JPS63294792A - 部位特異的突然変異体の作成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はラジオアイソトープを使用せず、容易に突然変
異体を取得するための、部位特異的突然変異体の作成方
法に関する。

［従来の技術］ 遺伝子工学的手法による蛋白質の発現や、蛋白工学等の
バイオテクノロジー利用技術の開発が盛んに行なわれる
ようになってきた今日、ＤＮＡ合成機も普及し、部位特
異的遺伝子変換（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　
ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）も各種論文、雑
誌を賑している。

部位特異的遺伝子変換は、ＤＮＡ合成機によって合成さ
れた十数〜数士塩基のジングルストランド（Ｓｉｎｇｌ
ｅ−ｓｔｒａｎｄ）　Ｄ　Ｎ　Ａを用イテ、ｌ　〜ｌ１
７Ｊｉの遺伝子変換を行なう手法である。しかしながら
、この変換効率は、その方法により異なるが、一般的な
方法ではそれ程高くないものである。

また、その変異体の検出方法も、ラジオアイソトープを
用いたスクリーニングか主流である。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、前記のラジオアイソトープによるスクリ
ーニングによれば　：１２ｐを用いるため、半減期か約
２週間であり、また高価である。しかも、その操作か煩
雑て、スクリーニングに要する時間かプラークハイブリ
ダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションで約
４日間必要という、操作に長期間を要するという欠点か
ある上、放射線被曝の危険性があるという欠点かあった
。

［問題点を解決するための手段］ そこて本発明者は上記従来技術の欠点に鑑み、これを解
決するため鋭意検討を行なった結果、本発明に到達した
ものである。

即ち、本発明によれば、１本鎖ＤＮＡと、遺伝子変換を
行なう部分を含む合成ＤＮＡとをアニールさせ、酵素反
応を利用して２本＠ｌＤＮＡとして大腸菌に形質転換を
行なうことにより、色の変化を判別して突然変異体を取
得することを特徴とする特許 質をコードしている遺伝子を有するプラスミドのクロー
ン化している遺伝子内の所定のアミノ酸に対応する（３
ｍ＋１又は２）（ここで、ｍは１以上の整Ｉ！！！！）
の塩基を、部位特異的遺伝子変換手段にて削除して１本
鎖ＤＮＡを作成し，次いで、・−・ＮＮＮｎ−−−（Ｎ
はＡ，Ｃ，Ｔ，Ｇの等比混合物一ｎはＡ，Ｃ，Ｔ，Ｇの
いずれかを指す。）を含む合成ＤＮＡを用いてアニール
させてフレームを元に戻すことにより，色の変化を判別
して突然変異体を得ることを特徴とする部位特異的突然
変異体の作成方法、が提供される。

蛋白質をコードする遺伝子は一つのオープンリーディン
グフレームを持っている。一般に，発現させる場合には
、その遺伝子の両末端近傍の制限酵素サイトを用いて、
発現ベクターにつなぎ、形質転換を行なう。後述のκＩ
Ｓベクターは、プロモーターのうしろ、フオノレミノレ
（ｆｏｒｍｙｌ）メチオニンより数アミノ酸後に２つの
マルチクローニングサイト（ＨｉｎｄＩＩＩ　、Ｐｓｔ
Ｉ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ，ＨｉｎｃＩＩ　、Ｂ
ａｌ１１１、ＳｎａＩ　、ＥｃｏＲＴ）と、その間に全
てのフレームに３種のストップコドンを含む中継ぎ配列
が入っており、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に続いてい
る。それ以外の構造は、従来公知のＰＵＣ系のベクター
と同じであり、アンピシリンによって形質転換体を選別
することができる。その２つのマルチクローニングサイ
トは、前後共金ての制限酵素サイトについて全てのフレ
ームがあり、前後全ての組み合わせが用意されており、
ＫＩＳベクターシリーズと呼んでいる。このベクターを
持つＥ。

ｃｏｌｉ　　ＪＭ８３（ΔＩａｃ　ｐｒｏ）はＸ−ｇａ
ｌ、アンピシリンを含むプレート上で白色コロニーを形
成する。ところかオーブンリーディングフレーム内の２
つの制限酵素サイトを用いて、前後共フレームの合うＫ
ＩＳベクターにクローニングしたプラスミドを持っＪＭ
８３は、Ｘ　−　ｇ　ａ　ｌ、アンピシリンを含むプレ
ート上で青色コロニーを形成し、容易にクローンを選別
することができる。また、β−ガラクトシダーゼが発現
していることより、接続部のフレームが合っていること
も同時に確認できる。

この蛋白質をコードしている遺伝子をもち、なおかつ青
色コロニーを形成するプラスミドのクローンしている遺
伝子内のアミノ酸を部位特異的遺伝子変換手段にて変換
させると同時に、その前後の塩基配列を変えて新しく制
限酵素サイトをつくり、また（３ｍ＋１又は２）（ここ
で、ｍは１以上の整数）の塩基を削除あるいは挿入すれ
ば、オープンリーディングフレームのフレームがずれる
ことにより．その突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）は白色コ
ロニーを形成する．従って、プレート上で青色コロニー
数百に対し、数パー上２５〜士数パーセントの、割合で
白色の突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）が得られ、検出は色
て行なわれ、確認は制限酵素か新しくできたことによっ
ててきる。

この過程で変換したいアミノ酸については、変換されて
フレームかずれたことになる。

次に、フレームを元に戻すための部位特異的遺伝子変換
を行ない、ずれたフレームを元に戻すと同時に、新しく
できた制限酵素サイトを消すか、または別の制限酵素サ
イトを作ることによって、白色コロニーから青色コロニ
ーを識別することで検出でき、制限酵素サイトて確認す
ることがてきる。

