｓｌＤＮＡを生産させるには、ＩＲ配列を含むプラスミドのｓｌＤＮＡが複製を開始する部分と転写終結する部分の間にアンチジーンの配列をクローニングすればよい。そしてこのプラスミドで細胞を形質転換しｓｌＤＮＡを生産させると、ｓｌＤＮＡの５′末端または３′末端のいずれか突出した部分にアンチジーンの配列の入った一重鎖ＤＮＡが生成する。
【０１７５】
ｓｌＤＮＡは原核生物である大腸菌で発見されたが、真核生物である酵母においてもｓｌＤＮＡは生産され、アンチジーンを持つｓｌＤＮＡが様々な真核細胞（例えば動物細胞）においても生産され、遺伝子制御に用いることができる。
【０１７６】
本発明が技術と科学に有為な貢献をすることは認められるであろう。
【０１７７】
以上に述べたように、ｓｌＤＮＡは価値ある遺伝的構築物である。したがって、こうしたｓｌＤＮＡを、これまで達成しえなかった収率で生成するという重要な必要性が存在するのである。
【０１７８】
本発明は、ｓｌＤＮＡを高収率で発現する方法ならびに遺伝的構築物を提供するものである。従来記載されてきた態様の方法では、組換え型ＤＮＡのビークルの複製起点からの複製を開始するプライマーの内在的レベルによって、ｓｌＤＮＡの生成レベルが決定かつ制限されていた。本発明のこの実施態様では、最良の結果をうるべく、組換え型ＤＮＡ構築物が、ビークルの複製を制御する遺伝的要素とは独立に作動する一群の要素を含む系を構築した。この系、すなわち一群の要素では、ｓｌＤＮＡ合成に関わるプライマーの細胞でのソベルが劇的に上昇しているので、価値あるｓｌＤＮＡの合成が高率で開始され、高収率で発現される。
【０１７９】
ｓｌＤＮＡは原核生物あるいは真核生物で発現させることができる。細胞の発現方法は、ｓｌＤＮＡの発現を誘導しうる、組換え型ＤＮＡが自己複製可能なビークルで形質転換した原核生物あるいは真核生物の宿主を培養する工程からなるものである。この組換え型ＤＮＡビークルは、以下の要素が作動可能に連結されたものである。すなわち、このビークルは、誘導可能なプロモーター、好ましくは強力なプロモーター−オペレーターをコードするＤＮＡ配列を含んでおり、この誘導可能なプロモーターが誘導されると、ＲＮＡプライマーあるいはタンパク質、たとえばプライマーゼのような酵素が生成され、このＲＮＡプライマーあるいはタンパク質が、宿主細胞に内在する適当な基質ならびにＤＮＡポリメラーゼを利用したｓｌＤＮＡの合成を開始するべく機能する。さらに、このビークルは、ＲＮＡプライマーあるいはプライマーゼをコードしているＤＮＡ配列の下流側に、逆方向反復配列を有している。さらに、この組換え型ＤＮＡビークルは、ＤＮＡビークル自体の複製に際して機能する複製起点、ならびに選択を可能とするマーカー、たとえば、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を有している。
【０１８０】
本発明の好適実施態様では、ｓｌＤＮＡの合成の開始は、組換え型ＤＮＡビークルの複製に付随、あるいは依存するものではない。しかし、本発明は、ｓｌＤＮＡの合成を開始するプライマーがプラスミドの複製も開始するように組換え型ＤＮＡビークルを構築することも包含するものである。
【０１８１】
一本鎖部分にアンチジーン断片を含むｓｌＤＮＡを過剰発現させようとする場合には、複製可能なビークルは、二つの反対向きの逆方向反復配列の間、あるいはｓｌＤＮＡの合成開始に際して使用されるプライミング部位と逆方向反復配列との間にアンチジーン断片を有するものとする。かくして、アンチジーン断片を保持するｓｌＤＮＡが高収率で生成されることとなる。
【０１８２】
ＲＮＡプライマーあるいはプライマーゼタンパク質をコードしているＤＮＡ断片の発現を誘導するうえで有用な誘導可能なプロモーターとしては、たとえば、ＳＶ４０の初期あるいは後期プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃあるいはＴＲＣプロモーター、λファージの主要なプロモーター、たとえばλｐｌ、λｐｒなど、ｆｄコートタンパク質のプロモーター、ｅ−ホスホグリセレートキナーゼ等の解糖酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、酵母交配因子のプロモーターをはじめとする、真核生物あるいは原核生物の細胞、またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御していることが既知の種々の配列を挙げることができる。ｓｌＤＮＡを哺乳動物の細胞で発現しようとする場合には、遺伝子をデヒドロ葉酸還元酵素をコードしている遺伝子に結合し、所望の遺伝子を増幅することとなる細胞の選択を行うことによって、発現単位を増幅することも可能である。
【０１８３】
有用なプロモーターは、適当な誘導物質で誘導することが可能である。たとえば、ｌａｃならびにｔａｃプロモーターは、ＩＰＴＧで誘導され、λｐｌあるいはλｐｒプロモーターの発現を誘導する際には、マリディクシック（malidixic ）酸が一般に使用される。こうした組み合わせは、当業界で他にも公知である。たとえば、下記で引用するコーンバーグ（Kornberg）の「ＤＮＡレプリケーション（DNA Replication）」、ならびに「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology ）」、アウスベット（Ausubet ）ら、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（John Wiley ＆Sons，Inc.）、１９９４（「カレント・プロトコール（Current Protocols）」）を参照されたい。
【０１８４】
真核生物、たとえば上述のような酵母細胞、あるいは哺乳動物の細胞中でｓｌＤＮＡを過剰発現しようとする場合には、酵母細胞の複製系がｓｌＤＮＡの合成系とは分離され、酵母細胞から発現されるｓｌＤＮＡが、酵母細胞の複製より高レベルかつ高速に、しかも酵母細胞の複製とは独立に発現される、上述のようなプロトコールを使用するものである。各種の適切な技法、ならびに酵母の分子生物学については、「ガイド・トゥ・イースト・ジェネティクス・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology ）」、ガスリーら（Guthrie および Fink ）編、アカデミック・プレス社（Academic Press ，Inc.）、ならびにメソッズ・イン・エンザイモロジー（ Methods in Enzymology）、１９４巻、１９９１をはじめとする本明細書に引用した参考文献を参照されたい。また、「エキスペリメンタル・マニピュレーション・オブ・ジーン・エキスプレッション（Experimental Manipulation of Gene Expression）」、井上（ Masayori Inouye）編、アカデミック・プレス（Academic Press ）、１９８３の全体ならびに第５章、「ベクターズ・フォー・ハイ・レベル，インダストリアル・エキスプレッション・オブ・クローンド・ジーンズ・イン・イースト（Vectors for High Level , Inducible Expression of Cloned Genes in Yeast ）」も参照されたい。
【０１８５】
図１７および１８は、本発明の好適な構築物を構成するプロトコールを例示するものである。図１７に示すように、ｓｌＤＮＡの合成を開始するべく機能するプライミング部位は、プラスミド、たとえば図１７のｐＵＣ１９の複製起点から誘導される。しかし、その最終形態では、このプライミング部位が、ｓｌＤＮＡをコードする組換え型ＤＮＡビークルの複製において機能することはなく、組換え型ＤＮＡビークルはそれ自身の機能的な複製起点を有している。
【０１８６】
他の複製起点を使用してｓｌＤＮＡの合成を誘導することもでき、例としては、ｐＭＢ１、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６−５、ｍｉｎｉ Ｆ、Ｒ１、Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、Ｒｔｓ１、ＲＫ２、Ｐ１、ＣｏｌＥII、ＣｏｌＥIII 、ｐ１５Ａ、Ｔ４バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、ＲＳＦ１０３０、ｐＢＲ、ならびにｐＵＣを挙げることができる。
【０１８７】
当業界でも周知のように、こうした複製起点の中には、効率良く作用するうえでタンパク質を必要とするものがある。合成開始のプライミング部位がこうした複製起点に由来する場合に、誘導可能なプロモーターを、こうした状況において、この種のタンパク質の発現を誘導しうるものとすることも、本発明の範囲に包含される。本発明は、フライミング部位を、図１７に示した以外の複製起点から誘導する場合も包含するものである。使用が可能な図１７以外の複製起点としては、ｐＭＢ１、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６−５、ｍｉｎｉ Ｆ、Ｒ１、Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、ＲＴｓｌ、ＲＫ２、Ｐ１、ＣｏｌＥII、ＣｏｌＥIII 、ｐ１５Ａ、ＲＤＦ１０３０、Ｔ４バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、ｐＢＲ、ならびにｐＵＣがある。また、本発明は、組換え型ＤＮＡビークルの複製を誘導する機能的複製起点を、図１７に示したｐ１５Ａ以外のものとすることも包含するものであり、こうした複製起点としては、ｐＭＢＩ、ＣｏｌＥl 、ｐＳＣ１０１、Ｒ６−５、ｍｉｎｉ Ｆ、Ｒ１、Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、ＲＴｓｌ、ＲＫ２、Ｐ１、ＣｏｌＥII、ＣｏｌＥIII 、Ｔ４バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、ｐ１５Ａ、ＲＳＦ１０３０、ｐＢＲ、ならびにｐＵＣがある。当業界では、これら以外にも各種の複製起点が知られている。「ＤＮＡレプリケーション（DNA Replication）」、オックスフォード大学出版局（Oxford University Press ）、１９９１；「ＤＮＡレプリケーション（DNA Replication）」、W. H. コーンバーグ（Kornberg ,W. H. ）、フリーマン・アンド・カンパニー（Freeman and Company ）、１９８０。
【０１８８】
出発プラスミドとしては、ｐＵＣ１０６以外にも、適切な複製起点を有するものが多数あり、例として、たとえば、ｐＭＢ１、ＣｏｌＥｌ、ｍｉｎｉ Ｆ、Ｒ１、Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、Ｒｔｓｌ、ＲＫ２、Ｆ、Ｐ１、Ｔ４バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、ＣｏｌＥII、ＣｏｌＥIII などを挙げることができる。
【０１８９】
ＤＮＡ組換え型ビークルで形質転換あるいはトランスフェクションした宿主を培養する方法は周知である。こうした方法では、宿主を適当な成長条件で培養し、所望のｓｌＤＮＡを培養から集める。本明細書に引用した「カレント・プロトコール（Current Protocols）」を参照されたい。
【０１９０】
好適実施態様の詳細な説明
本発明の好適実施態様は、図１７および１８を参照することによって容易に説明することができる。
【０１９１】
図１７からわかるように、構築物である組換え型ＤＮＡビークルｐＨＳ２７８０は、機能的複製起点ｐ１５Ａ、すなわち、プラスミドの複製に際してともに機能する開始プライマーＲＮＡＩ、ＲＮＡII、ならびにＲＯＰタンパク質をコードしているプラスミドの領域を有している。図からわかるように、ｐ１５Ａ Ｏｒｉ領域は、ｐＳＴＶ２８に由来するものである。
【０１９２】
この一組の要素は、プラスミド自体の複製をつかさどるものであって、ｓｌＤＮＡの合成を誘導するものではない。ｓｌＤＮＡを合成する機能を担っているのは、プラスミドの複製とは独立にｓｌＤＮＡの合成を誘導する一組の要素である。この一組の要素は、誘導されると逆方向反復配列の上流側に位置するプライマーを生成する、誘導可能な強力なプロモーター−オペレーターを有している。またこのプロモーター−オペロンの下流側に隣接して、このプラスミドは、ｓｌＤＮＡの合成を開始するＲＮＡプライマー、たとえばＲＮＡIIあるいはタンパク質、たとえば上述のプライマーゼをコードするＤＮＡ断片を有している。このＤＮＡ断片の下流には、上述したようにｓｌＤＮＡの合成に関わり、ｓｌＤＮＡの一部を構成する逆方向反復が位置している。ｓｌＤＮＡがアンチジーンを有していることが望ましい場合には、このアンチジーンは、逆方向反復の上流側、かつプライマーをコードするＤＮＡの下流側、すなわちこれらの２要素の間、あるいは逆方向反復配列の二つの反対向きのセグメントの間に、たとえば適当な制限部位への挿入によって位置させるものとする。上述したように、このアンチ遺伝子は、標的ｍＲＮＡにアニーリングして、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害するか、あるいは、ｄｓＤＮＡと結合して三重らせんを形成することによって、標的ＤＮＡの発現を阻害することのできる断片である。
【０１９３】
こうした説明から明らかなように、ｓｌＤＮＡの合成に際して作動する諸要素は、プラスミドの複製を制御する諸要素とは異なった各種の遺伝的構築物を起源としうるものであるが、必ずしもそうでなくともかまわない。
【０１９４】
本明細書に教示するように、本発明は、ｓｌＤＮＡを、プラスミド自体の複製とは独立に合成するプラスミドを構築するにあたっての一般的なスキームを提供するものである。このスキームでは、ｓｌＤＮＡの合成に関与し、ｓｌＤＮＡのステムを構成する所望の長さの逆方向反復配列を含むＤＮＡ断片が、任意所望の複製可能なビークルに挿入される。したがって、本発明では、プラスミド自体の合成とは独立に、またプラスミド自体の合成より過剰となるように、ｓｌＤＮＡの複製を調節することが可能となるものである。
【０１９５】
本発明は、例示した特定の構築物、あるいは機能的要素の起源となる構築物に限定されるものではないことに留意することが肝要である。また、本発明は、特定のプラスミドに限定されるものでもなく、最終構築物に必要とされる遺伝的要素を提供するような任意の他のプラスミドあるいはビークルを選択することが可能である。
【０１９６】
また、本発明は、例示した特定の遺伝的要素に限定されるものでもない。当業者であれば、本発明の概念を本発明の一般的概念にしたがって実施する適当な手段を容易に構築しうるはずである。
【０１９７】
以上では、本発明の実施態様をいくつか記載した。以上の記載から、本発明の教示内容を利用することによって、ｓｌＤＮＡのような一本鎖分子を過剰発現するのと実質的に同一の結果をもたらすもっと別の実施態様も利用可能となることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明のプラスミド、ｐＵＣＫ１０６の説明図である。
【図２】図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａＩ部位に挿入された２１５−ｂｐのＤＮＡ塩基配列を示す。
【図３】図３Ａ，３Ｂ，３ＣはｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成とその特徴とを説明するポリアクリルアミドゲルの臭化エチジウム染色を示す。
【図４】図４Ａ，４Ｂ，４ＣはｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのダイマー形成を説明するポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。
【図５Ａ】図５ＡはｓｌＤＮＡの５′端部のＤＮＡ塩基配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂの左側はｓｌＤＮＡのループ部分の５′端部塩基配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。図５Ｂの右側はｓｌＤＮＡのループ部分の３′端部塩基配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
【図５Ｃ】図５ＣはｓｌＤＮＡの３′端部のＤＮＡ塩基配列の乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
【図５Ｄ】図５ＤはｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの構造を説明する。
【図６Ａ】図６ＡはｓｌＤＮＡ合成の二つの可能なモデルのうちの一つを説明する図である。
【図６Ｂ】図６ＢはｓｌＤＮＡ合成の二つの可能なモデルのうちの他の一つを説明する図である。
【図７】図７のレーン１と３はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体（digest）を示し、レーン２はｐＵＣ７からのｓｌＤＮＡを示す。
【図８】図８はｓｌＤＮＡを利用して、特定の遺伝子にランダムミューテーションを導入する具体例を示す。
【図９】図９はプラスミドｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．、ｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−Ｉ、及びｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−IIを説明する図である。
