JPS61185190A - 酵母菌における異質遺伝子の発現のプロモ−タ−類、それらからなるプラスミド類、およびポリペプチド類の生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に異種のポリペプチドの遺伝情報を指定
する遺伝子の酵母菌中の発現（ｅｘｐｒｅ　ｓ　ｓ　ｉ
　ｏ　ｎ）を保証することのできるプロモーターからな
る酵母菌ＤＮＡの断片に関する。また、本発明は、前記
断片からなるベクターのプラスミドおよび前記プラスミ
ドにより形質転換された酵母菌に関する。

新しい遺伝子工学技術は、異質蛋白質の遺伝情報を指定
するを遺伝子の種々の有機体中の発現を可能とする。こ
の１つの例は、酵母菌サツ力ロミフェロン類の合成であ
る［Ｒ、Ａ　、ヒララマン（Ｈｉ　ｔ　ｚｍａ　ｎ）ら
、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２上９．１９８３．
６２０］。

酵母菌中の遺伝子の発現の先要条件は、酵母菌プロモー
ターのその上流の位置であり、その位置は酵母菌ＲＮＡ
ポリメラーゼ■により認識され、そして対応するＲＮＡ
メツセンジャーの合成を起こす、いくつかのこのような
酵母菌プロモーターはすでに記載されている。しかしな
がら、多くの場合において、得られる発現のレベルは、
ことに前記プロモーターが異質遺伝子の発現に使用され
るとき、工業的用途のためには低くかつ実際的ではない
［Ｔ、アトキンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ）ら、バイオケ
ミカル・ソサイアティφトランサクシ　７ズ（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　　５ｏｃｉｅｔｙ　　Ｔｒａｎｓａｃ
ｔｉｏｎｓ）１２，１９８４．２１５］、　　　　　’ したがって、プロモーターを実際的目的に使用できるよ
うな方法で、酵母菌を遺伝子操作するためにプロモータ
ーを効率よく配置されることが必須である。

本発明の目的は、このようなプロモーターを提供するこ
とである。他の目的は、前記プロモーターを異種遺伝子
と融合させて前記遺伝子の対応するポリペプチドへの発
現を酵母菌中において保証するベクターのプラスミドを
提供することである。前記プラスミドにより形質転換さ
れた酵母菌は、前記酵母菌により新規なポリペプチドが
生産されるので、本発明の他の目的である。なお他の目
的は、前記形質転換された酵母菌を生長させることによ
りポリペプチドを生産する方法を提供することである。

これらの種々の目的は、基本（ｂ　ａ　ｓ　ｅ）プロモ
ーターとして次のヌクレオチド配列：を有する酵母菌Ｄ
ＮＡの断片、ならびにプロモーター機能を保持したそれ
らの突然変異体類および下位断片類を使用することによ
って達成される。

本発明の基本プロモーター、以後ｐ４１５と呼ぶ、の単
離において既知の方法を使用した。それはＥ、ｃｏｌｉ
のβ−ガラクトシダーゼの遺伝情報を指定する遺伝子上
ａｃＺが、ある条件下で、現されうろこと、および発色
指示体Ｘ−ガル上で生長させるとき、この発現を酵母菌
のコロニーの青色により監視することができるという観
察に頼った［Ｌ、グアランチ（Ｇｕａｒａｎｔｅ）、メ
ソッズ会イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈ、　　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、）１０１，１９８３，１８１；Ｍ、Ｊ、カサ
ダバｙ（Ｃａｓａｄａｂａｎ）ら。

１ｂｉｄ、１００，１８３，２９３］、この青色は指示
体のβ−ガラクトシダーゼによる加水分解的切離しのた
めであり、そしてこの切離し速度は合成されるβ−ガラ
クトシダーゼの量に依存する。

したがって、コロニーの青色はβ−ガラクトシダーゼの
発現の効率に依存し、この効率は、なかでも、使用する
酵母菌プロモーターの力に依存する。こうして、酵母菌
プロモーターの選択のうちで、最強なものは青色をいっ
そう急速に与えることができ、そしてこれはβ−ガラク
トシダーゼの酵素アッセイにより定量的に確かめること
ができる。

上の方法に従う酵母菌プロモーターの単離のために先要
条件は、酵母菌中において複製しかつ選択することがで
きるベクターであり、このベクターはＥ、ｃｏｌｉの±
ａｃＺ遺伝子を含有するが、適当なプロモーターの不存
在のために酵母菌中でこれを発現しない、前記ベクター
はさらに次の条件を満足しなくてはならない、それは酵
母菌の複製機構により認識される配列により酵母菌中で
複製することができるべきである。それは標識遺伝子の
存在のために酵母菌中で選択および維持を行うことがで
きるべきである。それは、適当なプロモーターが与えら
れたとき、酵母菌中で上ＡｃＺ遺伝子を潜在的に発現す
ることができるべきである。それは、プロモーターを含
むと思われる酵母菌ＤＮＡの小さい断片の挿入のために
、この遺伝子より上流に独特の制限部位を含むべきであ
る。

このようなベクターの構成は第１図に概説されている。

２つの既知のプラスミド、ｐＪＤＢ２０７［Ｊ、Ｄ、ベ
ッグス（Ｂ　ｅ　ｇ　ｇ　ｓ）ら、ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）２８３，１９８０，８３５］およびｐＬＧ４０
０　［Ｌ、グアＬ／７テ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）ら、細胞
（Ｃｅｌｌ）２０．１９８０．５４３］を８典的技術に
従い結合した。この結合によりプラスミドＹＥｐＺ３６
が得られ、これはｐＪＤＢ２０７からの２−ミクロンの
内因性プラスミドの複製源のおかげでＳ、ＣｅｒｅＶｉ
ｓｉａｅ中で複製することができる。また、それは互互
旦２標識遺伝子を指示し、この遺伝子は上！上２−突然
変異体を有する酵母菌中で選択および維持を行うことが
できる。それは独特且１旦ＨＩ部位を有し、ここに鼠ｂ
ｏＩ制限酵素により発生される小さい断片を挿入できる
。

