JPS63294787A - ベクタ−とそれを用いた遺伝子の検出方法、および蛋白質の発現方法 - Google Patents

ベクタ−とそれを用いた遺伝子の検出方法、および蛋白質の発現方法

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JPS63294787A
JPS63294787A JP62130796A JP13079687A JPS63294787A JP S63294787 A JPS63294787 A JP S63294787A JP 62130796 A JP62130796 A JP 62130796A JP 13079687 A JP13079687 A JP 13079687A JP S63294787 A JPS63294787 A JP S63294787A
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JP62130796A
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Tomomasa Kanda
智正 神田
Kaoru Saigo
薫 西郷
Ichiro Shibuya
一郎 渋谷
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NIKKA UISUKII KK
Nikka Whisky Distilling Co Ltd
Original Assignee
NIKKA UISUKII KK
Nikka Whisky Distilling Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はベクターとそれを用いた遺伝子の検出方法、お
よび蛋白質の発現方法に関する。
ここでいう蛋白質とは、アミノ酸を複数個含むポリペプ
チドを指すものである。
［従来の技術］ 遺伝子工学的手法による蛋白質の発現や、蛋白工学等の
バイオテクノロジー利用技術の開発が盛んに行なわれる
ようになってきた今日、より優れた技術開発が大いに期
待されている０以上の蛋白工学の中でも、蛋白質（酵素
）の改良や解析は重要な役割を有しており、今後益々の
発展が期待されている。
近年、合成りＮＡを用いた遺伝子変換によるアミノ酸変
換等がよく行なわれるようになってきており、変異体の
検出にラジオアイソトープ（放射性同位元素）を用いた
オートラジオグラフィーが利用されている。
一方、従来より大腸菌を宿主とするｐＵＣベクター（ｐ
ＵＣ８／ｐＵＣ９）が市販されている。
このｐＵｃベクターは第２図に示すように、複製開始信
号（Ｏｒｉ）　、アンピシリン耐性遺伝子、ラクトース
プロモーター、オペレーター、β−ガラクトシダーゼ遺
伝子（ＪＬａｃＺ’）およびマルチクローニングサイト
より構成されている。このｐＵＣベクターは、ジデオキ
シ法によるＤＮＡシークエンシングに適したプラスミド
ベクターであり、１ａｃＺ’領域内にマルチクローニン
グサイトを持っており、イソプロピルβ−チオ−ガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ）と５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−ガラクトサイド（Ｘ−ｇａｌｌ）を含
むプｌ、−ト上で、外来ＤＮＡ　（目的とするＤＮＡ）
の挿入の有無を容易に色の変化（青→白）によって判別
することができるものである。また、ラクトースプロモ
ーターを利用して外来遺伝子を発現することもできるも
のである。
［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、前記従来のオートラジオグラフィーにあ
っては、ラジオアイソトープによる放射能被曝の危険性
があり、また高価であるという欠点があった。
また、染色体中の蛋白をコードする遺伝子を色の判別で
検索しようとする場合もしくはＪＬａｃＬａ上−ターに
つなげる外来遺伝子と１ａｃｚ’遣仏子を連結し融合蛋
白を発現させようとする場合、いずれの場合においても
、従来のｐＵＣ系ベクターを用いた場合、フレームが前
後とも完全にあうものを偶然に取得することしか出来な
かった（確率は１／１８）。
［問題点を解決するための手段］ 本発明は上記従来における問題点を解決した。
新規なベクターとそれを用いた遺伝子の検出方法および
蛋白質の発現方法を提供することを目的とする。そして
、その目的は、本発明によれば、制限酵素層ｎｄｍ　、
Ｐｓｔｌ　、　Ｓａｎ　Ｉ　、ＡｃｃＩ、旧ｎｔＡｌ　
、ＢａｍＨｌ、ＳｍａＩ　、ＥｃｏＲＩの各切断部位の
塩基配列を有するマルチクローニングサイトを２個有し
、該２個のマルチクローニングサイトの間に３種の終止
コドンが挿入された中継ぎ塩基配列を有することを特徴
とするベクター（第１発明）、制限酵素層ｎｄｍ、Ｐｓ
ｔＩ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、旧ｎｃ■、Ｂａｍ
ＨＩ、Ｓｍａ　Ｉ　、ＥｃｏＲＩの各切断部位の塩基配
列を有するマルチクローニングサイトを２個有し、該２
個のマルチクローニングサイトの間に３種の終止コドン
が挿入された中継ぎ塩基配列を有するベクターであって
、該ベクターは前記のすべての切断部位のアミノ酸に対
応するフレームを３種類すべて前記両マルチクローニン
グサイトに有する１８種のものであるベクターシリーズ
（第２発明）、制限酵素層ｎｄｍ、ＰｓｔＩ、　Ｓａｌ