このようにして得られた突然変異体（ｓ＋ｕｔａｎｔ）
は、目的のアミノ酸だけを変換したものになっている。

この方法が特に有効な場合は、一つのアミノ酸を多くの
アミノ酸に変換しようとする場合である。例えば、・・
・ＮＮＮｎ・・・（ここて、ＮはＡ、Ｃ，Ｔ、Ｇの混合
物を指し、ｎはＡ、Ｃ。

Ｔ、Ｇのいずれかを指す。）という配列で変換させると
、全てのアミノ酸への変換体が得られる。

ラジオアイソトープを用いたプローブでは、欲しいアミ
ノ酸の数たけ合成しなければならないが、このＫＩＳベ
クターを用いた方法によれば、２つの合成ＤＮＡだけで
最高１９種の変換体を得ることができる。

また、発現に関していえば、プロモーターから最初のＡ
ＴＧをも正確に合せることができる。オーブンリーディ
ングフレームにおける中のサイトと、５′側の外のサイ
トを用いて、ＫＩＳベクターにクローニングする。この
場合、オーブンリーディングフレーム内の制限酵素サイ
トだけフレームが合うようにする。このプラスミドを含
むＪＭ８３は白である。そこで、ＫＩＳベクター内のＳ
Ｄ（シャイン　ダルガルノ）配列とＡＴＧとの間の距離
を合わせた合成ＤＮＡを用いて、余分な塩基配列を除く
部位特異的遺伝子変換を行なう。

突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）は、前はプロモーターから
合っており、後はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に合って
いるので、白色コロニーから青色コロニーとして検出す
ることができる。そして、つないだ制限酵素サイトより
後の遺伝子を、先にＫＩＳベクターに挿入した突然変異
体（■ｕｊａｎｔ）のプラスミドに継げると、最初のＡ
ＴＧより始まる純粋な蛋白質を発現することができるの
である。

次に、本発明の部位特異的突然変異体の作成方法に好ま
しく使用することができる、ＫＩＳベクターについて説
明する。

ＫＩＳベクターは、制限酵素旧ｎｄｍ　、ＰｓｔＩ　。

Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、ＨｉｎｃｌＩ　、Ｂａｇ旧、
３Ｈ工、ＥｃｏＲＩの各切断部位の塩基配列を有するマ
ルチクローニングサイトを２個有し、その間に３種の終
止コドンが挿入された中継ぎ塩基配列を有するベクター
であり、ＫＩＳベクターシリーズは前記の全ての切断部
位のアミノ酸に対応するフレームを３種類全て両マルチ
クローニングサイトに有する１８種類の各ベクターから
なるものである。

これら１８種の各ベクターは、第１図に示す如く、前部
の制限酵素１１ｉｎｄＥＩＩ　、ＰｓｔＩ　、　Ｓａｕ
　Ｉ　、Ａｃｃｒ。

旧ｎｃＩＩ　、Ｒａｍ旧、ＳｍａＩ　、ＥｃｏＲｒの各
切断部位の塩基配列を持つマルチクローニングサイトを
有するリンカ−（以後、ポリリンカーという）、中継ぎ
配列（必ず、３種の終止コドンが入る）、後部のポリリ
ンカー、ｌ　ａｃＺ　’と連なっている。そしてその他
の構造はアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ’）、複製開
始信号（Ｏｒｉ）を有するもの（ｐＫＩＳベクターとよ
ぶ）、および他の構造として前記のばか更に従来のｐＵ
Ｃベクターと同様に、Ｍ１３の遺伝子開領域（ＩＧ）を
有しているものかある（ｐＫＩＳｌベクターとよぶ）。

ＫＩＳベクターは、３種のフレームのポリリンカー（前
部）×３種のフレームのポリリンカー（後部）×２（ク
ローニングサイトが逆向きもある）から、１８種類存在
するということになるのである。

ＫＩＳベクターは、第１図におけるマルチクローニング
サイトであるＡ部分およびＢ部分は第１表に示すような
塩基配列を有するものである。また、これらの塩基配列
は第２表に示す通りである。

また、−例としてｐＫＩＳベクター及びｐＫＩＳｔベク
ターのうち、ｐＫＩｓ８０１／ｐＫＩＳ１０８０１の構
造の特徴部分を表わせば、第３表の如くである。

（以下、余白） このｐＫＩＳベクター又はｐＫＩｓ１ベクターにクロー
ン化された蛋白質をコードする遺伝子に、合成ＤＮＡを
用いてＤＮＡの突然変異によるアミノ酸変換をラジオア
イソトープを用いないで、突然変異体を容易に検出する
ことができるのである。

また、この突然変異体検出方法では、ラジオアイソトー
プを用いていないので、危険性かなく、しかも安価にて
きるため極めて有益である。

［実施例コ 以下、本発明を実施例に基いて説明する。

まず、本発明に用いるベクター（ｐＫＩＳベクターおよ
びｐＫＩｓ１ベクター）の作製方法について説明する。

■ｐＵｃ１０９０の作成方法 １）プラスミドｐＵＣ９（全酒造■販売）ｌｏｇｇを制
限酵素ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄＩＩＩ（
５０単位）を用いて３７°Ｃにて１時間反応させた後、
分解産物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分離し
ＥｃｏＲＩ切断部位からｌｌｉｎｄｍ切断部位まてのポ
リリンカー断片（３０塩基対）をゲルより切り出し、フ
ェノール処理を行なうことにより精製した。

２）プラスミドｐＵｃ１１９（全酒造■販売）１０ｇｇ
を制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄ■（
５０単位）を用いて３７°Ｃにて１時間反応させた後、
分解産物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分離し
ＥｃｏＲＩ切断部位からＩｔ　ｉ　ｎ　ｄ　■切断部位
まてのポリリンカ一部分を含まない断片（約３．１００
塩基対）をゲルより切り出し、フェノール処理を行なう
ことにより精製した。

３）１）で得られたポリリンカー断片０．０１ｇｇと２
）で得られたポリリンカーを含まない断片Ｏ９ｌルｇを
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて４°Ｃ
，１２時間連結反応を行なった。