前述のプローブを使用する本発明のプロモーターの単離
を、次のようにして実施した。

Ｓ　、ｃｅ　ｒｅｖｉ　ｓ　ｉ　ａｅＫＬ１４−４ａｔ
ｙ）全体のＤＮＡのＭ　ｂ　ｏ　Ｉ制限酵素で部分的に
消化して得られたＤＮＡ断片［Ｇ、フェイジ（Ｐａｇｅ
）ら、ジャーナル・オブ・モレギュラーＱバイオロジー
（Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、）９９゜１９７５．
２０３］を前述のプラスミドＹＥｐＺ３６のＢａｍＨＩ
部位に挿入し、そしてこのようにして得られた組み換え
ＤＮＡを使用してＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧＲＦ１８
の上１１２−菌株を形質転換した。形質転換された酵母
菌のコロニーをＸ−ガル培地上でβ−ガラクトシダーゼ
の生産についてスクリーニングした。いくつかのコロニ
ーはＸ−ガル培地へ移したとき陽性に見え。

モしてβ−ガラクトシダーゼのアッセイにより決定して
最も活性なものを本発明のプロモーターの単離のために
選択した。

Ｅ、ｃｏｌｊへ移した後単離したこのクローンからのプ
ラスミドＤＮＡは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の前に
旦旦ｏＲＩ６３０ｂｐを含有する９８０ｂｐのＭ　ｂ　
ｏ　Ｉインサートを示した。β−ガラクトシダーゼの転
写を保証するプロモーターは、旦旦ｏＲＩ部位に先行す
る３５０ｂｐの置換がβ−ガラクトシダーゼ活性に影響
を及ぼさないので、この６３０ｂｐの断片に関連する（
ａＳＳｏｃｉａｔｅ）することが発見された。３５０ｂ
Ｐの断片が欠失（ｄｅｌｅｔｅ）する構成方法は第２図
に詳細に示されており、ここで初期の９８０ｂｐの断片
はＰ４に４と呼ぶ、Ｅ、ｃｏｌｉの上＾ｃＺｉｉ伝子で
開始する６３０ｂｐの断片のＤＮＡ配月は、Ａ、Ｍ、？
クサム（Ｍａｘａｍ）およびＷ、ギルバート（Ｇｉｌｂ
ｅｒｔ）の方法［プロシーディンゲス争オブーアカデミ
ック・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓ
　　ｃｉ　、）Ｕ、Ｓ、Ａ、７４．１９７７．５６０；
メソッズ・仁ハエンジモロジー（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎＺ
Ｙｍｏｌ、）６５，１９８０，４９９］に従い決定し、
そして第３図に示す、２つの転写開始コドン（ＡＴＧ）
は正しいリーディングフレーム中の位置５５Ｂおよび７
３２に存在する。しかしながら、サブクローニングの結
果は、ＡＴＧに近接する（位１７３２）ｌａｃＺのみが
活性であることを示した。このＡＴＧは酵母菌遺伝子の
開始コドンではなく、ｐＬＧ４００ベクターの構成にお
いて使用したＥ、ｃｏｌｉ　　±ａｃＩ遺伝子の部分で
あることを注意することは興味があることである［Ｍ、
ザベアウ（Ｚ　ａ　ｂ　ｅ　ａ　ｕ）およびに、に、ス
タンレイ（Ｓｔａｎｌｅｙ）、ユーロピアン・モレキュ
ラー〇バイオロジーゆオーガニゼイション中ジャーナル
（ＥＭＥＯＪ、）。

↓、１９８２，１２１７．およびＡ、Ｊ、ブレイク（Ｂ
ｒａｋｅ）ら、ＰＮＡＳ、７５，１９７８．４８２４］
、完結を目的として、部位Ｅｃ。

ＲＩと部位ＰｖｕＩＩとの間において構成され、そして
後者のＡＴＧからなるこの断片を以後ｐ４１５プロモー
ターと呼ぶ。

プロモーターＰ４１５を使用容易とするその配置 上のように単離したＰ４１５プロモーターの取扱いの容
易さを改良するために、両端を一般の使用において独特
の制限部位でフランキング（ｆｌｉｎｋｉｎｇ）する、
このようにして、それは意図する用途に従い１つのプラ
スミドから他のプラスミドに動くことができ、そしてプ
ロモーターからド流の発現用異質遺伝子の挿入は促進さ
れる。

次の実施例により、プラスミドＹＥｐＺ１０１をγえる
構成について詳述する。ここで本発明のプロモーターは
ＢｉｎｄＩ［［断片に対して上流でかつＢａｍＨＩ断片
に対して下流において関連し、この後者は、また実施例
に記載するように、異質遺伝子の導入のために使用する
ことができる。しかしながら、ｐ４１５プロモーターが
他の制限部位、例えば、ＥｃｏＲｌ、Ｃ１０工、Ｈｉｎ
ｄ■、Σ上上Ｉ、止見至Ｉ、旦ｓｔ１．Ｘ上１１、＼ｈ
ｏＩがフランキグする他の構成も明らかに考えられるで
あろう、このようにして得られるこのプロモーターの変
異種も本発明の範囲内に含まれる。

プロモーターｐ４１５の袈乞支入眉 種々の欠失により得られるプロモーターｐ４１５の他の
変異種は、また、興味ある実際的利点をもたらす、実際
的事柄として、プロモーターＰ４１５はそれがプラスミ
ドＹＥｐＺ１０１中に含まれるときある遺伝子、例えば
、ＡＴＧ開始コドンを欠失するｐＭｃ１５８７およびＹ
ＥｐＺ１００上ａｃＺ遺伝子（第４図）の発現のために
有利である。なぜなら、これは旦ａｍＨＩ部位のすぐ上
流にプロモーター自体により提供されるからである。し
かしながら、すでにそれ自信の開始コドンをもつ遺伝子
の場合において、プラスミドＹＥｐＺ１０１のプロモー
ターｐ４１５をそのまま使用することはできない、真核
生物において、メツセンジャーＲＮＡの第１ＡＴＧコド
ンを含む酵母菌が通常使用されることは事実知られてい
る。こうして、導入される第２ＡＴＧコドンは、それが
プロモーターのＡＴＧコドンとともに相内にあるいは相
外に存在するかどうかに従い、２つの効果の１つを有す
るであろう、後者の場合において、遺伝子により解読さ
れるものと完全に異るポリペプチドが生産されるであろ
う、前者の場合において、第１および第２のＡＴＧの間
のコドンに相当するアミノ酸がアミノ末端においてポリ
ペプチドへ付加されるであろう、こうして、遺伝子によ
り通常解読されるものと異るポリペプチドは、多分不活
性であるが、得られるであろう；これは天然の生産物の
できるだけ近い代替物が大部分の遺伝ｆ工学の用途にお
いて探究されているので不都合であろう、この場合は、
それがまた、実施例におけるように、形質転換された酵
母菌細胞の外側の輸送を保証するために、天然生産物の
信号配列を使用しようとするとき、ことに不都合である
。