　Ｉ　、Ａｃｃｌ、Ｈｉｎｃ■、Ｓａｎ旧、ＳｍａＩ　
、ＥｃｏＲＩの各切断部位の塩基配列を有するマルチク
ローニングサイトを２個有し、該２個のマルチクローニ
ングサイトの間に３種の終止コドンが挿入された中継ぎ
塩基配列を有するベクターであって、該ベクターは前記
のすべての切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３
種類すべて前記両マルチクローニングサイトに有する１
８種のものであるベクターシリーズの中から所望のベク
ターを選択し、該ベクターおよび蛋白質をコードしてい
る遺伝子を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合
することにより１色の変化を判別することにより蛋白質
をコードしている遺伝子を検出することを特徴とする遺
伝子の検出方法（第３発明）、制限酵素層ｎｄｍ　、Ｐ
ｓｔＩ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、Ｈｉｎｃ■、Ｓ
ａｎ旧、ＳｍａＩ　、Ｅｃ。
Ｒ１の各切断部位の塩基配列を有するマルチクローニン
グサイトを２個有し、該２個のマルチクローニングサイ
トの間に３種の終止コドンが挿入された中継ぎ塩基配列
を有するベクターであって、該ベクターは前記のすべて
の切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３種類すべ
て前記両マルチクローニングサイトに有する１８種のも
のであるベクターシリーズの中から所望のベクターを選
択し、該ベクターおよび蛋白質をコードしている遺伝子
を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合すること
により、蛋白質を発現させることを特徴とする蛋白質の
発現方法（第４発明）、制限酵素Ｈｉｎｄｍ　、Ｐｓｔ
Ｉ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、旧ｎｃＩＩ　、Ｂａ
ｍＨＩ、５ｓａ１、ＥｃｏＲｆの各切断部位の塩基配列
を有するマルチクローニングサイトを２個有し、該２個
のマルチクローニングサイトの間に３種の終止コドンが
挿入された中継ぎ塩基配列を有するベクターであって、
該ベクターは前記のすべての切断部位のアミノ酸に対応
するフレームを３種類すべて前記両マルチクローニング
サイトに有する１８種のものであるベクターシリーズの
すべての混合物、および蛋白質をコードしている遺伝子
を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合すること
により１色の変化を判別することにより蛋白質をコード
している遺伝子を検出することを特徴とする遺伝子の検
出方法（第５発明）、および制限酵素層ｎｄｍ、Ｐｓｔ
Ｉ　、　Ｓａｉ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、ＨｉｎｃＩＩ　、Ｓ
ａｎ旧、ＳｍａＩ　、ＥｃｏＲＩの各切断部位の塩基配
列を有するマルチクローニングサイトを２個有し、該２
個のマルチクローニングサイトの間に３種の終止コドン
が挿入された中継ぎ塩基配列を有するベクターであって
、該ベクターは前記のすべての切断部位のアミノ酸に対
応するフレームを３種類すべて前記両マルチクローニン
グサイトに有する１８種のものであるベクターシリーズ
のすべての混合物、および蛋白質をコードしている遺伝
子を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合するこ
とにより、蛋白質を発現させることを特徴とする蛋白質
の発現方法（第６発明）、により達成することができる
。
本発明のベクターは、制限酵素層ｎｄｍ　、ＰｓｔＩ　
。
３ａＱ　Ｉ　、Ａｃｃｌ、旧ｎｃＩＩ　、Ｂａａ旧、Ｓ
ｍａＩ　、ＥｃｏＲＩの各切断部位の塩基配列を有する
マルチクローニングサイトを２個有し、その間に３種の
終止コドンか挿入された中継ぎ塩基配列を有するベクタ
ーであり、本発明に係るベクターシリーズは前記の全て
の切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３種類全て
両マルチクローニングサイトに有する１８種類の各ベク
ターからなるものである。
これら１８種の各ベクターは、第１図に示す如く、前部
の制限酵素１１ｉｎｄｍ　、ＰｓＬＩ　、　Ｓａｌ　Ｉ
　、Ａｃｃｌ。
旧ｎｃＩＩ　、Ｒａｍ旧、Ｓ■ａＩ、ＥｃｏＲＩの各切
断部位の塩基配列を持つマルチクローニングサイトを有
するリンカ−（以後、ポリリンカーという）、中継ぎ配
列（必ず、３種の終止コドンが入る）、後部のポリリン
カー、ｌ　ａｃＺ　’と連なっている。そしてその他の
構造はアンピシリン耐性遺伝子（ＡＪｐゝ）、複製開始
信号（Ｏｒｉ）を有するもの（ｐＫＩＳベクターとよぶ
）、および他の構造として前記のほか更に従来のＰＵＣ
ベクターと同様に、Ｍ１３の遺伝子開領域（ＩＧ）を有
しているものがある（ｐにＩＳＬベクターとよぶ）。
本発明に係るベクターは、３種のフレームのポリリンカ
ー（前部）ｘ３種のフレームのポリリンカー（後部）×
２（クローニングサイトか逆向きもある）から、１８種
類存在するということになるのであり５本発明ではこれ
らの１８種類のベクターを組合わせて構成したベクター
シリーズをも提供するものである。
本発明のベクターにおいては、第１図におけるマルチク
ローニングサイトであるＡ部分およびＢ部分は第１表に
示すような塩基配列を有するものである。また、これら