４）３）で得られた反応生成物を、大腸菌ＪＭ８３株（
ａｒａ、△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）　、ｒｐｓＬ、φ８
０．ＩａｃＺ△Ｍ１５）を用いて形質転換を行なった後
、受容菌を寒天１．５％及びアンピシリンを１ｍＪ１当
り１００μｇを含むし寒天培地（組成＝１文当りトリプ
トンＬｏｇ、イーストエキス５ｇ、食塩１０ｇ、ｐＨ７
，５）に塗布し、３７°Ｃにて一昼夜培養を行ないいく
つかのコロニー（形質転換体）を得た。

５）コロニーの一つをアンピシリンを１ｍＪｌあたり１
００ルｇ含むＬ液体培地１０ｍ見に移植し、３７°Ｃに
て１２時時間上う培養を行ない、アルカリ−５ＤＳ法に
よりプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＵｃ１０
９０を得た。

■ｐＵｃ１０８０の　　　法 ■ｐＵｃ１０９０の作成方法のうち、■）のプラスミド
ＤＮＡとしてｐＵＣ８（全酒造■販売）を、又２）のプ
ラスミドＤＮＡとしてｐＵｃ１１８（全酒造■販売）を
用いることにより、同様の操作を経て、プラスミドｐｕ
ｃｔｏｓｏを作成した。

次いで、ｐＵｃ１０９１の作成方法を説明するが、まず
ｐＵｃ１０９０とｐＵｃ１０９１．ｐＵＣ１０９２の関
係をいうと、ｐＵｃ１０９０のポリリンカ一部分をはさ
んで、前部で１塩基、後部で２塩基欠失させたものがｐ
Ｕｃ１０９１で、ｐＵＣ１０９０のポリリンカ一部分を
はさんで、前部で２塩基、後部で１塩基欠失させたもの
がｐｔｒＣ１０９２”？’ある。また、ｐＵｃ１０８０
とｐＵＣ１０８１，ｐＵｃ１０８２の関係も、上記と同
様である。

■ｐＵｃ１０９１の作成　法 ｐＵｃ１０９１は次の段階にわけて作成した。

１）ＰＵＣ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成２）ポリリ
ンカ一部位の前部より一塩基欠いたオリゴヌクレオチド
の合成 ３）　　１）２）を用いた突然変異体の作成４）突然変
異体より一本鎖ＤＮＡの作成５）ポリリンカ一部位の後
部より２塩基欠いたオリゴヌクレオチドの合成 ６）　　４）５）を用いた再突然変異体の作成（ｐｕｃ
■−１） ｐＵｃ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成■ｐＵｃ１０９
０を大腸菌ＭＶ１１８４株（ａｒａ。

Δ（Ｉａｃ−ｐｒｏ）　、５ｔｒＡ、ｔｈｉ、（φ８０
．ＩａｃＺ　６Ｍ１５）、△（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０
６：：ＴｎｌＯ（ｔｅｔ’）、Ｆ’　　：ｔｒａＤ３６
．ｐｒｏＡＢ。

１ａｃｌｑＺ△Ｍ１５）を用いて形質転換を行なった。

■形質転換体を、アンピシリンを１ｍｆＬ当り１００ｇ
ｇ含む２ｘＹＴ液体培地（組成＝１見当りトリプトンｌ
ａｇ、イーストエキスＬｏｇ、食塩５ｇ、ｐＨ７，６）
１０ｍＭに植菌し、３７°Ｃにて１２時時間上う培養を
行なった。

■　■で得られた培養液１００．文に、Ｍ１３に０７由
来のへルバーファージ液（Ｉ　Ｏ”ｐｆｕ／ｍ　ｆＬ）
を加え、３７℃で３０分間静置した後、アンピシリンを
１ｍＭ当り１５０ｇｇ、カナマイシンを１ｒｒｊＬ当り
７０ｇｇ、チアミンを０．０１％含む２ｘＹＴ液体培地
１０ｍＭに加え、３７℃にて２４時間振どう培養を行な
った。

（Φ培養液１ｍ文を取り、遠心分離により菌体を除いた
後、２０％ＰＥＧ６０００及び２．５ＭＮａＣ１混合溶
液を２００１Ｌｉ加え遠心分離を行なうことにより、フ
ァージ粒子を沈降させ、エタノール沈殿処理を行なうこ
とにより、１本鎖ＤＮＡを分離精製、最終的に５０ｇ文
のＴＥ温溶液１０ｍＭ）−リス塩酸、１ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８，０の溶液）に溶解させた。

収量は約２〜１０ルｇ程度てあった。

■−２） 変異部分を含む合成ＤＮＡの作成 ＤＮＡ合成機を用いて第４表に示すＮｏ、９−１−５な
る配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、Ｔ４ＤＮ
Ａキナーゼ（２単位）を用いて３７°Ｃにて１時間反応
を行ない、５′末端部分をリン酸化させ、ブライマーＤ
ＮＡとした。

■−３） ポリリンカー前部に変異を有する突然変異体の■−１）
で得られた一本鎖ＤＮＡＩＪＬｇと、■−２）で得られ
たブライマーＤＮＡ２０ｐｍｏｆを混合して６０℃で３
０分間、引続き３７℃で３０分間保温し、アニーリング
させた後、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰを
最終濃度が各々０．５ｍＭとなるように加え、およびＡ
ＴＰを２５ｐｍｏｕ加え、クレノー（ＫＬＥＮＯＷ）酵
素（４単位）及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（１単位）を用い
て３７°Ｃにて３時間反応を行ない、突然変異部分を含
む２本銀ＤＮＡを合成した。

次に、反応生成物の一部（約０．１ｇｇ）を大腸菌ＪＭ
８３株を用いて形質転換を行なった後、受容菌を１．５
％寒天、アンピシリンを１ｍ文当り１１００ｐ及びＸ−
ｇａｌを０．００５％含むし寒天培地に塗布し、３７℃
にて一昼夜培養を行ない、出現したコロニーの内、白色
コロニーを選択した。白色コロニーの出現率は５〜１０
％程度であった。