【図１０】図１０はプラスミドｐＸＸ５６６の構築図である。
【図１１】図１１は実施例９−（３）におけるアンピシリン濃度とコロニー数の関係を示す図である。
【図１２】図１２はプラスミドｐＵＣＫＡ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．、ｐＵＣＫＡＧＴ３７、及びｐＵＣＫＡＣＡ３７を説明する図である。
【図１３】図１３はプラスミドｐＭＳＴＲ３７に挿入されている塩基配列及びプライマーの位置を示す図である。
【図１４】図１４はプラスミドｐＹＥＳ２−８−１０６及びｐＹＥＳ２−９−１０６の構築図である。
【図１５】図１５はｐＹＥＳ２−８−１０６，ｐＹＥＳ２−９−１０６、及び生産されたｓｌＤＮＡをＳａｌＩで切断したときの生成断片を説明する図である。
【図１６】図１６はｓｌＤＮＡの検出に用いた３種のプライマーの位置を示す図である。
【図１７】図１７は、本発明のｓｌＤＮＡを過剰発現させるための複製可能なビークルを構築する過程を示す模式図である。
【図１８】図１８は、最終構築物であるｐＨＳ２８７０を示す。
【図１９】図１９は、構築物ｐＨＳ２８７０（約４８０ｂｐ）と、このｐＨＳ２８７０のＨｉｎｄIII 制限部位に塩基４９個のＨｉｎｄIII 断片を挿入することによって構築されるｐＨＳ２８７０ＧＴと称されるプラスミド（約５００ｂｐ）の構築過程を示す模式図である。
【図２０】図２０は、ｐＨＳ２８７０ならびにｐＨＳ２８７０ＧＴから抽出したｓｌＤＮＡの電気泳動を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、大腸菌ＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′の構築過程を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、大腸菌ＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′の構築過程を示す。
【図２２】図２２は、β−ガラクトシダーゼの発現レベルの検出を示す。
【参考文献】
【配列表】
関連出願
本出願は、オオシマ ( Ohshima )等によって１９９３年３月１日に出願された「一本鎖ステム−ループＤＮＡの合成方法、その生成物、ならびにその使用」という名称の係属中の米国特許出願第０８／０２４６７６号の一部継続出願であり、この米国特許出願第０８／０２４６７６号はさらに、「一本鎖ステム−ループＤＮＡの合成方法、その生成物、ならびにその使用」という名称の係属中の米国特許出願第０７／７５３１１１号の一部継続出願である。本明細書は、これらの２件の特許出願（親出願）の双方の一言一句を、それらの各件が以下に全編にわたって再度記載されているかのごとく、明確に包含するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は組換え体ＤＮＡの分野に関する。さらに詳しくは、本発明はステム−ループ配列（ｓｓ−ｓｌＤＮＡ）を有する新規で有用な一重鎖ＤＮＡの合成方法に関する。本発明はインビトロ及びインビボ合成方法に関する。さらに本発明はこれらのｓｓ−ｓｌＤＮＡを製造する複製ビークル ( replicating vehicle )に関する。さらに、本発明はこれらの新規な構造物に関し、これらの新規な構造物の使用を開示する。さらに、標的タンパク質をコードする遺伝子を用いた、または用いないｓｓ−ｓｌＤＮＡ増幅方法をも開示する。さらにはまたｓｓ−ｓｌＤＮＡを用いた遺伝子制御方法を開示する。
【０００３】
背 景
逆転写酵素によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと逆転写されるRNA 中間体を介して、ゲノムの一部の重複が生ずることが判明している。この点については、ワイナー（Weiner）等のアニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー (Ann. Rev. Biochem. )５５、６３１（１９８６）を参照されたい。結果として遺伝情報が逆流することは真核ゲノムの進化の多様化に重要な役割を果すと考えられる。細菌由来の逆転写酵素が最近発見されたことを考慮すると、同様な機構が原核生物におけるゲノム進化の原因であるとみなされるのも非常にもっともなことだと思われる。この点についてはイノウエ（Inouye）等のＴＩＢＳ、１６、１８（１９９１ａ）とイノウエ等による、アニュアル・レビュー・オブ・マイクロバイオロジー（Ann. Rev. Microbiol.）４５、１６３（１９９１ｂ）を参照されたい。逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成の結果生ずる遺伝子重複は進化中のゲノムの多様化に重要な役割を果していると考えられる。
【０００４】
本発明はゲノム進化に関連する基礎研究に伴って生じたものである。プラスミドＤＮＡの複製に特有のｓｓ−ｓｌＤＮＡの合成が実証された。ｓｌＤＮＡの形成は原核ならびに真核生物の染色体ＤＮＡ複製時に広く行われる。ＩＲ構造を伴う染色体遺伝子要素は、ＩＲ構造の安定性とポリメラーゼの性質によっては常にｓｌＤＮＡへと複製しやすいと考えられる。
【０００５】
反復遺伝子外パリンドローム塩基配列に対してはＲＥＰとして知られ、パリンドローム単位に対してはＰＵとして知られる多くの逆方向反復（ＩＲ）構造が存在する（大腸菌（E. coli.）中には約１０００コピー）ことが判明している〔ヒギンス（Higgins ）等のネイチャー（Nature）２９８、７６０（１９８２）、ギルソン（ Gilson ）等、エンボ・ジャーナル（EMBO. J.）３、１４１７（１９８４）及びギルソン等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl. Acids. Res. )１９、１３７５（１９９１）〕。これらの構造はＤＮＡポリメラーゼＩを含む特定の細胞成分と会合して、染色体組織に重要な役割を果すと考えられる〔ギルソン等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ１８、３９４１（１９９０）とギルソン等、エンボ・ジャーナル３、１４１７（１９８４）参照〕。ヒトゲノムの約６％がＡｌｕと呼ばれる要素によって占められ、Ａｌｕの転写生成物は実質的な第二構造を含むことが判明している〔シメット（Simmett ）等のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）２６６、８６７５（１９９１）参照〕。
【０００６】
ｓｌＤＮＡ合成はｃＤＮＡ合成とは対照的にRNA 中間体も逆転写酵素活性も必要としないので、ｓｌＤＮＡはｃＤＮＡよりも頻繁に形成される。従って、ｓｌＤＮＡはゲノム内に分散または再配置された遺伝子要素を重複させることによって、原核生物を真核生物の両方のゲノム進化においてｃＤＮＡと同様な、重要な役割を果すと考えられる。
【０００７】
親出願は、双方とも、新規な一本鎖ＤＮＡ構造物であるｓｌＤＮＡのインビボならびにインビトロでの合成方法、ｓｌＤＮＡ構造物、ならびに他の各種の遺伝的構造物に関するものである。これらの親出願は、一本鎖部分にアンチ遺伝子を保持しているｓｌＤＮＡにも関するものであり、このアンチジーンは、標的ｍＲＮＡと結合してｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害したり、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡと結合して三重らせんを形成し、標的ＤＮＡの発現を阻害したりするアンチセンスとなることができる。
【０００８】
本発明は、一本鎖ＤＮＡ分子、特に、ｓｌＤＮＡ分子をこれまで達成しえなかった高収率で過剰発現させることに関わるものであり、こうした製造を行う方法、ならびにこうした目的を達成するための遺伝的構築物に関するものである。
【０００９】
（上述の）ｓｌＤＮＡ構造物は、一本鎖のループと、二重となった一本鎖の相補的な塩基からなる尾部から構成されている。この尾部は、単一の５′末端と、単一の３′末端で終端しており、一方の末端がもう一方の末端からさらに延びて一本鎖のオーバーハング部となっていてもよい。
【００１０】
一本鎖の分子は不安定なことで有名であるという事実からしても、本発明で一本鎖の構造物がこのような高収率で生成しえたことは予期せざることであった。
【００１１】
本発明の概要
本発明によって、基本的な発見がなされた。ゲノムの一部はゲノムから直接複製されることが判明した。判明したこの遺伝子複製はＲＮＡ中間体も逆転写酵素も必要とせず、ＤＮＡ複製中に生ずる。
【００１２】
簡単に説明すると、本発明は新規で有用な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子の合成方法（又はプロセス）を提供する。この方法は一重鎖構造の合成を開始するために、ＤＮＡ逆方向反復（ＩＲ）と必要な成分との使用を含む。本発明はまた、ＤＮＡ逆方向反復を含む必要な成分からのこのようなｓｓＤＮＡの合成系をも提供する。本発明はさらに、新規なｓｓＤＮＡ分子の合成のための必要な成分の全てを含む適切な複製ビークルを提供する。本発明はまた特有の構造を形成する新規で有用なｓｓＤＮＡ分子をも提供する。この構造は相補的塩基の二重鎖ＤＮＡからなるステムを含み、ステムはその端部の一つにおいて２個の末端、それぞれ３′と５′末端を有し、他方の端部ではループ形成ｓｓＤＮＡを有する。
【００１３】
本発明はインビトロまたはインビボでの方法及び系の実施を含む。
【００１４】
本発明はまた改良された又は新規な生物学的性質を有するタンパク質を形成する目的で遺伝子にランダムな突然変異を起こさせる方法を含めて、新しい分子の種々な使用を開示する。他の重要な考えられる使用法は、本発明ｓｓＤＮＡ分子をＤＮＡに加えて、安定性の高い三重鎖ＤＮＡを形成することである。また本発明ｓｓＤＮＡ分子のアンチセンスＤＮＡとしての使用である。他の使用法は単一プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用である。
【００１５】
本発明とその幾つかの実施態様を下記でさらに詳述する。
【００１６】
本発明の方法によるとｓｓＤＮＡ内のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡのステム部分を含む構造を有するｓｓＤＮＡ分子が製造される。このステムはその端部の一つにおいてｓｓＤＮＡ分子の５′と３′末端を形成し、他端部において２本のステム一重鎖を結合する非アニール塩基の一重鎖からなるループを形成する。特定の実施態様では、３′末端を端部に有する鎖は他方の鎖よりも長い。ｓｌＤＮＡはタンパク質をコードしうるＤＮＡセグメント、特に遺伝子を含みうる。遺伝子はループと末端との間に配置される。遺伝子は突然変異を有する遺伝子でありうる。
【００１７】
ｓｌＤＮＡ合成に対して仮定される機構を図６のＡと図６のＢに示す。この合成は概略的に下記の過程を含むと考えられる：ＤＮＡの合成は複製開始部位にて始まり、第１鎖（または“特定”もしくは“不特定”鎖）の複製は２本鎖ＤＮＡの鎖の一方を鋳型として進行する（染色体ＤＮＡの複製と同じ機構によって）〔トミザワ ( Tomizawa ) 等、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、７４、１８６５（１９７７）参照〕、そしてプラスミドを用いる場合には、ＩＲ構造を通しての進行は全プラスミドの複製を生ずる。しかし、以下で詳述するように、第１鎖合成が中断するまたはＩＲ内で終了した場合に、第１鎖の一部はループ構造を形成する（図６、工程２〜３）。このループは連続ＤＮＡ合成のプライミング部位として機能する短い二重鎖部分を形成する。ＤＮＡ鎖伸長は新たに形成された３′端部から再開し、テンプレートとして発生期の第１鎖を用いて第２鎖（または“他方の”鎖）を形成する。代替えの（または同時発生の）考えられる合成過程は以下で説明する。このようにして、テンプレート切換えによってＤＮＡ合成方向は逆になり、ＤＮＡフラグメントを二重にする（図６、工程１〜４）。新しく合成されたｓｌＤＮＡ分子は親テンプレート鎖から解離され、親テンプレート鎖は他の複製ラウンドを受けて他のｓｌＤＮＡを形成する。ｓｌＤＮＡを必要に応じて単離して精製する。
【００１８】
本発明の他の実施態様では、ＤＮＡ自己複製ビークル（self - replicating vehicle）、例えば逆方向反復（ＩＲ）構造を含むＤＮＡフラグメントを挿入されたプラスミドを提供する。このＤＮＡフラグメントはｓｓＤＮＡ合成のテンプレートとして、及び適当なプライミング部位、例えば大腸菌におけるＣｏｌＥ１の複製始点として働く。ＩＲはＯＲの下流に存在する。自己複製ビークルは適当なホスト（例えば大腸菌）中で複製される。ホストは少なくとも１種のポリメラーゼを含んでテンプレートからｓｓＤＮＡを合成する。この特定の実施態様では、２種のポリメラーゼ、ＯＲからＩＲまでのｓｓＤＮＡ部分、第１鎖の伸長に寄与する第１ＤＮＡポリメラーゼと、ｓｓＤＮＡ鎖の残部もしくは第２鎖を合成する第２ＤＮＡポリメラーゼが存在すると推定される。第１鎖の合成が終了すると、相補的塩基がアニールされて一重鎖非アニールループを形成する。その後に第２鎖の合成が行われる。二重鎖ＤＮＡステムと反対端部の一重鎖ループ構造とからなる、新しいＤＮＡ構造が合成される。この新しいＤＮＡ構造に対して“ステム−ループ”または“ｓｌＤＮＡ”なる名称が設けられている。
【００１９】
他の特定の実施態様はプロモーター、特にｌａｃプロモーター−オペレーターが欠如した複製ビークルを提供する。それでもなお、以下で詳述するように、提案した合成モデルを支持してｓｌＤＮＡが製造された。
【００２０】
プライミング部位とＩＲとの間のタンパク質をコードしうる特定のＤＮＡ配列を含むようにプラスミドを構成することができ、合成されたｓｌＤＮＡはＤＮＡ塩基配列またはその突然変異を含むと考えられる。
【００２１】
また、本発明はｓｌＤＮＡを用いた遺伝子制御方法を提供する。前記方法はＤＮＡポリメラーゼ合成に必要な要素を含有し、そして
（ａ）そのストランドの片方が、プライミング部位および前記プライミング部位の下流に逆方向反復配列（ＩＲ）を含有する鋳型ＤＮＡである二重鎖ＤＮＡであって、前記鋳型ＤＮＡ中に、その転写物が遺伝子の機能を調節するＤＮＡ配列が挿入されている二重鎖ＤＮＡ、
（ｂ）前記鋳型にＤＮＡの重合を開始させるプライマー、および
（ｃ）前記鋳型からｓｌＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼ、
からなる系において、
ステムが、ＩＲを含有し、ｓｓＤＮＡ内のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡで構成され、そして一方の端部でｓｓＤＮＡ分子の５′と３′の末端を形成し他方の端部で前記二重鎖ＤＮＡの反対側の両末端を結合するＤＮＡの一本鎖ループを形成する構造内に、遺伝子の機能を制御するＤＮＡ配列を含有する新規な安定した人工のｓｌＤＮＡを用い、そして
（１）前記鋳型にＤＮＡの重合を開始させ、
（２）前記ＤＮＡの二本鎖のうち一方を鋳型として用いてプライマーからｓｓＤＮＡを合成し、ＤＮＡ合成をＩＲ配列中に続け次いで合成をＩＲ配列内で停止し、
（３）ＩＲ配列において新しく合成されたストランド内の相補的塩基をアニールして、非二重鎖領域のループおよびそのループのネック部分に二重鎖領域を形成させ、その二重鎖領域がＤＮＡの合成を続けるためのプライミング部位として機能し、
（４）前記ＤＮＡの新しく合成されたストランドおよび／または他方のストランドを鋳型として用いてＤＮＡ合成を再開し、次いで
（５）ｓｌＤＮＡを生成する、
ステップからなることを特徴とする。
【００２２】
本発明のｓｌＤＮＡは自己複製ビークルによって合成される必要はなく、ＩＲと、ｓｓＤＮＡ合成に必要な要素とを含む、線状もしくは非線状のＤＮＡセグメントから構成される適当なインビトロ系で合成されることができる。このような系を以下で説明する。
【００２３】
【実施例】
下記実施例は説明のためのものであり、本発明の如何なる限定もを意図しないものである。これらの実施例では、全ての％は固体では重量％であり、液体では容量％であり、全ての温度は、他の注釈しないかぎり、摂氏度によるものである。なお、下記実施例において用いられるプラスミドｐＵＣＫ１０６はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受け入れ番号No.６８６７９として寄託されており、プラスミドｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯはＡＴＣＣによって受け入れ番号No.６８６８０として寄託されている。
【００２４】
便利さと簡潔さのために、実施例は図面に関連し、図面の詳細な説明を提供する。
【００２５】
実施例 １
図１はｐＵＣＫ１０６（円形マップ）、以下に示すように製造した特定のプラスミドを説明する。円形マップ中の白抜きバー（open bar ）はカナマイシン耐性遺伝子（Ｔｎ５から）を表す。上部右側に示す直線白抜きバーはＸｂａＩ部位に挿入した２１５−ｂｐＤＮＡフラグメントを表し、これは３５−ｂｐ逆方向反復（ＩＲ）塩基配列を含有している。中実矢印（solid arrow )はＩＲ構造を示す。中実円設定は複製の始点（Ori ）である。長い白抜き矢印ＯＲからのＤＮＡ複製の方向を示す。小さい白抜き矢印はｌａｃプロモーター−オペレーター（ｌａｃＰＯ）の位置を示す。
【００２６】