上の考察のために、ＡＴＧ開始コドンを含まないが、す
ぐｆ流の制限部位を保持するプロモーターｐ４１５の変
異種を有することを必要とした６次の実施例は１部位Ｂ
ａｍＨＩから出発して、ＹＥｐＺｌｏｌからのこのよう
な欠失を記載する。Ｈｉｎｄｍ末端：ｐ４１５Δ２、ｐ
４１５Δ４およびｐ４１５Δ５から種々の距離において
旦ａｍＨＩを含むプロモーターＰ４１５のいくつかの変
異種を得た。これらの変異種におけるハｍＨＩ末端およ
びＨｉｎｄＩＩＩ末端は、ちょうどもとのｐ４１５プロ
モーターの場合におけるように、他の制限部位で置換で
きることは明らかである。

変異種の１つのｐ４１５Δ４は、酵母菌中のニワトリリ
ソチームの遺伝子の発現にとくにすぐれていることが明
らかとなった。この結果は、酵母菌中の翻訳および転写
の現在の知識を考慮すると、それ自体驚くべきことであ
り、同一の技術により、あるいは生体外または生体内の
他の方法により得られたプロモーターｐ４１５の他の変
法が本願に記載する結果に関して改良しうるであろうこ
とを立証する。このようにして得られる異る変異種は、
また、本発明において構成されるものとして考えらるこ
とが明らかである。

挽 この分野において知られているように１本発明によるプ
ロモーターは、できるだけ大きい数のコピーに複製する
ことのできるベクターのプラスミド中で発現すべき異種
遺伝子にプロモーターが正しく関連する場合にのみ、酵
母菌中で異種遺伝子を発現するために使用することがで
きる。それゆえ、このベクターは宿主細胞により認識さ
れる複製源、およびまたプロモーターにより効果的に形
質転換された細胞の可視化および選択を可能とする標識
遺伝子からなる。

これらの異る要素からなる多数の発現ベクターを、こと
にＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種の酵母菌の形質転換のた
めに、構成した。それらは一般にこの種の大部分の菌株
中に存在する２−ミクロンのプラスミドの複製源からな
るか、あるいは染色体源の自律的ＡＲ３複製セグメント
からさえなる。

必須代謝物、例えば、アミノ酸の合成に参加する酵素の
遺伝情報を指定する遺伝子は、一般に遺伝標識として使
用される０次いで、宿主細胞を、突然変異により前記代
謝物について栄養要求変異種となった酵母菌菌株におい
て使用された。この菌株を前記代謝物を含まない培地上
で生長させると、ミッシング（ｍｉ　ｓ　ｓ　ｉ　ｎｇ
）遺伝子を有するプラスミ下により形質転換された細胞
のみが生長することができる。このような遺伝標識の典
型的な例は、それぞれロイシンおよびトリプトファンの
生物合成に参加する酵素の遺伝情報を指定するＬ旦旦２
遺伝子またはＴＲＰＩ遺伝子である。

これらの発現ベクターは、また、１つあるいは好ましく
はいくつかの制限部位を含むべきであり、前記部位にお
いて問題の解読部分とそれらの発現を最適化するために
必要な種々の要素：プロモーター、ターミネイタ−（ｔ
　ｅ　ｒｍｉ　ｎａｔ　ｏ　ｒ）および他の制ｇ１要素
を挿入する。

さらに、これらのプラスミドは中間のバクテリア宿主１
例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ中の複製および選択を保証するこ
とのできるバクテリアの配列からしばしばなる。このよ
うなシャトル（ｓｈｕｔｔＩｅ）プラスミドの古典的例
として、ＹＥｐ１３［Ｊ　、　Ｒ、ブローチ（Ｂｒｏａ
ｃｈ）ら、遺伝子（Ｇ　ｅ　ｎ　ｅ）旦、１９７９．１
２１］、ｐＦＬｌ−４［Ｍ、Ｒ，チェ〉＜すｘ−／Ｉ／
　（Ｃｈｅ　ｂａ　ｌ　ｌｉ　ｅ　ｒ）ら、遺伝子（Ｇ
ｅｎｅ）１１．１９８０．１１］、ｅｔ　　ｐＪＤＢ２
０７　　［Ｊ、Ｄ。

ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）、アルフレッドーベンソン争シ
ンポジウム（Ａｌｆｒｅｄ　　ＢｅｎｓｏｎＳｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ）Ｎ＠　１６．ムンクスガード（Ｍｕｎｋｓｇ
ａａｒｄ）、：Ｉペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ
）１９８１．３８３ページ１を引用することができる。

本発明の好ましい実施態様によれば、主として宿主細胞
がＳ、ｃｅｒｅｖｉＳｉａｅ種に属するとき、使用する
プラスミドは少なくとも２−ミクロンの内因性プラスミ
ド配列のＲＥＰ機能からなる。これらの機能は一般に、
ことに宿主細胞がその２−ミクロンのプラスミドについ
て前もって治癒されている場合、プラスミドによりすぐ
れた安定性を与える（Ｃ、Ｐ　、ホレンバーグ（Ｈｏｌ
ｌｅｎｂｅｒｇ）、Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）９６，１９８２゜１１９
、Ｒ，Ｍ、ワルムスＬ／イ（Ｗａｌｍｓｌｅｙ）ら、モ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテ！−／クス
（Ｍｏ　ｌ　、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ　、）１９８３．２
６１］、このようなベクターの古典的例は、プラスミド
ｐＪＤＢ２１９およびｐＪＤＢ２４９　［Ｊ、Ｄ、ベッ
グス（ＢｅｇｇＳ）、ネイチャー（Ｎａｋ　ｕｒｅ）２
７５．１９７８．１０４］、この型の他のベクターは下
の実施例に記載する。