次いで、白色コロニーを、アンピシリンを１ｍ文当り１
００ルｇ含むＬ液体培地ｌＯｍ文に植菌し、３７℃で１
２時時間上う培養を行ない、常法によりプラスミドＤＮ
Ａを回収した。回収したプラスミドＤＮＡを再び大腸菌
ＭＶ１１８４株を用いて形質転換を行なった後、受容菌
を寒天１．５％、アンピシリンをＩｎ文当り１１００Ｊ
Ｌ、Ｘ−ｇａｌをｏ、ｏｏｓ％及びＩ　ＰＴＯを１ｍＭ
含むし寒天培地に塗布し、３７°Ｃにて一昼夜培養を行
ない、白色コロニーを選択し、アンピシリンを１ｍＭ当
り１００ｇ、ｇ含むＬ液体培地１０ｍＪ１に移植し、３
７℃にて１２時時間上う培養を行ない、常法によりプラ
スミドＤＮＡを分離した。

■−４）突１、変異−末鎖ＤＮＡの作成■−３）で得ら
れた突然変異体プラスミドを有する大腸菌ＭＶ１１８４
株より、■−１）と全く同じ方法を用いて突然変異を有
する一本鎖ＤＮＡを得た。

■−５）ポリリンカー後部に・　、を有する合成ＤＮＡ
（７）立虞 ■−２）と同じ方法を用いて第４表のＮｏ、９−２−５
なる塩基配列を有する合成ＤＮＡを作成し、リン酸化を
行ないブライマーＤＮＡを作成した。

■−６）再突然・　　の作成 ■−３）と同じ方法を用いて、■−４）て得られた二本
鎖ＤＮＡ及び■−５）で得られたプライマーＤＮＡより
二本鎖ＤＮＡを合成、大腸菌ＪＭ８３株を用いて形質転
換を行なうことにより青色コロニーを得た。これよりプ
ラスミドＤＮＡを回収し、再び大腸菌ＭＶ１１８４株を
用いて形質転換を行なうことにより青色コロニーを出現
させた。これよりプラスミドＤＮＡを回収することによ
り、ポリリンカ一部分の前後２個所に合計３塩基対欠失
したプラスミドｐＵｃ１０９１を得た。

■ＰＵＣ１０９２の作成方法 プラスミドｐＵｃ１０９２の作成は、前記■のプラスミ
ドｐＵｃ１０９１の作成例に帛して行なった。変更点は
次の通りである。

（１）■−２）の塩基配列を第４表のＮｏ、９−１−３
とする。

（２）■−５）の塩基配列を第４表のＮｏ、９−１−５
とする。

これによりプラスミドＰＵＣ１０９０よりポリリンカ一
部分の前部を２塩基、後部を１１１！基、合計３塩基欠
いた突然変異プラスミドｐＵｃ１０９２を得た。

■ｐＵｃ１０８１．ｐＵｃ１０８２の作成方法前記■■
■と同様に、プラスミドｐｔｒｃｔｏｓＯを基本として
ポリリンカ一部分を１塩基および２塩基ずらした突然変
異プラスミドＰＵＣ１０８１、ｐＵｃ１０８２を作成し
た。

変更点は次の通りである。

（１）ｐＵｃ１０８１．ｐＵｃ１０８２共に、■−１）
のプラスミドとしてｐＵｃ　１０８０を用いた。

（２）■−２）ノ合成ＤＮＡとして、ｐＵｃ１０８１に
おいては第４表のＮｏ、８−１−５．ｐＵｃ１０８２に
おいてはＮｏ、８−２−５を用いた。

（３）■−５）の合成ＤＮＡとして、ｐＵｃ１０８１に
、おいては第４表のＮｏ、８−１−３、ｐＵＣ１０８２
においてはＮｏ、８−１−５を用いた。

以上、基本となるプラスミドｐＵｃ１０９０、ｐｕｃｔ
ｏａｏ及び作成した突然変異プラスミドｐＵｃ１０９１
．ｐＵｃ１０９２、ｐＵＫＪ１０８１及びｐＵｃ１０８
２の間の関係についてまとめると、第５表のとおりとな
る。

第　　４　　表 合成ＤＮＡの塩基配列表 変異部分を含むＤＮＡ塩基配列 ５’　ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＣＯＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧ３’
５’　ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡ八ＴＴＣＣＣＧＧ３’
（へ−１−５） ５’　ＣＣＧＧＧＡΔＴＴＣＴＡＡＴＣΔＴＧＧＴ３’
５’　ＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣΔＴＧＧＴＣ３’
５’　ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
５’　ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
第　　５　　表 ■ｐＫＩｓ１ベクターシリーズの作成 ［相］）−１）乙ｉ又凶２上五次１ プラスミドｐＵＣ１０９０１０ＪＬｇを制限酵素１１ｉ
ｎｄｍ　（５０単位）及びＡａｔｒＩ（４単位）を用い
て３７℃にて１時間反応させ分解産物を０．７％アガロ
ース電気泳動を用いて分離し、ポリリンカ一部分を含む
旧ｎｄＩＩＩ切断部位からＡａｔ　ＩＩ切断部位までの
断片（約ｔ　、ｏｏｏ塩基対）をゲルより切り出し、フ
ェノール処理を行なうことにより精製し、１０９０−Ｌ
フラグメント１終ｇを得た。

同様に、制限酵素ＥｃｏＲ［（５０単位）及び八ａｔＩ
Ｉ（４単位）を用いて、ポリリンカ一部分を含むＥｃｏ
ＲＩ切断部位からＡａｔ　ＩＩ切断部位までのＤＮＡ断
片（約２，２００塩基対）１０９０−Ｒフラグメント２
１Ｌｇを得た。