の塩基配列は第２表に示す通りである。
（以下、余白） 第　　１　　表 また、−例としてｐＫＩＳベクター及びｐＫＩＳｌベク
ターのうち、ｐＫＩｓ８０１／ｐにｌ５１０８０１の構
造の特徴部分を表わせば、第３表の如くである。
（以下、余白） 本発明のベクターにおいては、前記の通り、前後に制限
酵素旧ｎｄｍ　、ＰｓｔＩ　、　５ａＪＬ　Ｉ　、Ａｃ
ｃｌ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｂａ１１旧、５ｓａＩ　、Ｅｃｏ
ＲＩの各切断部位の塩基配列、すなわち、マルチクロー
ニングサイトを有し、また、前記制限酵素の全ての切断
部位のアミノ酸に対応するフレームを３種類全て両マル
チクローニングサイトに有する１８種類の各ベクターを
取り揃えている。
従って、このベクターあるいはベクターシリーズを用い
ることにより、蛋白質をコードしている遺伝子を極めて
容易に検出（検索）することができる。すなわち、目的
の蛋白質をコードしている遺伝子を適宜の制限酵素にて
切り出した後、上記１８種のベクターから所望のベクタ
ーを選択し、そのベクターを前記遺伝子を切り出した制
限酵素と同一の制限酵素で切って、両者をＤＮＡリガー
ゼ等の連結酵素により結合させると、蛋白質をコードし
ている遺伝子を含んでいる場合のみ青色となるので、こ
の遺伝子を検出すること、更に同時に蛋白質を発現する
ことができるのである。
一方、例えば、真核生物等のような、蛋白質をコードし
ている遺伝子（構造遺伝子）が、全体の遺伝子の中で相
当な間隔をおいて並んでいる場合においては、所定の制
限酵素によりランダムに切断した遺伝子と、同一の制限
酵素で上記１８種のベクターを混合し、これらを切断し
て、ＤＮＡリガーゼ等の連結酵素により結合すれば、蛋
白質をコードしている遺伝子を含んでいる場合のみ青色
となるので、この遺伝子を検出すること、および同時に
蛋白質を発現することができる。
即ち、切断、結合の操作を１度あるいは少数回行なうこ
とにより、容易に目的とする遺伝子の検出（いわゆるカ
ラースクリーニンク）および蛋白質の発現を行なうこと
ができる。
ｐＫＩＳベクター又はｐＫＩｓ１ベクターにクローン化
された蛋白質をコードする遺伝子に、合成りＮＡを用い
てＤＮＡの突然変異によるアミノ酸変換をラジオアイソ
トープを用いないで、突然変異体を容易に検出すること
ができる。
また、上記の遺伝子検出方法では、ラジオアイソトープ
を用いていないので、危険性がなく、しかも安価にでき
るため極めて有益である。
［実施例］ 以下、本発明を実施例に基いて説明する。
まず、本発明のベクター（ｐＫＩＳベクターおよびｐＫ
Ｉｓｌベクター）の作製方法について説明する。
■ｐＵｃ１０９０の作成方法 １）プラスミドｐＵＣ９（宝酒造■販売）　１０ＩＬｇ
を制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄｍ（
５０単位）を用いて３７８Ｃにて１時間反応させた後、
分解産物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分離し
ＥｃｏＲＩ切断部位から旧ｎｄＩＩＩ切断部位までのポ
リリンカー断片（３０塩基対）をゲルより切り出し、フ
ェノール処理を行なうことにより精製した。
２）プラスミドｐＵｃ１１９（宝酒造■販売）１０ＩＬ
ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及び旧ｎｄ■
（５０単位）を用いて３７℃にて１時間反応させた後、
分解産物を０．７％アガロース電気泳動を用いて分離し
ＥｃｏＲＩ切断部位から１ｌｉｎｄＩＩＩ切断部位まで
のポリリンカ一部分を含まない断片（約３　、１００塩
基対）をゲルより切り出し、フェノール処理を行なうこ
とにより精製した。
３）■）で得られたポリリンカー断片０．０１１Ｌｇと
２）で得られたポリリンカーを含まない断片０．　ＩＩ
Ｌｇを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて
４°Ｃ１１２時間連結反応を行なった。
４）３）で得られた反応生成物を、大腸菌ＪＭ８３株（
ａｒａ、△（１ａｃ−ｐｒｏＡＢ）　、　ｒｐｓＬ　、
φ８０，１ａｃＺΔ麗ｔＳ）を用いて形質転換を行なっ
た後、受容菌を寒天１．５％及びアンピシリンを１ｒｒ
ｊＬ当り１１００ｐを含むし寒天培地（組成＝ｌｉ当り
トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、食塩ｔｏｇ、
ｐＨ７，５）に塗布し、３７℃にて一昼夜培養を行ない
いくつかのコロニー（形質転換体）を得た。
５）コロニーの一つをアンピシリンを１ｍＪｌあたり１
１００ｐ含むＬ液体培地１０ｍＪ１に移植し。
３７°Ｃにて１２時間振どう培養を行ない、アルカリ−
５ＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミド
ｐＵｃ１０９０を得た。
■ｐｕｃｔｏｓｏの ■ｐＵｃ１０９０の作成方法のうち、１）のプラスミド
ＤＮＡとしてｐＵＣ８（宝酒造■販売）を、又２）のプ
ラスミドＤＮＡとしてｐＵｃ１１８（宝酒造■販売）を
用いることにより、同様の操作を経て、プラスミドｐＵ
ｃ１０８０を作成した。
次いで、ｐＵｃ１０９１の作成方法を説明するが、まず
ｐＵｃ１０９０とＰＵＣ１０９１，ｐｔＪＣ１０９２の
関係をいうと、ｐＵｃ１０９０のポリリンカ一部分をは
さんで、前部で１塩基、後部で２塩基欠失させたものが
ｐＵｃ１０９１で、ｐＵＣ１０９０のポリリンカ一部分