これらの種々のプラスミドは、ベクターとして、本発明
のプロモーターの上流に適当に位置する異種遺伝子の酵
母菌中の発現を確実にするために使用することができる
。特定の構成の実施例は本発明の例示として記載するが
、多くの他の可能性が明らかに存在し、そして複製源、
標識遺伝子゛および他の構造遺伝子の種々の組み合わせ
を明らかに使用して同様な結果を得ることができる０本
発明のプロモーターにより異種遺伝子を発現するために
こうして構成することができる種々の発現ベクターは、
本発明の範囲内に入るものとして考えなくてはならない
。

これらの種々の場合において得られる形質転換された細
胞も本発明の一部である。酵母菌細胞を形質転換するた
めに開発された技術の大部分はほとんどＳ、ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ種に適用されてきたが、本発明はまた酵母菌
の他の種および属を前述の型の発現ベクターで形質転換
することにより得られる細胞からなる。他の実施例とし
て。

ｅｒｏｍｙｃｅｓ　　１ａｃｔｉｓ）などを引用するこ
とができる。しかしながら、本発明の好ましい実施態様
によれば、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ）属から、好ましくはΣユ至ｅｒｅｖｉｓｉａｅ種か
らの形質転換可能な宿主細胞が使用されるであろう、こ
の種からの形質転換可能な例として、なかでもＡＨ２２
およびＧＲＦ１８を引用することができる。

形　転　された酵母菌によるポリペプチドの應 本発明に従い発現可能なりＮＡ断片は種々の源を有する
ことができる。それらは、以後の実施例の１つにおいて
その発現を記載するＥ、ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ
のように、原核生物の遺伝子であることができる。ＤＮ
Ａ断片は、また、酵母菌が断片化遺伝子の転写からメツ
センジャーＲＮＡの突然変異を保証することができない
ので、それがイントロンを含まないかぎり、真核生物で
あることができる。［Ｊ、Ｃ，ベッグス（Ｂ　ｅ　ｇｇ
ｓ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２且ｌ。

１９８０．８３５］、Ｌかしながら、この場合において
、酵母菌中で発現されるニワトリリソチームを示す他の
実施例において後述するように、対応するｃＤＮＡを発
現することが可能である。多くの他の遺伝子は、それら
がバクテリア、植物、動物またはヒトの起源であるかに
かかわらず、同様に発現可能である。こうして発現され
るであろう新規なポリペプチドは、また、明らかに本発
明に範囲内に入る。

本発明に従いこれらのポリペプチドの１つまたは他のも
のを生産するように酵母菌菌株を誘導したと！、その生
長に最も好適な条件下にそれを増殖させることが必要で
ある。当業者は、宿主として使用する酵母菌菌株に特有
の特性に従いこれらの条件を容易に決定するであろう、
形質転換された酵母菌はほとんどの場合において人工的
に構成されたプラスミドを失う重要な傾向を多少力する
ので、それらに正の選択圧力（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｌ
ｅｃｔｉｏｎ　　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を及ぼすような培
地を使用することが有利である。菌株が１つまたは他の
必須代謝物に対して栄養要求突然変異体であるとき、そ
して使用するベクターのプラスミドが菌株のプロトトロ
ピーを回復することのできる標識遺伝子、例えば、前述
の旦旦旦２またはＴＲＰＩ遺伝子であるとき、この選択
圧力は前記培地から前記代謝物を省略することによって
及ぼすことができる。これと反対に、プラスミドが酵母
菌に生長阻害剤、例えば、０４１８のような抗生物質［
Ｊ　、ジメネズ（Ｊｉｍｅｎｅｚ）およびＪ、ダビｚス
（Ｄａｖｉｅｓ）、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２８７
，１９８０，８６９］またはジウロン（ｄｉｕｒｏｎ）
のような除草剤（本出願人へのベルギー国特許８９９．
６０７号）に対する多少顕著な抵抗を付与することので
きる遺伝子を標識として含む場合、形質転換された酵母
菌の好適な選択圧力を、この阻害剤を補充した培地中で
それを生長させることによって加えることができる。同
一の結果を与えかつ本発明を実施するために同様に使用
することができる他の手段が存在する。

形質転換された酵母菌が問題のポリペプチドの最良の生
産を保証する条件下で生長されたとき、このポリペプチ
ドはなお回収しなくてはならない、当業者が各場合にお
いて組み合わせて所望のポリペプチドの最良の回収率お
よび最大の純度を得ることのできる多くの技術が存在す
る。しかしながら、本発明の好ましい実施態様によれば
、プロモーターｐ４１５またはその変異種の１つの介在
で発現される遺伝子は、形質転換された細胞のプラスミ
ド膜を通す生産物を輸送を確実にすることのできる信号
ペプチドの遺伝情報を指定する先導配列を有することが
好ましい、この場合において、形成されたポリペプチド
を古典的方法１例えば、吸着および／または沈殿、によ
り回収する培地中にそれが遊離されるか、あるいはそれ
を他の方法で分離しなくてはならないであろう酵母菌壁
へそれが会合（ａｓｓｏｃｉａｔ　１ｏｎ）してとどま
るかにかかわらず、形成されたポリペプチドの分離は事
実かなり容易であろう。

次の実施例により、本発明の種々の面を例示する。

Ｘ廊勇ユ その構成が、前述のように、本発明の プロモーターｐ４１５の単離に寄与す る、プラスミドＹＥｐＺ４１５を使用して、Ｓ、ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ　　ＧＲＦ１８　（ｌｅｕ−またはＨｉ
ｓ−）酵母菌菌株を形質転換し、ロイシンに対してプロ
トトロープのクローンを選択した。

これらのクローンの特異的β−ガラク トシダーゼ活性を、Ｍ、クラビール（Ｃｒａｂｅｅｌ）
ら［ユーロビアン番モレキュラー會バイオロジー・オー
ガニゼイション・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、） 名、１９８３．２０５］により修正されたＭ、Ｊ、ミラ
ー（Ｍｉｌｌｅｒ）［分子遺伝学における実験（Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉ’ｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧ
ｅｎｅｔ　１ｃｓ）、１９７２．コールド・スプリング
φハーバ一番ラボラト リ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング中バー
バー、ニュー・ヨーク］の方法により細胞抽出物につい
て測定した。他方において、抽出物の蛋白質濃度はＭ、
Ｍ、ブラッドフォード （Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方法［アナリ ティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、）７２，１９７ ６．１９４８］の方法により決定した。