以下、プラスミドｐＵｃ１０９１，１０９２．１０８０
．１０８１．１０８２を用いて同様の操作を行なうこと
により、１０９１−Ｌ、１０９１−Ｒ，１０９２−Ｌ、
１０９２−Ｒ，１０８０−Ｌ、１０８０−Ｒ，１０８１
−Ｌ％　１０８１−Ｒ，１０８２−Ｌ及び１０８２−Ｒ
フラグメン８合計１２種類を得た。各フラグメント、切
断されるプラスミド及び切断する酵素の組合わせは次の
通りである。

ＤＮＡ合成機を用いて第６表に示すジヨイント配列の玉
鎖及び下調を各々合成した。　　　　−玉鎖ＩＪＬｇ及
び下調ＩＪｊ−ｇを混合し、７０°Ｃに３０分間保温し
、室内に放置し徐々に冷却することによりアニーリング
を行ない、２本鎖ＤＮＡとした。

■−３）Ｌ　　Ｒフラグメントとジヨイント　　の金 ■−１）で得られた１０９０−Ｌフラグメント０、ｉｆ
ｉＬｇ、１０９０−Ｒフラグメント０．２鉢ｇ及び■−
２）で得られたジヨイント配列０．０１ｇｇを、常法に
よりＴ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて連結反応を
行なわせた。反応液を大腸菌ＪＭ８３株を用いて形質転
換を行なった後、受容菌を１．５％寒天及びアンピシリ
ンを１　ｍ　Ｊ１当り１００ｇｇ含むし寒天培地に塗布
し、３７℃にて一昼夜培養することにより形質転換コロ
ニーを出現させ、アンピシリンを１ｍ見当りｌｏＯ，ｇ
含むし液体培地１０ｍ１に移植し、３７°Ｃにて１２時
間振どう培養を行なった。その後培養液より常法により
プラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＫＩｓ１０９
００を得た。

以下、フラグメントの組合わせを変えることにより、ｐ
ＫＩｓ１０９０１．１０９０２．１０９１Ｏ１１０９１
１，１０９１２，１０９２０，１０９２１，１０９２２
，１０８００，１０８０１，１０８０２，１０８１０，
１０８１１，１０８１２，１０８２０，１０８２１及び
１０８２２の合計１８種類のｐＫＩｓ１ベクターシリー
ズを作成した。

完成したｐＫＩｓ１ベクター及びフラグメントの組合わ
せは次の通りである。

■ｐＫＩＳベクターシリーズの作成 プラスミドｐＵＣ９５弘ｇを制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩ（２
４単位）を用いて３７℃にて１時間反応させた後、０．
７％アガロース電気泳動にて分離を行ない、ポリリンカ
一部分を含まないＤＮＡ断片（約２，３００塩基対）を
ゲルより切り出し精製した。

又、ｐＫＩｓ１０９シリーズ（即ち、ｐＫＩＳ１０９０
０．１０９０１．１０９０２．１０９１０．１０９１１
，１０９１２．１０９２０，１０９２１．１０９２２）
各々５弘ｇを同じく制限酵素ＰｖｕＩＩ（２４単位）を
用いて３７℃にて１時間反応させた後、０．７％アガロ
ース電気泳動にて分離を行ない、ポリリンカ一部分を含
むＤＮＡ断片（約３００塩基対）をゲルより精製した。

次に、上記のｐＵＣ９由来のＤＮＡ断片０．２弘ｇ及び
ｐＫＩｓ１０９シリーズ由来のＤＮＡ断片各々０．０５
壓ｇを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて
４°Ｃ１１２時間連結反応を行ない、大腸菌ＪＭ８３株
を用いて順次形質転換を行ない、形質転換体よりプラス
ミドＤＮＡを順次分離し、プラスミドｐＫＩ　５９００
．９０１゜９０２．９１０．９１１．９１２．９２０．
９２１．９２２を得た。

の作成 ■−１）において、ｐＫＩｓ１０９シリーズの代りにＰ
ＫＩＳ１０Ｂシリーズ（即ち、ｐＫＩＳ１０８００．１
０８０１，１０８０２．１０８１Ｏ，１０Ｂ１１．１０
８１２．１０８２０．１０８２１．１０８２２）を用い
ることにより、全く同様の操作を経て、プラスミドＰＫ
Ｉ　５８００．８０１．８０２．８１０．８１１．８１
２．８２０．８２１．８２２を得た。

次に、本発明の具体的な実施例を説明する。

（実施例１） マウス白血球ウィルスの逆転写酵素をコードしている部
リー遺伝子約２．３ｋｂ　（キロ塩基対）を含むプラス
ミドｐ　Ｋ　Ｐ　１　（’Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　Ｎａ
ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　　５ｃｉｅｎｃｅ（ＰＮ
八へ）、ＵＳＡ」　ｖｏ１８２．ｐａｇｅ４９４４　〜
４９４８、１９８５に示されているプラスミドｐｓＨ１
のクローンのＳａｃ　Ｉ−旧ｎｄＩＩＩ　（２，：ｔｋ
ｂ）をｐＵｃ１８に組み換えたもの）２ＪＬｇを、制限
酵素ＥｃｏＲＩ　　（ｌＯ単位）と旧ｎｄｍ　（１２単
位）により３７℃で１時間処理し、０．７％アガロース
電気泳動後。

逆転写酵素遺伝子を含む約２．３ｋｂのＤＮＡ＠片をゲ
ルより切り出し、フェノール処理を行なうことにより精
製した。また、ｐＫＩｓ８１１　２ｇｇを、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ　　（１０単位）と旧ｎｄＩＩＩ（１２単位）
により３７°Ｃで１時間処理し、同様に約２．７ｋｂの
ＤＮＡ断片を回収した。得られた２、３ｋｂのＤＮＡ断
片０．ｔｐＬｇと２．７ｋｂのＤＮＡＦＩｉ片０．ｌ用
ｇを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）により１６
℃、１２時間処理した。このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌
ＪＭ８３株の形質転換を行ない、受容菌を、寒天１．５
％、アンピシリン１００ｇｇ／ｍＪ１．Ｘ−ｇａｆＬｏ
、００５％を含むし寒天培地に塗布し、３７℃にて一昼
夜培養を行ない、形質転換体コロニーを青色で得た。こ
の形質転換株を、Ｌ液体培地で３７℃、１２時間培養し
、アルカリ−５ＤＳ法でプラスミドＤＮＡを調製し、ｐ
ＫＰＢとした。