をはさんで、前部で２塩基、後部で１塩基欠失させたも
のがｐＵＣ１０９２である。また、ｐＵｃ１０８０とｐ
ＵＣ１０８１，ｐＵｃ１０８２の関係も、上記と同様で
ある。
■　ＵＣ１０９１の作　　法 ｐＵｃ１０９１は次の段階にわけて作成した。
１）ｐＵｃ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成２）ポリリ
ンカ一部位の前部より一塩基欠いたオリゴヌクレオチド
の合成 ３）　　１）２）を用いた突然変異体の作成４）突然変
異体より一本鎖ＤＮＡの作成５）ポリリンカ一部位の後
部より２塩基欠いたオリゴヌクレオチドの合成 ６）　　４）５）を用いた再突然変異体の作成（ｐＵＣ
■−１） ｐＵｃ１０９０より一本鎖ＤＮＡの作成■ｐＵｃ１０９
０を大腸菌ＭＶ１１８４株（ａｒａ。
△（ｌａｃ−ｐｒｏ）、５ｔｒＡ、Ｌｈｉ、（φ８０，
１ａｃＺΔＭｉｓ）、Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：
：ＴｎｌＯ（ｔｅｔ’）、Ｆ’　：ｔｒａＤ３６．ｐｒ
ｏＡＢ。
Ｉａｃ　Ｉ’Ｚ△Ｍ１５）を用いて形質転換を行なった
。
■形質転換体を、アンピシリンを１ｍ１当り１００ルｇ
含む２ＸＹＴ液体培地（組成：ｌ見当りトリプトン１６
ｇ、イーストエキスＬｏｇ、食塩５ｇ、ｐＨ７，６）１
０ｍＭに植菌し、３７℃にて１２時時間上う培養を行な
った。
■　■で得られた培養液ｔｏｏｐｉに、Ｍ１３に０７由
来のへルバーファージ液（１０”ｐｆｕ／ｍ　１）を加
え、３７℃で３０分間静置した後、アンピシリンを１ｍ
！；Ｌ当り１５０ｇｇ、カナマイシンを１ｒｒＪｌ当り
７０ＪＬｇ、チアミンを０．０１％含む２ＸＹＴ液体培
地１０ｎｆＬに加え、３７°Ｃにて２４時間振どう培養
を行なった。
■培養液１　ｍ　ｌを取り、遠心分離により菌体を除い
た後、２０％ＰＥＧ６０００及び２．５ＭＮａＣ１混合
溶液を２００ｐＪＬ加え遠心分離を行なうことにより、
ファージ粒子を沈降させ、エタノール沈殿処理を行なう
ことにより、１．ｔ！１３ＤＮＡを分離精製、最終的に
５０１ＬｕのＴＥ温溶液１０ｍＭ　　トリス塩酸、１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０の溶液）に溶解させた。
収量は約２〜１０ｐｇ程度であった。
■−２） ・　部分を含む　成りＮＡの作成 りＮＡ合成機を用いて第４表に示すＮｏ、９−１−５な
る配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、Ｔ４ＤＮ
Ａキナーゼ（２単位）を用いて３７℃にて１時間反応を
行ない、５′末端部分をリン酸化させ、プライマーＤＮ
Ａとした。
■−３） ポリリンカー前部に・　を有する一部・　、体の１虞 ■−１）で得られた一本鎖ＤＮＡ１１Ｌｇと、■−２）
で得られたプライマーＤ　Ｎ　Ａ　２０　ｐ　ｍ　ｏ　
ｎを混合して６０℃で３０分間、引続き３７°Ｃで３０
分間保温し、アニーリングさせた後、ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰを最終濃度が各々０．５ｍＭと
なるように加え、およびＡＴＰを２５　ｐ　ｍ　ｏ　ｆ
Ｌ加え、クレノー（ＫＬＥＮＯＷ）酵素（４単位）及び
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１単位）を用いて３７℃にて３時
間反応を行ない、突然変異部分を含む２木鎖ＤＮＡを合
成した。
次に、反応生成物の一部（約０．ｌＩＬｇ）を大腸菌Ｊ
Ｍ８３株を用いて形質転換を行なった後、受容菌を１．
５％寒天、アンピシリンを１　ｍ　ｌ当りｔｏｏｕｇ及
びＸ−ｇａｌをｏ、ｏｏｓ％含むＬ寒天培地に塗布し、
３７℃にて一昼夜培養を行ない、出現したコロニーの内
、白色コロニーを選択した。白色コロニーの出現率は５
〜１０％程度であった。
次いで、白色コロニーを、アンピシリンを１ｍ見当りＺ
ｏｏルｇ含むＬ液体培地１０ｍｆＬに植菌し、３７℃で
１２時時間上う培養を行ない、常法によりプラスミドＤ
ＮＡを回収した。回収したプラスミドＤＮＡを再び大腸
菌ＭＶ１１８４株を用いて形質転換を行なった後、受容
菌を寒天１．５％、アンピシリンを１ｍ見当り１１００
ＩＬ、Ｘ−ｇａＩＬを０．００５％及びＩＰＴＧを１ｍ
Ｍ含むし寒天培地に塗布し、３７℃にて一昼夜培養を行
ない、白色コロニーを選択し、アンピシリンを１ｍ見当
り１００．ｇ含むＬ液体培地１０ｍ１に移植し、３７℃
にて１２時時間上う培養を行ない、常法によりプラスミ
ドＤＮＡを分離した。
■−４）突然変異−水銀ＤＮＡの作成 ■−３）で得られた突然変異体プラスミドを有する大腸
菌ＭＶ１１８４株より、■−１）と全く同じ方法を用い
て突然変異を有する一本鎖ＤＮＡを得た。
■−５）ポリリンカー後部に変異を有する合成りＮＡの
作成 ■−２）と同じ方法を用いて第４表のＮｏ、９−２−５
なる塩基配列を有する合成りＮＡを作成し、リン酸化を
行ないプライマーＤＮＡを作成した。
■−６）再突然変異体の作成 ■−３）と同じ方法を用いて、■−４）で得られた一本
鎖ＤＮＡ及び■−５）で得られたプライマーＤＮＡより
二本鎖ＤＮＡを合成、大腸菌ＪＭ８３株を用いて形質転
換を行なうことにより青色コロニ−を得た。これよりプ
ラスミドＤＮＡを回収し、再び大腸菌ＭＶ１１８４株を
用いて形質転換を行なうことにより青色コロニーを出現
させた。これよりプラスミドＤＮＡを回収することによ
り、ポリリンカ一部分の前後２個所に合計３塩基対欠失
したプラスミドｐＵｃ１０９１を得た。