特異的活性は７７３３β−ガラクトシ ダーゼ単位であり、抽出の合計の蛋白質の２．５７％に
相当した。

２、　　　プラスミドＹＥ　　２１０１によるＳ、ｃこ
の実施例において、本発明によるプ ロモーターｐ４１５を遺伝子工学において普通に使用さ
れる２つの制限部位（Ｈ１且ｄｍおよびｌ工ｍＨＩ）に
よりフランキング（ｆ　Ｉａｎｋｉｎｇ）Ｌ、そしてこ
の形態で使用してＹＥｐＺｌｏｌと呼ばれるプラスミド
中でＥ、ｃｏｌｉの１ａｃＺ遺伝子を発現させた。この
操作はいくつかの工程で実施し、２つの中間プラスミド
：ＹＥｐＺｌｏｏおよびｐＪ０４、の構成を必要とした
。

２、Ｉ　　ＹＥｐＺｌｏｏ（第４図）はＰＭＣ１５８７
［Ｍ、Ｊ、カサダバｙ（Ｃａｓａｄａ　ｂ　ａ　ｎ）ら
、メソッズ・イン争エンジモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）よ００，１９８３゜
２９３］およびＹＥｐＺ４１５から構成した；ＹＥＰＺ
４１５はいくつかの利点を兼備する；それは工１　ａｃ
Ｚ遺伝子の開始およびｐＭｃ１５８７の制限部位Ｅｃ旦
ＲＩ、Σ三１工および且工旦ＨＩの群を有する；それは
ＹＥｐＺ４１５の±ＡｃＺ遺伝子の末端を有し、これに
よりプラスミドの大きさを無用に増大する９ＭＣ１５８
７の上見至Ｙおよび土土至Ｚ遺伝子が排除されている；
それはざらにｐＪＤＢ２０７から誘導されるプラスミ ド、例えば、ＹＥｐＺ４１５　［Ｅ、エアハルト（Ｅｒ
ｈａｒｔ）およびＣ，Ｐ。

ホレンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅ、ｒ ｇ）、ジャーナル・オブーバクテリオロジー（Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、）１旦６．１９８３．６２５］に対す
る大きい数のコピー特性を保持する。

２．２　　ｐＪＯ４（第５図）はプロモーターＰ４１５
のＲｓａＩ−Ｐｖｕ■断片（第３ 図）をプラスミドｐＭｃ１５８７のと ａＩ部位に導入することにより構成し た。この操作は３つの結果を有する： （＋）　　　　部位尺ヱユ■に対してすぐ上流のＡＴＧ
開始コドンが 保持される； （ｉ　ｉ）　　　ｐ４１５のＬヱヱ■部位お。

よびｐＭＣ１５８７の旦皿 ａｒ部位が破壊される； （ｉ　ｉ　ｉ）　　乱立ｍＨＩ部位はＡＴＧ開始コドン
のすぐ下流に導入 される、この部位はしばし ば異質遺伝子のクローニン グに使用されている。

２．３　次いで、ＹＥｐＺｌｏｌは、３つの結合事象を
含む方法（第６図）により、前述のプラスミドの３つか
らのＤＮＡ断片を結合することにより構成した。この構
成において、土Ｚ遺伝子、ａｍｐＲ遺 上ａｅ中の複製起源（２−ミクロンのプラスミドから）
のすべてはＹＥｐＺｌｏｏから誘導された。プロモータ
ーｐ４１５は２つの部分から無傷に再構成される：ＹＥ
ｐＺ４１５のＨｉｎｄｍ−Ｃ１ａ工断片の５°末端の半
分、およびｐＪ。

４からのＣ１ａｌ−乱ａｍＨＩ断片からの３゛隣接半分
、これらの操作の結果 は、次の通りである：ブロモ−タール４１５はここでＬ
流の独特Ｈｉｎｄ［ｌＩ部位および下流の独特旦ａｍＨ
Ｉ部位により境界されており、後者は後述するように異
質遺伝子の導入使用することができ る。

２．４　ちょうど上に述べたように構成されたプラスミ
ドＹＥｐＺ１０１を使用して酵母菌を形質転換した。前
の実施例に記載するように操作することによって、プラ
スミドＹＥｐＺ４１５により与えられるものと同一の特
異的β−ガラクトシダーゼ活性が得られた。

現 ニワトリリソチーム遺伝子を酵母菌中 で発現させるために、ベルギー国特許９０ｆ、２２３号
に記載されているようなそれ独自のＡＴＧコドンをもつ
ニワトリリソチームの完成された完全ｃＤＮＡからなる
プラスミドｐｌｙｓΔ９は入手可能であった。このｃＤ
ＮＡは、なお、前の実施例においてβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子について記載したように、酵母菌プロモーター
と適当に結合しなくてはならなった。しかしながら、丘
に与えた理由のため、前記ｃＤＮＡはそれ独自のＡＴＧ
開始コドンを含むので、この構成はそれ自体ＡＴＧコド
ンを含むプロモー ターｐ４１５からなるＹＥｐＺｌｏｌのようなプラスミ
ドを使用することは不可滝であった。それゆえ、このＡ
ＴＧを含まないこのプラスミドの変異種を必要とした。

３、Ｉ　　ＹＥｐＺｌｏｌの部位旦土凹ＨＩから出発す
る酵素Ｂａ１３１を使用して、１連の単一方向の欠失を
つくった０次いで。

このように短縮したプラスミドを独特！王土工部位にお
いて切離し、そしてＰｓ↓１部位とＢａ１３１により消
化された末端との間の断片をプラスミドＹＥｐＺ１００
の旦互±工部位とΣ王ａＩ部位との間に挿入した（第７
図）、この操作は２つの結果を有する： （ｉ）　　　ＹＥｐＺｌｏｌの乱ａｍＨＩのすぐ１流の
ＡＴＧ開始開始 ノド破壊される； （ｉ　ｉ）　　乱工旦ＨＩ部位はまた破壊されるが、欠
失した末端の点を プラスミドＹＥＰＺ１００中 のＢａｍＨＩ部位に隣接する Ｓｍａ１部位と融合すること により回復された。