ｐＫＰＢ　　２ルｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（１０単
位）、クレノー酵素（２単位）、最終濃度が各々０．１
ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰの混合物
を加え、３７°Ｃ″′ｃ１時間処理し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ２単位にて１６℃で１２時間処理した後、大腸菌Ｊ
Ｍ８３株に同様に導入した。

白い形質転換株のコロニーをＬ液体培地に植菌し、３７
°Ｃて１２時間培養した後、アルカリ−３ＤＳ法でプラ
スミドＤＮＡを調製し、ｐＫＰＷとした。

ｐＫＰＷより、逆転写酵素のＮ末端側の余分なアミノ酸
配列を、合成ＤＮＡを用いた部位特異的遺伝子変換を行
なって除去した。

ｐＫＰＷ　　５Ｊｊ−ｇを、制限酵素ＰｖｕＩＩ（１８
単位）とＮｄｅｌ　（２０単位）により３７℃、１時間
処理し、０．７％アガロース電気泳動後、約２．２ｋｂ
のＤＮＡ断片を回収した。また、ｐＫＰＷ５ｐｇを、制
限酵素５ｃａｌ　（１８単位）と脱リン酸酵素ＢＡＰ　
（０，２単位）により３７℃、１時間処理し、同様に約
５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。得られた２、２ｋｂお
よび５ｋｂの両ＤＮＡ断片を夫々０．６ＪＬｇづつ、及
びＳ　Ｏｐ　ｍ　ｏ文の第７表（ａ）に示す５′−リン
酸化合成ＤＮＡ　（４０塩基対）を混合し、１００ｍＭ
ＮａＣ文、６．６ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，６）、８ｍ
ＭＭｇ　Ｃｌ　ｔ、１ｍＭβ−メルカプトエタノール溶
液とし、１００°Ｃで３分間処理した後、３０℃で３０
分間処理した。このＤＮＡ溶液１７．２ｐ−１，５ｍＭ
ｄＮＴＰ　（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰ）
７ＩＬｌ、ｌ　ＯｍＭＡＴ　Ｐ　３　、６　ｇ文と、ク
レノー酵素（４単位）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ｌ単位）
を加え、２５℃で３時間処理した。

このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ８３株の形質転換を
行ない、アンピシリンとＸ　−ｇ　ａ　ｌを含むＬ寒天
培地上で、青いコロニ〒を形成するクローンｐＫＰｐｏ
ｌ−Ｎを得た。この突然変異体は約５％の頻度で得られ
た。

ｐＫＰｐｏｌ−Ｎ（逆転写酵素とβ−ガラクトシダーゼ
融合蛋白質をコードするプラスミド）に、合成ＤＮＡを
用いた部位特異的遺伝子変換で逆転写酵素の純粋な領域
と思われるＣ末端（ＴＩ及びＴ２）に終止コドンを導入
した。

プラスミドｐＫＰ　ｐｏｌ−Ｎ　　５　ｐ、　ｇを、制
限酵素５ｃａｌ　（１８単位）と脱リン酸酵素ＢＡＰ　
（０，２単位）で３７°Ｃ，１時間処理し、同様に約４
．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。

また、　ｐＫＰ　ｐｏｌ−Ｎ　　５ＪＬｇを、制限酵素
Ｋｐｎｒ　（５０単位）と旧ｎｄｍ（２４単位）により
３７℃で１時間処理し、同様に約２．９ｋｂのＤＮＡ断
片を回収した。４．９ｋｂ及び２．９ｋｂのＤＮＡ断片
をそれぞれＯ，ａＰｇづつ、および５０　ｐ　ｍ　ｏ　
４１の５′−リン酸化合成ＤＮＡ（第７表Ｃ）を用いて
上記と同様の操作により、白い形質転換株の突然変異体
及びｐＫＰ　ｐｏｌ−ＮＴ２を得た。

得られたクローンについて逆転写酵素活性を測定した。

まず、逆転写酵素活性の測定法を説明する。

各クローンについて、大腸菌ＪＭ　１０３練に導入した
ものを使用した。各プラスミドを持った大腸菌を、Ｌ液
体培地で３７°Ｃ，１２２時間振う培養した培養液０．
２ｍ文をＭ９液体培地（組成＝１文当りリン酸２ナトリ
ウム　６ｇ、リン酸１カリウム　３ｇ、塩化アンモニウ
ム　Ｉｇ、食塩０．５ｇ、　ＷＬ酸マグネシウム　１ｍ
Ｍ、塩化カルシウム　０．１ｍＭ、ＰＨ７−４）（＋０
．２％カザミノ酸＋０．２％グリセロール＋５ＪＬｇ／
ｍ文チアミン）１０ｍＪＬに加え、３０°Ｃで１時間振
どう培養した後、５０井文の２００　ｍ　Ｍ　Ｉ　Ｐ　
Ｔ　Ｇをそれぞれ加え、さらに３０℃で３時間振どう培
養した。各培養液を水中に１時間浸し、ＯＤ　？、”を
それぞれ測定した。次にＭ９培地を用いて各試料を夫々
ＯＤ　７ｏ”が０．２となるように希釈した後、０．１
ｍＭをマイクロ遠心チューブに採取した。遠心して菌体
な集めた後、緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．３ＭＮａＣ文、ｐＨ７，５）で菌体を洗
浄し、遠心して集めた菌体を８ル文の同緩衝液に攪拌し
た後、ｌＩＬ文の１０　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌリゾチーム
溶液を加え、０℃で１５分間処理した。さらに、１％ト
リトンＸ−１００，１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）Ｌｇｌを加え、０℃、１０分間処理し、各粗抽出液
とした。得られた各粗抽出液に、９０ル立の反応溶液（
３０ｇ　ｇ　／　ｍ文ｐｏ　１　ｙＣｒＣ（ｄＧ。