■ｐＵｃ１０９２の作成方法 プラスミドｐＵｃ１０９２の作成は、前記■のプラスミ
ドｐＵｃ１０９１の作成例に準じて行なった。変更点は
次の通りである。
（１）■−２）の塩基配列を第４表のＮｏ−９−１−３
とする。
（２）■−５）の塩基配列を第４表のＮｏ、９−１−５
とする。
これによりプラスミドｐＵｃ１０９０よりポリリンカ一
部分の前部を２塩基、後部を１塩基、合計３塩基欠いた
突然変異プラスミドｐＵｃ１０９２を得た。
■　ＵＣ１０８１，ＵＣ１０８２の　成前記■■■と同
様に、プラスミドｐＵｃ１０８０を基本としてポリリン
カ一部分を１塩基および２塩基ずらした突然変異プラス
ミドｐＵｃ１０８１、ｐＵｃ１０８２を作成した。
変更点は次の通りである。
（１）ｐＵＣ１０８１，ｐＵＣｌ　０８２共に、■−１
）のプラスミドとしてｐＵｃ１０８０を用いた。
（２）■−２）の合成りＮＡとして、ｐｕｃｉｏａｌに
おいては第４表のＮｏ、８−１−５、ｐｔｙｃ１０８２
においてはＮｏ、８−２−５を用いた。
（３）■−５）の合成りＮＡとして、ｐｔｒｃｉｏｓｌ
においては第４表のＮｏ、８−１−３、ｐｔｒｃ１０８
２においてはＮｏ、８−１−５を用いた。
以上、基本となるプラスミドｐＵｃ１０９０、ｐＵｃ１
０８０及び作成した突然変異プラスミドｐＵｃ１０９１
．ｐＵｃ１０９２、ｐｕｃｉｏａｌ及びｐＵｃ１０８２
の間の関係についてまとめると、第５表のとおりとなる
。
第　　４　　表 合成りＮＡの塩基配列表 変異部分を含むＤＮＡ塩基配列 ５’　ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ３’
５’　ＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧ３’
５’　ＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧ３’
５’　ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＣＡＴＧＧＴ３’
５’　ＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣ３’
５’　ＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
５’　ＣＧＧＣＣＡＧＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴ３’
第　　５　　表 ■ｐＫＩｓ１ベクターシリーズの作成 ■−１）フラグメントの分離 プラスミドｐＵｃ１０９０　１０ルｇを制限酵素旧ｎｄ
ｍ（５０単位）及びＡａｔＩＩ（４単位）を用いて３７
℃にて１時間反応させ分解産物を０．７％アガロース電
気泳動を用いて分離し、ポリリンカ一部分を含む旧ｎｄ
ｍ切断部位からＡａｔ　ＩＩ切断部位までの断片（約１
．０００塩基対）をゲルより切り出し、フェノール処理
を行なうことにより精製し、１０９０−Ｌフラグメント
ｌルｇを得た。
同様に、制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（５０単位）及びＡａ
ｔｎ（４単位）を用いて、ポリリンカ一部分を含むＥｃ
ｏＲＩ切断部位からＡａｔ■切断部位までのＤＮＡ断片
（約２，２００塩基対）１０９０−Ｒフラグメント２Ｊ
Ｌｔ：を得た。
以下、プラスミドｐＵｃ１０９１，１０９２．１０８０
．１０８１．１０８２を用いて同様の操作を行なうこと
により、１０９１−Ｌ、１０９１−Ｒ，１０９２−Ｌ％
　１０９２−Ｒ，１０８０−Ｌ、　　１０８０−Ｒ，１
０８１−Ｌ、　　１０８１−Ｒ，１０８２−Ｌ及び１０
８２−Ｒフラグメント合計１２種類を得た。各フラグメ
ント、切断されるプラスミド及び切断する酵素の組合わ
せは次の通りである。
ＤＮＡ合成機を用いて第６表に示すジヨイント配列の玉
鎖及び下鎖を各々合成した。
玉鎖ｌルｇ及び下鎖ｌ終ｇを混合し、７０℃に３０分間
保温し、室内に放置し徐々に冷却することによりアニー
リングを行ない、２本鎖ＤＮＡとした。
■−３）Ｌ、Ｒフラグメントとジヨイント配列の結合 ■−１）で得られた１０９０−Ｌフラグメント０．１終
ｇ、１０９０−Ｒフラグメント０．２ルｇ及び■−２）
で得られたジヨイント配列０．０１１Ｌｇを、常法によ
りＴ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用いて連結反応を行
なわせた０反応液を大腸菌ＪＭ８３株を用いて形質転換
を行なった後、受容菌を１．５％寒天及びアンピシリン
を１ｍＭ当り１１００１Ｌ含むＬ寒天培地に塗布し、３
７°Ｃにて一昼夜培養することにより形質転換コロニー
を出現させ、アンピシリンを１　ｍ　ｌ当りｌｏｏｇｇ
含むし液体培地１０　ｍ　ｌに移植し、３７°Ｃにて１
２時時間上う培養を行なった。その後培養液より常法に
よりプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミドｐＫＩｓ１
０９００を得た。
以下、フラグメントの組合わせを変えることにより、ｐ
ＫＩｓ１０９０１．１０９０２．１０９１Ｏ１１０９１
１，１０９１２，１０９２０，１０９２１，１０９２２
，１０８００，１０８０１，１０８０２，１０８１０，
１０８１１，１０８１２，１０８２０，１０８２１及び
１０８２２の合計１８種類のｐＫＩｓｌベクターシリー
ズを作成した。
完成したｐＫＩｓｌベクター及びフラグメントの組合わ
せは次の通りである。