このようにして実施した欠失は、それぞれプラスミドＹ
ＥＰＺＩＯＩΔ２、ＹＥｐＺ１０１Δ４およびＹＥＰＺ
ＩＯＩΔ５により支持されるプロモーターｐ４１５Δ２
、ｐ４１５Δ４およびｐ４１５Δ５（第８図）を生じた
。

３．２　このようにして得られたプロモーターは、なお
、適当な構成を通して、プラスミドｐｌｙｓΔ９により
支持されるニワトリｃＤＮＡと会合させなくではならな
かった。プロモーターｐ４１５Δ２の場合において、こ
の構成は５つの次の断片を同時に結合することによりつ
くった：（ａ）　　　プラスミドＹＥｐＺ１０１Δ２か
らの、プロモーターｐ４１５ Δ２からなるＨｉｎｄｌＩＩ−Ｂａ ｍＨＩ断片； （ｂ）　　　ｐｌｙｓΔ９からの、リソチームの完全な
ｃＤＮＡからなる互 り上ニー且上凹Ｈ１断片： （Ｃ）　　断片（ｂ）と断片（ｄ）との間の結合として
使用すべきプラス ミドＰＫＯＩからのＥｃｏＲＩ −Σヱ１１断片［Ｋ、マクケ ＝−（ＭｃＫｅｎｎｙ）ら。

「遺伝子の増幅および分析（Ｇ ｅｎａ　　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ ｔｏｎ　　ａｎｄ　　ａｎａｌｙｓ ｉｓ）Ｊ、Ｊ、Ｇ、クリリフ ジャン（Ｃｈｒｉｒｉｋｊａ ｎ）およびＴ、パナス（Ｐａｎ ａｓ）編、エルセビーア／ノー ス・ホランド（Ｅｌｓｅｖｉｅ ｒ／Ｎｏｒｔｈ　　Ｈｏ１ｌａｎ ｄ）、ニューヨーク、１９８ １．３８３ページ］　； （ｄ）　　プラスミドＹＥｐＺ４１５からの、複製起源
およびｐＢＲ３２ ２のβ−ラクタマーゼ遺伝子の 一方の半分からなる旦互±Ｉ− ＥｃｏＲＩ断片；および （ｅ）　　　ｐＪＤＢ２０７からの、２−ミクロン−Ｌ
ＥＵ２セグメントお よびβ−ラクタマゼーゼ遺伝子 の他方の半分からなるＨｉ　ｎｄ ｍ−ＰｓｔＩ断片。

結合の前に、これらの種々の断片を使用し、そして、そ
れらは異る末端および相補的接着末端を有するので、こ
の結合からただ１つの生存しうるプラスミドが生じた：
ｐｌｙｓΔ２９（第９図）。

同一の方法においてプロモーターｐ４１５からの欠失に
より誘導された２つの他の断片（ｐ４１５Δ４およびｐ
４１５Δ５）を使用することにより、２つの他のプラス
ミドが生産された：ｐｌｙｓΔ４９およびｐｌｙｓΔ５
９．これらの３つのプラスミドは、こうして、次の事実
によりのみ異る。プロモーターはリソチームｃＤＮＡか
ら種々の距離に位置し、これは対応するメツセンジャー
ＲＮＡ５の開始（５゛末端）と自然ＡＵＧ翻訳開始部位
との間の異る距離における転写の間に生ずる。

３．３　次いで、前述のように構成されたプラａｅのＧ
ＲＦ１８菌株（ｌｅｕ−１ＨｉＳ−）に形質転換し、次
いでロイシンについてプロトトロープのクローンについ
て選択した（ｌｅｕ”）。

次いで、これらのクローンをガラスピーズで粉砕し、そ
して得られたリゼイトを遠心により清澄にした。それら
のリゼイトの活性を、Ｅ、ｃｏｌｉ細胞の懸濁液の光学
濃度の増加をＭｃ　　マツケン（Ｍａｃｋｅｎ）らの方
法［ジャーナル・オブーモレキュラー〇バイオロジー（
Ｊ。

Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、）４９，１９７０．６３９］の
決定することにより試験した。第１０図において、６５
０ｎｍのおける光学濃度（００６ｓ　ｏ　）の初期の値
はすべてのクローンについて同一である（０　、７）が
、完結を目的として線図上でシフトさせた。第１０図の
結果はＧＲＦ１８　（ｐ　ｌｙｓΔ４９）について有意
の活性を示し、そしてプラスミドＰＩｙｓΔ５９により
形質転換された細胞について多少低い。

リソチームの作用のためのインジケー ターとして使用する細胞がバタテリウムｋｔｉｃｕｓ）
の細胞である方法［Ｇ−アルダートｙ（Ａｌｄｅｒｔｏ
ｎ）ら。

ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、）１旦ヱ、１９４５．４３］を使用して同様な結果
が得られた。

異る型のアッセイにおいて、鼠ユｎユ ｏｃｌｅｉｋｉｃｔｕｓの菌叢で覆われたベトリ皿上で
生長する形質転換されたコロニーのまわりにリソチーム
が明示された。この場合において、リソチームの発現は
コロニーのまわりの溶菌の透明なハローにより可視化さ
れた。細胞不合リゼイトを使用する結果と一致して、溶
菌のハローはｐ１ｙｓΔ４９を使用したとき最大であり
、このことはこのクローンがリンチームの最良の生産体
であることを示した。この結果が、また、示すよう に、リソチームは形質細胞から輸送された。なぜなら、
バクテリアのインジケーターを溶解するためには、それ
は細胞外に存在すことがかならず必要であったからであ
る。

第１Ｏ図がまた示すように、ｐｌｙｓΔ２９クローンを
同一方法で操作することにより、細胞の溶解を観測する
ことができなかった。したがって、プロモーターの機能
に原因となる配列は発現すべき遺伝子の上流に存在する
ばかりでなく、かつまたこの遺伝子に関して適当に位置
すべきである。