−Ｉ（１）、２０延ＭｄＧＴＰ、１１００ＯＣＰ／ｐｍ
　ｏ　ｌ、ｄ−３２Ｐ−ｄＧＴＰ、０．５ｍＭＭｎＣｌ
　２．５０　ｍ　Ｍ　トリス塩酸、ｐＨ８−３，２０ｍ
Ｍジチオスレイトール、６０ｍＭＮａＣＪＬ、０．１％
ＮＰ−４０）を加え、２５℃で３０分間処理した０反応
終了後、反応溶液３０ＪＬｌを、ＤＥ−８１デイスクに
スポットし、２ｘＳＳＣ（組成：　０．３ＭＮａＣＪＩ
　　０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）２００ｍｕで５分
間処理を３回行ない、９９．５％エタノール２００ｍ文
で５分間処理後、空気乾燥した。

乾燥したＤＥ−８１デイスクをバイアルに入れ、シンチ
レーションカウンターでチェレンコフ効果を用いてカウ
ントを測定したところ、第２図のようになった。

ベクターのみを含むクローンに比べ、ｐＫＰｐｏｔ−Ｎ
には逆転写活性が認められた。ＰＫＰｐｏｌ−ＮＴ２に
ついては、さらに活性か上昇していた。

更に、カリフラワーモザイクウィルスの逆転写酵素のア
ミノ酸配列より予想されるＣ末端（ＴＩ）に、同様に第
７表（ｂ）に示す合成ＤＮＡを用いて部位特異的遺伝子
変換を行なった。

得られたクローンｐＫＰ　ｐｏｌ−ＮＴＩは、第２図に
示したように、ｐＫＰ　ｐｏｌ−ＮＴ２よす更ニ高い活
性を示した。

（実施例２） モロニーマウス白血病ウィルスの変異型逆転写酵素の発
現プラスミドの作製法およびその逆転写活性について説
明する。

モロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素において、
他のレトロウィルス等と最も相同性の高いアミノ酸配列
の中に変異を挿入した。その結果、天然のものとよく似
た活性を示すものや、マンガンだけでなくマグネシウム
でも活性を示すもの、天然のものより活性の高いもの等
が得られた。

（作製法） モロニーマウス白血病ウィルスの逆転写酵素の最も相同
性の高いアミノ酸配列を含む領域を有するプラスミドｐ
ＢＢ９を作成した。逆転写酵素領域を含むクローンｐ　
Ｓ　Ｈ１（’Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　Ｎａｔｉｏｎａｌ
　　八ｃａｄｅ＋ｓｙ　　５ｃｉｅｎｃｅ（ＰＮＡＳ）
、ＵＳＡＪ　ｖｏｌ、８２．ｐａｇｅ４９４４〜４９４
８．１９８５）５　ｇ　ｇ　？：％制限酵素Ｂａｍ１ｌ
ｌ　　（２０単位）で３７℃、１時間処理し、０．７％
アガロース電気泳動を用いて０．３ｋｂ　（キロ塩基対
）のＤＮＡ断片を切り出し、フェノール処理を行なうこ
とにより精製した。一方、ｐＫＩ　Ｓ９００２ＪＬｇを
制限酵素Ｂａｍｆｌｌ（１０単位）で３７°Ｃ，１時間
処理した後、　同様の操作を行なうことにより２．７ｋ
ｂのＤＮＡＩＩ片を精製した。上記の逆転写酵素領域の
０．３ｋｂとＰＫＩＳ９００の２．７ｋｂのＤＮＡＩｒ
片各々０．ＩＩＬｇを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２
単位）を用いて、４　’Ｃ１１２時間連結反応を行なっ
た０反応液の一部を大腸菌ＪＭ８３株を用いて形質転換
を行ない、受容菌を１．５％寒天、アンピシリン１００
　ｐ−ｇ　／　ｍ文及びＸ−ｇａｌ０．００５％を含む
し寒天培地に塗布し、３７°Ｃにて一昼夜培養を行ない
、青色の形質転換コロニーを得た。

形質転換体コロニーをＬ液体培地（アンピシリンを１ｍ
９．当り１１００ｐ含む）ｌＯｍｉに植菌し、３７℃に
て１２時時間上う培養を行ない、常法によりプラスミド
ＤＮＡ　　ｐ　Ｂ　Ｂ　９を分離した。

ｐＢＢ９　２ｐｇを制限酵素５ｃａｌ　（１８単位）と
脱リン醜酵素ＢＡＰ　（０，２単位）を用いて、３７℃
で１時間処理した後、０．７％アガロース電気泳動を用
いて約３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また、ｐＢＢ９
　２．ｇを、制限酵素ＥｃｏＲＩ（２０単位）とＰｓｔ
ｌ（２０単位）を用いて３７°Ｃで１時間処理した後同
様の操作を行なうことにより、２．７ｋｂのＤＮＡ断片
を精製し、以下の部位特異的遺伝子変換を行なった。

先ず、目的のアミノ酸バリンの塩基配列を含む４塩基を
削除する遺伝子変換を行なう。

上記のＤＮＡ断片各０．６１Ｌｇと、５０ｐｍ。

見の５′リン酸化合成ＤＮＡ　（第８表ａに示す）を用
いて、１００℃で３分間処理した後、３０℃で３０分間
アニーリングを行ない、更にこのＤＮＡ溶液１７．２ｇ
文にＳｍＭｄＮＴＰ　　ＴＩＬ文と１０ｍＭＡＴＰ３．
６ＩＬ文、クレノー酵素（４単位）およびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（１単位）を加えて、２５℃で３時間処理した。

このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ８３株に形質転換を
行ない、Ｘ−ｇａｌ、アンピシリンを含むＬ寒゛天培地
にて形質転換体の白いコロニーを得た。この形質転換体
コロニーを１０ｍＪｌのＬ液体培地に植菌し、３７゛　
　℃て１２時間培養し、常法によりプラスミドＤＮＡ　
（ＰＢＢＤ７）を分離した。

次に、削除した４塩基に相５する全てのアミノ酸に対応
するコドンを有するＮＮＮＧ　（Ｎ　：　ＡＧＣＴ等比
混合物）を挿入する遺伝子変換を行なう。

ｐＢ８７　２ｇｇを制限酵素５ｃａｌ　（１８単位）と
脱リン酸酵素ＢＡＰ　（０，２単位）を用いて、３７°
Ｃて１時間処理し、０．７％アガロース電気泳動を用い
て３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。また、ｐＢ８７　２
ＪＬｇを、制限酵素ＥｃｏＲｒ　　（２０単位）とＰｓ
ｔｒ　（２０単位）を用いて３７°Ｃ″ｒ！１時間処理
した後同様の操作で、２．７ｋｂのＤＮＡ断片を精製し
た。これらの３ｋｂと２．７ｋｂのＤＮＡ断片を夫々０
．６．ｇと、上記のＮＮＮＧ配列を含む５０　ｐ　ｍ　
ｏ　ｎの５′リン酸化合成ＤＮＡ（第７表すに示す）を
用いて、上記の方法により部位特異的遺伝子変換を行な
った。得られた形質転換体の青いコロニー２４個を植菌
し、常法によりプラスミドＤＮＡを分離した後、大腸菌
ＪＭ８３株に形質転換した。

２４枚のプレートよりそれぞれ青いコロニーを、Ｌ液体
培地に植菌し、培養後常法によりプラスミドＤＮＡ　（
ｐＢＢＸ）を分離した。各々のＤＮＡをジデオキシ法に
よるＤＮＡシーケンシングを行ない、変換した塩基配列
及びアミノ酸を確認したところ、２４個中１０種類のア
ミノ酸変換体が得られた。

各々のアミノ酸の変換したプラスミド２ルｇを、制限酵
素Ｂａａ＋ＩＩＩ　　（１０単位）を用いて３７℃で１
時間処理した後０．７％アガロース電気泳動を用いて０
．３ｋｂのＤＮＡＩＩ片を精製した。また、天然の逆転
写酵素発現プラスミドｐＫＰｐｏｌ　−ＮＴＩ（バリン
）５ＩＬｇを７、Ｂａｏ＋ｌｌＩ　　（５０単位）を用
いて３７°Ｃで１時間処理した後同様の操作を行なうこ
とにより、約４．７ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。この
４．７ｋｂのＤＮＡ断片と各々のアミノ酸変異を含む０
．３ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ０．ＩＪＬｇづつ混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位づつ）を用いて４℃で
１２時間連結反応を行なった。

これらのＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ８３株に形質転
換を行ない、アンピシリン、Ｘ−ｇａｌを含むＬ寒天培
地にて形質転換体コロニーをそれでれ得た。これらを、
Ｌ液体培地に植菌し、３７’Ｃ，１２時間振どう培養を
行ない、常法によりプラスミドＤＮＡを分離した。

以上の製造工程を第３図に示す。

これらはそれぞれ、ｐＫＰ−ＴＩＬ（ロイシン）、ｐＫ
Ｐ−ＴＩＩ　（イソロイシン）、ＰＫＰ−ＴＩＡ　（ア
ラニン）、ｐＫＰ−ＴＩＦ　（フェニルアラニン）、ｐ
ＫＰ−ＴＩＲ（アルギニン）、ｐにＰ−ＴＩＫ（リジン
）、ｐＫＰ−ＴＩＤ　（アスパラギン酸）、ｐＫＰ−Ｔ
ＩＮ　（アスパラギン）、ｐＫＰ−ＴＩＭ　（メチオニ
ン）、ｐＫＰ−ＴＩＧ（グリシン）である。

これらのクローンについて、逆転写活性を測定した。結
果を第８表に示す。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明の部位特異的突然変異体の
作成方法によれば、蛋白質をコードしている遺伝子を極
めて容易に検出することかできるという利点を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係るベクターの一例の遺伝子地図、第
２図は逆転写酵素活性を示すクラ７、第３図は本発明の
一実施例を示す工程図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）１本鎖ＤＮＡと、遺伝子変換を行なう部分を含む
   合成ＤＮＡとをアニールさせ、酵素反応を利用して２本
   銀ＤＮＡとして大腸菌に形質転換を行なうことにより、
   色の変化を判別して突然変異体を取得することを特徴と
   する部位特異的突然変異体の作成方法。
2. （２）蛋白質をコードしている遺伝子を有するプラスミ
   ドのクローン化している遺伝子内の所定のアミノ酸に対
   応する（３ｍ＋１又は２）（ここで、ｍは１以上の整数
   ）の塩基を、部位特異的遺伝子変換手段にて削除して１
   本鎖ＤＮＡを作成し、次いで、…ＮＮＮｎ…（ＮはＡ、
   Ｃ、Ｔ、Ｇの等比混合物、ｎはＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇのいずれ
   かを指す。）を含む合成ＤＮＡを用いてアニールさせて
   フレームを元に戻すことにより、色の変化を判別して突
   然変異体を得ることを特徴とする部位特異的突然変異体
   の作成方法。
3. （３）蛋白質をコードしている遺伝子を有するプラスミ
   ドが、制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、
   Ａｃｃ I 、ＨｉｎｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I 、Ｅ
   ｃｏＲ I の各切断部位の塩基配列を有するマルチクロ
   ーニングサイトを２個有し、その間に３種の終止コドン
   が挿入された中継ぎ塩基配列を有するものである、特許
   請求の範囲第２項記載の方法。