図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａＩ部位に挿入された、配列表の配列番号１及び配列番号２でそれぞれ表されるＤＮＡより構成される２１５−ｂｐＤＮＡフラグメントの塩基配列を示す。このプラスミドはここではｐＵＣＫ１０６と名づける。白抜き矢印はＩＲ塩基配列を示す。ＨｉｎｄIII （ＡＡＧＣＴＴ）部位はＩＲの中心を示す。
【００２７】
ＩＲ中の不適正位置はスペース内に挿入された不適正塩基ＣとＴを含む矢印内の２個の白抜きスペースによって示す。
【００２８】
上記ＤＮＡフラグメント（ＩＲを含む）は図２に示された配列を有する。
【００２９】
実施例 ２
この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成とその特徴とを説明する。
【００３０】
（Ａ） 大腸菌ＣＬ８３をｐＵＣＫ１９，ｐＵＣＫ１０６のいずれかとｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯとによって形質転換し、プラスミドＤＮＡ画分を形成した。ＤＮＡ標本（リボヌクレアーゼＡ処理後）を電気泳動のために５％アクリルアミドゲルに塗布した。ゲルを臭化エチジウムによって染色した。図３のＡにおいて、レーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体を示す。レーン２はｐＵＣＫ１９を収容する細胞からのＤＮＡ標本；レーン３はｐＵＣＫ１０６；レーン４はｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯを示す。ｐＵＣＫ１９はｐＵＣ１９のカナマイシン変異体である。
【００３１】
（Ｂ） ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、次に種々の制限酵素消化を行った。消化体をポリアクリルアミド（５％）ゲル電気泳動によって分析し、ゲルを臭化エチジウムによって染色した。図３のＢにおいて、レーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体；レーン２は消化されないｓｌＤＮＡ；レーン３はＸｂａＩによって消化されたｓｌＤＮＡ；レーン４はＨｉｎｄIII によって消化されたｓｌＤＮＡ；レーン５はＰｖｕIIによって消化されたｓｌＤＮＡを示す。
【００３２】
（Ｃ） ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの熱変性。精製ｓｌＤＮＡ（上記のような）を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１ｍＭ ＥＤＴＡ中に溶解した。このｓｌＤＮＡ溶液を沸とう水浴中で３分間インキュベートし、氷浴中で急冷した。サンプルをＡに述べたように分析した。図３のＣにおいて、レーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体；レーン２は熱処理なしのｓｌＤＮＡ；レーン３は熱変性後に急冷したｓｌＤＮＡを示す。
【００３３】
このｓｌＤＮＡは、塩基５３個のループ、塩基約４４０個のステム、ならびに塩基１５〜１８個のオーバーハングした３′尾部を有している。
【００３４】
実施例 ３
この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのダイマー形成を説明する。
【００３５】
（Ａ） 実施例２について述べたようなｐＵＣＫ１０６からの精製ｓｌＤＮＡを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ 中に溶解した。このｓｌＤＮＡ溶液を沸とう水浴中で３分間インキュベートしてから、徐々に冷却する。再結合 ( renatured )ＤＮＡをＸｂａＩによって消化させ、このようにして生じたＤＮＡフラグメントをそれらの末端において〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって標識した。これらの生成物を５％ポリアクリルアミドゲルに塗布した。電気泳動後に、ゲルを乾燥させ、このゲルにオートラジオグラフィーを実施した。
【００３６】
図４のＡにおいて、レーン１はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体；レーン２はサイズマーカーとしてのλＤＮＡのＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII 消化体；レーン３は処理なしのｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡ；レーン４は非処理ｓｌＤＮＡのＸｂａＩ消化体；レーン５は熱変性後に徐冷したｓｌＤＮＡ；レーン６はレーン５からのｓｌＤＮＡのＸｂａＩ消化体を示す。帯を右手側において“ａ”から“ｅ”までマークを付した。
【００３７】
（Ｂ） 図４のＡ中のフラグメント“ｄ”の特性化（図４のＢ）。フラグメント“ｄ”はゲルから精製した。レーン３は精製フラグメント“ｄ”のＨｉｎｄIII 消化体；レーン４では精製フラグメント“ｄ”は図３に関して述べたように熱変性し、急冷した。
【００３８】
（Ｃ） （Ａ）と（Ｂ）に示した“ａ”〜“ｂ”帯の概略図（図４のＣ）。ＸとＨはそれぞれＸｂａＩとＨｉｎｄIII を示す。ＸｂａＩ部位に非常に近接したバンド“ａ”中に２個の他のＨｉｎｄIII 部位があり、これはバンド“ｃ”中にある。これらのＨｉｎｄIII 部位は図示せず。
【００３９】
実施例 ４
この実施例はｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのＤＮＡ塩基配列の決定を説明する。
【００４０】
（Ａ） ｓｌＤＮＡの５′端部のＤＮＡ塩基配列の決定。単離、精製したｓｌＤＮＡ０．２μｇを鎖停止方法 (chain termination method )による塩基配列決定に用いた。始点（図５のＢ左側参照）から下流の配列９６−ｂｐに相当する配列表の配列番号３で表されるプライマー“ａ”（５′ＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧ３′）をプライマーとして用いた。
【００４１】
（Ｂ） ｓｌＤＮＡのループ部分の５′端部塩基配列の決定。ｓｌＤＮＡ０．５μｇをＳａｃIIによって消化させ、このようにして生じたＤＮＡフラグメントを５′端部において〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって標識した。約４０−ｂｐ移動したＤＮＡフラグメントを単離し、マキサム−ギルバート（Maxam − Gilbert）法によって塩基配列を決定した。
【００４２】
（Ｃ） ｓｌＤＮＡのループ部分の３′端部塩基配列の決定。ＳａｃII消化体ｓｌＤＮＡを末端デオキシヌクレオチジル転移酵素を用いて３′端部において〔γ−３２Ｐ〕ジデオキシＡＴＰによって標識した。ループ部分を含むＤＮＡフラグメントを単離し、マキサム−ギルバート法によって塩基配列を決定した。
【００４３】
（Ｄ） ｓｌＤＮＡの３′端部のＤＮＡ塩基配列。ｓｌＤＮＡをＡｆｌIII によって消化させた（図５のＤ参照）、５′端部を〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによって標識した。標識生成物を塩基配列決定用ゲルによって分離した。７６塩基移動した一重鎖ＤＮＡを単離し、マキサム−ギルバート法によって塩基配列決定した。図５のＣを参照すると、数字はｐＵＣＫ１９の始点からの残基数を表す。
【００４４】
（Ｅ） ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの構造。このｓｌＤＮＡは１１３７〜１１３９塩基の一重鎖ＤＮＡからなる。ｓｌＤＮＡの５′端部は不均一であるように見える；一部は＋１から開始し、他の部分は−１，＋２，＋３から開始する。＋１位置はＣｏｌＥｌ ＤＮＡ複製の始点に相当する。従って、種々のｓｌＤＮＡは異なる長さの５′末端鎖を有する。３′端部では１６塩基の配列が５′末端の＋１位置を越えて伸長する。このループはＨｉｎｄIII 部位（ＡＡＧＣＴＴ）が配置されるように設定されたＩＲ構造の中心の配列に相当する４塩基配列（ＡＧＣＴ）によって形成されると考えられる。ｐＵＣＫ１０６中のＩＲ構造中の不適正に相当する塩基対はＣ・Ｔ（ｐＵＣＫ １０６）からＣ・Ｇ（ｓｌＤＮＡ中）に変えられＳａｃII部位とＰｓｔＩ部位との間に示される。図５のＡのＤＮＡ塩基配列決定に用いられるプライマー“ａ”の位置は矢印によって示す。
【００４５】
このｓｌＤＮＡは、３００〜４０００個以上の塩基からなるステムを有するよう構築することができる。オーバーハング部は、たとえば、塩基１０〜８０個程度の任意所望の長さ、たとえば塩基約５０個の長さに調整することができる。この部分の長さは、安定性が損なわれることのないよう選ぶ必要がある。ｓｌＤＮＡは、所望の長さのループを有するよう構築することができる。
【００４６】
ｓｌＤＮＡの分離と精製は、モレキュラー クローニング；ア ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning；A Laboratory Manual ）、サムブルック（Sambrook）等、第２版（セクション１．１２１〜１．４０）（“サムブルック”）に述べられている方法に従って標準方法によって実施した。
【００４７】
実施例 ５
この実施例は二つの可能なｓｌＤＮＡ合成方法を説明する（図６参照）。ＣｏｌＥｌ ＤＮＡ複製の始点を中心とする二重鎖ＤＮＡを上部に示す。斜線入り円は始点からＤＮＡ複製を開始するＤＮＡ複製複合体を表す。ＤＮＡ鎖上の白抜き矢印はＤＮＡ塩基配列中の３５−ｂｐ逆方向反復（ＩＲ）構造（図２参照）の位置を示す。ＩＲ構造中の不適正塩基対（Ｃ・Ｔ）も矢印中に示す。
【００４８】
工程１において、ＤＮＡ複製フォークは始点（＋１位置）から斜線入り円によって示される位置にまで進行する。新たに合成された第１鎖が始点（中実円）から複製フォークまで伸長するのが示される。ＤＮＡ複製複合体は中実矢印によって示されるＩＲ構造中の不適正Ｔ残基の直前に達する。工程２では、この新たに合成された第１鎖の３′末端がＤＮＡ複製複合体から剥離して、２次構造がＩＲ構造によって形成される。工程３では、ＤＮＡ合成がこの新たに合成された第１鎖（モデルＡ）または上部の親鎖（モデルＢ）をテンプレートとして用いてステーム−ループ構造の３′末端から再開する。工程４では、ＤＮＡ合成が始点を越えて１６塩基だけ進行する。
【００４９】
モデルＡでは、ＤＮＡの５′末端に結合して残留するプライマーＲＮＡがテンプレートＲＮＡとして用いられる。続いて、ＲＮＡが除去されて、ｓｌＤＮＡが形成される。モデルＢでは、ＤＮＡ合成が第２鎖ＤＮＡ合成の停止のために知られた機構と同様な機構によってｔｅｒＨ部位において停止する。
【００５０】
モデルＡとＢが合成を説明することができ、合成が両ルートによって、少なくとも一部の時間では、同時に進行しうることが考えられる。従って、第１鎖のテンプレートであった鎖以外の第２鎖に対しては適当なテンプレートが用いられる。
【００５１】
実施例 ６
ｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯの構成
ｌａｃプロモーター−オペレーターを含む１９９−ｂｐ ＰｖｕII−ＨｉｎｃIIフラグメントがｐＵＣＫ１０６（図１参照）から欠失すると、結果として生ずるｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯは図３のＡ、レーン４の位置（ｂ）に示すような、ｐＵＣＫ１０６からｓｌＤＮＡよりも迅速に移動する新しいｓｌＤＮＡを形成した。この新しいｓｌＤＮＡのサイズは３６０−ｂｐ長さであり、ｐＵＣＫ１０６ｓｌＤＮＡよりも、ｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯ中の欠失サイズに殆ど等しい長さだけ短い。
【００５２】
図３のＡでは、レーン３はｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯを収容する細胞からのＤＮＡ形成のｓｌＤＮＡを示す。
【００５３】
この実験は上記で提案したｓｌＤＮＡ合成モデルを支持し、ｌａｃプロモーター−オペレーターがｓｌＤＮＡ合成にとって本質的でないことをも実証する。この解釈はｌａｃ誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加がｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成に影響しないという事実によってさらに支持された。しかし、ｐＵＣＫ１０６ΔｌａｃＰＯからのｓｌＤＮＡ合成減少の理由は現在まだ不明である。
【００５４】
実施例 ７
ｓｌＤＮＡの合成はｐＵＣＫ１０６に用いられるＩＲ構造の一次塩基配列に依存しなかった。興味あることには、ポリリンカー部位にＩＲ構造を有するｐＵＣ７ベクター自体も、始点からポリリンカー中心までのＤＮＡフラグメントに対応するｓｌＤＮＡを形成することができる。
【００５５】
ｐＵＣ７から形成された単離精製されたｓｌＤＮＡは２５２ｂｐ長さであった。プラスミド画分を実施例２と同様に形成し、処理し、電気泳動のためにアクリルアミドゲルに塗布し染色した。
【００５６】
図７では、レーン１と３はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体を示す。レーン２はｐＵＣ７から形成されたｓｌＤＮＡを示す。
【００５７】
実施例 ８
ｓｌＤＮＡ構造の確認
上記ｓｌＤＮＡ構造と機構（図６に説明）は次のように確認した：
【００５８】
合成によって構築したＤＮＡフラグメントに不適正塩基ＣＴをＣＧの代りに故意に加えた。図２のＩＲの開放スペースを参照のこと。ｓｌＤＮＡ合成（第１鎖上にスナップ−バックした第２鎖を含む）後に、不適正は修正された。なぜなら図５のＤでは、ＣＧが出現している。もし構造がスナップ−バック構造でなかったとしたら、ポリメラーゼがＩＲ領域を正しく読み、Ｔを鋳型として読みＡが挿入されるはずである。すなわち；新しい鎖はまだ不適正を含むと思われる。不適正Ｔを置換するために、ＩＲ部分は第１鎖に必然的にスナップ−バックして、ポリメラーゼにテンプレートとして第１合成鎖を使わせて、第２鎖を合成させ、第２鎖が合成されるときに、不適正Ｔの代りに相補的Ｇを挿入させる。これは本発明のｓｌＤＮＡの合成機構と構造を決定的に確立する。
【００５９】
実施例 ９
この実施例はアンチセンス配列を有するｓｌＤＮＡ（以下、アンチセンスｓｌＤＮＡと称する）による遺伝子制御を説明する。
【００６０】
（１）ｓｌＤＮＡ生産プラスミドの構築
ｐＵＣＫ１０６のＰｖｕII−ＨｉｎｃII領域（１９９ｂｐ）を削除し、ｌａｃＺのプロモーター／オペレーター領域を欠失させたｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．を構築した（図９）。次に、配列表の配列番号４に示される配列（アンチセンス配列）を有するオリゴヌクレオチド及び配列表の配列番号５に示される配列（センス配列）を有するオリゴヌクレオチドを合成し、５′末端をリン酸化したのちアニーリングさせ、ｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．のＨｉｎｄIIIサイトに挿入した。センス配列を有するｓｌＤＮＡ（以下、センスｓｌＤＮＡと称する）を生産するプラスミドをｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−Ｉ，アンチセンスｓｌＤＮＡを生産するプラスミドをｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−IIと命名した（図９）。
【００６１】
このｓｌＤＮＡは、塩基４２個のループ、塩基３６０個が二重らせん状となったステム、ならびに塩基１５〜１８個の尾部、すなわちオーバーハング部を有していた。
【００６２】
（２）β−ラクタマーゼ遺伝子を有する宿主大腸菌の創製
ｐＢＲ３２２（寳酒造社）をＥｃｏＲＩとＨａｅIIで切断し、β−ラクタマーゼ遺伝子を含む約１．６ｋｂの断片を得、該断片を末端平滑後ｐＨＳＧ３９９（寳酒造社）のＳｍａＩサイトに挿入してｐＸＸ５５５を構築した。次に、ミニＦ（ｍｉｎｉＦ）由来のプラスミドｐＸＸ３２５〔プロシーディングズ オブ ザナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ、第８０巻、第４７８４−４７８８頁、（１９８３）に記載〕のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIIIサイトにβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むｐＸＸ５５５のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ断片を挿入し、プラスミドｐＸＸ５６６を構築した（図１０）。ｐＸＸ５６６で大腸菌ＭＣ４１００を形質転換し、β−ラクタマーゼ遺伝子を有する大腸菌ＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６を得た。
【００６３】
（３）アンチセンスｓｌＤＮＡによるβ−ラクタマーゼ遺伝子の発現抑制
ｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−Ｉ、ｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−IIをそれぞれ大腸菌ＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６に導入し、それぞれＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／Ｉ、ＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIと命名した。それぞれの形質転換体をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬ−ブロスで３７℃一昼夜培養し、その培養液を１００００倍希釈して、その５０μｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌとアンピシリンを５０〜１５０μｇ／ｍｌ含むＬ−ブロスプレートにまいて３７℃で一昼夜培養した。各プレートのコロニー数を計算した。表１にアンピシリン濃度５０μｌ／ｍｌの時のコロニー数を１００としたときの相対％を、図１１に縦軸にコロニー数（相対％）、横軸にアンピシリン濃度をとったグラフを示す。その結果、ＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIではアンチセンスｓｌＤＮＡによってβ−ラクタマーゼ遺伝子の発現が抑制されアンピシリンに対する耐性が低下し、死滅率が上昇した。
【００６４】
【表１】
（４）ウエスタンブロッティングによるβ−ラクタマーゼ発現量の測定
実施例９−（３）で得られたＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／Ｉ及びＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIの単一コロニーを無作為に選び、それぞれ５ｍｌのＬ−ブロス（２０μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む）に植菌し、３７℃で一昼夜培養した後、その培養液１００μｌを同じ培地５ｍｌに植菌した。ＯＤ６００ ＝１．２付近で集菌し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．１）で洗浄した後、同緩衝液１ｍｌに懸濁しＯＤ６００ 数を測定した。各々０．７５ＯＤ６００ 分の菌体を破砕し、その細胞抽出液を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ＰＶＤＦ膜（イモビロン、ミリポア社）にブロッティングした後、抗β−ラクタマーゼ抗体（５′プライム→３′プライム社）を用いてウエスタンブロッティングを行った。検出にはイムノステインキット（コニカ社）を使用した。その結果、アンチセンスｓｌＤＮＡを生産しているＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／IIではセンスｓｌＤＮＡを生産しているＭＣ４１００／ｐＸＸ５６６／Ｉに比べて約３０％のβ−ラクタマーゼの発現量の低下が認められた。
【００６６】
さらに、センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡの遺伝子コピーが同一であり、いずれの分子も欠失あるいは組換えを生じていないことが例証された。センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡを含むゲルの写真には、生成したｓｌＤＮＡが予想通りのサイズを有することが示されており、これらの構築物中で遺伝子組換えが生じていないことが示唆された。また、センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡのバンドは似通った強度を有しており、センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡのコピー数が似通ったものであることが示された。
【００６７】
こうした結果は、カナマイシン耐性遺伝子について調べた結果によって、さらに裏づけられるものである。カナマイシン遺伝子の発現は、アンチセンス系とは独立しており、したがって、内部コントロールの役目をはたす。センスならびにアンチセンスｓｌＤＮＡを発現する細胞から誘導した抽出物のポリアクリルアミドゲルからは、Ｋｍ耐性タンパク質を表すバンドの強度が同一であることが示される。さらに、これらの２種の抽出物のβ−ラクタマーゼ以外のタンパク質の総量は同一である。こうした結果から、観察データに示す影響が、アンチセンスの影響であることがわかる。このように、観察されるβ−ラクタマーゼの発現の変化は、細胞での転写ならびに翻訳に対する全体的影響の結果として生じるのではなく、アンチセンスｓｌＤＮＡの発現に直接起因するものなのである。
【００６８】
実施例 １０
この実施例は三重鎖形成能を有するｓｌＤＮＡ（以下、三重鎖形成ｓｌＤＮＡと称する）を説明する。
（１）ｐＵＣＫ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．の構築
ｐＵＣＫ１９のＮｄｅＩサイトに配列表の配列番号６および７で示される配列で構成される１０６ＮｄｅＩ配列を挿入してｐＵＣＫ１０６Ａを構築した。次に、ｌａｃプロモーター／オペレーター領域を含むＨｉｎｃII−ＶｓｐＩ領域（２０６ｂｐ）を欠失させてｐＵＣＫ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．を構築した。
【００６９】
（２）三重鎖形成ｓｌＤＮＡの調製
配列表の配列番号８に示すオリゴヌクレオチド（ＧＴ３７配列）及び配列表の配列番号９で示されるオリゴヌクレオチド（ＣＡ３７配列）を合成し５′末端をリン酸化したのちアニーリングさせ、ｐＵＣＫ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．の１０６ＮｄｅＩ配列中のＨｉｎｄIIIサイトに挿入した。ＧＴ３７配列を含むｓｌＤＮＡが生産される方向に断片が挿入されているプラスミドをｐＵＣＫＡＧＴ３７、ＣＡ３７配列を含むｓｌＤＮＡが生産される方向に断片が挿入されているプラスミドをｐＵＣＫＡＣＡ３７と命名した（図１２）。これらのプラスミドで大腸菌ＭＣ４１００を形質転換し、これらの形質転換体をそれぞれＭＣ４１００／ｐＵＣＫＡＧＴ３７、ＭＣ４１００／ｐＵＣＫＡＣＡ３７と命名した。これらの形質転換体及び実施例９−（２）で作製したＭＣ４１００／ｐＵＣＫ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．をＬ−ブロス（７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む）にて培養後アルカリ−ＳＤＳ法にてＤＮＡを抽出し、次にＲＮａｓｅＡで処理した。この抽出液をポリアクリルアミド電気泳動に供し、各々の精製ｓｌＤＮＡを得た。
【００７０】
（３）標的ＤＮＡの調製
配列表の配列番号１０及び１１に示されるオリゴヌクレオチドを合成し、５′末端をリン酸化した後アニーリングさせ、ｐＭＳ４３４〔ジーン（Gene）、第５７巻、第８９〜９９頁、（１９８７）に記載〕のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIIIサイトに挿入し、ｐＭＳＴＲ３７を構築した。３７をテンプレートとし、配列表の配列番号１２で示されるプライマーＭＳ１と配列表の配列番号１３で示されるプライマーＭ４でＰＣＲを行い、挿入断片を増幅し、該増幅断片を標的ＤＮＡとした（図１３）。
【００７１】
（４）三重鎖形成の確認
実施例１０−（２）で調製した各ｓｌＤＮＡの５′末端を３２Ｐで放射性標識した。次に、各々の３２Ｐ標識ｓｌＤＮＡと実施例１０−（２）で調製した過剰量の標的ＤＮＡを１０ｍｌの三重鎖形成用緩衝液（５ｍＭトリス−酢酸 ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ）中で３７℃で一昼夜処理した。
【００７２】
該処理液を、５０ｍＭトリス−ホウ酸、５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、ｐＨ８．５の泳動用緩衝液を用いる１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、三重鎖形成をゲルシフトアッセイにより検出した。その結果、ＧＴ３７配列を含むｓｌＤＮＡは三重鎖を形成してゲルシフトした。一方、ＣＡ３７配列を含むｓｌＤＮＡ及び挿入配列のないｓｌＤＮＡはゲルシフトしなかった。
【００７３】
実施例 １１
この実施例は酵母におけるｓｌＤＮＡ生産を説明する。
（１）プラスミドｐＹＥＳ２−８−１０６及びｐＹＥＳ２−９−１０６の構築
ＣｏｌＥｌと２μの複製開始点を持つシャトルベクターｐＹＥＳ２（インビトロジョン社）を用い、酵母でのｓｌＤＮＡ生産を調べた。
【００７４】
ｐＹＥＳ２をＭｕｌＩ及びＳｓｐＩで切断した後、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い平滑化し環状化することによりＭＣＳ及びＧａｌＩプロモーター領域を除いた（ステップ１）。次に、このプラスミドをＡｖａＩで切断し、末端を平滑化した後、配列表の配列番号１４，１５でそれぞれ示されるＤＮＡ断片Ａ又はＢを挿入した（ステップ２）。次に、これらのプラスミドをＢａｍＨＩとＳａｌＩで切断し、そこにｐＵＣＫ１０６のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片（２２７ｂｐ）を挿入した（ステップ３）。構築されたプラスミドをそれぞれｐＹＥＳ２−８−１０６（図１４、左側）、ｐＹＥＳ２−９−１０６（図１４、右側）と命名した。
【００７５】
（２）形質転換体からのプラスミドＤＮＡとｓｌＤＮＡの回収
酢酸リチウム法（ジャーナル オブ バクテリオロジー( Journal of Bacteriology ) 、第１５３巻、第１６３〜１６８頁、（１９８３））によってサッカロミセス セレビシエ ( Saccharomyces cerevisiae )ＹＰＨ４９９（ストラタジーン社）をプラスミドｐＹＥＳ２−８−１０６又はｐＹＥＳ２−９−１０６で形質転換した。各々の形質転換体を１００ｍｌのＹＰＤ培地（１％バクトイーストエキストラクト、２％バクトペプトン、２％デキストロース）にてＯＤ６００がおよそ１．５になるまで培養した後、集菌した。該菌体を１０ｍｌのＳＣＥ液（１８２ｇ／ｌ ソルビトール、２９．４ｇ／ｌ クエン酸２ナトリウム、２２．３ｇ／ｌ ＥＤＴＡ２ナトリウム）で１回洗浄し、次に４ｍｌの溶液Ｉ（ＳＣＥ１０ｍｌ中に１０μｌのβ−メルカプトエタノールと５ｍｇのザイモリアーゼ１００Ｔを含む溶液）に懸濁し３７℃で２時間ゆっくり振とうしスフェロプラスト化した。次に、８ｍｌの溶液II（０．２Ｎ水酸化ナトリウム、１％ラウリル硫酸ナトリウム）を加え５分間氷中に静置し、次に、６ｍｌの溶液III（６０ｍＭ酢酸カリウム、氷酢酸１１．５ｍｌ、水２８．５ｍｌ）を加え５分間氷中に静置した後、遠心して上清を回収した。該上清にイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈澱として回収し、該沈澱を７０％エタノールで洗浄後ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）に溶解した。フェノール／クロロホルム混合液により除蛋白操作を行った後、エタノールで沈澱化し、更に、キアーゲンチップ５（Qiagen tip ５、キアーゲン社）でＤＮＡを精製し、回収したＤＮＡ画分を２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００７６】
（３）プラスミドＤＮＡとｓｌＤＮＡの分離
実施例１１−（２）で得られた試料のうち１０μｌ分をＳａｌＩにて処理した。これによりプラスミドＤＮＡは線状化して５０２４ｂｐの２本鎖線状ＤＮＡになり、ｓｌＤＮＡは１２７ｂｐのｓｌＤＮＡと長さ不明の２本鎖線状ＤＮＡ断片に分離される（図１５）。これに、２μｌのＣｏｌＥｌのＡｆａＩ分解物（２９，４６，６０，６２，６９，９９，１２０，１２６，１３０，２４３，２５２，３２３，４１３，４１５，５６４，７７８，９５０，９７６，９９１ｂｐの各断片を含む）を混合して、１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ゲルの下半分をエチジウムブロマイドで染色し、１２０〜１３０ｂｐの間のゲルを切り出し細かく切断後、回収し、滅菌水を加えて６０℃で３０分間処理した。遠心後、その上清からグラスウールカラムにより不溶物を取り除き、凍結乾燥してＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを２０μｌのＴＥ緩衝液に溶解した。
【００７７】
（４）ＰＣＲによるｓｌＤＮＡの検出
図１６に示すように、配列表の配列番号１６に示されるプライマー１８７１と配列表の配列番号１７に示されるプライマー２０２６１を用いてＰＣＲを行い、ｓｌＤＮＡの存在を目的のDNA 断片が増幅されるか否かで判定した。このとき、プラスミドＤＮＡの混入の可能性を否定するため、同時に配列表の配列番号１８で示されるプライマー１８７０とプライマー１８７１を用いてＰＣＲを行った。なお、両プライマーの組合せによるＰＣＲ反応の効率をみるためプラスミドＤＮＡを段階的に希釈して検出限界の濃度を調べ、どちらも約２．５×１０−２０ モル分子であり差がないことを確認した。
【００７８】
まず、実施例１１−（３）で得られた試料をＰｓｔＩで処理し、その反応液の１００分の１を用いて５０μｌのスケールでＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分で２５サイクル行いプライマーの濃度は５００ｎＭで行った。反応後、反応液の５μｌを６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色後ＦＭＢＩＯ−１００（寳酒造社）により生成物を検出した。その結果、ｐＹＥＳ２−８−１０６、ｐＹＥＳ２−９−１０６のいずれで形質転換した形質転換体もプライマー１８７１とプライマー２０２６１の組合せの場合のみ９３ｂｐの増幅物が確認され、ｓｌＤＮＡの生産が確認できた。また、いずれもプライマー１８７０とプライマー１８７１の組合せでは増幅物は検出されずプラスミドの混入は否定された。
【００７９】
ｓｌＤＮＡは、後述する他の真核生物から発現させることもできる。
【００８０】
以上より、酵母のような真核細胞でもｓｌＤＮＡが生産できることが明らかになった。またｐＹＥＳ２−９−１０６でもｓｌＤＮＡが生産されることより、リーディング鎖だけでなくラギング鎖合成においてもｓｌＤＮＡが合成されることが示唆された。
【００８１】
実施例 １２
プラスミドの複製に依存しないｓｌ−ＤＮＡの生産
（１）ｐＨＳ２８７０の構築
配列表の配列番号６と７で表される配列からなる１０６−ＮｄｅＩリンカーをｐＵＣ１９のＮｄｅＩサイトに挿入し、当該プラスミドをｐＵＣ１０６Ａと命名した。ｐＵＣ１０６Ａからｌａｃプロモーター−オペレーター領域を含むＰｖｕII断片を欠失させてプラスミドｐＵＣ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．を構築した。次に、配列表の配列番号１９で表されるＲＮＡIIＡプライマーと配列表の配列番号２０で表される１８７０プライマーとテンプレートにｐＵＣ１０６Ａｄ．Ｐ．Ｏ．を用いてＰＣＲを行い、ＲＮＡ１８７０断片を調製した。なお、ＲＮＡIIＡプライマーは複製プライマーＲＮＡII領域の５′末端にアニールし、１８７０プライマーは１０６−ＮｄｅＩリンカーの３′末端にアニールする。さらに、これら二つのプライマーはそれぞれ５′末端にＸｂａＩサイトを含んでおり、その結果、ＲＮＡ１８７０断片は両側にＸｂａＩサイトをもつ。次に、ＲＮＡ１８７０をＸｂａＩで消化してｐＳＴＶ２８（寳酒造社）のｌａｃプロモーター−オペレーター下流のＸｂａＩサイトに挿入し、ｐＨＳ２８７０を構築した。図１７にｐＨＳ２８７０の構築方法を示す。
【００８２】
図１８にｐＨＳ２８７０の構造を示す。図１８が示すように、ｐＨＳ２８７０ではプライマーＲＮＡはｌａｃプロモーターの下流におかれており、逆方向反復配列はプラスミド自身の複製をするｐ１５Ａのオリジンの上流に置かれている。
【００８３】
（２）ｐＨＳ２８７０をもつ細胞でのｓｌ−ＤＮＡの生産量の解析
大腸菌ＪＭ１０９株をｐＨＳ２８７０で形質転換し、ＪＭ１０９／ｐＨＳ２８７０を得た。この形質転換体を１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬ−ブロスで２ｍＭのＩＰＴＧ存在下、非存在下の両条件で培養した。アルカリＳＤＳ法にてＤＮＡを調製し、ＲＮａｓｅ処理した。これらのＤＮＡサンプルを６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。その結果、ＩＰＴＧ存在下では非存在下に比べて、１００倍以上のｓｌＤＮＡの生産が確認された。
【００８４】
このｓｌＤＮＡは４塩基のループと１５〜１８塩基のオーバーハングと４４０塩基のステムをもっている。
【００８５】
以上より、このｓｌＤＮＡ生産はプラスミドの複製に依存せず、プライマーＲＮＡをコントロールすることによりコントロールされている。
【００８６】
プライマーＲＮＡの合成にプライマーゼを利用する場合は、プライマーゼの生産をコントロールすることにより、ｓｌＤＮＡの生産がプラスミドの複製とは関係なくコントロールされる。プライマーゼを利用する系としては、Ｔ７ファージの遺伝子４やＴ４ファージの遺伝子４１，６１がある。コーンベルグ（Kornberg）著、「ＤＮＡレプリケション（DNA Replication）」の第１１−１０章を参照。
【００８７】
実施例 １３
大腸菌における三重鎖形成ｓｌＤＮＡによる遺伝子発現阻害
（１）ｐＨＳ２８７０ＧＴの構築