■ｐＫＩＳベクターシリーズの作成 プラスミドｐＵＣ９５ＩＬｇを制限酵素Ｐｖｕ■（２４
単位）を用いて３７℃にて１時間反応させた後、０．７
％アガロース電気泳動にて分離を行ない、ポリリンカ一
部分を含まないＤＮＡ断片（約２　、３００塩基対）を
ゲルより切り出し精製した。
又、ｐＫＩｓ１０９シリーズ（即ち、ｐＫＩＳ１０９０
０．１０９０１％　１０９０２．１０９１０．１０９１
１，１０９１２．１０９２０．１０９２１．１０９２２
）各々５ＪＬｇを同じく制限酵素Ｐｖｕ■（２４単位）
を用いて３７℃にて１時間反応させた後、０．７％アガ
ロース電気泳動にて分離を行ない、ポリリンカ一部分を
含むＤＮＡ断片（約３００塩基対）をゲルより精製した
。
次に、上記のｐＵＣ９由来のＤＮＡ′断片０．２終ｇ及
びｐＫＩｓ１０９シリーズ由来のＤＮＡ断片各々０．０
５終ｇを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）を用い
て４°Ｃ，１２時間連結反応を行ない、大腸菌ＪＭ８３
株を用いて順次形質転換を行ない、形質転換体よりプラ
スミドＤＮＡを順次分離し、プラスミドｐＫＩｓ９００
．９０１．９０２．９１０．９１１，９１２，９２０．
９２１．９２２を得た。
盆立虞 ■−１）において、ｐＫＩｓ１０９シリーズの代りに：
　ｐ　Ｋ　Ｉ　Ｓ　ｌ　０８　シ’）−ズ（即ち、ＰＫ
ＩＳ１０８００．１０８０１，１０８０２．１０８１０
．１０８１１，１０８１２，１０８２０，１０８２１．
１０８２２）を用いることにより、全く同様の操作を経
て、プラスミドｐＫＩｓ８００．８０１．８０２，８１
０，８１１．８１２，８２０．８２１，８２２を得た。
次に、本発明のベクターを用いた具体的な実施例を説明
する。
（実施例） マウス白血球ウィルスの逆転写酵素をコードしているｐ
ｏｌ遺伝子約２．３ｋｂ　（キロ塩基対）を含むプラス
ミドｐ　Ｋ　Ｐ　１　（（’Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　Ｎ
ａｔｉｏｎａｔ　Ａｃａｄｅｍｙ　５ｃｉｅｎｃｅ（Ｐ
ＮＡＳ）、ＵＳＡＪｖｏ１８２．ｐａｇｅ４９４４〜４
９４８．１９８５）に示されているプラスミドｐｓＨ１
のクローンのＳａｃ　Ｉ−旧ｎｄＩＩＩ（２，３ｋｂ）
をｐＵｃ１８に組み換えたもの）２ｐｇを、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ　　（１０単位）と旧ｎｄｍ　（１２単位）に
より３７°Ｃで１時間処理し、０．７％アガロース電気
泳動後、逆転写酵素遺伝子を含む約２．３ｋｂのＤＮＡ
断片をゲルより切り出し、フェノール処理を行なうこと
により精製した。また、ｐＫＩｓ８１１　２ＩＬｇを、
制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（１０単位）と旧ｎｄＩＩＩ（
１２単位）により３７℃で１時間処理し、同様に約２．
７ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。得られた２、３ｋｂの
ＤＮＡ断片０．１％ｇと２．７ｋｂのＤＮＡ断片０．１
井ｇを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位）により１
６°Ｃ，１２時間処理した。このＤＮＡ溶液を用いて大
腸菌ＪＭ８３株の形質転換を行ない、受容菌を、寒天１
．５％、アンピシリン１１００ｈ／ｍｌ、ｘ−ｇａＭＯ
，。
０５％を含むし寒天培地に塗布し、３７°Ｃにて一昼夜
培養を行ない、形質転換体コロニーを青色で得た。この
形質転換株を、し液体培地で３７℃、１２時間培養し、
アルカリ−５ＤＳ法てプラスミドＤＮＡｆｔ調製し、ｐ
ＫＰＢとした。
ｐＫＰ８　２ｇｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（１０単位
）、クレノー酵素（２単位）、最終濃度が各々０．１ｍ
ＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＴＰの混合物を
加え、３７℃で１時間処理し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２単
位にて１６℃で１２時間処理した後、大腸菌ＪＭ８３株
に同様に導入した。
白い形質転換株のコロニーをＬ液体培地に植菌し、３７
°Ｃて１２時間培養した後、アルカリ−３ＤＳ法でプラ
スミドＤＮＡを調製し、ｐＫＰＷとした。
ｐにＰＷより、逆転写酵素のＮ末端側の余分なアミノ、
酸配列を、合成りＮＡを用いた部位特異的遺伝子変換を
行なって除去した。
ｐＫＰＷ　　５．ｇを、制限酵素ＰｖｕＩＩ（１８単位
）とＮｄｅｌ（２０単位）により３７℃、１時間処理し
、０．７％アガーロース電気泳動後、約２．２ｋｂのＤ
ＮＡ断片を回収した。また、ｐＫＰＷ５７７−ｇを、制
限酵素５ｃａｌ　（１８単位）と脱リン酸酵素ＢＡＰ　
（０，２単位）により３７℃、１時間処理し、同様に約
５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した、得られた２、２ｋｂお
よび５ｋｂの両ＤＮＡ断片を夫々０．６井ｇづつ、及び
５０ｐｍｏｆの第７表（ａ）に示す５′−リン酸化合成
りＮＡ　（４０塩基対）を混合し、１００ｍＭＮａＣＪ
Ｌ、６．６ｍＭ）リス塩酸（ｐｌ（７，６）、８ｍＭＭ
ｇ　Ｃｌ　ｔ、１ｍＭβ−メルカプトエタノール溶液と
し、１００℃で３分間処理した後、３０℃て３０分間処
理した。このＤＮＡ溶液１７．２ｈｌ、５　ｍ　Ｍ　ｄ