４、　　ベクター　ｌ　Ｓ５０による３、ｃｅｒの３退 ４、　１　　リソチーム発現プラスミドｐｌｙｓΔ２９
、ｐｌｙｓΔ４９およびｐｌｙｓΔ５９（前述した）が
基づくベクターｐＪＤＢ２０７は、全体の２−ミクロン
の酵母菌プラスミドを含有せず、結局その連続する維持
に内因性の２−ミクロンのプラスミド（Ｓ、ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ（１）はとんどの菌株において見出される）
の存在に依存する。これはｐＪＤＢ２０７型プラスミド
型線ラスミド繁に損失されるという不安定な場合に導く
［Ｅ、エアヘルド（Ｅｒｈａｅｒｔ）およびｃ、ｐ−ホ
エンバーグ（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒ ｇ）、ジャーナルＯオブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、）±１６．１９８３．６２５およびＭ
、ジャラヤム（Ｊａｒａｙａｍ）ら、セル（Ｃｅ１１）
ユ４，１９８３，９５］、対照的に、自然２−ミクロン
のプラスミドは安定に遺伝される。プラスミドが全体の
２−ミクロンのプラスミドＰＪＤＢ２１９を含有するよ
うな方法で構成されたプラスミドはｐＪＤＢ２０７型の
ものより も安定であることは事実知られている ［Ｃ、Ｐ　、ホランバーグ（Ｈｏｌｌａｎｂｅｒｇ）、
Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、）旦 旦、１９８２，１１９．Ｒ，Ｍ、ワルムスレイ（Ｗａｌ
ｍｓｌｅｙ）ら、モレ キュラー〇アンドｅジェネラル・ジェネテ４ｙクス（Ｍ
’ｏ　１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）１９８３，３６１］
、それゆえ、このようなプラスミドは、工業的発酵にお
ける例のように、長期間の生長のために一層有用である
。

このような完全な２−ミクロンのベク ターを構成するために、プラスミドＹＥｐＢ２　（第１
１図）を使用し、これは全体の２−ミクロンのプラスミ
ドをＰＢＲ３２２中にそれらの独特Ｐｓ工工部部位おい
てクローニングすることにより前 もってつくられた０次いで、ＹＥＰＢ２からの２つの断
片およびｐｌｙｓΔ４９からの２つの断片を結合してｐ
ｌｙｓ５０を得た（第１２図）、このプラスミドにおい
て、３つの２−ミクロンの遺伝子Ａ、ＢおよびＣは無傷
であり、そしてリソチーム遺伝子は前の実施例において
記載したｐｌｙｓΔ４９におけるようにｐ４１５Δ４プ
ロモーターから発現され る。

４．２　　Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＲＦ１８菌株
（Ｈｉ　ｓ−，１ｅｕ−）をプラスミドｐｌｙｓ５０お
よびｐＪＤＢ２０７により形質転換した後、両者の場合
に得られた形質転換された細胞をヒスチジン （０，００２％）を補充した最小培地上で別々に生長さ
せた。培養物が静止相 （約５の光学濃度）（細胞の乾燥重量＝培養物の約１．
５ｇ／ｌ）に到達したとき、細胞を培地から遠心により
分離し、０．１モルのｐＨ７のリン酸塩緩衝液中に懸濁
させそしてガラスピーズで粉砕した６両者の培養物から
の上澄み液およびリゼイト中のリソチーム活性を、Ｄ。

シュガー（Ｓ　ｈ　ｕ　ｇ　ａ　ｒ）の方法［バイオヒ
ミカ・エト・バイオフィシカーアクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｂｔｏｈｙｓ、Ａｃｔａ）、旦、１９５２．３０２］
に従い、Ｍ、ｌ　　５ｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細胞を溶解
するそれらの能力により決定した。プラスミドｐＪＤＢ
２０７により形質転換された菌株のホモジネート中に活
性は検出されず、これに対して菌株ＧＲＦ１８　（ｐｌ
ｙｓ５０）のそれについて３５単位／ｍｌ培養物のリソ
チーム活性を示すことができた。

Ｃ，ワンプ（Ｗａｎｇ）およびＲ，Ｌ。

スミス（Ｓｍｉｔｈ）［アナリティ力ルーバイオケミス
トリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）８３，１９７５
．４１ ４］により修正されたり、バーバート （Ｈｅｒｂｅｒｔ）らの方法［メンツズ・イン・エンジ
モロジ−（Ｍａｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ　、）５Ｂ、１９７１．２０９］に従い
合計の蛋白質を決定し、商業的に精製されたリソチーム
の特異的活性を考慮する［ベーリンガー・マンハイム（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅ　ｉ　ｍ）　］
ことにより、上の条件下で酵母菌中で生産されるリソチ
ームは可溶性酵母菌蛋白質の約０．８％になることが誘
導された。