配列番号８および９に示されたオリゴヌクレオチドからなる実施例１２に示された二本鎖オリゴヌクレオチドを ｐＨＳ２８７０のＨｉｎｄIII サイトに導入した（図１９）。ＨｉｎｄIII フラグメントの方向をＤＮＡシークエンスにより確認し、ＧＴ３７配列を含むｓｌＤＮＡが生産される方向に断片が挿入されているプラスミドをｐＨＳ２８７０ＧＴと命名した（図１９）。
【００８８】
（２）ＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalactoside )によるｓｌＤＮＡ発現の誘導
ｐＨＳ２８７０またはｐＨＳ２８７０ＧＴで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、２ｍｌのＬ−ブロス（５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む）中３７℃で一晩培養した。この培養液をＬ−ブロス（５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む）で１０２ 倍希釈し、培養液のＯＤ６００ が約０．７に到達した時点でＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を加え３７℃でさらに２時間培養した。この培養液からアルカリ−ＳＤＳ法でｓｌＤＮＡを調製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した（図２０）。ＩＰＴＧを加えた場合のｓｌＤＮＡ（〜４８０ｂｐ：ｐＨＳ２８７０，〜５００ｂｐ：ｐＨＳ２８７０ＧＴ）の発現量はＩＰＴＧを加えない場合より約２０倍増加した。
【００８９】
ｓｌＤＮＡは５３塩基のループ、約４４０塩基対のステム及び１５〜１８塩基のオーバーハングを有する。
【００９０】
（３）大腸菌ＭＣ４１００ｌｐＦＴＲｌＦ′の創製
大腸菌ＭＣ４１００をラムダファージλｐＦ１３（ジーン、第５７巻、第８９〜９９頁（１９８７）に記載）で溶原化した大腸菌ＭＣ４１００λｐＦ１３を、プラスミドｐＭＳＴＲ３７（ＡＴＣＣ No.３５６９５）で形質転換した。λｐＦ１３は京都大学ウイルス研究所（京都市左京区）から入手可能である。ｉｎ ｖｉｖｏ組換えによりβガラクトシダーゼ遺伝子のプロモーター領域に三重鎖形成ｓｌＤＮＡのターゲット配列を有するラムダファージλｐＦＴＲ１を得た。このλｐＦＴＲ１を用いて大腸菌ＭＣ４１００を溶原化し、さらに大腸菌 Nova Blue ( Novagen 社）との接合によりＦ′を導入することによりＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′を創製した（図２１）。
【００９１】
（４）パルスラベルと免疫沈澱法によるβガラクトシダーゼ発現量の検出
大腸菌ＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′をｐＨＳ２８７０またはｐＨＳ２８７０ＧＴで形質転換し、２ｍｌのＬ−ブロス（５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む）中３７℃で一晩培養した。この終夜培養液をＭ９改変培地（ｌｘＭ９塩、０．２％グリセロール、１ｍＭ ＭｇＳＯ４ 、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２ 、０．００１％塩酸チアミン、４０μｇ／ｍｌアルギニン、５μｇ／ｍｌ各種アミノ酸（メチオニン、システインを除く））で５０倍希釈し３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００ が約０．２に達した時点でＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を加え、さらに３７℃で３時間培養した。この培養液０．５ｍｌに４０７ｋＢｑの３５Ｓ−Ｍｅｔ，Ｃｙｓ（４３．５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、エキスプレス〔３５Ｓ〕プロテインラベリングミックス（ Express〔３５Ｓ〕Protein Labeling Mix）、ＮＥＮ社）を加え３７℃で３０秒標識後、０．５ｍｌの２０％ＴＣＡを加え反応を停止した。沈澱を遠心により回収し、０．５ｍｌのアセトンで洗浄後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡに溶解した。標識されたタンパク質の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し、１×１０６ ｃｐｍ相当の試料を１μｌの抗βガラクトシダーゼ抗体（コスモバイオ社、ＡＢ−９８６）と０．５ｍｌのＴＢＳ−０．１％ Triton Ｘ−１００溶液中、４℃で一晩反応させた。抗原−抗体複合体を回収するために、この反応液に２０μｌの IgG Sorb（ジエンザイムセンター（ The Enzyme Center）社、ＩＧＳＬ１０）を加え、４℃で１時間激しく振盪した。沈澱を遠心で回収し、ＴＢＳ−０．１％ Triton Ｘ−１００で３回、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０で１回洗浄した。最終沈澱を２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料液に懸濁し９５℃で１分間加熱した。この免疫沈澱した試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、バイオイメージングアナライザーＢＡＳ２０００（フジ写真フィルム社）で解析した（図２２）。ｐＨＳ２８７０ＧＴで形質転換したＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′をＩＰＴＧで処理した場合のβガラクトシダーゼのバンドの放射活性はｐＨＳ２８７０で形質転換した場合よりも約５０％減少していた。
【００９２】
当業者であれば以上に開示した教示内容からわかるように、本発明を実施するにあたっては、本発明の精神あるいは範囲から逸脱することなく、おおくの改変、変更、および／または置換をたやすく行うことができる。本発明の精神および範囲には、方法論として実質的に同等な手段、ならびに、プラスミドの複製とは独立にｓｌＤＮＡを過剰生成するという、本発明と同一の目的を達成する遺伝的構築物、あるいは他の適当なビークルも含まれるものである。
【００９３】
本発明の種々の実施態様の詳細な説明
本発明者は、ゲノムの一部が直接ゲノムから複製されるという基本的な発見をした。開示する機構は周知のような、ＲＮＡ中間体も逆転写酵素（ＲＴ）も必要としない。ワイナー等、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー５５、６３１（１９８６）；コーンベルグ（Kornberg）、ＤＮＡレプリケーション（ DNA Replication ）〔ダブリュ・エッチ・フリーマン・アンド・カンパニー（ W. H. Freeman and Company）、カルフォルニア州サンフランシスコ、１９８０〕、１０１〜１６６頁参照。ステム−ループＤＮＡ（ｓｌＤＮＡ）と呼ばれる新しい、有用なＤＮＡ構造が発見された。
【００９４】
はじめに、本発明は幾つかの実施態様を提供する。一実施態様は新規で有用なｓｓＤＮＡ分子の合成方法（又はプロセス）である。他の実施態様は適当なプライミング部位と、逆方向反復（ＩＲ）と、ｓｌＤＮＡ合成の他の必要な成分とを有するＤＮＡフラグメントを含む、このような分子を合成するためのインビボ及びインビトロ系である。
【００９５】
このような分子を合成するためのインビボ系はコンピテント自己複製ビークルと系の他の成分とを用いる。この実施態様の他の面は逆方向反復、ｓｌＤＮＡの第１鎖の複製のためのテンプレートとして役立つＤＮＡ、逆配向のＤＮＡ合成をテンプレートに開始させるための適当なプライミング部位、及び必要な場合の親ＤＮＡの第２鎖と以下で述べる他の成分を含む自己複製ビークルである。
【００９６】
もう一つの実施態様は新規なｓｓ−ｓｌＤＮＡ分子である。
【００９７】
本発明は新規な一重鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子の合成方法を提供する。この分子は、ステムがｓｓＤＮＡ中のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡからなり、一端においてｓｓＤＮＡ分子の５′と３′末端を形成し、他端において二重鎖 DNAの反対端部を結合するＤＮＡの一重鎖ループを形成するステム−ループ構造（ｓｌＤＮＡ）を含む。この方法はＤＮＡ合成の通常の成分と下記成分：
（ａ）適当なプライミング部位と、前記プライミング部位の下流の逆方向反復（ＩＲ）とを含むテンプレートＤＮＡ；
（ｂ）テンプレートにＤＮＡ重合を開始させるためのプライマー；及び
（ｃ）テンプレートからｓｌＤＮＡを複製するＤＮＡポリメラーゼ
を含む系において実施される。
【００９８】
この方法は次の工程：
（１）ＤＮＡ重合を開始させるためのＤＮＡテンプレートのプライミング工程；
（２）テンプレートとしてＤＮＡの二重鎖の一つを用いてプライマーからｓｓＤＮＡを合成し、一つの鎖を形成し、ＩＲ塩基配列に入るまで鎖のＤＮＡ合成を続け、ＩＲ塩基配列内で合成を停止させる工程；
（３）新しく合成された鎖内のＩＲ塩基配列における相補的塩基がその端において非重複部分を重複部分とからなるループを形作するために、アニールし、重複部分を連続ＤＮＡ合成のプライミング部位として機能させる工程；
（４）テンプレートとしてＤＮＡの新たに合成された鎖及び／又は他の鎖を用いてＤＮＡ合成を再開する工程；
（５）ｓｌＤＮＡを形成する工程；及び
（６）必要に応じてｓｌＤＮＡを分離し、単離する工程
を含む。
【００９９】
この方法はＤＮＡ合成のために必要な通常の成分の全てを含む系で実施される。これらの成分はインビボでこの方法が実施されるときに本質的に存在し；この方法をインビトロで実施するときに通常、系に導入される。
【０１００】
この方法は、適当なプライミング部分と、このプライミング部位から下流の逆方向反復とを有するＤＮＡの存在を必要とする。ＤＮＡはＤＮＡ複製を導くためのテンプレートとして機能する。プライマーは、ＤＮＡ鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物の合成を開始させるように作用しうるオリゴヌクレオチド（天然に生成又は合成的の製造）でありうる。ＤＮＡ複製の開始方法は当然周知である。ワトソン（Watson）、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン（Molecular Biology of the Gene ）、第３版、ダブリュ・エイ・ベンジャミン社（W. A. Benjamin. Inc.）；ＤＮＡシンセシス：プレゼント・アンド・フューチャー（DNA Synthesis : Present and Future ）、モリノイクス（ Molineux ）とコイヤマ（ Kohiyama ）編集、（１９７７）第Ｖ部、“Ｇ４アンドＳＴ−１ＤＮＡシンセシス・イン・ビトロ（Ｇ４ and ST− 1DNA Synthesis in Vitro）”ワーカー著；第VII 部、“ＤＮＡ・シンセシス・イン・パーミアブル・セル・シンセシス・フロム・サッカロマイセス・セレヴィジュ（DNA Synthesis in Permeable Cell Systems from Saccharomyces cerevisiae ）オエルテル（Oertel）とゴーリアン（Goulian ）著を参照のこと。第１鎖の合成に寄与するポリメラーゼに対して、第２鎖の合成には異なるポリメラーゼが寄与する。プライマーはＤＮＡ又はＲＮＡプライマーのいずれでも良い。合成はヌクレオチドと、例えばＤＮＡポリメラーゼのような重合剤との存在下、適当な温度及びｐＨにおいて誘導される。
【０１０１】
本発明の方法は、テンプレートに沿った鎖の合成を触媒する酵素のような重合剤を用いる。このための適当な酵素には、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩもしくはIII 、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ（Klenow）フラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（ＲＴ）；ウイルスポリメラーゼがあり、熱安定性酵素をも含まれる。そのＤＮＡ複製開始部位を認識するポリメラーゼが適当である。一般に、このプロセスをインビボで実施する場合に、これらの遺伝要素が存在すると考えられ；インビボで実施しない場合又はインビトロで実施する場合には、これらを系に加えることになる。
【０１０２】
開始部位を認識するポリメラーゼは重合を惹起させる又は重合に寄与する。発明者はこの場合に特定の理論にしばられるのを望むわけではないが、第１ＤＮＡ鎖の合成に寄与するポリメラーゼが他方のすなわち第２ＤＮＡ鎖の合成にも寄与することを除外することはできない。従って、この方法は第２鎖が第１合成鎖の５′末端を越えて３′末端において停止するまで、第２鎖の合成を続けることを含む。このように、ｓｌＤＮＡの重複ステムが形成される。
【０１０３】
ＤＮＡポリメラーゼについての情報は入手可能である。例えば、コーンベルグによるＤＮＡレプリケーション（DNA Replication）（ダブリュ・エッチ・フリーマン・アンド・カンパニー、カリフォルニア州、サンフランシスコ）、１０１〜１６０頁、第４章、ＤＮＡポリメラーゼ・オブ・イー・コリ（DNA Polymerase I of E. Coli ）、第５章、アザー・プロカリオティック・ポリメラーゼズ（Other Procaryotic Polymerases ）、第６章、ユーカリオティック・ＤＮＡ・ポリメラーゼズ（ Eucaryotic DNA Polymerases ）及び第７章を参照のこと。
【０１０４】
ｃＤＮＡ中の第２鎖合成に有用であるポリメラーゼのような、他のポリメラーゼも考えられる。
【０１０５】
上記の特定の説明では、ポリメラーゼが２種類：ＤＮＡポリメラーゼIII とポリメラーゼＩであることが考えられる。
【０１０６】
もし蛋白質をコードしうる好ましいもしくは標的となる核酸塩基配列を例えば合成されたｓｌＤＮＡ部分遺伝子として複製することが望ましい場合にはこの塩基配列をＩＲの上流に配置する。例えば、複製始点（ＯＲ）を有する、例えばｐＵＣＫ１０６等のベクターのような、複製ビークル中で複製が行われる場合には、標的核酸配列はＩＲとＯＲとの間に位置する。
【０１０７】
本発明の方法は、上述したように、プライミング部位と逆方向反復（ＩＲ）すなわち逆配向で存在する二つの同じ塩基配列を含む二重鎖ＤＮＡフラグメントを用いる。ＩＲは塩基配列又は“パリンドローム”として存在しうる。
【０１０８】
後に述べるように、核酸配列へのランダム点突然変異の導入を容易にすることが好ましい場合には、例えばＲＴのような、ある特定の酵素が特に好ましい。
【０１０９】
第１鎖の合成がｄｓＤＮＡテンプレートに沿って接触しながら、ＩＲを通って進行して、全プラスミドゲノムの複製を生ずる。一定の周期で、ＤＮＡ鎖の合成はＩＲ内で停止して、それ自体に相補的である塩基配列の短い部分を形成し、ループを形成し、ＩＲ塩基配列においてそれ自体にアニールする。新たに合成された鎖内のこの二重鎖部分は第２鎖又は他のＤＮＡ鎖のプライミング部位として認識される。第２鎖の合成はＤＮＡの最初に形成された鎖及び／又は他の親鎖をテンプレートとして用いて出発する。従って、テンプレート切換えが生ずると考えられる。
【０１１０】
ヌクレオチドを含むポリメラーゼによって第２鎖が合成されるので、アニールされた相補的塩基からステムが形成され、内部相補性を有する二重構造が生ずる。
【０１１１】
第２鎖の合成は第１合成鎖の第１ヌクレオチドをはるかに過ぎて、この第１鎖のＲＮＡプライマーを通って進行する。第１鎖は結局は減成して、３′−オーバーハングを形成する。一つの特定の説明では、ＤＮＡ合成はダスグプタ（Dasgupta）等、セル（ Call ）５１、１１１３（１９８７）に述べられている方法と同様な方法によってｔｅｒＨ部位において停止すると考えられる。
【０１１２】
適当な処置によって、３′末端オーバーハングの長さは、例えば延ばすように、ｔｅｒＨ部位をプライミング位置から下流へ動かすことによって制御することができる。
【０１１３】
さらに、３′末端オーバーハングを有するステムの代りに、適当な停止部位、例えばｔｅｒＨをプライミング部位の上流に配置することによって、第１鎖の端部の前で第２鎖の合成をブロックすることが可能であると考えられる。従って、いずれかの鎖が他方に比べてかなりの長さで長くなると考えられる。
【０１１４】
第２鎖合成が停止したときに、テンプレートと形成されたｓｌＤＮＡが分離する。
【０１１５】
本発明の方法は望ましい頻度のサイクルでくり返すことができる。必要な成分のいずれかが欠乏すると、必要に応じて補充することができる。
【０１１６】
この方法をインビボで実施する場合には、プライミング部位とこのプライミング部位の下流のＩＲとを含む、適当なコンピテント複製ビークルが形成される。ＩＲを有するＤＮＡフラグメントは通常、ポリリンカー塩基配列中に特有の制限部位に挿入される。ポリリンカーがＩＲ（及び対称的制限部位）を有するプラスミドが用いられている。本質的に存在しない場合には、ＤＮＡフラグメントにＤＮＡ塩基配列へのプライマーが供給される；ポリメラーゼはビークルに固有であっても固有でなくても良い。ビークルは複製とｓｌＤＮＡ形成とに必要な、他の全ての成分を含む。
【０１１７】
上述したことから、テンプレートとして役立つＤＮＡフラグメント、ＩＲ塩基配列、ｓｌＤＮＡを形成する鎖の複製をプライムし、続けるために必要な要素を含む自己複製ビークルがｓｌＤＮＡの合成に適することが理解されるであろう。