　Ｎ　Ｔ　Ｐ　（ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　、　ｄ　Ｇ　Ｔ　Ｐ
　、　ｄ　ＣＴＰ、ＴＴＰ）’７ｇｌ、ｌｏｍＭＡＴＰ
３．６ｐ、１と、クレノー酵素（４単位）、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ（１単位）を加え、２５℃で３時間処理した。
このＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＪＭ８３株の形質転換を
行ない、アンピシリンとＸ−ｇａｌを含むＬ寒天培地上
で、青いコロニーを形成するクローンｐＫＰｐｏｌ−Ｎ
を得た。この突然変異体は約５％の頻度で得られた。
ｐＫＰｐｏｌ−Ｎ（逆転写酵素とβ−ガラクトシダーゼ
融合蛋白質をコードするプラスミド）に、合成りＮＡを
用いた部位特異的遺伝子変換で逆転写酵素の純粋な領域
と思われるＣ末端（ＴＩ及びＴ２）に終止コドンを導入
した。
プラスミドｐＫＰ　ｐｏｌ−Ｎ　　５　ＪＬ　ｇを、制
限酵素５ｃａｌ　（１８単位）と脱リン酸酵素ＢＡＰ　
（０，２単位）で３７°Ｃ，１時間処理し、同様に約４
．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
また、ｐＫＰ　ｐｏｔ−Ｎ　　５　ｐ−ｇを、制限酵素
Ｋｐｎｌ　（５０単位）と旧ｎｄＩＩＩ（２４単位）に
より３７℃で１時間処理し、同様に約２．９ｋｂのＤＮ
Ａ断片を回収した。４．９ｋｂ及び２．９ｋｂのＤＮＡ
断片をそれぞれ０．６℃ｇづつ、および５０　ｐ　ｍ　
ｏ　ｎの５′−リン酸化合成りＮＡ　（第７表Ｃ）を用
いて上記と同様の操作により、白い形質転換株の突然変
異体及びｐＫＰ　ｐｏｌ−ＮＴ２を得た。
得られたクローンについて逆転写酵素活性を測定した。
まず、逆転写酵素活性の測定法を説明する。
各クローンについて、大腸菌ＪＭ１０３株に導入したも
のを使用した。各プラスミドを持った大腸菌を、Ｌ液体
培地で３７℃、１２２時間振う培養した培養液０．２ｍ
文をＭ９液体培地（組成：ｌｌ当りリン酸２ナトリウム
　６ｇ、リン酸ｌカリウム　３ｇ、塩化アンモニウム　
Ｉｇ、食塩０．５ｇ、硫酸マグネシウム　１ｍＭ、塩化
カルシウム　０．１ｍＭ、ｐＨ７，４）（＋０．２％カ
ザミノ酸＋０．２％グリセロール＋５ｐ−ｇ／ｍ立チア
ミン）１０ｍＪＬに加え、３０℃で１時間振どう培養し
た後、５０ＩＬｉの２００ｍＭＩＰＴＧをそれぞれ加え
、さらに３０℃で３時間振とう培養した。各培養液を水
中に１時間浸し、０Ｄ８６Ｇをそれぞれ測定した。次に
Ｍ９培地を用いて各試料を夫々Ｑ［）６６Ｇが０．２と
なるように希釈した後、Ｏ，１ｍＭをマイクロ遠心チュ
ーブに採取した。遠心して菌体を集めた後、緩衝液（５
０ｍＭトリス塩酸、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．３ＭＮａ
Ｃ１，ｐＨ７，５）で菌体を洗浄し、遠心して集めた菌
体を８１ＬｆＬの同緩衝液に攪拌した後、１ｇ文のｌ　
Ｏｍ　ｇ　／　ｍ　ｌリゾチーム溶液を加え、ｏ’ｃで
１５分間処理した。さらに、１％トリトンＸ−１００，
１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）１ル文を加え、
０℃、１０分間処理し、各粗抽出液とした。得られた各
粗抽出液に、９０ｕ、ｌの反応溶液ＣＣ５０ＩＬ／ｍ１
ｐｏ　１　ｙＣｒＣ（ｄＧ＋ｚ−ｓａ　）、２０　ＩＬ
ＭｄＧＴＰ、ｌ　０００ＣＰＭ／Ｐｍ　ｏ　ｌ、ｄ−３
２Ｐ−ｄＧＴＰ、０．５ｍＭＭｎＣｉＬｔ　、５０　ｒ
ｎ　Ｍ　トリス塩酸、ｐＨ８，３，２０ｍＭジチオスレ
イトール、６０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｌ、０．１￥；Ｎ
Ｐ−４０）を加え、２５℃で３０分間処理した。反応終
了後、反応溶液３０ＩＬｌを、ＤＥ−８１デイスクにス
ポットし、２ＸＳＳＣ（組成：　０．３ＭＮａＣ１，０
，０３Ｍクエン酸ナトリウム）２００ｍｌで５分間処理
を３回行ない、９９．５％エタノール２００ｍ１で５分
間処理後、空気乾燥した。
乾燥したＤＥ−８１デイスクをバイアルに入れ、シンチ
レーションカウンターでチェレンコフ効果を用いてカウ
ントを測定したところ、第３図のようになった。
ベクターのみを含むクローンに比べ、ｐＫＰｐｏｌ−Ｎ
には逆転写活性が認められた。ＰＫＰｐｏｌ−ＮＴ２に
ついては、さらに活性が上昇していた。
更に、カリフラワーモザイクウィルスの逆転写酵素のア
ミノ酸配列より予想されるＣ末端（ＴＩ）に、同様に第
７表（ｂ）に示す合成りＮＡを用いて部位特異的遺伝子
変換を行なった。
得られたクローンｐＫＰ　ｐｏｌ−ＮＴＩは、第３図に
示したように、ｐＫＰ　ｐｏｌ−ＮＴ２より更に高い活
性を示した。
＾Ｌｎ　　　Ａ　膿　　　。膿 １）　　　　−〇 ［発明の効果］ 以上説明したように、本発明のベクターあるいはベクタ
ーシリーズによれば、蛋白質をコードしている遺伝子を
極めて容易に検出することができるという利点を有する
。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明に係るベクターの一例の遺伝子地図、第
２図は従来のベクターの遺伝子地図、第３図は逆転写酵
素活性を示すグラフである。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｆ I 、
    Ａｃｃ I 、ＨｉｎｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I 、Ｅ