菌株ＧＲＦ１８（ｐｌｙｓΔ４９）およびＡＨ２２ｃｉ
ｒ”　　（ｐｌｙｓ５０）は１９８４年１２月５日に、
セントラアル・ビュウロウ・ブーア・シンメル力ル チュアーズ（Ｃｅｎｔｒａａｌ　　Ｂｕｒｅａｕ　　ｖ
ｏｏｒ　　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、０ｏｓ
ｔｅｒｓｔ　ｒａａｔ　　ｌ、Ｐ、Ｐ、Ｂｏｘ　　２７
３．ＮＬ−３７４０ＡＧ　　Ｂａａｒｎ）（オランダ国
）に受託され、ここでそれらはそれぞれ受託番号ＣＢＳ
　　７１３０およびＣＢＳ　　７１２９を受けた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵母菌プロモーターを単離するためのプロー
ブとして使用するプラスミドＹＥｐＺ３６の構成を表わ
す、この構成は互旦旦２標識遺伝子（ｍａｒｋｅｒ　　
ｇｅｎｅ）および２−ミクロンの酵母菌プラスミドの複
製源を含有するプラスミドｐＪＤＢ２０７からの断片を
、エシェリヒア−コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃ
ｏｌｉ）β−ガラクトシダーゼの遺伝情報を指定する一
Ｌ１旦Ｚ遺伝子を含有するプラ、スミドｐＬＧ４００か
らの断片と結合することにより得られる。 第２図は、プラスミドＹＥｐＺ３６．ＹＥｐＺ４１４お
よびｐＪＤＢ２０７からの４つの断片を結合することに
より、本発明の基本プロモーター（ｐ　４１５）を有す
るプラスミドＹＥｐＺ４１５の構成を表わす。 第３図は、旦ｃｏＲＩと邑互ユＩとの間に位置する酵母
菌配列からなるプロモーターｐ４１５の配列を示し、こ
こで他の強い酵母菌プロモーター中に一般に見出される
いくつかの要素：ＴＡＴＡのボックス、ＣＴのブロック
、密接して統＜ＣＡＡＧＣの配列が見える。 第４図および第５図は、それぞれ、プラスミドＹＥｐＺ
１００およびｐＪＯ４の構成を表わし。 これらは順次に、第６図に示すように、Ｂｉｎｄｍ−Ｂ
ａｍＨＩ断片に関連するプロモーターｐ４１５の変異種
からなるプラスミドＹＥｐＺ１０１の構成に使用される
。 第７図は、プラスミドＹＥＰＺ１００およびＹＥｐＺｌ
ｏｌからのプラスミドＹＥｐＺ１０１Δの構成を表わし
、このプラスミドＹＥｐＺ１０１ΔはＢａ１０１酵素を
使用して実施した欠失により得られるプロモーターのい
くつかの変異種から°なる。このようにして得られる変
異種（ｐ４１５Δ２、ｐ４１５Δ４およびｐ４１５Δ５
）は第８図に記載されている。 第９図は、ニワトリリソチームｃＤＮＡのｐｔｙｓΔ２
９．ｐｌｙｓΔ４９およびｐｌｙｓΔ５９の構成を表わ
す、この構成はプラスミドＹＥｐＺ４１５、ＹＥｐＺ１
０１Δ、ｐｌｙｓΔ９．ｐＫＯＩおよびｐＪＤＢ２０７
からの５つの精製された断片の一義の結合によりつくら
れた。 第１Ｏ図は、プラスミドｐｌｙｓΔ４９およびｐｌｙｓ
Δ５９により形質転換された酵母菌のすへての抽出物が
ＥＤＴＡで処理したＥ、ｃｏｌｉ細胞を溶解してＥ、ｃ
ｏｌｉ細胞をリソチーム作用に対して感受性とすること
ができることを示す。 第１１図は、プラスミドｐＢＲ３２２および２−ミクロ
ンの酵母菌内因性プラスミドへ旦土工Ｉ制限酵素を作用
させることにより得られた断片の遺伝子によりプラスミ
ドＹＥｐＢ２の構成を表わす。 第１２図は、プラスミドＹＥｐＢ２およびｐ１ｙｓΔ４
９からの５つの精製断片の一義の結合による発現ベクタ
ーの構成を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、￥Ｅｃｏ￥ＲＩ部位と￥Ｐｖｕ￥II部位との間で構
   成されかつ次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片から成ることを特徴とする、一般に
   異種のポリペプチドの遺伝情報を指定する遺伝子の酵母
   菌中の発現を保証することができるプロモーター類、な
   らびにプロモーター機能を保持したそれらの突然変異体
   類および下位断片類。 ２、部位￥Ｐｖｕ￥IIが他の制限部位で置換されている
   特許請求の範囲第１項記載のプロモーター類。 ３、部位￥Ｐｖｕ￥IIが部位ＢａｍＨ I 、ＥｃｏＲ I
   、￥Ｃｌａ￥ I 、￥Ｈｉｎｄ￥III、￥Ｓｐｈ￥ I 、
   ￥Ｓａｃ￥ I 、￥Ｐｓｔ￥ I 、￥Ｘｂａ￥ I および
   ￥Ｘｈｏ￥ I から成る群より選択される制限部位によ
   り置換されている特許請求の範囲第１項記載のプロモー
   ター類。 ４、次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片から成ることを特徴とする特許請求
   の範囲第３項記載のプロモーター類、ならびにプロモー
   ター機能を保持したそれらの突然変異体類および下位断
   片類。 ５、次のヌクレオチド配列： 【遺伝子配列があります】 を有するＤＮＡ断片から成ることを特徴とする特許請求
   の範囲第４項記載のプロモーター類、ならびにプロモー
   ター機能を保持したそれらの突然変異体類および下位断
   片類。 ６、特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のプロ
   モーター類により、一般に異種のポリペプチドの遺伝情
   報を指定するＤＮＡ断片の酵母菌中の発現を保証にする
   ことができることを特徴とする、酵母菌中で自律的に複
   製することができるベクターのプラスミド。 ７、複製が２−ミクロンのプラスミドから得られかつ２
   −ミクロンのプラスミドの複製源から少なくともなる配
   列の存在により保証されることを特徴とする特許請求の
   範囲第６項記載のベクターのプラスミド。 ８、このプラスミドにより形質転換された酵母菌に正の
   選択圧力を及ぼすことを可能とする標識遺伝子をさらに
   含むことを特徴とする特許請求の範囲第６または７項記
   載のベクターのプラスミド。 ９、前記プラスミドはｐｌｙｓΔ４９であることを特徴
   とする特許請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載のプ
   ラスミド。 １０、前記プラスミドはｐｌｙｓΔ５９であることを特
   徴とする特許請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載の
   プラスミド。 １１、前記プラスミドはｐｌｙｓ５０であることを特徴
   とする特許請求の範囲第６〜８項のいずれかに記載のプ
   ラスミド。 １２、特許請求の範囲第６〜１１項のいずれかに記載の
   プラスミドからなることを特徴とする形質転換された酵
   母菌。 １３、￥サッカロミセス￥（￥Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
   ｅｓ￥）属に属することを特徴とする特許請求の範囲第
   １２項記載の形質転換された酵母菌。 １４、￥サッカロミセス￥・￥セレビシアエ￥（￥Ｓａ
   ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ￥　￥ｃｅｖｉｓｉａｅ￥
   ）種に属することを特徴とする特許請求の範囲第１３項
   記載の形質転換された酵母菌。 １５、菌株ＡＨ２２および菌株ＧＲＦ１８から成る群よ
   り選択されることを特徴とする特許請求の範囲第１４項
   記載の形質転換された酵母菌。 １６、特許請求の範囲第１２〜１５項のいずれかに記載
   の酵母菌を生長させ、そしてこのようにして生産された
   一般に異種のポリペプチドを回収することから成ること
   を特徴とするポリペプチドを生産する方法。 １７、生産されるポリペプチドは１，４−β−Ｎ−アセ
   チルムラミダーゼであることを特徴とする特許請求の範
   囲第１６項記載の方法。