【０１１８】
本発明の他の主要な実施態様は新しいｓｌＤＮＡを形成する。これらの構造はすでに上述した、以下では補足の説明を述べる。
【０１１９】
“ステム−ループ”又は“ｓｌＤＮＡ ”と名づけられた新しい構造は一重鎖である。ｓｌＤＮＡの説明は図５のＥ（ｐＵＣＫ１０６から）と図７（ｐＵＣ７から）に示す。
【０１２０】
典型的なｓｌＤＮＡはアニールされた相補的塩基の重複二重鎖ステムとステムの２鎖を結合する一重鎖ヌクレオチドのループとを含む。ループの一重鎖性は本発明のｓｌＤＮＡのもう一つの興味ある特徴である。ｓｌＤＮＡはヌクレオチドの非常に短い配列またはかなり長い配列のループを含むことができる。ｓｌＤＮＡはループを形成するために充分な長さのヌクレオチド配列と短い重複二重鎖を形成する塩基対合を含むことができる。最小サイズは第２鎖の合成開始のためのプライミング部位を形成するために充分な塩基対合を与えるものであるべきである。ループの最小サイズは安定構造になるための塩基対合を阻止する塩基上の歪み（strain）によって限定される。最大サイズはｓｌＤＮＡに予定された用途によって影響される。図５のＢに図示したループは４塩基からなるが；１０塩基、２０塩基又はそれ以上の塩基のループも考えられる。ｓｌＤＮＡループの一重鎖性はｓｌＤＮＡに提案される用途に非常に有用である特徴である。
【０１２１】
ｓｌＤＮＡに考えられる他の興味ある構造は二重体ｓｌＤＮＡである。この構造では、二つのｓｌＤＮＡの一重鎖の自由端部が結合する。この構造は非常に安定であると期待される。通常ＤＮＡを変性させるような条件に暴露されると、これらのｓｓＤＮＡはそれらのオリジナル構造に“スナップ−バック”しがちである。鎖の結合はＤＮＡ及び／又はＲＮＡリガーゼによる通常の方法によって実施される。このような構造は蛋白質をコードするための特定の遺伝子をも有し、それによって興味ある新しい実用的可能性を提供する。
【０１２２】
ｓｌＤＮＡの重要な性質である安定性は重複端部（tail）が長くなると共に増加する傾向があると考えられる；従って、このような構造はこのことが強調されるべき特性である場合に好ましい。同一の複製ビークルから形成されるｓｌＤＮＡの全てが必ずしも同じサイズでないことに注目すべきである。上記説明では、ｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡにおいて、第１鎖の５′末端は不均一であるように思われ、一部の鎖は＋１位置（ＣｏｌＥｌ複製の始点に相当）から出発するが〔トミザワ等、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザイ・ＵＳＡ、７４、１８８５（１９７７）を参照のこと〕、他の鎖は、−１，＋２，＋３から出発する。従って、ＤＮＡは類似したｓｌＤＮＡの類と見なすことができる。
【０１２３】
ＤＮＡフラグメント内にＩＲを越えて一つ以上の不適正が存在することがｓｌＤＮＡの合成にも構造にも不利な影響を与えないことが認められる。このことはこの場合にパリンドロームの中心から２５ヌクレオチド離れたＧに対する不適正Ｔによって説明される（図２参照）。この不適正はｓｌＤＮＡの合成において修復された。
【０１２４】
端部の１未満の他方の末端をこえたｓｓＤＮＡオーバーハングを利用した、本発明のｓｌＤＮＡの幾つかの用途が提案される。それ故、このことが本発明の新しい構造の重要な特徴であることは理解されよう。
【０１２５】
図示したプラスミド内のｓｌＤＮＡの合成は本発明の最も良い形式（mode）を説明する。
【０１２６】
しかし、ＩＲとここに述べる他の成分とを含むベクターはｓｌＤＮＡの合成に適切である。
【０１２７】
ＩＲは原核生物と真核生物にしばしば出現する構造である。このようなＩＲは本発明に使用可能である。ＩＲ塩基配列は合成的に製造することもできる。１例は図２に示す合成ＩＲである。
【０１２８】
ＩＲの塩基配列又はパリンドローム塩基配列は大腸菌から得られている〔ギルソン（Gilson）等、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ１８、３９４１（１９９０）〕；ギルソン等のヌクレイック・アシッズ・リサーチ１９、１３７５（１９９１）は大腸菌とサルモネラエンテリチカ（Salmonella enteritica）からのパリンドローム塩基配列を報告している（パリンドローム単位配列４０ヌクレオチド長さ）。チャルカー（Chalher ）等のジーン（Gene）７１、（１）：２０１−５（１９８８）は大腸菌における５７１−ｂｐパリンドロームの増殖を報告している；逆方向反復はルイス（ Lewis）等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol）（イングランド）２１５、（１）：７３〜８４（１９９０）によって枯草菌（Bacillus subtilis）において報告されている（２６−塩基対反復）、サウリン（Saurin）のコンピュータ・アプリケーションズ・イン・ザ・バイオサイエンシーズ（Comput. Appl. Biosci. ）３、（２）：１２１−７（１９８７）は大腸菌における反復パリンドローム構造を系統的に研究するための新しいコンピュータプログラムの使用を考察している。下記米国特許はポリドンローム塩基配列を開示する：第４９７５３７６号；第４８６３８５８号；第４８４０９０１号；第４７４６６０９号；第４７１９１７９号；第４６９３９８０号及び第４６９３９７９号。
【０１２９】
ｓｌＤＮＡは、その当該使用目的に即して、様々な長さのループならびにステムを、尾部（すなわち３′末端あるいは５′末端のオーバーハング部）とともに有するよう構築することができる。ステムは、塩基１００個、好ましくは３００個から５０００個以上、好ましくは約４０００個の鎖長となるよう構築することができる。一方の末端からもう一方の末端がさらに延びているオーバーハング部は、ヌクレオチド１５〜１８個、あるいは１５〜３０個といった比較的短い鎖長から、塩基約５０〜１００個、あるいはそれ以上の比較的長い鎖長までの範囲とすることができる。一本鎖のオーバーハング部は、ＤＮＡアンチジーン断片を含んでいる可能性があるので、３′あるいは５′末端の尾部のオーバーハング部は、ＤＮＡアンチジーン断片の鎖長に対して合理的な鎖長となるようにして、アンチジーン断片が必要に応じてアンチセンスあるいは三重らせんとして機能しうるようにするのが一般に好ましい。ｓｌＤＮＡのループの鎖長を決定する際にも、同様のことを考慮するのが好ましい。塩基４個から８０個の鎖長のループを想定しうるものの、実施するうえでは、他の条件も勘案して、塩基４０個から６０個のループが好ましい。
【０１３０】
パリンドロームは殆ど同じ（必ずしも同一ではない）塩基配列が逆方向にランする逆方向反復を含むと定義されている。一部は短いが（一方向に３〜１０塩基）、他の配列は数百の塩基対を含めて、非常に長い。ワトソン（Watson）、モレキュラー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン第３版、２２４〜２２５頁。
【０１３１】
ＤＮＡフラグメント中のＩＲはサイズがかなり変化しうる。限定するわけではなく、１０から３０以上のヌクレオチドの逆方向反復を含むｓｌＤＮＡが考えられる。逆方向反復は３００を越えるｂｐを含むと報告されている。カレント プロトコール（Current Protocols）、セクション１．４．１０．
【０１３２】
ｓｌＤＮＡは原核生物又は真核生物のホスト発現（例えば細菌、酵母及び哺乳動物細胞）の合成生成物であり得る。
【０１３３】
プラスミドのような適当なベクターの例とこれによって形質転換されるホスト細胞は、当業者に周知である。必要な成分を有するプラスミドの適当なホストには、原核生物と真核生物とが存在する。原核生物は、例えばエシエリキア（Escherichia ）属、特に大腸菌；バチルス（Bacillus）属；特に枯草菌のような微細物を含む。真核生物は、例えば酵母、動物、植物等であり、動物細胞、植物細胞等のような微細物を含む。
【０１３４】
大腸菌を形質転換することのできるプラスミドは、例えばｐＵＣ型とＣｏｌＥｌ型プラスミドがある。米国特許第４９１０１４１号参照、大腸菌を形質転換することができるプラスミドは例えば、一般にＣｏｌＥｌ型プラスミドを含む。大腸菌の形質転換に適当な、他のプラスミドを下記に挙げる：ｐＳＣ１０１、ｐＳＦ２１２４、ｐＭＢ８、ｐＭＢ９、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＣＫ１、Ｒ６Ｋ、ｐＢＲ３１２、ｐＢＲ３１３、ｐＭＬ２、ｐＭＬ２１、ＣｏｌＥｌＡＰ、ＲＳＦ１０１０、ｐＶＨ５１、ｐＶＨ１５３。
【０１３５】
枯草菌を形質転換することのできるプラスミドを下記に挙げる：ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２２３、ｐＵＢ１１２、ｐＴ１２７、ｐＥ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＳＡ０５０１、ｐＳＡ２１００、ｐＴＰ４、ｐＴＰ５及びこれらの誘導体。
【０１３６】
枯草菌と大腸菌の両方を形質転換することのできるプラスミドは、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacteriol. ）１４５、４２２〜４２８（１９８２）；プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ＵＳＡ、７５、１４３３〜１４３６（１９７８）及びプリンシプルズ・オブ・ジーン・マニピュレーション（Principles of Gene Manipulation）第２版、カル（ Carr ）等編集、カリフォルニア大学出版局（バークレイ）、１９８１、４８頁に述べられている。
【０１３７】
真核生物においてｓｌＤＮＡ合成を実施するために特に重要であるのは、サッカロマイセス・セレヴィジェを形質転換することのできるプラスミド：ｐＭＰ７８、ＹＥｐ１３、ｐＢＴＩ１、ｐＬＣ５４４、ＹＥｐ２、ＹＲｐ１７、ｐＲＢ８（ＹＩｐ３０）、ｐＢＴ１７、ｐＢＴ１９、ｐＢＴ１１０、ｐＡＣ１、ｐＳＬｅ１、ｐＪＤＢ２１９、ｐＤＢ２４８及びＹＲｐ７である。ＹＩｐ５、ｐＵＣ−ＵＲＡ３、ｐＵＣ−ＬＵＥ２及びｐＵＣ−ＨＩＳ３も考えられる。メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology ）１９４巻、２８５、３７３〜３７８頁「ガイド・トゥ・イースト・ジェネティクス・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology ）」、グスリー（Guthrie ）とフィンク（Fenk）編集（１９９１）、アカデミック プレス社（Academic Press. Inc.）を参照のこと。他の酵母ベクターはエクスペリメンタル・マニピュレーション・オブ・ジーン・イクスプレッション（Experimental Manipulationof Gene Expression）イノウエ マサヨリ（Masayori Inouye）編集、アカデミック プレス社（１９８３）、１００〜１０４頁に述べられている。
【０１３８】
さらに、大腸菌ならびに例えばエス・セレヴィジェのような酵母の形質転換に用いることができるシャトルベクターが特に重要である。このようなベクターはｐｋｂ４２とｐＹＣ１を含む。他の例はア・プラクティカル・ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング（A Practical Guide to Molecular Cloning ）ベルナード ペルバル（Bernard Perbal ）による第２版（ウイリーアンドサンズ）中の“コスミド・ベクター・フォー・ロー・アンド・ハイカー・ユーカリオーツ（ Cosmid Vector for Low and Hiher Eucaryotes）”に関するセクションに挙げられている。他の適当なベクターはカレント プロトコール、２巻、セクション１３．４．１、１３．４．２（１９８９）に述べられる。他の適当なビークルはＹＥｐ２４〔ボトシュタイン（Botstein）等、ジーン、８、１７（１８７９）〕とｐＪＤＢ２０７〔ベッグ（Beggs ）、ゲネチック エンジニヤリング（Genetic Engineering）（ウィリアムソン（Williamson）編集）２巻、１７５頁、アカデミック プレス（１９８２）のような、一般のマルチコピーベクターを含む。選択可能な、他のベクターは、ＹＥｐ５１、ＹＥｐ５２、ｐＹＥＳ２のようなＹＥｐクラスのプラスミドを含む。
【０１３９】
本発明の実施するための商業的に入手可能な真核ベクターの例は、例えばＣＯＳ、ＣＨＯ及びＨｅＬａ細胞におけるｐＳＶＬとｐＫＳＶ−１０である。他の例はア・プラクティカル・ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニングに挙げられている。
【０１４０】
こうした複製可能な遺伝的ビークルは、ビークルの複製に適した遺伝的要素、たとえばビークルの複製起点、プロモーターなどを含んでいるので、本明細書に記載する逆方向反復配列をはじめとする要素が挿入されると、ｓｌＤＮＡが発現されることとなる。しかし、本明細書に記載する本発明の改善策、すなわちｓｌＤＮＡの過剰発現においては、ｓｌＤＮＡの合成ならびに生成は、ビークルの複製を支配している要素とは異なった、すなわち、ビークルの複製を支配している要素とは異なる要素に対して応答あるいは作動する独立に誘導可能なプロモーターおよび遺伝的要素によって、ビークル、たとえばベクターの複製とは独立に制御するのが好適である。
【０１４１】
形質転換ホストの培養と発酵は技術上公知の標準的な一般方法によって実施される。例えば、メソッズ イン エンザイモロジー、１８５巻、ジーン・エクスプレッション・テクノロジー（Gene Expression Technology）〔編集者ゴッデル（Goeddel ）〕１９９０（特に、グロス・オブ・セル・ラインズ（Groth of Cell Lines））を参照、酵母に関しては、メソッズ イン エンザイモロジー、１９４巻、ガイド・トゥ・イースト・ジェネティクス・アンド・モレキュラー・バイオロジーを参照；大腸菌の増殖条件は、カレント プロトコール インモレキュラー バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology）、１巻、１．１．１、１．１．２、１．１．３、１．１．４、１．３．１頁及びモレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル（Moloecular Cloning ：A Laboratory Manual ）第２版、１．２１頁に述べられており、プラスミドＤＮＡの精製は、１．２３頁に述べられており、哺乳動物細胞に適した培養増殖条件がカレント プロトコール、１巻と２巻、９．０．４〜９．０．６、９．１、９．１．２、９．１．３、９．２．５、９．４．３、１１．５．２、１１．６．２及び１１．７．３頁に述べられている。
【０１４２】
要約すると、一重第１鎖の複製開始と合成のために必要な成分、すなわち開始部位を含むＤＮＡテンプレートフラグメントとＩＲ（及びポリメラーゼ）を複製ビークル中に供給すると、ｓｌＤＮＡが形成されると期待される。
【０１４３】
本発明のｓｌＤＮＡの合成をインビトロで実施する場合に、合成はテンプレートとしてＤＮＡフラグメントを用いるヌクレオチド鎖の合成のための通常の成分を含む培質中で実施する。一般に、合成は好ましくはｐＨ７〜９の緩衝化水溶液中で行われる。ＤＮＡテンプレート鎖上にモル過剰量のオリゴヌクレオチドが存在することが好ましい、デオキシリボヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰも合成混合物の成分である。溶液を加熱し、次に冷却する。次にポリメラーゼを加えると、合成が進行する。これらの成分はここに述べる本発明のための「通常成分」と呼ばれる。
【０１４４】
オリゴヌクレオチド合成は、米国特許第４４１５７３４号と、マットイシ（Matteuci）等ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（J. Am. Chem. Soc. ）１０３（１１）：３１８５〜３１９１頁（１９８１）；アダムス（Adams ）等、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー１０ ５（３）：６６１〜６６３頁（１９８３）；及びベムケージ（Bemcage ）等、テトラヘドロン レタース（Tetrahedron Letters）２２（２０）：１８５９〜１８６７（１９８１）に述べられている。
【０１４５】
本発明の方法は遺伝子工学の技術と分子クローニングを利用する。遺伝子工学の一般的技術と分子クローニングは下記文献に含まれる：サムブロック（Sambrook）等、モノキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル、第２版、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、１９９０、ア・プラクティカル・ガイド・トゥ・モレキュラー・クローニング（A Practical Guide to Molecular Cloning ）、第２版、バーナード ペルバル（１９８８）；メソッズ イン エンザイモロジー、６８巻、リコンビナントＤＮＡ（Recombinant DNA）〔ウー（Wu）編集者〕、アカデミック プレス、N. Y. 、１９７９；メソッズ イン エンザイモロジー、１８５巻、ジーン・エクスプレッション・テクノロジー（Gene Expression Technology）〔ゴエデル（Goeddel ）編集者〕１９９０、カレント プロトコールス イン