    ｃｏＲ I の各切断部位の塩基配列を有するマルチクロ
    ーニングサイトを２個有し、該２個のマルチクローニン
    グサイトの間に３種の終止コドンが挿入された中継ぎ塩
    基配列を有することを特徴とするベクター。
  2. （２）制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、
    Ａｃｃ I 、ＨｉｎｃII、ＢａｌＨ I 、Ｓｍａ I 、Ｅ
    ｃｏＲ I の各切断部位の塩基配列を有するマルチクロ
    ーニングサイトを２個有し、該２個のマルチクローニン
    グサイトの間に３種の終止コドンが挿入された中継ぎ塩
    基配列を有するベクターであって、該ベクターは前記の
    すべての切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３種
    類すべて前記両マルチクローニングサイトに有する１８
    種のものであるベクターシリーズ。
  3. （３）制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、
    Ａｃｃ I 、ＨｉｎｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I 、Ｅ
    ｃｏＲ I の各切断部位の塩基配列を有するマルチクロ
    ーニングサイトを２個有し、該２個のマルチクローニン
    グサイトの間に３種の終止コドンが挿入された中継ぎ塩
    基配列を有するベクターであって、該ベクターは前記の
    すべての切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３種
    類すべて前記両マルチクローニングサイトに有する１８
    種のものであるベクターシリーズの中から所望のベクタ
    ーを選択し、該ベクターおよび蛋白質をコードしている
    遺伝子を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合す
    ることにより、色の変化を判別することにより蛋白質を
    コードしている遺伝子を検出することを特徴とする遺伝
    子の検出方法。
  4. （４）制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、
    Ａｃｃ I 、ＨｉｎｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I 、Ｅ
    ｃｏＲ I の各切断部位の塩基配列を有するマルチクロ
    ーニングサイトを２個有し、該２個のマルチクローニン
    グサイトの間に３種の終止コドンが挿入された中継ぎ塩
    基配列を有するベクターであって、該ベクターは前記の
    すべての切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３種
    類すべて前記両マルチクローニングサイトに有する１８
    種のものであるベクターシリーズの中から所望のベクタ
    ーを選択し、該ベクターおよび蛋白質をコードしている
    遺伝子を所定の制限酵素にて切り出した後両者を結合す
    ることにより、蛋白質を発現させることを特徴とする蛋
    白質の発現方法。
  5. （５）制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、
    Ａｃｃ I 、ＨｉｎｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I 、Ｅ
    ｃｏＲ I の各切断部位の塩基配列を有するマルチクロ
    ーニングサイトを２個有し、該２個のマルチクローニン
    グサイトの間に３種の終止コドンが挿入された中継ぎ塩
    基配列を有するベクターであって、該ベクターは前記の
    すべての切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３種
    類すべて前記両マルチクローニングサイトに有する１８
    種のものであるベクターシリーズのすべての混合物、お
    よび蛋白質をコードしている遺伝子を所定の制限酵素に
    て切り出した後両者を結合することにより、色の変化を
    判別することにより蛋白質をコードしている遺伝子を検
    出することを特徴とする遺伝子の検出方法。
  6. （６）制限酵素ＨｉｎｄIII、Ｐｓｔ I 、Ｓａｌ I 、
    Ａｃｃ I 、ＨｉｎｃII、ＢａｍＨ I 、Ｓｍａ I 、Ｅ
    ｃｏＲ I の各切断部位の塩基配列を有するマルチクロ
    ーニングサイトを２個有し、該２個のマルチクローニン
    グサイトの間に３種の終止コドンが挿入された中継ぎ塩
    基配列を有するベクターであって、該ベクターは前記の
    すべての切断部位のアミノ酸に対応するフレームを３種
    類すべて前記両マルチクローニングサイトに有する１８
    種のものであるベクターシリーズのすべての混合物、お
    よび蛋白質をコードしている遺伝子を所定の制限酵素に
    て切り出した後両者を結合することにより、蛋白質を発
    現させることを特徴とする蛋白質の発現方法。
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