モレキュラー バイオロジー、１，２及び３巻。
【０１４６】
本発明のｓｌＤＮＡは幾つかの重要な用途を有する。本発明の方法は特定の遺伝子にランダム突然変異を導入するために利用することができる。このような系は形質転換ベクター中のβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を示す図７に説明される。
【０１４７】
この方法は、ステム中の配置された重要な遺伝子を含むｓｌＤＮＡの合成、ｓｌＤＮＡの単離、ｓｌＤＮＡから遺伝子の切断、適当な複製ビークルへのそれのクローニング及びその遺伝子によってコードされる蛋白質の表現を含む。蛋白質は目的の活性に関して試験することができる。標準方法によって、コロニーを検査して、突然変異遺伝子を有するコロニーを確認することができる。
【０１４８】
突然変異の発生と確認の説明は次のように進める。ｌａｃＺ遺伝子を収容するｐＵＣＫ１９（実施例１参照）中に、ＤＮＡフラグメントとＯＲ（実施例１に示す）との間に３５ｂｐＩＲ（実施例に説明）を含む前出の配列表の配列番号１及び２で構成され、図２で示す２１５ｂｐＤＮＡフラグメントを結合させる。このプラスミドを標準条件下で増殖するコンピテント大腸菌ＣＬ８３に形質転換させる。その後、ｓｌＤＮＡを単離し、ｌａｃＺ遺伝子を切断して、ｐＵＣ１９中（ＩＲ含有フラグメントをもっていない）に挿入する。次いでこのプラスミドを大腸菌ＣＬ８３に形質転換させる。突然変異の頻度をβ−ｇａｌ、無色基質を用いて公知のインビボ試験によって評価する、前記無色基質は加水分解されると暗青色生成物を生ずる。コロニーが無色である場合には、このことがβ−ガラクトシダーゼが製造されないことを示唆する。
【０１４９】
ｌａｃ遺伝子類の他の遺伝子、例えばｌａｃＹもしくはｌａｃＡ又は他の適当な遺伝子をこのスクリーニング試験に用いることができる。重要な蛋白質（又はポリペプチド）をコードする遺伝子も、突然変異の頻度決定と、誘導蛋白質（又はポリペプチド）をコードする適当な遺伝子の選択とに用いることができる。
【０１５０】
スクリーニング方法は標的遺伝子に突然変異を導入し、突然変異率を増加させやすい、ポリメラーゼの選択を可能にする。従って、例えばｌａｃＺ遺伝子のような適当な遺伝子をスクリーニング遺伝子として用いることができる。複製確実度（replication fidelity ）の低いことが知られる逆転写酵素は目的蛋白質をコードする標的遺伝子に突然変異を導入するために選択すべき酵素であるように思われる。
【０１５１】
好ましい標的蛋白質は、好ましい生物学的性質のために選択された、突然変異遺伝子を有する、特定のコンピテント形質転換ホストによって表現される。
【０１５２】
突然変異の頻度は、複製における確実度の低いことが知られる適当な酵素を選択することによって影響されやすいと考えられる。従って、標的ＤＮＡフラグメント又は遺伝子を増幅する場合に、系は複製確実度又は不確実度すなわち挿入ＤＮＡフラグメント又は遺伝子の複製におけるＤＮＡポリメラーゼによってなされるエラー（error ）頻度に依存する。このようにして、各複製エラーに対してランダム突然変異が遺伝子に導入される。ＤＮＡポリメラーゼの不確実度が高ければ高いほど、突然変異遺伝子類は大きくなる（この逆もいえる）。
【０１５３】
ＰｏｌIII とＰｏｌＩとが有効であると考えられる本発明の上記実施態様の一つでは、ＰｏｌＩが自己修正機能を有することが知られているので、ＰｏｌIIが低い確実性を有すると考えられる。このようにして、系の複製確実度はＤＮＡポリメラーゼの適当な選択によって調節することができる。一般に、ランダム突然変異は第２鎖を合成するポリメラーゼによって導入されやすいと考えられる。興味ある候補ポリメラーゼはＲＴである。
【０１５４】
好ましい突然変異を有する遺伝子は染色体交差（chromosomal crossover）に有用である。この方法によって、重要な遺伝子又は突然変異遺伝子を有するｓｌＤＮＡを用いて、同種の一つの分子からもう一つの分子への遺伝情報を融和させ、交換することができる。突然変異遺伝子はゲノム内にベクター塩基配列に類似した塩基配列を配置し、相同な遺伝子が突然変異遺伝子によって複製される。
【０１５５】
このようにして、突然変異遺伝子を含み、好ましい蛋白質を表現する微生物の新しい系統が発生することができる。突然変異遺伝子を有するｓｌＤＮＡはインビトロ又はインビボで製造することができる。
【０１５６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＤＮＡの特定セグメントをインビトロ酵素増幅するための迅速手段である。標準ＰＣＲ方法は増幅すべき二重鎖ＤＮＡセグメント、セグメントと側面を接する常に二つの一重鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、適当なデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、バッファー及び塩を必要とする。カレント プロトコール セクション１５参照のこと。
【０１５７】
本発明のｓｓ−ｓｌＤＮＡは単一プライマーによって増幅することができる。この特徴は増幅をかなり簡単化し、プライマーがその適当な複製開始部位を見出す問題の解決を助け、これをさらに経済的にし、従来のＰＣＲ方法に付随する問題の解決を助ける。
【０１５８】
ｓｌＤＮＡの増幅はｓｌＤＮＡを変性して、一重鎖ＤＮＡ（３′から５′末端まで）を形成することを含む。この反応は通常の順序：３′末端からのプライミング、ポリメラーゼ反応、変性とアニーリングに従って行われる。これが２５サイクル実施されると、ｓｌＤＮＡの１００万倍増幅が生ずる。ｓｌＤＮＡは標的蛋白質をコードする遺伝子を有することができる。
【０１５９】
エルリッヒ（Erlich）等による“リーセント・アドバンシーズ・イン・ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Recent Advances in Polymerase Chain Reaction ）”なるタイトルのサイエンス（Science ）２５２、１６４３〜１６５０（１９９１年６月２１日）内の最近の報告はプライマーに関連する問題と、ＰＣＲ方法に提案されている改良とを考察している。
【０１６０】
従って、本発明のｓｓ−ｓｌＤＮＡ構造を１プライマーを用いる方法によって増幅する方法は非常に重要である。ｓｌＤＮＡは例えば改良された生物学的特性を有する突然変異遺伝子のような、重要な遺伝子を有することができる。
【０１６１】
本発明のｓｌＤＮＡのインビボ製造は目的の塩基配列を形成するように操作されることができる。このようにして製造されたｓｌＤＮＡを次に、アンチセンス（antisense ）ＤＮＡとして用いることができる。
【０１６２】
現在考えられている魅力的な用途は、本発明のｓｌＤＮＡが三重鎖らせんＤＮＡ、すなわち三重鎖ＤＮＡを形成し、結果としての新しい三重鎖ｓｌＤＮＡの形成に果たす役割である。サイエンス、２５２、１３７４〜１３７５（１９９１年６月２７日）における最近の報告、“トリプレックス・ＤＮＡ・ファイナリー・カムズ・オブ・エイジ（Triplex DNA Finally Comes of Age ）”は本発明の適時性を強調している。三重鎖ＤＮＡは第３鎖を染色体ＤＮＡ上の特定認識部位に結合させることによって製造することができる。好ましくは塩基の完全量（full complement）（例えば１１〜１５以上）を含むサイズの合成鎖を検討している。長い３′（又は５′）末端（及び非重複塩基のループ）を有する本発明のｓｌＤＮＡは良好な候補であるように思われる。結果として生ずる三重鎖ＤＮＡは大きな安定性と有用性とを有するように思われる。ＡＩＤＳ療法、選択的遺伝子阻害等を含めた三重鎖らせん形成に基づく新しい療法がこの報告に提案されている。
【０１６３】
本発明の重要な実施態様の一つでは、ｓｌＤＮＡは、その一本鎖部分に、アンチセンス断片あるいは三重らせん形成能をもつ配列として遺伝子機能を調節するＤＮＡ配列であるアンチジーンを有している。
【０１６４】
アンチセンス配列、三重鎖形成配列等の遺伝子制御配列（以下、アンチジーンと称す）を有するｓｌＤＮＡはインビボの系において遺伝子制御ＤＮＡとして生成、利用できる。
【０１６５】
生命現象はその根元をたどると遺伝子に組み込まれた情報によってつかさどられているので、その遺伝子に何らかの方法で直接働きかけることは特定の遺伝子の発現制御をするうえで最も効果的な手法である。遺伝子工学的手法で遺伝子の発現制御する方法としてアンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、それに三重鎖形成能をもつ核酸等を使用する方法が知られている。アンチセンスＲＮＡ及びアンチセンスＤＮＡに関しては、ターゲット遺伝子から生産されるメッセンジャーＲＮＡと相補的な配列を持つＲＮＡ又はＤＮＡを細胞内に供給することによりメッセンジャーＲＮＡとアニーリングし、部分的に二重鎖の核酸を形成し、メッセンジャーＲＮＡから蛋白へと翻訳されるのを阻害する。このアンチセンスＲＮＡは適当なプロモーターによって細胞内で生産させることができるが、アンチセンスＤＮＡは一重鎖ＤＮＡであるがゆえにインビボでの生産は難しく、合成したＤＮＡをアンチセンスＤＮＡとして細胞の外から供給し、遺伝子制御効果を見るにとどまっている。
【０１６６】
次に三重鎖ＤＮＡ形成能を持つ核酸に関して述べると、例えばプリン塩基（ＧあるいはＡ）、他方に相補的なピリミジン塩基（ＣあるいはＴ）が並んだ二重鎖のポリプリン、ポリピリミジン配列に対してはHoogsteen 型の結合を介して三本目の鎖が形成し、部分的に三重鎖になることが知られている。この三本目の鎖が三重鎖形成能を持つ核酸であり、遺伝子の制御ばかりではなく遺伝子工学的にも様々な応用例が提唱されている。しかし、実際に遺伝子の発現の調節という観点から治療法へと結びつけるにあたり、この三重鎖形成能を持つ核酸を細胞内で生産させることはアンチセンスＤＮＡ同様難しく、合成ＤＮＡを細胞の外から供給し遺伝子制御の効果を見るにとどまっている。
【０１６７】
インビトロの系においてアンチセンスＤＮＡ、三重鎖形成能を持つＤＮＡを生成させることは、最近のＤＮＡ合成機の進歩によってもはや簡単に作ることができるようになった。しかし、インビボの系においてこのような一重鎖ＤＮＡを人為的に生産させることはｍｓＤＮＡを除いて知られていない。しかし、ｍｓＤＮＡは細胞内でmRNAを生成させ逆転写酵素によって一重鎖ｃＤＮＡを合成するもので、その生成過程の複雑さから応用面に至ることが非常に難しい。
【０１６８】
一方、アンチジーンを有するｓｌＤＮＡはインビボで生成させるにあたりｍＲＮＡの中間体を介さずに直接二重鎖のＤＮＡから一重鎖ＤＮＡを生成させ、それを遺伝子制御に応用させ得る。
【０１６９】
遺伝子が複製する際にその複製方向の途中に逆方向反復配列（ＩＲ配列）が存在すると、第一鎖ＤＮＡ合成がそのＩＲ配列内でそれまで鋳型としていたＤＮＡとは別の同じＩＲ配列を持つ鋳型ＤＮＡとアニーリングし、そこから第二鎖のＤＮＡ合成が始まり複製開始点に向かって合成が進む。そして適当な転写終結部位においてＤＮＡ合成が終わり、第一鎖ＤＮＡ合成の際に鋳型とした遺伝子からｓｌＤＮＡとして遊離する。ｓｌＤＮＡはループを形成している部分及び３′末端または５′末端が一重鎖構造を有していて、アンチセンスＤＮＡまたは三重鎖形成能を持つＤＮＡはこれらの部位にその塩基配列を入れることができる。すると遺伝子が複製する過程においてこれらアンチジーンの配列を持つｓｌＤＮＡが生成され、インビボの系においてもアンチセンスＤＮＡ、または三重鎖形成能を持つ一重鎖ＤＮＡを生成させることができる。
【０１７０】
アンチセンスＤＮＡ配列を持つｓｌＤＮＡはターゲットのＲＮＡとアニーリングし、その遺伝子機能を阻害するばかりでなく、アンチセンスＤＮＡを持つｓｌＤＮＡとアニーリングしたターゲットＲＮＡは通常細胞内に内在するＲＮａｓｅＨによって分解されていく。
【０１７１】
三重鎖形成能を持つＤＮＡを含むｓｌＤＮＡも遺伝子が複製する際ｓｌＤＮＡとして生産されるのでインビボで常時三重鎖形成能を持つ一重鎖ＤＮＡが生産され、該ＤＮＡによるターゲット遺伝子の二重鎖ＤＮＡの制御が可能となる。
【０１７２】
次に、実際にアンチセンスＤＮＡまたは三重鎖形成能を持つＤＮＡといったアンチジーンをｓｌＤＮＡ内に組み込み、発現させる方法について詳細に説明する。
【０１７３】
まずｓｌＤＮＡのループ内にアンチジーンを入れるには、例えばプラスミドを用いてｓｌＤＮＡを生成させる場合にはプラスミドの複製方向の途中にＩＲ配列を挿入し、アンチジーン配列は二つの反復配列の間にクローニングすればよい。そしてこのプラスミドで細胞を形質転換することによって、このプラスミドを持つ細胞はプラスミドが複製する際にアンチジーンを持つｓｌＤＮＡを生産し続ける。
【０１７４】
またｓｌＤＮＡはその生産過程において、５′末端のプライミング位置と転写終結部位とが異なる場合が多く、５′末端または３′末端が突出した構造をとっている。そこでこの突出した部分にアンチジーンを挿入することができる。ｓｌＤＮＡの３′末端または５′末端の突出した部分にアンチジーンの入ったｓｌＤＮＡを生産させるには、ＩＲ配列を含むプラスミドのｓｌＤＮＡが複製を開始する部分と転写終結する部分の間にアンチジーンの配列をクローニングすればよい。そしてこのプラスミドで細胞を形質転換しｓｌＤＮＡを生産させると、ｓｌＤＮＡの５′末端または３′末端のいずれか突出した部分にアンチジーンの配列の入った一重鎖ＤＮＡが生成する。
【０１７５】
ｓｌＤＮＡは原核生物である大腸菌で発見されたが、真核生物である酵母においてもｓｌＤＮＡは生産され、アンチジーンを持つｓｌＤＮＡが様々な真核細胞（例えば動物細胞）においても生産され、遺伝子制御に用いることができる。
【０１７６】
本発明が技術と科学に有為な貢献をすることは認められるであろう。
【０１７７】
以上に述べたように、ｓｌＤＮＡは価値ある遺伝的構築物である。したがって、こうしたｓｌＤＮＡを、これまで達成しえなかった収率で生成するという重要な必要性が存在するのである。
【０１７８】
本発明は、ｓｌＤＮＡを高収率で発現する方法ならびに遺伝的構築物を提供するものである。従来記載されてきた態様の方法では、組換え型ＤＮＡのビークルの複製起点からの複製を開始するプライマーの内在的レベルによって、ｓｌＤＮＡの生成レベルが決定かつ制限されていた。本発明のこの実施態様では、最良の結果をうるべく、組換え型ＤＮＡ構築物が、ビークルの複製を制御する遺伝的要素とは独立に作動する一群の要素を含む系を構築した。この系、すなわち一群の要素では、ｓｌＤＮＡ合成に関わるプライマーの細胞でのソベルが劇的に上昇しているので、価値あるｓｌＤＮＡの合成が高率で開始され、高収率で発現される。
【０１７９】
ｓｌＤＮＡは原核生物あるいは真核生物で発現させることができる。細胞の発現方法は、ｓｌＤＮＡの発現を誘導しうる、組換え型ＤＮＡが自己複製可能なビークルで形質転換した原核生物あるいは真核生物の宿主を培養する工程からなるものである。この組換え型ＤＮＡビークルは、以下の要素が作動可能に連結されたものである。すなわち、このビークルは、誘導可能なプロモーター、好ましくは強力なプロモーター−オペレーターをコードするＤＮＡ配列を含んでおり、この誘導可能なプロモーターが誘導されると、ＲＮＡプライマーあるいはタンパク質、たとえばプライマーゼのような酵素が生成され、このＲＮＡプライマーあるいはタンパク質が、宿主細胞に内在する適当な基質ならびにＤＮＡポリメラーゼを利用したｓｌＤＮＡの合成を開始するべく機能する。さらに、このビークルは、ＲＮＡプライマーあるいはプライマーゼをコードしているＤＮＡ配列の下流側に、逆方向反復配列を有している。さらに、この組換え型ＤＮＡビークルは、ＤＮＡビークル自体の複製に際して機能する複製起点、ならびに選択を可能とするマーカー、たとえば、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を有している。
【０１８０】
本発明の好適実施態様では、ｓｌＤＮＡの合成の開始は、組換え型ＤＮＡビークルの複製に付随、あるいは依存するものではない。しかし、本発明は、ｓｌＤＮＡの合成を開始するプライマーがプラスミドの複製も開始するように組換え型ＤＮＡビークルを構築することも包含するものである。
【０１８１】
一本鎖部分にアンチジーン断片を含むｓｌＤＮＡを過剰発現させようとする場合には、複製可能なビークルは、二つの反対向きの逆方向反復配列の間、あるいはｓｌＤＮＡの合成開始に際して使用されるプライミング部位と逆方向反復配列との間にアンチジーン断片を有するものとする。かくして、アンチジーン断片を保持するｓｌＤＮＡが高収率で生成されることとなる。
【０１８２】
ＲＮＡプライマーあるいはプライマーゼタンパク質をコードしているＤＮＡ断片の発現を誘導するうえで有用な誘導可能なプロモーターとしては、たとえば、ＳＶ４０の初期あるいは後期プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃあるいはＴＲＣプロモーター、λファージの主要なプロモーター、たとえばλｐｌ、λｐｒなど、ｆｄコートタンパク質のプロモーター、ｅ−ホスホグリセレートキナーゼ等の解糖酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター、酵母交配因子のプロモーターをはじめとする、真核生物あるいは原核生物の細胞、またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御していることが既知の種々の配列を挙げることができる。ｓｌＤＮＡを哺乳動物の細胞で発現しようとする場合には、遺伝子をデヒドロ葉酸還元酵素をコードしている遺伝子に結合し、所望の遺伝子を増幅することとなる細胞の選択を行うことによって、発現単位を増幅することも可能である。
【０１８３】
有用なプロモーターは、適当な誘導物質で誘導することが可能である。たとえば、ｌａｃならびにｔａｃプロモーターは、ＩＰＴＧで誘導され、λｐｌあるいはλｐｒプロモーターの発現を誘導する際には、マリディクシック（malidixic ）酸が一般に使用される。こうした組み合わせは、当業界で他にも公知である。たとえば、下記で引用するコーンバーグ（Kornberg）の「ＤＮＡレプリケーション（DNA Replication）」、ならびに「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current Protocols in Molecular Biology ）」、アウスベット（Ausubet ）ら、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社（John Wiley ＆Sons，Inc.）、１９９４（「カレント・プロトコール（Current Protocols）」）を参照されたい。
【０１８４】
真核生物、たとえば上述のような酵母細胞、あるいは哺乳動物の細胞中でｓｌＤＮＡを過剰発現しようとする場合には、酵母細胞の複製系がｓｌＤＮＡの合成系とは分離され、酵母細胞から発現されるｓｌＤＮＡが、酵母細胞の複製より高レベルかつ高速に、しかも酵母細胞の複製とは独立に発現される、上述のようなプロトコールを使用するものである。各種の適切な技法、ならびに酵母の分子生物学については、「ガイド・トゥ・イースト・ジェネティクス・アンド・モレキュラー・バイオロジー（Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology ）」、ガスリーら（Guthrie および Fink ）編、アカデミック・プレス社（Academic Press ，Inc.）、ならびにメソッズ・イン・エンザイモロジー（ Methods in Enzymology）、１９４巻、１９９１をはじめとする本明細書に引用した参考文献を参照されたい。また、「エキスペリメンタル・マニピュレーション・オブ・ジーン・エキスプレッション（Experimental Manipulation of Gene Expression）」、井上（ Masayori Inouye）編、アカデミック・プレス（Academic Press ）、１９８３の全体ならびに第５章、「ベクターズ・フォー・ハイ・レベル，インダストリアル・エキスプレッション・オブ・クローンド・ジーンズ・イン・イースト（Vectors for High Level , Inducible Expression of Cloned Genes in Yeast ）」も参照されたい。
【０１８５】
図１７および１８は、本発明の好適な構築物を構成するプロトコールを例示するものである。図１７に示すように、ｓｌＤＮＡの合成を開始するべく機能するプライミング部位は、プラスミド、たとえば図１７のｐＵＣ１９の複製起点から誘導される。しかし、その最終形態では、このプライミング部位が、ｓｌＤＮＡをコードする組換え型ＤＮＡビークルの複製において機能することはなく、組換え型ＤＮＡビークルはそれ自身の機能的な複製起点を有している。
【０１８６】
他の複製起点を使用してｓｌＤＮＡの合成を誘導することもでき、例としては、ｐＭＢ１、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６−５、ｍｉｎｉ Ｆ、Ｒ１、Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、Ｒｔｓ１、ＲＫ２、Ｐ１、ＣｏｌＥII、ＣｏｌＥIII 、ｐ１５Ａ、Ｔ４バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、ＲＳＦ１０３０、ｐＢＲ、ならびにｐＵＣを挙げることができる。
【０１８７】
当業界でも周知のように、こうした複製起点の中には、効率良く作用するうえでタンパク質を必要とするものがある。合成開始のプライミング部位がこうした複製起点に由来する場合に、誘導可能なプロモーターを、こうした状況において、この種のタンパク質の発現を誘導しうるものとすることも、本発明の範囲に包含される。本発明は、フライミング部位を、図１７に示した以外の複製起点から誘導する場合も包含するものである。使用が可能な図１７以外の複製起点としては、ｐＭＢ１、ＣｏｌＥｌ、ｐＳＣ１０１、Ｒ６−５、ｍｉｎｉ Ｆ、Ｒ１、Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、ＲＴｓｌ、ＲＫ２、Ｐ１、ＣｏｌＥII、ＣｏｌＥIII 、ｐ１５Ａ、ＲＤＦ１０３０、Ｔ４バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、ｐＢＲ、ならびにｐＵＣがある。また、本発明は、組換え型ＤＮＡビークルの複製を誘導する機能的複製起点を、図１７に示したｐ１５Ａ以外のものとすることも包含するものであり、こうした複製起点としては、ｐＭＢＩ、ＣｏｌＥl 、ｐＳＣ１０１、Ｒ６−５、ｍｉｎｉ Ｆ、Ｒ１、Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、ＲＴｓｌ、ＲＫ２、Ｐ１、ＣｏｌＥII、ＣｏｌＥIII 、Ｔ４バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、ｐ１５Ａ、ＲＳＦ１０３０、ｐＢＲ、ならびにｐＵＣがある。当業界では、これら以外にも各種の複製起点が知られている。「ＤＮＡレプリケーション（DNA Replication）」、オックスフォード大学出版局（Oxford University Press ）、１９９１；「ＤＮＡレプリケーション（DNA Replication）」、W. H. コーンバーグ（Kornberg ,W. H. ）、フリーマン・アンド・カンパニー（Freeman and Company ）、１９８０。
【０１８８】
出発プラスミドとしては、ｐＵＣ１０６以外にも、適切な複製起点を有するものが多数あり、例として、たとえば、ｐＭＢ１、ＣｏｌＥｌ、ｍｉｎｉ Ｆ、Ｒ１、Ｒ１００、Ｒ６Ｋ、Ｒｔｓｌ、ＲＫ２、Ｆ、Ｐ１、Ｔ４バクテリオファージ、Ｔ７バクテリオファージ、ＣｏｌＥII、ＣｏｌＥIII などを挙げることができる。
【０１８９】
ＤＮＡ組換え型ビークルで形質転換あるいはトランスフェクションした宿主を培養する方法は周知である。こうした方法では、宿主を適当な成長条件で培養し、所望のｓｌＤＮＡを培養から集める。本明細書に引用した「カレント・プロトコール（Current Protocols）」を参照されたい。
【０１９０】
好適実施態様の詳細な説明
本発明の好適実施態様は、図１７および１８を参照することによって容易に説明することができる。
【０１９１】
図１７からわかるように、構築物である組換え型ＤＮＡビークルｐＨＳ２７８０は、機能的複製起点ｐ１５Ａ、すなわち、プラスミドの複製に際してともに機能する開始プライマーＲＮＡＩ、ＲＮＡII、ならびにＲＯＰタンパク質をコードしているプラスミドの領域を有している。図からわかるように、ｐ１５Ａ Ｏｒｉ領域は、ｐＳＴＶ２８に由来するものである。
【０１９２】
この一組の要素は、プラスミド自体の複製をつかさどるものであって、ｓｌＤＮＡの合成を誘導するものではない。ｓｌＤＮＡを合成する機能を担っているのは、プラスミドの複製とは独立にｓｌＤＮＡの合成を誘導する一組の要素である。この一組の要素は、誘導されると逆方向反復配列の上流側に位置するプライマーを生成する、誘導可能な強力なプロモーター−オペレーターを有している。またこのプロモーター−オペロンの下流側に隣接して、このプラスミドは、ｓｌＤＮＡの合成を開始するＲＮＡプライマー、たとえばＲＮＡIIあるいはタンパク質、たとえば上述のプライマーゼをコードするＤＮＡ断片を有している。このＤＮＡ断片の下流には、上述したようにｓｌＤＮＡの合成に関わり、ｓｌＤＮＡの一部を構成する逆方向反復が位置している。ｓｌＤＮＡがアンチジーンを有していることが望ましい場合には、このアンチジーンは、逆方向反復の上流側、かつプライマーをコードするＤＮＡの下流側、すなわちこれらの２要素の間、あるいは逆方向反復配列の二つの反対向きのセグメントの間に、たとえば適当な制限部位への挿入によって位置させるものとする。上述したように、このアンチ遺伝子は、標的ｍＲＮＡにアニーリングして、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を阻害するか、あるいは、ｄｓＤＮＡと結合して三重らせんを形成することによって、標的ＤＮＡの発現を阻害することのできる断片である。
【０１９３】
こうした説明から明らかなように、ｓｌＤＮＡの合成に際して作動する諸要素は、プラスミドの複製を制御する諸要素とは異なった各種の遺伝的構築物を起源としうるものであるが、必ずしもそうでなくともかまわない。
【０１９４】
本明細書に教示するように、本発明は、ｓｌＤＮＡを、プラスミド自体の複製とは独立に合成するプラスミドを構築するにあたっての一般的なスキームを提供するものである。このスキームでは、ｓｌＤＮＡの合成に関与し、ｓｌＤＮＡのステムを構成する所望の長さの逆方向反復配列を含むＤＮＡ断片が、任意所望の複製可能なビークルに挿入される。したがって、本発明では、プラスミド自体の合成とは独立に、またプラスミド自体の合成より過剰となるように、ｓｌＤＮＡの複製を調節することが可能となるものである。
【０１９５】
本発明は、例示した特定の構築物、あるいは機能的要素の起源となる構築物に限定されるものではないことに留意することが肝要である。また、本発明は、特定のプラスミドに限定されるものでもなく、最終構築物に必要とされる遺伝的要素を提供するような任意の他のプラスミドあるいはビークルを選択することが可能である。
【０１９６】
また、本発明は、例示した特定の遺伝的要素に限定されるものでもない。当業者であれば、本発明の概念を本発明の一般的概念にしたがって実施する適当な手段を容易に構築しうるはずである。
【０１９７】
以上では、本発明の実施態様をいくつか記載した。以上の記載から、本発明の教示内容を利用することによって、ｓｌＤＮＡのような一本鎖分子を過剰発現するのと実質的に同一の結果をもたらすもっと別の実施態様も利用可能となることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は本発明のプラスミド、ｐＵＣＫ１０６の説明図である。
【図２】図２はｐＵＣＫ１９のＸｂａＩ部位に挿入された２１５−ｂｐのＤＮＡ塩基配列を示す。
【図３】図３Ａ，３Ｂ，３ＣはｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの形成とその特徴とを説明するポリアクリルアミドゲルの臭化エチジウム染色を示す。
【図４】図４Ａ，４Ｂ，４ＣはｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡのダイマー形成を説明するポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。
【図５Ａ】図５ＡはｓｌＤＮＡの５′端部のＤＮＡ塩基配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
【図５Ｂ】図５Ｂの左側はｓｌＤＮＡのループ部分の５′端部塩基配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。図５Ｂの右側はｓｌＤＮＡのループ部分の３′端部塩基配列決定を説明する乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
【図５Ｃ】図５ＣはｓｌＤＮＡの３′端部のＤＮＡ塩基配列の乾燥ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。
【図５Ｄ】図５ＤはｐＵＣＫ１０６からのｓｌＤＮＡの構造を説明する。
【図６Ａ】図６ＡはｓｌＤＮＡ合成の二つの可能なモデルのうちの一つを説明する図である。
【図６Ｂ】図６ＢはｓｌＤＮＡ合成の二つの可能なモデルのうちの他の一つを説明する図である。
【図７】図７のレーン１と３はサイズマーカーとしてのｐＢＲ３２２のＨａｅIII 消化体（digest）を示し、レーン２はｐＵＣ７からのｓｌＤＮＡを示す。
【図８】図８はｓｌＤＮＡを利用して、特定の遺伝子にランダムミューテーションを導入する具体例を示す。
【図９】図９はプラスミドｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．、ｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−Ｉ、及びｐＵＣＫ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．−IIを説明する図である。
【図１０】図１０はプラスミドｐＸＸ５６６の構築図である。
【図１１】図１１は実施例９−（３）におけるアンピシリン濃度とコロニー数の関係を示す図である。
【図１２】図１２はプラスミドｐＵＣＫＡ１０６ｄ．Ｐ．Ｏ．、ｐＵＣＫＡＧＴ３７、及びｐＵＣＫＡＣＡ３７を説明する図である。
【図１３】図１３はプラスミドｐＭＳＴＲ３７に挿入されている塩基配列及びプライマーの位置を示す図である。
【図１４】図１４はプラスミドｐＹＥＳ２−８−１０６及びｐＹＥＳ２−９−１０６の構築図である。
【図１５】図１５はｐＹＥＳ２−８−１０６，ｐＹＥＳ２−９−１０６、及び生産されたｓｌＤＮＡをＳａｌＩで切断したときの生成断片を説明する図である。
【図１６】図１６はｓｌＤＮＡの検出に用いた３種のプライマーの位置を示す図である。
【図１７】図１７は、本発明のｓｌＤＮＡを過剰発現させるための複製可能なビークルを構築する過程を示す模式図である。
【図１８】図１８は、最終構築物であるｐＨＳ２８７０を示す。
【図１９】図１９は、構築物ｐＨＳ２８７０（約４８０ｂｐ）と、このｐＨＳ２８７０のＨｉｎｄIII 制限部位に塩基４９個のＨｉｎｄIII 断片を挿入することによって構築されるｐＨＳ２８７０ＧＴと称されるプラスミド（約５００ｂｐ）の構築過程を示す模式図である。
【図２０】図２０は、ｐＨＳ２８７０ならびにｐＨＳ２８７０ＧＴから抽出したｓｌＤＮＡの電気泳動を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは、大腸菌ＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′の構築過程を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、大腸菌ＭＣ４１００λｐＦＴＲｌＦ′の構築過程を示す。
【図２２】図２２は、β−ガラクトシダーゼの発現レベルの検出を示す。
【参考文献】
Claims (8)
- 以下の要素：
（１）強力な誘導性のプロモーター−オペレーターをコードするＤＮＡ配列、
（２）このプロモーター−オペレーターの下流側に隣接する、プライマーまたはプライマーゼをコードするＤＮＡ配列、
（３）前記のプライマーまたはプライマーゼをコードするＤＮＡ配列の下流側に隣接する逆方向反復配列（ＩＲ）、
（４）前記のプライマーまたはプライマーゼをコードするＤＮＡ配列と前記逆方向反復配列との間、あるいは逆方向反復配列の二つの反対向きの配列の間に位置するアンチジーンの配列、および
（５）ＤＮＡビークル自体の複製に際して機能する複製起点、
を有するＤＮＡビークルを作製する工程、
前記ＤＮＡビークルで原核生物または非ヒト真核生物の細胞を形質転換する工程、および
前記の形質転換された細胞において、ステムがＩＲを含有し、ｓｓＤＮＡ内のアニールされた相補的塩基の二重鎖ＤＮＡで構成され、そして一方の端部でｓｓＤＮＡ分子の５′と３′の末端を形成し他方の端部で前記二重鎖ＤＮＡの反対側の両末端を結合するＤＮＡの一本鎖ループを形成する構造内に、アンチジーンの配列を含有するｓｌＤＮＡを生成せしめ、これにより前記アンチジーンの標的遺伝子の発現を阻害する工程、
を包含することを特徴とする、前記アンチジーンの標的遺伝子の機能の制御方法。 - 前記真核生物が、動物、植物または酵母である請求項１記載の方法。
- 前記原核生物が、イー・コリまたはビー・サブチリスである請求項１記載の方法。
- 前記ｓｌＤＮＡが、遺伝子の機能を制御するアンチジーンの配列として、アンチセンスＤＮＡ配列または三重らせん構造を形成できるＤＮＡ配列を含有する請求項１記載の方法。
- 以下の要素：
（１）強力な誘導性のプロモーター−オペレーターをコードするＤＮＡ配列、
（２）このプロモーター−オペレーターの下流側に隣接する、プライマーまたはプライマーゼをコードするＤＮＡ配列、
（３）前記のプライマーまたはプライマーゼをコードするＤＮＡ配列の下流側に隣接する逆方向反復配列、
（４）前記のプライマーまたはプライマーゼをコードするＤＮＡ配列と前記逆方向反復配列との間、あるいは逆方向反復配列の二つの反対向きの配列の間に位置するアンチジーンの配列、および
（５）ＤＮＡビークル自体の複製に際して機能する複製起点、
を有するＤＮＡビークルで形質転換された原核生物または非ヒト真核生物の細胞。 - 前記真核生物が、動物、植物または酵母である請求項５記載の細胞。
- 前記原核生物が、イー・コリまたはビー・サブチリスである請求項５記載の細胞。
- アンチジーンの配列として、アンチセンスＤＮＡ配列または三重らせん構造を形成できるＤＮＡ配列を含有するＤＮＡビークルで形質転換された請求項５記載の細胞。
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